JPWO2011007797A1 - 糖タンパク質の測定方法、肝疾患の検査方法、糖タンパク質定量用試薬および肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
1−1.肝疾患の病態
B型肝炎ウイルス又はC型肝炎ウイルスに感染すると、急性期炎症から5−15年をかけて慢性期炎症へと進行する。特に慢性期に移行したC型肝炎が自然に治癒する事は稀で、肝機能の低下が進行し肝硬変に至る。C型肝炎感染から肝細胞がんへと至るまでの時間経過と肝の状態の変化を図1に示す。慢性肝炎から肝硬変に至る病態を定義するため、肝臓のグリソン領域及び肝小葉に出現する線維性変化を病理形態学的に捉えて、軽度(F1)、中度(F2)、重度(F3)、肝硬変期(F4)に分類する。線維化の進展は肝細胞がん発がんのリスク上昇と相関しており、図2に示されるようにF1もしくは2である場合年率1%以下であるのに対し、F3である場合には年3−4%に上昇する。線維化の程度がより進展した組織像を確認して診断される肝硬変(F4)では、図3に示されるように年率7%程度の確率で肝細胞がんが出現する。従って肝細胞がんを効率良く発見して治療するためには、特にF3およびF4の状態にある患者を簡便に選別して、精密検査対象者としてフォローすることが重要である。
C型慢性肝炎に対しては、PEG-IFN+RBV療法、C型肝硬変代償期に対してインターフェロン単独投与が適応されている。一方、B型肝炎(慢性肝炎、肝硬変)に対する治療としては核酸アナログが主体であり、炎症や線維化評価マーカーは必須と思われる。特に、血清バイオマーカーは診断・評価目的に幅広く臨床応用されることが期待される。
肝細胞発がんには、 B型肝炎ウイルスもしくはC型肝炎ウイルス感染による微生物学的因子と、環境因子が大きく交互に作用すると考えられている。わが国において、肝細胞がん患者の約9割は、B型あるいはC型肝炎ウイルスの感染既往があり、慢性肝炎・肝硬変患者に発生している事が知られている。肝細胞がんの発がん危険因子には、ウイルス以外にも、男性、高齢、アルコール多飲、タバコ、カビ毒の一つであるアフラトキシンなどが指摘されている。(肝がん診療ガイドライン、財)国際医学情報センター)
1−4.肝細胞がんの早期診断
肝細胞がんの発見は、現在のところ、被験者からの血清サンプル中のAFPやPIVKA-IIなどの肝臓がんマーカーの測定、及び超音波検査(エコー検査)を中心とした画像診断が主として用いられている。画像診断としては、最初の検査として、超音波検査又はCTを用い、これらで何らかの異常が見いだされときには、更にMRIや血管造影をするのが通常である。
肝細胞がん患者の約9割が、B型肝炎ウイルスもしくはC型肝炎ウイルス感染による肝炎患者から発生する我が国においては、ウイルス感染と肝機能低下を指標として、精密検査の対象となる患者を囲い込む事は可能である。
本願発明の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質であるAGPおよびM2BPは、ウイルス感染による疾患の発症と進展において生じる慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がんを特徴づける糖鎖変化を生じることが見出された。このような、ウイルス性肝疾患の病態進行に伴う糖鎖変化を指標として、肝疾患病態を特定できるマーカー糖タンパク質を肝疾患病態指標糖鎖マーカーと呼ぶ。
AGPおよびM2BP上に存在する糖鎖の疾患特異的な変化は後述するレクチンアレイにより検証する。より好ましくは抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法を用いる。上記マーカー糖タンパク質をレクチンアレイを用いて測定した結果をもとに、1)病気の進み具合に応じてどのレクチンシグナルにどの程度の測定値変化が見られるのか、2)測定値の変化は、どの病期(初期か晩期か)にもっとも顕著となるのか、3)測定値変化の情報は、疾病のコントロールに資するかどうかを検討し、有用性を評価し、どの肝疾患病態に適したマーカーであるかを検証する。
レクチンアレイは、複数種の特異性の異なる判別子(プローブ)レクチンを1つの基板上に並列に固定(アレイ化)したもので、分析対象となる複合糖質にどのレクチンがどれだけ相互作用したかを一斉に解析できるものである。レクチンアレイを用いることで、糖鎖構造推定に必要な情報が一度の分析で取得でき、かつ、サンプル調製からスキャンまでの操作工程は迅速かつ簡便にできる。質量分析などの糖鎖プロファイリングシステムでは、糖タンパク質をそのまま分析することはできず、あらかじめ糖ペプチドや遊離糖鎖の状態にまで処理をしなければならない。一方、レクチンマイクロアレイでは、例えば、コアタンパク質部分へ直接蛍光体を導入するだけで、そのまま分析できるという利点がある。レクチンマイクロアレイ技術は、本発明者等が開発したもので、その原理・基礎は、例えば、Kuno A., et al. Nat. Methods 2,851-856(2005).に記載されている。
レクチンアレイは、現在では、精製標品だけでなく、血清や細胞ライセートなどの混合試料の定量比較糖鎖プロファイリングができる実用化技術にまで発展してきている。特に細胞表層糖鎖の比較糖鎖プロファイリングはその発展がめざましい(Ebe, Y. et al. J. Biochem. 139, 323-327(2006)、Pilobello, K.T. et al. Proc Natl Acad Sci USA.104,11534-11539(2007)、Tateno, H. et al. Glycobiology 17, 1138-1146(2007))。
レクチンマイクロアレイのプラットフォームは基本的に上記の通りとし、検出に際しては上記被検体を直接蛍光などで標識するのではなく、抗体を介して間接的に蛍光基などを被検体に導入することで、一斉に多検体に対する分析を簡便、高速化することができる応用法である(「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108(2009)」、「平林淳、久野敦、内山昇「レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリング応用技術の開発」、実験医学増刊「分子レベルから迫る癌診断研究〜臨床応用への挑戦〜」、羊土社、Vol25(17)164-171(2007)」、久野敦、平林淳「レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリングシステムの糖鎖バイオマーカー探索への活用」、遺伝子医学MOOK11号「臨床糖鎖バイオマーカーの開発と糖鎖機能の解明」、pp.34-39、メディカルドゥ(2008)参照)。
レクチンマイクロアレイの代わりにコアタンパク質に対する抗体をガラス基板などの基板上に並列に固定(アレイ化)した抗体マイクロアレイを用いる方法である。調べるマーカーに対するだけの数の抗体が必要である。糖鎖変化を検出するレクチンをあらかじめ確定することが必要である。
AGPおよびM2BPは、線維化の進展などの肝疾患の病態変化に伴い糖鎖構造が変化する新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーである。このためAGPおよびM2BP糖鎖構造の変化に対応して反応性が変化するレクチン(以下、レクチン“A”と略す)と、被験者から採取した試料に含まれるマーカーとを反応させ、レクチンに反応したマーカーを測定することにより、肝疾患の病態を判別したり、肝の線維化の度合いを判定したりすることができる。
(1)(イ)上記レクチン“A”及び(ロ)上記マーカーの糖鎖以外の部分(コアタンパク質)を検出する抗体を用いて実施することができる。また(2)肝疾患病態指標糖鎖マーカーに対する特異的な抗体であって、糖鎖結合部分を含む個所ををエピトープとする抗体を用いて肝疾患病態指標糖鎖マーカーを検出することができる。
1)被験者から採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカーを測定する工程、
2)健常者から採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカーを測定する工程、
3)肝疾患患者から採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカーを測定する工程、
及び
4)被験者から得られた肝疾患病態指標糖鎖マーカーの測定結果と健常者又は肝疾患患者から得られた肝疾患病態指標糖鎖マーカーの測定結果を比較し、被験者の測定結果がより肝疾患患者の測定値に近い場合に肝疾患であると判別する工程を含む肝疾患の検出方法が挙げられる。
肝炎ウイルス感染による肝炎の進展に於いて、線維化の程度は、肝機能低下及び肝細胞発がんのリスクと相関する事が知られている。したがって線維化の測定は、肝機能低下および発がんリスクを評価することを意味する。また肝炎患者の全体の4割程度は、インターフェロン治療に反応せずウイルス感染が持続する。これらの病態が活動性に進行するか否かは、線維化の進展で判断されるべきであると考えられている。これらの観点から、線維化の進展を測定する事は、肝炎の診断治療に於いて重要な意味を持つ。
例えば、少なくとも第1レクチンが固定された第1レクチンアレイと、抗AGP抗体とを用いて、第1レクチンに結合するAGPを測定することができ、少なくとも第2レクチンが固定された第2レクチンアレイと、抗M2BP抗体とを用いて、第2レクチンに結合するM2BPを測定することができる。
