TWI539161B - 用於偵測胃癌之標識物 - Google Patents

Description

用於偵測胃癌之標識物

本發明係關於癌症的檢測。特定而言，本發明係關於檢測癌症之遺傳及/或蛋白質標識物的用途，且更特定而言，檢測胃癌之遺傳及/或蛋白質標識物的用途。

當早期檢測並治療癌症時，大大地提高了癌症患者的存活。在胃癌的案例中，診斷出患有早期疾病的患者，90%有5-年存活率，與大約10%之診斷患有晚期疾病的患者相比較。然而，目前絕大多數的胃癌患者是患有晚期疾病。因此，導致胃癌之早期診斷的發展可導致改善患者的預後。

在生物試樣，包括體液，例如血液、尿、腹膜沖洗液和糞便萃取物中確認與專一之癌症有關的標識物，可提供早期診斷癌症的有價值方法，導致早期治療並改善預後。專一的癌症標識物亦可提供監視疾病進行的工具，能夠追蹤手術、放射線治療和化學治療的治療效力。然而，對許多主要的癌症而言，可利用的標識物苦於不足的敏感性和專一性。例如，最常使用的胃癌標識物ca19-9、ca72-4和絨毛膜胚胎抗原(CEA)僅檢測出大約15-50%的任何階段之胃腫瘤，而對於早期疾病則衰退至大約2-11%。因此，有極高頻率的偽陰性測試，可導致患者和照顧健康之醫師相信沒有疾病存在，但事實上患者可能有需要立刻注意的嚴重癌症。此外，這些標識物可能在高達1/3的患有良性胃病之個體中，得到偽陽性的信號。

因此，迫切地需要檢測癌症存在的較佳方法。本發明之觀點提供可提供早期癌症之檢測，並降低偽陽性和偽陰性測試結果之頻率的方法、組合物及裝置。

在某些具體實施例中，可使用分子分析來確認與非-惡性胃組織相比較，在胃腫瘤組織中過度表現的基因。這類分析包括微陣列和定量聚合酶連鎖反應(qPCR)方法。在本文中將癌症基因和由那些基因編碼的蛋白質稱為胃腫瘤標識物(GTM)。應了解GTM一詞並未要求該標識物是僅對胃腫瘤專一的。反而可在其他類型的腫瘤中，包括惡性或非-惡性的腫瘤，包括胃、膀胱、結直腸、胰臟、卵巢、皮膚(例如黑色素瘤)、肝臟、食道、子宮內膜和腦癌等等，增加GTM的表現。然而，應了解GTM一詞不包括先前技藝之標識物ca19-9、ca72-4和CEA。一些GTM充分地過度表現，以高度的可靠性用來診斷胃癌，而在其他的案例中，二或多個GTM的過度表現可提供可靠的胃癌診斷。

在某些具體實施例中，可使用微陣列方法來檢測一或多個與癌症有關之基因的過度表現的圖譜。

在其他的具體實施例中，可使用定量聚合酶連鎖反應(qPCR)確認在腫瘤或其他生物試樣中過度表現之標識物的存在。

在本文中揭示之GTM檢測的一些具體實施例，是以高度選擇性之方式，在腫瘤細胞中過度表現，而在非-腫瘤細胞中即使有也很少過度表現，容許僅利用一種過度表現GTM的測量值，選擇性和精確地檢測癌症。在其他的具體實施例中，可在試樣中檢測二、三或多個GTM，並提供較大的診斷確實性。

可藉著或從細胞中切下來篩選編碼蛋白質之選出的基因。這些蛋白質，單獨或彼此混合，具有做為診斷胃癌之血清或體液標識物，或做為監視已建立之疾病進行的標識物。可使用此項技藝中已知的方法，進行蛋白質標識物的檢測，包括使用單株抗體、多株抗血清及其類似物，使用放射性免疫測定(RIA)、蛋白質晶片或懸浮陣列。

定義

在詳細描述本發明的具體實施例之前，提供一些在本文中所使用之名詞的定義將是有用的。

"GTM"或"胃腫瘤標識物"或"GTM家族成員"一詞意指與胃癌有關之基因、基因片段、RNA、RNA片段、蛋白質或蛋白質片段，或其他確認與其相關的分子，其不包括在先前技藝中已知與胃癌有關的分子，ca19-9、ca72-4和CEA。在下文中包括GTMs的實例。

"標識物"一詞意指與生物現象的存在有定性或定量關聯的分子。"標識物"的實例為GTMs，然而"標識物"亦包括代謝產物、副產物，無論是與隱藏在機制下之條件直接或間接有關的。

"qPCR"一詞意指定量聚合酶連鎖反應。

"表現"一詞包括從基因或一部分基因中產生mRNA，亦包括產生由RNA或基因或一部分基因編碼的蛋白質，更包括出現與表現有關的檢測材料。例如，結合配體，如抗體與基因或其他寡核苷酸、蛋白質或蛋白質片段結合，並使該結合配體顯色，亦納入"表現"一詞的範圍內。因此，在免疫墨點，如西方墨點上增加斑點的密度，亦納入隱藏在生物分子下之名詞"表現"的範圍內。

"CPN2"一詞意指人類羧肽酶N，多肽2，83kDa鏈；以及羧肽酶N。

"HAPLN4"一詞意指人類透明質酸糖蛋白連接蛋白質4。

"MMP12"一詞意指人類基質金屬蛋白酶12。

"INHBA"一詞意指人類抑制素，βA(亦包括激活素(activin)A、激活素AB或α多肽)。

"IGFBP7"一詞意指人類類胰島素生長因子7。

"GGH"一詞意指人類γ-穀胺醯水解酶(亦稱為接合酶(conjugase)、佛里聚γ穀胺醯基(folylpolygammaglutamyl)水解酶)。

"LEPRE1"一詞意指人類富含亮胺酸脯胺酸之蛋白多糖(亦稱為蕾普肯(leprecan)1)。

"CST4"一詞意指人類半胱胺酸蛋白酶抑制劑S。

"SFRP4"一詞意指人類分泌性捲曲(frizzled)相關蛋白質4。

"ASPN"一詞意指人類阿斯波雲(asporin)(亦稱為LRR第1類)。

"CGREF1"或"CGR11"一詞意指具有EF手功能部位1的人類細胞生長調節劑。

"KLK"一詞除非另行指定，意指人類激肽釋放酶10，變體1或人類激肽釋放酶10，變體2或兩者。

"TIMP1"一詞意指金屬蛋白酶1的人類組織抑制劑(亦稱為紅血球系增效活性(erythroid potentiating activity)或膠原蛋白酶抑制劑)。

"SPARC"一詞意指人類分泌性蛋白質，酸性的，富含半胱胺酸(亦稱為骨黏連蛋白(osteonectin))。

"TGFBI"一詞意指人類轉化生長因子，β-誘導，68kDa。

"EFEMP2"一詞意指人類含EGF之類-菲布林(fibulin)細胞外基質蛋白質2。

"LUM"一詞意指人類魯米肯(lumican)。

"SNN"一詞意指人類斯特寧(stannin)。

"SPP1"一詞意指人類分泌性磷蛋白1(亦稱為造骨蛋白(osteopontin)或骨唾液酸蛋白質I或早期T-淋巴細胞激活1)。

"CSPG2"一詞意指人類硫酸軟骨素蛋白多糖2(亦稱為福西肯(versican))。

"ASAH1"一詞意指人類N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶，變體1或N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶，變體2或N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶變體1和2兩者(亦稱為酸性神經醯胺酶，變體1和2)。

"PRSS11"一詞意指人類蛋白酶，絲胺酸11(亦稱為IGF結合絲胺酸蛋白酶)。

"SFRP2"一詞意指人類分泌性捲曲-相關蛋白質2。

"PLA2G12B"一詞意指人類磷脂酶A2，XIIB群。

"SPON2"一詞意指人類斯旁汀(spondin)2，細胞外基質蛋白質。

"OLFM1"一詞意指人類嗅托美定(olfactomedin)1。

"TSRC1"一詞意指含有1之人類血小板反應蛋白(thrombospondin)重複段。

"THBS2"一詞意指人類血小板反應蛋白2。

"阿德利肯"一詞意指DKFZp564I1922。

"CST2"一詞意指人類半胱胺酸蛋白酶抑制劑SA。

"CST1"一詞意指人類半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN。

"LOXL2"一詞意指人類離胺醯氧化酶-類酵素2。

"TG"一詞意指人類甲狀腺球蛋白。

"TGFB1"一詞意指人類轉化生長因子，β1。

"SERPINH1"一詞意指人類絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑，位階H(亦稱為熱休克蛋白質47，成員1，或膠原蛋白結合蛋白質1)。

"SERPINB5"一詞意指人類絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑，位階B(亦稱為卵清蛋白，成員5)。

"CEACAM5"或"CEA"一詞意指人類癌胚抗原-相關之細胞黏連分子5。

"MMP2"一詞意指人類基質金屬蛋白酶2(亦稱為明膠酶A或72kDa明膠酶或72kDa第IV型膠原蛋白酶)。

"PCSK5"一詞意指人類蛋白原轉變酶枯草桿菌蛋白酶/凱欣(kexin)第5型。

應了解以上的名詞可意指蛋白質、DNA序列及/或RNA序列。亦應了解上文的名詞亦可意指具有與在本文中敘述的相同之序列的非-人類蛋白質、DNA及/或RNA。

本發明之具體實施例的說明

提供檢測和評估包括胃癌之癌症的標識物，其在檢測胃癌上具有比先前技藝之標識物更大的可靠性。關於"可靠性"一詞，我們包括缺乏偽陽性及/或偽陰性。因此，標識物的可靠性越高，則與使用該標識物進行之診斷相關的偽陽性及/或偽陰性就越少。因此，在某些具體實施例中，提供容許以比先前技藝之標識物的可靠性更高大約50%之可靠性來檢測胃癌的標識物。在其他的具體實施例中，提供具有比大約70%更高之可靠性的標識物；在另外的具體實施例中，比大約73%更高；在另外的具體實施例中，比大約80%更高；在另外的具體實施例中，比大約90%更高；在另外的具體實施例中，比大約95%更高；在另外的具體實施例中，比大約98%更高；且在某些具體實施例中，大約100%可靠性的標識物。

