FI80345B - Visualiseringsfoerfarande foer direkt eller indirekt detektering av ett agglomerat bildat av ett specifikt bindande aemne och en motsvarande acceptorsubstans vid blot overlay-bestaemningar och i dessa bestaemningar anvaendbar testfoerpackning. - Google Patents
Visualiseringsfoerfarande foer direkt eller indirekt detektering av ett agglomerat bildat av ett specifikt bindande aemne och en motsvarande acceptorsubstans vid blot overlay-bestaemningar och i dessa bestaemningar anvaendbar testfoerpackning. Download PDFInfo
- Publication number
- FI80345B FI80345B FI844508A FI844508A FI80345B FI 80345 B FI80345 B FI 80345B FI 844508 A FI844508 A FI 844508A FI 844508 A FI844508 A FI 844508A FI 80345 B FI80345 B FI 80345B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- specific binding
- colloidal metal
- labeled
- metal particles
- acceptor substance
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 28
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims abstract description 20
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 26
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 25
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 16
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 13
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 9
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 8
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 3
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 claims 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 claims 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 claims 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 21
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 21
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 10
- 150000002736 metal compounds Chemical class 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 8
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 8
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 7
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- -1 diazobenzyloxymethyl Chemical group 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 4
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 3
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 3
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- LMEWRZSPCQHBOB-UHFFFAOYSA-M silver;2-hydroxypropanoate Chemical compound [Ag+].CC(O)C([O-])=O LMEWRZSPCQHBOB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WJWMRPDAOIYYRX-UHFFFAOYSA-N 4-(4-diazoniophenyl)sulfanylbenzenediazonium Chemical compound C1=CC([N+]#N)=CC=C1SC1=CC=C([N+]#N)C=C1 WJWMRPDAOIYYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000003570 air Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L barium sulfate Chemical compound [Ba+2].[O-]S([O-])(=O)=O TZCXTZWJZNENPQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 2
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052976 metal sulfide Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-5-hydroxy-3-[(4-nitrophenyl)diazenyl]-6-phenyldiazenylnaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=C(N=NC=3C=CC=CC=3)C(O)=C2C(N)=C1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 HKJKONMZMPUGHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- QPLDLSVMHZLSFG-UHFFFAOYSA-N Copper oxide Chemical compound [Cu]=O QPLDLSVMHZLSFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005751 Copper oxide Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000585553 Homo sapiens Glycodelin Proteins 0.000 description 1
- 102000002151 Microfilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229910021612 Silver iodide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N Trioxochromium Chemical compound O=[Cr](=O)=O WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 1
- XHCLAFWTIXFWPH-UHFFFAOYSA-N [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[V+5].[V+5] Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[V+5].[V+5] XHCLAFWTIXFWPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108091000387 actin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002767 anti-calmodulin effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 102000028861 calmodulin binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000084 calmodulin binding Proteins 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000423 chromium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- VQWFNAGFNGABOH-UHFFFAOYSA-K chromium(iii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Cr+3] VQWFNAGFNGABOH-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910000431 copper oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 235000014413 iron hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L iron(ii) hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Fe+2] NCNCGGDMXMBVIA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052981 lead sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940056932 lead sulfide Drugs 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- IPJKJLXEVHOKSE-UHFFFAOYSA-L manganese dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Mn+2] IPJKJLXEVHOKSE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012205 qualitative assay Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- ADZWSOLPGZMUMY-UHFFFAOYSA-M silver bromide Chemical compound [Ag]Br ADZWSOLPGZMUMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940045105 silver iodide Drugs 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N sulfanylidenemercury Chemical compound [Hg]=S QXKXDIKCIPXUPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 1
- XPDICGYEJXYUDW-UHFFFAOYSA-N tetraarsenic tetrasulfide Chemical compound S1[As]2S[As]3[As]1S[As]2S3 XPDICGYEJXYUDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K trisodium;6-oxido-4-sulfo-5-[(4-sulfonatonaphthalen-1-yl)diazenyl]naphthalene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=CC=C2C(N=NC3=C4C(=CC(=CC4=CC=C3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 SWGJCIMEBVHMTA-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229910001935 vanadium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
- G01N33/559—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody through a gel, e.g. Ouchterlony technique
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/805—Optical property
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Communication Control (AREA)
- Details Of Television Scanning (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Conductive Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
i 80345
Visualisointimenetelmä spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin toteamiseksi suoraan tai epäsuorasti blot overlay-määri-tyksissä sekä näissä määrityksissä käyttökelpoinen testi-5 pakkaus Käsiteltävänä oleva keksintö koskee menetelmää spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin toteamiseksi tai määrittämisek-10 si blot overlay-tekniikkaa käyttävien yleismenetelmien avulla, joissa käytetään merkittyjä komponentteja. Lisäksi keksintö koskee testipakkausta, jolla todetaan tai määritetään yksi spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan aksep-toriaineen välisessä reaktiossa muodostuvan agglomeraatin 15 komponenteista yleisellä blot overlay-määritysmenetelmäl-lä.
Akseptoriaine on tavallisesti vesipitoisessa tes-tinäytteessä ja määrityksen myöhemmässä vaiheessa se adsorboidaan ja/tai sidotaan kovalenttisesti immobilisoivaan 20 matriisiin. Esimerkkejä immobilisoivista matriiseista ovat nitroselluloosa (NC)-kalvo (ohut, tunnetun huokoisuuden omaava, typpihapolla esteröidystä selluloosasta valmistettu kalvo), diatsobentsyylioksimetyylillä (DBM) ja diatso-fenyylitioeetterillä (DPT) modifioitu selluloosapaperi, 25 syaanibromidilla aktivoitu paperi tai selluloosa-asetaatti sekä nailonista valmistetut kalvot kuten Gene Screen ja Zetabind. Jälkimmäinen on nailonmatriisi (polyheksamety-leeniadipamiini, josta käytetään nimeä nailon 66), joka valmistuksen yhteydessä on modifioitu liittämällä siihen 30 useita tertiäärisiä aminoryhmiä. Mainittuja immobilisoivia matriiseja kutsutaan usein blottausväliaineiksi (ks. esim.
J.M. Gershoni ja G.E. Pallade, Analytical Biochemistry 131, 1-15 (1983)).
Blot overlay-määritysmenetelmät jaetaan yleensä 35 kahteen ryhmään: 2 80345 A. Sandwich overlay-määrityksessä puhdistettu tai konsentroitu spesifinen sitoja-aine liitetään immobilisoi-vaan matriisiin jäljempänä esitettävän kohdan B mukaisesti, edullisesti pienenä täplänä, ja akseptoriaineen an- 5 netaan sitoutua siihen, jolloin matriisi immobilisoi akseptoriaineen, joka voidaan tämän jälkeen todeta. Spesifisen sitoja-aineen spesifisyyden ansiosta on mahdollista eristää akseptoriaine monimutkaisesta testinäytteestä, esim. virtsasta, plasmasta, seerumista, muista kehon nes-10 teistä, soluttomista siirtosysteemeistä, solu- ja kudos-lysaateista jne, ja käyttää tätä kykyä hyväksi puolikvan-titatiivisissa ja/tai -kvalitatiivisissa (diagnostisissa) määrityksissä eli ns. sandwich blot overlay-määrityksessä (SBOA). Tähän saakka SBOA:n käyttöarvo on ollut olematon, 15 koska tähän saakka on ollut tarjolla vain suhteellisen monimutkaisia toteamismenetelmiä. Tämän keksinnön toteuttamismuodon ansiosta toteaminen on erittäin yksinkertaista ja näin ollen SBOA:n diagnostinen käyttö saattaa kasvaa.
B. Suorassa blot overlay-määrityksessä akseptoriai-20 ne sidotaan suoraan blottausväliaineeseen menettelyn avulla, jota kutsutaan "transferoinniksi" tai "blottaukseksi". Kirjallisuudesta löytyy erilaisia tunnettuja tapoja tämän toteuttamiseksi. Voidaan esim. siirtää pieniä pisaroita, joiden tilavuus on suunnilleen 1 μΐ (tilavuus voi olla 25 muukin) ja jotka sisältävät vesipitoisessa liuoksessa tunnetun tai tuntemattoman määrän akseptoriainetta (puhdistettuna tai puhdistamattomana), blottausvällaineelle täpliksi, jolloin akseptoriaine voi kiinnittyä blottausväliaineeseen. Tällaisia täpläblottauksia voidaan mahdollises-30 ti käyttää diagnostisesti, kun erilaisista kehon nesteistä halutaan todeta immobilisoituun akseptoriaineeseen liittyneiden spesifisten sitoja-aineiden läsnäolo. Jos akseptoriaine muodostaa osan monimutkaisesta seoksesta, seos voidaan akseptoriaineen tunnistamiseksi ensin erottaa kom-35 ponenteikseen erilaisin kromatografisin tekniikoin, esim.
3 80345 ohutkerroskromatografialla tai elektroforeesitekniikoilla esim. polyakryyliamidigeeleissä, joista tekniikoista esimerkkeinä natriumdodekyylisulfaatti (SDS)-elektroforeesi, isoelektrinen fokusointi, kaksiulotteinen geelielektrofo-5 reesi, gradienttigeeli- ja happo-ureageelielektroforeesi ja denaturoimaton geelielektroforeesi. Joissakin tapauksissa esim. nukleiinihapoille, voidaan myös käyttää agar-geelejä. Sitten toisistaan elektroforeettisesti erotetut komponentit (esim. proteiinit, peptidit ja nukleiinihapot) 10 siirretään immobilisoivaan matriisiin menettelyin, jotka tunnetaan kapillaari-, vakuumi- tai elektrosiirtona (eli -blottauksena). Sitten komponentit immobilisoidaan blot-tausväliaineelle, jolloin niiden alkuperäinen elektrofo-reettinen kuvio säilyy suurelta osin. Tämä kuvio voidaan 15 kokonaisuudessaan visualisoida tunnetuin värjäystekniikoin esim. amidomustalla ja coomassiesinisellä ja näin tutkittava komponentti (akseptoriaine) voidaan määrittää (ks. alla) ja sen sijainti voidaan paikallistaa kokonaiselekt-roforeesi kuviossa.
20 Useimmat tähän saakka käytetyistä sitoja-aineista ovat olleet proteiineja, jotka sitoutuvat tarkoin tunnettuihin kohtiin akseptorlaineessa. Glykoproteiinien toteamiseksi on käytetty lektiinejä. Polyklonaalisia ja mono-klonaalisia vasta-aineita on käytetty niitä vastaavien 25 antigeenien tai hapteenien toteamiseksi (esim. biotiini tai biotinyloitu DNA reagoi antibiotiinin kanssa, dinitro-fenyloiduissa proteiineissa oleva DNP anti-DNP:n kanssa). Blot overlay-määrityksiä käytetään jo yleisesti vasta-aineiden spesifisyyden testaamiseksi ja monoklonaalisten 30 vasta-aineiden seulontatutkimuksissa. Näiden laajasti käytettyjen systeemien ohella voidaan analysoida monien muiden proteiinien (esim. kalmoduliinia tai aktiinia sitovien proteiinien) välisiä tai proteiinin ja ligandin (esim. avidiinin ja biotiinin) välisiä vuorovaikutuksia, joista 35 komponenteista jokin immobilisoidaan. Näihin kuuluvat DNA- i 80345 proteiini- ja RNA-proteiinivuorovaikutukset, reseptori-ligandivuorovaikutukset ja yleensä kaikki riittävän spesifiset ja affiiniset makromolekyyli-makromolekyylivuorovaikutukset .
