CN112666146A - 一种基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法，包括：将金纳米颗粒、核酸适配体、氯化钠、荧光物质混合，核酸适配体包裹在金纳米颗粒表面，使其抵抗氯化钠诱导的金纳米颗粒团聚，从而使金纳米颗粒呈现出单分散的状态，而单分散的金纳米颗粒通过内滤效应使荧光物质罗丹明B淬灭；将待测样品与上述混合物混合，待测样品中的粘蛋白1会与核酸适配体形成稳定的复合结构，使核酸适配体远离金纳米颗粒表面，使金纳米颗粒失去保护，在氯化钠的诱导下发生团聚，内滤效应减弱，荧光产生；基于上述步骤中荧光强度的变化，确定所述样品中粘蛋白1浓度。本发明还公开了一种粘蛋白1的生物传感器，用以实现样品溶液中粘蛋白1的检测。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤标志物检测技术与分析化学技术领域，涉及一种基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法。
背景技术
粘蛋白1是一种存在于某些细胞表面的糖蛋白，它可以通过形成凝胶状基质而绑定在细胞上，并参与完整的跨膜区域。它包括由31个氨基酸组成的疏水性膜域和69个氨基酸组成的细胞质域，以及一个由20个氨基酸重复组成的细胞外区域。粘蛋白1可以与病原体结合从而实现保护细胞的生理功能，也可参与到一些重要的转导途径。粘蛋白1的高表达已被证实与多种癌症有关，包括乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌等。因此，若可以发展一种病人体液中粘蛋白1的检测方法，则有望代替一些灵敏度比较低的传统影像学癌症诊断法(如胸部x光检查，超声波检查，骨骼扫描和骨骼检查)等。目前，针对粘蛋白1的检测，已有几种方法报道。如基于抗原-抗体反应的酶联免疫荧光分析法，该方法特异性高但是结果有可能会不够稳定(因为动物源或细胞源的抗体批次差异)。电化学分析法具有高灵敏和高经济效应的优点，但是通常需要将核酸适配体或抗体键合到电极表面。基于核酸适配体的比色法具有无标记核酸适配体、操作简单等诸多优点，但是该方法往往会受到样品基质的颜色或者吸光度干扰导致结果不准确。综上，多数现有技术涉及复杂的纳米材料修饰或者分离步骤，比较繁琐，因此，亟需开发一种简单、快速的无标记核酸适配体的粘蛋白1检测方法。
核酸适配体是利用SELEX技术从核酸分子库中筛选得到的寡核苷酸片段，它对目标分析物具有很严格的特异性识别能力与结合能力，同时非特异性结合极少，它可识别出目标物质与非目标物之间的细微差异。因此，通过核酸适配体有望实现高选择性地结合特定的靶标物质。内滤效应是指淬灭物质或者吸收物质对荧光物质的激发光或发射光的吸收作用。基于内滤效应的荧光分析方法的优势是荧光物质和其淬灭物质之间没有共价结合且灵敏度足够高。在基于内滤效应的检测体系中，金纳米颗粒常被认为是一种优秀的淬灭物，这是由金纳米颗粒独特的性质决定的，包括高荧光淬灭效率、可调节的淬灭程度、稳定的光学性质。罗丹明 B是一种人工合成的荧光染料，具有很强的荧光且具备一定的耐光性和良好的水溶性。罗丹明B可以吸附到金纳米颗粒表面并发生荧光淬灭，若金纳米颗粒团聚，则淬灭效果减弱。金纳米颗粒在单分散和团聚状态下展现出对罗丹明B不同的淬灭能力，可归因于金纳米颗粒的比表面积变化以及金纳米颗粒对荧光的内滤效应。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测肿瘤标志物粘蛋白1的方法，用以实现溶液中的简单、快速、高灵敏检测。
本发明拟发展一种基于金纳米颗粒和核酸适配体的“turn on”荧光分析方法。氯化钠会引起单分散的金纳米颗粒发生团聚，而核酸适配体可以通过配位作用包裹在金纳米颗粒表面使金纳米颗粒抵抗氯化钠诱导的团聚作用，并且单分散的金纳米颗粒可以通过内滤效应使罗丹明B的荧光淬灭。但是当粘蛋白1存在时，核酸适配体会优先与粘蛋白1结合形成稳定的复合物结构，从而离开金纳米颗粒表面。溶液中的氯化钠会引起金纳米颗粒发生团聚，从而使金纳米颗粒对罗丹明B的内滤效应减弱，使荧光产生。因此结合体系产生的荧光信号的强度与粘蛋白1浓度的关系，可以实现粘蛋白1的荧光检测新方法。本方法无须纳米材料的修饰也无须任何分离步骤。
本发明提供了一种基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法，包括以下步骤：
(1)将金纳米颗粒、核酸适配体、氯化钠和荧光物质混合，核酸适配体通过配位作用包裹在金纳米颗粒表面，从而使金纳米颗粒处于单分散的状态，单分散的金纳米颗粒可以通过内滤效应使荧光物质的荧光淬灭；
(2)再将含有粘蛋白1的待测样品与上述混合物混合，待测样品中的粘蛋白1与核酸适配体形成稳定的复合物结构，核酸适配体从金纳米颗粒表面离开，金纳米颗粒在氯化钠的诱导下团聚，团聚的金纳米颗粒对荧光物质的内滤效应减弱，从而使荧光物质产生荧光反应；