因此，我們已經驚人地發現許多基因和蛋白質的出現與胃腫瘤有關連。因此，可使用基因產物(例如寡核苷酸，如mRNA)，以及從這類寡核苷酸中轉譯之蛋白質和肽的檢測，來診斷腫瘤，如胃腫瘤。取自患有胃腫瘤之患者和相同個體之非-惡性組織的試樣之陣列分析，已經引導我們至該驚人發現，在許多胃腫瘤中，某些基因之過度表現的專一圖譜與疾病有關。

亦可使用對抗癌症標識物而升高之抗體，來檢測癌症標識物。

因此，藉著分析多個癌症標識物的存在和含量，可增加診斷的敏感性，同時降低偽陽性及/或偽陰性結果的頻率。

癌症檢測的一般方法

下列的方法是使用GTM家族成員，可用來檢測癌症，包括胃癌的非限制性方法。

‧使用對GTM基因之產物有選擇性的寡核苷酸探針的微陣列。

‧使用標識物專一的引子和探針，對腫瘤試樣和正常試樣進行即時定量PCR(qPCR)。

‧酵素連結免疫測定(ELISA)。

‧使用抗-標識物抗體，對胃腫瘤和淋巴結轉移進行免疫組織化學。

‧使用抗-標識物抗體，對其他腫瘤，包括但不限於結直腸、胰臟、卵巢、黑色素瘤、肝臟、食道、膀胱、子宮內膜和腦，進行免疫組織化學。

‧在手術移除腫瘤之前和之後，從胃癌患者中採取的血清中，進行標識物家族成員的免疫檢測。

‧在得自健康個體和罹患非-惡性疾病，如胃炎、潰瘍、胃化生和發育不良的個體之血清中，進行標識物家族成員的免疫檢測。

‧在患有其他癌症，包括但不限於結直腸、胰臟、卵巢、黑色素瘤、肝臟、食道、膀胱、子宮內膜和腦的患者中，進行標識物家族成員的免疫檢測。

‧在體液，包括血清、淋巴、腹膜液、腦脊髓液、滑囊液及其類似物中，檢測標識物。

‧在得自胃癌患者之胃液、腹膜沖洗液、尿和糞便中，進行標識物家族成員的免疫檢測。使用陣列法及/或qPCR。

‧使用電腦分析陣列或qPCR數據。收集原始數據，並藉著比較胃腫瘤基因表現與相同基因在非-腫瘤組織中表現的程度，進行倍數變化分析。提供斷定表現增加的閾值(例如1.5x增加、2-倍增加，且在另外的具體實施例中，3-倍增加、4-倍增加或5-倍增加)。可了解可選擇其他斷定已經發生增加表現的閾值，不違背本發明之範圍。腫瘤基因表現的進一步分析，包括使那些顯示出增加表現的基因與已知胃腫瘤之表現圖譜相配，提供腫瘤的診斷。

在某些觀點中，本發明提供檢測癌症的方法，包括：

(a)提供生物試樣；並

(b)在該試樣中檢測GTM家族成員的過度表現。在其他的觀點中，本發明包含檢測GTM mRNA之過度表現的步驟。

在其他的觀點中，本發明包含檢測GTM蛋白質之過度表現的步驟。

在更進一步的觀點中，本發明包含檢測GTM肽之過度表現的步驟。

在更進一步的觀點中，本發明包括檢測GTM之裝置，包括：在其上具有GTM捕捉試劑之受質；以及與該受質連結的檢測器，該檢測器能夠檢測與該捕捉試劑結合的GTM，其中該捕捉試劑包含寡核苷酸或抗體。

額外的觀點包含檢測癌症的套組，包括：受質；GTM捕捉試劑，包括一或多個GTM-專一之寡核苷酸和GTM-專一之抗體；以及使用說明書。

本發明更進一步的觀點包含使用qPCR檢測GTM的方法，包括：對該GTM專一的前進引子；對該GTM專一的逆向引子；PCR試劑；反應瓶；以及使用說明書。

本發明額外的觀點包括檢測GTM蛋白質或肽之存在的套組，包括：具有該GTM蛋白質或肽之捕捉試劑的受質；對該GTM蛋白質或肽專一的抗體；能夠標示已經與該GTM蛋白質或肽結合之抗體的試劑；以及使用說明書。

本發明額外的觀點包含製造單株抗體的方法，包括下列步驟：在更進一步的觀點中，本發明包含檢測胃癌的方法，包括下列步驟：提供來自懷疑患有胃癌之患者的試樣；使用ELISA法測量GTM蛋白質的存在。

如同在本文中描述的，可藉著測量一或多個腫瘤-專一之標識物的表現，完成腫瘤的檢測。我們意外地發現在增加GTMs表現與診斷胃癌的存在之間的關聯性是極高的。檢測到最不顯著之關聯具有大約1.6x10^-6的p值。在小於10^-20之p值處，許多關聯是顯著的。利用這樣的高顯著性，可能不必在一種以上的GTM中檢測到增加的表現。然而，在本發明中冗長的GTMs，可容許以增加的可靠性來檢測胃癌。

在本文中提供之方法亦包含高敏感性的測定。qPCR是極為敏感的，並可用來在試樣中檢測極低副本數目(例如1-100)的基因產物。利用這樣的敏感性，有可能進行與胃癌有關之事件的極早檢測。

方法

使用下列的一般方法來評估各種方法對於與胃腫瘤有關之標識物之分子確認的適當性。

腫瘤收集

從在Seoul National University Hospital,Korea和Dunedin Hospital,New Zealand切除的手術樣本中，收集胃腫瘤試樣和非-惡性胃組織。以徵候、理學發現和組織的組織學檢查為基礎，進行胃癌的診斷。

RNA萃取

在一些具體實施例中，藉著判定在得自取自腫瘤的試樣之RNA上的變化，分析與胃腫瘤有關之基因的表現。在OCT介質中包埋冷凍的手術樣本。使用切片機從組織塊中切下60微米的薄片，在TriReagent：水(3:1)混合物中均質化，然後以氯仿萃取。然後使用RNeasy^TM程序(Qiagen)，從液相中純化總RNA。亦從16個癌細胞株中萃取RNA，並集合做為參考RNA。

微陣列載片製備

從MWG Biotech AG,Ebersberg,Germany獲得環氧樹脂塗覆的玻片，並根據製造者的草案，使用Gene Machines微陣列機器人，印上大約30,000個50體的寡核苷酸。在圖2中出示有關的寡核苷酸，以及NCBI mRNA和蛋白質參考序列的整理號碼(MWG oligo#)。在下文中出示本發明之GTM的完整DNA序列。

RNA標示和雜交作用

在含有5-(3-胺烯丙基)-2'-脫氧尿苷-5'-三磷酸的反應中，使用SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen)，從10微克總RNA中轉錄cDNA。然後在Microcon管柱中將該反應去-離子，之後在室溫下，在重碳酸鹽緩衝溶液中與Cy3或Cy5一起培養1小時。使用Qiaquick管柱(Qiagen)，移除未併入的染料，並在SpeedVac中將試樣濃縮至15微升。然後將Cy3和Cy5標示之cDNAs與Ambion ULTRAhyb緩衝溶液混合，在100℃下變性2分鐘，並在42℃下，在雜交室中與微陣列載片雜交16小時。然後沖洗載片，並在設定為2出力的Axon 4000A掃描器上掃描2次，產生基因表現的原始螢光數據。

標準化程序

欲比較來自腫瘤和非-癌性組織之癌症基因的表現，藉著減去局部背景螢光強度，校正藉著Genepix^TM軟體檢測到的中間螢光強度。排除具有低於0之背景校正強度的點。欲使標準化更便利，將強度比例和整體墨點強度進行對數轉換。針對染料和空間偏斜，使用在LOCFIT^TM套裝軟體中提供的局部迴歸，校正對數轉換的強度比例。關於整體墨點強度和位置，同時進行對數轉換之強度比例的迴歸。局部迴歸的餘差提供經過校正之對數-倍數變化。為了品管，將每個標準化微陣列的比例對墨點強度和局部化作圖。隨後對可能剩下的加工品，以肉眼檢查點圖。此外，亦應用變異數分析(ANOVA)模式，檢測針-尖偏斜。將所有標準化的結果和參數插入統計分析的Postgres-資料庫中。

統計分析

藉著測量在陣列之間的倍數變化，確認在腫瘤試樣對正常組織中，在基因表現上的統計顯著變化。欲完成該工作，按比例調整log2(比例)，使每個陣列具有相同的整體標準偏差。標準化過程降低了平均組織種類-內的變異性。更進一步轉換log2(比例)，使每個寡核苷酸具有0之中間值，以便使肉眼檢查結果更容易。然後使用以倍數變化為基礎的等級-檢定，改善噪音的強健性。該檢定由兩個步驟組成：(i)計算在陣列內倍數變化的等級(Rfc)，並(ii)從腫瘤組織的中間值(Rfc)中減去正常組織的中間值(Rfc)。兩個中間值等級的差異定義出現在圖2中之倍數變化等級的分數。亦可對該標準化數據進行兩種額外的統計檢定：1)兩個試樣的student's t-檢定，有或無Bonferroni調整，以及2)Wilcoxon檢定。

標識物組合的統計分析

欲判定使用二或三個標識物之組合，辨別腫瘤和非-惡性試樣的價值，使得自40對試樣之qPCR數據(腫瘤和非-惡性試樣係得自相同的患者)接受下列的分析。使用試樣平均值和標準偏差，產生非-惡性和腫瘤試樣的標準分布。然後判定取自腫瘤表現數據之值將超過在非-惡性分布中之限定閾值(例如大於50%、70%、73%、80%、90%、95%、98%、99%或100%)的或然率(即敏感性)。至於標識物的組合，判定至少一個標識物超過閾值的或然率。