5 Blot overlay-määritysten olennainen osa muodostuu menetelmästä immobi li soidun akseptoriaineen visualisointi-seksi. On olemassa suoria ja epäsuoria menettelyjä. Visualisoinnissa käytetään merkkiaineita: radioaktiivisia isotooppeja (3 H, 14 C, 32 P, 3 5 S tai 12 5I), jonka jälkeen kehi-10 tetään autoradiografisesti; entsyymejä, jotka pystyvät muodostamaan liukenemattomia, värillisiä tuotteita ja fluorikromeja. Suorissa menettelyissä merkkiaine sidotaan spesifiseen sitoja-aineeseen. Epäsuorassa menettelyssä se sidotaan makromolekyyliin, joka spesifisesti pystyy sitou-15 tumaan ensimmäiseen spesifiseen sitoja-aineeseen. Jos jälkimmäisenä on vasta-aine, makromolekyylinä voi olla proteiini A tai toinen vasta-aine. Vasta-aineille voidaan myös käyttää monivaihetekniikkoja, esim. avidiinin ja bio-tinyloidun piparjuuriperoksidaasin muodostamaa kompleksia 20 (ABC) käyttävää menettelyä ja merkitsemättömän peroksidaa-sin ja anti-peroksidaasin välistä reaktiota (PAP) käyttävää menettelyä.
Käsiteltävänä olevan keksinnön olennaisena kohtana on käyttää blot overlay-tekniikoissa visualisointi- ja/tai 25 toteamiskeinona dispersiota, joka sisältää metallia tai metalliyhdistettä tai metallilla tai metalliyhdisteellä pinnoitettuja ytimiä. Tässä tekstissä käytetyllä sanonnalla "kolloidiset metallihiukkaset" tarkoitetaan hiukkasia sisältäviä dispersioita, valinnaisesti soolia, jotka hiuk-30 kaset muodostuvat metallista, metalliyhdisteestä tai metallilla tai metalliyhdisteellä pinnoitetuista ytimistä.
Kolloidiset metallihiukkaset voidaan valmistaa tekniikan tason tuntemin menetelmin, esim. menetelmin kolloidisen kullan, hopean tai rautaoksidin ym. valmistamiseksi. 35 Kolloidiset metallihiukkaset voidaan suoraan tai epäsuo- 5 80345 rasti liittää spesifiseen sitojaproteiiniin tai akseptori-aineeseen tai makromolekyyliin, joka sitoutuu spesifisesti ensimmäiseen spesifiseen sitoja-aineeseen, esim. proteiini Aihan, toiseen vasta-aineeseen (kun määritetään ensimmäi-5 nen vasta-aine) tai streptavidiiniin ja avidiiniin (kun jokin komponenteista on biotinyloitu), jolloin alkuperäinen sitoutumisaktiivisuus säilyy suurimmaksi osaksi. Liittäminen suoritetaan tekniikan tason tuntemin menetelmin. Liittämisellä tarkoitetaan kaikkia kemiallisia tai fysi-10 kaalisia sitoutumistapoja kuten sitoutumista kovalenttisi-dosten välityksellä, vetysiltojen välityksellä, poolisen vetovoiman avulla ja adsorption avulla.
Nyt on havaittu, että kun blottausväliainetta ja siihen joko epäsuorasti (ks. A) tai suoraan (ks. B) sidot-15 tua akseptoriainetta inkuboidaan asiamukaisen määrän kanssa spesifistä sitoja-ainetta, joka on merkitty kolloidi-silla metallihiukkasilla, (suora toteamismenetelmä) tai sitä inkuboidaan ensin merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen kanssa ja sitten kolloidisilla metallihiukkasilla 20 merkityn makromolekyylin kanssa, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan ensimmäiseen spesifiseen sitoja-aineeseen, (epäsuora toteamismenetelmä), kolloidiset metallihiukkaset akkumuloituvat spesifisiin sitoutumiskohtiin ja tulevat yllättäen näkyviksi värinä, joka on tunnusomainen käyte-25 tyille kolloidisille metallihiukkasille. Esimerkiksi käytettäessä metallina kultaa saadaan väri, joka on vaaleanpunaisesta tummanpunaiseen, ja hopeaa käytettäessä saadaan väri, joka on keltaisesta ruskeaan mustaan. Tämä väri on signaali, joka on kvalitatiivisesti luettavissa paljaalla 30 silmällä tai valinnaisesti mitattavissa tekniikan tason tuntemin spektrofotometrisin menetelmin, esim. densitomet-risesti.
Kolloidisten metallihiukkasten hiukkaskoko on mieluiten 3-100 nm ja erityisesti 5-50 nm.
35 Esimerkkeinä kolloidisista metallihiukkasieta, jot ka voidaan liittää spesifisiin sitoja-aineisiin, on kuvat- 6 80345 tu metallit platina, kulta, hopea ja kupari ja metalliyh-disteet hopeajodidi, hopeabromidi, kidevesipitoinen kuparioksidi, rautaoksidi, rautahydroksidi tai vesipitoinen rautaoksidi, alumiinihydroksi tai vesipitoinen alumiiniok-5 sidi, kromihydroksidi tai vesipitoinen kromioksidi, vana-diinioksidi, arseenisulfidi, mangaanihydroksidi, lyijysul-fidi, elohopeasulfidi, bariumsulfaatti ja titaanidioksidi. Tunnetusti voidaan myös käyttää kolloideja, jotka sisältävät ytimiä, jotka on pinnoitettu yllä mainituilla metal-10 leiliä tai metalliyhdisteillä. Nämä hiukkaset vastaavat ominaisuuksiltaan metalli- tai metalliyhdistekolloideja, mutta niiden koko, tiheys ja metallipitoisuus voidaan yhdistää optimaalisella tavalla. Yleensä voidaan käyttää kaikkia kolloidisia metallihiukkasia tai metalliyhdistei-15 tä, jotka voidaan liittää spesifisiin sitoja-aineisiin näiden sitomisaktiivisuutta vahingoittamatta ja jotka blot overlay-määritykeissä muodostavat paljaalla silmällä havaittavan väri-intensiteetin. Herkkyys on edullisesti yhtä hyvä tai parempi kuin kullalla ja hopealla saavutettava 20 herkkyys.
Menettelyt, joissa käytetään kolloidisia metallihiukkasia ja erityisesti kultasoolihiukkasia, jotka pystyvät pinnoittamaan spesifisiä sitoja-aineita kuten vasta-aineita, lektiinejä, proteiini A:ta, avidiinia ja monia 25 muita tai jopa akseptoriproteiineja kuten antigeenejä, ovat nykyään vakiinnuttaneet paikkansa monissa sytokemial-lisissa merkitsemistekniikoissa läpivalaisu- ja pyyhkäisyelektronimikroskopiassa. Esimerkki kolloidisen metallihiukkasen käytöstä, joka on metallilla pinnoitetun poly-30 meerin muodossa, on raudalla pinnoitettu dekstraani, joka liittyneenä vasta-aineisiin on erittäin käyttökelpoinen merkkiaine läpivalaisuelektronimikroskopiassa. Tällaisessa käytössä käytetään kuitenkin hyväksi tämän tyyppisille merkkiaineille tyypillistä elektroniläpäisemättömyyttä 35 (läpivalaisuelektronimikroskopia) tai niiden kykyä emit toida sekundäärielektroneja tai takaeroittuvia primääri- 7 80345 elektroneja (pyyhkäisyelektronimikroskopia).
Kolloidisia metallihiukkasia, erityisesti kullasta ja hopeasta valmistettuja, on myös käytetty merkkiaineina valomikroskooppisissa sytokemiallisissa merkintäteknii-5 koissa, kun oli osoitettu, että tällaisten kolloidisten metallihiukkasten akkumuloituminen sitoutumiskohtiin ob-jektilasilla olevassa kudosvalmisteessa tai solun pintaan voitiin havaita valomikroskoopilla.
Kolloidisia metallihiukkasia käytetään myös jois-10 sakin kvalitatiivisissa ja kvantitatiivisissa määrityksissä, joissa määritetään in vitro immunologisia komponentteja kuten hapteeneja, antigeenejä ja vasta-aineita vesivä-liaineessa. Näitä tekniikkoja on kutsuttu soolihiukkasim-munomäärityksiksi ja passiiviseksi kulta-agglutinaatioksi 15 (Geoghegan).
Passiivisessa kulta-agglutinaatiotekniikassa agglu-tinoidaan kullalla merkitty antigeeni (kultahiukkaset 18-20 nm) merkitsemättömällä vasta-aineella. Käytetään stan-dardimikrotitterilaitteistoa, jossa aggregoitumaton kulta 20 valuu syvennysten seinämää pitkin alaspäin muodostaen punaisen raidan. Tämä tekniikka on analoginen klassilliselle passiiviselle hemagglutinaatiolle ja on yhtä herkkä kuin tämä. On väitetty tällä tekniikalla pystyttävän käänteis-agglutinaatioon, jolloin vasta-aine merkitään kullalla.
25 Soolihiukkasimmunomääritykset jakaantuvat kahdeksi ryhmäksi. Ensimmäinen on ns. homogeeninen soolihiukkasim-munomääritys, jossa kolloidisilla hiukkasilla merkitty vasta-aine agglutinoidaan immunokemiallisesti kaksi- tai moniarvoisilla antigeeneillä tai hapteeneilla, jotka on 30 sidottu kantajaproteiiniin. Agglutinaatiosta johtuva värin heikkeneminen mitataan kolorimetrisesti käyttäen puskuria nollanäytteenä. Näytteestä peräisin olevat vapaat haptee-nimolekyylit voivat sitten estää kolloidisten metallihiukkasten agglutinoitumisen. Tällaisia menetelmiä on kuvattu 35 EP-patenttijulkaisussa nro 0 007 654.
Soolihiukkasimmunomäärityksen toinen tyyppi perus- 8 80345 tuu vapaiden/sitoutuneiden kolloidisten metallihiukkasten muodostaman konjugaatin erotusmeentelmiin, jotka ovat analogisia radioimmunomääritykselle ja entsyymi-immunomääri-tykselle. Tällaisia menetelmiä on kuvattu EP-patenttijul-5 kaisussa nro 0 007 654. Yhtä tällaista menetelmää kutsutaan sandwichsoolihiukkasimmunomääritykseksi (SSPIA) ja se on analoginen sandwich-ELISA eli kiintofaasisandwich-radioimmunomääritykselle. SSPIA:ssa toimitaan tyypillisesti siten, että määritettävän antigeenin vasta-aine adsor-10 boidaan ensin esim. polystyreeniä olevan mikrotitrauslevyn pinnalle. Näyte (antigeenistandardi tai nollanäyte), joka on liuotettu asianmukaiseen puskuriin, pipetoidaan vasta-aineella peitettyihin syvennyksiin ja inkuboidaan asianmukaisella tavalla. Lisätään kullalla merkittyä vas-15 ta-ainetta ja reaktioseoksen inkubointia jatketaan. Syvennykset imetään ja pestään sitoutumattoman konjugaatin poistamiseksi. Lopuksi sidottu immuunikompleksi ja homogenoidut kolloidiset metallihiukkaset irroitetaan toisistaan. Joko tarkastellaan saadun dispersion väri-intensi-20 teettiä visuaalisesti tai mitataan metallin konsentraatio kolorimetrisesti. Visuaalista (esim. dispergoidun kullan värin) tarkastelua voidaan käyttää vain suurilla antigee-nikonsentraatioilla.
