CN108841954A - 生物标志物在卵巢癌评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本文提供生物标志物在卵巢癌评估中的应用。本文提供来自外泌体的生物标志物的检测试剂在制备用于评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的组合物或试剂盒中的用途,其中所述生物标志物包括c5a,还可以包括另外的卵巢癌生物标志物,例如CA125,HE4和PLG中的一种或多种。本文还提供包括所述生物标志物检测试剂的组合物或试剂盒。本文公开的方法、组合物和试剂盒能够有效用于卵巢癌的评估、诊断和/或监测。
Description
技术领域
本发明一般性涉及癌症的诊断/分级/分期和预后的领域,更具体来说,本发明涉及卵巢癌的领域。本发明还涉及了包括生物标志物表达的卵巢癌诊断、分级、分期和预后领域,并且还提供了相关的分析试剂、诊断模型、测试试剂盒和临床分析。
背景技术
卵巢癌是致死率最高的妇科癌症,仅在2015年,中国约5.2万人被诊断为卵巢癌患者,且2.25万人因此死亡。卵巢癌病人的死亡率在近三十年来没有明显改变,晚期病人的5年生存率不超过20%,而I期病人的5年存活率可以达到90%。然而绝大多数病人在确诊时都已经是晚期,因此,开发早期筛查卵巢癌的诊断产品将可能提高病人的存活率,降低卵巢癌的死亡率。
卵巢细胞的突变理论上可以通过检测血液中的特定的蛋白而被发现。实际操作中,由于检测仪器和试剂的限制,少数细胞的突变带来的变化无异于大海捞针,非常难以被检测。所以突变的信息需要被浓缩或检测仪器试剂的灵敏度显著上升的情况下才可以在早期被发现。市售卵巢癌相关的生物标记物试剂主要为糖链抗原-125(cancer antigen 125,CA125)和人附睾蛋白4(Human epididymis protein 4,HE4)两种,两种指标实际都通常被用为确诊后对于复发和病情发展的检测手段。近期的多个研究发现,这两种试剂在早期病人的诊断和筛查都难以达到理想的敏感性、特异性和阳性预测值。
已经对卵巢癌的生物标志物进行了许多研究。例如,WO2005034732公开了涉及其中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:43任一序列的完整或部分序列的DNA作为卵巢癌的标志基因。WO2005098447提及Apo A1、修饰的Apo A1、甲状腺素运输蛋白ΔN10、天然甲状腺素运输蛋白、半胱氨酰化甲状腺素运输蛋白、磺化甲状腺素运输蛋白、CysGly修饰的甲状腺素运输蛋白、谷胱甘肽化甲状腺素运输蛋白、IAIH4片段No.1、IAIH4片段No.2以及IAIH4片段No.3及其组合物作为生物标志物用于确定卵巢癌状态。WO2007002264公开了CTAP3相关蛋白质和CA125、转铁蛋白、结合珠蛋白、ApoA1、转甲状腺素蛋白、ITIH4内部片段、beta 2-微球蛋白、hepcidin、prostatin、骨桥素、esoinophil衍生神经毒素、瘦素、催乳素、IGF-II、血红蛋白及其修饰形式、CA125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA 195、肿瘤相关胰蛋白脢抑制剂(TATI)、CEA、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、唾液酸(Sialyl)TN、半乳糖转移酶、巨噬细胞集落激激因子(M-CSF,CSF-1)、溶血磷脂酸(LPA)、表皮生长因子受体胞外段的110KD成分(p110EGFR)、组织激肽释放酶原,如激肽释放酶6和激肽释放酶10(NES-1)、丝氨酸蛋白水解酶(prostasin)、HE4、肌酸激酶B(CKB)、LASA、HER-2/neu、尿促性腺激素肽、Dianon NB 70/K、组织肽抗体(TPA)、SMRP、骨桥素和结合珠蛋白、类胰岛素生长因子I以及类胰岛素生长因子II等用于鉴定卵巢癌状态。