JP2006522736A - アシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体、モノクロナール抗体からなる免疫クロマトグラフィ用帯状片及びこの免疫クロマトグラフィ用帯状片を用いる肝疾患診断法 - Google Patents

Abstract

本発明は初期肝疾患の迅速診断法に関する。より正確には本発明はアシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクローナル抗体に関する。このモノクロナール抗体を用いて試験試料中のアシアロα１−酸性糖タンパクを評価する肝疾患診断法及びアシアロα１−酸性糖タンパクとトウゴマレクチン（ＲＣＡ）に対するこのモノクロナール抗体からなる免疫クロマトグラフィ用診断帯状片に関する。本発明の診断装置はアシアロα１−酸性糖タンパク濃度測定及び肝疾患の迅速診断に便利である。

Description

本発明は初期肝疾患の迅速診断法に関する。より詳細には本発明はアシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体に関し、肝疾患診断にこのモノクロナール抗体を用いて試験試料中のアシアロα１−酸性糖タンパク濃度測定による肝疾患診断方法とアシアロα１−酸性糖タンパクとトウゴマレクチン（ＲＣＡ）からなる免疫クロマトグラフィ用診断帯状片に関する。本発明の診断装置はアシアロα１−酸性糖タンパク濃度測定及び肝疾患の迅速診断に便利である。

肝炎、肝硬変及び肝臓癌を含む肝疾患は韓国、日本、台湾、中国及び他の東南アジア諸国で最もよく見られる疾患である。今まで患者の尿中のビリルビンやウロビリノゲン含有量を評価し、血液中の生化学成分変化を分析するためにグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ、総ビリルビン、アルブミン、乳酸脱水素酵素や類似体を測定し、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の抗原或いはこれらウイルスに対する抗体を検出して肝疾患を診断してきた。加えて肝硬変はαフェトプロテイン（ＡＦＰ）及び癌胎児抗原（ＣＥＡ）試験で診断できる。しかし肝臓は多様な機能のため複雑な臓器であり非常に特異的で表向きな異常を示さない。更に早期診断法はまだ確立されおらず、肝疾患はひどく悪化した後に診断されるためその治療はしばしば困難になる。

本発明者は肝疾患を臨床的に早期診断し患者の重症度を正確に反映するマーカーを開発し診断キットを作成した。出願書及び論文にこのマーカーが肝疾患診断に卓越した試薬である事を開示した。

具体的に本発明者はその診断法と診断キットを国際特許出願ＰＣＴ／ＫＲ００／００８４０（２０００年８月１日）、米国特許出願０９／６６２，３６３（２０００年９月１３日）及び韓国特許出願１０−２０００−００４０６０９（２０００年７月１４日）に明示し、特定抗体及びレクチンを用いてサンドイッチ酵素結合免疫測定法を用いて血液中のアシアロ糖タンパクを測定する。この技法は再現性があり且つ正確であり肝機能診断及び肝疾患治療に有効であることを確認した。

アシアロ糖タンパクが血清中のマーカーとして肝疾患の予後状態を示す事が報告されている。（ティ．サワムラ（Ｔ．Ｓａｗａｍｕｒａ）等、ガステロエンテロロジー（Gastroenterology）、１９８１、８１卷：５２７−５３３頁；ティ．サワムラ（Ｔ．Ｓａｗａｍｕｒａ）等、ガステロエンテロロジー（Gastroenterology）、１９８４、８７卷：１２１７−１２２１頁）。更にアシアロ糖タンパクはその濃度が肝臓癌の重症度に比例することから、肝臓癌状態の検出に役立つ事が明らかになった。（ティ．サワムラ（Ｔ．Ｓａｗａｍｕｒａ）等、ガストロロジアジャポニカ（Gastrologia Japanoica）、１９８５、２０卷；２０１−２０８頁）。

常とう的にはアシアロ糖タンパクに対する受容体はヒトやウサギやマウスの様な他動物から分離し、アシアロ糖タンパク濃度測定のために捕獲蛋白質として精製利用する。放射性物質で標識化後、競合放射性定量及び電気免疫拡散法を実行する。（ジェイ．エス．マーシャル（J. S. Marshall）等、ジャーナルオブラボラトリークリニカルメディスン (J. Lab. Clin. Med)、１９７８、９２巻、３０−３７頁；エヌ．サーボースーゴーゲル（N. Serbource-Goguel） 等、ヘパトロジー（Hepatology）１９８３、３巻、３５６−３５９頁）。