定量即時PCR

在其他的具體實施例中，可為了PCR模板副本數目的絕對或相對定量，使用即時或定量PCR(qPCR)。使用Primer Express V 2.0^TM(Applied Biosystems)，設計Taqman^TM探針和引子組。在可能之處，將所有有潛力的接合變體納入所得的擴大區內，擴大區優先提供由MWG-Biotech-衍生之微陣列寡核苷酸涵蓋的區域。或者，若藉著涵蓋想要擴大區之Assay-on-Demand^TM表現陣列(Applied Biosystems)來代表標靶基因，則使用這些。在表1和在圖1中，出示qPCR所使用之基因、符號、Applied Biosystems"要求即進行測定"的號碼、前進引子、逆向引子和探針序列的名稱。在公司內設計的測定中，使用SYBR綠標示草案和從參考RNA製造的cDNA，滴定引子濃度。在標準環化條件下，在ABI Prism^TM 7000序列檢測系統上進行擴大作用。當在解離曲線中觀察到單一的擴大產物時，使用最適引子濃度和終濃度250nM的5'FAM-3'TAMRA磷酸Taqman^TM探針(Proligo)，產生超過625-倍濃度範圍的標準曲線。在後續的測定中，使用提供具有超過0.98之迴歸係數的標準曲線的測定。可了解在其他的具體實施例中，迴歸係數不用那樣高。更確切地說，可使用任何標準曲線，只要迴歸係數高得足以容許在統計上顯著地判定在表現上的差異即可。在另類的具體實施例中，這類迴歸係數可以是大約0.7以上，大約0.8以上，大約0.9以上或大約0.95以上。

在兩個96孔的培養盤上進行測定，以單一cDNA代表每個RNA試樣。每盤含有一式兩份參考cDNA標準曲線，超過625-倍濃度範圍。分析包括計算ΔCT(標靶基因CT-平均參考cDNA CT)。ΔCT與負的log2倍數變化成正比。然後計算相對於中間非-惡性log2倍數變化的log2倍數變化(log2倍數變化-中間標準log2倍數變化)。然後將這些倍數變化群聚成頻率類別，並作出圖表。

癌症標識物基因的微陣列分析

以Cy5標示得自58個胃腫瘤和58個非-惡性("正常")胃組織試樣的RNA，並以一式兩份或一式三份與Cy3標示之參考RNA雜交。在標準化之後，然後藉著三種測量估計在29,718個基因的每一個中，在表現上的變化：(i)倍數變化：在腫瘤試樣中之基因的中間值表現除以在非-惡性試樣中之中間值的比例。觀察到顯著之倍數變化的(ii)倍數變化等級和(iii)統計或然率。

癌症標識物基因的免疫學分析

可了解一旦產生對抗GTM的抗體(單株或多株的)，便可使用數種類型的免疫學方法，進行GTM之檢測。放射免疫測定(RIA)法是此項技藝中已熟知的，並可在流體或腫瘤的萃取物中，用來檢測並定量GTM蛋白質。

此外，亦可製造蛋白質晶片及/或懸浮液陣列，其中將對抗GTM之抗體放在受質上，如玻璃或塑膠表面。可將試樣施用在晶片表面或懸浮液陣列上，並使出現在試樣中之GTM與抗體結合。在沖洗移除未結合的抗體之後，可使用針對GTM的第二個抗體，使GTM顯色。製造抗體和蛋白質晶片，以及懸浮液陣列的方法，為此項技藝中已知的，不用在本文中進一步說明。

為了胃惡性選擇血清標識物

在某些具體實施例中，可在生物流體，包括血清中找到癌症標識物。以(i)分泌性蛋白質特有的或從膜外側切開之信號序列的存在，(ii)與非-惡性對照組相比較，在腫瘤中過度表現(倍數變化)的中間程度，(iii)在腫瘤和非-惡性對照組之間的表現等級上的中間變化，以及(iv)在腫瘤和非-惡性對照組中之表現範圍之間的重疊程度為基礎，從陣列數據中選擇血清標識物。

已知所有29個GTMs均在其密碼序列的5'端具有信號肽序列。信號序列瞄準GTM蛋白質，經由漿膜運送至細胞外的隔間(Gunner von Heijne,Journal of Molecular Biology 173:243-251(1984))。此外，沒有任何GTMs具有穿透膜序列基序，其將導致全長的蛋白質被保留在漿膜內。結果，本發明所有的GTM標識物均可能被分泌至細胞外的間隔內，並因此可與血液供應接觸，被毛細血管攝入或被運送至淋巴系統內，然後進入血液供應內。結果，這些腫瘤-衍生的標識物均將出現在血液中。

接下來，若>50%的腫瘤試樣顯示表現程度在非-惡性範圍的95%內，便排除該基因。在腫瘤試樣中，在過度表現之程度上的變化，不僅反映腫瘤的異質性，還有在腫瘤試樣被"正常"組織，包括肌肉、基質細胞和非-惡性上皮腺體污染之程度上的變化。"正常"污染範圍從5到70%，中間值大約25%。排除其他的基因，因為在造血細胞中的高相對表現，或是在化生之胃組織中升高的表現。可了解依據被正常細胞或正常表現該標識物之細胞污染的程度，可選擇不同的閾值範圍，提供癌症來源與正常來源的充分分離。

我們發現有用的GTM包括下列標識物之基因(DNA)、互補DNA(cDNA)、RNA、蛋白質和蛋白質片段：羧肽酶N，多肽2，83kDa鏈(亦稱為羧肽酶N(CPN2))、基質金屬蛋白酶12(MMP12)、抑制素("INHBA")、類胰島素生長因子7("IGFBP7")、γ-穀胺醯水解酶("GGH")、富含亮胺酸脯胺酸之蛋白多糖("LEPRE1")、半胱胺酸蛋白酶抑制劑S("CST4")、分泌性捲曲相關蛋白質4("SFRP4")、阿斯波雲("ASPN")、具有EF手功能部位1的細胞生長調節劑("CGREF1")、激肽釋放酶10("KLK10")、金屬蛋白酶1之組織抑制劑("TIMP1")、分泌性酸性的富含半胱胺酸之蛋白質("SPARC")、轉化生長因子，β-誘導的("TGFBI")、含EGF之類-菲布林細胞外基質蛋白質2("EFEMP2")、魯米肯("LUM")、斯特寧("SNN")、分泌性磷蛋白1("SPP1")、硫酸軟骨素蛋白多糖2("CSPG2")、N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶("ASAH1")、絲胺酸蛋白酶11("PRSS11")、分泌性捲曲-相關蛋白質2("SFRP2")、磷脂酶A2，XIIB群("PLA2G12B")、斯旁汀2，細胞外基質蛋白質("SPON2")、嗅托美定1("OLFM1")、含有1之血小板反應蛋白重複段("TSRC1")、人類血小板反應蛋白2("THBS2")、阿德利肯、半胱胺酸蛋白酶抑制劑SA("CST2")、半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN("CST1")、離胺醯氧化酶-類酵素2("LOXL2")、甲狀腺球蛋白("TG")、轉化生長因子，β1("TGFB1")、絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑，位階H("SERPINH1")、絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑，位階B("SERPINB5")、基質金屬蛋白酶2("MMP2")、蛋白原轉變酶枯草桿菌蛋白酶/凱欣第5型("PCSK5")，以及透明質酸糖蛋白連接蛋白質4("HAPLN4")。

在下文中出示本發明之GTM的DNA序列，連同確認資訊。

基質金屬蛋白酶12

>gi∣4505206∣ref∣NM_002426.1∣人類基質金屬蛋白酶12(巨噬細胞彈性蛋白酶)(MMP12)，mRNA∣qPCR前進_引子與[758..780]相配∣qPCR逆向_引子與[888..864]相配∣qPCR探針與[786..815]相配

抑制素βA

>gi|4504698|ref|NM_002192.1|人類抑制素，βA(激活素A、激活素ABα多肽)(INHBA),mRNA|qPCR在前後文中要求時測定與[457..481]相配

類胰島素生長因子7

>gi∣4504618∣ref∣NM_001553.1∣人類類胰島素生長因子7(IGFBP7),mRNA∣qPCR前進_引子與[470..487]相配∣qPCR逆向_引子與[567..546]相配∣qPCR探針與[492..517]相配

γ-穀胺醯水解酶

>gi∣4503986∣ref∣NM_003878.1∣人類γ-穀胺醯水解酶(接合酶、佛里聚γ穀胺醯基水解酶)(GGH),mRNA∣qPCR前進_引子與[531..547]相配∣qPCR逆向_引子與[611..587]相配∣qPCR探針與[549..577]相配

富含亮胺酸脯胺酸之蛋白多糖1

>gi∣21361917∣ref∣NM_022356.2∣人類富含亮胺酸脯胺酸之蛋白多糖(蕾普肯)，(LEPRE1),mRNA∣qPCR前進_引子與[813..836]相配∣qPCR逆向_引子與[894..872]相配∣qPCR探針與[841..870]相配

半胱胺酸蛋白酶抑制劑S

>gi∣19882254∣ref∣NM_001899.2∣人類半胱胺酸蛋白酶抑制劑S(CST4),mRNA∣qPCR前進_引子與[343..361]相配∣qPCR逆向_引子與[434..411]相配∣qPCR探針與[382..410]相配

分泌性捲曲相關蛋白質4

>gi∣8400733∣ref∣NM_003014.2∣人類分泌性捲曲相關蛋白質4(SFRP4),mRNA∣qPCR在前後文中要求時測定與[1079..1103]相配

阿斯波雲

>gi∣41350213∣ref∣NM_017680.3∣人類阿斯波雲(LRR類型)(ASPN),mRNA∣qPCR前進_引子與[798..823]相配∣qPCR逆向_引子與[934..912]相配∣qPCR探針與[842..875]相配

具有EF手功能部位1的細胞生長調節劑

>gi∣33589823∣ref∣NM_006569.2∣人類具有EF手功能部位1的細胞生長調節劑(CGREF1),mRNA∣qPCR前進_引子與[378..394]相配∣qPCR逆向_引子與[455..431]相配∣qPCR探針與[396..415]相配