WO2015042115提及用于进行卵巢癌评估的生物标志物的实例包括:醛脱氢酶1(ALDH1)、ApoCI、ApoAII、ApoCII、β-血红蛋白、钙周期蛋白、钙粒蛋白A、钙粒蛋白C、紧密连接蛋白(claudin)-3、结缔组织生长因子(CTGF)、嗜酸粒细胞衍生神经毒素、成纤维细胞生长因子2(碱性)(FGF2)、叶酸盐受体1(FOLR1)、生殖糖蛋白(glycodelin)、GPCR49、谷胱甘肽S-转移酶θ1(GSTT1)、hepsin、铁调素(hepcidin)、胰岛素样生长因子-II、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4(inter-α-trypsininhibitor heavy chain H4)、激肽释放酶相关肽酶6(KLK6/7)、激肽释放酶10、瘦素、巨噬细胞抑制因子、粘蛋白-16(CA125)、骨桥蛋白、促乳素、蛋白酶丝氨酸8(proteaseserine 8)(PRSS8)、蛋白C抑制剂、溶质携带物家族39(锌转运体)成员4(SLC39A4)、小MBL相关蛋白C端片段、角质层糜蛋白酶(stratumcorneumchymotryticenzyme)、转铁蛋白、运甲状腺素蛋白、WAP四二硫化物核心域2(WAPfour-disulfidecore domain2)(HE4)、含有磷酸化Src同源区2结构域的转化蛋白1(Shc)、含有磷酸化Src同源区2结构域的E(She)、以及特异于酪蛋白激酶1ε的自身抗体等。
外泌体是活细胞分泌的直径为约30-100nm(最大可到150nm)的囊泡。其天然存在于体液中,包括血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、乳汁、眼泪、腹水,例如来自胸膜、心包、腹膜、腹部或其他体腔的液体中。外泌体包含核酸、蛋白质和脂质。外泌体脂质来源于细胞膜,属于磷脂双分子层结果。外泌体还包含膜蛋白如外泌体标志物CD9、CD63、CD81、CD326和膜内蛋白如热休克蛋白、核糖体蛋白、粘附分子、细胞骨架蛋白和细胞分泌的特定蛋白等。外泌体核酸包括DNA和RNA如mRNA,microRNA,ncRNA等。已经发现外泌体蛋白和RNA可能与疾病如癌症相关。
尽管进行了相关研究,本领域仍然需要能够有效用于卵巢癌筛查和诊断的有利生物标志物。
发明内容
在一些实施方案中,本发明提供用于评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的方法,其中使用c5a作为卵巢癌生物标志物。c5a由C5前体蛋白在C5转化酶作用下产生,分子量为115kDa。已经鉴定卵巢癌患者中的c5a(例如来自外泌体的c5a)能够用作卵巢癌的生物标志物。已经发现其可以补充或替代现有生物标志物。在一些实施方案中,用于评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的方法包括以下步骤:1)获得来自受试者的外泌体,和2)确定来自受试者的外泌体中生物标志物的存在和/或水平。
在一些实施方案中,本发明的方法还包括测定另外的卵巢癌生物标志物,例如CA125,HE4和PLG中的一种或多种,例如包括CA125和HE4二者。在一些实施方案中,本发明的方法包括测定由c5a、CA125和HE4组成的生物标志物。由于各肿瘤生物标志物之间的相容性,生物标志物的简单组合难以获得令人满意的效果,而如何从众多的肿瘤生物标志物中获得能够显著提高灵敏度和/或特异性的数种标志物实现有效诊断非常难以预期,已经成为本领域进行深入研究的课题。已经发现令人吃惊地发现c5a与其它卵巢癌生物标志物如CA125、HE4等具有良好的互补性,它们的组合显示了在卵巢癌检测中显著提高的灵敏度和特异性,显著高于其中各生物标志物的简单叠加,显示了协同效应。