CN104374919B - 糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能比过去更精准地检测肝病的糖链标志物糖蛋白的测定方法。本发明提供一种能比过去更精准地检测肝病的肝病检查方法。本发明提供一种用于上述测定方法的糖蛋白定量用试剂。本发明还提供一种能够根据肝病病情发展区别肝病病情的肝病病情指标糖链标志物糖蛋白。本发明提供的糖蛋白测定方法是对采自受检者的试样中所含α‑1‑酸性糖蛋白(AGP)和Mac‑2‑结合蛋白（M2BP）至少其中之一的糖蛋白进行测定，当糖蛋白为AGP时，测定与选自AOL和MAL的第一凝集素结合的AGP，当糖蛋白为M2BP时，测定与选自WFA、BPL、AAL、RCA120和TJA‑II的第二凝集素结合的M2BP。

Description

糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物
本申请是申请号为201080040972.3、申请日为2010年7月14日、名称为“糖蛋白质的测定方法、肝病的检查方法、糖蛋白质定量用试剂及肝病病情指标糖链标记糖蛋白质”的由同一申请人提交的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域：
本发明涉及以下内容：选自α-1-酸性糖蛋白(AGP)和Mac-2-结合蛋白（M2BP）中至少其中之一的糖蛋白测定方法；使用了选自AGP和M2BP中至少一种糖蛋白的肝病的检查方法；以及能够根据糖链的不同检测出基础肝病（underlying liver）状态，即检测出肝细胞癌和炎症、纤维化等的糖链标记物糖蛋白。
背景技术：
肝癌大致可以分为在肝脏发生的原发性肝癌和转移性肝癌，普遍认为，原发性肝癌的90%都是肝细胞癌。
在肝细胞癌患者的基础疾病中，大多是感染C型肝炎病毒或B型肝炎病毒，并从急性病毒性肝炎转为慢性病毒性肝炎、肝硬化，大多数情况下，从患病毒性肝炎起，再经过很长一段时间才会发生癌变。在肝硬化中，由于炎症和再生会反复进行，所以正常肝细胞减少，从而变为由纤维组织构成的器官。比如，仅日本就有300万的C型肝炎患者，在中国和非洲据说有1000多万人。B型和C型肝炎患者从慢性肝炎转为癌症的比率如下：轻度慢性肝炎（F1）的年率为0.8%，中度慢性肝炎（F2）的年率为0.9%，而重度慢性肝炎（F3）的年率达到3.5%，肝硬化（F4）转为癌症的概率则上升为年率7%（图1、2）。患肝病时，随着病情的发展，组织学图像会发生变化（图3），如首先在慢性肝炎中，肝功能开始消失，然后，在肝硬化中出现病态结构，肝脏逐渐纤维化等。
在癌症治疗中，癌症的早期发现非常重要，在肝细胞癌中也是同样，早期发现癌症对治疗和术后预后有很大影响。进行了肝切除治疗后的5年存活率在I期为80%，在IV期则不过38%。
迄今为止已知的肝癌标记物有甲胎蛋白（AFP）和通过维生素K缺乏或拮抗剂II诱导的蛋白质（PIVKA-II）（专利文件1、2），但其特异性和灵敏性都不够。因此，现在为了尽早发现肝癌，在检查和诊断中往往使用肝癌标记物、以及超声波检查、计算机断层摄影（CT）、核磁共振成像法（MRI）等图像检查。
非专利文件1所记述的内容中做了以下尝试：用AAL凝集素测定血清中的岩藻糖基化AGP，检测出肝硬化。然而，从其表2所述结果可以看出，在非专利文件1中的技术中，灵敏性为66%左右，特异性为87%，正确诊断率为77%左右，其肝病检测功能不能令人十分满意。
非专利文件2中记述有如下实验：通过使用RCA凝集素的免疫色谱法，测定健康人、急性肝炎患者、慢性肝炎患者、肝硬化患者和肝细胞癌患者的血清中的缺乏唾液酸基的AGP（asialo AGP），以验证能否对各种肝病作出阳性判断。然而，从其表2所述结果可以看出，非专利文件2中的技术中，肝硬化的灵敏度为88%左右，但是慢性肝炎患者中的假阳性率达到了63%，从肝病检测功能上来看不能令人满意。
在先技术文献
专利文件
专利文件1：特开平10-26622号
专利文件2：特开平8-184594号。
非专利文件
非专利文件1：Ingvar Ryden等,α1-酸性糖蛋白岩藻糖基化在接受肝活检患者中的肝硬化诊断准确性，《临床化学》48:12，2195-2201(2002)（Diagnostic Accuracy of α1-Acid Glycoprotein Fcosylation for Liver Cirrhosis in Patients UndergoingHepatic Biopsy，Clinical Chemistry 48:12，2195-2201(2002)）
非专利文件2：Eun Young Lee等,用于检测肝病患者的血清缺乏唾液酸基的α1-酸性糖蛋白的快速免疫色谱法试纸的进展，《免疫法杂志》，308(2006)116-123（Developmentof a rapid, immunochromatographic strip test for serum asialo α1-acidglycoprotein in patients with hepatic disease, Journal of ImmunologicalMethods 308(2006)116-123）。
发明内容：
发明要解决的课题
本发明的课题在于：提供一种能够比过去更精准地检测肝病的糖链标记物糖蛋白的测定方法。本发明的课题在于：提供一种能够比过去更精准地检测肝病的肝病检查方法。本发明的课题在于：提供一种用于上述测定方法的糖蛋白定量用试剂。本发明的课题还在于：提供一种肝病病情指标糖链标记物糖蛋白，该糖链标记物糖蛋白能够区分开与肝病的进展情况相应的肝病病情。
解决课题的手段
选自以下物质中的至少一种的糖蛋白测定方法，其中上述物质为采自受检者的试样中所含α-1-酸性糖蛋白(AGP)和Mac-2-结合蛋白（M2BP），在该糖蛋白测定方法中，当糖蛋白为AGP时，测定与第一凝集素结合的AGP，其中所述第一凝集素选自AOL和MAL，当糖蛋白为M2BP时，测定与第二凝集素结合的M2BP，其中所述第二凝集素选自WFA、BPL、AAL、RCA120和TJAII。
发明的效果
用本发明的测定方法可以简便地测定糖链标记物糖蛋白，其中该糖链标记物糖蛋白能够高可信度地检查肝硬化等肝病。
用本发明的肝病病情指标糖链标记物糖蛋白所进行的检查中，其正确诊断率比现有的标记物高，且用微量血清即可检查，通过本发明的肝病病情指标糖链标记物糖蛋白，不仅能监视肝纤维化的进展情况，把握病情发展，还能够对进行了干扰素等抗病毒疗法后的肝纤维化和炎症的改善进行评估。
附图说明：
[图1]显示的是从感染C型肝炎到患肝细胞癌的时间推移和肝状态的变化；
[图2]为由慢性肝炎转为肝细胞癌的比率的示图；
[图3]为肝硬化转为肝细胞癌的比率示图；
[图4]为基础肝组织的变化与患癌的关系图；
[图5]为从感染到患癌的肝结构变化的示图；
[图6]显示的是肝的状态变化与诊断治疗方案的关系；
[图7]为以凝集素微阵列为基础的生物标记物候选分子的验证实验的步骤流程图；
[图8]是一张结果图，其显示的是通过抗体铺覆凝集素微阵列对肝病病情指标标记物糖蛋白之一的α1酸性糖蛋白(AGP)进行比较糖链分析的结果；
[图9]是一张结果图，其显示的是通过抗体铺覆凝集素微阵列，对肝病病情指标标记物糖蛋白之一的90K/Mac-2-结合蛋白（M2BP）进行比较糖链分析的结果；
[图10]的附图显示的是以下两者之间的相关性：肝脏的纤维化进展、以及通过AGP的抗体铺覆凝集素阵列分析获得的凝集素信号强度变化；
[图11]显示的是：根据肝病病情指标糖链标记物，即AGP的抗体铺覆凝集素微阵列分析而制定的肝硬化检测方案；
[图12]是将AGP作为能够监视肝脏的纤维化进展的标记物的干扰素的治疗的效果判断图；
[图13]为在第一快速测定法中使用DSA时的稀释线性示意图；
[图14]为在第一快速测定法中使用MAL时的稀释线性示意图；
[图15]为在第一快速测定法中使用AOL时的稀释线性示意图；
[图16]为在第一快速测定法中，对市场出售的样本使用MAL时的测定结果示意图；
[图17]为在第一快速测定法中，对市场出售的样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图18]为在凝集素阵列法中，对市场出售的样本使用MAL时的测定结果示意图；
[图19]为在凝集素阵列法中，对市场出售的样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图20]为在第二快速测定法中使用DSA时的稀释线性示意图；
[图21]为在第二快速测定法中使用MAL时的稀释线性示意图；
[图22]为在第二快速测定法中使用AOL时的稀释线性示意图；
[图23]为在第二快速测定法中，对市场出售的样本使用MAL时的测定结果示意图；
[图24]为在第二快速测定法中，对市场出售的样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图25]为在第二快速测定法中对临床样本使用MAL时的测定结果示意图；
[图26]为在第二快速测定法中对临床样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图27]为在凝集素阵列法中对临床样本使用MAL时的测定结果示意图；
[图28]为在凝集素阵列法中对临床样本使用AOL时的测定结果示意图；
[图29]是以125例HCV感染患者的血清为对象，用第二快速测定法进行测定后的结果示意图；
[图30]是以100例健康者的样本为对象，用凝集素阵列法和第二快速测定法进行测定后的结果的比较图；
[图31]的附图显示的是以下两者之间的相关性：肝脏的纤维化进展、以及通过M2BP的抗体铺覆凝集素阵列分析获得的凝集素信号强度的变化；
[图32]为肝细胞癌患者术前术后的血清中M2BP上糖链变化的示图；
[图33]为检测WFA结合性M2BP的最佳方式，即凝集素-抗体三明治型ELISA的模型图；
[图34]为肝癌症患者术后血清中WFA结合性M2BP量的随时间变化的示意图；
[图35]显示的是用ELISA检测WFA结合性M2BP时，样本加热处理的有无对检测灵敏性的影响；
[图36]显示的是在用第二快速测定法测定M2BP时，在以HepG2培养细胞的上清为试样的情况下，使用WFA进行测定的稀释线性示意图；
[图37]显示的是在用第二快速测定法测定M2BP时，在以重组人半乳糖凝集素-3BP（Recombinant Human Galectin-3BP）/MAC-2BP为试样的情况下，使用WFA进行测定的稀释线性示意图。
具体实施方式：
1. 慢性肝病的现状
1-1. 肝病的病情