残念ながら幾つかの問題がある。とりわけ試験キットは大量のアシアロ糖タンパクを必要とするが、アシアロ糖タンパクに対する受容体を大規模に得るのは困難である。競合放射性定量の場合、放射性物質の使用は危険であり廃棄物や類似物処理用特殊施設の設置は困難である。電気免疫拡散法の場合はデータの定量分析が複雑である。特に競合定量は精度及び再現性に欠けるので一般診断キットに適さない。

上記の技術的問題を解決し肝疾患をアシアロ糖タンパク検出により迅速且つ容易に診断するため、本発明者はアシアロα１−酸性糖タンパクに特異なモノクロナール抗体（ＡｓＡＧＰ）、このモノクロナール抗体使用の肝疾患診断法及びこの同方法に利用できる免疫クロマトグラフィ用診断帯状断片の開発を試みた。

本発明の目的は肝疾患の簡便な検出装置と方法を提供することである。

この目的を達成するために本発明者はアシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応しハプトグロビン及びα２−マクログロブリンとは反応しないモノクロナール抗体を提供する。本発明のモノクロナール抗体はアシアロハプトグロビン及びアシアロα２−マクログロブリンと反応しない。好ましくは本発明のモノクロナール抗体はサブクラス免疫グロブリンＧ_１型である。

モノクロナール抗体は既知技術に開示のプロセスで作成できる。（ダヴィドソン、アール．エル．及びピー．エス．ジェラルド（Davison R. L. and P. S. Gerald）１９７６、ポリエチレングリコールによる哺乳類細胞交雑導入の改良手法（Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization by polyethylene glycol）、ソマティック セル ジェネティック（Somatic Cell Genet.）、２巻、１６５―１７６頁；プライス、 シー．及びニューマン、 ディ．（Price C. and Newman D.）編“免疫測定法の原理と実施”（Principles and Practice of Immunoassay）第２版、ニューヨーク、ストックトンプレス社(Stockton Press)中のノット、 シー．エル．、クースーライチェル、 ケイ．、リュー、 アール．及びウオルフェルト、 アール．エル．（Knott C. L., Kuus-Reichel K., Liu R. and Wofert R. L. １９９７、診断検査用抗体の開発（Development of antibodies for diagnostic assays）、３６−６４頁；ジレット、 アール．ダブリュ．１９８７、腹水用原始初回刺激の代変えとモノクロナール抗体生成（Alternatives to pristine priming for ascitic fluid and monoclonal antibody production）、ジャーナル オフ インミュノロジィ メソッド（J. Immunol. Meth.）、９９巻、２１−２３頁；ノーウッド、 ティ．エッチ．、シー．ジェイ．ジーグラー及びジー．エム．マーティン（Norwood T. H., C. J. Zeigler and G. M. Martin）
１９７６、ジメチルスルフォキサイドによるポリエチレングルコール媒介体細胞融合の増
進（Dimethyl sulfoxide enhances polyethylene glycol-mediated somatic cell fusion）、ソマティック セル ジェネティック（Somatic cell Genet.）２巻、２６３−２７０頁。正確には（１）アシアロα１酸性糖タンパクを分離し（２）マウスを免疫する事からなる方法で作成する。

とりわけ上に得たモノクロナール抗体を大規模に作成するにはハイブリドーマ細胞を従来法で作成し、分離、選別しネズミに腹膜注射し腹水から採取する。

具体的にはアシアロα１−酸性糖タンパクは特許出願（ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＫＲ００／００８４０）（２０００年８月１日）、米国特許出願０９／６６２，３６３（２０００年９月１３日）、韓国特許出願１０−２０００−００４０６０９（２０００年７月１４日）に記載の方法で血液を精製する。アシアロα１−酸性糖タンパクをリン酸緩衝液を用いて懸濁し、タイターマックス（Titer Max）を用いて混合し、マウスの免疫に用いる。脾臓細胞と骨髄腫細胞を免疫実験ネズミから分離融合し、酵素結合免疫測定法によりアシアロα１−酸性糖タンパクに特異なハイブロドーマ細胞系列を選択選別する。アシアロα１−酸性糖タンパクに特異なモノクロナール抗体を上述のハイブリドーマ細胞から大規模に作成するため、アシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体を生成するハイブリドーマ細胞を実験マウスに注射し、高濃度ハイブリドーマ細胞含有マウス腹水を採取し、本発明のモノクロナール抗体を分離する。

更に本発明はハプトグロビン及びα２−マクログロブリンを除くアシアロα１−酸性糖タンパクとのみ結合するモノクロナール抗体を大規模に生成できるハイブリドーマ細胞系列を提供する。