激肽釋放酶10，轉錄變體1

>gi∣22208981∣ref∣NM_002776.3∣人類激肽釋放酶10(KLK10)，轉錄變體1,mRNA∣qPCR前進_引子與[851..874]相配∣qPCR逆向_引子與[950..931]相配∣qPCR探針與[890..914]相配

激肽釋放酶10，轉錄變體2

>gi∣22208983∣ref∣NM_145888.1∣人類激肽釋放酶10(KLK10)，轉錄變體2,mRNA∣qPCR前進_引子與[714..737]相配∣qPCR逆向_引子與[813..794]相配∣qPCR探針與[753..777]相配

金屬蛋白酶1之組織抑制劑

>gi∣4507508∣ref∣NM_003254.1∣人類金屬蛋白酶1之組織抑制劑(紅血球系增效活性，膠原蛋白酶抑制劑)(TIMP1),mRNA∣qPCR前進_引子與[221..241]相配∣qPCR逆向_引子與[359..340]相配∣qPCR探針與[251..283]相配

AGGGGCCTTAGCGTGCCGCATCGCCGAGATCCAGCGCCCAGAGAG

分泌性蛋白質，酸性的，富含半胱胺酸

>gi∣48675809∣ref∣NM_003118.2∣人類分泌性蛋白質，酸性的，富含半胱胺酸(骨黏連蛋白)(SPARC),mRNA∣qPCR前進_引子與[788..810]相配∣qPCR逆向_引子與[915..898]相配∣qPCR探針與[818..839]相配

轉化生長因子，β-誘導的

>gi∣4507466∣ref∣NM_000358.1∣人類轉化生長因子，β-誘導的，68kDa(TGFBI),mRNA∣qPCR在前後文中在要求時測定與[170..194]相配

含EGF之類-菲布林細胞外基質蛋白質2

>gi∣8393298∣ref∣NM_016938.1∣人類含EGF之類-菲布林細胞外基質蛋白質2(EFEMP2),mRNA∣qPCR在前後文中在要求時測定與[1248..1272]相配

魯米肯

>gi∣21359858∣ref∣NM_002345.2∣人類魯米肯(LUM),mRNA∣qPCR前進_引子與[61..84]相配∣qPCR逆向_引子與[182..162]相配∣qPCR探針與[117..152]相配

斯特寧

>gi∣29893560∣ref∣NM_003498.3∣人類斯特寧(SNN),mRNA

分泌性磷蛋白1

>gi∣38146097∣ref∣NM_000582.2∣人類分泌性磷蛋白1(造骨蛋白，骨唾液酸蛋白質I，早期T-淋巴細胞激活1)(SPP1),mRNA∣qPCR在前後文中在要求時測定與[253..277]相配

硫酸軟骨素蛋白多糖2

>gi∣21361115∣ref∣NM_004385.2∣人類硫酸軟骨素蛋白多糖2(福西肯)(CSPG2),mRNA∣qPCR前進_引子與[10087..10106]相配∣qPCR逆向_引子與[10185..10163]相配∣qPCR探針與[10139..10161]相配

N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶1

>gi∣30089929∣ref∣NM_004315.2∣人類N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶(酸性神經醯胺酶)1(ASAH1)，轉錄變體2,mRNA∣qPCR前進_引子與[1212..1228]相配∣qPCR逆向_引子與[1290..1266]相配∣qPCR探針與[1233..1260]相配

N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶1轉錄變體1

>gi∣30089927∣ref∣NM_177924.1∣人類N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶(酸性神經醯胺酶)1(ASAH1)，轉錄變體2,mRNA∣qPCR前進_引子與[1050..1066]相配∣qPCR逆向_引子與[1128..1104]相配∣qPCR探針與[1071..1098]相配

GTGCCAGTCAGCAGTCATGCA　序列第87號

蛋白酶，絲胺酸11

>gi∣21327712∣ref∣NM_002775.2∣人類蛋白酶，絲胺酸11(IGF結合)(PRSS11),mRNA∣qPCR前進_引子與[1030..1048]相配∣qPCR逆向_引子與[1106..1083]相配∣qPCR探針與[1080..1050]相配

分泌性捲曲-相關蛋白質2

>gi∣42656988∣ref∣XM_050625.4∣人類分泌性捲曲-相關蛋白質2(SFRP2),mRNA∣qPCR前進_引子與[686..703]相配∣qPCR逆向_引子與[750..728]相配∣qPCR探針與[705..726]相配

磷脂酶A2，XIIB群

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斯旁汀2，細胞外基質蛋白質

>gi|6912681|ref|NM_012445.1|人類斯旁汀2，細胞外基質蛋白質(SPON2),mRNA

嗅托美定1，轉錄變體3

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含有1之血小板反應蛋白重複段

>gi∣38016903∣ref∣NM_019032.2∣人類含有1之血小板反應蛋白重複段(TSRC1),mRNA

人類血小板反應蛋白2

>gi∣40317627∣ref∣NM_003247.2∣人類人類血小板反應蛋白2(THBS2),mRNA∣qPCR前進_引子與[3558..3580]相配∣qPCR逆向_引子與[3682..3655]相配∣qPCR探針與[3597..3623]相配

阿德利肯

>gi∣18390318∣ref∣NM_0015419.1∣人類阿德利肯(DKFZp564I1922),mRNA∣qPCR在前後文中在要求時測定與[694..718]相配

半胱胺酸蛋白酶抑制劑SA

>gi∣19882252∣ref∣NM_001322.2∣人類半胱胺酸蛋白酶抑制劑SA(CST2),mRNA∣qPCR前進_引子與[302..320]相配∣qPCR逆向_引子與[393..370]相配∣qPCR探針與[341..369]相配

半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN

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離胺醯氧化酶-類酵素2

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甲狀腺球蛋白

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轉化生長因子，β1

>gi|10863872|ref|NM_000660.1|人類轉化生長因子，β1(凱莫瑞提(Camurati-Engelmann)症)(TGFB1),mRNA|qPCR前進_引子與[1651..1668]相配|qPCR逆向_引子與[1539..1557]相配|qPCR探針與[1687..1713]相配

絲胺酸蛋白酶抑制劑，位階H，成員1

>gi∣32454740∣ref∣NM_001235.2∣人類絲胺酸(或半胱胺酸)蛋白酶抑制劑，位階H(熱休克蛋白質47)，成員1，(膠原蛋白結合蛋白質1)(SERPINH1),mRNA∣qPCR在前後文中在要求時測定與[184..208]相配

絲胺酸蛋白酶抑制劑，位階B，成員5

>gi∣4505788∣ref∣NM_002639.1∣人類絲胺酸(或半胱胺酸)蛋白酶抑制劑，位階B(卵清蛋白)，成員5(SERPINB5),mRNA∣qPCR前進_引子與[36..56]相配∣qPCR逆向_引子與[106..86]相配∣qPCR探針與[60..80]相配

癌胚抗原-相關之細胞黏連分子5

>gi∣11386170∣ref∣NM_004363.1∣人類癌胚抗原-相關之細胞黏連分子5(CEACAM5)，mRNA∣qPCR在前後文中在要求時測定與[2128..2152]相配

基質金屬蛋白酶2

>gi∣11342665∣ref∣NM_004530.1∣人類基質金屬蛋白酶2(明膠酶A，72kDa明膠酶，72kDa第Ⅳ型膠原蛋白酶)(MMP2)，mRNA∣qPCR前進_引子與[1713..1732]相配∣qPCR逆向_引子與[1793..1775]相配∣qPCR探針與[1751..1773]相配

蛋白原轉變酶枯草桿菌蛋白酶/凱欣第5型

>gi∣20336245∣ref∣NM_006200.2∣人類蛋白原轉變酶枯草桿菌蛋白酶/凱欣第5型(PCSK5),mRNA∣qPCR前進_引子與[2677..2697]相配∣qPCR逆向_引子與[2821..2801]相配∣qPCR探針與[2737..2765]相配

羧肽酶N，多肽2，83kD

>gi∣18554966∣ref∣XM_087358.1∣人類羧肽酶N，多肽2，83kD(CPN2)，mRNA

透明質酸和蛋白多糖連接蛋白質4

>gi∣30794471∣ref∣NM_023002.1∣人類透明質酸和蛋白多糖連接蛋白質4(HAPLN4),mRNA

免疫組織化學

從組織塊中切下8uM冷凍切片，並放在APES載片上。在風乾之前，在丙酮中固定組織10分鐘。然後將載片浸泡在0.3%在甲醇中之過氧化氫中10分鐘，並以磷酸-緩衝之生理鹽水(PBS)沖洗。藉著在20%得自適當動物之血清中培養載片，並再度以PBS沖洗，阻斷非-專一的結合位置。然後將以含有1%血清之PBS稀釋的初級抗體加至載片上。在培養1小時之後，再度以PBS沖洗載片，然後再與二級抗體一起培養1小時。在最後以PBS沖洗之後，利用溶解於Tris緩衝生理鹽水(TBS)中之二胺基聯苯胺四鹽酸鹽檢測二級抗體，然後再以TBS和水沖洗。然後以蘇木素對載片計數染色，並在光學顯微鏡下檢查。

在某些具體實施例中，可使用以本發明之癌症標識物為基礎的染色，就地將胃腫瘤局部化。至少一個標識物可形成澱粉樣蛋白結構，可使用剛果(Congo)紅或相等的非-專一澱粉樣蛋白染色使其顯色。

在體液中測試胃癌標識物

在數個具體實施例中，可能想要對獲自血液、血漿、血清、使用例如腹膜沖洗所獲得之腹膜液的試樣，或其他體液，如尿、淋巴、腦脊髓液、胃液或糞便試樣，進行GTM測定。

通常，在這些流體中測定寡核苷酸、蛋白質和肽的方法，為此項技藝中已知的。可使用雜交法，如北方墨點法、南方墨點法，或微陣列法或qPCR，進行寡核苷酸的檢測。檢測蛋白質的方法包括如酵素連結免疫吸附測定(ELISA)、有抗體的蛋白質晶片、懸浮小珠放射性免疫測定(RIA)、西方墨點法和外源凝集素結合。然而，為了解釋，可使用三明治-類型的酵素連結免疫吸附測定(ELISA)來定量GTM的流體含量。至於血漿測定，將5微升等分的適當稀釋之試樣或連續稀釋的標準GTM，與75微升過氧化酶-共軛之抗-人類GTM抗體加至微量滴定盤的孔中。在30℃下培養30分鐘之後，以0.05%在磷酸緩衝之生理鹽水(PBS)中的吐溫20沖洗各孔，以便移除未結合的抗體。然後在30℃下，將GTM和抗-GTM抗體的結合複合物與含有H₂O₂的鄰-苯二胺一起培養15分鐘。藉著加入1MH₂SO₄中止該反應，並利用微量滴定盤讀取器測量在492毫微米處的吸光度。