还令人吃惊地发现可以通过来自外泌体的生物标志物实现对卵巢癌的检测,并显示显著提高的灵敏度和/或特异性。例如,已经发现使用ROC曲线分析,与血清HE4和CA125组合检测相比,通过来自外泌体的c5a、HE4、CA125进行检测获得的曲线下面积(AUC)值为0.930,远大于血清HE4和CA125组合值(0.743);在95%的特异性下,外泌体的c5a、HE4、CA125的灵敏度为76%,而血清HE4和CA125组合的灵敏度为60%;在85%的灵敏度下,外泌体的c5a、HE4、CA125的特异性为92%,血清HE4和CA125的特异性为45%。相比之下,使用其他标志物的组合则不能达到类似的提高灵敏度和/或特异性的效果。
因此,在一些实施方案中,本发明涉及使用来自外泌体的生物标志物,而不使用血清或血浆生物标志物。在一些实施方案中,本发明涉及使用生物标志物c5a、HE4、CA125的组合。在一些实施方案中,所使用的生物标志物由c5a、HE4和CA125组成,而不包括任何其它生物标志物。在一些实施方案中,所使用的生物标志物均来自外泌体。在一些实施方案中,通过本发明的生物标志物或生物标志物组合改善卵巢癌分析的灵敏度和/或特异性。在一些实施方案中,通过本发明的生物标志物或生物标志物组合提高卵巢癌分析灵敏度和/或特异性例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍或更高。在一些实施方案中,通过本发明的生物标志物或生物标志物组合(例如外泌体生物标志物c5a、HE4、CA125组合)与对照相比(例如血清生物标志物,如血清HE4和CA125或其它标志物)提高卵巢癌检测的灵敏度,例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍或更高。在一些实施方案中,通过本发明的生物标志物或生物标志物组合(例如外泌体生物标志物c5a、HE4、CA125组合)与对照相比(例如血清生物标志物,如血清HE4和CA125或其它标志物)提高卵巢癌检测的特异性,例如5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍或更高。
在一些实施方案中,本发明的方法包括测定来自外泌体的生物标志物。用于检测生物标志物的方法是本领域已知的,例如可以使用包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、质谱法、放射免疫、化学发光、实时PCR、核酸杂交方法、蛋白质印迹分析、免疫检测(如免疫沉淀和/或免疫荧光)、Southern杂交等方法来检测生物标志物。例如可以使用抗体单克隆抗体作为生物标志物的检测试剂。
在一些实施方案中,生物标志物是指与疾病(如卵巢癌)相关的分子,例如与卵巢癌的存在、阶段、预后、预测治疗反应等相关的分子。卵巢癌生物标志物可以包括在卵巢癌受试者中有差异表现的蛋白(例如全长多肽、剪接变体、翻译后修饰多肽等)以及基因产物的片段及相应多核苷酸序列,如mRNA、DNA等。在一些实施方案中,本发明的方法包括测定来自怀疑患有卵巢癌的受试者的生物样品(例如来自外泌体的生物样品)中的c5a的步骤。
在一些实施方案中,可以检测生物标志物本身和/或生物标志物的产物,例如生物标志物的代谢产物和/或其它与生物标志物直接关联的产物。
在一些实施方案中,本发明的方法包括测定来自外泌体的生物标志物的步骤。在一些实施方案中,已经发现通过检测外泌体内含物中的生物标记物可以改善早期卵巢癌筛查和诊断时的敏感性、特异性和阳性预测值。外泌体(extracellular vesicles,exosomes)是一种胞吐小泡,通过转运母细胞中的蛋白,核酸等进行细胞间的信息交换。几乎所有细胞都会分泌外泌体,细胞分泌的外泌体携带了母细胞来源的诸多生物学信息。已经发现是重要的潜在生物标记物。由于大量的免疫反应、炎症反应、凝血反应,凋亡和自噬的发生,疾病状态的细胞会释放更多的外泌体,外泌体的内含物在量和质两方面都发生了显著地变化。相比于直接从血液中检测生物标记物,已经发现检测外泌体内含物中的生物标记物(例如本文描述的生物标志物中的一种或多种,例如全部生物标志物)是一种浓缩信息的方法,尤其可以用于卵巢癌的评估和分析。