肝硬変は、肝小葉構造の消失した再生結節とこれを取り囲む緻密な線維性結合組織が肝全体に瀰漫性に出現する病態と定義される。これは、肝細胞障害と線維化が持続する進行性慢性肝疾患の終末状態でもある。肝硬変における肝生検は成因診断を探るために行なわれるもので、早期の肝硬変や大結節型の肝硬変では診断困難な症例が多い(外科病理学第4版、文光堂より)。したがって、肝硬変を定性的、定量的に診断できる検査技術が必要とされている。この目的に対し、1)の線維化の進展測定方法、の項で見出された線維化の進展をモニタリングできる候補分子抗体およびレクチンセットのうち、線維化ステージF3とF4を見分けることができる場合、肝硬変検出に使用できる。
4−3.試料中の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー上の疾患特異的糖鎖変化の検出
試料としては、生検試料、体液試料、好適には、血液(血清、血漿等)が挙げられる。
新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーを利用する肝細胞がんの検出方法において、肝疾患病態指標糖鎖マーカー特異的ポリクローナル抗体及び/又はモノクローナル抗体が容易に入手できる場合は、それらを用いることができるが、容易に入手できない場合は、例えば、以下のように調製できる。
本願発明の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーは、肝疾患検出用のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の調製に用いることができる。
肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質であるAGP、およびMac2BP(M2BP)について、抗体オーバーレイ・レクチンアレイを活用して肝疾患の検出を実施した例を以下に示す。なお、本手法による(ウイルス性)肝炎患者(CH)、肝硬変患者(LC)、肝細胞がん患者(HCC)、および健常者(HV)血清に由来する該マーカー糖タンパク質上糖鎖の比較解析の手順を図7に示す。
(ウイルス性)肝炎患者(CH)、肝硬変患者(LC)、肝細胞がん患者(HCC)、および健常者(HV)血清に由来する該マーカー糖タンパク質のエンリッチは、「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J.Mol Cell Proteomics. 8, 99-108 (2009) 」に従って行われた。なお、得られる結果が病態に依存していることを明らかにするため、各病態につき5例ずつを分析に用いることにした。各患者血清を0.2%SDS含有PBS緩衝液で10倍希釈し、10分間95℃で加熱処理したものを、AGPにおいては5μL、Mac2BPにおいては20μL反応チューブに分注し、そこへ500 ngの各抗原に対する抗体(ビオチン化物)を添加した。各反応溶液は反応バッファー(1%Triton X-100入りTris-buffered saline (TBSTx))により、45μLに調整された後、4℃で2時間振盪反応された。抗原抗体反応後、速やかにストレプトアビジン固定化磁気ビーズ溶液(Dynabeads MyOne Streptavidin T1, DYNAL Biotech ASA製)をあらかじめ反応バッファーで3回洗浄し、かつ2倍濃縮状態で調整したもの5μL(元のビーズ溶液10μL分に相当)を上記反応溶液へ加え、1時間さらに反応した。この反応により、ビオチン化抗体を介して、該糖タンパク質は磁気ビーズと複合体を形成する。この複合体を磁気ビーズ回収用マグネットに吸着させた後に溶液を廃棄した。回収された複合体は500μLの反応バッファーにより3回洗浄された後に、10μLの溶出バッファー(0.2%SDS含有TBS)に懸濁された。この懸濁溶液を95℃で5分間熱処理することで、該糖タンパク質を磁気ビーズから解離溶出し、得られた溶液を溶出液とした。その際、熱変性されたビオチン抗体も混入するため、溶出液に上述の手法で2倍濃縮状態で調整された磁気ビーズ溶液を10μL(元のビーズ溶液20μl分に相当)加え、1時間反応することで、ビオチン化抗体を吸着除去した。これにより得られた溶液を血清由来該糖タンパク質溶液とし、以降の実験に用いた。
上述により得られた該糖タンパク質溶液適当量とり、レクチンアレイ反応バッファーである1%Triton X-100含有Phosphate-buffered saline (PBSTx)により、60μLに調整した。この溶液をレクチンマイクロアレイの各反応槽(ガラス1枚当たり8つの反応槽が形成されている)へ添加し、20℃で10時間以上反応した。この8つの反応槽からなるレクチンマイクロアレイ基盤の作製は内山ら(Proteomics 8, 3042-3050 (2008))の手法に従った。これにより該糖タンパク質上の糖鎖とアレイ基板上に固定されている43種のレクチンとの結合反応が平衡状態に達する。その後、未反応の基盤上レクチンへ検出用抗体上の糖鎖が結合し、ノイズとして生じてしまうことを避けるため、ヒト血清由来IgG溶液(シグマ社製)を2μL加え、30分反応させた。60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、再度ヒト血清由来IgG溶液を2μL加え、若干攪拌した後に、検出用の該糖タンパク質に対する抗体(ビオチン化物)を100 ng相当加え、20℃で1時間反応させた。抗原抗体反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄し、次いでCy3標識ストレプトアビジン200 ng相当が含有しているPBSTx溶液を加え、さらに30分、20℃で反応した。反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、モリテックス社製アレイスキャナーGlycoStationによりアレイスキャンを行った。
実施例1の通り、糖タンパク質の抗体オーバーレイ・レクチンアレイ解析により得られたレクチンシグナル情報から、統計解析により取捨選択し最適なものを用いることで、各肝疾患病態を検出できる可能性が見出された。
線維化進展に伴いシグナル変動を示すレクチン群を絞り込むため、まず臨床診断済み患者HCC, LC, CH各10症例の血清を用い、AGPの抗体オーバーレイ・レクチンアレイ解析を実施した。より客観的な絞り込みを行うため、HCC-LCおよびLC-CH間でStudent T検定を行い、危険度が0.1%以下の値を示すレクチンを有用レクチンとした。その結果を表3に示す。先の実験結果(図8)からわかるように、AGPのアレイ解析により、15種のレクチンにおいてシグナルが得られているが、そのうちStudent T検定により危険度が0.1%以下の有意差を示すレクチンはLEL, AOL, AAL, MAL, STL,およびPHAEの6種であった。また、本実験により、最もシグナル変動せず再現性高い結果を取得できたレクチンDSAについては、取得されたデータの規格化に有効性を見出し、以降スキャン後、数値化されたデータはすべてDSAシグナルにより規格化することとした。
つぎに、肝炎ウイルスに罹患し、肝生検により病理診断され線維化のステージングがなされている患者群125症例を対象に、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイを実施例1の手順に従い行った。なお、125症例の肝臓線維化ステージの内訳は、F0およびF1が33症例、F2が32症例、F3が31症例、F4が29症例である。上述の手順に従い、統計学的に判別に有用なレクチンの絞り込みを行った。その結果、上位6種レクチンの結果を表4に示す。先に得られた6つレクチンが上位を占め、その中でもLEL, AOL, MALが最も判別に有効なものとして選抜されたため、この3種についてより詳細なデータ解析を行った。
実施例2の結果から、肝線維化の進展を基準として各レクチンシグナル単独もしくは組み合わせのカットオフ値を設定することで、肝硬変の検出が可能となると考え、以下の手順で実験を実施した。
まず、肝炎ウイルス罹患者の中から肝硬変発症患者を検出するための、各レクチンのカットオフ値を設定することにした。このために病理診断済み患者80症例分(F1, F2, F3, F4各20症例)を対象に、実施例2で絞り込まれた2種レクチンのシグナルをDSAレクチンシグナルで規格化したデータを用い、他(F1-F3)からF4(肝硬変)を区別するReceiver operating characteristic curve (ROC曲線)を作成した。その結果を図11左に示す。図11には、AOL, MALシグナルを単独に用いた場合の曲線のほかに、2つのシグナルを用いた数式(AOLの相対シグナル強度)X 1.5 -(MALの相対シグナル強度)から得られる数値による曲線も示す。曲線の下部領域の面積を示すAUC(area under curve)値を求め、各手法の診断力を査定する。また感度100%、特異度100%点から最も近い距離にある曲線上の点、言い換えるとY=Xの直線に平行な線と、ROC曲線との接点を、「最適な特異度および感度」とし、その周辺にカットオフ値を設定した。それらの数値を図11の右表に記す。得られたカットオフ値を用い、病理学的診断又は画像・臨床診断 により肝炎および肝硬変と確定された患者、45症例および43症例を対象にブラインドテストを実施した。その結果を図11の右表のValidation setの項に記す。肝硬変を陽性、肝炎を陰性とし、それぞれの検出数を列挙した。ROC曲線より、最良の感度(Sensitivity)および特異度(Specificity)を示す点におけるカットオフ値を決定したところ、AOLは8%、MALは11.8%であった。また、コンビネーションの系が最も偽陰性、偽陽性患者数が少なく、正診率(%)((総患者数―偽陽性、偽陰性患者数)/(総患者数)X100)が高くなった。