人在感染B型肝炎病毒或C型肝炎病毒后，从急性期炎症开始，经过5-15年会发展为慢性期炎症。特别是进入慢性期的C型肝炎很少自愈，肝功能会逐渐降低，直至肝硬化。图1显示的是从感染C型肝炎起，直到发展为肝细胞癌的时间推移与肝状态的变化。为了定义从慢性肝炎到肝硬化的病情，从病理形态学角度捕捉肝脏的格利森区域（Glisson）和肝小叶的纤维性变化，并将其分类为轻度（F1）、中度（F2）、重度（F3）和肝硬化期（F4）。纤维化进展与肝细胞癌患癌风险的上升之间存在关联，如图2所示，F1或2的年率为1%以下，与此相对应，F3中上升到每年3-4%。在对纤维化程度进一步发展的组织学图像进行确认，并诊断为肝硬化的（F4）中，如图3所示，肝细胞癌出现的概率为年率7%。因此，为了有效发现并治疗肝细胞癌，重要的是简便地甄别出处于F3及F4状态的患者，并将其作为精密检查的对象进行跟踪。
在日本的B型肝炎和C型肝炎患者医疗补助事业中，主要针对的对象是：在肝活检标本的病理组织学诊断中，判断为纤维化程度为F1-3的患者。当诊断为F4时，将其归类为肝硬化，在干扰素治疗的B型肝炎和C型肝炎患者医疗补助事业中，仅有其中的一部分成为补助对象，无法取得满意的治疗结果。
1-2. 对于抗病毒疗法控制纤维化进行评估
慢性C型肝炎适用于PEG-IFN+RBV疗法，C型肝炎硬化代偿期则适合单独用干扰素治疗。另一方面，B型肝炎（慢性肝炎、肝硬化）的治疗中主要使用核酸类似物，因此必须有炎症和纤维化评估标记物。尤其是血清生物标记物有望广泛应用于临床诊断和评估。
1-3. 肝细胞癌
一般认为，患肝细胞癌是由于以下两种因子活跃地交互作用所致：B型肝炎病毒或C型肝炎病毒感染所产生的微生物学因子、以及环境因子。在日本，已知肝细胞癌患者的约9成感染过B型肝炎或C型肝炎病毒，肝细胞癌患者的约9成出现在慢性肝炎和肝硬化患者中。据认为，肝细胞癌的癌变危险因子中，除病毒以外，还有男性、高龄、大量饮酒、抽烟、以及毒枝菌素中的黄曲霉毒素等。（肝癌诊疗指南,（财）国际医学情报中心）。
1-4. 肝细胞癌的早期诊断
目前，肝细胞癌的发现主要靠以下方法：测定受检者血清样本中的AFP和PIVKA-II等肝癌标记物、以及以超声波检查（回声检查）为中心的图像诊断。在图像诊断中，通常将超声波检查或CT作为初次检查，这些检查中发现某种异常时，再做MRI和血管造影。
1-5. 从预防肝细胞癌的观点出发，筛选癌症高危人群
在日本，肝细胞癌患者的约9成来自于感染B型肝炎病毒或C型肝炎病毒的肝炎患者,可以以病毒感染和肝功能下降为指标，筛选成为精密检查的对象的患者。
然而，即使是肝细胞癌以7%的年率出现的肝硬化（F4）患者，为早期发现并治疗癌症，需要每隔三个月进行一次高额的高侵袭性精密检查，不得不说，这对患者的经济和身体都是很大的负担。每年癌变率为3-4%的F3更是如此。此外，考虑到通过干扰素治疗C型肝炎病毒的成功率只有5成左右，就更需要对众多干扰素治疗未奏效的慢性肝炎患者进行临床跟踪，明确其处于肝硬化和肝细胞癌进程中的哪个阶段。即在目前的肝炎到肝细胞癌的疾病治疗中，需要通过血液检查等简易的检查，权衡肝炎到肝硬化患者的癌变风险，并进行与之相应的肝细胞癌的诊断治疗。
在临床病理学上，纤维化程度与肝硬化和肝细胞癌的风险之间存在着相关性，这一点入手，我们发现，开发出一种能够以血清学方式定量测定纤维化进展的检查技术，便可以解决上述问题。如图4所示，肝脏中的C型肝炎病毒感染会引起受损肝细胞的再生，以及切口修复，即纤维化。随着肝脏纤维化的发展，患癌的风险升高，因此，“纤维化程度”是一项向癌症发展的指标。在出现癌的基础肝组织中，由于结构细胞发生变化，因此可以预测到，伴随着纤维化的发展会发生糖链变化。如图5所示，从感染起逐渐发展成癌症，此时，可以观察到肝丧失了其正常结构和功能的常规活性，同时出现了以纤维化为特征的病态结构。已知在肝细胞癌中，早期肝细胞癌发展为典型肝细胞癌，细胞特性发生变化，超过2cm后，早期肝细胞癌中就会出现典型肝细胞癌。图6显示了肝的状态变化与诊治方案的关系。对于慢性肝炎采用的是聚乙二醇干扰素和病毒唑并用疗法（PEG-IFN+RBV疗法），对于早期肝细胞癌采用的是无线电频率烧灼术(RFA)。对肝硬化没有诊断检查法及有效的治疗方法。本发明的糖链标记物糖蛋白能够区分慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌，因此是肝硬化的新治疗方法的开发中的一项指标。此外，将其与FibroScan共用，有望对纤维化进行定量评估，因此也能够用糖链标记物糖蛋白圈定纤维化（F3-F4）病例。除了纤维化的定量诊断外，在以抑制肝纤维化的发展和癌变为目的的治疗中，也有望临床导入该成果，并将其作为治疗效果的血清评估标记物使用。
2. 新肝病病情指标糖链标记物糖蛋白的肝病特异性糖链变化
本发明中的新肝病病情指标糖链标记物糖蛋白，即AGP和M2BP会产生糖链变化，该糖链变化使得以下各项具有各自的特征：因病毒感染而引起的疾病在其发生、发展过程中出现的慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。将这种以病毒性肝病的病情发展中所伴随的糖链变化为指标，能够判断肝病病情的标记物糖蛋白称为肝病病情指标糖链标记物。
对本发明的新肝病病情指标糖链标记物，即对AGP和M2BP的糖链变化的检测中，能反映出病毒性肝病的各种病情的特征，即能够反映出肝细胞癌、肝硬化、肝纤维化（F3和F4标记物）或慢性肝炎的特征，能够鉴别出上述各种疾病。然而因疾病的种类和进展程度的不同，这些标记物的糖链变化也会表现为不同的种类和比率。因此，为了充分利用标记物，并制造出专门针对各个对象的检测试剂盒，就需要从统计学的角度，选择反映疾病特异性糖链变化的凝集素探针。
3. 糖链标记物糖蛋白的肝病特异性糖链变化的验证
用后述凝集素阵列验证了AGP和M2BP上的糖链的疾病特异性变化。最好使用抗体铺覆凝集素阵列法。根据用凝集素阵列测定上述标记物糖蛋白的结果，研究1）随着病情的进展，在哪个凝集素信号中看出多少测定值变化，2）测定值的变化在哪个疾病阶段（初期还是晚期）最明显，3）测定值变化的信息是否有利于疾病的控制，以评估其有用性，验证该标记物适用于哪种肝病病情。
下面将更具体地介以下方法：将糖链标记物糖蛋白用于肝纤维化的进展监视和肝硬化检测时，如何选择适合的凝集素探针。
对于从（病毒性）肝炎患者、肝硬化患者和肝细胞癌患者的血清中采集的糖蛋白（AGP和M2BP），用抗体铺覆凝集素阵列法等比较糖链特征。首先，从（病毒性）肝炎患者、慢性肝炎、肝硬化患者和肝细胞癌患者采集血样。在采集的各个血样中，分别用抗体对AGP和M2BP进行免疫沉降，浓缩提纯，用抗体铺覆凝集素阵列确认了可以将其作为肝病病情的糖链标记物糖蛋白使用。更具体而言，如图7所示，以肝炎病毒感染者的血清为对象，就AGP和M2BP进行比较糖链分析。通过使用抗AGP抗体和抗M2BP抗体的免疫沉降法，可以分别简单地对AGP和M2BP进行浓缩。凝集素微阵列是高灵敏性的比较糖链分析装置，有100纳克的蛋白质制备量就足够进行分析，因此，可以以小规模进行上述前处理。将浓缩后的AGP和M2BP迅速地添加到凝集素微阵列中，反应一定时间后，通过抗体铺覆凝集素微阵列法，获得AGP和M2BP的糖链探针。此时，添加到凝集素阵列中的蛋白质的量因蛋白质而不同，大概从1纳克到数十纳克。只对统计分析所需数量的样本进行阵列分析，然后，用其数据集进行T检验（Student-T test）等二群比较分析。以此，可以客观地选择出随病情变化而在信号上产生显著性差异（significant difference）的凝集素。凝集素微阵列比如可以使用固化多个凝集素的凝集素微阵列，其中所述多个凝集素包含下面的表2所述凝集素的部分或全部，更具体而言，可以使用Kuno A.等,《自然方法学》（Nat. Methods）2,851-856(2005)中所记述的凝集素微阵列或GP生物科学公司生产的LecChip。抗体可以使用表1所列抗体
[表1]
3-1 凝集素微阵列(也简称为凝集素阵列)
凝集素阵列是将多种特异性不同的识别因子（探针）凝集素并列固定（矩阵排列）在一个基板上而形成的，它可以同时分析哪个凝集素对分析对象的复合糖类产生了多少相互作用。使用凝集素阵列，仅通过一次分析就可获得推断糖链结构所需要的信息，而且从制备样本起到扫描为止的操作步骤快速而简便。在质量分析等糖链特征系统中，不能够在不加任何处理的情况下分析糖蛋白，必须事先将蛋白质处理到糖缩氨酸或者游离糖链的状态。而凝集素微阵列与之相比则具有优势，如只需要向核心蛋白质部分直接导入荧光体，即可进行原样分析。凝集素微阵列技术是本发明人等所开发的技术，其原理和基础在Kuno A.等,《自然方法学》2,851-856(2005)上有记述。
用于凝集素阵列的凝集素可列举如以下表2所述：
[表2]
比如，现在已经可以商业性地购买到以45种凝集素为基础而固定的凝集素阵列（GP生物科学公司生产的LecChip）。
3-2 用凝集素阵列对糖链特征进行统计分析
目前，凝集素阵列已经不仅用于提纯标准样品，而且发展成了一种可以对血清和细胞溶解物等混合试样进行定量比较糖链特征（profiling）的实用化技术。尤其是在细胞表层糖链的比较糖链特征中，其发展突飞猛进（Ebe,Y.等，《生物化学杂志》（J.Biochem.）139,323-327(2006)；Pilobello,K.T.等，《美国科学院院刊》（Proc Natl Acad Sci USA.）104,11534-11539(2007)； 、Tateno,H.等，《糖生物学》（Glycobiology） 17,1138-1146(2007)）。
通过糖链特征的统计分析进行挖掘数据时，可以下述文献所述方法进行：“KunoA., 等,《蛋白质组和生物信息学杂志》（J Proteomics Bioinform.）1,68-72(2008)”、或“日本糖类学会2008/8/18凝集素微阵列应用技术开发-生物试样的比较糖链特征和统计分析，久野敦、松田厚志、板仓阳子、松崎英树、成松久、平林淳”、以及“Matsuda A, 等,《生物化学与生物理研究通讯》(Biochem Biophys Res Commun.)370,259-263(2008).”。
3-3 抗体铺覆凝集素微阵列法
凝集素微阵列平台基本如上所述，检测时不是直接用荧光标记上述待检物，而是通过抗体间接将荧光基团等导入待检物中，如此即可简便、快速地同时对多个样本进行分析（参照“Kuno A，Kato Y，Matsuda A，Kaneko MK，Ito H，Amano K，Chiba Y，Narimatsu H，Hirabayashi，《分子与细胞蛋白质组学杂志》（J. Mol Cell Proteomics.）. 8,99-108(2009)”、“平林淳、久野敦、内山升《使用了凝集素微阵列的糖链特征应用技术的开发》、实验医学增刊《分子级别的研究癌症诊断研究-向临床应用挑战-》、羊土社、Vol25（17）164-171（2007）”、久野敦、平林淳《应用了凝集素微阵列的糖链特征系统在糖链生物标记物探索中的应用》、基因医学M00K11号《临床糖链生物标记物的开发与糖链功能的探明》、pp.34-39、Medicaldo公司(2008)”）。