On huomattava, että soolihiukkasmäärityksiä on myös 25 kuvattu käyttökelpoisiksi ei-immunologisiksi määrityksiksi ja yleensä, "kun todetaan ja/tai määritetään yksi tai useampi komponentti spesifisen sitojaproteiinin ja vastaavan sitoutuvan aineen välisessä reaktiossa vesipitoisessa testinäytteestä siten, että käytetään hyväksi tällaisten 30 komponenttien tunnettua molemminpuolista sitomisaffini-teettiä, jolloin käytetään yhtä tai useampaa merkittyä komponenttia, jotka saadaan kytkemällä mainitun reaktion haluttu komponentti suoraan tai epäsuorasti veteen disper-goituihin hiukkasiin, jotka ovat metallista, metalliyhdis-35 teestä tai metallilla tai metalliyhdisteellä pinnoitetuista polymeeriytimistä muodostuvia hiukkasia, joiden hiuk- 9 80345 kaskoko on vähintään 5 nm, jolloin reaktion aikana tai asianmukaisen reaktioajan jälkeen ja valinnaisesti sitoutuneiden ja vapaiden merkittyjen komponenttien toisistaan erottamisen jälkeen määritetään tekniikan tason tuntemin 5 menetelmin testinäytteestä tai yhdestä siitä saadusta fraktioista metallin ja/tai muodostuneen metallipitoisen agglomeraatin fysikaaliset ominaisuudet ja/tai määrä, joka määritys ilmaisee kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti todettavan ja/tai määritettävän komponentin tai kom-10 ponentit".
Käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytetään kolloidista metallihiukkasia merkkiaineina blot overlay-mää-ritysmenetelmissä, mikä käyttö on täysin uutta ja minkä toteuttaminen on yllättäen mahdollista.
15 Kolloidisiin metallihiukkasiin katsotaan kuuluvan metallista, metalliyhdisteestä tai metallilla tai metal-liyhdisteellä pinnoitetuista ytimistä muodostuva dispersio.
Kolloidisten metallihiukkasten käyttö merkkiaineina 20 on sovellettavissa kaikkiin blot overlay-määritysmuotoihin ja niiden käytön etuna on, että blottausväliaineen pinnan sitoutumiskohtiin akkumuloituvat kolloidiset metallihiukkaset voidaan nähdä pelkällä silmällä herkkyydellä, joka on vähintään yhtä hyvä kuin nykyisten tekniikkojen esim. 25 entsyymeihin perustuvien blot overlay-määritysten erittäin suuri herkkyys. On erityisesti tähdennettävä, että keksintö olisi arvoton ilman tätä viimeistä näkökohtaa. Keksinnön tärkeänä etuna on, että tulos on luettavissa ilman toista entsymaattista reaktiota, autoradiografiaa tai 30 fluoresoivien värien havaitsemissysteemiä, ja että sitoutuneita kolloidisia metallihiukasia ei tarvitse irroittaa seuraavaa määritystä varten paljaalla silmällä (pieni herkkyys), kolorimetrisesti tai CRAAS:llä (suurempi herkkyys) kuten sandwichsoolihiukkasimmunomääritykeissä. Kek-35 sinnön suurimpana etuna on sen yksinkertaisuus, koska väri kehittyy reaktion aikana. Tämä mahdollistaa reaktion kes- 10 80345 keyttämisen halutun signaalin muodostumisen jälkeen tai systeemin kalibroinnin ennalta määritellyn tuloksen saavuttamiseksi vakioaikarajoissa.
Kullalla merkittyjen vasta-aineiden käyttö on pal-5 jon yksinkertaisempi ja yhtä herkkä menettely kuin tunnetusti hyvin herkkä inununoperoksidaasimenetelmä. Tämä yksinkertainen määritys voidaan suorittaa testipakkauksella, jolla voidaan epäsuorasti todeta spesifisten sitoja-ainei-den läsnäolo, jotka sitoutuvat blottausvällaineeseen si-10 dottuun akseptorlaineeseen, ja ensimmäisen spesifisen si-toja-aineen kolloidisilla metallihiukkasilla merkityn spesifisen sitoja-aineen läsnäolo. Jos spesifisenä sitoja-aineena on vasta-aine, tänä toisena sitoja-aineena voi olla kolloidisilla metallihiukkasilla merkitty toinen vas-15 ta-aine tai proteiini A. Toteaminen voi tapahtua hyvin yksinkertaisena kastoliuskatestinä, esim. täpläblot overlay- immunomäärityksenä, jolla voidaan nopeasti seuloa valitun antigeenin vasta-aineiden läsnäolo vesipitoisesta testinäytteestä kuten seerumista.
20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle spesifisestä si- toja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin toteamiseksi tai määrittämiseksi blot overlay-tekniikkaa käyttävien yleismenetelmien avulla, joissa käytetään merkittyjä komponentteja, on tunnusomais-25 ta, että merkityt komponentit, jotka on saatu kytkemällä kolloidisiin metallihiukkasiin agglomeraatin haluttu komponentti, joka agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta, tai kytkemällä kolloidisella metallilla merkittyyn sitoja-ainee-30 seen agglomeraatin haluttu komponentti, joka agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta aksepetoriaineesta, visualisoidaan värisignaalina, joka sijaitsee spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan akseptori-aineen välisen reaktion reaktiokohdassa blottausväliaineen 35 pinnalla, tai määritetään kvantitatiivisesti tässä kohdas- 11 sa sinänsä tunnetuilla spektrofotomertrisillä menetelmil lä.
n 80345
Menetelmä muodostuu seuraavista vaiheista: 1. Akseptoriaine immobilisoidaan immobilisoivaan 5 matriisiin, jota myös kutsutaan blottausväliaineeksi.
I.I Joko adsorboidaan suoraan ja/tai sidotaan kova-lenttisesti menettelyn avulla, jonka yleisnimi on blot-taus, mahdollisesti sen jälkeen kun on erotettu elektrofo-reettisesti ja siirretty tai blotattu elektroforeesiväli-10 aineesta blottausväliaineeseen, ja tekemällä sitten jäljellä olevat proteiinin sitoutumiskohdat tehottomiksi tekniikan tason tuntemin menettelyin esimerkiksi BSA:n, gelatiinin, PEG:n tai Tween 20:n avulla, I. II tai annetaan akseptoriaineen sitoutua spesifi-15 seen sitoja-aineeseen, joka on immobilisoitu blottausväliaineeseen, saattamalla mainittu blottausväline kosketukseen akseptoriainetta sisältävän vesiliuoksen kanssa.
II. Saatetaan kohdan I) blottausväliaine ennen pesua ja ilmakuivausta määräajaksi kosketukseen: 20 II.I joko kolloidisilla metallihiukkasilla merkit tyjen spesifisten sitoja-aineiden kanssa, jotka konsetraa-tioiltaan ovat sopivia, II. II tai ensin merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen kanssa, jonka konsentraatio on sopiva, ja sitten 25 kolloidisella metallilla merkityn proteiinin kanssa, joka on spesifinen merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen suhteen.
III. Luetaan muodostunut värisignaali, joka on tunnusomainen blottausväliaineen pinnalle sidotuille kolloi- 30 disille metallihiukkasille, paljaalla silmällä tai tekniikan tason tuntemin spektrofotometrisin menetelmin, esim. densitometrisesti.
Tämä keksintö koskee myös testipakkauksia, joilla määritetään suoraan tai epäsuorasti yksi komponenteista, 35 joka syntyy spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan aksep- 12 80345 torlaineen reaktiossa, blot overlay-määrityksessä. Näille testipakkauksille on tunnusomaista, että a) kolloidisilla metallihiukkasilla merkittyjä komponentteja, jotka aiheuttavat värisignaalin mainitun spe- 5 sifisen sitoja-aineen ja mainitun akseptoriaineen välisen reaktion reaktiokohdalla, immobilisoivan matriisin pinnalla; b) fysikaalisen kehitteen komponentteja ja c) muita reagensseja.
10 Kolloidisilla metallihiukkasilla merkityt komponen tit on saatu kytkemällä yllä kuvatusta reaktiosta saatu komponentti tai komponentti, jolla tämä reaktio voidaan todeta epäsuorasti, yllä määriteltyihin kolloidisiin metallihiukkasiin. Jos reaktio on immunologista tyyppiä, 15 testipakkausta voidaan käyttää sandwich blot overlay-mää-rityksissä (ks. esimerkki lii) ja vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi seerumista valikoitujen antigeenien avulla (ks. esimerkki I).
Käsiteltävänä olevan keksinnön eräänä piirteenä on 20 se seikka, että blot overlay-määrityksessä voidaan blot-tausvällaineen pintaan sidotut kolloidiset metallihiukkaset todeta visualisoimalla ne epäsuorasti ja/tai parantaa toteamista käyttämällä fysikaalista kehitettä, joka voidaan pelkistää vastaaviksi metalleiksi. Sopivia fysikaali-25 siä kehitteitä ovat esim. hopealaktaatti, hopeanitraatti ja vastaavat. Kun fysikaalisena kehitteenä käytetään esim. hopeaa, reaktio tapahtuu aluksi metallihiukkasten pinnalla, jotka katalysoivat pelkistymisen, ja tämän jälkeen nämä ymppihiukkaset autokatalysoivat reaktion. Tällä ta-30 voin muodostuu musta, erittäin kontrastoiva signaali, joka johtuu akkumuloituneesta hopeametallista. Tämä merkitsee herkkyyden huomattavaa paranemista. Olemme myös havainneet, että valolle epäherkän hopeasaostuman saamiseksi on blotit kiinnitettävä mikrovalokuvauksessa käytettävällä 35 kiinnitteellä.
13 80345
Fysikaalisia kehitteitä on jo useita vuosia käytetty veteen liukenemattomien metallien, erityisesti metal-lisulfidien visualisoimiseksi kudoksissa (ks. Danscher, Histochemistry 71, 1-16, 1981). Metallisulfidit ja metal-5 linen hopea katalysoivat hopeaionien pelkistymistä. Kudoksessa oleva kolloidinen metallinen kulta voidaan myös osoittaa fysikaalisella kehitteellä, jota havaintoa Hol-gate et ai. (J. Histochem. Cytochem. 31, 938-944 (1983)) ovat käyttäneet hyväksi esittämässään immunokulta/hopea-10 värjäysmenetelmsssään, jonka herkkyys on paljon parempi kuin alkuperäisessä immunokultavärjäysmenetelmässä.
Tämän keksinnön lisätunnusmerkin tärkeimpänä etuna on sen suunnaton herkkyys, joka on suurempi kuin missään nykyisessä blot overlay-määrityksessä. Se on käyttökelpoi-15 nen, kun käyttäjä haluaa tehdä reagenssien käytön taloudellisemmaksi tai kun käytettävissä on äärimmäisen pieniä määriä akseptoriainetta ja/tai spesifistä sitoja-ainetta.
Käsiteltävänä olevan keksinnön toisena lisätunnus-merkkinä on valokuvauksessa käytettävän kiinnitteen käyt-20 tö, joka vähentää taustahäiriötä ja parantaa fysikaalisella kehitteellä saadun reaktiotuotteen pysyvyyttä.
Seuraavat esimerkit valaisevat käsiteltävänä olevan keksinnön piiriä.
Esimerkki I
25 Yksinkertainen täplä-blot overlay-immunomääritys koiran aivoista saadun tubuliinin ja kalmoduliinin vasta- aineiden osoittamiseksi epäsuorasti kullalla merkityillä sekundäärisillä vasta-aineilla immunisoitujen kaniinien seerumista.