臨床診断済み慢性肝炎患者45症例および肝硬変患者43症例について、実施例2の手順に従い、AGPを標的分子とした抗体オーバーレイ・レクチンアレイを実施した。シグナルはすべてDSAレクチンのシグナルを100%とし、規格化した。その数値を上述したカットオフ値を利用し、陽性、陰性の判別をすることにより、肝硬変検出検定を試みた。その結果、AOLシグナルを用いた場合、検出力として感度86.1%、特異度91.1%、正診率88.6%となり、MALシグナルを用いた場合、検出力として感度90.7%、特異度88.9%、正診率89.8%となった。いずれもかなり高度な検出が可能でり、正診率が85%を超えていた。さらに、2つのシグナルをコンビネーションした式((AOLの相対シグナル強度)X 1.5 -(MALの相対シグナル強度))を用いて検出力を調べてみたところ、感度95.4%、特異度91.1%、正診率は93.2%という最も確度の高い肝硬変検出結果が得られた。特筆すべきことは、これまで公知となっているAALレクチンやRCAレクチンを用いたAGPの疾患特異的糖鎖変化を検出する手法と比較して圧倒的に検出力が高い点である。このような結果は、今回の抗体オーバーレイ・レクチンアレイによる絞り込みの工程で、AALやRCA120がAOL, MALに比べ劣っていたことと一致する(表3,4を参照)。
実施例2の結果により、AOLおよびMALのシグナル変動の観察により、線維化の進展をモニタリングすることができることが分かった。そこで、AOL/DSAやMAL/DSAを線維化進展パラメーターとして用い、抗ウイルス剤であるインターフェロンの治療効果を判定できるかを試みた。C型肝炎患者でインターフェロンの治療効果が認められた持続性ウイルス陰性化(SVR)例群と、治療効果が認められなかったウイルス学的不応(NVR)例群について以下の実験を行った。インターフェロン治療後、経時的に血液採取された患者の血清を対象に実施例1と同様の手法で血清中AGPのエンリッチおよび抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ解析を行い、DSAシグナルによる規格化後のAOL, MALの相対シグナル値を算出した。その典型例それぞれ2症例分の各シグナルの経時的変化を図12に示す。時間軸は治療直後の採血日を0とし、相対結合シグナルは治療直後の相対値を0としている。SVR症例ではMALシグナルは経時的に増加したが、AOLのシグナルは減少もしくはシグナル検出できなかった。すなわち、これら症例は線維化が緩和されている傾向にあった。それに対しNVR症例では、AOLシグナルは経時的に増加し、MALのシグナルはほぼ変化がなかった。すなわちこれら症例の線維化は緩和されず、むしろ悪化している(線維化が進展している)傾向が観察された。以上により、インターフェロン治療後の効果判定を血液検査で行うことが可能であることがわかった。
1. 第1迅速測定方法(マニュアル法)
1−1.試薬の調製
R1試薬の調製:緩衝液A(PBS−1%TritonX、pH7.4)中に5μg/mLのビオチン化DSA(J−オイルミルズ社製)を添加してR1試薬1を調製した。緩衝液A中に5μg/mLのビオチン化MAL(Vector社製)を添加してR1試薬2を調製した。緩衝液A中に2.5μg/mLのビオチン化AOLを添加してR1試薬3を調製した。なお、ビオチン化AOLは、ビオチン標識キット(DOJIDO社製)を用いて、AOL(東京化成社製)をビオチン化したものを使用した。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)中のAGPを、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いて緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し試料とした。回収した試料を緩衝液Bで1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍にそれぞれ希釈した希釈試料を調製した。
「DSAの希釈直線性の確認」において、R1試薬1に代えてR1試薬2を使用し、R3試薬1に代えてR3試薬2を使用すること以外は同様にして、MAL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図14に示した。図14に示されるようにMAL測定系についてはR2=0.99と良好な直線性を示した。
「DSAの希釈直線性の確認」において、コンセーラに代えてHCV陽性血漿2(Millenium Biotech社製)を使用し、R1試薬1に代えてR1試薬3を使用すること以外は同様にして、AOL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図3に示した。図15に示されるようにAOL測定系についてはR2=0.98と良好な直線性を示した。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)、正常ヒト血清(TRINA社製)、HCV陽性血漿1および2(Millenium Biotech社製)のそれぞれについて、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いてAGPを分離し、緩衝液(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し測定試料とした。また、緩衝液のみをブランク測定試料(NC)とした。
上記1−5の各測定試料について、実施例1で用いたレクチンアレイを用いて、抗体オーバーレイ法による測定を行った。レクチンアレイ法による測定時間は約18時間であった。結果を表6に示すと共に図18及び図19に示した。
2−1.試薬の調製
R1試薬の調製:緩衝液A(PBS−1%TritonX、pH7.4)をR1試薬とした。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)中のAGPを、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いて緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し試料とした。回収した試料を緩衝液Bで1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍にそれぞれ希釈した希釈試料を調製した。
「DSAを用いる測定系の希釈直線性の確認」において、R2試薬1に代えてR2試薬2を使用し、R3試薬1に代えてR3試薬2を使用すること以外は同様にして、MAL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図21に示した。図21に示されるようにMAL測定系についてはR2=0.99と良好な直線性を示した。
「DSAの希釈直線性の確認」において、コンセーラに代えてHCV陽性血漿2(Millenium Biotech社製)を使用し、R2試薬1に代えてR2試薬3を使用すること以外は同様にして、AOL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図22に示した。図22に示されるようにAOL測定系についてはR2=0.99と良好な直線性を示した。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)、正常ヒト血清(TRINA社製)、HCV陽性血漿1および2(Millenium Biotech社製)のそれぞれについて、抗AGP抗体を用いた免疫沈降法によりAGPを分離し、緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し測定試料とした。また、緩衝液Bのみをブランク測定試料とした。
線維化ステージF1の患者血清1及び2、線維化ステージF2の患者血清3及び4、線維化ステージF3の患者血清5及び6、線維化ステージF4の患者血清7及び8のそれぞれについて、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いてAGPを分離し、緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し測定試料とした。また、緩衝液Bのみをブランク測定試料とした。
上記2−6の各測定試料について、実施例1で用いたレクチンアレイを用いて、抗体オーバーレイ法による測定を行った。レクチンアレイ法による測定時間は約18時間であった。結果を表9、図27及び図28に示した。
1.HCV感染患者125症例を用いた解析