如果糖蛋白（AGP和M2BP）是待检物，则糖链部分会被凝集素微阵列上的凝集素识别，因此，只要将核心蛋白质部分的抗体（抗AGP抗体和抗M2BP抗体）覆盖在上面（铺覆）即可，在无需标记待检糖蛋白或将待检糖蛋白高度纯化的条件下，即可灵敏地将其检测出来。
3-4 凝集素铺覆抗体微阵列法
在本方法中，所用抗体微阵列的玻璃基板等基板上并列固定（矩阵排列）的不是凝集素微阵列，而是核心蛋白质的抗体。所需要的抗体数量与所要检测的标记物相应即可。要事先确定检测糖链变化的凝集素。
4 利用肝病病情指标糖链标记物的疾病特异性糖链变化的肝病的检测方法
AGP和M2BP是新肝病病情指标糖链标记物，随着纤维化的进展等肝病的病情变化，其糖链结构也会发生变化。因此，让下述两种物质反应，测定与凝集素反应的标记物，即可判别肝病病情，判断肝纤维化的程度，其中该两种物质为：其反应性与AGP和M2BP的糖链结构变化相应地发生变化的凝集素（以下简称为凝集素“A”）、以及采自受检者的试样中所含标记物。
比如，在检测新肝病病情指标糖链标记物时，
（1）可以用以下抗体进行检测：检测（a）上述凝集素“A”和（b）上述标记物的糖链以外的部分（核心蛋白质）的抗体。（2）可以使用以下抗体检测肝病病情指标糖链标记物：对肝病病情指标糖链标记物具有特异性，并以含糖链结合部分的部位作为表位的抗体。
比如，可以用标记物的核心蛋白质的抗体和凝集素“A”来检测标记物，以此区分肝病患者和健康人，最好可以采取使用凝集素阵列的抗体铺覆法（Kuno A，Kato Y，MatsudaA，Kaneko MK，Ito H，Amano K，Chiba Y，Narimatsu H，Hirabayashi《分子与细胞蛋白质组学杂志》(J. Mol Cell Proteomics). 8,99-108(2009)）。在三个疾病特异性糖链变化的验证实验中，当选择出了一个至二个以上的最适当凝集素“A”时，用后述第一或第二快速测定法最为合适。
比如，使用了新肝病病情指标糖链标记物的具体肝病检测方法可以是包括以下步骤的肝病检测方法：
1）测定肝病病情指标糖链标记物，其中所述肝病病情指标糖链标记物中有与采自受检者的试样中的凝集素“A”发生特异性反应的糖链；
2）测定肝病病情指标糖链标记物，其中所述肝病病情指标糖链标记物中有与采自健康人的试样中的凝集素“A”发生特异性反应的糖链；
3）测定肝病病情指标糖链标记物，其中所述肝病病情指标糖链标记物中有与采自肝病患者的试样中的凝集素“A”发生特异性反应的糖链；及
4）将从受检者获得的肝病病情指标糖链标记物的测定结果与健康人或肝病患者的肝病病情指标糖链标记物的测定结果进行比较，当受检者的测定结果更接近肝病患者的测定值时，判断为肝病。
也可以采取下述方法：根据多名肝病患者和健康人的测定结果，预先设定用于判断肝病的阈值，将受检者的测定值与阈值进行比较，判断受检者是否患有肝病。
4-1 纤维化进展的测定方法
人们已经知道，肝炎病毒感染引发的肝炎在其进展过程中，纤维化程度与肝功能降低和患肝细胞癌的风险之间有相关性。因此，纤维化的测定也就意味着对肝功能降低和患癌的风险进行评估。肝炎患者中的40%对干扰素治疗无反应，病毒感染会持续下去。应该从纤维化进展来判断这些病情是否处进展活跃。由此看来，对纤维化的进展进行测定在肝炎的诊断治疗中具有重要意义。
目前的纤维化评估是通过对活体标本进行病理诊断来进行的。近年来，随着肝脏瞬时弹性探测仪（Fibro Scan）的导入，该方法的普及指日可待。在从血清学方面评估纤维化的方法中，临床上使用的是纤维化血清学检测（Fibro Test）、Forn’s指数(Forn'sindex)、肝评估（Hepatoscore）等，但其灵敏性和特异性均不如活检诊断。
关于AGP和M2BP，使用纤维化进展程度不同的患者血清组，通过抗体铺覆凝集素微阵列，选择信号强度与纤维化进展程度相关地增强或减弱的凝集素。以此信息为基础，可以构建使用了下述物质的夹心检测法：标记物候选分子抗体和在纤维化进展过程中信号变动的凝集素“A”，上述方法如有凝集素－抗体夹心ELISA（酶联免疫吸附试验）法和抗体铺覆凝集素微阵列法。可以收集100例经病理诊断进行了纤维化分期的患者的血清，对其进行分析，设定各分期的截止值，用患者血清监视肝纤维化进展。
AGP的凝集素“A”可以列举出选自AOL和MAL的第一凝集素，M2BP的凝集素“A”可以列举出选自WFA、BPL、AAL、RCA120和TJAII的第二凝集素。以下有时将选自AOL和MAL的凝集素称为第一凝集素，将选自WFA、BPL、AAL、RCA120和TJAII的凝集素称为第二凝集素。
比如可以用至少固定有第一凝集素的第一凝集素阵列和抗AGP抗体，对结合到第一凝集素的AGP进行测定，可以用至少固定有第二凝集素的第二凝集素阵列和抗M2BP抗体，对结合到第二凝集素的M2BP进行测定。
4-2 肝硬化检测
肝硬化的定义是：一种病情，肝小叶结构消失的再生结节和围绕在其周围的紧密的纤维结缔组织弥漫性地出现在整个肝脏。这也是肝细胞损伤和纤维化持续进行的进行性慢性肝病的最后状态。肝硬化中的肝活检是用于诊断出病因的，但在早期肝硬化和大结节性肝硬化难以诊断的例子也很多（根据文光堂出版的外科病理学第4版）。因此，需要有一种检查技术能够定性、定量地诊断肝硬化。针对这一目的，在1）所述纤维化进展的测定方法中所找到的、可监视纤维化进展的候选分子抗体和凝集素组中，如果可以区分纤维化分期F3和F4，便可以将其用于肝硬化检测。
4-3 检测出试样中新肝病病情指标糖链标记物上的疾病特异性糖链变化
试样可以是活检试样、体液试样，最好是血液（血清、血浆等）。
所谓的测定包括定性测定和定量测定两个方面。
测定肝病病情指标糖链标记物时，比如可以用以下（1）、（2）进行：（1）固定有凝集素“A”的栏（column）和阵列，（2）AGP或M2BP的抗体。宜采用抗体铺覆凝集素阵列法，最好用第一或第二快速测定法。
还可以测量AGP或M2BP的浓度，这其中也可以列举出使用了凝集素阵列的抗体铺覆凝集素阵列法、免疫学测定法、酶活性测定法、毛细管电泳法等。较为理想的是使用以下定性或定量方法：使用了下述物质的酶免疫测定法、二抗体夹心ELISA法、金胶体法、放射免疫测定法、酶化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法、乳胶凝集免疫测定法、荧光免疫测定法、蛋白免疫印迹法、免疫组织化学法、表面等离子共振法（以下写为SPR法）等，其中上述物质为：通过抗体铺覆凝集素阵列，从统计学角度选择出的最能反映疾病特异性糖链变化的凝集素“A”；以及对AGP或M2BP具有特异性的单克隆抗体或多克隆抗体。
进一步具体而言，也可用使用以下物质的蛋白免疫印迹法进行半定量，上述物质为凝集素“A”和抗新疾病病情指标糖链标记物抗体。在定性测定中，上述“受检者的测定结果更高时”是指：定性显示的结果显示出，受检者试样中新疾病病情指标糖链标记物比健康人更多。也包括不通过抗体的糖链的直接测定法中的凝集素法。
在此，其反应性随着肝纤维化进展过程中的AGP糖链结构的变化而发生变化的凝集素“A”可以列举出以下：在抗体铺覆凝集素阵列后，经统计分析严格筛选的AOL、MAL或AOL和MAL并用物。随着肝纤维化的进展，在对AGP的糖链的反应性增高的凝集素群中，AOL是最具有有效差异的凝集素，随着肝纤维化的进展，在对AGP的糖链的反应性降低的凝集素群中，MAL是最具有有效差异的凝集素。因此，通过结合到AOL的AGP的测定值、以及结合到MAL的AGP的测定值，可以更准确地分辨受检者的肝病病情。在使用结合到AOL的AGP的测定值（AOL测定值）、以及结合到MAL的AGP的测定值（MAL测定值）的方法中，可以采用众所周知的统计学方法，但可以更简便地，使用AOL测定值和MAL测定值的差或比。在用AOL测定值和MAL测定值的差或比时，最好统一两种测定值的数值范围，简单地说，就是可以求两测定值的截止线值(cut off line value)的不同，并校正数值范围。比如，用MAL截止线值和AOL截止线值之比校正AOL测定值和MAL测定值中的某一方即可。通过用AOL和/或MAL测定采自受检者的试样中所含AGP，便可以将AGP作为判别肝纤维化的标记物、检测肝硬化的标记物、或检测肝细胞癌的标记物。此外，使用这些凝集素“A”，对采自正在接受干扰素等治疗的患者的试样中的AGP进行测定，便可以监视治疗效果。
另外，关于与AOL或MAL结合的AGP的测定值，最好用与以下凝集素结合的AGP的测定值对其进行标准化：不论AGP糖链结构如何变化，反应性实际都不变的凝集素。这种凝集素最好用DSA。也可以用采自受检者的试样中所含AGP的核心蛋白质的测定值，对与AOL或MAL结合的AGP的测定值进行标准化。在使用AOL测定值和MAL测定值的方法中，最好使用标准化的AOL测定值和标准化的MAL测定值。比如，上述第一凝集素阵列和第二凝集素阵列可以使用还分别固定有DSA的阵列，测定与DSA结合的AGP，用与DSA结合的AGP的测定值，对与第一凝集素结合的AGP的测定值进行标准化，测定与DSA结合的M2BP，用与DSA结合的M2BP的测定值，对与第二凝集素结合的M2BP的测定值进行标准化，再进行AGP和/或M2BP的测定。与肝病病情变化过程中M2BP的糖链结构的变化相应地，反应性也随之变化的凝集素“A”可以列举出：在抗体铺覆凝集素阵列后，经统计分析严格筛选出的WFA、BPL、AAL、RCA120和/或TJAII。随着肝病病情的发展，凝集素WFA、BPL、AAL、RCA120和TJAII对M2BP糖链的反应性都会增高。WFA、BPL和TJAII与肝细胞癌患者、特别是与术后癌症复发病例的M2BP的反应性很强，用WFA、BPL和/或TJAII测定采自受检者的试样中所含M2BP，便可以将M2BP用作筛查肝细胞癌高危患者群的标记物。此外，用AAL和/或RCA120测定采自受检者的试样中所含M2BP，便可以将M2BP用作肝纤维化判断标记物、肝硬化检测标记物、或肝细胞癌检测标记物。对于进行了肝细胞癌摘除后的患者，可以定期用WFA测定采自患者的试样中的M2BP，以此预测复发风险。在血清中含有的糖蛋白中，因为能与WFA结合的分子非常之少，因此可以将血清直接作为测定试样使用，因此，在构建WFA的测定系列时的自由度很大，较为理想。