在一些实施方案中,外泌体来自体液,例如来自血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、乳汁、眼泪、腹水,例如来自胸膜、心包、腹膜、腹部或其他体腔的流体。在一些实施方案中,外泌体来自与受试者接触或与来自受试者的样品接触的培养物、溶液如灌洗液,例如,细胞和器官培养基,包括细胞或器官条件培养基。
在一些实施方案中,本发明提供生物标志物检测试剂在制备用于评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的组合物或试剂盒中的用途。在一些实施方案中,本发明提供制备通过本发明的方法评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的组合物和/或试剂盒的用途。在一些实施方案中,其中所述组合物或试剂盒包括1)用于提取外泌体的试剂(例如外泌体特异性抗体)和/或装置(如用于分离外泌体的试管、过滤器、免疫磁珠等),和2)用于确定来自受试者的外泌体中生物标志物的存在和/或水平的试剂(例如针对所述生物标志物的抗体)。
在一些实施方案中,本发明中的来自外泌体的生物标志物的检测试剂可以包括外泌体提取试剂。在一些实施方案中,本发明中的来自外泌体的生物标志物的检测试剂还可以包括外泌体裂解试剂。外泌体分离的方法是本领域技术人员已知的。例如,外泌体分离方法包括超速离心法,密度梯度离心(如蔗糖密度梯度离心法)、外泌体沉降法,过滤法,免疫磁珠法,层析法、综合方法(采用不同方法进行外泌体粗提和纯化的方法)等。在一些实施方案中,外泌体提取试剂可以包括例如进行外泌体沉降的试剂,如PEG或其它亲水试剂。在一些实施方案中,本发明的生物标志物的检测试剂和/或外泌体提取试剂在广泛意义上可以包括例如用于进行生物标志物分析和/或外泌体分离的相关装置如离心机、用于离心的试管、用于分离外泌体的过滤器(如过滤细胞的大孔径过滤器、过滤蛋白杂志的小孔径过滤器和分离得到外泌体的孔径约0.1μm的过滤器等)、滤纸、薄膜(如硝酸纤维素膜)、凝胶、免疫磁珠等。在一些实施方案中,外泌体提取试剂包括针对外泌体特异性生物标志物的抗体如单克隆抗体。在一些实施方案中,可以采用的外泌体特异性生物标志物包括CD9、CD63、CD81、CD326、TSG101、Alix等。在一些实施方案中,外泌体提取试剂可以包括厂商(如SBI、Invitrogen等)提供的各种外泌体提取和/或分析试剂盒。在一些实施方案中,生物标志物的检测试剂和/或外泌体提取试剂可以包括用于生物标志物分析和/或外泌体分离和/或分析的各种缓冲液如PBS、电泳缓冲液等。在一些实施方案中,生物标志物的检测试剂和/或外泌体提取试剂可以包括针对特异性生物标志物的抗体和/或引物、探针,例如针对c5a,CA125,HE4和PLG中的任何一种或多种的抗体和/或相关核酸序列的引物、探针等。这样的抗体、引物和/或探针可以通过本领域已知的方法制备或从厂商购买。在一些实施方案中,本发明中的来自外泌体的生物标志物的检测试剂还可以包括外泌体裂解试剂。如本领域技术人员已知的,外泌体具有类似于细胞膜的磷脂双分子层。为了释放外泌体内容物,本发明所述的相关外泌体提取和/或分离和/或分析试剂中可以包括外泌体裂解试剂如RIPA裂解液等。在一些实施方案中,本发明中的来自外泌体的生物标志物的检测试剂还可以包括蛋白抑制剂。在一些实施方案中,可以不采用专门的裂解试剂而直接对外泌体内容物进行分析,例如将外泌体悬液直接加样于凝胶上进行电泳分析。在一些实施方案中,生物标志物的检测试剂和/或外泌体提取试剂可以包括蛋白分析试剂如Western Blot、ELISA分析试剂、蛋白质组分析试剂如蛋白质谱和抗体芯片等。在一些实施方案中,生物标志物的检测试剂和/或外泌体提取试剂可以包括示踪试剂,例如使所述生物标志物和/或外泌体与可视标记(如PKH26标签等)相连。在一些实施方案中,生物标志物的检测试剂和/或外泌体提取试剂可以包括序列分析试剂如高通量测序试剂。