実施例5により第2迅速測定法はレクチンアレイと同様のパターンを示すことがわかった。より多くの症例で実証するために、実施例2で使用した、肝炎ウイルスに罹患し、肝生検により病理診断され線維化のステージングがなされている患者群125症例を対象に、第2迅速測定法を実施例5の2−6の手順に従い行った。なお、125症例の肝臓線維化ステージの内訳は、F0およびF1が33症例、F2が32症例、F3が31症例、F4が29症例である。
実施例3に示したレクチンアレイによる肝硬変の検出と同様の手順で、第2迅速測定法により肝硬変の検出を試みた。上述の病理診断済み患者125症例分を対象に、2種レクチンのシグナルをDSAレクチンシグナルで規格化したデータを用い、他(F1-F3)からF4(肝硬変)を区別するROC曲線を作成し、感度100%、特異度100%点から最も近い距離にある曲線上の点、言い換えるとY=Xの直線に平行な線と、ROC曲線との接点を、「最適な特異度および感度」とし、その周辺にカットオフ値を設定した。得られた個々のレクチンに対するカットオフ値から肝硬変検出に最適なコンビネーション式(AOL/DSA ×1.8 − MAL/DSA)を求め、それにより病理学的診断又は画像・臨床診断 により肝炎および肝硬変と確定された患者、45症例および43症例を対象にブラインドテストを実施した。
実施例2の通り、M2BPにおいても、抗体オーバーレイ・レクチンアレイ解析により得られたレクチンシグナル情報から、各肝疾患病態を検出できる可能性が見出された。そこで肝線維化との相関を検討するための実験を実施した。AGPの実験で用いた肝炎ウイルスに罹患し、肝生検により病理診断され線維化のステージングがなされている患者群125症例を対象に、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイを実施例2の手順に従い行った。結合シグナルの生じた17種レクチンのうち、有意差検定により線維化の進展に伴うシグナル変化が認められた6つのレクチンについて、線維化進展との相関を表すグラフを作成した。それを図31に示す。各ステージのレクチンシグナルの分布を箱ひげ図により示した。箱の上端および下端はそれぞれ75%点、25%点を示し、ひげの上端および下端はそれぞれ95%点、5%点を示す。箱中の横線は中央値を示し、×は平均値を示す。なお、各グラフの縦軸はDSAのシグナルを100%とした時の相対値となっている。RCA120, AAL, TJAII, WFA, BPLのシグナルは、線維化の進展に伴い強度を増す一方、LELシグナルは線維化の進展に伴い強度が減少していることが分かった。このうち、線維化の進展をモニタリングするという観点においてはRCA120やAALが適していると考えられる。また、TJAII, WFA, BPLに関しては肝硬変(F4)になり初めてシグナルが生じているタイプである。かつ、F4におけるシグナルのばらつきが大きいため、これは発がん高リスク群を囲い込むのに有効なマーカーとなる可能性が示唆された。
1.肝がん発がん高リスク群囲い込みに適したレクチンの選抜
実施例7において、肝線維化に伴いシグナル強度が増すレクチン群が見出された。それらレクチン群のうち発がん高リスク群を囲い込むことのできるものを選抜するため、肝細胞がん患者術前術後血清7症例を対象にした、M2BPの抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ解析を行った。その実験手順は実施例1に従った。また、全自動蛍光免疫測定装置(μTAS Wako i30;和光純薬工業株式会社製)および専用試薬により、公知である肝細胞がんマーカーAFP血中量および良性疾患・肝細胞がん鑑別マーカーAFP-L3%の測定も行った。その結果の一部のレクチンシグナルパターンを図32に示す。AFP-L3%を含めたすべてのパラメーターが、7症例すべてで必ずしも術後のシグナル減少を示すというわけではなかった。これはいずれもがん検出マーカーではないことを意味している。本実験では肝細胞がん発がんの高リスク群囲い込みマーカー候補を選抜することが目的である。その点においては、AFP-L3%にパターンが類似していることが望まれる。実施例7で予想したとおりWFA, BPLレクチンがAFP-L3%のパターンに類似していた。かつ、BPLに比べWFAはシグナル強度がより強く安定であったため、WFAを有力レクチンとして選抜した。
WFA結合性M2BPを肝がん発がん高リスク群囲い込みマーカーとし、該バイオマーカーを検出する最良の形態としては、血清に含まれるバイオマーカーを臨床上許容される性能で、かつ、臨床上適用可能な簡便な手段により検出及び判別する方法が考えられる。以下にはその例として、抗M2BP抗体オーバーレイ−WFAウェルプレート(図33を参照)を用いたサンドイッチ検出分析の結果を示す。なお、本手法においてWFAウェルプレートには血清を直接添加することが可能である。その根拠としては、血清中に含まれる糖タンパク質でWFAに結合できる分子は非常に少なく、発がん高リスク群患者においてはM2BPが最も血中濃度の高い分子の一つであるからである。
(実験方法)
マイクロタイタープレート(グライナー社製 96ウェル平底ストレプトアビジンコートプレート)へPBS緩衝液に溶解したビオチン化WFA(Vector社製、5μg/mL)を各ウェルに50μLずつ加え、2時間室温で保温し、支持体へWFAを固相化した。未結合WFAを洗浄液である0.1%Tween20含有PBS(300μL)で2回ずつ洗浄し、WFA固相化ウェルプレートを完成させた。
まず、上述の肝細胞がん患者術前術後血清7症例を対象にアッセイした。その結果、図32の結果に酷似したシグナルパターンが得られた(図34上段)。これら症例のうち術後に継続的に採血を実施していた3症例についてWFA結合性M2BP量の測定を試みた。なお、患者AおよびBは術後再発症例であり、患者Eは再発なし症例である。再発したポイントを矢印で示す。その結果を図34下段に示す。横軸は施術日を0とし、経過月数を表す。また、縦軸は健常者血清をネガティブコントロール(N)とし、S/N比で表す。患者Aは術後も測定値はS/N=2.5付近で推移し、再発ポイント以降で値が上昇している。患者Bは術前の測定値が非常に高く、術後その値は減少するがS/N=2.5付近で停滞した。一方患者Eは術前術後にS/N=2.0と最も低値を示し、かつその数値は徐々に下降していった。以上の結果より、術後、S/N>2.5で停滞した患者は再発リスクが高く、かつ再発後値が上昇する一方で、術後速やかに減少しS/N=2.0を大きく下回る患者は再発しない可能性が高いことが見出された。以上により、WFA結合性M2BPは肝がん発がん高リスク群囲い込みマーカーとして有用であり、それを検出する簡易測定系として、抗M2BP抗体オーバーレイ−WFAウェルプレートを開発することができた。
ELISA法によるWFA結合性M2BP検出において、検体加熱処理の有無が検出感度に及ぼす影響を確認した。
1.試薬の調製
R1試薬の調製:10mMのHEPES(pH7.5)、150mMのNaCl、0.01mMのMnCl2、0.1mMのCaCl2、0.08w/v%のNaN3を含む溶液(緩衝液C)を調製し、R1試薬とした。
ヒト肝がん由来細胞株培養上清(HepG2培養上清)100μg/mlを緩衝液(PBS)で10倍、100倍、1000倍および10000倍に希釈した希釈試料を調製した。 また、Recombinant Human Galectin−3BP/MAC−2BP(R&D SYSTEMS製)5μg/mlを緩衝液(PBS)で2倍、4倍、8倍、16倍、32倍および64倍に希釈した希釈試料を調製した。
健常人血清、HBV陽性肝細胞がん患者血清およびHCV陽性肝細胞がん患者血清を、「2.WFAを用いる測定系の希釈直線性の確認」と同様の条件で全自動免疫測定装置HISCL2000iにより測定した。各検体の測定に要した時間は17分であった。結果を表13に示す。
1−1.肝疾患の病態
B型肝炎ウイルス又はC型肝炎ウイルスに感染すると、急性期炎症から5−15年をかけて慢性期炎症へと進行する。特に慢性期に移行したC型肝炎が自然に治癒する事は稀で、肝機能の低下が進行し肝硬変に至る。C型肝炎感染から肝細胞がんへと至るまでの時間経過と肝の状態の変化を図1に示す。慢性肝炎から肝硬変に至る病態を定義するため、肝臓のグリソン領域及び肝小葉に出現する線維性変化を病理形態学的に捉えて、軽度(F1)、中度(F2)、重度(F3)、肝硬変期(F4)に分類する。線維化の進展は肝細胞がん発がんのリスク上昇と相関しており、図2に示されるようにF1もしくは2である場合年率1%以下であるのに対し、F3である場合には年3−4%に上昇する。線維化の程度がより進展した組織像を確認して診断される肝硬変(F4)では、図3に示されるように年率7%程度の確率で肝細胞がんが出現する。従って肝細胞がんを効率良く発見して治療するためには、特にF3およびF4の状態にある患者を簡便に選別して、精密検査対象者としてフォローすることが重要である。
C型慢性肝炎に対しては、PEG-IFN+RBV療法、C型肝硬変代償期に対してインターフェロン単独投与が適応されている。一方、B型肝炎(慢性肝炎、肝硬変)に対する治療としては核酸アナログが主体であり、炎症や線維化評価マーカーは必須と思われる。特に、血清バイオマーカーは診断・評価目的に幅広く臨床応用されることが期待される。
肝細胞発がんには、 B型肝炎ウイルスもしくはC型肝炎ウイルス感染による微生物学的因子と、環境因子が大きく交互に作用すると考えられている。わが国において、肝細胞がん患者の約9割は、B型あるいはC型肝炎ウイルスの感染既往があり、慢性肝炎・肝硬変患者に発生している事が知られている。肝細胞がんの発がん危険因子には、ウイルス以外にも、男性、高齢、アルコール多飲、タバコ、カビ毒の一つであるアフラトキシンなどが指摘されている(肝がん診療ガイドライン、財)国際医学情報センター)。