对于与WFA、BPL、AAL、RCA120或TAJII结合的M2BP的测定值，最好用与以下凝集素结合的M2BP的测定值加以标准化：M2BP的糖链结构发生变化，但其反应性不会随着变化的凝集素。这种凝集素以DSA较为理想。也可以使用采自受检者的试样中所含M2BP的核心蛋白质的测定值，对与WFA、BPL、AAL、RCA120或TAJII结合的M2BP的测定值进行标准化。
最好用抗体铺覆凝集素微阵列法进行以下测定：与AOL、MAL或DSA结合的AGP的测定，与WFA、BPL、AAL、RCA120或TAJII结合的M2BP的测定。特别是抗体铺覆凝集素微阵列法可以同时测定与数种凝集素结合的AGP或M2BP。当用凝集素“A”快速测定AGP或M2BP等标记物时，最好使用以下第一或第二快速测定方法。
第一快速测定法如有下述方法：将生物素结合到凝集素“A”中，形成生物素化凝集素“A”，将该生物素化凝集素“A”与试样混合，再向其中添加固定有链霉亲和素的磁性粒子，形成磁性粒子-凝集素“A”-AGP的复合物，使标记抗AGP抗体与该复合物反应，形成磁性粒子-凝集素“A”-AGP-标记抗AGP抗体的第二复合物，测定第二复合物的标记数量，以此定量与上述凝集素“A”反应的AGP。测定M2BP时，除使用标记抗M2BP抗体以外，其余均与上述AGP测定方法相同。在第一快速测定法中，能够用60分钟的时间来定量试样中的AGP和M2BP。如果使用生物素化凝集素“A”和链霉亲和素固定化磁性粒子的话，可以提高凝集素“A”对试样中的AGP和M2BP的反应性，将AGP和M2BP与凝集素“A”的反应时间缩短到约30分钟。
第二快速测定法如有下述方法：混合固定有凝集素“A”的磁性粒子和试样，用凝集素“A”捕捉试样中的AGP糖链，让标记抗AGP抗体与捕捉到磁性粒子上的AGP进行反应，形成磁性粒子-凝集素“A”-AGP-标记抗AGP抗体的复合物，测定复合物的标记数量，以此来定量与上述凝集素“A”反应的AGP。用第二快速测定法测定M2BP时，除使用标记抗M2BP抗体外，可以用与上述AGP的测定方法同样的方法。第二快速测定法能够用20分钟的时间来定量试样中的AGP和M2BP。这是因为，使用凝集素“A”固定化磁性粒子，可以显著提高凝集素“A”对试样中的AGP和M2BP的反应性，将AGP和M2BP与凝集素“A”的反应时间缩短到约5分钟。
第一和第二快速测定法均适用于自动化，特别是第二快速测定法可以在全自动测定装置中使用。将第二快速测定法进行自动化，就可以轻松地连续测定多个样本。通过自动化，还可以在短时间内对一个样本进行多个项目的测定（使用不同凝集素的测定）。
标记抗AGP抗体和标记抗M2BP抗体的标记可以使用荧光物质和酶。荧光物质如有异硫氰酸荧光素（FITC）、绿色荧光蛋白（GFP）和虫萤光素等。酶如有碱性磷酸酶（ALP）、过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酪氨酸酶、酸性磷酸酶等。当酶使用的是碱性磷酸酶时，可以使用众所周知的发光底物、显色底物等，比如CDP-star（注册商标）（4-氯-3-(甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5’-氯)三环 [3.3.1.13,7] 癸烷}- 4-基) 磷酸苯基二钠）、CSPD（注册商标）（3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5’-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)- 磷酸苯基二钠）等化学化光底物；以及对硝基酚磷酸盐、5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）、4-氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、碘硝基四唑（INT）等显色底物。也可以用生物素标记抗体，通过生物素-抗生物素蛋白结合，使结合有链霉亲和素的上述荧光物质和上述酶与抗体结合。
血样中因肝脏纤维化而发生糖链结构变化的AGP和M2BP的含量很少，因此，从高灵敏性、标记检测的快速性的观点出发，标记最好使用酶，使用发光底物。
另外，ALP等酶具有糖链。为防止其糖链与凝集素发生非特异性反应，最好使用经去糖基处理的酶。经过了这种处理的酶可以使用：如重组AP、 EIA
Drade、CR 03535452(罗氏诊断公司制)等的经过了去糖基处理的ALP。
抗AGP抗体和抗M2BP抗体也具有糖链。为防止其糖链与凝集素发生非特异性反应，最好使用经去糖基处理的抗体。比如，最好使用通过胃蛋白酶消化和还原转换成Fab’的抗AGP抗体或抗M2BP抗体。
标记物抗体试剂的制备可以按照公认的方法进行，让抗AGP抗体或抗M2BP抗体、以及用EMCS（N-(6-马来酰亚胺己酸)琥珀酰亚胺）（同仁化学）等交联剂进行了马来酰亚胺化的标记物进行混合、反应，制备标记物抗体。比如，用交联剂对经过了去糖基处理的ALP进行马来酰亚胺化，让其与转换为Fab’的抗AGP抗体或抗M2BP抗体反应，用如此制备的试剂可以防止发生非特异性反应。
5 使用了新肝病病情指标糖链标记物的新特异性多克隆抗体和/或单克隆抗体
在使用新肝病病情指标糖链标记物的肝细胞癌检测方法中，如果很容易购买到肝病病情指标糖链标记物特异性多克隆抗体和/或单克隆抗体，则可以使用这些抗体，但当不容易买到时，可以如下制备。
5-1 抗体的制备
本发明的新肝病病情指标糖链标记物可以用于制备以下抗体：肝病检测用的多克隆抗体或单克隆抗体。
比如，新肝病病情指标糖链标记物的抗体可以用众所周知的方法制备。也可以同时放入弗罗因德完全佐剂（Freund's complete adjuvant），促进抗体生成。合成含有与X糖链结合的结合位置的缩氨酸，让此缩氨酸与市场销售的钥孔虫戚血蓝蛋白（Keyholelimpet hemocyanin，KLH）共价结合，并将其投药给动物。此时，也可以同时放入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor ，GM-CSF），以促进抗体产生。
比如，抗新肝病病情指标糖链标记物单克隆抗体可以用Kohler和Milstein的方法制备（《自然》（Nature） Vol. 256, pp495-497(1975)）。比如，从经抗原免疫后的动物获得的抗体形成细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，制备杂交瘤，从所得杂交瘤选择产生抗X抗体的克隆，以此进行制备。
具体而言，在所得抗原用肝病病情指标糖链标记物中添加佐剂。佐剂有弗罗因德完全佐剂和弗罗因德不完全佐剂等，也可以混合这些佐剂。
将如上获得的抗原投药到哺乳动物中，如小鼠、大鼠、马、猴子、兔子、山羊、绵羊等体内。免疫可以用现有的任何方法进行，但主要采取静脉注射、皮下注射和腹腔注射等。免疫的间隔无特别限定，间隔数日到数周均可，最好以4-21日的间隔进行免疫。
从最后免疫日起的2-3日后，采集抗体形成细胞。抗体形成细胞有脾脏细胞、淋巴结细胞、末梢血细胞。
与抗体形成细胞融合的骨髓瘤细胞使用的是：来自小鼠、大鼠和人等各种动物、本行业人员一般可获得的确立细胞株。所使用的细胞株具有如下性质：具有抗药性、在未融合状态下无法在选择性培养基（如HAT培养基）中生存，仅在融合状态下才能生存。一般使用8-氮杂鸟嘌呤抗性株，这种细胞株缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT），无法在次黄嘌呤·氨基蝶呤·胸腺嘧啶脱氧核苷（HAT）培养基中生存。
骨髓瘤细胞可以使用已知的各种细胞株，如P3（P3x63Ag8.653）（《免疫学杂志》（J.Immunol.） 123,1548-1550 1979）)、P3x63Ag8U.1(《微生物学和免疫学热点》（CurrentTopics in Microbiology and Immunology） 81,1-7(1978))、NS-1(Kohler,G.和Milstein, C., 《欧洲免疫学杂志》（Eur. J. Immunol）. 6,511-519(1976))、MPC-11(Margulies, D.H.等, 《细胞》（Cell） 8,405-415(1976))、SP2/0(Shulman,M.等, 《自然》（Nature） 276,269-270(1978))、F0(de St.Groth, S.F.等,《免疫学方法杂志》（J.Immunol. Methods） 35,1-21(1980))、S194(Trowbridge, I.S., 《试验医学杂志》（J.Exp. Med.） 148, 313-323(1978))、R210(Galfre, G.等, 《自然》（Nature） 277, 131-133(1979))等。
然后，让上述骨髓瘤细胞与抗体形成细胞进行细胞融合。细胞融合的方法如下：在MEM、DMEM、RPME-1640培养基等动物细胞培养基中，让骨髓瘤细胞与抗体形成细胞以1：1-1：10的混合比例混合，在有融合催化剂的条件下，在30-37℃接触1-15分钟。为促进细胞融合，可以使用平均分子量为1，000-6，000的聚乙二醇、聚乙烯醇或仙台病毒等融合催化剂和融合病毒。也可以使用市场销售的、使用了电刺激（比如电穿孔）的细胞融合装置，以促进抗体形成细胞和骨髓瘤细胞的融合。
从细胞融合处理后的细胞中选择出作为目标的杂交瘤。其方法如有：在选择性培养基中使用细胞的选择性增殖的方法等。即，用适当的培养基稀释细胞悬浊液后，将其撒在微孔板上，在各孔中加入选择性培养基（HAT培养基等），然后适当交换选择性培养基并进行培养。如此，可以获得生存的细胞，并将其作为杂交瘤。
杂交瘤的筛选采用极限稀释法、荧光激发细胞分选法等，最后获得单克隆抗体形成杂交瘤。从获得的杂交瘤获取单克隆抗体的方法可以列举出常规的细胞培养法和腹水形成法等。
本发明所述抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，还包括单链Fvs（scFv）、单链抗体、Fab片段、F（ab’）片段、二硫键Fvs（sdFv）等。此外，在本发明中不限于第一或第二快速测定法，所用抗体最好是经去糖基处理的抗体，以防糖链与凝集素发生非特异反应。比如，可以使用通过以下抗体：通过胃蛋白酶消化和还原，转换为Fab’的抗AGP抗体和抗M2BP抗体。
实施例
[实施例1] 肝病病情指标糖链标记物糖蛋白在肝病检测中的应用
关于肝病病情指标糖链标记物糖蛋白，即AGP和Mac2BP（M2BP），以下列举了用抗体铺覆凝集素阵列检测肝病的实施例。此外，图7显示的是：用本方法，对来源于（病毒性）肝炎患者（CH）、肝硬化患者（LC）、肝细胞癌患者（HCC）和健康人（HV）血清的该标记物糖蛋白上糖链进行比较分析的步骤。