(3)基于步骤(2)中荧光强度的变化，确定样品中粘蛋白1的浓度。
步骤(1)中，所述核酸适配体是指能够对粘蛋白1特异性识别的核酸适配体。
其中，所述能够对粘蛋白1特异性识别的核酸适配体的DNA序列为：5’-GCAGTT GATCCT TTG GATACC CTG G-3’。
步骤(1)中，所述核酸适配体的用量为：2μL，浓度为80-100μM；优选浓度为100μM。
步骤(1)中，所述荧光物质为罗丹明B。
步骤(1)中，所述荧光物质的用量为0.8-1μL，浓度为5mM。
步骤(1)中，所述金纳米颗粒的直径为13-15nm。
步骤(1)中，所述金纳米颗粒的用量为18-25μL；优选地，为20μL。
步骤(1)中，所述氯化钠的用量为400μL，浓度为100mM。
步骤(1)中，混合的温度为25℃。
步骤(1)中，混合的时间为25-35min；优选地，为30min。
步骤(2)中，所述“含有粘蛋白1的待测样品”具体指含有粘蛋白1的PBS溶液。
步骤(2)中，所述“荧光反应”具体指单分散的金纳米颗粒通过内滤效应淬灭罗丹明B 的荧光，在加入粘蛋白1后，金纳米颗粒发生团聚作用，从而无法淬灭罗丹明B的荧光，使罗丹明B的荧光恢复，其荧光激发波长为520-530nm，优选波长为525nm，最大发射波长为580nm
步骤(2)中，待测样品的用量为10μL。
步骤(3)中，基于下列线性方程，确定所述样品中粘蛋白1的浓度为7.13-100ng/mL。
Y＝4.2053C-4.7543，R2＝0.9901。
其中Y为不同粘蛋白1浓度下荧光强度，C为相应的粘蛋白1浓度。
由此，可进一步提高利用本发明进行粘蛋白1检测的效率和灵敏度。
本发明所述检测方法的机理如下：将金纳米颗粒、核酸适配体、氯化钠和荧光物质混合后，其中核酸适配体可通过配位作用包裹在金纳米颗粒表面，使得金纳米颗粒呈现单分散状态，可通过内滤效应淬灭荧光物质的荧光；当待测样品与上述混合物混合后，待测样品中的粘蛋白1与核酸适配体形成稳定的复合物结构，从而使核酸适配体从金纳米颗粒表面离开；离开后的金纳米颗粒在氯化钠的诱导下团聚，导致金纳米颗粒对荧光物质的内滤效应减弱，从而引起荧光的产生；最后基于荧光强度的变化，确定所述样品中粘蛋白1的浓度。本方法无须纳米材料的修饰也无须任何分离步骤。
在一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)将金纳米颗粒、能够对粘蛋白1特异性识别的核酸适配体、氯化钠和罗丹明B混合，其中，核酸适配体可以通过配位作用包裹在金纳米颗粒表面，使其呈现出单分散状态，单分散的金纳米颗粒可通过内滤效应使罗丹明B荧光淬灭；
(2)将待测样品与上述混合物混合，待测样品中的粘蛋白1与核酸适配体形成稳定的复合物结构，从而使核酸适配体离开金纳米颗粒，金纳米颗粒在氯化钠的诱导下团聚，导致金纳米颗粒对罗丹明B的内滤效应减弱，荧光产生；
(3)基于步骤(2)中荧光强度的变化，确定所述样品中粘蛋白1浓度。
本发明还提供了一种与粘蛋白1特异性识别的DNA片段，所述DNA的序列为：5’-GCAGTT GAT CCT TTG GATACC CTG G-3’。
本发明还提供了所述DNA片段在基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法中的应用。
本发明还提供了一种用于检测粘蛋白1的生物传感器，包括金纳米颗粒、能够特异性识别粘蛋白1的核酸适配体、氯化钠、荧光物质罗丹明B。
本发明还提供了所述粘蛋白1的生物传感器在PBS中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明通过将金纳米颗粒、核酸适配体、氯化钠和荧光物质混合，再将含有粘蛋白1的待测样品与上述混合物混合，产生荧光反应，再根据荧光强度的变化，确定样品中粘蛋白1的浓度，采用本方法可以实现溶液中粘蛋白1的简单、快速、高灵敏检测，本方法无须纳米材料的修饰以及任何分离步骤，仅需30min即可实现粘蛋白1 的检测，检测限可低至7.13ng/mL。根据本发明的实施例，基于体系荧光强度的变化，确定所述样品中粘蛋白1浓度是通过将所述体系的荧光光谱与标准曲线进行比较而完成的，其中所述标准曲线是基于已知粘蛋白1浓度分别为：0-100ng/mL的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行粘蛋白1浓度检测的效率和灵敏度。
附图说明
图1是本发明利用不同粘蛋白1浓度标准样品进行检测的荧光光谱图；
图2是本发明利用不同粘蛋白1浓度标准样品进行检测所绘制的标准曲线图；
图3是本发明实施例5对不同蛋白(牛血清白蛋白、溶菌酶、粘蛋白1)的特异性分析图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1设计与合成相应的寡核苷酸片段
通过查阅相关文献，设计一段能与粘蛋白1特异性识别的DNA片段，序列通过DNA合成仪器制备。DNA的探针序列为：5’-GCAGTT GAT CCT TTG GATACC CTG G-3’(SEQ IDNO.1)。