1−4.肝細胞がんの早期診断
肝細胞がんの発見は、現在のところ、被験者からの血清サンプル中のAFPやPIVKA-IIなどの肝臓がんマーカーの測定、及び超音波検査(エコー検査)を中心とした画像診断が主として用いられている。画像診断としては、最初の検査として、超音波検査又はCTを用い、これらで何らかの異常が見いだされときには、更にMRIや血管造影をするのが通常である。
肝細胞がん患者の約9割が、B型肝炎ウイルスもしくはC型肝炎ウイルス感染による肝炎患者から発生する我が国においては、ウイルス感染と肝機能低下を指標として、精密検査の対象となる患者を囲い込む事は可能である。
本願発明の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質であるAGPおよびM2BPは、ウイルス感染による疾患の発症と進展において生じる慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がんを特徴づける糖鎖変化を生じることが見出された。このような、ウイルス性肝疾患の病態進行に伴う糖鎖変化を指標として、肝疾患病態を特定できるマーカー糖タンパク質を肝疾患病態指標糖鎖マーカーと呼ぶ。
AGPおよびM2BP上に存在する糖鎖の疾患特異的な変化は後述するレクチンアレイにより検証する。より好ましくは抗体オーバーレイ・レクチンアレイ法を用いる。上記マーカー糖タンパク質をレクチンアレイを用いて測定した結果をもとに、1)病気の進み具合に応じてどのレクチンシグナルにどの程度の測定値変化が見られるのか、2)測定値の変化は、どの病期(初期か晩期か)にもっとも顕著となるのか、3)測定値変化の情報は、疾病のコントロールに資するかどうかを検討し、有用性を評価し、どの肝疾患病態に適したマーカーであるかを検証する。
レクチンアレイは、複数種の特異性の異なる判別子(プローブ)レクチンを1つの基板上に並列に固定(アレイ化)したもので、分析対象となる複合糖質にどのレクチンがどれだけ相互作用したかを一斉に解析できるものである。レクチンアレイを用いることで、糖鎖構造推定に必要な情報が一度の分析で取得でき、かつ、サンプル調製からスキャンまでの操作工程は迅速かつ簡便にできる。質量分析などの糖鎖プロファイリングシステムでは、糖タンパク質をそのまま分析することはできず、あらかじめ糖ペプチドや遊離糖鎖の状態にまで処理をしなければならない。一方、レクチンマイクロアレイでは、例えば、コアタンパク質部分へ直接蛍光体を導入するだけで、そのまま分析できるという利点がある。レクチンマイクロアレイ技術は、本発明者等が開発したもので、その原理・基礎は、例えば、Kuno A., et al. Nat. Methods 2,851-856(2005).に記載されている。
レクチンアレイは、現在では、精製標品だけでなく、血清や細胞ライセートなどの混合試料の定量比較糖鎖プロファイリングができる実用化技術にまで発展してきている。特に細胞表層糖鎖の比較糖鎖プロファイリングはその発展がめざましい(Ebe, Y. et al. J. Biochem. 139, 323-327(2006)、Pilobello, K.T. et al. Proc Natl Acad Sci USA.104,11534-11539(2007)、Tateno, H. et al. Glycobiology 17, 1138-1146(2007))。
レクチンマイクロアレイのプラットフォームは基本的に上記の通りとし、検出に際しては上記被検体を直接蛍光などで標識するのではなく、抗体を介して間接的に蛍光基などを被検体に導入することで、一斉に多検体に対する分析を簡便、高速化することができる応用法である(「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J. Mol Cell Proteomics. 8, 99-108(2009)」、「平林淳、久野敦、内山昇「レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリング応用技術の開発」、実験医学増刊「分子レベルから迫る癌診断研究〜臨床応用への挑戦〜」、羊土社、Vol25(17)164-171(2007)」、久野敦、平林淳「レクチンマイクロアレイによる糖鎖プロファイリングシステムの糖鎖バイオマーカー探索への活用」、遺伝子医学MOOK11号「臨床糖鎖バイオマーカーの開発と糖鎖機能の解明」、pp.34-39、メディカルドゥ(2008)参照)。
レクチンマイクロアレイの代わりにコアタンパク質に対する抗体をガラス基板などの基板上に並列に固定(アレイ化)した抗体マイクロアレイを用いる方法である。調べるマーカーに対するだけの数の抗体が必要である。糖鎖変化を検出するレクチンをあらかじめ確定することが必要である。
AGPおよびM2BPは、線維化の進展などの肝疾患の病態変化に伴い糖鎖構造が変化する新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーである。このためAGPおよびM2BP糖鎖構造の変化に対応して反応性が変化するレクチン(以下、レクチン“A”と略す)と、被験者から採取した試料に含まれるマーカーとを反応させ、レクチンに反応したマーカーを測定することにより、肝疾患の病態を判別したり、肝の線維化の度合いを判定したりすることができる。
1)被験者から採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカーを測定する工程、
2)健常者から採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカーを測定する工程、
3)肝疾患患者から採取された試料中のレクチン“A”と特異的に反応する糖鎖を有する肝疾患病態指標糖鎖マーカーを測定する工程、
及び
4)被験者から得られた肝疾患病態指標糖鎖マーカーの測定結果と健常者又は肝疾患患者から得られた肝疾患病態指標糖鎖マーカーの測定結果を比較し、被験者の測定結果がより肝疾患患者の測定値に近い場合に肝疾患であると判別する工程
を含む肝疾患の検出方法が挙げられる。
肝炎ウイルス感染による肝炎の進展に於いて、線維化の程度は、肝機能低下及び肝細胞発がんのリスクと相関する事が知られている。したがって線維化の測定は、肝機能低下および発がんリスクを評価することを意味する。また肝炎患者の全体の4割程度は、インターフェロン治療に反応せずウイルス感染が持続する。これらの病態が活動性に進行するか否かは、線維化の進展で判断されるべきであると考えられている。これらの観点から、線維化の進展を測定する事は、肝炎の診断治療に於いて重要な意味を持つ。
例えば、少なくとも第1レクチンが固定された第1レクチンアレイと、抗AGP抗体とを用いて、第1レクチンに結合するAGPを測定することができ、少なくとも第2レクチンが固定された第2レクチンアレイと、抗M2BP抗体とを用いて、第2レクチンに結合するM2BPを測定することができる。
肝硬変は、肝小葉構造の消失した再生結節とこれを取り囲む緻密な線維性結合組織が肝全体に瀰漫性に出現する病態と定義される。これは、肝細胞障害と線維化が持続する進行性慢性肝疾患の終末状態でもある。肝硬変における肝生検は成因診断を探るために行なわれるもので、早期の肝硬変や大結節型の肝硬変では診断困難な症例が多い(外科病理学第4版、文光堂より)。したがって、肝硬変を定性的、定量的に診断できる検査技術が必要とされている。この目的に対し、1)の線維化の進展測定方法、の項で見出された線維化の進展をモニタリングできる候補分子抗体およびレクチンセットのうち、線維化ステージF3とF4を見分けることができる場合、肝硬変検出に使用できる。
試料としては、生検試料、体液試料、好適には、血液(血清、血漿等)が挙げられる。
測定とは、定性的測定及び定量的測定の両者を包含する。
また、レクチン“A”を用いてAGPやM2BPなどのマーカーを迅速に測定する場合には、下記の第1又は第2迅速測定方法で測定することが好ましい。
新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーを利用する肝細胞がんの検出方法において、肝疾患病態指標糖鎖マーカー特異的ポリクローナル抗体及び/又はモノクローナル抗体が容易に入手できる場合は、それらを用いることができるが、容易に入手できない場合は、例えば、以下のように調製できる。
本願発明の新規肝疾患病態指標糖鎖マーカーは、肝疾患検出用のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の調製に用いることができる。
肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質であるAGP、およびMac2BP(M2BP)について、抗体オーバーレイ・レクチンアレイを活用して肝疾患の検出を実施した例を以下に示す。なお、本手法による(ウイルス性)肝炎患者(CH)、肝硬変患者(LC)、肝細胞がん患者(HCC)、および健常者(HV)血清に由来する該マーカー糖タンパク質上糖鎖の比較解析の手順を図7に示す。