1. 从血清中浓缩标记物蛋白质
对来源于（病毒性）肝炎患者（CH）、肝硬化患者（LC）、肝细胞癌患者（HCC）和健康人（HV）血清的该标记物糖蛋白进行浓缩，该浓缩按照下述方法进行：“Kuno A，Kato Y，Matsuda A，Kaneko MK，Ito H，Amano K，Chiba Y，Narimatsu H，Hirabayashi J. 《分子与细胞蛋白质组学》. 8,99-108(2009)”。为证明所得结果是依存于病情的，在各病情中分别取5例进行分析。用含0.2%SDS的PBS缓冲液将各患者血清稀释10倍，以95℃加热处理10分钟，在AGP的反应管中注入5µL上述加热处理后的液体，在Mac2BP的反应管中注入20µL上述加热处理后的液体，再分别在其中加入500 ng各抗原的抗体（生物素化物）。用反应缓冲液（含1%TtitonX-100的Tris-缓冲盐水(TBSTx)）将各反应溶液调整到45µL后，在4℃中振荡反应2小时。抗原抗体反应后，迅速向上述反应溶液中加入2倍浓缩状态的磁珠溶液5µL（相当于原磁珠溶液10µL），再反应1小时，其中上述磁珠溶液为链霉亲和素固定化磁珠溶液（Dynabeads® MyOne™ 链霉亲和素T1, DYNAL Biotech ASA公司制），且事先用反应缓冲液清洗了三遍，并将其调整为2倍浓缩状态。通过此反应，该糖蛋白通过生物素化抗体与磁珠形成了复合物。将此复合物吸附到磁珠回收用磁块后，扔掉溶液。用500µL反应缓冲液将回收的复合物清洗三遍后，回收的复合物被悬浊于10µL的洗脱缓冲液（含有0.2%SDS的TBS）。将此悬浊液在95℃进行5分钟热处理，从磁珠分离洗脱该糖蛋白，将所得溶液作为洗出液。此时，因为混入了热变性的生物素抗体，因此，将用上述方法调整为2倍浓缩状态的磁珠溶液10µL（相当于原磁珠溶液20µL）加入洗出液中，反应1小时，吸附并除去生物素化抗体。将如此获得的溶液作为来源于血清的该糖蛋白溶液，并用于以后的实验中。
2．抗体铺覆凝集素阵列
取适量如上获得的该糖蛋白溶液，用凝集素阵列反应缓冲液，即含有1%TtitonX-100的磷酸盐-缓冲盐水(PBSTx)将其调整为60µL。将此溶液加入凝集素微阵列的各反应槽（每一片玻璃上有8个反应槽），在20℃反应10小时以上。在制作由此8个反应槽构成的凝集素微阵列基板时，按照内山等人（《蛋白质组学8》(Proteomics 8), 3042-3050(2008)）的方法进行制作。以此，该糖蛋白上的糖链和固定在阵列基板上的43种凝集素的结合反应达到平衡状态。然后，为避免检测用抗体上的糖链结合到未反应的基板上的凝集素上并产生杂波，添加2µL来源于人血清的IgG溶液（西格玛公司制），反应30分钟。用60µL的PBSTx将各反应槽清洗三遍后，再加入2µL来源于人血清的IgG溶液，经搅拌后，加入100ng的检测用该糖蛋白的抗体（生物素化物），在20℃反应1小时。抗原抗体反应后，用60µL的PBSTx将各反应槽清洗三遍，然后，加入含有200 ng的Cy3标记链霉亲和素的PBSTx溶液，在20℃反应30分钟。反应后，用60µL的PBSTx将各反应槽清洗三遍，之后用MORITEX公司生产的阵列扫描仪GlycoStation进行阵列扫描。
所得结果中，AGP和Mac2BP的各病情的典型例分别显示在图8和图9中。图8是一张结果图，其显示的是：用抗体铺覆凝集素微阵列对肝病病情指标标记物糖蛋白之一的α1酸性糖蛋白(AGP)进行比较糖链分析的结果。左上图显示的是凝集素微阵列上的凝集素的配置。粗体字表示在本实验中获得了有效信号的凝集素。在15种凝集素中获得了信号。右上图显示的是来源于肝细胞癌、肝硬化和慢性肝炎患者血清、以及健康人血清的AGP的典型扫描图。下半部分以图表的形式显示了在15种凝集素中，用扫描数据，通过阵列分析软件将各信号数值化的结果。很明显，肝细胞癌、肝硬化组群以及肝炎患者组群和健康人组群之间的信号图形（signal pattern）有差异。图9是一张结果图，其显示的是：用抗体铺覆凝集素微阵列，对肝病病情指标标记物糖蛋白之一的90K/Mac-2-结合蛋白（M2BP）进行比较糖链分析的结果。左上图显示的是凝集素微阵列上的凝集素的配置。粗体字表示在本实验中获得了有效信号的凝集素。在17种凝集素中获得了信号。右上图显示的是来源于肝细胞癌、肝硬化和慢性肝炎患者血清、以及健康人血清的M2BP的典型扫描图。下半部分以图表的形式显示了在17种凝集素中，用扫描数据，通过阵列分析软件将各信号数值化的结果。可以看出，根据病情的轻重，信号强度有所变化（增强或减弱）。
[实施例2] 通过肝病病情指标糖链标记物糖蛋白AGP的抗体铺覆凝集素阵列分析，判断肝纤维化进展
如实施例1所述，根据糖蛋白的抗体铺覆凝集素阵列分析得出的凝集素信号信息，可以看出，使用经统计分析选择出的最合适的物质，可以检测出各肝病病情。
在此以AGP为靶分子按照以下步骤进行实验。
1．选择用于区分肝硬化与肝炎的凝集素
为了选择出其信号随纤维化的进展而变动的凝集素群，首先用已经临床诊断的患者HCC、LC、CH的各10例的血清，进行AGP抗体铺覆凝集素阵列分析。为更加客观地进行选择，在HCC-LC和LC-CH之间进行行T（Student T）检验，将危险度数值在0.1%以下的凝集素作为可用凝集素。其结果见表3。从刚才的实验结果（图8）可知，通过AGP的阵列分析在15种凝集素中获得了信号，但在T（Student T）检验中，危险度为0.1%以下的显著性差异的凝集素仅有LEL、AOL、AAL、MAL、STL和PHAE六种。另外，在本实验中，关于信号变动最少、再现性高的凝集素DSA，所获取的数据的标准化具有有效性，以下，在扫描后，进行了数值化的数据全部都通过DSA信号进行了标准化。
[表3]
2. 选择用于判断纤维化进展的凝集素
下面以感染了肝炎病毒、且经肝活检病理诊断，在分期中被定为纤维化的患者群125例为对象，按照实施例1的步骤进行了抗体铺覆凝集素阵列分析。125例肝脏纤维化分期的明细为：F0和F1为33例、F2为32例、F3为31例、F4为29例。按照以上步骤，选择出对统计学判断有用的凝集素。在所得结果中，前6种凝集素的结果如表4所示。此前获得的6个凝集素占据了前几位，特别是其中的LEL、AOL、MAL被选为对判断最为有效的凝集素，故就此3种凝集素进行了更详细的数据分析
[表4]
图10显示的是以下两者之间的相关性：肝脏的纤维化进展、以及通过AGP的抗体铺覆凝集素阵列分析获得的凝集素信号强度的变化。用DSA凝集素信号对各信号进行标准化，数值则是DSA信号为100%时的相对信号强度。在图10的上面A处，对于肝活检后的病理分析中分期为纤维化（F）的125例病例，进行凝集素阵列分析，用盒图显示了各分期的凝集素信号的分布。盒的上端和下端分别显示75%点、25%点，线的上端和下端分别显示95%点、5%点。盒中的横线表示中间值，x表示平均值。实施了T（Student-T）检验，以检验肝硬化（F4）和慢性肝炎的各分期的群组（F0、1、2和3）的显著性差异，并在危险度P<0.0001时标记*号。为进行对比，用同样的方式标注普通生化检查中的肝脏纤维化的指标，即血小板数值的分布。其结果表明，AOL的信号随着纤维化的进展而增强，可以从强度差上明确区分慢性肝炎（F0-3）和肝硬化（F4）。与此相对，MAL和LEL的信号强度随着纤维化的进展而减弱。
对同一患者，按时间顺序测定了AOL、MAL和LEL的信号变动，其结果如图10下面的B所示。在图10下面的B中，对于各有一例肝硬化患者和肝细胞癌患者的系列样本（采集时间不同的血清）中的AGP，进行了抗体铺覆凝集素微阵列分析，标识出用DSA信号进行了标准化后的AOL、MAL和LEL的相对信号值。在时间坐标中，以确诊为肝硬化和肝细胞癌的日期为0。AOL信号随时间推移而增强，MAL信号减少，这反映了肝纤维化的进展。与此相对，LEL信号和作为简易纤维化标记物使用的血小板数在某个特定时间显示出急剧变动，并未清晰地表现纤维化的进展。
从以上结果可以看出，单独使用AOL和MAL的信号变动，或者是将两者组合使用，便可以判断肝脏纤维化的进展。
[实施例3] 通过肝病病情指标糖链标记物糖蛋白AGP的抗体铺覆凝集素阵列分析来检测肝硬化
根据实施例2的结果，我们认为，以肝纤维化进展为基准，设定各凝集素信号单独使用或组合使用时的截止值，便可检测出肝硬化，在此，按以下步骤进行了实验。
1．设定检测肝硬化的凝集素信号的截止值
首先，设定从肝炎病毒患者中检测肝硬化患者的各凝集素的截止值。为此，以已进行了病理诊断的80例患者（F1、F2、F3、F4各20例）为对象，用DSA凝集素信号对实施例2选出的2种凝集素的信号进行标准化，并使用标准化后的数据，绘制了受试者操作特征曲线（ROC曲线），以便将F4（肝硬化）与其他分期（F1-F3）进行区分。其结果如图11的左图所示。图11中显示了单独使用AOL、MAL信号时的曲线，此外，还显示有根据以下数值绘制的曲线：通过使用了二个信号的数学公式，即通过（AOL的相对信号强度）×1.5-（MAL的相对信号强度）所求得的数值。求出表示曲线下面部分的面积的AUC（曲线下面积）值，以检验各种方法的诊断能力。将距离灵敏性100%、特异性100%的点最近的曲线上的点，换言之，也就是将以下两者的切点定为“最佳特异性和灵敏性”，将截止值设在其附近，其中上述两者为：与Y=X的直线平行的线和ROC曲线的切点。这些数值见图11的右表。对病理学诊断或图像及临床诊断中确定为肝炎的患者45例和确定为肝硬化的患者43例，用所得截止值进行了盲测。其结果见图11的右表的验证集（Validation set）一项。以肝硬化为阳性，肝炎为阴性，列举了各检测数。根据ROC曲线，决定在表示最佳灵敏性和特异性的点中的截止值，其结果，AOL为8%，MAL为11.8%。组合中的假阴性和假阳性患者人数最少，正确诊断率（%）（（总患者数-假阳性、假阴性患者数）/（总患者数）×100）增高。
2．检测肝硬化
按照实施例2的步骤，对于临床诊断完毕的慢性肝炎患者45例和肝硬化患者43例，进行了以AGP为靶分子的抗体铺覆凝集素阵列分析。以DSA凝集素的信号为100%，对所有信号进行了标准化。利用其数值和上述截止值，通过判别阳性和阴性来进行了肝硬化检测检定。其结果，当使用AOL信号时，检测能力分别为：灵敏性86.1%、特异性91.1%、正确诊断率88.6%，使用MAL信号时，检测能力为：灵敏性90.7%、特异性88.9%、正确诊断率89.8%。均能够精确检测，正确诊断率均超过85%。此外，通过组合使用了二个信号的公式，即通过（（AOL的相对信号强度）×1.5-（MAL的相对信号强度）验证了检测能力，结果，灵敏性为95.4%、特异性为91.1%、正确诊断率为93.2%，所获得的肝硬化检测结果的准确率最高。特别值得一提的是，和以往大家所公知的用AAL凝集素和RCA凝集素检测AGP的疾病特异性糖链变化的方法相比，本方法的检测能力有压倒性优势。这种结果与以下一致：在此次抗体铺覆凝集素阵列的选择步骤中，AAL和RCA120不如AOL、MAL（参照表3、4）。