可了解該抗-GTM抗體可以是單株抗體或多株抗血清。亦可了解可適當地研究任何其他的體液。

某些出現在血漿或血清中的標識物是已知的。這些包括造骨蛋白(Hotte等人,Cancer 95(3):507-510(2002))、前列腺-專一之抗原(Martin等人，Prostate Cancer Prostatic Dis.(2004年3月9日)(公開案編號PMID：15007379)、甲狀腺球蛋白(Ha11等人，Laryngoscope 113(1):77-81(2003)；Mazzaferri等人，J. Clin. Endocrinol. Metab. 88(4):1433-14421(2003))、基質金屬蛋白酶-2和-9(Kuo等人，Clin. Chem. Acta. 294(1-2):157-168(2000))、CEA和TIMP1(Pellegrini等人，Cancer Immunol. Immunother. 49(7):388-394(2000))。因此，因為一些以上的標識物亦是有用的GTM標識物，故關於其檢測和定量，已經可利用血漿、血清或其他流體測定。因為許多蛋白質是(1)由細胞分泌，(2)從細胞膜脫落，或(3)當細胞死亡時從細胞中流失，故其他GTM亦可出現在體液，如血漿、血清及其類似物中。因此，在本發明的具體實施例中，在便利獲得的試樣中檢測GTM，將是有用且希望的，並可能是診斷胃癌的基礎。

西方分析

使用TriReagent和胍HCl萃取法，從胃組織中萃取蛋白質。將得自RNA之TriReagent萃取的非-液相與1.5倍體積的乙醇混合，並離心移除DNA和OCT介質。將0.5毫升的上清液與0.75毫升異丙醇混合，在室溫下陪養10分鐘，然後離心。以1毫升0.3M在95%乙醇中之胍HCl沖洗小球3次，並單獨以乙醇沖洗一次，然後再懸浮於50微升1% SDS中。

使用標準方法，在SDS聚丙烯醯胺凝膠上定量並電泳蛋白質。簡言之，使用標準方法學，使用BioRad反-墨點電泳轉移細胞，將分離過的蛋白質移至PVDF膜上。然後利用含有脫脂奶粉的溶液阻斷該膜30分鐘，隨後在室溫下與初級抗體一起培養2小時。在沖洗之後，在室溫下將該膜與二級抗體一起培養1小時。在最後的沖洗之後，使用ECL檢測系統(Amersham Biosciences)使已經結合的抗體顯色。

藉著使用已知方法提供血清試樣，然後使該血清試樣接受分析，使用直接對抗感興趣之蛋白質的寡核苷酸探針或抗體，完成在血清中之標識物的檢測。免疫墨點法，包括西方墨點分析，可能對判定另行表現之蛋白質是否出現在血清中是特別有用的。此外，其他體液亦可含有標識物，並包括腹膜液、腦脊髓液及其類似物。對於被分泌的標識物，在生理學意義中，不必是有用的。更確切地說，任何標識物蛋白質或基因藉以進入血清的機制，在產生可檢測、可定量含量之標識物上，都可能是有效的。因此，可溶性蛋白質從細胞中的正常分泌、膜蛋白質從漿膜中脫落、mRNA或從其中表現之蛋白質的另類接合形式的分泌、細胞死亡(細胞凋零)，均可產生足量的有用標識物。對於使用血清標識物做為診斷及/或評估對各種癌症類型之治療效力的工具，有逐漸增加的支持。

Yoshikawa等人(Cancer Letters,151:81-86(2000))，描述在患有胃癌之患者的血漿中，基質金屬蛋白酶-1的組織抑制劑。

Rudland等人(Cancer Research 62:3417-3427(2002))描述造骨蛋白在人類乳癌中做為與轉移有關之蛋白質。

Buckhaults等人(Cancer Research 61:6996-7001(2002))描述某些在結直腸腫瘤中表現的分泌性和細胞表面基因。

Kim等人(JAMA 287(13):1671-1679(2002))描述造骨蛋白做為卵巢癌可能的診斷生物標識物。

Hotte等人(AJ. American Cancer Society 95(3):507-512(2002))描述血漿造骨蛋白成為在人類體液中可檢測的蛋白質，並與某些惡性有關。

Martin等人(Prostate Cancer Prostatic Dis. 2004年3月9日(PMID:15007379)(摘要))描述使用人類激肽釋放酶2、前列腺-專一之抗原(PSA)和自由PSA做為檢測前列腺癌的標識物。

Hall等人(Laryngoscope 113(1):77-81(2003)(PMID:12679418)(摘要))描述血清甲狀腺球蛋白在甲狀腺癌中的預測價值。

Mazzaferri等人(J. Clin. Endocrinol. Metab. 88(4):1433-1441(2003)(摘要))描述甲狀腺球蛋白可做為患有甲狀腺癌之患者的可能監視方法。

Whitley等人(Clin. Lab. Med. 24(1):29-47(2004)(摘要))描述甲狀腺球蛋白做為甲狀腺癌的血清標識物。

Kuo等人(Clin. Chim. Acta. 294(1-2):157-168(2000)(摘要))描述在感染HCF和HBV之患者中的血清基質金屬蛋白酶-2和-9。

Koopman等人(Cancer Epidemiol. Biomarkers PreV 13(3):487-491(2004)(摘要))描述造骨蛋白做為胰腺癌之生物標識物。

Pellegrini等人(Cancer Immunol. Immunother. 49(7):388-394(2000)(摘要))描述可溶性癌胚抗原和TIMP1的測量，做為原位結直腸癌的標識物。

因此，我們已經確認許多可用來發展檢測及評估胃癌之試劑、裝置和套組的基因及/或蛋白質。可單獨或混合使用一或多個胃的標識物，提供可靠的胃癌之分子測試。

實例

在本文中描述的實例僅為了解釋本發明之具體實施例。其他的具體實施例、方法和分析類型均在熟諳分子診斷技藝者的技術範圍內，不必在本文中詳細說明。將在此項技藝範圍內的其他具體實施例，視為本發明的一部分。

實例1：確認胃惡性的標識物

圖2敘述顯示使用利用以上基準選出之38種胃惡性的標識物進行研究之結果的表。圖2包括基因的符號("符號")、MWG寡編號、NCBI mRNA參考序列編號、蛋白質參考序列編號、在腫瘤與非-腫瘤基因表現之間的倍數變化、相對於在微陣列分析中其他基因的倍數變化等級、原始未經調整之Student's t-檢定的結果、Bonferroni-調整之p值的結果，以及2-試樣Wilcoxon檢定的結果。

這34個基因之中間倍數變化(腫瘤：非惡性組織)範圍從1.6到7，且在倍數變化等級上的中間變化範圍從-16,995到-25,783。在倍數變化等級中的最大可能變化是-29,718。對每個所示的標識物而言，發現它們做為癌症標識物之專一性的統計顯著性是極高的。Bonferroni-調整之p值，通常均低於10^-6或更低，表示使用這些標識物的診斷是與胃癌極有關聯的。

三個半胱胺酸蛋白酶抑制劑(CST1、CST2和CST4)是高度同種的，且除非另行陳述，在陣列上藉著相同的寡核苷酸表示，並集體地稱為"CST1,2,4"

使用SMART套裝軟體(歐洲分子生物實驗室(European Molecular Biology Laboratory))，預測在圖2中敘述的所有蛋白質均具有信號肽。已知信號肽是使合成蛋白質瞄準細胞外隔間，並因此可被分泌至組織間隙液內，它們可從那裡接近血液。事實上，已經在血清中檢測到本發明的一些蛋白質。

在圖2中敘述的每個基因，均在與CEA一致的陣列上，在強度等級上顯示出超過兩個寡核苷酸的變化，CEA是在監視胃癌進行之臨床實行上最常使用的標識物。

實例2：qPCR分析

使用qPCR，對在圖3中出示之基因的亞組，獲得基因表現較敏感和較精確的定量。針對藉著微陣列分析確認的23個基因(圖2)，分析得自46個腫瘤和49個非-惡性試樣，並在圖3中出示結果。圖3包括基因符號、在癌症與正常組織之間的中間倍數變化，以及表現程度超過在非-惡性試樣中之表現程度的95%的腫瘤試樣%。從分析中排除12個腫瘤試樣和9個正常試樣，因為高的(>75%)正常細胞污染、高程度的壞死(>40%)，或在微陣列上不良的雜交信號。這23個基因的中間倍數變化(腫瘤組織與中間非-惡性組織表現相比較)，範圍是從3至525倍(圖3)

基因ASPN、CST1,2,4、LOXL2、TIMP1、SPP1、SFRP4、INHBA、THBS2和SPARC的表現程度，有≧90%的案例，在腫瘤中比非-惡性範圍的95%更大(圖3)。至於剩下的基因，在>50%的試樣中，在腫瘤中的表現比95%更大。每個腫瘤過度表現至少7個基因超過95%，表示標識物的組合將引導所有胃腫瘤的廣大範圍。