实施例2金纳米颗粒的制备
根据文献报道[1]，首先将实验所用的所有玻璃器皿用新鲜制备的王水(vHCl/vHNO3,3:1) 浸泡24h，并用超纯水清洗干净，在烘箱中干燥待用。将已经配制好的HAuCl4溶液(100mL， 0.03％)加入到250mL的三颈瓶中，并连接冷凝装置，使其在不断剧烈搅拌的条件下加热至沸腾。然后在上述快速搅拌的混合溶液中，快速加入10mL的柠檬酸三钠溶液(1％wt)，继续搅拌30min，移去加热装置，待冷却至室温，即可得到酒红色的纳米金胶(金纳米颗粒)，将其置于4℃冰箱保存备用，所制备的金纳米颗粒尺寸在15nm左右。
实施例3实验条件的优化
为使实验检测条件最优化，取20μL本发明实施例2制备的金纳米颗粒于1.5mL离心管中，向其中加入2μL的100μM的核酸适配体，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，振荡10min，取出向其中加入10μL 100ng/mL的粘蛋白1 溶液，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，振荡20min，取出向其中加入400μL的NaCl溶液，再加入70μL超纯水，补足体积到500μL，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，继续振荡10min。取出向其中加入不同体积的5mM罗丹明B溶液，然后置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，继续振荡10min。将离心管取出，对里面的混合液体进行荧光发射光谱表征，其中，当罗丹明B的浓度为8μM时，可得到荧光强度的变化△F最大。故以下实验中罗丹明 B的浓度选用8μM作为最优反应条件来检测溶液中的粘蛋白1。
实施例4标准曲线的建立
取20μL本发明实施例2制备的金纳米颗粒于1.5mL离心管中，向其中加入2μL的100μM的核酸适配体，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，振荡10min。取出向其中加入10μL浓度为0-800ng/mL的粘蛋白1溶液，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，振荡20min。取出向其中加入 400μL的NaCl溶液，再加入70μL超纯水，补足体积到500μL，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，继续振荡10min，取出向其中加入0.8μL 的5mM罗丹明B溶液，然后置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，继续振荡10min。将离心管取出，对里面的混合液体进行荧光发射光谱表征，获得荧光强度 F(图1)，并作空白实验，获得荧光强度F0，从而获得荧光强度的变化△F，由图1可以看出，随粘蛋白1浓度的增加，其荧光强度F也随之增加，二者呈正相关。根据测定的不同粘蛋白 1浓度下的荧光强度F相比与F0的变化值△F绘制粘蛋白1的标准曲线(图2)，本发明检测方法的线性范围是7.13-100ng/mL，即荧光强度变化值△F与粘蛋白1在7.13-100ng/mL范围内呈现出线性，其检测限为7.13ng/mL。标准曲线的线性方程为Y＝4.2053C-4.7543。其中Y 为不同粘蛋白1浓度下荧光强度变化值，C为相应的粘蛋白1浓度，线性相关性R2＝0.9901。
实施例5粘蛋白1检测的特异性
取20μL本发明实施例2制备的金纳米颗粒于1.5mL离心管中，向其中加入2μL的100μM的核酸适配体，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，振荡10min，取出分别向其中加入10μL的浓度为100ng/mL的粘蛋白1溶液、牛血清白蛋白溶液或者溶菌酶水溶液，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，振荡20min。取出向其中加入400μL的NaCl溶液，再加入70μL超纯水，补足体积到500μL，将离心管封口，置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，继续振荡10min，取出向其中加入0.8μL的5mM罗丹明B溶液，然后置于恒温气浴振荡器中，设置参数为200rpm，温度为25℃，继续振荡10min。将离心管取出，对里面的混合液体进行荧光发射光谱表征，激发波长为525nm，发射波长为560-760nm，记录其荧光发射光谱曲线，以及最高荧光发射波长580nm处的荧光强度。由实验结果得知这种基于荧光检测技术的粘蛋白1检测方法具有很高的特异性，结果如图3，本发明对目标分析物粘蛋白1的响应很高，对非目标分析物牛血清白蛋白和溶菌酶仅有很低的响应，此结果提示，本发明所建立的方法对目标粘蛋白1具有很高的特异性。