[实施例4] 用可监视肝脏纤维化进展的标记物判断干扰素的治疗效果
根据实施例2的结果得知，通过观察AOL和MAL的信号变动，可以监视纤维化的进展。因此，在此做了以下尝试：以AOL/DSA和MAL/DSA为纤维化进展参数，验证其是否能判断抗病毒药，即干扰素的治疗效果。对以下两个群组进行如下实验：其中上述两组群分别是在C型肝炎患者中，已确认有干扰素疗效的持续性病毒应答（SVR）的病例组；以及确认无疗效的病毒学无应答（NVR）病例组。在干扰素治疗后，以随着时间推移而采血的患者血清为对象，以与实施例1同样的方法，进行了血清中AGP的浓缩、以及抗体铺覆凝集素阵列分析，算出用DSA信号进行了标准化后的AOL和MAL的相对信号值。图12显示的是在其典型病例中，即在其各自的2个病例中各信号随着时间的变化。在时间坐标中，以治疗后随即进行采血的采血日为0，在相对结合信号中，以治疗后的最初相对值为0。在SVR病例中，MAL信号随时间推移而增强，而AOL的信号则减弱，或是未能检测出AOL信号。即，在这些病例中，纤维化有缓解趋势。与此相反，在NVR病例中，AOL的信号随时间推移而增强，而MAL信号则基本上没有变化。也就是说，这些病例的纤维化没有得到缓解，或者是有恶化（纤维化发展）的趋势。从以上得知，可通过血液检查来评估干扰素治疗后的效果。
[实施例5]
1. 第一快速测定法（手动测定法）
1-1 试剂的制备
R1试剂的制备：在缓冲液A（PBS-1%TritonX，pH7.4）中添加5µg/mL的生物素化DSA（J-OIL MILLS公司制），以此制备R1试剂1。在缓冲液A中添加5µg/mL的生物素化MAL（Vector公司制），以此制备R1试剂2。在缓冲液A中添加2.5µg/mL的生物素化AOL，以此制备R1试剂3。所使用的生物素化AOL是用生物素标记试剂盒（DOJIDO公司制）对AOL（东京化成公司制造）进行生物素化所得到的。
R2试剂的制备：在缓冲液A中添加固定有链霉亲和素的磁性粒子（个数平均粒径2µm）至0.5w/v%，以此制备R2试剂。
R3试剂的制备：制备含有下述物质的溶液作为R3试剂1：0.025U/mL的ALP(碱性磷酸酶)标记鼠抗AGP单克隆抗体、0.1M的MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸，pH6.5）、0.15M的氯化钠、1mM的氯化镁、0.1mM的氯化锌、0.1w/v%的NaN3、以及0.5w/v%的酪蛋白钠。用0.5U/mL的ALP标记鼠抗AGP单克隆抗体取代0.025U/mL的ALP标记鼠抗AGP单克隆抗体，除此之外，以与R3试剂1同样的方法制备R3试剂2。
R4试剂的制备：制备含有以下的溶液作为R4试剂：0.1M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP、pH9.6）、1mM的氯化镁、以及0.1w/v%的NaN3。
R5试剂的制备：以具有Sapphirine-II的CDP-Star（注册商标）（CDP-Star withSapphirine-II）（ALP的发光底物，应用生物系统公司制）为R5试剂。
清洗试剂的制备：制备含有20mM的Tris（pH7.4）、0.1w/v%吐温20、0.1w/v% NaN3、以及0.8w/v%的氯化钠的溶液，并将其作为清洗试剂。
1-2．确认DSA的稀释线性
与实施例1中的浓缩同样地，用抗AGP抗体将CONSERA（产品名称）（健康人血清，日水制药公司制）中的AGP回收到缓冲液B（TBS-0.5%TritonX-0.1% SDS）中，并将其作为试样。用缓冲液B将回收的试样分别稀释到1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍，以此获得了稀释试样。
在各稀释试样30µL中添加110µL的R1试剂1，在室温下反应2分钟后，添加30µL的R2试剂，并在室温下反应30分钟。对载有DSA和AGP的复合物的磁性粒子进行磁诱导，进行了B/F分离后，进行四遍下述处理：用清洗试剂清洗分离的磁性粒子并废弃溶液。在清洗后的磁性粒子中添加100µL的R3试剂1，在室温下反应20分钟，让磁性粒子所载复合物中的AGP和ALP标记鼠抗AGP单克隆抗体发生反应。在对载有ALP标记鼠抗AGP单克隆抗体、AGP和DSA的复合物的磁性粒子进行磁诱导的状态下，除去液体成份（B/F分离）后，进行四遍以下处理：用清洗试剂清洗分离的磁性粒子并废弃溶液。将载有复合物的磁性粒子分散在50µL的R4试剂中，再添加100µL的R5试剂，用发光测定装置测定ALP的化学发光强度，即光计数（PhotoCount）值。结果见图13。如图13所示，在DSA测定系列中，表现出R2=0.99这一良好的线性。
1-3 确认MAL的稀释线性
在“确认DSA的稀释线性”中用R1试剂2取代R1试剂1，用R3试剂2取代R3试剂1，除此之外，用同样的方法进行实验，以确认MAL测定系列中的稀释线性，结果见图14。如图14所示，MAL测定系列表现出了R2=0.99这一良好的线性。
1-4 确认AOL的稀释线性
在“确认DSA的稀释线性”中用HCV阳性血浆2（Millenium Biotech公司制）取代CONSERA，用R1试剂3取代R1试剂1，除此之外，用同样的方法进行实验，以确认AOL测定系列中的稀释线性，结果见图3。如图15所示，AOL测定系列表现除了R2=0.98这一良好的线性。
1-5 对各种市场销售的样本进行DSA、MAL、AOL测定
对于CONSERA（健康人血清，日水制药公司制）、健康人血清（TRINA公司制）、HCV阳性血浆1和2（Millenium Biotech公司制）,分别进行与实施例1同样的浓缩，用抗AGP抗体分离AGP，并将其回收到缓冲液（TBS-0.5%TritonX-0.1%SDS）中作为测定试样。仅将缓冲液作为空白测定试样（NC）。
在各测定试样30µL中添加110µL的R1试剂1，在室温下反应2分钟后，添加30µL的R2试剂，在室温下反应30分钟。对载有DSA和AGP的复合物的磁性粒子进行磁诱导，进行B/F分离后，进行四遍以下处理：用清洗试剂清洗分离的磁性粒子并废弃溶液。在清洗后的磁性粒子中添加100µL的R3试剂1，在室温下反应20分钟，让磁性粒子所载复合物中的AGP和ALP标记鼠抗AGP单克隆抗体发生反应。对载有ALP标记鼠抗AGP单克隆抗体、AGP和DSA的复合物的磁性粒子进行磁诱导，在进行了B/F分离后，进行四遍以下处理：用清洗试剂清洗分离的磁性粒子并废弃溶液。将载有复合物的磁性粒子分散在50µL的R4试剂中，再添加100µL的R5试剂，用发光测定装置测定DSA测定系列中的化学发光强度，即光计数（Photo Count）值。测定所需时间为65分钟。测定结果见表5。
在DSA测定系列中用R1试剂2取代R1试剂1，用R3试剂3取代R3试剂1，除此之外，以同样的方法测定MAL测定系列中的化学发光，结果见表5。在DSA测定系列中用R1试剂1取代R1试剂3，除此之外，用同样的方法测定AOL测定系列中的化学发光，结果见表5。此外，用DSA的测定结果对MAL和AOL的测定结果进行标准化后的值见表5、图16和图17
[表5]
1-6 用凝集素阵列法对各种市场销售的样本进行测定
用实施例1使用的凝集素阵列对上述1-5的各测定试样进行抗体铺覆法测定。凝集素阵列法测定的时间约为18个小时。其结果显示在表6、图18和图19中
[表6]
关于用DSA进行了标准化后的MAL的测定结果，可以看出，以下两者之间有着良好的相关性：图16所示本实施方式的第一测定法的测定结果、以及图18所示凝集素阵列法的测定结果。关于用DSA进行了标准化的AOL的测定结果，可以看出以下两测定结果的图形一致，两者之间存在良好的相关性：图17所示第一快速测定法的测定结果、以及图19所示凝集素阵列法的测定结果。
2. 第二快速测定法（自动测定法）
2-1 试剂的制备
R1试剂的制备：以缓冲液A（PBS-1%TtitonX，pH7.4）作为R1试剂。
R2试剂的制备：在缓冲液A中添加固定有链霉亲和素的磁性粒子（个数平均粒径2µm）至0.5w/v%，再添加2.5µg/mL生物素化DSA（J-OIL MILLS公司制），在室温下搅拌30分钟。搅拌后进行磁诱导，沉降磁性粒子，废弃溶液成分。在此添加缓冲液A并进行搅拌后，反复进行三次以下操作：在磁诱导后沉降磁性粒子，并废弃溶液成分的操作。在此添加缓冲液A至磁性粒子浓度达到0.5w/v%，制备出含有磁性粒子的R2试剂1，其中该磁性粒子载有DSA。用25µg/mL生物素化MAL（Vector公司制）取代2.5µg/mL生物素化DSA（J-OIL MILLS公司制），除此之外，以与R2试剂1同样的方法，制备含有磁性粒子的R2试剂2，其中该磁性粒子载有MAL。用25µg/mL生物素化AOL取代2.5µg/mL生物素化DSA（J-OIL MILLS公司制），除此之外，用与与R2试剂1同样的方法制备含有磁性粒子的R2试剂3，其中该磁性粒子载有AOL。此外，所使用的生物素化AOL是用生物素标记试剂盒（DOJIDO公司制）对AOL（东京化成公司制）进行生物素化所得到的。
R3试剂的制备：制备含有以下成分的溶液并将其作为R3试剂1：0.1U/mL的ALP (重组AP, EIA Drade, CR 03535452)标记鼠抗AGP单克隆抗体-Fab’、0.1M的MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸，pH6.5）、0.15M的氯化钠、1mM的氯化镁、0.1mM的氯化锌、0.1w/v%的NaN3、以及0.25w/v%的酪蛋白钠。用0.1w/v% 的BSA取代0.25w/v%的酪蛋白钠，除此之外，用与R3试剂1同样的方法制备R3试剂2。
在上述第一快速测定法（手动测定法）中，使用了未去糖基的ALP，而第二快速测定法使用的是去糖基处理后的ALP。
R4试剂的制备：制备含有以下成分的溶液，并将其作为R4试剂：0.1M的2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP、pH9.6）、1mM的氯化镁、以及0.1w/v%的NaN3。
R5试剂的制备： 将带有Sapphirine-II的CDP-Star（注册商标）（ALP的发光底物，应用生物系统公司制）作为R5试剂。
清洗试剂的制备：制备含有20mM的Tris（pH7.4）、0.1w/v%的吐温20、0.1w/v% 的NaN3、以及0.8w/v%的氯化钠的溶液，并将其作为清洗试剂。