ハイブリドーマ細胞から得たアシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体がアシアロα１−酸性糖タンパクに特異的であるかどうかを調べるため、アシアロα１−酸性糖タンパクを先ず電気泳動法及びウエスタンブロット法を用いて分析する。更に本発明のモノクロナール抗体がアシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応し他の糖タンパクは除外するかどうかを酵素結合免疫測定法及び実施例２に示した類似法を用いて調べる。

好ましくは本発明はアシアロα１−酸性糖タンパクに特異なサブクラスグロブリンＧ_１型モノクロナール抗体を生成し、２００２年５月２４日にブダペスト条約に基づく韓国生命工学研究院遺伝子バンク（受付け番号ＫＣＴＣ１０２６１ＢＰ）に寄託したハイ
ブリドーマ細胞系列を提供する。

更に本発明は（１）アシアロα１−酸性糖タンパクとのみ結合しハプトグロビン及びα２−マクログロブリンとは反応しないモノクロナール抗体、レクチンとしてアシアロ糖タンパクを特異的に認識するトウゴマレクチン（以後“ＲＣＡ”と呼ぶ）及び試験試料と反応し、（２）アシアロα１―酸性糖タンパク（ＡｓＡＧＰ）を測定する段階からなる肝疾患検出法を提供する。

本発明の肝疾患検出法で試験試料をマイクロプレート上でサンドイッチ酵素免疫測定法により、免疫クロマトグラフィ用診断帯状片上で酵素免疫測定法により、更に種々の酵素免疫測定法により分析できる。特にこれらの方法のうち免疫クロマトグラフィ用診断帯状片上での酵素免疫測定法が最も便利な方法である。

好ましくは本発明の診断法に利用するモノクロナール抗体は上述のごとくサブクラス免疫グロブリンＧ_１型である。より好ましくはモノクロナール抗体が受付け番号ＫＣＴＣ１０２６１ＢＰとして寄託した本発明のマウスバイブリドーマ細胞系列から作成される。さらにアシアロα１−酸性糖タンパク認識レクチンとしてＲＣＡの利用が好ましい。

本発明はアシアロα１−酸性糖タンパクとのみ結合しヘパトグロビン及びα２―マクログロブリンとは反応しないモノクロナール抗体、アシアロ糖タンパクを認識するＲＣＡレクチンからなる、試験試料中のアシアロα１−糖タンパク濃度を測定し、迅速且つ簡便に肝疾患を診断する免疫クロマトグラフィ用診断帯状片を提供する。

好ましくは本発明は受付け番号ＫＣＴＣ１０２６１ＢＰとして寄託したモノクロナール抗体Ａｓ１６．８９とレクチンとしてＲＣＡ含有免疫クロマトグラフィ用診断帯状片を提供する。本発明の免疫クロマトグラフィ用診断帯状片はモノクロナール抗体と金コロイドの様な微粒子の接合したガラス繊維（ＧＦ）膜と、標準ライン及びアシアロα１−酸性糖タンパク検出の診断用ラインが描かれているニトロセルロース膜（ＮＣ）、試験試料溶液を吸収する試料パッド、非反応物質を廃棄する吸収剤パッド及び上記構成物装填用接着性プラスチック裏打ちからなる。

本発明の免疫クロマトグラフィ用診断帯状片は好ましくはＮＣ膜、ＧＦ膜、試料パッド及び吸収剤パッドの順に接着性プラスチック裏打ち上に部分的に重ね合わせ毛細管現象による物質移行が円滑になるよう取り付ける。

免疫クロマトグラフィ用診断帯状片は従来法で作成できる。好ましくは本発明の診断帯状片はカセット型又は棒型に製作できる。

更に試験試料は好ましくは血液又は血清であり溶出緩衝液を用いて１０倍に希釈し、この溶出緩衝液は好ましくは５％サッカロース、１％ウシ血清アルブミン又はトリトンＸ−１００含有の５０ｍＭホウ酸塩緩衝液である。

本発明の免疫クロマトグラフィ用診断帯状片を以下の様に肝疾患検出に使用する。試験試料を希釈し試料パッドに滴下すると、３乃至５分後に帯状片上に標準ラインと診断用ラインが着色し、その色により試料が肝疾患に陽性であるか否かを判断する。正確にはもし抗体―金接合物を微粒子として選んだ場合、アシアロα１−酸性糖タンパク含有の陽性試料では試験後標準ライン及び判定基準ラインの両者が赤色を示し、正常レベルの（肝疾患患者ではない）アシアロα１−酸性糖タンパク含有の陰性試料では標準ラインのみが赤色を示す。

上述のように本発明の免疫クロマトグラフィ用診断帯状片により、アシアロα１−酸性糖タンパクの限界値、約１．５０μｇ／ｍｌに到達するのを検出でき、肝硬変や肝臓癌患者に存在するアシアロα１−酸性糖タンパク水準を継続評価できれば、肝疾患の初期診断、予後診断、治療を監視出来る。