在一些实施方案中,本发明提供通过本发明的方法评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的组合物和/或试剂盒,其中所述组合物或试剂盒包括所述生物标志物的检测试剂。在一些实施方案中,检测试剂可以包括蛋白和/或核酸检测试剂。在一些实施方案中,检测试剂可以包括免疫检测试剂。在一些实施方案中,试剂盒包含用于确定生物标志物表达的试剂。在一些实施方案中,试剂盒包含多种探针,所述探针与对应于本发明的生物标志物特异性结合。在一些实施方案中,试剂盒包含多种抗体,所述抗体与本发明的生物标志物特异性结合。在一些实施方案中,试剂盒包括与生物标志物蛋白或蛋白质片段特异性结合的抗体、抗体衍生物或抗体片段。在一些实施方案中,所述试剂盒可以包括多种与生物标志物与蛋白或其片段特异性结合的抗体、抗体衍生物或抗体片段。在一些实施方案中,试剂盒包括与生物标志物核酸或其片段特异性结合的核酸探针。在一些实施方案中,试剂盒可以包括多种与生物标志物核酸或其片段特异性结合的探针。核酸生物标志物可以包括基因组DNA、mRNA、剪切mRNA、cDNA等。检测试剂可以包括互补核酸。例如,固定于基质上的标记或未标记的寡核苷酸、未与基质结合的寡核苷酸、PCR引物、分子信标等。在一些实施方案中,试剂盒包括结合本发明的生物标志物的捕获试剂和包括至少一种生物标志物的容器。在一些实施方案中,所述捕获试剂可以结合多种生物标记,也可以结合至少一种已知生物标记。在一些实施方案中,试剂盒还可以包括第二或更多种捕获试剂。在一些实施方案中,试剂盒包括缓冲液。在一些实施方案中,试剂盒包括使用说明书。在一些实施方案中,试剂盒包括芯片或微阵列。在一些实施方案中,试剂盒包括附有吸附剂的一种或多种基质。
在一些实施方案中,本发明提供评估、诊断和/或监测卵巢癌状态的方法,其包括以下步骤:提取来自所述患者的生物流体样品中的外泌体,并检测(例如使用试剂盒检测)外泌体中生物标志物的存在和/或浓度,与未患卵巢癌的对照组患者相比,生物标志物的水平或评价的改变预示了患者患有卵巢癌。
本发明一般性地涉及癌症生物标志物,并且特别地涉及与卵巢癌相关的生物标志物。本发明提供了通过测量某些生物标志物来预测、评价诊断和监测癌症特别是卵巢癌的方法,并且还提供了评价与卵巢癌有关的生物标志物表达水平的试剂集合或阵列。
本发明涉及选自下列的一种或更多种生物标志物CA125,HE4,C5a,PLG的水平以及相应的组合。本发明涉及生物标志物的来源包括外泌体。
本发明中外泌体的来源包括体液。体液包括血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、乳汁、眼泪和腹水;也包括胸膜、心包、腹膜、腹部和其他体腔等的流体。生物流体可还包括与对象或生物来源(例如,细胞和器官培养基,包括细胞或器官条件培养基)相接触的液体溶液、灌洗液等。
本发明中包含使用免疫学方法检测上述生物标志物的试剂盒。在一些实施方案中,所述试剂盒包括1)用于提取外泌体的试剂和/或装置,和2)用于确定来自受试者的外泌体中生物标志物的存在和/或水平的试剂。
与现有技术通常直接分析体液样本中生物标志物不同,本发明通过分离特定的外泌体将病灶处的生物信息定向浓缩,可以显著降低体液中其他信息的干扰,从而放大了病灶处的信息。这使得在目前的检验仪器试剂的灵敏度下,早期疾病的诊断变得更为精准。
在一些实施方案中,本发明发现标志物c5a(例如来自外泌体)能够提高癌症诊断的灵敏度和特异性。在一些实施方案中,标志物c5a可以与现有技术通常使用的标志物(例如CA125/HE4)组合用于癌症诊断和预后分析。