2-2 确认使用DSA的测定系列的稀释线性
与实施例1中的浓缩同样地，用抗AGP抗体将CONSERA（健康人血清，日水制药公司制）中的AGP回收到缓冲液B（TBS-0.5%TtitonX-0.1%SDS）中，并将其作为试样。将回收的试样用缓冲液B分别稀释到1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍，以此制备稀释试样。
将全自动免疫测定装置HISCL2000i（希森美康公司制）的操作设定更改为以下条件，并对各稀释试样进行化学发光（光计数值）测定。
将各稀释试样30µL分装到容器中，在42℃培养2.25分钟后，分装30µL的R2试剂1，在42℃反应2.5分钟。再分装入100µL的R3试剂1，在42℃反应2.75分钟。通过磁分离对磁性粒子进行磁诱导，吸移并废弃溶液。分装清洗试剂，用清洗试剂分散、清洗磁性粒子，再通过磁分离对磁性粒子进行磁诱导，吸移并废弃溶液，此处理反复进行三遍。分装50µL的R4试剂，再添加100µL的R5试剂，测定化学发光。上述测定进行三遍，其结果见图20。如图20所示，DSA测定系列显示出良好的线性，即R2=0.98。
2-3 确认使用MAL的测定系列的稀释线性
在“确认使用DSA的测定系列的稀释线性”中，用R2试剂2取代R2试剂1，用R3试剂2取代R3试剂1，除此之外，以同样的方法对MAL测定系列中的稀释线性进行了确认实验，结果见图21。如图21所示，MAL测定系列显示出良好的线性，即R2=0.99。
2-4 确认使用AOL的测定系列的稀释线性
在“确认DSA的稀释线性”中，用HCV阳性血浆2（Millenium Biotech公司制）取代CONSERA，用R2试剂3取代R2试剂1，除此之外，用同样的方法，AOL测定系列中的稀释线性进行了确认实验，结果见图22。如图22所示，AOL测定系列显示出良好的线性，即R2=0.99。
2-5 用DSA、MAL、AOL对各种市场销售的样本进行测定
对于CONSERA（健康人血清，日水制药公司制）、健康人血清（TRINA公司制）、HCV阳性血浆1和2（Millenium Biotech公司制），用使用了抗AGP抗体的免疫沉降法分离AGP，并将其回收到缓冲液（TBS-0.5%TtitonX-0.1%SDS）中作为测定试样。仅将缓冲液B作为空白测试样。
在与“确认使用DSA的测定系列的稀释线性”、“确认使用MAL的测定系列的稀释线性”、“确认使用AOL的测定系列的稀释线性”相同的条件下，用全自动免疫测定装置HISCL2000i测定各测定试样。各测定所需的时间为17分钟。测定结果见表7、图23和图24
[表7]
DSA MAL AOL MAL/DSA AOL/DSA
CONSERA 13757054 1377260 132648 10.0 1.0
健康人血清 17770250 1549266 417612.7 8.7 2.4
HCV-1 19885106 1877027 185538 9.4 0.9
HCV-2 15225585 825426.3 1776264 5.4 11.7
关于用DSA的测定结果进行了标准化的用MAL的测定的结果，可以看出，图23所示第二快速测定法的测定结果与图18所示凝集素阵列法的测定结果之间有着良好的相关性。关于用DSA的测定结果进行了标准化的用AOL的测定结果，可以看出，图24所示第二快速测定法的测定结果与图19所示凝集素阵列法的测定结果有相同图形，具有良好的相关性。
2-6 用DSA、MAL和AOL对临床样本进行测定
对于纤维化分期为F1的患者血清1和2、纤维化分期为F2的患者血清3和4、纤维化分期为F3的患者血清5和6、纤维化分期为F4的患者血清7和8，分别与实施例1中的浓缩同样地，用抗AGP抗体分离AGP，并将其回收到缓冲液B（TBS-0.5%TtitonX-0.1%SDS）中作为测定试样。仅将缓冲液B作为空白测定试样。
在与“确认使用DSA的测定系列的稀释线性”、“确认使用MAL的测定系列的稀释线性”、“确认AOL的稀释线性”相同的条件下，用全自动免疫测定装置HISCL2000i测定各测定试样。各测定所需的时间为17分钟。结果见表8、图25和图26。
[表8]
样本 1 2 3 4 5 6 7 8
MAL/DSA 12.8 11.5 11.5 10.7 9.4 8.7 5.5 1.1
AOL/DSA 0.3 0.7 0.7 1.2 3.2 3.9 20.2 117.0
2-7 用凝集素阵列法对临床样本进行测定
对于上述2-6的各测定试样，用实施例1所用的凝集阵列，通过抗体铺覆法进行了测定。凝集素阵列法的测定时间约为18小时。结果见表9、图27和图28。
[表9]
样本 1 2 3 4 5 6 7 8
MAL/DSA 27.3 24.3 25.6 24.0 18.1 18.9 8.5 1.3
AOL/DSA 0.5 3.0 4.0 5.0 11.8 13.1 37.1 73.6
从图25-图28所示结果可以看出,第二快速测定法对临床样本也显示出与凝集素阵列法同样的图形，显示出良好的相关性。
[实施例6] 第二快速测定法的验证
1．用125例HCV感染患者的病例进行分析
从实施例5得知，第二快速测定法与凝集素阵列显示出同样的图形。为了用更多的病例进行证实，用下述对象按照实施例5的2-6的步骤实施了第二快速测定法，其中所述对象为：实施例2中使用的、感染了肝炎病毒，并通过肝活检进行了病理诊断，进行了纤维化分期的患者组群125例。125例肝纤维化分期的明细为：F0和F1为33例，F2为32例，F3为31例，F4为29例。
图29显示的是以下两者之间的相关性：肝脏的纤维化进展、以及AGP第二快速测定法中获得的凝集素信号强度的变化。各信号均用DSA凝集素的信号进行了标准化，数值是以DSA信号为100%时的相对信号强度。在图29的左图，对于通过肝活检后的病理分析进行了纤维化分期（F）的125例病例，实施了第二快速测定法，并用盒图显示了各分期中的凝集素信号的分布。从第二快速测定法测得的三种凝集素的值求出MAL/DSA值，并将其绘制成盒图，结果见左上部分，求出AOL/DSA值，并绘制成盒图，结果见左下部分。盒的上端和下端分别是75%点、25%点，线的上端和下端分别是95%点和5%点。盒中的横线为中间值，x为平均值。可以看出，其结果均酷似凝集素阵列的结果，AOL的信号强度随纤维化的进展而增强，通过强度差可以明确地区分慢性肝炎（F0-3）和肝硬化（F4）。与此相反，可以看出MAL的信号强度随着纤维化的进展而减弱。为了证明凝集素阵列的结果和第二快速测定法的结果之间具有相关性，将从二者获得的数值绘制成二维图。该图显示在图29的右图。从此图得知，凝集素阵列的结果和第二快速测定法的结果之间具有很强的相关性。
2．检测肝硬化
用与实施例3所示凝集素阵列的肝硬化检测相同的步骤，用第二快速测定法进行了肝硬化检查。以上述已经进行了病理诊断的125例患者为对象，用DSA凝集素信号对二种凝集素的信号进行标准化并获取数据，用如此获得的数据，绘制了用于将F4（肝硬化）与其他（F1-F3）区分开来的ROC曲线，以距灵敏性100%、特异性100%的点最近的曲线上的点，换言之，也就是以以下两线的切点作为“最佳特异性和灵敏性”，并在其附近设定了截止值，其中上述线为：与Y=X的直线平行的线、以及ROC曲线。通过所获得的与各个凝集素相应的截止值，求出最适合肝硬化检测的组合式（AOL/DSA×1.8度- MAL/DSA），并跟据此组合式，以病理学诊断或图像及临床诊断中确诊为肝炎、肝硬化的患者45例、43例为对象，进行了盲测。
然后，用组合式（AOL/DSA×1.8-MAL/DSA）对检测能力进行了检验，得出的结果是，灵敏性88.3%，特异性91.1%，正确诊断率89.8%。
接下来，为调查本计算公式中假阳性的出现频率，对100名健康人的血清用第二快速测定法进行了分析。用计算公式进行了肝硬化判断，的结果是，如图30所示，假阳性率为5%，假阳性样本与凝集素阵列的结果一致。
[实施例7] 通过肝病病情指标糖链标记物候补糖蛋白M2BP的抗体铺覆凝集素阵列分析来判断肝纤维化的进展
如实施例2所述，我们发现在M2BP中，也可以从抗体铺覆凝集素阵列分析得出的凝集素信号信息中检测出各种肝病病情。在此，为研究其与肝纤维化的相关性而进行了实验。实验对象是：感染了AGP实验中所用的肝炎病毒、通过肝活检进行了病理诊断，进行了纤维化分期的患者组125例，对上述对象，按照实施例2的步骤进行了抗体铺覆凝集素微阵列实验。在产生结合信号的17种凝集素中，通过显著性差异验证，得知有6种凝集素随着纤维化的进展出现信号变化，就这6种凝集素绘制了反映其与纤维化进展的相关性的图表，见图31。用盒图显示了各分期的凝集素信号的分布。盒的上端和下端分别是75%点、25%点，线的上端和下端分别是95%点、5%点。盒中的横线为中间值，x为平均值。各图表的纵轴是以DSA信号为100%时的相对值。可以看出，RCA120、AAL、TJAll、WFA、BPL的信号强度随着纤维化的进展而增强，而LEL信号强度随着纤维化的进展而减弱。其中，从监视纤维化的进展这一观点而言，RCA120和AAL比较适合。另外，TJAll、WFA、BPL是属于转为肝硬化（F4）后才产生信号的类型。而且，在F4中信号的差别很大，这意味着其可能成为用于筛查患癌高危人群的有效标记物。
[实施例8] 通过检测M2BP的糖链变化来筛查肝癌高危人群
1. 选择适于筛查肝癌高危人群的凝集素
在实施例7中发现了信号强度随肝纤维化而增强的凝集素群。为了从这些凝集素群中选择能够筛查患癌高危人群的凝集素，以肝细胞癌患者术前术后血清7例为对象，进行了M2BP的抗体铺覆凝集素微阵列分析。其实验步骤与实验例1相同。此外，还使用全自动荧光免疫测定装置（µTAS Wako i30；和光纯药工业株式会社制）和专用试剂，对以下进行了测定：众所周知的肝细胞癌标记物AFP的血液中含量、以及良性疾病·肝细胞癌的鉴别标记物AFP-L3%。图32显示的是其结果中的一部分凝集素信号图形。在7例对象中，包括AFP-L3%的所有参数在术后并非都出现了信号减弱。这意味着其均不是癌症检测标记物。本实验的目的是选择肝细胞癌患癌高危人群的标记物候补。在这一点上，希望有与AFP-L3%相类似的图形。如所预料的，在实施例7中，WFA、BPL凝集素与AFP-L3%的图形类似。而且，WFA比BPL信号强度更强、更稳定，因此将WFA选为可用凝集素。
2. 用凝集素-抗体夹心ELISA法检测WFA结合性M2BP
将WFA结合性M2BP作为用于筛选肝癌高危人群的标记物，检测该生物标记物的最佳方式可以考虑到以下方式：通过性能能够得到临床认可，且能够在临床中使用的方法来检测血清中含有的生物标记物。以下举例显示了使用抗M2BP抗体铺覆-WFA微孔板（参照图33）的夹心检测分析的结果。在本方法中可直接在WFA微孔板中添加血清。其依据是：血清所含糖蛋白中能与WFA结合的分子非常少，在患癌高危人群中，M2BP是血中浓度最高的分子之一。