(ウイルス性)肝炎患者(CH)、肝硬変患者(LC)、肝細胞がん患者(HCC)、および健常者(HV)血清に由来する該マーカー糖タンパク質のエンリッチは、「Kuno A, Kato Y, Matsuda A, Kaneko MK, Ito H, Amano K, Chiba Y, Narimatsu H, Hirabayashi J.Mol Cell Proteomics. 8, 99-108 (2009) 」に従って行われた。なお、得られる結果が病態に依存していることを明らかにするため、各病態につき5例ずつを分析に用いることにした。各患者血清を0.2%SDS含有PBS緩衝液で10倍希釈し、10分間95℃で加熱処理したものを、AGPにおいては5μL、Mac2BPにおいては20μL反応チューブに分注し、そこへ500 ngの各抗原に対する抗体(ビオチン化物)を添加した。各反応溶液は反応バッファー(1%Triton X-100入りTris-buffered saline (TBSTx))により、45μLに調整された後、4℃で2時間振盪反応された。抗原抗体反応後、速やかにストレプトアビジン固定化磁気ビーズ溶液(Dynabeads MyOne Streptavidin T1, DYNAL Biotech ASA製)をあらかじめ反応バッファーで3回洗浄し、かつ2倍濃縮状態で調整したもの5μL(元のビーズ溶液10μL分に相当)を上記反応溶液へ加え、1時間さらに反応した。この反応により、ビオチン化抗体を介して、該糖タンパク質は磁気ビーズと複合体を形成する。この複合体を磁気ビーズ回収用マグネットに吸着させた後に溶液を廃棄した。回収された複合体は500μLの反応バッファーにより3回洗浄された後に、10μLの溶出バッファー(0.2%SDS含有TBS)に懸濁された。この懸濁溶液を95℃で5分間熱処理することで、該糖タンパク質を磁気ビーズから解離溶出し、得られた溶液を溶出液とした。その際、熱変性されたビオチン抗体も混入するため、溶出液に上述の手法で2倍濃縮状態で調整された磁気ビーズ溶液を10μL(元のビーズ溶液20μl分に相当)加え、1時間反応することで、ビオチン化抗体を吸着除去した。これにより得られた溶液を血清由来該糖タンパク質溶液とし、以降の実験に用いた。
上述により得られた該糖タンパク質溶液適当量とり、レクチンアレイ反応バッファーである1%Triton X-100含有Phosphate-buffered saline (PBSTx)により、60μLに調整した。この溶液をレクチンマイクロアレイの各反応槽(ガラス1枚当たり8つの反応槽が形成されている)へ添加し、20℃で10時間以上反応した。この8つの反応槽からなるレクチンマイクロアレイ基盤の作製は内山ら(Proteomics 8, 3042-3050 (2008))の手法に従った。これにより該糖タンパク質上の糖鎖とアレイ基板上に固定されている43種のレクチンとの結合反応が平衡状態に達する。その後、未反応の基盤上レクチンへ検出用抗体上の糖鎖が結合し、ノイズとして生じてしまうことを避けるため、ヒト血清由来IgG溶液(シグマ社製)を2μL加え、30分反応させた。60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、再度ヒト血清由来IgG溶液を2μL加え、若干攪拌した後に、検出用の該糖タンパク質に対する抗体(ビオチン化物)を100 ng相当加え、20℃で1時間反応させた。抗原抗体反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄し、次いでCy3標識ストレプトアビジン200 ng相当が含有しているPBSTx溶液を加え、さらに30分、20℃で反応した。反応後、60μLのPBSTxで各反応槽を3回洗浄した後、モリテックス社製アレイスキャナーGlycoStationによりアレイスキャンを行った。
実施例1の通り、糖タンパク質の抗体オーバーレイ・レクチンアレイ解析により得られたレクチンシグナル情報から、統計解析により取捨選択し最適なものを用いることで、各肝疾患病態を検出できる可能性が見出された。
そこでAGPを標的分子とし、以下の手順で実験を実施した。
線維化進展に伴いシグナル変動を示すレクチン群を絞り込むため、まず臨床診断済み患者HCC, LC, CH各10症例の血清を用い、AGPの抗体オーバーレイ・レクチンアレイ解析を実施した。より客観的な絞り込みを行うため、HCC-LCおよびLC-CH間でStudent T検定を行い、危険度が0.1%以下の値を示すレクチンを有用レクチンとした。その結果を表3に示す。先の実験結果(図8)からわかるように、AGPのアレイ解析により、15種のレクチンにおいてシグナルが得られているが、そのうちStudent T検定により危険度が0.1%以下の有意差を示すレクチンはLEL, AOL, AAL, MAL, STL,およびPHAEの6種であった。また、本実験により、最もシグナル変動せず再現性高い結果を取得できたレクチンDSAについては、取得されたデータの規格化に有効性を見出し、以降スキャン後、数値化されたデータはすべてDSAシグナルにより規格化することとした。
つぎに、肝炎ウイルスに罹患し、肝生検により病理診断され線維化のステージングがなされている患者群125症例を対象に、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイを実施例1の手順に従い行った。なお、125症例の肝臓線維化ステージの内訳は、F0およびF1が33症例、F2が32症例、F3が31症例、F4が29症例である。上述の手順に従い、統計学的に判別に有用なレクチンの絞り込みを行った。その結果、上位6種レクチンの結果を表4に示す。先に得られた6つレクチンが上位を占め、その中でもLEL, AOL, MALが最も判別に有効なものとして選抜されたため、この3種についてより詳細なデータ解析を行った。
実施例2の結果から、肝線維化の進展を基準として各レクチンシグナル単独もしくは組み合わせのカットオフ値を設定することで、肝硬変の検出が可能となると考え、以下の手順で実験を実施した。
まず、肝炎ウイルス罹患者の中から肝硬変発症患者を検出するための、各レクチンのカットオフ値を設定することにした。このために病理診断済み患者80症例分(F1, F2, F3, F4各20症例)を対象に、実施例2で絞り込まれた2種レクチンのシグナルをDSAレクチンシグナルで規格化したデータを用い、他(F1-F3)からF4(肝硬変)を区別するReceiver operating characteristic curve (ROC曲線)を作成した。その結果を図11左に示す。図11には、AOL, MALシグナルを単独に用いた場合の曲線のほかに、2つのシグナルを用いた数式(AOLの相対シグナル強度)X 1.5 -(MALの相対シグナル強度)から得られる数値による曲線も示す。曲線の下部領域の面積を示すAUC(area under curve)値を求め、各手法の診断力を査定する。また感度100%、特異度100%点から最も近い距離にある曲線上の点、言い換えるとY=Xの直線に平行な線と、ROC曲線との接点を、「最適な特異度および感度」とし、その周辺にカットオフ値を設定した。それらの数値を図11の右表に記す。得られたカットオフ値を用い、病理学的診断又は画像・臨床診断 により肝炎および肝硬変と確定された患者、45症例および43症例を対象にブラインドテストを実施した。その結果を図11の右表のValidation setの項に記す。肝硬変を陽性、肝炎を陰性とし、それぞれの検出数を列挙した。ROC曲線より、最良の感度(Sensitivity)および特異度(Specificity)を示す点におけるカットオフ値を決定したところ、AOLは8%、MALは11.8%であった。また、コンビネーションの系が最も偽陰性、偽陽性患者数が少なく、正診率(%)((総患者数―偽陽性、偽陰性患者数)/(総患者数)X100)が高くなった。
臨床診断済み慢性肝炎患者45症例および肝硬変患者43症例について、実施例2の手順に従い、AGPを標的分子とした抗体オーバーレイ・レクチンアレイを実施した。シグナルはすべてDSAレクチンのシグナルを100%とし、規格化した。その数値を上述したカットオフ値を利用し、陽性、陰性の判別をすることにより、肝硬変検出検定を試みた。その結果、AOLシグナルを用いた場合、検出力として感度86.1%、特異度91.1%、正診率88.6%となり、MALシグナルを用いた場合、検出力として感度90.7%、特異度88.9%、正診率89.8%となった。いずれもかなり高度な検出が可能でり、正診率が85%を超えていた。さらに、2つのシグナルをコンビネーションした式((AOLの相対シグナル強度)X 1.5 -(MALの相対シグナル強度))を用いて検出力を調べてみたところ、感度95.4%、特異度91.1%、正診率は93.2%という最も確度の高い肝硬変検出結果が得られた。特筆すべきことは、これまで公知となっているAALレクチンやRCAレクチンを用いたAGPの疾患特異的糖鎖変化を検出する手法と比較して圧倒的に検出力が高い点である。このような結果は、今回の抗体オーバーレイ・レクチンアレイによる絞り込みの工程で、AALやRCA120がAOL, MALに比べ劣っていたことと一致する(表3,4を参照)。