實例3：使用qPCR確認陣列數據

在腫瘤和非-惡性試樣上利用24個基因的探針，使用定量、即時PCR(qPCR)確認陣列數據。在所有24個進行研究的基因中，有20個在兩種技術之間顯示出強烈的相關性。在圖4a-4d中顯示這些分析物中的4個，其敘述使用陣列和qPCR方法檢測4個被選出之癌症標識物的相對表現的圖表。關於在圖4中的每個圖表，橫軸代表在基因表現中的陣列log2倍數變化，而縱軸代表在基因表現中的qPCR log2倍數變化。我們發現在兩個方法之間有強烈的相關性，以在兩個方法之間的協變關係表示。強烈的相關性代表微陣列倍數變化分析和qPCR是檢測在胃癌標識物基因表現上之變化的適當方法，並因此可用來做為精確、敏感的篩選方法。亦可從圖4a-4d了解，qPCR在檢測表現之變化時可能比陣列法更敏感。因此，在其中特別想要早期檢測的情況下，qPCR可能是特別有用的。

圖5a-5w敘述比較觀察一系列23個基因之每個表現的頻率(縱軸)與在基因表現上之log2倍數變化(橫軸)的直方圖，包括正常組織(空心柱)和腫瘤組織(黑色柱)。我們驚訝地發現這23個基因中的每一個，在正常和腫瘤組織之間，在頻率分布上均相當分開，反映出在頻率分布曲線之間的低程度重疊。例如，圖5b敘述CST1,2,4之結果，其中觀察到僅有一個正常試樣具有在腫瘤範圍中的表現程度。在其他的案例中(例如圖5n；關於PRS11)，每個頻率分布曲線相對上都是較窄的，並有一些程度的重疊。然而，即使是該標識物，中間log2倍數變化仍顯示基因表現的量相當分開。在其他的案例中(例如圖5a；ASPN)，雖然有一些重疊，但在正常和腫瘤試樣之間，中間log2倍數表現仍清楚地分開。

圖6敘述與正常試樣相比較，顯示出在腫瘤試樣中有明顯增加表現("過度表現")之基因的數目(縱軸)，與受試之個別試樣的直方圖。在每個案例中，腫瘤試樣均顯示多個基因有升高的表現程度。具有增加表現之基因的最低數目為7，在試樣E123中找到。這些發現表示，在其中相對於正常組織，過度表現多個基因的情況下，癌症檢測的可靠性可能是極高的，將癌症的診斷弄得更清楚。然而，在一些情況下，單一標識物基因的表現升高，便足以引導癌症的診斷。

我們先前與目前最常用來檢測胃癌的血清標識物，CEA比較，是以在腫瘤與正常試樣之間陣列數據之強度等級上的差異為基礎。使用標識物和CEA的qPCR數據證實該比較。

圖7a-7c敘述與腫瘤標識物CEA之基因的表現相比較，在個別腫瘤試樣和非-惡性試樣中，標識物之相對log2表現(與參考RNA製備相比較)的圖。CEA是目前最常用來監視胃癌之進行的血清標識物。將0點定義為每個標識物的中間標準表現。可看到在腫瘤試樣與正常試樣中CEA基因(CEACAM5)的表現之間有大規模的重疊。該重疊明顯地比在胃癌標識物ASPN、CSPG2、CST1,2,4、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SFRP4、SPARC、SPP1、THBS2、TIMP1、阿德利肯、LEPRE1和EFEMP2中的少。至於在圖7b-7c中的其他標識物，ASAH1、SFRP2、GGH、M MP12、KLK10、TG、PRSS11和TGFBI，在腫瘤表現範圍與非-惡性組織表現範圍之間的重疊，比以上標識物的重疊更大，但仍小於CEA，指出在本文中描述的所有新穎標識物均在定量上勝過CEA，並因此可提供較可靠的診斷。

欲將多變的組織操作之影響減至最少，使用得自腫瘤和衍生自相同患者之非-惡性組織試樣的qPCR數據，計算腫瘤：正常(非-惡性)倍數變化。這類成對分析修正了在不同個體中之基因表現的背景程度上的差異，並將組織操作對RNA品質的影響減至最少。例如，若被切除的胃在室溫下1小時，則得自正常和腫瘤試樣之轉錄本將降解至相同的程度。

圖8概述藉著qPCR判定之標識物的T:N表現程度，但使用得自相同個體的成對數據(即腫瘤和非-惡性試樣)。圖8亦包括未納入圖3之6個基因的表現數據。額外進行研究的基因為MMP2、CGR11、TGFB1、PCSK5、SERPINB5和SERPINH1。在圖1和2中出示確認的資訊及探針。圖8顯示在這40個有"成對"試樣的患者中，29個胃癌標識物的中間T:N倍數變化和最大T:N倍數變化。29個標識物中有27個具有大於或等於先前技藝之標識物，CEA的中間T:N差異。29/29的標識物具有較高百分比的成對試樣，其中在腫瘤試樣中的表現超過在正常試樣中的表現。

圖9a-9d敘述得自腫瘤和來自相同個體之正常組織的數據的點圖。每個點代表在患者中，相對於在非-惡性組織中之表現，在腫瘤組織之標識物表現上的倍數-變化。所有進行研究的標識物均具有比CEA更好的腫瘤與非-腫瘤組織之分辨。三個標識物，CST1,2,4、ASPN和SFRP4，在成對的腫瘤和正常試樣之間，顯示出100%分辨。即對那些標識物而言，每個腫瘤組織均具有比得自相同個體之相對應非-腫瘤試樣更大的表現。在許多其他的標識物中，例如阿德利肯、CSPG2、EFEMP2、IGFBP7、INHBA、LOXL2、LUM、SERPINH1、SPARC、SPP1、TGFbI、THBS2和TIMP1，均只在2或3個個別之處，腫瘤組織表現比非-腫瘤組織的更低。因此，對那些標識物而言，任一對腫瘤和非-腫瘤組織將產生偽陰性的可能性相對上是很低的(例如40個中的3個，或7.5%；40個中的2個或5%，40個中的1個，或2.5%)。因此，即使利用緊接之上文列舉的其他標識物，使用得自個別患者的多個試樣亦將產生可靠的診斷資訊。

在上文中出示這些標識物的基因序列，以及用來檢測它們之引子和探針的位置。

欲判定標識物基因的過度表現是否與胃腫瘤之階段無關，將成對的T:N log2倍數變化對腫瘤階段作圖(圖10a-10ad)。對在圖8中列舉的26個標識物，觀察到表現對於腫瘤階段並沒有階段依賴性。這些標識物在早期和晚期的腫瘤中以類似方式過度表現。然而，KLK10在階段1和階段2的腫瘤中顯示出較一致的過度表現，而PCSK5和SERPINB5在階段4的腫瘤中顯示出較一致的過度表現。因此，可使用KLK10、PCSK5和SERPINB5來判定胃腫瘤的階段。

在類似的測定中，將成對的T:N log2倍數變化對腫瘤的勞倫(Lauren)分類(瀰漫型或腸道型)作圖。圖11a-11ad顯示無論該腫瘤類型是腸道型(I)或瀰漫型(D)，29個GTMs均可辨別腫瘤和非-腫瘤組織。

實例4：多重標識物的使用

如同上述，某些標識物顯示出在100%的試樣中辨別腫瘤與非-腫瘤組織的能力。亦在上文中描述的其他標識物，可組合使用，達成極高程度的腫瘤與非-腫瘤組織的辨別。圖12敘述3種標識物SERPINH1、CST1,2,4和INHBA表現的3-維作圖，對於一系列胃腫瘤試樣和非-惡性胃試樣，以log2 T:N倍數變化表示。在兩組試樣之間有完全的分開。

藉著在圖13中概述的統計分析，進一步解釋使用標識物組合，連續辨別腫瘤和非-腫瘤試樣的可靠性。該分析比較使用得自成對腫瘤和非-惡性試樣之qPCR基因表現產生之數據的標準分布，顯示增加用來辨別腫瘤與非-惡性試樣之標識物數目對測試敏感性(具有95%的固定專一性)的影響。雖然29個標識物中有少數(如在圖8中所示)，當在該分析中單獨使用時，具有超過90、95或99%的敏感性，但二或三個標識物的組合，使大數目之組合能夠達到高敏感性。例如，50個三種標識物的組合將以≧99%之敏感性和≧95%之專一性辨別腫瘤和非-腫瘤試樣。

實例5：檢測胃腫瘤標識物蛋白質

在另外的具體實施例中，可檢測GTM蛋白質做為診斷的基礎。在某些情況下，mRNA在特殊試樣中的濃度，如不含細胞的試樣，可能不易使用微陣列或qPCR法，來檢測在基因表現上的升高。因此，在某些具體實施例中，可使用針對整個蛋白質、蛋白質片段(肽)或蛋白質核心的抗體，完成GTM蛋白質的檢測。檢測及定量蛋白質和肽之表現的方法，為此項技藝中已知的，並可包括依靠對該蛋白質或肽升高之專一抗體的方法。可使用此項技藝中已熟知的方法，製造單株抗體和多株抗血清，且不需要在本文中進一步說明。

欲證實可使用GTM蛋白質來辨別腫瘤與非-腫瘤組織，獲得對抗SPARC(R＆D Systems；目錄第AF941號)、THBS2(Santa Cruz Biotechnology Inc；目錄第sc-7655號)、CSPG2(Calbiochem；目錄第428060號)和IGFBP7(R＆D Systems；目錄第AF1334號)的市售抗體。可在兔子(Alpha Diagnostic International Inc；San Antonio)中升高對抗半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN肽序列50-66(C)FAISEYNKATKDDYYRR，序列第108號的額外多株抗體。

在腫瘤和非-惡性胃組織之免疫組織化學或西方分析中使用這些抗體。這些標識物均在蛋白質層面顯示出強的腫瘤：正常差異。這證實在RNA層面觀察到這些基因的過度表現，亦可發生在蛋白質層面。

圖14顯示使用對抗由SPARC、CST1(半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN)、IGFBP7和THBS2編碼之蛋白質的抗體，從兩對腫瘤和非-惡性組織中萃取之總蛋白質的西方墨點分析。對每個標識物而言，在腫瘤試樣中的信號明顯比在非-惡性試樣中的更高。

對半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN升高的抗體檢測三個主要譜帶，分別與大約34、45和65kDa之分子量相符。在圖14中出示最低的分子量譜帶。蛋白質物種比對照組半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN蛋白質更大，暗示藉著經歷過轉譯後修改或多聚化作用(multimerization)的腫瘤產生該蛋白質。與負責在CST蛋白質之分子量上之差異的機制無關，圖14證實CST表現在非-腫瘤組織中是低的，但在腫瘤-衍生之蛋白質的墨點上很容易觀察。