30 1.1 Antiseerumien valmistus 1.1 Antiseerumien kehittäminen
Sekoitettiin 1 mg koiran aivoista saatua tubuliinia (uutettu SDS-polyakryyliamidigeeleistä) 1,0 ml:ssa puskuria (0,1-m PIPES, pH 6,9) tai 1 mg elektroforeettisesti 35 puhdasta, koiran aivoista saatua kalmoduliinia (vedessä) 14 80345 ja 1,0 ml Freundin täydellistä apuainetta (Dlffco). Homo-genoinnin jälkeen antigeeni ruiskutettiin intradermaalisti viiteen kohtaan valkoisen kaniinin selkärankaa. Neljän viikon välein annettiin tehosteruiskeita. Antigeeni val-5 mistettiin muuten samalla tavoin, mutta käytettiin Freundin epätäydellistä apuainetta. Viikko jokaisen tehoste-ruiskeen jälkeen kaniineista otettiin verta (n. 60 ml) ja valmistettiin seerumi, jota varastoitiin ennen käyttöä pienempinä erin -20°C:ssa.
10 1.2 Kolloidisella kullalla merkityt sekundääriset vasta-aineet Näiden toimittajana oli Janssen Life Sciences Products, 2340, Beerse, Belgia, koodi GAR G20. Nämä vasta-aineet ovat vuohesta saatuja kaniini-IgG:n affiniteettipuh-15 distettuja vasta-aineita, jotka on merkitty 20 nm:n kolloidisilla kultahiukkasilla.
Antigeeniä sisältävien täplien muodostaminen nitro-selluloosaliuskoihin
Kymmenen 1 μΐ tippaa puhtaan tubuliinin nelinker-20 täisiä sarjalaimennuksia (lähtien määrästä 250 ng/μΐ) 0,1 moolisessa PIPES:issä, 1 millimoolisessa EGTA:ssa ja 1 millimoolisessa MgCl2:ssa, pH 6,75, tai puhdasta kalmodu-liinia vedessä, siirrettiin täplärivinä kuiville nitrosel-luloosaliuskoille (6 cm x 0,6 cm). Täplien kuivuttua (noin 25 viiden minuutin kuluttua) liuskoilla olevien proteiinitäplien jäljellä olevat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi inkuboimalla niitä liuoksen kera, jossa oli 5 % naudansee-rumialbumiinia (BSA) 20 millimoolisessa tris-puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, pH 8,2, 30 minuuttia 37°C:ssa.
30 1.3 Testiprotokolla tubuliini- ja kalmoduliinivas- ta-alneiden toteamiseksi. Kullalla merkittyjen vasta-aineiden käytön ja ABC-peroksidaasitoteamismenetelmän vertailu
Jollei muuta mainita, menettelyn ainoana puskurina 35 oli 0,1 % BSA-tris (0,1 % BSA 20 millimoolisessa tris-HC1:ssä, 0,9 % NaCl, pH 8,2, 20 mmol NaN3 ).
15 80 345 a. Inkubolntl primäärisen antiseerumin kera
Kaksi liuskaa inkuboitiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa 5 ml:n tulpitetuissa muoviputkissa 1 ml:n kera kaniinin antitubuliiniseerumia, 1:1000 laimennos 0,1 5 %:isessa BSA-trispuskurissa.
Kaksi liuskaa inkuboitiin kuten yllä sama antiseerumi absorboituna tubuliiniin, joka oli kovalenttisesti sidottu Sepharose-4B:hen. Liuskat toimivat antigeenispesi-fisyyskontrollina.
10 Kaksi liuskaa inkuboitiin kuten yllä kaksi tuntia huoneen lämpötilassa 1 ml:n kera kaniinin antikalmodulii-niseerumia, 1:1000-laimennos 0,1 %:isessa BSA-trispuskurissa.
Kaksi liuskaa inkuboitiin kuten yllä sama antisee-15 rumi absorboituna kalmoduliiniin, joka oli kovalenttisesti sidottu Sepharose-4B:hen.
Absorboituneiden ja absorboitumattomien primääristen antiseerumien inkuboinnin päätyttyä liuskoja pestiin 3 x 10 minuuttia 0,1 %:isessa BSA-trispurkurissa. Toinen 20 liuska kustakin parista inkuboitiin edelleen GAR G20:n kera (ks. 1.3.b).
Toinen liuska inkuboitiin käyttäen hyvin herkkää Vectastain ABC-immunoperoksidaasipakkausta, valmistaja Vector Laboratories, valmistajan ohjeiden mukaan (ks.
25 1,3.c).
b. Inkubointi kullalla merkityn sekundaarisen vasta-aineen kera: GAR G20
Pestyjä liuskoja (ks. 1.3.a) inkuboitiin kaksi tuntia GAR G20:n kera laimennettuna absorbanssiarvoon 1 30 cm/520 nm = 0,21 0,1 %:isessa BSA-trispurksurissa + 0,4 %.isessa gelatiinissa. Inkuboinnin päätyttyä liuskat pestiin 0,1 %:isessa BSA-trispuskurissa 2 x 10 minuuttia ja kuivattiin ilmassa.
c. Inkubointi Vectastain-pakkauksen avulla 35 Pestyjä liuskoja (ks. 1.3.a) inkuboitiin tunti se kundäärisen biotinyloidun vasta-aineliuoksen kera (1:200 16 80345 0,1 %:ista BASA-trlspuskuria 3 x 10 minuuttia ja inkuboi-tiin sitten tunti avidiini-biotinyyliperoksidaasikomplek-sin kera. Kompleksi valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaan: 100 μΐ reagenssi A:ta (avidiini DH) lisättiin 10 5 ml:aan PBS:ää (Belbecco, ei Mg2*- ja Ca2*-ioneja). Lisättiin jatkuvasti sekoittaen 100 μΐ reagenssi B:ta (biotiny-loitu piparjuuriperoksidaasi). Kompleksi käytettiin viiden minuutin kuluttua. Liuskat pestiin 0,1 %:isessa BSA-tris-puskurissa (2 x 10 minuuttia) ja sitten 100 millimoolises-10 sa tris-HCl-puskurissa, pH 7,6. Sitten immobilisoitu per-oksidaasi visualisoitiin 4-kloori-lnaftoli substraattina: 20 mg 4-kloori-l-naftolia liuotettiin 1 ml:aan etanolia ja laimennettiin edelleen 20 ml:11a 100 millimoolista tris-HCl-puskuria, pH 7,6, lämmitettiin n. 50°C:een, li-15 sättiin 200 μΐ 1 %:ista vetyperoksidia ja substraattiliuos lisättiin liuskoihin ruiskulla mikrosuodattimen (0,2 μ, Millipore) läpi, joka oli kiinnitetty ruiskuun. Reaktion annettiin jatkua viisi minuuttia ja sitten reaktio keskeytettiin pesemällä liuskat vedellä. Liuskat kuvattiin il-20 massa.
1.4 Arviointi ABC-menettelyssä sininen väri merkitsee positiivista tulosta. Käytettäessä kolloidista kultaa positiivinen tulos näkyy värinä, joka on vaaleanpunaista punertavaan, 25 käytetyn kullan hiukkaskoosta riippuen (suurehkot kulta-hiukkaset, esim. 40 nm, antavat purppuranpunertavan värin). Molemmat menetelmät ovat herkkyydeltään täysin vertailukelpoisia eli herkkyys on tubuliinille n. 5 ng/μΐ ja kalmoduliinille n. 30 ng/μΐ käytetyissä olosuhteissa. Ne-30 gatiivinen reaktio on merkkinä spesifisyydestä, kun anti-seerumit adsorboituvat niitä vastaavan antigeenin kera.
Esimerkki II
Mikrotubulusproteiineihin reagoivien hiiren mono-klonaalisten vasta-aineiden läsnäolon seulontatutkimus 35 kasvavien hybridoomien viljelysupernatanteista käyttäen 17 80345 vuohesta saatuja, kullalla merkittyjä hiiren lgG:n vasta-aineita.
2.1. Hiirien immunisointi
Hiiriin (Balb/C) ruiskutettiin homogenoitu seos 5 (ks. esimerkki 1.1), joka muodostui rotan aivojen mikro-tubulusproteiineista (100 pg/hiiri), (valmistettu kahden lämpötilasta riippuvan polymerointi-depolymerointisyklin avulla) ja Freundin täydellisestä apuaineesta. Ruiskeet annettiin selkään ihon alle viiteen kohtaan. Annettiin 10 kolme kertaa kahden viikon välein tehosteruiskeita, jotka sisälsivät 100 pg antigeeniä valmistettuna Freundin epätäydellisen apuaineen avulla. Kolme päivää ennen pernasolujen ja myeloomasolulinjan fuusioimista hiirille annettiin tehosteruiskeena laskimoon 50 pg antigeeniä/hiiri 100 15 pl:ssa PBS-puskuria.
2.2 Pernasolujen ja NS-1 myeloomasolujen fuusioiminen NS-1- solut fuusioitiin kahden immunisoidun hiiren 20 pernasoluihin tekniikan tason tuntemin menetelmin ja muodostuneita hybridoomeja viljeltiin viidellä 96:11a syvennyksellä varustetulla levyllä (Nunc) 37°C:ssa vedellä kyllästetyssä ilmakehässä, joka sisälsi 7 % hiilidioksidia. Kun kasvu oli jatkunut noin kaksi viikkoa, syvennyksistä 25 otettiin 100 pl kasvavia hybridoomeja sisältävää viljely-supernatanttia, josta testattiin erittyneiden monoklonaa-listen vasta-aineiden läsnäolo (ks. 2.4).
2.3 Nitroselluloosapaperiliuskojen valmistus, joihin on elektroblottaamalla muodostettu täplä proteiineja 30 sisältävällä SDS-polyakryyllamidigeelillä
Antigeenin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (kaksi kertaa polymeroituja mikrotubulusproteiineja) suoritettiin Laemmlin mukaan 7,5 %:isella geelillä. Antigeeni, joka oli liuotettu näytepuskuriin ja keitetty siinä, 35 panostettiin yhtenäisenä kerroksena koholla olevan geelin 18 80345 yläpinnalle, 300 pg geeliä kohti. Kun väririntama oli tunkeutunut 3 cm erotusgeeliin, elektroforeesi lopetettiin. Geelistä leikattiin irti pieni vaakasuora liuska värjäystä varten coomassiesinisellä ja loput geelistä käytettiin 5 elektroblottaukseen nitroselluloosapaperille. Geeliä tasapainotettiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa siirtopus-kurissa (25 mmol tris-192 mmol glysiini/20 t/t-% metanoli, pH 8,3). Geeli asetettiin nitroselluloosaarkille (esikos-tutettu puskurissa) välttäen ilmakuplia ja poistaen sul-10 keuksiin jääneet ilmakuplat. Tämä yhdistelmä asetettiin kahden esikostutetun suodatinpaperin ja kahden nailonverk-kotuen väliin. Näin syntynyt yhdistelmä sopi tiukasti EC-elektroblottauslaitteen suljettuun elektrodiverkkopiti-meen. Elektroblotattiin yli yön huoneen lämpötilassa vir-15 ralla 400 mA. Elektroforeettisen siirron jälkeen nitrosel-luloosapaperiin jääneet proteiinin sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi inkuboimalla arkkeja liuoksessa, jossa oli 5 % BSA:ta 20 mmol tris:illä puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, pH 8,2, 30 minuuttia 37°C:ssa. Sitten nitro-20 selluloosa-arkki leikattiin 3 mm leveiksi liuskoiksi, jotka olivat yhdensuuntaisia elektroforeesin kulun kanssa. Näitä liuskoja käytettiin hydridoomasolujen seulomiseksi supernatanteista.