（实验方法）
在微孔板（Greiner公司制，96孔平底链霉亲和素包被板）的各孔中分别注入50µL溶解于PBS缓冲液的生物素化WFA（Vector公司制，5µg/mL），在室温下保温2小时，将WFA固化到载体上。用清洗液，即含0.1%吐温20的PBS（300µL）分别清洗二遍未结合的WFA，制成WFA固化微孔板。
用上述清洗液50µL稀释各样本1µL，将其添加到1中制作的WFA固化微孔板后，在室温进行2小时的结合反应。反应后，用300µL上述清洗液清洗各孔5遍，除去未结合蛋白质。向各孔各加入50µL预先用清洗液调到1.0µg/mL的检测剂（羊抗M2BP多克隆抗体溶液；R&DSystems公司制），在室温下进行2小时抗原抗体反应。
为除去未结合抗体，用300µL清洗液进行清洗后，在各孔中分别加入50µL用清洗液稀释10000倍的抗羊IgG抗体-HRP溶液（Jackson immuno Research公司制），在室温下保温1小时。用300µL清洗液清洗各孔5遍后，在各孔中分别加入100µL的显色试剂，即ULTRA-TMB溶液（Thermo公司制），进行10分钟显色反应。在各孔中分别加入1M的H2SO4溶液100µL，停止反应，用酶标仪以450nm测定吸光度。在所得信号中，以健康人血清为阴性对照，数值化为S/N比，用于以后的分析。
（结果）
首先以上述肝细胞癌患者的术前术后血清7例为对象进行了分析。结果，获得了酷似图32的结果的信号图形（图34的上图）。在这些病例中，对术后继续采血的3例，测试了WFA结合性M2BP的量。患者A和B为术后复发病例，患者E为无复发病例。用箭头表示复发点。其结果显示在图34的下图。横轴以手术日为0，表示术后经过的月数。在纵轴中以健康人血清为阴性对照（N），用S/N比表示。患者A的测定值在术后也继续在S/N=2.5附近推移，复发点以后数值开始上升。患者B术前的测定值非常高，术后该值减少，在S/N=2.5附近停止。另一方面，患者E在术前术后均显示S/N=2.0这一最低值，且该数值逐渐下降。从以上结果看出，术后停止在S/N﹥2.5的患者的复发风险高，而且复发后数值一路上升，与此相对地，术后迅速减少、大大低于S/N=2.0的患者不复发的可能性高。根据以上结果得知，WFA结合性M2BP可以作为用于筛选肝癌发病高危人群的标记物，且开发出了抗M2BP抗体铺覆-WFA微孔板，将该板作为用于检测上述标记物的简易测定系统。
[实施例9] 验证在通过ELISA（酶联免疫吸附试验）法检测WFA结合性M2BP时样本加热处理的影响
在此验证确认了以下：在通过ELISA法检测WFA结合性M2BP时，是否进行样本加热处理对检测灵敏性的影响。
用含有0.2% SDS的PBS缓冲液将来源于人肝癌的细胞株（HepG2培养上清）稀释10倍，在95℃加热10分钟。
样本使用的是HepG2培养上清（未处理）和HepG2培养上清（加热处理），且需要使各孔的蛋白质量达到下述表10所示量，除此之外，用与实施例8的2相同的方法测定与WFA结合的M2BP。用酶标仪测得的吸光度见表10和图35。
[表10]
ng 总蛋白质/孔 未处理 加热处理
5000 2.073 0.365
3000 1.861 0.275
1000 1.372 0.143
500 1.102 0.097
100 0.398 0.032
50 0.181 0.03
10 0.047 0.05
表10和图35的结果表明，在用ELISA法测定WFA结合性M2BP时，将未进行加热处理的血清作为测定样本使用的话，测定灵敏性提高。
[实施例10] 用第二快速测定法测定M2BP
1. 试剂的制备
R1试剂的制备：制备含有以下成分的溶液（缓冲液C），并将其作为R1试剂：10 mM的HEPES（pH7.5）、150mM的NaCl、0.01mM MnCl2、0.1mM的CaCl2、以及0.08w/v%的NaN3。
R2试剂的制备：在缓冲液C中添加市场销售的、固定有链霉亲和素的磁性粒子（个数平均粒径2µm）（以下称为链霉亲和素敏化磁性粒子），直至浓度为0.5 w/v%，再在其中添加生物素化凝集素溶液（WFA）。此混合液在室温下搅拌30分钟。搅拌后用磁铁进行磁诱导，使磁性粒子沉降，废弃溶液成分。用缓冲液C清洗3遍后，添加缓冲液D（含有以下成分的溶液：10mM的HEPES（pH7.5）、150mM的NaCl、0.01mM的MnCl2、0.1mM的CaCl2、0.1%W/V的BSA、以及0.08w/v%的NaN3，直至磁性粒子浓度达0.5 w/v%。
R3试剂的制备：制备含有以下成分的溶液作为R3试剂：0.1U/mL重组ALP标记鼠抗M2BP单克隆抗体、0.1M的MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸，pH6.5）、0.15M的NaCl、1mM的MgCl2、0.1mM的ZnCl2、0.1 w/v%的NaN3。
R4试剂、R5试剂和清洗试剂使用实施例5的第二快速测定法中使用的R4试剂、R5试剂和清洗试剂。
2. 确认使用WFA的测定系列的稀释线性
用缓冲液（PBS）将来源于人肝癌的细胞株培养上清（HepG2培养上清）100µg/ml稀释到10倍、100倍、1000倍和10000倍，制备出稀释试样。再用缓冲液（PBS）将5µg/ml的重组人半乳糖凝集素-3BP/MAC-2BP[Recombinant Human Galectin-3BP/MAC-2BP(R & D系统公司制）]将其稀释到2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍，制备出稀释试样。
将全自动免疫测定装置HISCL2000i（希森美康公司制）的操作设定更改为以下条件，对各稀释试样进行化学发光强度（光计数值）测定。
将30µL的R1试剂和10µL的各稀释试样分装到容器中，在42℃培养2.25分钟后，再分装30µL的R2试剂，在42℃反应1.5分钟。通过磁分离法，对磁性粒子进行磁诱导，吸移并废弃溶液。分装入清洗试剂，用清洗试剂分散、清洗磁性粒子，再通过磁分离法，对磁性粒子进行磁诱导，吸移并废弃溶液，此处理反复进行三遍。分装100µL的R3试剂，在42℃反应2.75分钟。通过磁分离法，对磁性粒子进行磁诱导，吸移并废弃溶液。分装清洗试剂，用清洗试剂分散、清洗磁性粒子，再通过磁分离法，对磁性粒子进行磁诱导，吸移并废弃溶液，此处理反复进行三遍。分装50µL的R4试剂，再分装100µL的R5试剂，测定化学发光强度。HepG2培养细胞的上清的测定结果见表11和图36，重组人半乳糖凝集素-3BP/MAC-2BP的测定结果见表12和图37。如这些测定结果所示，WFA测定系列显示出良好的稀释线性。
[表11]
µg/测试（10µl） 发光强度（计数） S/N（对稀释液）
稀释液（PBS） 2,987 1.00
0.0001 3,043 1.02
0.001 4,850 1.62
0.01 31,671 10.60
0.1 332,706 111.38
[表12]
ng/测试（10µl） 发光强度（计数） S/N（对稀释液）
稀释液（PBS） 2,987 1.00
0.3906 14,456 4.84
0.7813 26,640 8.92
1.5625 55,721 18.65
3.125 123,939 41.49
6.25 313,747 105.04
12.5 663,628 222.17
25 1,822,168 610.03
3. 对临床样本进行测定
在与“2. 确认使用WFA的测定系列的稀释线性”同样的条件下，用全自动免疫测定装置HISCL2000i测定了健康人血清、HBV阳性肝细胞癌患者血清、以及HCV阳性肝细胞癌患者血清。各样本测定所需的时间为17分钟。结果如表13所示。
[表13]
发光强度（计数） S/N（对健康人血清）
健康人血清 654,663 1
HBV阳性肝癌患者血清 11,317,040 17.3
HCV阳性肝癌患者血清 17,124,911 26.2
从表13的结果可以确认,用第二快速测定法可以迅速而准确地测定与WFA结合的M2BP。
产业上应用的可行性
本项发明可以用于制造以下：判断肝病或肝病病情的装置、器具或试剂盒，还可以用于肝病病情判断或肝硬化检测等。

Claims (7)

1.一种用于测定采自受检者的试样中所含具有与肝纤维化进展相关的特异性糖链变化的α-1-酸性糖蛋白(AGP) 的AGP定量用试剂，其特征在于，该AGP定量用试剂具有以下物质：固定有凝集素AOL的磁性粒子、固定有凝集素MAL的磁性粒子、以及标记抗AGP抗体。
2.根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，所述标记抗AGP抗体的标记物是经过去糖基处理的碱性磷酸酶。
3.根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，所述标记抗AGP抗体的抗AGP抗体是经过去糖基处理的抗AGP抗体。
4.根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，还具有反应性不随AGP的糖链结构变化而变化的标准化用凝集素。
5.根据权利要求4所述AGP定量用试剂，其特征在于，所述标准化用凝集素是DSA。
6.根据权利要求1所述AGP定量用试剂，其特征在于，该试剂包括固定有DSA的磁性粒子。
7.一种肝病病情指标糖链标记物，该标记物由具有与肝纤维化进展相关的特异性糖链变化且与凝集素AOL结合了的α-1-酸性糖蛋白(AGP)和具有与肝纤维化进展相关的特异性糖链变化且与凝集素MAL结合了的AGP构成。
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Assignee: Sysmex biotechnology (Wuxi) company limited

Assignor: Sysmex Corp.

Contract record no.: X2019990000175

Denomination of invention: Method for measurement of glycoprotein, reagent and sugar chain marker

Granted publication date: 20170118

License type: Common License

Record date: 20191108

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