圖14亦顯示SPARC蛋白質在腫瘤組織中，以比非-腫瘤組織更大的程度實質地表現。SPARC蛋白質具有比該蛋白質在血清中檢測到之形式更慢的凝膠移動性(圖15)，亦代表在由惡性胃細胞產生之蛋白質中發生不同的轉譯後修改。與負責任何這類修改的機制無關，發現相對於非-惡性組織，SPARC在腫瘤組織中過度表現，代表SPARC是有用的蛋白質標識物。類似地，IGFBP7和THBS2亦顯示相對於非-惡性組織，在腫瘤組織中過度表現。

可使用對抗由CSPG2(福西肯)和CST1(半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN)編碼之蛋白質的抗體，進行腫瘤和非-惡性組織的免疫組織化學分析。利用對抗福西肯之抗體的組織之免疫組織化學分析，確認在腫瘤組織，但不是非-惡性組織之細胞外基質中的強染色。利用抗-半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN抗體，在腫瘤細胞外側周圍的地方觀察到強染色。在非-惡性細胞中，利用該抗體的染色很弱，並僅在組織之黏膜表面和胃小凹的襯裡觀察到。這證實在非-惡性細胞中，指揮半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN蛋白質到細胞外的黏膜表面上，而不進入細胞外的空間。因此，不僅在腫瘤組織中以比非-惡性組織更高的量產生半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN蛋白質，且不像由非-惡性組織產生的蛋白質，腫瘤的半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN是直接與組織脈管系統接觸。欲擴展這些觀察，利用單株抗體(R＆D Systems；目錄第MAB1285號)，從胃癌細胞株AGS之上清液中將半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN免疫沉澱(圖16)。在上清液中檢測到大量的半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN，證實由胃上皮細胞產生並從其中分泌該蛋白質。

實例6：在血清中分析腫瘤標識物

至於可用來迅速篩選的標識物，希望該標識物以足夠檢測的量出現在血清中。在圖8中描述的某些蛋白質，可以可檢測的程度，從胃癌中被分泌到血液中。一個已知以可檢測之程度，從胃腫瘤中被分泌至血液內的標識物是TIMP1。然而，若一蛋白質被分泌或從黏膜表面以外的任何細胞表面脫落，則其將與組織間液接觸。它可能從那裡經由毛細血管或經由淋巴系統，直接進入血液供應中。因此，任何脫落之GTM皆會存在於血液中。先前已經描述了造骨蛋白、甲狀腺球蛋白，以及MMP和激肽釋放酶家族的成員，在患有上皮癌而非胃癌之患者的血清中升高。然而，先前已經觀察到TIMP1在胃癌患者的血清中升高。這些發現暗示在本研究中的選擇基準，即在腫瘤組織但不是非-惡性組織中分泌性蛋白質的過度表現，可有效地用來檢測在血清中的標識物，並因此可能具有實質的臨床用途，不需要組織或器官生檢。

從圖15中，顯然血清SPARC具有不同的分子量(這裡在西方墨點法中敘述)，其中腫瘤SPARC具有比由血液細胞產生之SPARC更低的分子量。因此，即使由腫瘤和非-腫瘤血液細胞產生的SPARC，亦可使用如使用西方分析或利用對由腫瘤細胞產生之糖基化蛋白質專一的抗體判定之分子尺寸，來判定腫瘤SPARC的存在。

在其他的研究中，我們檢測在胃癌細胞株AGS之上清液中的半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN。圖16敘述僅有培養基或得自培養AGS細胞之上清液的西方分析。圖16右邊的譜帶跑道顯示濃密的譜帶，與半胱胺酸蛋白酶抑制劑SN一致。

因此，我們由圖10作出結論，本發明之GTM適合在疾病進行的早、中或晚期，用來診斷胃癌。

雖然某些標識物蛋白質可被糖基化，但在某些狀況下，在糖基化模式上的變化，可導致缺乏普通糖基化模式之GTMs形式的錯誤-檢測。因此，在本發明的某些具體實施例中，GTM免疫原可包括脫糖基化的GTM或脫糖基化的GTM片段。可使用一或多個此項技藝中已知的配糖酶，完成脫糖基化作用。或者，可在糖基化作用-缺陷細胞株中表現GTM cDNA，如原核生物細胞株，包括大腸桿菌，藉此產生無-糖基化的蛋白質或肽。亦可了解糖基化作用的程度和品質可能對糖側鏈之必要前驅物的存在是很敏感的。因此，在缺乏必要的糖時，可能不發生"正常的"糖基化作用，但可能形成較短或失蹤的側鏈糖。可使用這類"糖基化作用變體"做為免疫原，產生對標識物基因之不同類型專一的抗體。

此外，某些GTMs可形成同種-或異種二聚體，或其他類型的多聚形式。例如，抑制素βA是47kDa的蛋白質，其可形成97kDa分子量的同種二聚體(激活素A)和92kDa的異種二聚體，其帶有45kDa之蛋白質抑制素βB(將該異種二聚體稱為激活素AB)。因此，可了解西方分析或其他類型的測定，其提供之分子量不必僅限於檢測GTM的單體形式。更確切地說，可迅速了解可檢測任何形式的GTM，與分子量無關。因此，可輕易地使用多聚形式之GTM的檢測，來診斷胃癌的存在。此外，對於那些對胃腫瘤之階段(1-4)或類型(瀰漫型或腸道型)有選擇性的GTM而言，多聚形式的檢測可提供評估胃癌之階段或類型的適當標靶。

一旦產生對抗GTM的抗體或抗血清，便可以各種方式使用這類抗體製備物。首先，可使用酵素-連結免疫吸附測定(ELISA)或放射性免疫測定(RIA)法來定量GTM蛋白質或肽。可使用免疫組織化學法在組織中完成免疫檢測。這些方法均為此項技藝中已知的，不必在本文中進一步說明。

實例7：含有GTM寡核苷酸的載體

本發明的其他具體實施例包括可在活體外用來表現標識物基因或其蛋白質("標識物肽")或標識物基因產物之片段的載體。例如，可製造其中具有編碼GTMs之寡核苷酸的載體。許多這類載體可以此項技藝中已知的標準載體為基礎。本發明亦包括可用來轉移感染各種細胞株，製備產生GTM之細胞株的載體，其可用來產製想要含量的GTMs，以便發展檢測GTMs的專一抗體或其他試劑，或用來標準化對GTMs發展的測定。

應了解製造這類載體，將含有編碼欲表現之蛋白質的一部分之完整開放編閱架構或這類開放編閱架構的一部分的寡核苷酸插入載體內，該載體含有啟動基因區、一或多個促進子區，其以可操作之方式與該寡核苷酸序列連接，還有起始密碼子、開放編閱架構和中止密碼子。產生表現載體的方法為此項技藝中已知的，且不必在本文中重複。

亦可了解可將一或多個可選擇標識物插入表現載體內，容許選擇含有感興趣之表現載體的細胞株的擴大。此外，亦可在架構中插入此項技藝中已知的前導序列，以便在表現細胞中指揮蛋白質或蛋白質片段的分泌、內部儲存或插入膜內。

實例8：以含有GTM之載體轉移感染的細胞

在另外的具體實施例中，提供可表現GTMs、GTM片段或肽標識物的細胞。可使用原核生物和真核生物細胞。例如，可使用大腸桿菌(原核生物細胞)來產生大量的GTMs，其缺乏成熟的糖基化作用(若特定的GTM正常是經糖基化的)。可使用COS細胞、293細胞和各種其他的真核生物細胞，產生經過糖基化的GTMs，或有適當的摺疊，並因此GTM蛋白質之天然形式的三維結構。轉移感染這類細胞的方法為此項技藝中已知的，且不必在本文中進一步描述。

實例9：套組

以本發明的發現為基礎，可產生數類的測試套組。首先，可製造具有預先裝載檢測分子(或"捕捉試劑")之檢測裝置的套組。在檢測GTM mRNA的具體實施例中，這類裝置可包括受質(例如玻璃、矽、石英、金屬等等)，在其上有做為捕捉試劑，並可與欲檢測之mRNA雜交的寡核苷酸。在一些具體實施例中，可藉著使mRNA(以cy3、cy5、放射性標識物或其他標識物標示)與在受質上之寡核苷酸雜交，完成mRNA的直接檢測。在其他的具體實施例中，可藉著先製造想要mRNA的互補DNA(cDNA)，完成mRNA的檢測。然後，可使經過標示之cDNA與在受質上的寡核苷酸雜交，並檢測之。

與所使用之檢測方法無關，想要比較受試GTM表現與表現的標準測量。例如，可對總細胞DNA、對在組成上表現之RNAs(例如核糖體RNA)或對其他相關不變的標識物進行RNA表現的標準化。

亦可在套組中使用抗體做為捕捉試劑。在一些具體實施例中，受質(例如多孔培養盤)可具有與其附接的專一GTM捕捉試劑。在一些具體實施例中，套組可具有阻斷試劑。可使用阻斷試劑降低非-專一之結合。例如，可使用得自任何不含GTM寡核苷酸之便利來源的過量DNA，如鮭精DNA，降低非-專一的寡核苷酸結合。可使用過量的阻斷蛋白質，如血清白蛋白，降低非-專一的抗體結合。可了解許多檢測寡核苷酸和蛋白質的方法為此項技藝中已知的，並可使用可專一地檢測GTM結合分子的任何策略，並認為在本發明的範圍內。

在依賴抗體檢測的具體實施例中，可按每個細胞，或以總細胞、組織或流體蛋白質、流體體積、組織質量(重量)為基礎，來表示GTM蛋白質或肽。此外，可以相對上較高富含量之血清蛋白質，如白蛋白為基礎，表示在血清中之GTM。

除了受質之外，測試套組可包括捕捉試劑(如探針)、沖洗溶液(如SSC、其他鹽類、緩衝溶液、去垢劑及其類似物)，以及檢測部分(如cy3、cy5、放射性標識物及其類似物)。套組亦可包括使用說明書和包裝。