在一些实施方案中,本发明包括使用体液样本中抽提的外泌体替代体液样本作为检测对象。已经发现其能够有效用于卵巢癌(风险)评估、诊断、检测、监测、预后、治疗等一个或多个方面。在一些实施方案中,可以通过CA125/HE4/c5a联合应用于卵巢癌(风险)评估、诊断、检测、监测、预后、治疗等一个或多个方面。
在一些实施方案中,患者的生物标志物比未患有所述癌症的生物标志物水平高或低1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中,本发明提供生物标志物的组合,其包括两种或更多种本发明的生物标志物的组合。在一些实施方案中,生物标志物的水平(例如蛋白水平、蛋白活性水平、RNA水平、相关代谢物水平等)可单独用于卵巢癌的评估、诊断和/或预后。在一些实施方案中,生物标志物(例如c5a)可以进行组合,例如与本领域中已知的卵巢癌生物标志物(例如上文提及的那些)组合用于卵巢癌的评估、诊断和/或预后。
本发明的方法、组合物、试剂盒可以用于评估受试者是否患有卵巢癌;评估受试者中卵巢癌的分期;评估受试者中卵巢癌的分级;评估受试者卵巢癌的良性或恶性性质;评估受试者卵巢癌的转移可能性;评估卵巢癌细胞的存在;评估一种或多种候选化合物抑制受试者卵巢癌的效果;评估治疗方法的效果;监测受试者卵巢癌的进展;筛选抑制受试者卵巢癌的组合物或治疗方法;评估试验化合物的致卵巢癌能力;以及预防具有发展卵巢癌危险的受试者的卵巢癌发病。
附图说明
图1:ROC分析结果。
具体实施方式
从晚期病人(III/IV)组和健康对照组的血清、血浆中分离和富集卵巢突变卵巢细胞分泌的外泌体,并提取其中蛋白,通过蛋白组学方法分别对两组样本中的蛋白进行全扫描;
对比两组样本扫描结果,通过通路(pathway)分析,排除偶然误差;
选定并排序候选生物标记物。
进一步扩大样本量,选择20个晚期(III/IV)病人(病因单一为卵巢癌无其他相关并发症)和20个健康对照,从他们血样中提取外泌体,检验候选生物标记物在两组的区别是否显著。
选择100位卵巢癌病人(I-IV),且I-IIa不少于35人和年龄匹配的相对健康对照组进行验证。
病人组和对照组定义
·病人组:卵巢癌病人(FIGO 1-4期)的血样需要在尚未进行手术或化疗之前取得。早期病人(FIGO I-IIa)不低于病人组的1/3。
·对照组:对照组病人在取样后两年内没有被确诊为卵巢癌。对照组内的病人,可以有相似的症状,却需要避免因为相同的病因,从而减少干扰。
通过如下方法进行分析:
1.蛋白组学(proteomics):iTraq用于外泌体内含物中的蛋白的扫描和对照;
2.下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS):Illumina用于外泌体内含物中核酸的扫描;
3.免疫结合反应用于检验和验证阶段的蛋白候选的检测;
4.即时定量聚合酶链式反应(Quantitative real time polymerase chainreaction,qrt-PCR)用于检验和验证阶段的核酸候选的检测。
5.IBM SPSS将用于数据分析和截点(cut-offpoint)的选取。
外泌体抽提如下进行:
1.1取一定量血清或血浆样本,加入1/4体积的外泌体提取试剂(上海思路迪生物医学科技有限公司,备案号:沪闵械备20170019号);
1.2使用移液器吹打直至混合物形成絮状胶体,置于20℃孵育10分钟;
1.3将混合物放入离心机中,4℃4500×g离心10分钟,弃去上清;收集沉淀备用(沉淀即为提取的外泌体);
1.4进入与样本等体积裂解液(罗氏货号:04719964001)室温裂解30分钟后测试蛋白含量。
