CN115772525A - 一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合及其应用，涉及生物检测技术领域。所述核酸适体组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑7所示的7种核酸适体。本发明针对卵巢癌外泌体膜蛋白标志物设计对应的核酸适体探针，这些探针可实现对卵巢癌患者分泌的外泌体表面多个膜蛋白标志物的联合检测分析，揭示不同标志物表达水平与早期卵巢癌的相关性，从而发展一种基于外泌体膜蛋白标志物联合检测分析的卵巢癌早期诊断新方法，进而提高卵巢癌早期诊断准确率。

Description

一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合及其应用。

背景技术

卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。早期卵巢癌患者5年生存率可达90％，然而，由于早期卵巢癌症状不明显且缺乏有效检测手段，卵巢癌早期检出率不足20％。约70％卵巢癌患者确诊时已处于晚期，其5年生存率已不足30％。因此，卵巢癌的早期精准诊断是提高患者生存率的关键。目前，卵巢癌的临床诊断主要依赖于影像学检查和血液蛋白标志物检测。其中，阴道超声检查(TVU)、电子计算机断层扫描(CT)等影像学检查手段具有对体积较小或部位隐蔽的肿瘤组织检测敏感度较低，难以准确检测肿块良恶性等缺点，难以实现卵巢癌的早期精准诊断。此外，临床上常用于卵巢癌诊断的糖类抗原125(CA125)、人附睾蛋白4(HE4)及甲胎蛋白(AFP)等肿瘤标志物均非卵巢癌特异性蛋白标志物，且其表达水平受多种因数调节，导致难以通过对血液蛋白标志物检测实现卵巢癌的精准诊断。因此，目前急需发展卵巢癌早期精准诊断新方法，用于提高卵巢癌早期诊断准确率。

外泌体是一类由细胞分泌的尺寸在30-150nm的细胞外囊泡。外泌体因携带来自亲代细胞的蛋白质、核酸及代谢小分子等信息，广泛分布于血液、尿液及唾液等体液，具有数量多，生物结构稳定等优点，而在癌症液体活检中得到了广泛关注与应用。近年来，外泌体膜蛋白标志物已被证明是癌症检测的有效靶点，并被广泛用于多种癌症的诊断。相较于单个膜蛋白标志物检测，多种膜蛋白标志物的联合检测分析能显著提高癌症检测准确率，从而有助于实现癌症的精准诊断。因此，发展外泌体膜蛋白高特异性检测方法，对卵巢癌外泌体膜蛋白标志物进行联合检测分析，将有助于提高卵巢癌检测准确率。

核酸适体(Aptamer)是一类通过指数富集配体系统进化技术筛选得到的能与靶标高特异性、高亲和力结合的单链寡聚核苷酸。核酸适体又被称为“化学抗体”，它能与蛋白、小分子、细胞等多种靶标特异性结合，从而实现相关靶标的高特异性检测分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的核酸适体组合，可以完成对卵巢癌外泌体多个膜蛋白标志物的联合检测分析，从而实现卵巢癌的早期精准诊断。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合，包括核苷酸序列如SEQIDNO.1-7所示的7种核酸适体。

本发明还提供一种检测早期卵巢癌的核酸适体探针组合，所述核酸适体探针组合由上述的核酸适体组合经标记修饰得到。

进一步地，所述标记修饰为在核酸适体上连接标记基团。

进一步地，所述标记基团为FAM荧光基团。

本发明还提供上述的核酸适体组合或核酸适体探针组合在制备检测早期卵巢癌的产品中的应用。

进一步地，所述产品为试剂盒或试剂。

本发明还提供一种检测早期卵巢癌的产品，包含上述的核酸适体组合或核酸适体探针组合。

本发明公开了以下技术效果：

本发明针对卵巢癌外泌体膜蛋白标志物设计对应的核酸适体探针，这些探针可实现对卵巢癌患者分泌的外泌体表面多个膜蛋白标志物的联合检测分析，揭示不同标志物表达水平与早期卵巢癌的相关性，从而发展一种基于外泌体膜蛋白标志物联合检测分析的卵巢癌早期诊断新方法，提高卵巢癌早期诊断准确率。本发明开发的精准和非侵入性的卵巢癌早期诊断新方法也为其它癌症的早期精准诊断提供了一种新思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为外泌体的表征；其中，A：纳米流式检测仪表征外泌体的尺寸分布；B：透射电子显微镜表征外泌体的形貌；C：Western Blot表征外泌体标志蛋白；