2.4 Monoklonaalisten vasta-aineiden toteaminen 25 100 μΐ jokaista hybrididoomaviljelysupernatanttia otettiin 3,5 cm pitkiin 0,5 ml:n Eppendorf-kärkiin ja laimennettiin suhteessa 1:5 0,4 ml:11a 0,1 %:ista BSA-tris-puskuria. Kärjet ja liuskat varustettiin koodinumerolla. Jokaiseen kärkeen liitettiin yksi liuska ja tätä yhdistel-30 mää inkuboitiin kaksi tuntia. Liuskat pestiin panoksittain ylimäärällä 0,1 %:ista BSA-trispuskuria ja inkuboitiin myös panoksittain GAM G20:n kera (vuohesta saatu anti-hiiri IgG, merkitty 20 nm:n kolloidisilla kultahiukkasilla), Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgia. GAM 35 G20 laimennettiin 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla + 0,4
II
19 80345 %:isella gelatiinilla absorbanssiarvoon 1 cm/520 nm = 0,1 ja annettiin reagoida yli yön. Liuskat pestiin 0,1 %:isel-la BSA-trispuskurilla ja vedellä ja kuivattiin ilmassa.
Positiivinen reaktio näkyi selvästi väriltään vaa-5 leanpunaisesta punertavaan vaihtelevina vyöhykkeinä, jotka vastasivat proteiinivyöhykkeitä määrätyllä molekyylimassa-alueella. Tällä erittäin yksinkertaisella seulontamenet-telyllä ei voida vain tunnistaa vasta-ainetta erittäviä hybridoomeja, vaan sillä saadaan myös välittömästi tietoja 10 ko. vasta-aineen spesifisyydestä ja siten menettelystä on suuri apu valittaessa mielenkiintoisia vasta-ainetta erittäviä hybridoomeja.
Esimerkki III
Sandwich immuno-blot overlay-määritysmenetelmä an-15 tigeenien toteamiseksi vesipitoisesta testinäytteestä: IgG-antigeenien toteaminen vesipitoisesta testinäytteestä.
3.1 Määrityksen periaate
Pieni pisara (n. 1 μΐ) puhdistettua tai väkevöityä vasta-ainetta, joka on monospesifinen määritettävälle an-20 tigeenille, blotattiin nitroselluloosapaperiliuskalle (tai muulle sopivalle blottausväliaineelle), kuivattiin ja proteiinin vapaat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi (ks. esimerkki 1.3). Valinnaisesti nämä vasta-ainetta sisältävät, sitoutumiskohdiltaan tehottomiksi tehdyt liuskat voi-25 daan pestä vedessä, kuivata ilmassa ja varastoida. Sitten tällainen liuska inkuboidaan määrätyn tilavuuden kera antigeeniä sisältävää testiliuosta määrätyn pituisen ajan. Kun sitoutumattomat aineet on pesty pois, liuskojen inku-bointia jatketaan asianmukaisesti laimennetun, kolloidi-30 silla metallihiukkasilla (esim. kulta- tai hopeasoolilla) merkityn monospesifisen vasta-aineen kera, joka on samanlainen kuin blottausväliaineelle adsorboitu vasta-aine. Valinnaisesti voidaan käyttää kahta monoklonaalista vasta-ainetta, joista kumpikin tunnistaa erilaisen antigeeniepi-35 toopin. Toinen on sidottu blottausvällaineeseen ja toinen 20 8 0 3 4 5 on sidottu kolloidisiin metallihiukkasiin. Vakio-olosuhteissa menetelmällä voidaan todeta antigeeninen ennalta määritelty minimikonsentraatio ja sitä voidaan käyttää kvalitatiivisena diagnostisena testinä edellyttäen, että 5 sillä voidaan tunnetusta testiliuoksesta todeta vaadittava minimikonsentraatio.
3.2 Periaatteen sovellutusesimerkki: kaniinin igG-antigeenien toteaminen puskuroidusta liuoksesta, joka sisältää kaniinin konsentraatioltaan tunnettua lgG;tä 10 Tämän uuden sanwichtekniikan toimivuuden testaami seksi suoritettiin seuraava koe:
Kuusi nitroselluloosapaperiliuskaa (6 x 0,6 cm) blotattiin pisaroilla (1 μΐ), jotka sisälsivät kasvavia määriä (puolilaimennussarja, lähtöarvona 125 ng/μΐ) vuo-15 hesta saatuja affiniteettipuhdistettuja kaniinin IgG:n (GAR IgG) vasta-aineita kuten kuvattiin esimerkissä 1.2.
Proteiinin jäljellä olevat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi esimerkissä 1.2 kuvatulla tavalla. Yksi liuska (n:o 6) pestiin 20 mmol trispuskuri-keittosuolaliuok-20 sessa, blotattiin kuivana suodatinpaperille, kuivattiin ilmassa ja käytettiin yli yön huoneen lämpötilassa kuivana varastoinnin jälkeen.
Muut viisi liuskaa inkuboitiin tulpitetuissa muoviputkissa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa seuraavalla 25 tavalla: nro 1: RIgG:n kera, 1 ml, l/pg/ml nro 2: RIgG:n kera, 1 ml, 0,25 pg/ml nro 3: RIgG:n kera, 1 ml, 0,063 pg/ml nro 4: RIgG:n kera, 1 ml, 0,015 pg/ml 30 nro 5: RIgG:n kera, 1 ml, 0 pg/ml
Kaniinin IgG laimennettiin 0,1 %:isella BSA-tris-puskurilla. Liuska nro 6 inkuboitiin 0,25 pg/ml kera RIgG:tä.
Liuskat pestiin (2 x 10 minuuttia) 0,1 %:isessa 35 BSA-trispuskurissa.
Il 21 80345
Kaikkia liuskoja inkuboitiin tasan yksi tunti huoneen lämpötilassa GAR G20:ssä (vuohesta saatuja kaniinin IgG:n vasta-aineita, merkitty kolloidisilla kultahiukka-silla, halkaisija 20 nm), Janssen Life Sciences Products, 5 B-2340 Beerse, Belgia. GAR G20 laimennettiin absorbenssi- arvoon 1 cm/520 nm = 0,2 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla + 0,4%:isella gelatiinilla.
Liuskat pestiin 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja sitten vedellä ja kuivattiin ilmassa.
10 3.3 Arviointi Täplät, joissa oli niinkin vähän kuin 15 ng adsorboitunutta GAR IgG:tä tulivat näkyviin vaaleanpunaisina pilkkuina, kun oli inkuboitu vain 30 minuuttia 1 ml:ssa liuosta, jossa oli 15 ng/ml RlgGrtä, jonka jälkeen inku-15 boitiin tunti 1 ml:n kera GAR G20:tä, 0,0520 nm = 0,2. Liuosten, joissa oli vähintään tämä määrä RlgGrtä, katsottiin reagoivan positiivisesti. Liuskojen nro 6 ja nro 2 tulokset olivat indenttiset. Tämä osoittaa, että liuskat voidaan kuivata tehottomaksi tekemisvaiheen jälkeen ilman 20 vasta-aineaktiivisuuden menettämistä.
Esimerkki IV
Nitroselluloosapaperiin sidotun antigeenin suora toteaminen kolloidisella hopealla merkityllä primäärisellä vasta-aineella: hiiren IgG-antigeenejä sisältävien täplien 25 toteaminen hiiren IgG:n kolloidisella hopealla merkityillä, vuohesta saaduilla vasta-aineilla.
Nitroselluloosapaperisuikaleet (6 cm x 0,6 cm) hiotettiin hiiren IgG:tä (1 μΐ) sisältävillä täplillä, jotka saatiin kaksinkertaisella laimennussarjalla 250-0,4 ng/μΐ, 30 esimerkissä 1.2 kuvatulla tavalla.
Proteiinin jäljellä olevat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi kuten esimerkissä 1.2.
Liuskat inkuboitiin hiiren IgG:n kolloidisella hopealla merkittyjen, vuohesta saatujen vasta-aineiden kera 35 (valmistaja E.Y. Laboratories, SP-0011) laimennoksena 22 80345 1:100 0,1 %:isessa BSA-trispuskurissa yksi tunti kolmekymmentä minuuttia huoneen lämpötilassa.
Liuskat pestiin 2 x 10 minuuttia 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja vedellä ja kuivattiin ilmassa.
5 Positiiviset täplät tunnistettiin keltaisen värin avulla. Näissä olosuhteissa voitiin todeta n. 30 ng 1 μ1:η täplässä.
Esimerkki V
Kananpojan kuvusta saadun aktiinin affiniteettipuh-10 distetun, kaniinista saadun vasta-aineen spesifisyyden testaaminen aktiinin suhteen, joka esiintyy kananpojan keuhkojen epiteelisolujen sekundääriviljelmistä saadussa kokonaissolulysaatissa, käyttäen blot overlay-immunomääri-tystä ja kullalla merkittyä sekundääristä vasta-ainetta 15 ja tämän jälkeistä hopealla voimistamista.
5.1 Anti-aktiinin antiseerumin valmistus
Elektroforeettisesti puhdas kananpojan kuvun aktiini homogenoitiin ja ruiskutettiin kaniineihin kuten on kuvattu tubuliinin ja kalmoduliinin yhteydessä esimerkissä 20 1.1. Seerumi valmistettiin ja varastoitiin kuten esimer kissä 1.1 on kuvattu.
5.2 Aktiinin vasta-aineen affiniteettipuhdlstus
Aktiini kytkettiin Sepharose-4-B-CNBr:ään (Pharmacia) valmistajan ohjeiden mukaan. Vasta-aine puhdistettiin 25 suoraan seerumista. Jälkimmäistä inkuboitiin antigeeniä sisältävän geelin kera. Käytettiin 20 ml seerumia 10:tä milligrammaa kohti kytkettyä antigeeniä. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen geeli kaadettiin pylvääseen ja pestiin 10 millimoolisella tris-puskuroidulla keittosuolaliuoksel-30 la (TBS), kunnes absorbanssi aallonpituudella 280 nm oli olennaisesti nolla. Ei-spesifinen adsorboiva aines eluoi-tiin TBStllä, jossa oli 1 moolista NaCl:ää ja sitten pestiin TBS:llä. Spesifinen vasta-aine eluoitiin 0,1 mooli-sella glysiini-HCl-puskurilla pH-arvossa 2,8. Yhden mil-35 lilitran fraktiot neutraloitiin välittömästi 100 pl:lla 1 23 8 0 3 4 5 moolista tris-HCl-puskuria, pH 8,5. Vasta-aineen konsent-raatio mitattiin aallonpituudella 280 nm käyttäen E2 % = 14,3. Eluoitujen vasta-aineiden määräosia varastoitiin li-säkäsittelemättä -20° C:ssa.
5 5.3 Kananpoikasikiön keuhkoista saatujen epiteeli solu jenviljely
Kananpoikasikiön keuhkoepiteelisolut eristettiin 14 vrk vanhojen kananpoikasikiöiden keuhkoista. Kudos hienonnettiin käsin ja sitä trypsinoitiin 20 minuuttia 10 37°C:ssa 0,25 %:isessa trypsiinissä Hanksin tasapainotetussa suolaliuoksessa, jossa ei ollut Ca2*- ja Mg2*-ioneja. Reaktio keskeytettiin elatusalustalla ja 10 %:isella FCSrllä. Sentrifugoinnin ja uudelleensuspendoimisen jälkeen solut siirrettiin 75 cm2 T-kolveihin ja annettiin 15 kiinnittyä 12-24 tuntia ennen elatusalustan vaihtamista. Kun oli viljelty 3-5 vuorokautta solut trypsinoitiin nopeasti (2-3 minuuttia) (0,25 %:isessa trypsiiniliuoksessa) ja soluista valmistettiin maljaviljelmiä petrimaljoissa, joiden halkaisija oli 9 cm, ja käytettiin 3-5 vuorokauden 20 kasvun jälkeen eli solujen kasvettua yhteen. Soluja viljeltiin Eaglen minimum essential medium'issa, johon oli lisätty ei-välttämättömiä aminohappoja ja 10 % naudansi-kiöseerumia, kostutetussa 5 % C02/ilmakehässä 37°C:ssa.
