CN109085226A - 基于MXene的竞争型电化学适体传感器用于粘蛋白MUC1的检测 - Google Patents

基于MXene的竞争型电化学适体传感器用于粘蛋白MUC1的检测 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种基于MXene的竞争型电化学适体传感器以及其在粘蛋白MUC1检测中的应用。MXene是一种新型的二维过渡金属碳化物或碳氮化物，它具有独特的二维层结构，通过静电吸引可直接与DNA分子结合。MXene较大的表面积为信号分子提供大量的附着位点，起到了信号放大的作用。通过电化学的表征发现，该适体传感器对MUC1的检测具有特异性，具有较高的稳定性和灵敏度。

Description

基于MXene的竞争型电化学适体传感器用于粘蛋白MUC1的 检测
技术领域
本公开涉及一种基于MXene的竞争型电化学适体传感器以及其在粘蛋白MUC1检测中的应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
在全球女性癌症相关的死亡中，乳腺癌的死亡率位居第二，其仅次于肺癌。因此，对于乳腺癌标志物的检测至关重要。粘蛋白MUC1是一种高分子量跨膜糖蛋白，氨基酸序列(APDTRPAPG)，由于其在肿瘤组织中的异常表达，已被开发作为癌症早期诊断的生物标志物。与正常人相比，MUC1在乳腺癌患者中大量表达。另外，早期对于MUC1生物学功能的认识主要局限于其润滑、保护作用，随着对MUC1研究的逐渐深入，发现MUC1是一种具有多种功能的分子，在不同情况下有时甚至表现出截然相反的功能，如同时具有粘附和抗粘附作用，免疫活化和免疫抑制作用等等。因此，MUC1不管是作为乳腺癌标志物，还是生物活性功能成分，其检测都较重要。
目前已经开发了许多用于MUC1检测的方法，例如表面增强拉曼方法，酶联免疫吸附测定，荧光分析和电化学检测。与其他检测方法相比，电化学方法具有灵敏度高，响应快，简单，成本低等优点，受到广泛关注。适体通过称为SELEX(指数富集配体的系统进化)的筛选技术开发，并且是可以在实验室中直接设计和合成的一类单链核苷酸。与抗体相比，适配体成本低，分子量小，合成速度快，结构稳定，各种功能易于修饰。到目前为止，电化学适体传感器得到了很大的发展和应用，结合了电化学的高灵敏度和高适体对靶分子的选择性。
MXene是一种新型的二维过渡金属碳化物或碳氮化物，具有独特的二维层状结构、较大的比表面积及良好的导电性、稳定性、磁性能和力学性能,已广泛应用于储能、催化、吸附等多处领域。基于此，申请人希望研究开发一种新的电化学适体传感器以应用在粘蛋白MUC1检测中。
发明内容
针对以上背景技术，本公开提供了一种基于MXene的竞争型电化学适体传感器以及其在粘蛋白MUC1检测中的应用。
本公开具体采用以下技术方案：
在本公开的第一个方面，提供一种用于检测粘蛋白MUC1的MXene-DNA信号探针，其特点是，以MXene为载体，表面通过静电吸引力连接与MUC1适体互补的二茂铁或其衍生物修饰的DNA。
在本公开的第二个方面，提供所述用于检测MUC1的MXene-DNA信号探针的制备方法，该方法包括：以MXene为载体，其表面通过静电吸引力与MUC1适体互补的二茂铁或其衍生物修饰的DNA相连接。
在本公开的第三个方面，提供一种基于MXene的竞争型电化学适体传感器，其特点是：
包括：
上述MXene-DNA信号探针；以及，
表面沉积金纳米粒子(AuNP)的基体电极，所述基体电极通过金纳米粒子连接MUC1适体；
其中，所述MXene-DNA信号探针中的二茂铁或其衍生物修饰的DNA与所述MUC1适体部分互补结合。
在本公开的第四个方面，提供所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
首先将基体电极沉积金纳米粒子(AuNP)，然后连接MUC1适体，再加入所述的MXene-DNA信号探针，即可得到基于MXene的竞争型电化学适体传感器。
在本公开的第五个方面，提供所述MXene-DNA信号探针或所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器在检测MUC1中的应用。
在本公开的第六个方面，提供一种非诊断目的的MUC1的检测方法，该方法包括使用所述MXene-DNA信号探针或所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器进行电化学检测的步骤。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