実施例2の結果により、AOLおよびMALのシグナル変動の観察により、線維化の進展をモニタリングすることができることが分かった。そこで、AOL/DSAやMAL/DSAを線維化進展パラメーターとして用い、抗ウイルス剤であるインターフェロンの治療効果を判定できるかを試みた。C型肝炎患者でインターフェロンの治療効果が認められた持続性ウイルス陰性化(SVR)例群と、治療効果が認められなかったウイルス学的不応(NVR)例群について以下の実験を行った。インターフェロン治療後、経時的に血液採取された患者の血清を対象に実施例1と同様の手法で血清中AGPのエンリッチおよび抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ解析を行い、DSAシグナルによる規格化後のAOL, MALの相対シグナル値を算出した。その典型例それぞれ2症例分の各シグナルの経時的変化を図12に示す。時間軸は治療直後の採血日を0とし、相対結合シグナルは治療直後の相対値を0としている。SVR症例ではMALシグナルは経時的に増加したが、AOLのシグナルは減少もしくはシグナル検出できなかった。すなわち、これら症例は線維化が緩和されている傾向にあった。それに対しNVR症例では、AOLシグナルは経時的に増加し、MALのシグナルはほぼ変化がなかった。すなわちこれら症例の線維化は緩和されず、むしろ悪化している(線維化が進展している)傾向が観察された。以上により、インターフェロン治療後の効果判定を血液検査で行うことが可能であることがわかった。
1.第1迅速測定方法(マニュアル法)
1−1.試薬の調製
R1試薬の調製:緩衝液A(PBS−1%TritonX、pH7.4)中に5μg/mLのビオチン化DSA(J−オイルミルズ社製)を添加してR1試薬1を調製した。緩衝液A中に5μg/mLのビオチン化MAL(Vector社製)を添加してR1試薬2を調製した。緩衝液A中に2.5μg/mLのビオチン化AOLを添加してR1試薬3を調製した。なお、ビオチン化AOLは、ビオチン標識キット(DOJIDO社製)を用いて、AOL(東京化成社製)をビオチン化したものを使用した。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)中のAGPを、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いて緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し試料とした。回収した試料を緩衝液Bで1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍にそれぞれ希釈した希釈試料を調製した。
「DSAの希釈直線性の確認」において、R1試薬1に代えてR1試薬2を使用し、R3試薬1に代えてR3試薬2を使用すること以外は同様にして、MAL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図14に示した。図14に示されるようにMAL測定系についてはR2=0.99と良好な直線性を示した。
「DSAの希釈直線性の確認」において、コンセーラに代えてHCV陽性血漿2(Millenium Biotech社製)を使用し、R1試薬1に代えてR1試薬3を使用すること以外は同様にして、AOL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図3に示した。図15に示されるようにAOL測定系についてはR2=0.98と良好な直線性を示した。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)、正常ヒト血清(TRINA社製)、HCV陽性血漿1および2(Millenium Biotech社製)のそれぞれについて、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いてAGPを分離し、緩衝液(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し測定試料とした。また、緩衝液のみをブランク測定試料(NC)とした。
上記1−5の各測定試料について、実施例1で用いたレクチンアレイを用いて、抗体オーバーレイ法による測定を行った。レクチンアレイ法による測定時間は約18時間であった。結果を表6に示すと共に図18及び図19に示した。
2−1.試薬の調製
R1試薬の調製:緩衝液A(PBS−1%TritonX、pH7.4)をR1試薬とした。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)中のAGPを、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いて緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し試料とした。回収した試料を緩衝液Bで1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍にそれぞれ希釈した希釈試料を調製した。
「DSAを用いる測定系の希釈直線性の確認」において、R2試薬1に代えてR2試薬2を使用し、R3試薬1に代えてR3試薬2を使用すること以外は同様にして、MAL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図21に示した。図21に示されるようにMAL測定系についてはR2=0.99と良好な直線性を示した。
「DSAの希釈直線性の確認」において、コンセーラに代えてHCV陽性血漿2(Millenium Biotech社製)を使用し、R2試薬1に代えてR2試薬3を使用すること以外は同様にして、AOL測定系における希釈直線性の確認実験を行い、結果を図22に示した。図22に示されるようにAOL測定系についてはR2=0.99と良好な直線性を示した。
コンセーラ(正常ヒト血清、日水製薬社製)、正常ヒト血清(TRINA社製)、HCV陽性血漿1および2(Millenium Biotech社製)のそれぞれについて、抗AGP抗体を用いた免疫沈降法によりAGPを分離し、緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し測定試料とした。また、緩衝液Bのみをブランク測定試料とした。
線維化ステージF1の患者血清1及び2、線維化ステージF2の患者血清3及び4、線維化ステージF3の患者血清5及び6、線維化ステージF4の患者血清7及び8のそれぞれについて、実施例1のエンリッチと同様にして、抗AGP抗体を用いてAGPを分離し、緩衝液B(TBS−0.5%TritonX−0.1%SDS)に回収し測定試料とした。また、緩衝液Bのみをブランク測定試料とした。
上記2−6の各測定試料について、実施例1で用いたレクチンアレイを用いて、抗体オーバーレイ法による測定を行った。レクチンアレイ法による測定時間は約18時間であった。結果を表9、図27及び図28に示した。
1.HCV感染患者125症例を用いた解析
実施例5により第2迅速測定法はレクチンアレイと同様のパターンを示すことがわかった。より多くの症例で実証するために、実施例2で使用した、肝炎ウイルスに罹患し、肝生検により病理診断され線維化のステージングがなされている患者群125症例を対象に、第2迅速測定法を実施例5の2−6の手順に従い行った。なお、125症例の肝臓線維化ステージの内訳は、F0およびF1が33症例、F2が32症例、F3が31症例、F4が29症例である。
実施例3に示したレクチンアレイによる肝硬変の検出と同様の手順で、第2迅速測定法により肝硬変の検出を試みた。上述の病理診断済み患者125症例分を対象に、2種レクチンのシグナルをDSAレクチンシグナルで規格化したデータを用い、他(F1-F3)からF4(肝硬変)を区別するROC曲線を作成し、感度100%、特異度100%点から最も近い距離にある曲線上の点、言い換えるとY=Xの直線に平行な線と、ROC曲線との接点を、「最適な特異度および感度」とし、その周辺にカットオフ値を設定した。得られた個々のレクチンに対するカットオフ値から肝硬変検出に最適なコンビネーション式(AOL/DSA ×1.8 − MAL/DSA)を求め、それにより病理学的診断又は画像・臨床診断 により肝炎および肝硬変と確定された患者、45症例および43症例を対象にブラインドテストを実施した。
実施例2の通り、M2BPにおいても、抗体オーバーレイ・レクチンアレイ解析により得られたレクチンシグナル情報から、各肝疾患病態を検出できる可能性が見出された。そこで肝線維化との相関を検討するための実験を実施した。AGPの実験で用いた肝炎ウイルスに罹患し、肝生検により病理診断され線維化のステージングがなされている患者群125症例を対象に、抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイを実施例2の手順に従い行った。結合シグナルの生じた17種レクチンのうち、有意差検定により線維化の進展に伴うシグナル変化が認められた6つのレクチンについて、線維化進展との相関を表すグラフを作成した。それを図31に示す。各ステージのレクチンシグナルの分布を箱ひげ図により示した。箱の上端および下端はそれぞれ75%点、25%点を示し、ひげの上端および下端はそれぞれ95%点、5%点を示す。箱中の横線は中央値を示し、×は平均値を示す。なお、各グラフの縦軸はDSAのシグナルを100%とした時の相対値となっている。RCA120, AAL, TJAII, WFA, BPLのシグナルは、線維化の進展に伴い強度を増す一方、LELシグナルは線維化の進展に伴い強度が減少していることが分かった。このうち、線維化の進展をモニタリングするという観点においてはRCA120やAALが適していると考えられる。また、TJAII, WFA, BPLに関しては肝硬変(F4)になり初めてシグナルが生じているタイプである。かつ、F4におけるシグナルのばらつきが大きいため、これは発がん高リスク群を囲い込むのに有効なマーカーとなる可能性が示唆された。