5.4 Kananpoikasikiön keuhkoista saatujen epiteeli-25 solujenkokonalssolu-SDS-lysaatin valmistus
Petrimaljoissa (halkaisija 9 cm) kasvaneet solut pestiin Ca2* - ja Mg2 +-ioneja sisältämättömässä PBS:ssä (Dulbecco) ja otettiin talteen kumilastalla ja upotettiin Eppendorf-kärjessä (1,5 ml) absoluuttiseen asetoniin 30 -20°C:ssa. Asetoni haihdutettiin ja kuiva solujäännös liuotettiin kiehuvaan SDS-näytepuskuriin, jossa oli 1 mil-limoolista TAME (proteaasin estoaine). Sentrifugoinnin jälkeen saatu liukenematon aines hylättiin. Tästä lysaa-tista saadut SDS-geelit (Laemmlin mukaan) ajettiin sarja-35 laimennettuina näytepuskurilla ja värjättyinä coomassiesi-nisellä sopivimman näytelaimennuksen arvioimiseksi. Siir- 24 8 0 3 4 5 rettäessä sitten elektroforeettisesti geenin seulontamem-braaniin (valmistaja NEN) käytettiin laimennussuhdetta 1:16. Yksi siirtoyksikkö muodostui yhdestä kaistasta tätä lysaattilaimennosta ja yhdestä kaistasta seosta, jossa oli 5 puhdistettuja vertailuproteiineja Ch. g. filamiini, Ch. g. myosiini (H- + L-ketju), Ch. g. α-aktiini, BSA, rotan-aivotubuliini ja sianmahatropomyosiini, jokaista 0,06 pg kaistaa kohti.
Tämän jälkeen annettiin puskuririntaman laskeutua 10 geelin alapäähän ja elektroforeettinen siirto geenin seu-lontamembrääniin tapahtui samoin kuten esimerkissä 2.3. Blottausyksikkö leikattiin irti ja proteiinin jäljelle jääneet sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi kuten esimerkeissä 1.2 ja 2.3 on kuvattu. Inkubointi aktiinin vas-15 ta-aineen (0,5 pg/ml) ja GAR G20:n (abrorbanssiarvo 520 nm » 0,2) kera ja GAR G20:n laimentaminen 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja 0,4 %:isella gelatiinilla suoritettiin suljetuissa muovipusseissa, joiden koko vastasi suunnilleen arkin kokoa, kumpikin toimenpide kesti kaksi tun-20 tia kuten esimerkissä 2.4 on kuvattu.
Kun oli kaksi tuntia inkuboitu GAR G20:n kera, arkit pestiin 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja preparoitiin hopealla voimistamista varten. Tänä aikana tulivat jo näkyviin aktiinin liikkuessa väriltään vaaleanpunaises-25 ta punertavaan vaihteleva vyöhyke lysaatissa, joka vyöhyke vastasi aktiinia proteiiniseoksessa.
5.5 Hopealla voimistaminen
Arkit pestiin kaksi minuuttia sitraattiperuspusku-rin 1:10-laimennoksessa. Tämä puskuri sisälsi 100 ml:ssa 30 25,5 g trinatriumsitraattia ja 23,5 g sitruunahappoa, pH
4.
Sitten arkkeja inkuboitiin 15 minuuttia, huolellisesti valolta suojattuna, fysikaalisessa kehitteessä, joka sisälsi: 25 80 3 45 60 ml deionoitua vettä 0,85 g hydrokinonia 15,0 ml:ssa deionoitua vettä 10 ml sltraattlpuskurla, pH 4 0,11 g hopealaktaattia 15,0 ml:ssa deionoitua vettä 5 Hopealaktaattl suojattiin huolellisesti valolta ja lisättiin muihin komponentteihin juuri ennen käyttöä.
Reaktioajan päätyttyä arkit pestiin runsaalla vesimäärällä ja käsiteltiin Agefixilla (1:4 vedessä), joka on valokuvauskiinnite.
10 Arkit pestiin uudelleen runsaalla vesimäärällä ja kuivattiin ilmassa.
5.6 Tulokset
Aikaisemmin vaaleanpunaisen-punertavaksi värjäyty-nyt vyöhyke näkyi nyt intensiivisen mustana. Aktiinin vas-15 ta-ainetta voidaan pitää äärimmäisen spesifisenä ja vasta-aineella on saatu hyviä tuloksia värjättäessä immunosyto-kemiallisesti soluviljelmien aktiinipitoisia rakenteita.
5.7 Päätelmät
Hopealla voimistaminen parantaa voimakkaasti totea-20 mismenetelmän kontrastia ja herkkyyttä. Niinpä jatkettaessa esimerkkiä IV kehittämällä värjäytyneet, kolloidisella hopealla merkityt vasta-aineet saatiin toteamisrajaksi vain viiden minuutin reaktion jälkeen 3 ng 30 ng:n asemasta täplää kohti.
25
Claims (13)
1. Menetelmä spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin to-5 teamiseksi tai määrittämiseksi blot overlay-tekniikkaa käyttävien yleismenetelmien avulla, joissa käytetään merkittyjä komponentteja, tunnettu siitä, että merkityt komponentit, jotka on saatu kytkemällä kolloidisiin metallihiukkasiin agglomeraatin haluttu komponentti, joka 10 agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta, tai kytkemällä kolloidisella metallilla merkittyyn sitoja-aineeseen agglomeraatin haluttu komponentti, joka agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriai- 15 neesta, visualisoidaan värisignaalina, joka sijaitsee spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan akseptoriaineen välisen reaktion reaktiokohdassa blottausväliaineen pinnalla, tai määritetään kvantitatiivisesti tässä kohdassa sinänsä tunnetuilla spektrofotometrisillä menetelmillä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifinen sitoja-aine on spesifinen sitojaproteiini.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vai- 25 heet: I) immobilisoidaan akseptoriaine immobilisoivaan matriisiin, II) saatetaan mainittu immobilisoiva matriisi kosketukseen kolloidisilla metallihiukkasilla merkityn spesi- 30 fisen sitoja-aineen kanssa ja III) todetaan värisignaali reaktiokohdassa immobi-lisoivan matriisin pinnalla.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vai- 35 heet: 27 80 345 I) immobi li soidaan akseptoriaine inunobi li soivaan matriisiin, II) saatetaan mainittu immobilisoiva matriisi kosketukseen merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen kanssa 5 ja sitten kolloidisella metallilla merkityn proteiinin kanssa, joka on spesifinen merkitsemättömälle spesifiselle sitojaproteiinille, ja III) todetaan värisignaali reaktiokohdassa immobi-lisoivan matriisin pinnalla.
5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisointivaihe suoritetaan adsorboimalla suoraan ja/tai sitomalla kovalenttises-ti, mahdollisesti sen jälkeen, kun on erotettu elektrofo-reettisesti ja siirretty tai blotattu elektroforeesiväli-15 aineesta blottausväliaineeseen, ja tekemällä sitten jäljellä olevat sitoja-aineelle spesifiset sitoutumiskohdat tehottomiksi sinänsä tunnetuilla menetelmillä.
6. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisointivaihe suorite- 20 taan antamalla akseptoriaineen sitoutua spesifiseen sitojaproteiiniin, joka on immobilisoitu blottausväliaineeseen, saattamalla mainittu blottausväliaine kosketukseen akseptoriainetta sisältävän vesiliuoksen kanssa.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen mene-25 telmä, tunnettu siitä, että kolloidiset metallihiukkaset ovat kultaa, hopeaa tai platinaa tai näiden metallien tai raudan tai kuparin yhdisteitä, ja niiden hiuk-kaskoko on 3-100 nm.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen mene-30 telmä, tunnettu siitä, että kolloidiset metallihiukkaset ovat kulta- ja/tai hopeahiukkasia, joiden hiuk-kaskoko on 3-100 nm.
9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolloidisten metalli- 35 hiukkasten lopullinen toteaminen suoritetaan fysikaalisen kehitteen käyttämisen jälkeen. 28 80345
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fysikaalinen kehite on hopea-pitoinen yhdiste.
11. Testipakkaus, jolla todetaan tai määritetään 5 yksi spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan akseptoriaineen välisessä reaktiossa muodostuvan agglomeraatin komponenteista yleisellä blot overlay-määritysmenetelmällä, tunnettu siitä, että siinä on a) kolloidisilla metallihiukkasilla merkittyjä kom-10 ponentteja, jotka aiheuttavat värisignaalin mainitun spesifisen sitoja-aineen ja mainitun akseptoriaineen välisen reaktion reaktiokohdalla, immobilisoivan matriisin pinnalla; b) fysikaalisen kehitteen komponentteja ja 15 c) muita reagensseja.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että muut reagenssit on valittu seuraavista aineista (i) puskurit, 20 (ii) immunologista sitoutumista optimoivat aineet, (iii) merkitsemätön sitoja-aine ja (iv) kiinnitysaine.