实施例6实际添加样品的测定
向PBS中分别添加20.0、50.0、100.0ng/mL的粘蛋白1，采用本发明所述的基于荧光技术的粘蛋白1检测新方法测定实际样品中粘蛋白1的添加回收率，结果如表1所示，结果显示采用本发明所述的基于荧光技术的粘蛋白1检测新方法测定实际样本中的粘蛋白1的添加回收率在96.5％-104.2％之间，其精密度在2.5-4.1％之间，说明本方法回收率良好，具有很高的准确度，并且精密度很高。
表1粘蛋白1的回收率(n＝3)
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
1.Sang F,Zhang X,Liu J,Yin S,Zhang Z(2019)A label-free hairpinaptamer probe for colorimetric detection of adenosine triphosphate based onthe anti-aggregation of gold nanoparticles.Spectrochimica Acta Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy 217:122-127.doi:10.1016/j.saa.2019.03.081。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海鹿明生物科技有限公司
<120> 一种基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gcagttgatc ctttggatac cctgg 25
Claims (10)
1.一种基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将金纳米颗粒、核酸适配体、氯化钠和荧光物质混合，所述核酸适配体通过配位作用包裹在所述金纳米颗粒表面，所述金纳米颗粒通过内滤效应使荧光物质的荧光淬灭；
(2)将待测样品与上述混合物混合，待测样品中的粘蛋白1与核酸适配体形成稳定的复合物结构，核酸适配体离开金纳米颗粒并在氯化钠的诱导下团聚，金纳米颗粒对荧光物质的内滤效应减弱，从而使荧光物质产生荧光；
(3)基于步骤(2)中荧光强度的变化，确定所述样品中粘蛋白1浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述核酸适配体是指能够对粘蛋白1特异性识别的核酸适配体，其DNA序列如下：5’-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACC CTGG-3’。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述核酸适配体的用量为2μL，浓度为80-100μM；所述荧光物质为罗丹明B；所述荧光物质的用量为0.8-1μL，浓度为5mM；所述金纳米颗粒的直径为13-15nm；所述金纳米颗粒的用量为18-25μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述混合的温度为25℃；所述混合的时间为25-35min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述待测样品的用量为10μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的粘蛋白1的浓度为7.13-100ng/mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，基于下列线性方程，确定所述样品中粘蛋白1的浓度：Y＝4.2053C-4.7543，R2＝0.9901；其中Y为不同粘蛋白1浓度下荧光强度的变化值，C为相应的粘蛋白1浓度。
8.一种与粘蛋白1特异性识别的DNA片段在基于金纳米颗粒核酸适配体荧光检测粘蛋白1的方法中的应用，其特征在于，所述DNA的序列为：5’-GCA GTT GAT CCT TTG GAT ACCCTG G-3’。
9.一种用于检测粘蛋白1的生物传感器，其特征在于，包括金纳米颗粒、能够对粘蛋白1特异性识别的核酸适配体、氯化钠、荧光物质罗丹明B。
10.根据权利要求9所述的粘蛋白1的生物传感器在PBS中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115772525A (zh) * | 2022-11-29 | 2023-03-10 | 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) | 一种检测早期卵巢癌的核酸适体组合及其应用 |
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