1.肝がん発がん高リスク群囲い込みに適したレクチンの選抜
実施例7において、肝線維化に伴いシグナル強度が増すレクチン群が見出された。それらレクチン群のうち発がん高リスク群を囲い込むことのできるものを選抜するため、肝細胞がん患者術前術後血清7症例を対象にした、M2BPの抗体オーバーレイ・レクチンマイクロアレイ解析を行った。その実験手順は実施例1に従った。また、全自動蛍光免疫測定装置(μTAS Wako i30;和光純薬工業株式会社製)および専用試薬により、公知である肝細胞がんマーカーAFP血中量および良性疾患・肝細胞がん鑑別マーカーAFP-L3%の測定も行った。その結果の一部のレクチンシグナルパターンを図32に示す。AFP-L3%を含めたすべてのパラメーターが、7症例すべてで必ずしも術後のシグナル減少を示すというわけではなかった。これはいずれもがん検出マーカーではないことを意味している。本実験では肝細胞がん発がんの高リスク群囲い込みマーカー候補を選抜することが目的である。その点においては、AFP-L3%にパターンが類似していることが望まれる。実施例7で予想したとおりWFA, BPLレクチンがAFP-L3%のパターンに類似していた。かつ、BPLに比べWFAはシグナル強度がより強く安定であったため、WFAを有力レクチンとして選抜した。
WFA結合性M2BPを肝がん発がん高リスク群囲い込みマーカーとし、該バイオマーカーを検出する最良の形態としては、血清に含まれるバイオマーカーを臨床上許容される性能で、かつ、臨床上適用可能な簡便な手段により検出及び判別する方法が考えられる。以下にはその例として、抗M2BP抗体オーバーレイ−WFAウェルプレート(図33を参照)を用いたサンドイッチ検出分析の結果を示す。なお、本手法においてWFAウェルプレートには血清を直接添加することが可能である。その根拠としては、血清中に含まれる糖タンパク質でWFAに結合できる分子は非常に少なく、発がん高リスク群患者においてはM2BPが最も血中濃度の高い分子の一つであるからである。
マイクロタイタープレート(グライナー社製 96ウェル平底ストレプトアビジンコートプレート)へPBS緩衝液に溶解したビオチン化WFA(Vector社製、5μg/mL)を各ウェルに50μLずつ加え、2時間室温で保温し、支持体へWFAを固相化した。未結合WFAを洗浄液である0.1%Tween20含有PBS(300μL)で2回ずつ洗浄し、WFA固相化ウェルプレートを完成させた。
まず、上述の肝細胞がん患者術前術後血清7症例を対象にアッセイした。その結果、図32の結果に酷似したシグナルパターンが得られた(図34上段)。これら症例のうち術後に継続的に採血を実施していた3症例についてWFA結合性M2BP量の測定を試みた。なお、患者AおよびBは術後再発症例であり、患者Eは再発なし症例である。再発したポイントを矢印で示す。その結果を図34下段に示す。横軸は施術日を0とし、経過月数を表す。また、縦軸は健常者血清をネガティブコントロール(N)とし、S/N比で表す。患者Aは術後も測定値はS/N=2.5付近で推移し、再発ポイント以降で値が上昇している。患者Bは術前の測定値が非常に高く、術後その値は減少するがS/N=2.5付近で停滞した。一方患者Eは術前術後にS/N=2.0と最も低値を示し、かつその数値は徐々に下降していった。以上の結果より、術後、S/N>2.5で停滞した患者は再発リスクが高く、かつ再発後値が上昇する一方で、術後速やかに減少しS/N=2.0を大きく下回る患者は再発しない可能性が高いことが見出された。以上により、WFA結合性M2BPは肝がん発がん高リスク群囲い込みマーカーとして有用であり、それを検出する簡易測定系として、抗M2BP抗体オーバーレイ−WFAウェルプレートを開発することができた。
ELISA法によるWFA結合性M2BP検出において、検体加熱処理の有無が検出感度に及ぼす影響を確認した。
1.試薬の調製
R1試薬の調製:10mMのHEPES(pH7.5)、150mMのNaCl、0.01mMのMnCl2、0.1mMのCaCl2、0.08w/v%のNaN3を含む溶液(緩衝液C)を調製し、R1試薬とした。
ヒト肝がん由来細胞株培養上清(HepG2培養上清)100μg/mlを緩衝液(PBS)で10倍、100倍、1000倍および10000倍に希釈した希釈試料を調製した。 また、Recombinant Human Galectin−3BP/MAC−2BP(R&D SYSTEMS製)5μg/mlを緩衝液(PBS)で2倍、4倍、8倍、16倍、32倍および64倍に希釈した希釈試料を調製した。
健常人血清、HBV陽性肝細胞がん患者血清およびHCV陽性肝細胞がん患者血清を、「2.WFAを用いる測定系の希釈直線性の確認」と同様の条件で全自動免疫測定装置HISCL2000iにより測定した。各検体の測定に要した時間は17分であった。結果を表13に示す。
Claims (17)
- 被験者より採取された試料に含まれるalpha-1-acid glycoprotein(AGP)およびMac-2-binding protein(M2BP)から選択される少なくとも一つの糖タンパク質の測定方法であって、糖タンパク質がAGPの場合には、AOLおよびMALから選択される第1レクチンに結合するAGPを測定し、糖タンパク質がM2BPの場合には、WFA、BPL、AAL、RCA120およびTJAIIから選択される第2レクチンに結合するM2BPを測定することを特徴とする糖タンパク質の測定方法。
- AGPの糖鎖構造の変化にかかわらず反応性が実質変化しないレクチン(規格化用レクチン)に結合した糖タンパク質を測定し、第1レクチンに結合したAGPの測定値を、前記規格化用レクチンと結合したAGPの測定値を用いて規格化する請求項1記載の糖タンパク質の測定方法。
- M2BPの糖鎖構造の変化にかかわらず反応性が実質変化しないレクチン(規格化用レクチン)に結合した糖タンパク質を測定し、第2レクチンに結合したM2BPの測定値を、前記規格化用レクチンと結合したM2BPの測定値を用いて規格化する請求項1記載の糖タンパク質の測定方法。
- 前記規格化用レクチンがDSAである請求項2または請求項3に記載の糖タンパク質の測定方法。
- 前記第1または第2レクチン、前記糖タンパク質および標識抗糖タンパク質抗体の複合体を形成し、複合体における標識量を測定することにより前記第1または第2レクチンに結合する前記糖タンパク質を定量する請求項1〜4の何れか1項に記載の糖タンパク質の測定方法。
- 複合体の形成が、第1または第2レクチンが固定された磁性粒子を用いて実行される請求項5記載の糖タンパク質の測定方法。
- 複合体の形成が、ビオチン化された第1または第2レクチンと、ストレプトアビジンまたはアビジンが固定された磁性粒子を用いて実行される請求項5記載の糖タンパク質の測定方法。
- 標識抗糖タンパク質抗体の標識が、脱グリコシル化処理されたアルカリホスファターゼである請求項5〜7の何れか1項に記載の糖タンパク質の測定方法。
- 抗糖タンパク質抗体が脱グリコシル化された抗糖タンパク質抗体である請求項5〜7の何れか1項に記載の糖タンパク質の測定方法。
- 少なくとも第1レクチンが固定された第1レクチンアレイと、抗AGP抗体とを用いて、第1レクチンに結合するAGPを測定し、少なくとも第2レクチンが固定された第2レクチンアレイと、抗M2BP抗体とを用いて、第2レクチンに結合するM2BPを測定する請求項1記載の糖タンパク質の測定方法。
- 第1および第2レクチンアレイにさらにDSAが固定されており、DSAに結合するAGPを測定し、第1レクチンに結合したAGPの測定値をDSAに結合したAGPの測定値で規格化し、DSAに結合するM2BPを測定し、第2レクチンに結合したM2BPの測定値をDSAに結合したM2BPの測定値で規格化する請求項10に記載の糖タンパク質の測定方法。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の糖タンパク質の測定方法によって得られた糖タンパク質の測定値に基づいて、肝臓の線維化ステージを判定する肝疾患の検査方法。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の糖タンパク質の測定方法によって得られた糖タンパク質の測定値に基づいて、肝硬変か否かを判定する肝疾患の検査方法。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の糖タンパク質の測定方法によって得られた糖タンパク質の測定値に基づいて、肝細胞がんの再発リスクを判定する肝疾患の検査方法。
- 請求項1〜11の何れか1項に記載の糖タンパク質の測定方法によって得られた糖タンパク質の測定値に基づいて、肝疾患の治療における抗ウイルス剤の治療効果を判定する方法。
- 請求項1に記載の糖タンパク質の測定方法に用いられる糖タンパク質定量用試薬であって、糖タンパク質がAGPの場合には、第1レクチンが固定された磁性粒子と、標識抗AGP抗体とを備え、糖タンパク質がM2BPの場合には、第2レクチンが固定された磁性粒子と、標識抗M2BP抗体とを備えたことを特徴とする糖タンパク質定量用試薬。
- 肝疾患特異的な糖鎖変化を有するMac-2-binding protein(M2BP)からなる肝疾患病態指標糖鎖マーカー。
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