更に上に説明したようにアシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応しヘパトグロビン及びα２−マクログロブリンとは反応しないモノクロナール抗体とこの物を用いた免疫クロマトグラフィ用診断帯状片により、迅速で便利な試験結果情報がもたらされ、その結果肝疾患を容易に診断できる。それ故肝疾患防止及び治療に寄与することが期待される。
実施例

本発明の実用的で現在の好ましい実施形態を以下の実施例に示すように明らかにする。しかしこの技術に熟知した者にはこの開示を検討すると本発明の精神と範囲内での変更及び改良は理解できる。
実施例１ アシアロα１−酸性糖タンパク（ＡｓＡＧＰ）の分離と精製

ヒト血漿に含まれるアシアロ糖タンパクからα１−酸性糖タンパク（ＡＧＰ）を以下のように分離精製した。

トロンビン２ＮＩＨ単位をヒト血漿２００ｍｌに加え、３７℃で２時間４℃で一晩保存し、遠心分離により血液凝固物を除いた。この作成血清を０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）を用いて透析し、同じ緩衝液を用いて前もって平衡化したＤＥＡＥカラムに加え、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）と０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．３）を混合後線形濃度勾配で溶出した。その後光学密度（ＯＤ）を２８０nmで測定し、そのデータを図１に示す。ＡＧＰ及び他の蛋白質含有フラクションを集め、硫酸アンモニュウムと混合して０．５ｇ／ｍｌとし、遠心分離にかけて蛋白質を沈降した。生成上澄みを再度硫酸アンモニュウムと混合して０．１８ｇ／ｍｌとし、蛋白質を沈降させペレットを少量の蒸留水（Ｄ．Ｗ．）に溶解し、Ｄ．Ｗ．を用いて十分に透析し凍結乾燥した。

上記の分離ＡＧＰ４０ｍｇを０．１Ｎ硫酸６ｍｌを用いて８０℃で２時間加水分解し、１Ｎ苛性ソーダを用いて中和し、０．０１Ｎリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて透析した。上記方法作成の脱シアル酸α１−酸性糖タンパク（ＡｓＡＧＰ）をセファデックスＧ−２００（Sephadex G-200）カラムに加え、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて濾過し、２８０nmのＯＤ値より計算し、最後に蛋白質含有フラクションを集めた。結果を図１に示す。レーン１は蛋白質分子量の標準マーカー、レーン２はα１−酸性糖タンパク、レーン３と４はアシアロα１−酸性糖タンパク（ＡｓＡＧＰ）である。
実施例２ アシアロα１―酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体の作成
（１）マウスの免疫

アシアロα１―酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体を生成するハイブリドーマ細胞系列作成に不可欠な免疫マウスを得るために、抗原としてアシアロα１−酸性糖タンパクをタイターーマックス（Titer-Max）を用いてよく懸濁し、５０μｇ／５０ｍｌ濃度に調整し、年齢６−８週間のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。２週間後に第一回目の注射に記述したと同量の抗原をタイターマックス（Titer-Max）で混合し、同じ場所に繰り返し注射した。同じ方法で抗原を７日後に再度注射し、３週間後繰り返し注射した。その後少量の血液をマウスの尾から採取し力価を評価した。
（２）細胞融合

ハイブリドーマ細胞系列作成のための細胞融合を行うため、マウスを上記のアシアロα１−糖タンパクで免疫し、脾臓細胞及び骨髄腫細胞をマウスから採取した。そこで脾臓細胞１０^８と骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）１０^７を十分洗浄し、混合後ＰＥＧ１５００１ｍｌを約１分間に注ぎ、おおよそ１分間やや攪拌した。その後ＲＰＭＩ媒地９ｍｌをおおよそ３分
間に加え、ゆっくり攪拌しながら最終体積を５０ｍｌとした。細胞懸濁液を遠心分離にかけ細胞ペレットを収集し、再度ＨＡＴ媒地を用いて１−２ｘ１０^５細胞／ｍｌに懸濁し、９６個の凹部付きマイクロプレートに凹部当たり０．２ｍｌずつ注ぎ、炭酸ガス培養器中３７℃で培養した。
（３）モノクロナール抗体作成用ハイブリドーマ細胞の選別