对于血清ROMA模型:使用逻辑回归算法(logistic regression algorithms)对良恶性卵巢肿瘤患者血清HE4和CA125水平进行分析,评估恶性卵巢癌风险;参见例如A novelmultiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction ofovarian cancer in patients with a pelvic mass.Moore,Richard G.etal.Gynecologic Oncology,Volume 112,Issue 1,40-46。
对于外泌体ABD模型:使用IBM SPSS软件,通过受试者工作特征曲线(receiveroperating characteristic curve,简称ROC曲线)方法对良恶性卵巢肿瘤患者血清来源的外泌体中HE4(Gene ID:10406)、CA125(Gene ID:94025)及c5a(Gene ID:727)水平进行分析,评估恶性卵巢癌风险。
曲线下面积
检测结果变量:血清CA125和HE4模型预测可能性在阳性实际状态组和阴性实际状态组之间具有至少一种联系。统计可能有偏倚。
a.在非参数假设下
b.零假设:真实面积=0.5
使用接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,或者叫ROC曲线)对患者血清样本进行分析,与现有技术血清ROMA模型相比,外泌体ABD模型曲线下面积(AUC)值为0.930,远大于血清ROMA模型的AUC值(0.743),在95%的特异性下,外泌体ABD模型的灵敏度为76%,血清ROMA模型的灵敏度为60%;在85%的灵敏度下,外泌体ABD模型的特异性为92%,血清ROMA模型的特异性为45%。
Claims (10)
1.来自外泌体的生物标志物的检测试剂在制备用于评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的组合物或试剂盒中的用途,其中所述来自外泌体的生物标志物包括c5a,其中评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌包括1)获得来自受试者的外泌体,和2)确定来自受试者的外泌体中生物标志物的存在和/或水平。
2.权利要求1所述的用途,其中所述生物标志物还包括另外的卵巢癌生物标志物,例如CA125,HE4和PLG中的一种或多种。
3.权利要求1或2所述的用途,其中所述生物标志物包括来自外泌体的c5a、CA125和HE4。
4.权利要求1-3中任一项所述的用途,其中所述来自外泌体的生物标志物的检测试剂包括抗体,例如单克隆抗体。
5.权利要求2-4中任一项所述的用途,其中所述外泌体来自体液,例如来自血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、乳汁、眼泪、腹水,例如来自胸膜、心包、腹膜、腹部或其他体腔的流体。
6.权利要求2-5中任一项所述的用途,其中所述外泌体来自与受试者接触或与来自受试者的样品接触的培养物、溶液如灌洗液,例如,细胞和器官培养基,包括细胞或器官条件培养基。
7.权利要求1-6中任一项所述的用途,其中所述来自外泌体的生物标志物的检测试剂检测生物标志物本身和/或所述生物标志物的产物。
8.评估、诊断和/或监测受试者卵巢癌的组合物或试剂盒,其中所述组合物或试剂盒包括权利要求1-7中任一项中定义的生物标志物的检测试剂,其中所述组合物或试剂盒包括1)用于提取外泌体的试剂和/或装置,和2)用于确定来自受试者的外泌体中生物标志物的存在和/或水平的试剂。
9.权利要求8所述的组合物或试剂盒,其中所述来自外泌体的生物标志物的检测试剂包括蛋白和/或核酸检测试剂,例如外泌体蛋白和/或核酸检测试剂。
10.权利要求8或9所述的组合物或试剂盒,其中所述来自外泌体的生物标志物的检测试剂包括免疫检测试剂。
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