13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen testi-pakkaus käytettäväksi jonkin patenttivaatimuksista 1-10 25 mukaisessa menetelmässä. tl 29 80345
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8331514 | 1983-11-25 | ||
GB838331514A GB8331514D0 (en) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | Visualization method |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI844508A0 FI844508A0 (fi) | 1984-11-16 |
FI844508L FI844508L (fi) | 1985-05-26 |
FI80345B true FI80345B (fi) | 1990-01-31 |
FI80345C FI80345C (fi) | 1992-11-16 |
Family
ID=10552346
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI844508A FI80345C (fi) | 1983-11-25 | 1984-11-16 | Visualiseringsfoerfarande foer direkt eller indirekt detektering av ett agglomerat bildat av ett specifikt bindande aemne och en motsvarande acceptorsubstans vid blot overlay-bestaemningar och i dessa bestaemningar anvaendbar testfoerpackning |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4775636A (fi) |
EP (1) | EP0158746B1 (fi) |
JP (2) | JPH0643998B2 (fi) |
KR (1) | KR890001131B1 (fi) |
AT (1) | ATE64468T1 (fi) |
AU (1) | AU583484B2 (fi) |
CA (1) | CA1253422A (fi) |
CY (1) | CY1759A (fi) |
DE (1) | DE3484710D1 (fi) |
DK (1) | DK160108C (fi) |
ES (1) | ES537926A0 (fi) |
FI (1) | FI80345C (fi) |
GB (1) | GB8331514D0 (fi) |
HK (1) | HK14894A (fi) |
IL (1) | IL73607A (fi) |
NO (1) | NO163754C (fi) |
NZ (1) | NZ210309A (fi) |
PT (1) | PT79533A (fi) |
ZA (1) | ZA849182B (fi) |
Families Citing this family (116)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5622871A (en) | 1987-04-27 | 1997-04-22 | Unilever Patent Holdings B.V. | Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents |
GB8415998D0 (en) * | 1984-06-22 | 1984-07-25 | Janssen Pharmaceutica Nv | Staining method |
US5958790A (en) * | 1984-12-20 | 1999-09-28 | Nycomed Imaging As | Solid phase transverse diffusion assay |
US5512332A (en) * | 1985-10-04 | 1996-04-30 | Immunivest Corporation | Process of making resuspendable coated magnetic particles |
US5137827A (en) * | 1986-03-25 | 1992-08-11 | Midwest Research Technologies, Inc. | Diagnostic element for electrical detection of a binding reaction |
US4837145A (en) * | 1986-06-09 | 1989-06-06 | Liotta Lance A | Layered immunoassay using antibodies bound to transport particles to determine the presence of an antigen |
AU7385387A (en) * | 1986-06-09 | 1987-12-10 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Immunoassay using detection of colloidal gold |
AU602694B2 (en) * | 1986-06-09 | 1990-10-25 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Improved colloidal gold membrane assay |
US5514602A (en) * | 1986-06-09 | 1996-05-07 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of producing a metal sol reagent containing colloidal metal particles |
EP0254081A3 (en) * | 1986-06-30 | 1988-04-20 | Yuko Yoneda | Method of detecting specific protein |
US5491098A (en) * | 1987-03-09 | 1996-02-13 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Method for depositing metal particles on a marker |
CA1340803C (en) * | 1987-03-09 | 1999-10-26 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Method for depositing metal particles on a marker |
USRE38430E1 (en) | 1987-03-27 | 2004-02-17 | Becton, Dickinson And Company | Solid phase chromatographic immunoassay |
ATE225509T1 (de) * | 1987-04-27 | 2002-10-15 | Inverness Medical Switzerland | Testgerät zur durchführung von spezifischen bindungsprüfungen |
US4962023A (en) | 1987-06-22 | 1990-10-09 | Louisiana State University, Agricultural And Mechanical College | Single incubation immuno sorbent assay method using particle labels to detect test antigen specific antibodies in presence of other antibodies |
US5120643A (en) * | 1987-07-13 | 1992-06-09 | Abbott Laboratories | Process for immunochromatography with colloidal particles |
JP2581566B2 (ja) * | 1987-09-30 | 1997-02-12 | 和光純薬工業株式会社 | 鉄コロイド標識抗体及びその製法並びにこれを用いる組織細胞化学的検出方法 |
US5006464A (en) * | 1987-10-01 | 1991-04-09 | E-Y Laboratories, Inc. | Directed flow diagnostic device and method |
US5571667A (en) * | 1987-10-01 | 1996-11-05 | Chu; Albert E. | Elongated membrane flow-through diagnostic device and method |
ES2039025T3 (es) * | 1987-11-16 | 1993-08-16 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Un agregado para determinar sustancias combinables. |
NL8702769A (nl) * | 1987-11-19 | 1989-06-16 | Holland Biotechnology | Werkwijze voor het bepalen in een testmonster van componenten van de reactie tussen een specifiek bindend eiwit en de bijbehorende bindbare stof onder toepassing van ten minste een gemerkte component, werkwijze voor het bereiden van de gemerkte component, en testkit voor de bepaling van immunocomponenten. |
GB8800702D0 (en) * | 1988-01-13 | 1988-02-10 | Nycomed As | Test method & reagent kit therefor |
US4952517A (en) * | 1988-02-08 | 1990-08-28 | Hygeia Sciences, Inc. | Positive step immunoassay |
US5202267A (en) * | 1988-04-04 | 1993-04-13 | Hygeia Sciences, Inc. | Sol capture immunoassay kit and procedure |
WO1989011285A1 (en) * | 1988-05-23 | 1989-11-30 | Steffen Gay | Diagnostics and therapy for rheumatoid arthritis |
AU2684488A (en) | 1988-06-27 | 1990-01-04 | Carter-Wallace, Inc. | Test device and method for colored particle immunoassay |
US5079172A (en) | 1988-11-04 | 1992-01-07 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method for detecting the presence of antibodies using gold-labeled antibodies and test kit |
CA2002660A1 (en) * | 1988-11-10 | 1990-05-10 | Susan J. Mroczkowski | Method for electrical detection of a binding reaction |
US5202268A (en) * | 1988-12-30 | 1993-04-13 | Environmental Diagnostics, Inc. | Multi-layered test card for the determination of substances in liquids |
US5028535A (en) * | 1989-01-10 | 1991-07-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Threshold ligand-receptor assay |
ES2070264T3 (es) * | 1989-06-05 | 1995-06-01 | Janssen Pharmaceutica Nv | Un analisis en fase solida para uso con un revelador fisico. |
GB8915512D0 (en) | 1989-07-06 | 1989-08-23 | Sec Dep For Health | Silver enhanced gold-labelled immuno assay method |
US5698271A (en) * | 1989-08-22 | 1997-12-16 | Immunivest Corporation | Methods for the manufacture of magnetically responsive particles |
US6352863B1 (en) | 1990-01-19 | 2002-03-05 | La Mina, Inc. | Assay device |
US5143852A (en) * | 1990-09-14 | 1992-09-01 | Biosite Diagnostics, Inc. | Antibodies to ligand analogues and their utility in ligand-receptor assays |
WO1992012428A1 (en) * | 1991-01-11 | 1992-07-23 | Quidel Corporation | A one-step lateral flow nonbibulous assay |
US6168956B1 (en) | 1991-05-29 | 2001-01-02 | Beckman Coulter, Inc. | Multiple component chromatographic assay device |
US5607863A (en) * | 1991-05-29 | 1997-03-04 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Barrier-controlled assay device |
US5468648A (en) * | 1991-05-29 | 1995-11-21 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Interrupted-flow assay device |
US5998220A (en) | 1991-05-29 | 1999-12-07 | Beckman Coulter, Inc. | Opposable-element assay devices, kits, and methods employing them |
US5877028A (en) | 1991-05-29 | 1999-03-02 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Immunochromatographic assay device |
US5869345A (en) * | 1991-05-29 | 1999-02-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing conductive barrier |
DE69210048T2 (de) * | 1992-02-25 | 1996-08-29 | Peter Andersen | Verfahren zur elektroeluierung von einem getrennt geladenem makromolekül, wie proteine und dna/rna, enthaltendem gel und vorrichtung und mittel zur anwendung im verfahren |
US5395754A (en) * | 1992-07-31 | 1995-03-07 | Hybritech Incorporated | Membrane-based immunoassay method |
US5340746A (en) * | 1993-01-08 | 1994-08-23 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Composite reactive articles for the determination of cyanide |
CA2105515A1 (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-04 | Carlos A. Santizo Lescaille | Visual immunoassay method for the detection of ligands, based on the use of opaque plastic supports |
US5712172A (en) | 1995-05-18 | 1998-01-27 | Wyntek Diagnostics, Inc. | One step immunochromatographic device and method of use |
US20010051350A1 (en) | 1995-05-02 | 2001-12-13 | Albert Nazareth | Diagnostic detection device and method |
US6551794B1 (en) | 1995-11-09 | 2003-04-22 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stable biotinylated biomolecule composition |
US5691152A (en) * | 1995-11-09 | 1997-11-25 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stable avidin composition |
US5856194A (en) | 1996-09-19 | 1999-01-05 | Abbott Laboratories | Method for determination of item of interest in a sample |
US5795784A (en) | 1996-09-19 | 1998-08-18 | Abbott Laboratories | Method of performing a process for determining an item of interest in a sample |
JP4068677B2 (ja) * | 1996-10-25 | 2008-03-26 | アークレイ株式会社 | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット |
JP4025833B2 (ja) * | 1996-10-25 | 2007-12-26 | アークレイ株式会社 | 遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット並びに遺伝子分析装置 |
US7153651B1 (en) | 1996-10-31 | 2006-12-26 | Inverness Medical - Biostar, Inc. | Flow-through optical assay devices providing laminar flow of fluid samples, and methods of construction thereof |
US5879951A (en) | 1997-01-29 | 1999-03-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing unidirectional flow |
US6103536A (en) * | 1997-05-02 | 2000-08-15 | Silver Lake Research Corporation | Internally referenced competitive assays |
US5939252A (en) | 1997-05-09 | 1999-08-17 | Lennon; Donald J. | Detachable-element assay device |
WO2000021665A1 (en) * | 1998-10-14 | 2000-04-20 | Arizona Board Of Regents | Immobilized silver immunoassay system |
IL126776A (en) * | 1998-10-27 | 2001-04-30 | Technion Res & Dev Foundation | A method of investing gold |
US6136610A (en) | 1998-11-23 | 2000-10-24 | Praxsys Biosystems, Inc. | Method and apparatus for performing a lateral flow assay |
US6136044A (en) * | 1999-02-03 | 2000-10-24 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Stable coloring by in situ formation of micro-particles |
JP2003527584A (ja) * | 2000-03-09 | 2003-09-16 | ヘスカ コーポレイション | 動物の免疫状態を決定するための組換え抗原の使用 |
US6699722B2 (en) | 2000-04-14 | 2004-03-02 | A-Fem Medical Corporation | Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes |
DE10108359B4 (de) * | 2001-02-21 | 2008-03-27 | Enßlin, Walther, Dr. | Nachweisverfahren für reduzierende Substanzen |
WO2002100444A1 (en) * | 2001-06-08 | 2002-12-19 | Biosphere Medical Inc. | Colloidal metal labelled microparticles, their production and use |
US20030013084A1 (en) * | 2001-07-12 | 2003-01-16 | Berlock Aps | Organometallic probe |
DE60325564D1 (de) * | 2002-03-05 | 2009-02-12 | Univ Texas | Biospezifische kontrastmittel |
US7138468B2 (en) | 2002-03-27 | 2006-11-21 | University Of Southern Mississippi | Preparation of transition metal nanoparticles and surfaces modified with (CO)polymers synthesized by RAFT |
EP1549436B1 (en) * | 2002-10-11 | 2014-09-03 | ZBx Corporation | Diagnostic devices |
CA2834041C (en) | 2003-12-31 | 2017-05-16 | President And Fellows Of Harvard College | Assay device and method |
US7638093B2 (en) * | 2004-01-28 | 2009-12-29 | Dnt Scientific Research, Llc | Interrupted flow rapid confirmatory immunological testing device and method |
US7465587B2 (en) | 2004-12-03 | 2008-12-16 | Genzyme Corporation | Diagnostic assay device |
US20060292700A1 (en) * | 2005-06-22 | 2006-12-28 | Naishu Wang | Diffused interrupted lateral flow immunoassay device and method |
WO2007063423A1 (en) | 2005-05-23 | 2007-06-07 | Phadia Ab | Two step lateral flow assay methods and devices |