アシアロα１−酸性糖タンパクに特異なハイブリドーマ細胞を選択するため、酵素結合免疫測定法により以下のようにアシアロα１−糖タンパク塗布マイクロプレートの活用を試みた。正確にはアシアロα１−酸性糖タンパク抗原を凹部一個につき１００μｌ（１μｇ／ｍｌ）だけマイクロプレートに注いで表面を塗布し、反応しなかった抗原を洗浄除去した。ハイドローマ細胞培地を各凹部に１００μｌ注ぎ、２時間反応後トゥイーン（Tween）２０リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）を用いて洗浄し、非反応培地を除去した。その後ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を加え、室温で１時間反応し、ＰＢＳＴ溶液を用いて洗い流した。ついでオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）をペリオキシダーゼ基質として用いて反応し、酵素結合免疫測定読み取り機により４９０nmでのＯＤ値測定を検討した。

その結果アシアロα１−酸性糖タンパクと強く結合する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系列を先ず選別し、アシアロα１−酸性糖タンパク抗原に特異なモノクロナール抗体を分泌するハイドローマ細胞を分離するよう選別を繰り返した。生成細胞を限界希釈処理により単クローンにし、モノクロナール抗体生成ハイブリドーマ細胞系列を再度選別した。その後アシアロα１−酸性糖タンパク１及びアシアロα１−酸性糖タンパク２のような最高力価を有する２つのクローンを集め、酵素結合免疫測定法により培地中上澄み液の力価測定を試み、サブユニット型モノクロナール抗体を二重免疫拡散法により分析した。その結果本発明のクローンから分泌した抗体はそれぞれ免疫グロブリンＧ_１と免疫グロブリンＭであると同定した。

免疫グロブリンＧ_１分泌細胞系列をＡＳ１６．８９と名付け２００２年５月２４日に韓国生命工学研究院の遺伝子銀行に寄託した。（受付け番号ＫＣＴＣ１０２６１ＢＰ）
（４）モノクロナールクローン抗体の大規模作成と精製

ハイブリドーマ細胞から大規模にモノクロナール抗体を作成するため、プリスタン０．５ｍｌをＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注射した。１週間後上述の方法（３）で得た各細胞系列をマウス一匹あたり細胞５ｘ１０^６個実験用マウスに注射し、膨潤した場合腹腔から腹水
を採取した。腹水を１２，０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を集め、生成上澄み液を蛋白質Ｇカラムにより濾過し、アシアロα―１酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体を分離精製し、次の実験のためにー２０℃で保存した。
（５）ウエスタンブロット法によるモノクロナール抗体特異性の同定

アシアロ糖タンパクに特異なモノクロナール抗体の物性を解明するため、上記の方法（４）で精製したアシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法とウエスタンブロット法の実施により同定した。（図２参照）。ウエスタンブロット法は既知技術の典型的方法によりおこなった。図２でレーン１は蛋白質分子量の標準マーカー、レーン２はα１−酸性糖タンパク、レーン３はアシアロα１−酸性糖タンパク、レーン４はα２−マクログロブリン及びレーン５はハプトグロビンである。
（６）酵素免疫化学的測定法によるモノクロナール抗体特異性の同定

アシアロα１−糖タンパク、ハプトグロビン、α２−マクログロブリン抗原を９６個の凹部付きマイクロプレート凹部一個当たり１００μｌ（１μｇ／ｍｌ）ずつ加えて表面に付着し、１００μｌずつ加えたアシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体と２時間反応し、リン酸緩衝液―ツィイーン(Tween)２０（ＰＢＳＴ）で洗い流して未反応培地を除去した。更にヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ―ＨＲＰを加え、室温で１時間反応し、ＰＢＳＴ溶液を用いて十分に洗浄した。その後オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）をペルオキシダーゼ基質として加えて反応し、酵素結合免疫測定読み取り機により４９０nmでのＯＤ値を測定した。その結果上記精製アシアロα１−糖タンパクに対するモノクロナール抗体はアシアロα１−酸性糖タンパクに特異なモノクロナール抗体であることを確認した。（図３参照）図３でＡＧＰはα１−酸性糖タンパク、ＡｓＡＧＰは本発明のアシアロα１−酸性糖タンパクである。
実施例３ 免疫クロマトグラフィ用診断キットによる肝疾患の検出

試験試料中のアシアロα１−酸性糖タンパク濃度を上記作成アシアロα１−酸性糖タンパクに特異なモノクロナール抗体Ａｓ１６．８９と血液中のアシアロα１−酸性糖タンパク間の免疫反応により測定できる本発明の免疫クロマトグラフィ用診断キットを下記のように作成し臨床領域に応用した。
（１）免疫クロマトグラフィ用診断キットの作成