图2为核酸适体探针用于卵巢癌患者来源外泌体的膜蛋白检测；

图3为统计不同样本来源外泌体的相关蛋白标志物表达阳性率；

图4为基于外泌体膜蛋白联合检测分析的卵巢癌早期诊断。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1核酸适体探针的设计

本发明首先构建了7条能特异性识别卵巢癌相关蛋白标志物(CA125，STIP1，CD24，EpCAM，EGFR，MUC1，HER2)的核酸适体探针，每条核酸适体探针的3’端均修饰FAM荧光基团，用于卵巢癌外泌体膜蛋白标志物的荧光检测分析。核酸适体序列如表1所示。

表1核酸适体序列

实施例2外泌体的提取

临床样本：卵巢癌患者(包括I期、II期和III/IV期患者)和健康志愿者血液样本，采集自浙江省肿瘤医院生物样本库及浙江省肿瘤医院体检中心。

外泌体提取步骤如下：

(1)将血清样本用等量的DPBS稀释，并在2000g下离心10分钟以去除细胞碎片；

(2)将步骤(1)所得上清在10000g下离心1小时，并利用0.22微米滤膜过滤去除大尺寸囊泡；

(3)将步骤(2)过滤所得上清液用DPBS稀释至500微升，并利用尺寸排阻色谱提取外泌体。

(4)将提取所得外泌体在-80℃保存以备后用。

3.外泌体的表征

(1)利用纳米流式检测仪对外泌体粒径进行表征：取100微升外泌体溶液进行检测，测得外泌体的粒径主要分布于55纳米到120纳米，平均粒径约为70纳米(如图1中A所示)。

(2)利用透射电子显微镜对外泌体形貌进行表征：吸取10微升外泌体溶液滴于铜网上静置10分钟后用滤纸吸干样品；加入10微升2wt％醋酸双氧铀溶液染色并快速吸干后，再次滴加上述醋酸染液染色5分钟；用滤纸吸尽染色液，将铜网于空气中干燥后，使用透射电子显微镜在80kv的电压下进行拍摄。如图1中B所示，透射电镜结果显示，外泌体具有典型的“杯状结构”。

(3)利用蛋白质印迹法(Western Blot)对外泌体标志蛋白进行表征：首先利用RIPA裂解液对外泌体进行裂解，所得蛋白用商业化BCA试剂盒进行定量；然后对所得蛋白进行SDS变性处理后，于12％(4-20％可达相同效果)的琼脂糖凝胶中进行电泳分离。随后将琼脂糖凝胶中的蛋白转移到PVDF膜，并用5％的脱脂牛奶室温封闭半小时后，分别与兔抗人TSG101抗体，兔抗人Alix抗体，兔抗人CD63抗体和兔抗人GM130抗体4℃孵育过夜。随后用HRP标记的鼠抗兔IgG抗体与膜在室温下孵育2小时，滴加化学发光试剂，并利用凝胶成像仪进行拍摄。如图1中C所示，3种外泌体蛋白标志物(TSG101、Alix、CD63)可被检测到，而外泌体阴性对照蛋白GM130未被检测到，证明外泌体被成功提取。