US20070015166A1 (en) * | 2005-07-14 | 2007-01-18 | Nilsen Thor W | Lateral flow methods and devices for detection of nucleic acid binding proteins |
EP1962093B1 (en) * | 2005-11-25 | 2013-06-12 | Japan Science and Technology Agency | Analysis method |
US7879623B2 (en) * | 2006-03-31 | 2011-02-01 | Guirguis Raouf A | Integrated device for analyte, testing, confirmation, and donor identity verification |
US11906512B2 (en) | 2006-03-31 | 2024-02-20 | Zeus Diagnostics, LLC | Integrated device for analyte testing, confirmation, and donor identity verification |
US8940527B2 (en) * | 2006-03-31 | 2015-01-27 | Lamina Equities Corp. | Integrated device for analyte testing, confirmation, and donor identity verification |
US7741103B2 (en) * | 2006-03-31 | 2010-06-22 | Guirguis Raouf A | Integrated screening and confirmation device |
US7569396B1 (en) | 2006-09-08 | 2009-08-04 | Purplecow Llc | Caffeine detection using internally referenced competitive assays |
US7919331B2 (en) * | 2006-12-21 | 2011-04-05 | Silver Lake Research Corporation | Chromatographic test strips for one or more analytes |
JP4980946B2 (ja) * | 2008-02-12 | 2012-07-18 | 富士フイルム株式会社 | ブロッティング検出方法 |
JP4870695B2 (ja) * | 2008-02-12 | 2012-02-08 | 富士フイルム株式会社 | メンブレン内の標識を洗浄、増幅、停止する方法 |
US8673644B2 (en) | 2008-05-13 | 2014-03-18 | Battelle Memorial Institute | Serum markers for type II diabetes mellitus |
WO2010011860A1 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes |
US20100047913A1 (en) * | 2008-08-19 | 2010-02-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Colloidal Gold Single Reagent Quantitative Protein Assay |
US20100190652A1 (en) | 2009-01-27 | 2010-07-29 | Srinivasa Nagalla | Biomarkers for Detection of Neonatal Sepsis in Biological Fluid |
AU2010209763B2 (en) | 2009-01-30 | 2016-05-12 | Mycartis N.V. | Biomarker for diagnosis, prediction and/or prognosis of acute heart failure and uses thereof |
US8168396B2 (en) | 2009-05-11 | 2012-05-01 | Diabetomics, Llc | Methods for detecting pre-diabetes and diabetes using differential protein glycosylation |
AU2010309808B2 (en) | 2009-10-21 | 2016-04-28 | Mycartis Nv | Biomarker for diagnosis, prediction and/or prognosis of acute heart failure and uses thereof |
EP2504706B1 (en) | 2009-11-25 | 2018-05-23 | Hologic Inc. | Detection of intraamniotic infection |
WO2011117371A2 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Pronota N.V. | Ltbp2 as a biomarker for renal dysfunction |
CA2793487A1 (en) | 2010-04-13 | 2011-10-20 | Pronota N.V. | Biomarkers for hypertensive disorders of pregnancy |
US10670586B2 (en) * | 2010-04-14 | 2020-06-02 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Test instrument for measuring analyte in sample by an aggregation assay using a metal colloid and using a reagent attached in a dry state in a reaction chamber, and method for measuring analyte using same |
WO2011150186A1 (en) | 2010-05-26 | 2011-12-01 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Personal glucose meters for detection and quantification of a broad range of analytes |
AU2011275753A1 (en) | 2010-07-08 | 2013-01-10 | Pronota N.V. | Quiescin Q6 as biomarker for hypertensive disorders of pregnancy |
US8956859B1 (en) | 2010-08-13 | 2015-02-17 | Aviex Technologies Llc | Compositions and methods for determining successful immunization by one or more vaccines |
CA2819886A1 (en) | 2010-12-06 | 2012-06-14 | Pronota N.V. | Biomarkers and parameters for hypertensive disorders of pregnancy |
US20150045245A1 (en) | 2011-12-08 | 2015-02-12 | Biocartis Nv | Biomarkers and test panels useful in systemic inflammatory conditions |
AU2012351504C1 (en) | 2011-12-15 | 2018-04-26 | Mycartis N.V. | Biomarkers and parameters for preeclampsia |
US10139405B2 (en) | 2012-01-24 | 2018-11-27 | Cd Diagnostics, Inc. | System for detecting infection in synovial fluid |
US20140248629A1 (en) * | 2013-03-03 | 2014-09-04 | Morteza Mahmoudi | Gold nanoparticle based dipstick nano-biosensor for detecting plasmodium falciparum and plasmodium vivax and mehtod of synthesizing the same |
US9383352B2 (en) | 2014-03-26 | 2016-07-05 | Diabetomics, Inc. | Salivary protein glycosylation test for diagnosis and monitoring of diabetes |
GB2552427A (en) | 2015-01-29 | 2018-01-24 | Neogen Corp | Methods for immuno chromatographic assay desensitization |
US10584162B2 (en) | 2015-04-23 | 2020-03-10 | Board Of Regents Of The Nevada System Of Higher Education, On Behalf Of The University Of Nevada, Reno | Fungal detection using mannan epitope |
WO2017023929A1 (en) | 2015-08-04 | 2017-02-09 | Cd Diagnostics, Inc. | Methods for detecting adverse local tissue reaction (altr) necrosis |
US10151749B2 (en) * | 2015-08-05 | 2018-12-11 | Alfaisal University | Method and kit for the detection of microorganisms |
WO2017147186A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | Ursure, Inc. | System and method for detecting therapeutic agents to monitor adherence to a treatment regimen |
WO2017178554A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods and kits for the rapid detection of the escherichia coli o25b-st131 clone |
US10564155B2 (en) | 2017-01-27 | 2020-02-18 | Raouf A Guirguis | Dual swab fluid sample collection for split sample testing and fingerprint identification device |
US11061026B2 (en) | 2017-02-17 | 2021-07-13 | MFB Fertility, Inc. | System of evaluating corpus luteum function by recurrently evaluating progesterone non-serum bodily fluids on multiple days |
BR112019019630A2 (pt) | 2017-05-19 | 2020-04-14 | Philip Morris Products Sa | teste diagnóstico para distinguir o status de tabagismo de um sujeito |
WO2019152657A1 (en) | 2018-02-03 | 2019-08-08 | Simple Healthkit, Inc. | Reliable, comprehensive, and rapid sexual health assessment |
US11300576B2 (en) | 2019-01-29 | 2022-04-12 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | DARPin reagents that distinguish Alzheimer's disease and Parkinson's disease samples |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4115198A (en) * | 1974-02-11 | 1978-09-19 | Coughlin Robert W | Method of immobilization of biologically active organic substances including enzymes |
IL49685A (en) * | 1976-05-31 | 1978-10-31 | Technion Res & Dev Foundation | Specific binding assay method for determining the concentration of materials and reagent means therefor |
US4208185A (en) * | 1976-08-16 | 1980-06-17 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
US4203724A (en) * | 1976-08-16 | 1980-05-20 | Mitsubishi Chemical Industries Limited | Method and apparatus for the measurement of antigens and antibodies |
SE431257B (sv) * | 1977-11-03 | 1984-01-23 | Du Pont | Sett och anordning for immunanalys med magnetisk metall eller metalloxid som merksubstans |
NL7807532A (nl) * | 1978-07-13 | 1980-01-15 | Akzo Nv | Metaal-immunotest. |
US4420558A (en) * | 1981-02-12 | 1983-12-13 | Janssen Pharmaceutica N.V. | Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors |
US4487839A (en) * | 1983-01-05 | 1984-12-11 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Immunoassay methods employing patterns for the detection of soluble and cell surface antigens |
CA1260827A (en) * | 1984-08-31 | 1989-09-26 | Richard C. Siegel | Antibody-metal ion complexes |
-
1983
- 1983-11-25 GB GB838331514A patent/GB8331514D0/en active Pending
-
1984
- 1984-10-31 EP EP84201559A patent/EP0158746B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 AT AT84201559T patent/ATE64468T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-10-31 DE DE8484201559T patent/DE3484710D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-07 CA CA000467203A patent/CA1253422A/en not_active Expired
- 1984-11-15 KR KR1019840007168A patent/KR890001131B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-11-16 FI FI844508A patent/FI80345C/fi active IP Right Grant
- 1984-11-21 JP JP59244692A patent/JPH0643998B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-22 PT PT79533A patent/PT79533A/pt unknown
- 1984-11-23 NZ NZ210309A patent/NZ210309A/en unknown
- 1984-11-23 IL IL73607A patent/IL73607A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 AU AU35825/84A patent/AU583484B2/en not_active Expired
- 1984-11-23 NO NO844672A patent/NO163754C/no not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 DK DK557684A patent/DK160108C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 ZA ZA849182A patent/ZA849182B/xx unknown
- 1984-11-23 ES ES537926A patent/ES537926A0/es active Granted
-
1987
- 1987-10-27 US US07/115,652 patent/US4775636A/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-03-17 JP JP5081149A patent/JP2601616B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-02-24 HK HK148/94A patent/HK14894A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-07-15 CY CY175994A patent/CY1759A/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ210309A (en) | 1987-04-30 |
KR890001131B1 (ko) | 1989-04-24 |
IL73607A0 (en) | 1985-02-28 |
US4775636A (en) | 1988-10-04 |
HK14894A (en) | 1994-03-04 |
ZA849182B (en) | 1986-06-25 |
JPH0643162A (ja) | 1994-02-18 |
NO163754C (no) | 1993-01-12 |
JPS60185160A (ja) | 1985-09-20 |
DK160108C (da) | 1995-07-24 |
CY1759A (en) | 1994-07-15 |
NO844672L (no) | 1985-05-28 |
IL73607A (en) | 1988-12-30 |
ATE64468T1 (de) | 1991-06-15 |
JPH0643998B2 (ja) | 1994-06-08 |
PT79533A (en) | 1984-12-01 |
DK557684D0 (da) | 1984-11-23 |
EP0158746A3 (en) | 1987-09-23 |
AU3582584A (en) | 1985-05-30 |
ES8602255A1 (es) | 1985-11-01 |
AU583484B2 (en) | 1989-05-04 |
KR850003728A (ko) | 1985-06-26 |
EP0158746A2 (en) | 1985-10-23 |
GB8331514D0 (en) | 1984-01-04 |
FI844508A0 (fi) | 1984-11-16 |
FI80345C (fi) | 1992-11-16 |
FI844508L (fi) | 1985-05-26 |
DK160108B (da) | 1991-01-28 |
ES537926A0 (es) | 1985-11-01 |
EP0158746B1 (en) | 1991-06-12 |
NO163754B (no) | 1990-04-02 |
DE3484710D1 (de) | 1991-07-18 |
JP2601616B2 (ja) | 1997-04-16 |
CA1253422A (en) | 1989-05-02 |
DK557684A (da) | 1985-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI80345B (fi) | Visualiseringsfoerfarande foer direkt eller indirekt detektering av ett agglomerat bildat av ett specifikt bindande aemne och en motsvarande acceptorsubstans vid blot overlay-bestaemningar och i dessa bestaemningar anvaendbar testfoerpackning. | |
US5958790A (en) | Solid phase transverse diffusion assay | |
US7241418B2 (en) | Method for immobilizing conjugates in diagnostic tests | |
AU693095B2 (en) | Simple immunochemical semiquantitative assay method and apparatus | |
KR920005963B1 (ko) | 특이적으로 결합가능한 물질의 측정방법 | |
JP2005189246A (ja) | 制御された感度の免疫クロマトグラフィー検定 | |
CA2166913A1 (en) | Quantitative detection of analytes on immunochromatographic strips | |
US20140287527A1 (en) | Method and apparatus for time-resolved fluorescence immunoassay testing | |
EP0207152B1 (en) | Solid phase diffusion assay | |
EP1540343B1 (en) | Method for the elimination of interferences in immunochromatographic assays | |
WO1999064863A9 (en) | Colloidal colorimetric flow through and lateral flow assays utilizing soluble submicron particles | |
KR940008091B1 (ko) | 리간드의 면역학적 검출방법 | |
WO1999041611A1 (en) | Assaying of antibodies directed against one or more antigens of helicobacter pylori in biological liquids by a heterogeneous immunologic method of the reverse type | |
CA1323832C (en) | Process for immunochromatography with colloidal particles | |
JP2010025866A (ja) | 非特異反応抑制剤 | |
JP3773339B2 (ja) | 免疫分析用クロマトグラフィストリップ | |
JPH11118801A (ja) | 免疫分析装置 | |
CN117554622A (zh) | 一种微量白蛋白/肌酐联合检测试剂条及其制备方法和应用 | |
Avrameas | Qualitative and Quantitative Immunoenzymatic Techniques | |
Ferenčík et al. | Immunochemical methods |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG | Patent granted |
Owner name: JANSSEN PHARMACEUTICA N.V. |