血液中のアシアロα１−酸性糖タンパク検出用診断キットは以下に記述する下記構成要素
からなる。
Ａ．マイクロプレートの様な固体担体上に固定したアシアロα１−酸性糖タンパク用モノクロナール抗体（Ａｓ１６．８９）
Ｂ．アシアロα１−酸性糖タンパクに対するレクチン（ＲＣＡ）―西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）
Ｃ．試料希釈用緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）
Ｄ．酵素基質溶液（ＯＰＤ）
Ｅ．洗浄用緩衝液（ＰＢＳＴ）
Ｆ．アシアロα１−酸性糖タンパク標準溶液
Ｇ．停止用緩衝液
（２）測定

ａ．アシアロα１−酸性糖タンパク標準溶液（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌずつモノクロナール抗体Ａｓ１６．８９が固定されたマイクロプレート上に注いだ。正常人４１人、非肝疾患患者１５５人、急性肝炎患者３６人、慢性肝炎（ＣＨ）患者２７２人、肝硬変患者２３０人、肝硬変肝臓癌（ＨＣＣ）患者７２人を含む実験試料を聖マリア病院（St. Mary Hospital）、カソリック医学校 (Catholic Medical School)から得た。血液試料を希釈用緩衝液で比１：１０に希釈し、１００μｌずつマイクロプレートの各凹部に割り当て、室温で１２０分間培養した。
ｂ．反応後洗浄緩衝液を凹部一個当たり１００μｌ加え、三回繰り返し洗浄した。
ｃ．この作成工程により希釈したレクチン（ＲＣＡ）―ＨＲＰをマイクロプレートの各凹部に割り当て、室温で６０分間反応した。
ｄ．ステップｂを繰り返した。
ｅ．酵素基質溶液（ＯＰＤ）を上記マイクロプレートの各凹部に１００μｌずつ割り当てた。
ｆ．停止用緩衝液を１００μｌずつ各凹部に加えて酵素反応を停止した。
ｇ．酵素結合免疫測定読み取り機により４９０nmでのＯＤ値を測定した。

その結果血液中のアシアロα１−酸性糖タンパク含有量を表１に示すように上記方法で評価した。

表１
血液ＡｓＡＧＰの測定
（限界値：１．５０μｇ／ｍｌ）

従って正常者と非肝疾患患者のアシアロα１−酸性糖タンパク（ＡｓＡＧＰ）濃度は平均レベルで１．００μｇ／ｍｌ以下であり、ＡｓＡＧＰ濃度が１．５０μｇ／ｍｌを越える試料数は約１０％であることを確認した。急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝硬変肝臓癌の患者グループではＡｓＡＧＰの血液レベルはそれぞれ平均１．３３μｇ／ｍｌ、１．６３μｇ／ｍｌ、３．１２μｇ／ｍｌ及び３．６４μｇ／ｍｌと評価された。ＡｓＡＧＰが１．５μｇ／ｍｌを越す試料割合がそれぞれ２５％、３６％、７２％及び８２％ではあるが、この濃度は標準グループの濃度と明白に区別できる。それ故この試験は肝疾患診断に有効である事が立証された。

従って上記のデータにより本発明のモノクロナール抗体Ａｓ１６．８９を酵素免疫測定法として用いると、肝疾患診断限界値は１．５０μｇ／ｍｌと決定された。
実施例４ 免疫クロマトグラフィ用診断帯状片の作成
（１）モノクロナール抗体―金接合体の作成

本発明で選択したアシアロα１―酸性糖タンパクに特異なモノクロナール抗体を１５μｇ／ｍｌ金粒子コロイド溶液に加え、室温で２時間反応回転した。ついで１０％ＢＳＡを体積で１／１０に混合して１％濃度にし、更に１時間反応して抗体―金接合体を作成した。その後この生成物を１２０００ｒｐｍで４０分遠心分離し上澄み液を廃棄後、２ｍＭホウ酸塩緩衝液を加えて抗体―金接合体を洗浄した。生成物を３回繰り返し洗浄し、最後に１％ＢＳＡ含有２ｍＭホウ酸塩緩衝液を金溶液体積の約１／１０だけ加え懸濁した。紫外分光器測定で、５３０nmでのＯＤ値が３．００になるように希釈調整した。
（２）試料パッド

試料パッドは試験試料吸収部材で、この目的のためのセルロース材から出来ている。
（３）ガラス繊維（ＧＦ）膜

ガラス繊維はその上でＡｓＡＧＰ試験試料と本発明方法で作成のモノクロナール抗体とを反応させる構成材である。ＧＦ膜表面を金コロイド粒子―Ａｓ１６．８９で塗布し、下記のようにして作成した。