实施例3核酸适体探针用于外泌体的膜蛋白检测

首先将实施例1设计的7种核酸适体探针在95℃下退火5分钟，冰上孵育2分钟，并在室温放置1小时。随后，将浓度为100nM的7种核酸适体探针与实施例2得到的临床样本来源的外泌体分别在4℃下孵育30分钟，并利用100KD超滤管超滤去除未结合的核酸适体探针。最后，利用纳米流式检测仪对外泌体膜蛋白进行检测。如图2所示，外泌体与核酸适体探针孵育后在纳米流式检测中被记录为两个信号群体(红色和绿色)，群体中每个点代表一个外泌体。其中，红色点群代表与核酸适体探针结合的外泌体(即表达相关膜蛋白标志物的外泌体)，绿色点群代表未与核酸适体探针结合的外泌体(即不表达相关膜蛋白标志物的外泌体)。将与核酸适体探针结合的外泌体占所有检测外泌体的比例定义为膜蛋白标志物表达阳性率，即：阳性率＝与核酸适体探针结合的外泌体/(与核酸适体探针结合的外泌体+未与核酸适体探针结合的外泌体)。如图2所示，外泌体能与所设计的7种核酸适体探针结合，且阳性率各有不同，表明所检测的外泌体携带了7种卵巢癌相关膜蛋白标志物且标志物表达水平各不相同。

实施例4外泌体膜蛋白分析用于卵巢癌的早期诊断

首先将实施例1设计的7种核酸适体探针在95℃下退火5分钟，冰上孵育2分钟，并在室温放置1小时。随后，将浓度为100nM的7种核酸适体探针与实施例2得到的卵巢癌患者(包括I期、II期和III/IV期患者)和健康志愿者血液样本来源的外泌体分别在4℃下孵育30分钟，并利用100KD超滤管超滤去除未结合核酸适体探针。最后，利用纳米流式检测仪对外泌体膜蛋白进行检测并对检测结果进行统计分析。为了寻找7种外泌体膜蛋白标志物表达水平与卵巢癌的相关性及建立基于外泌体膜蛋白联合检测分析的卵巢癌早期诊断新方法，本发明对6例I期患者、10例II期患者、20例III/IV期患者及10例健康志愿者样本来源外泌体进行了膜蛋白检测，并对检测结果进行了统计分析。如图3所示，中晚期患者、早期患者和健康志愿者来源外泌体的检测阳性率(包括7种膜蛋白标志物)具有显著差异性。此外，进一步对7种外泌体膜蛋白标志物进行联合分析(即将7种膜蛋白的阳性率进行加和分析)，可以实现卵巢癌的精准诊断。如图4和表1-3所示，通过对7种外泌体膜蛋白标志物进行联合分析(即SUM7)，可实现以94.4％的灵敏、100％的特异性及95.7％的准确度检测卵巢癌。同时也能实现以83.3％的灵敏、100％的特异性及93.8％的准确度检测I期卵巢癌及以87.5％的灵敏、100％的特异性及92.3％的准确度检测I/II期卵巢癌。因此，本发明基于外泌体膜蛋白标志物联合检测分析的卵巢癌诊断新方法能实现早期卵巢癌的精准诊断。

表1预测

注：灵敏度：94.4％，特异性：100％，准确度：95.7％。

表2预测

注：灵敏度：83.3％，特异性：100％，准确度：93.8％。

表3预测

注：灵敏度：87.5％，特异性：100％，准确度：92.3％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1-7所示的7种核酸适体。

2.一种检测早期卵巢癌的核酸适体探针组合，其特征在于，所述核酸适体探针组合由权利要求1所述的核酸适体组合经标记修饰得到。

3.根据权利要求2所述的核酸适体探针组合，其特征在于，所述标记修饰为在核酸适体上连接标记基团。

4.根据权利要求3所述的核酸适体探针组合，其特征在于，所述标记基团为FAM荧光基团。

5.一种如权利要求1所述的核酸适体组合或权利要求2-4任一项所述的核酸适体探针组合在制备检测早期卵巢癌的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒或试剂。

7.一种检测早期卵巢癌的产品，其特征在于，包含权利要求1所述的核酸适体组合或权利要求2-4任一项所述的核酸适体探针组合。

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