雖然參考其特定的具體實施例來說明本發明，但可了解其他的具體實施例涉及可使用所揭示之標識物，不違背本發明之範圍的用途。

工業利用性

檢測GTM家族成員的方法，包括使用微陣列及/或即時PCR法檢測核酸，並檢測蛋白質和肽。本發明之組合物和方法可用來製造診斷裝置和套組、診斷疾病、評估治療的效力，以及產製適合用來測量GTM家族成員在生物試樣鐘之表現的試劑。

參考其特定的具體實施例，並參考圖式來描述本發明，其中：

圖1敘述本發明之胃癌標識物和標識物之寡核苷酸序列的表。

圖2敘述使用微陣列方法進行研究所獲得之結果的表。

圖3敘述使用定量PCR進行研究所獲得之結果的表。

圖4a-4d敘述在使用微陣列和qPCR方法所獲得的log2倍數結果之間的關係，其中該數據集中在四個胃癌標識物的中間常態。灰色正方形相當於非-惡性("正常")試樣，而黑色三角形為腫瘤試樣。圖4a：ASPN。圖4b：SPP1。圖4c：SPARC。圖4d：MMP12。

圖5a-5w敘述顯示相對頻率對獲自各種腫瘤標識物的定量PCR研究之log2倍數變化數據的直方圖。圖5a：ASPN；圖5b：CST1,2＆4；圖5c：CSPG2；圖5d：IGFBP7；圖5e：INHBA；圖5f：LOXL2；圖5g：LUM；圖5h：SFRP4；圖5i：SPARC；圖5j：SPP1；圖5k：THBS2；圖5l：TIMP1；圖5m：阿德利肯(adlican)；圖5n：PRS11；圖5o：ASAH1；圖5p：SFRP2；圖5q：GGH；圖5r：MMP12；圖5s：KLK10；圖5t：LEPRE1；圖5u：TG；圖5v：EFEMP2和圖5w：TGFBI。

圖6為顯示具有比中間常態表現的95%更高表現之標識物的號碼的直方圖。結果以qPCR數據為基礎，並分別顯示每個腫瘤試樣的結果。

圖7a-7c敘述顯示與腫瘤標識物CEA之基因表現相比較，在個別腫瘤試樣和非-惡性試樣中，標識物之相對log2表現的圖表。CEA是目前最常用來監視胃癌進行的血清標識物。

圖8顯示補充圖3的表。圖8概述由qPCR判定候選的腫瘤標識物之表現程度，但使用成對的數據(即得自相同個體之腫瘤("T")和非-腫瘤("N")試樣)，提供T:N比例。圖8亦包括圖3以外的標識物，即MMP2、CGR11、TGFB1、PCSK5、SERPIMB5、SERPINH1。至於比較，亦顯示已確立之血清標識物基因CEACAM5(CEA)的表現程度。29個標識物中有27個具有大於或等於CEA的中間T:N差異。此外，與CEA相比較，29/29的標識物具有較高的成對試樣百分比，其中在腫瘤試樣中的表現超過在正常試樣中的表現。三個標識物，CST1,2,44、ASPN和SFRP4在成對的腫瘤與正常試樣之間，顯示出100%的區別。在本文中出示這些標識物的基因序列，以及與來檢測它們的引子和探針位置。

圖9a-9d敘述在40個患者中，利用成對試樣之29個胃癌標識物之個別的和中間的T:N倍數變化數據。

圖10a-10ad敘述在CEA和本發明之其他GTM的表現上，腫瘤階段和log2倍數變化的圖解。圖10a：阿德利肯；圖10b：ASPN；圖10c：CSPG2；圖10d：CST1,2,4；圖10e：EFEMP2；圖10f：GGF；圖10g：INHBA；圖10h：IGFBP7；圖10i：KLK10；圖10j：LEPRE1；圖10k：LUM；圖10l：LOXL2；圖10m：MMP12；圖10n：TIMP1；圖10o：ASAH1；圖10p：SPP1；圖10q：SFRP2；圖10r：SFRP4；圖10s：SPARC；圖10t：PRSS11；圖10u：THBS2；圖10v：TG；圖10w：TGFBI；圖10x：CGR11；圖10y：SERPINH1；圖10z：MMP2；圖10aa：PCSK5；圖10ab：SERPINB5；圖10ac：TGFB1和圖10ad：CEA(CEACAM5)。

圖11a-11ad敘述在表現本發明的29個GTM和CEA時，腫瘤類型(瀰漫性(D)或腸道的(I))和log2倍數變化的圖解。圖11a：阿德利肯；圖11b：ASPN；圖11c：CSPG2；圖11d：CST1,2,4；圖11e：EFEMP2；圖11f：GGH；圖11g：INHBA；圖11h：IGFBP7；圖11i：KLK10；圖11j：LEPRE1；圖11k：LUM；圖111：LOXL2；圖11m：MMP12；圖11n：TIMP1；圖11o：ASAH1；圖11p：SPP1；圖11q：SFRP2；圖11r：SFRP4；圖11s：SPARC；圖11t：PRSS11；圖11u：THBS2；圖11v：TG；圖11w：TGFBI；圖11x：CGR11；圖11y：SERPINH1；圖11z：MMP2；圖11aa：PCSK5；圖11ab：SERPINB5；圖11ac：TGFB1和圖11ad：CEA(CEACAM5)。

圖12敘述在一系列胃腫瘤試樣和非-惡性胃試樣中，顯示3個標識物SERPINH1、CST1,2,4和INHBA的三維圖解。

圖13敘述顯示多個標識物對精確辨別腫瘤組織和非-惡性組織的能力之影響的表。該表係衍生自從qPCR數據推衍來的常態分布。

圖14為衍生自腫瘤和非-腫瘤組織之4個腫瘤標識物的西方墨點。

圖15為在胃腫瘤組織和在血清中，腫瘤標識物SPARC的西方墨點。

圖16為在胃細胞株AGS之上清液中，描繪半胱胺酸蛋白酶抑制劑(cystatin)SN的免疫墨點。

(無元件符號說明)

Claims (14)

1. 一種檢測胃癌的方法，：(a)提供生物試樣；並(b)在該試樣中檢測胃腫瘤標識物(GTM)家族成員的過度表現，特徵為該GTM家族成員係絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑，位階H("SERPINH1")。
2. 如請求項1之方法，其包括下列進一步之步驟：將在該受試試樣中出現之GTM的含量，與獲自未患有胃癌之個體的對照組試樣的值相比較。
3. 如請求項1之方法，包括檢測至少一個選自由下列所組成之群之其他GTM家族成員的過度表現：羧肽酶N，多肽2，83kDa鏈(CPN2)、基質金屬蛋白酶12(MMP12)、抑制素("INHBA")、類胰島素生長因子7("IGFBP7")、γ-穀胺醯水解酶("GGH")、富含亮胺酸脯胺酸之蛋白多糖("LEPRE1")、半胱胺酸蛋白酶抑制劑S("CST4")、分泌性捲曲相關蛋白質4("SFRP4")、阿斯波雲("ASPN")、具有EF手功能部位1的細胞生長調節劑("CGREF1")、激肽釋放酶10("KLK10")、金屬蛋白酶1之組織抑制劑("TIMP1")、分泌性酸性的富含半胱胺酸之蛋白質("SPARC")、轉化生長因子，β-誘導的("TGFBI")、含EGF之類-菲布林細胞外基質蛋白質2("EFEMP2")、魯米肯("LUM")、斯特寧("SNN")、分泌性磷蛋白1("SPP1")、硫酸軟骨素蛋白多糖2("CSPG2")、N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶("ASAH1")、絲胺酸蛋白酶11("PRSS11")、分泌性 捲曲-相關蛋白質2("SFRP2")、磷脂酶A2，XIIB群("PLA2G12B")、斯旁汀2，細胞外基質蛋白質("SPON2")、嗅托美定1("OLFM1")、含有1之血小板反應蛋白重複段("TSRC1")、血小板反應蛋白2("THBS2")、阿德利肯、半胱胺酸蛋白酶抑制劑SA("CST2")、離胺醯氧化酶-類酵素2("LOXL2")、甲狀腺球蛋白("TG")、轉化生長因子β1("TGFB1")、絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑，位階B("SERPINB5")、基質金屬蛋白酶2("MMP2")、蛋白原轉變酶枯草桿菌蛋白酶/凱欣第5型("PCSK5")和透明質酸糖蛋白連接蛋白質4("HAPLN4")。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，特徵為藉著檢測GTM mRNA、cDNA的過度表現或使用與該GTM cDNA之至少一部分互補的寡核苷酸進行該檢測步驟。
5. 如請求項4之方法，特徵為使用qPCR方法以前進引子和逆向引子進行該檢測步驟。
6. 如請求項1至3中任一項之方法’特徵為藉著檢測GTM蛋白質或肽之過度表現進行該檢測步驟。
7. 如請求項6之方法，特徵為使用針對該GTM之抗體進行該檢測步驟。
8. 如請求項6之方法，特徵為使用三明治-類型的免疫測定法進行該檢測步驟。
9. 如請求項7之方法，特徵為該抗體為單株抗體或多株抗血清。
10. 如請求項1至3中任何一項之方法，特徵為該檢測步驟係 使用ELISA分析。
11. 如請求項1至3中任何一項之方法，特徵為該受試試樣係獲自組織、尿、胃液、血清和糞便。
12. 一種檢測胃癌的套組，其包括：一種上面有二或多個胃腫瘤標識物(GTM)捕捉試劑的受質，其中至少一者可與GTM絲胺酸或半胱胺酸蛋白酶抑制劑，位階H("SERPINH1")結合；使該GTM捕捉試劑和GTM之複合物顯色的工具；試劑；以及使用說明書。
13. 如請求項12之套組，其中該GTM補捉試劑為GTM-專一的寡核苷酸。
14. 如請求項12之套組，其中該GTM捕捉試劑為GTM-專一的抗體，其對GTM寡核苷酸、GTM蛋白質或GTM肽有選擇性。