本発明のハイブリドーマ細胞系列Ａｓ１６．８９から作成したモノクロナール抗体をステップ１に示す膜に接合した。

ミリポア社（Millipore Co. Ltd）から購入のＧＦ膜（１．０ｃｍＸ０．７ｃｍ）を２０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液に浸し、乾燥して、その表面に金コロイド粒子―Ａｓ１６．８９を均一に吹きつけ、３７℃で乾燥して表面上に着色用粒子と結合したモノクロナール抗体が固定された免疫クロマトグラフィ用ＧＦ膜パッド（又接合パッドも）を作成した。。
（４）ニトロセルロース（ＮＣ）膜と線引き

ミリポア社（Millipore Co. Ltd）から購入のニトロセルロース膜を適当な大きさ（０．７ｃｍＸ５ｃｍ）に切り、プラスチック裏打ちの底から約３．４ｃｍ地点に標準ラインとしてヤギ抗マウス免疫グロブリンＧで、２．７ｃｍ地点にアシアロα１−酸性糖タンパク検出用判定基準ラインとしてイーワイラボ（EY Lab）から購入のＲＣＡで線引きし、乾燥してＮＣ膜を完成した。
（５）吸着剤パッド

セルロース膜を用いて免疫反応後試験試料中の未反応物質を吸収し、毛管現象による試料溶液移動に用いた。
（６）免疫クロマトグラフィ用診断帯状片の作成

図４aと図４ｂに示すように上記膜を接着性プラスチック裏打ち上に取り付けた。正確にはＮＣ膜、ＧＦ膜、試料パッド及び吸着剤パッドの順で毛管現象により基質が滑らかに移動するように平均に約０．１ｃｍだけ覆われるように配置し、固定した。
実施例５
免疫クロマトグラフィ用診断帯状片を用いるアシアロα１−糖タンパク分析

血清試料を溶出緩衝液（５％サッカロース、１％ウシ血清アルブミン又は１％トリトンＸ−１００含有ホウ酸塩緩衝液５０ｍＭの様な）を用いて１：１０の割合で希釈し、標準ラインと判定基準ラインが３―５分後に発色するかどうかを検査するため、実施例４で作成の免疫クロマトグラフィ用診断帯状片試料パッド上に６０−７０μｌの量を加えた。

図５に免疫クロマトグラフィ用カセット型帯状片の結果を示す。Ｎｏ１はα１−酸性糖タンパク（ＡＧＰ）、ハプトグロビン及びα２−マクログロブリン混合物滴下標準片、Ｎｏ２は正常者血清の診断帯状片、Ｎｏ３―Ｎｏ６はそれぞれアシアロα１―酸性糖タンパクの１．５μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、３．０μｇ／ｍｌ及び４．０μｇ／ｍｌの帯状片である。図５に示すようにＮｏ３ではラインははっきりしないがＮｏ４―Ｎｏ６では標準ライン（上部）及び判定基準ライン（下部）の両者で赤色が明白である。

本発明の免疫クロマトグラフィ用帯状片においてアシアロα１−酸性糖タンパク限界値１．５０μｇ／ｍｌ以下の正常者試験試料では、抗原―抗体―酵素接合錯体が生成しないため、標準ラインのみが赤色になるのが観察される。一方アシアロα１−酸性糖タンパクレベルが肝疾患のため１．５０μｇ／ｍｌ以上に増加すると、アシアロα１−酸性糖タンパクは試料パッドに吸収され、ＧＦ膜上の金粒子―モノクロナール抗体Ａｓ１６．８９接合体と反応して免疫錯体を形成し、毛管反応によりＮＣ膜上に移動し、ＮＣ膜上の判定基準ラインのＲＣＡと結合して金沈殿を生成し、両ラインが赤色になる。更に判定基準ラインはアシアロα１−酸性糖タンパク濃度に依存してその色濃度を変化出来る。それ故試験試料中のアシアロα１−糖タンパク濃度により肝疾患の重症度を推定できる。

上に説明したようにアシアロα１―酸性糖タンパクに特異なモノクロナール抗体及び本発明と同一物を用いた免疫クロマトグラフィ用診断キットは血液試料中のアシアロα１−酸性糖タンパクの迅速且つ簡便な評価に利用できる。従って本発明のモノクロナール抗体及
び診断装置は肝疾患の重症度、治療及び予後を有効に監視できる。

この技術に熟知の者には、以前に開示の概念及び特定実施形態が本発明と同一目的で実施する他実施形態の改良又は設計基準として容易に利用出来る事が判る。

この技術に熟知の者にはこのような相当実施形態が付記請求項に示した本発明の精神と範囲を逸脱しないことが判る。

本発明の上記及び他の目的、特性及び他の利点は付記図面と関連して以下の詳細記述からより明快に理解できる。ここで
ナトリウムドデシルポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）実施による血漿精製α１−酸性糖タンパク（ＡＧＰ）及び脱シアル酸α１−酸性糖タンパク質を表す。 ウエスタンブロット法実施による本発明のハイブリドーマ細胞系列から作成したアシアロα１−酸性糖タンパクに対するモノクロナール抗体を示す。 アシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応しハプトグロビン及びα２−マクログロブリンとは反応しない酵素結合免疫測定法実施による本発明の作成モノクロナール抗体を示す。 本発明の作成免疫クロマトグラフィ用診断帯状片の平面図を示す。 本発明の作成免疫クロマトグラフィ用診断帯状片の正面図を示す。 本発明の作成免疫クロマトグラフィ用カセット型診断帯状片を用いた測定結果を示し濃度依存モードでのアシアロα１−酸性糖タンパクを示す。

Claims (20)

1. アシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応し且つハプトグロビン及びα２−マクログロブリンを除外するモノクロナール抗体。
2. サブクラス免疫グロブリンＧ_１型である請求項１によるモノクロナール抗体。
3. アシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応し且つハプトグロビン及びα２−マクログロブリンを除外するモノクロナール抗体の大規模作成細胞系列。
4. 免疫マウスから抽出した脾臓細胞及び骨髄腫細胞をアシアロα１−酸性糖タンパクと融合して作成する請求項３による細胞系列。
5. アシアロα１−酸性糖タンパクに特異なサブクラス免疫グロブリンＧ_１型モノクロナール抗体を作成し、且つブタペスト条約に基づき２００４年５月２４日に韓国生物科学生物工学研究所（Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology）の遺伝子銀行に寄託した（受付け番号ＫＣＴＣ１０３４９ＢＰ）請求項４による細胞系列。
6. アシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応し且つハプトグロビン及びα２−マクログロブリンを除外するモノクロナール抗体及び試験試料と反応してアシアロα１−酸性糖タンパク（ＡｓＡＧＰ）量を測定するアシアロ糖タンパク認識可能なＲＣＡレクチン（トウゴマレクチン）による肝疾患診断法。
7. モノクロナール抗体が受付け託番号ＫＣＴＣ１０２６１ＢＰの寄託マウス細胞から生成したサブクラス免疫グロブリンＧ_１である請求項６による肝疾患診断法。
8. 試験試料が血液又は血清である請求項６による肝疾患診断法。
9. ハプトグロビン及びα２−マクログロブリンを除くアシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応するモノクロナール抗体、レクチンとしてアシアロ糖タンパクを認識するＲＣＡレクチン及びアシアロα１―酸性糖タンパクが１．５０μｇ／ｍｌ以上の試験試料と反応して肝疾患を検出することからなる免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
10. モノクロナール抗体が受付け番号ＫＣＴＣ１０２６１ＢＰの預託したＡｓ
    １６．８９である請求項９による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
11. モノクロナール抗体がコロイド型金粒子のような微粒子と接合した請求項９による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
12. （１）モノクロナール抗体と接合した微粒子塗布ガラス繊維（ＧＦ）、（２）糖タンパク検出用標準ラインと診断用ラインを含むニトロセルロース膜（ＮＣ）、（３）試験試料用試料パッド、（４）未反応物用吸収剤パッド及び（５）上記部材取り付け用接着性プラスチック裏打ちからなる請求項１１による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
13. ＮＣ膜、ＧＦ膜、試料パッド及び吸収剤パッドがこの順に部分的にこの接着性プラスチック裏打ちを覆い毛管反応で物質を移動しかつＲＣＡバンドを診断用ラインとして抗体バンドを標準ラインとしてある間隔で分離する請求項１２による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
14. この試験試料が溶出緩衝液を用いて１０倍に希釈した血液又は血清である請求項９による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
15. この溶出緩衝液が５％サッカロース、１％ウシ血清アルブミン又は１％トリトン含有５０ｍＭホウ酸塩緩衝液である請求項１４による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
16. 標準ラインと診断用ラインがこの帯状片上で着色し肝疾患が陽性であることを示す請求項９による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
17. カセット型である請求項９による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
18. 棒形である請求項９による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
19. アシアロα１−酸性糖タンパクとのみ反応しハプトグロビン及びα２−マクログロブリンを除去するモノクロナール抗体、レクチンとしてアシアロ糖タンパクを認識するＲＣＡレクチン（トウゴマレクチン）及びアシアロα１―酸性糖タンパクが１．５０μｇ／ｍｌ以上の試験試料と反応して肝疾患を検出することからなる免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
20. モノクロナール抗体が受付け番号ＫＣＴＣ１０２６１ＢＰの寄託したＡｓ１６．８９である請求項１９による免疫クロマトグラフィ用診断帯状片。
    
    
    

Images