本公开设计了基于MXene的竞争型电化学适体传感器。MXene是一种新型的二维过渡金属碳化物或碳氮化物，它具有独特的二维层结构，通过静电吸引可直接与DNA分子结合。MXene较大的表面积为信号分子提供大量的附着位点，起到了信号放大的作用。通过电化学的表征发现，该适体传感器对MUC1的检测具有特异性，具有较高的稳定性和灵敏度。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1基于MXene的电化学适体传感器用于MUC1检测示意图。
图2基于MXene的电化学适体传感器在不同MUC1浓度的PBS缓冲溶液(pH＝7.00)中的SWV曲线(A)及浓度与峰电流之间的线性关系曲线(B)，其中，a-i分别代表1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、1uM、10uM和100uM。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，申请人希望研究开发一种新的电化学适体传感器以应用在粘蛋白MUC1检测中，为此，在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种用于检测MUC1的MXene-DNA信号探针，其特点是，以MXene为载体，表面通过静电吸引力连接与MUC1适体互补的二茂铁或其衍生物修饰的DNA。
进一步的，所述MXene是化学通式Mn+1XnTz所表示的化合物或混合物，其中M指过渡族金属(如Ti、Zr、Hf、V、Nb、Ta、Cr、Sc等)，X指C或/和N，n一般为1-3，Tz指表面基团(如O2-、OH-、F-、NH3、NH4+等)。MXene主要通过HF酸或盐酸和氟化物的混合溶液将MAX相中结合较弱的A位元素(如Al原子)抽出而得到。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述MXene是通过HF刻蚀MAX制备得到，其中，其中M指过渡族金属(如Ti、Zr、Hf、V、Nb、Ta、Cr、Sc等)，A指Al，X指C或/和N。
进一步的，MAX为Ti3AlC2，近密堆积的Ti层与纯Al族元素层交错，C原子填充前者之间的八面体位置。因为Ti-Al键相对弱于Ti-C键，Al原子是Ti3AlC2中反应性最强的物质，可以很容易地从Ti3AlC2结构中除去，产生二维Ti3C2纳米材料。
适体(aptamer)是用配体指数富集法系统演化(SELEX)技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。本公开中所述MUC1适体的具体序列并没有特别限定，在本公开的一个或一些实施方式中，所述MUC1适体的序列为5′-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′，如SEQ ID NO：1所示。
进一步的，所述二茂铁或其衍生物修饰的DNA与MUC1适体可完全互补，也可部分互补，其具体的序列可根据MUC1适体确定。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述二茂铁或其衍生物修饰的DNA的序列为5′-TTTTTTCGCTTGCGCATG-3′，如SEQ ID NO：2所示。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述DNA采用二茂铁或其衍生物修饰，二茂铁是一种具有夹心型结构和芳香性的高度富电子体系，热稳定性好，有良好的反应活性，较易进行结构修饰，在大多数常见溶剂中可经受可逆的单电子氧化，具有易受环境影响的可逆氧化还原电对的特点，因此选用二茂铁作为信号分子。其他的电化学信号基团没有二茂铁结构稳定，在测试的过程中信号不稳定，会影响实验的重复性。
进一步的，MXene无活性位点连接牛血清白蛋白(BSA)进行封闭。
在本公开的第二个典型的实施方式中，提供所述用于检测MUC1的MXene-DNA信号探针的制备方法，该方法包括：以MXene为载体，其表面通过静电吸引力与MUC1适体互补的二茂铁或其衍生物修饰的DNA相连接。
在本公开的一个或一些实施方式中，所述用于检测MUC1的MXene-DNA信号探针的制备方法，具体包括以下步骤：将MXene和二茂铁或其衍生物修饰的DNA混合，然后反应形成MXene-DNA聚合物，将MXene无活性位点用牛血清白蛋白(BSA)封闭，并去除未结合的DNA，得到用于检测MUC1的MXene-DNA信号探针。
进一步的，所述MXene与二茂铁或其衍生物修饰的DNA的添加比例为(1～3)mL：(10～30)uL，所述二茂铁或其衍生物修饰的DNA的浓度为40～60uM。
其中，二茂铁或其衍生物修饰的DNA可通过本领域的常规手段制备得到。
进一步的，反应条件为室温，时间为0.5～1.5h。
进一步的，MXene的制备可采用本领域中常规的技术手段，在此并不特别限定。本公开中采用MXene悬浮液，为HF刻蚀MAX相中的A元素制备得到。具体的制备方法包括但不仅仅限于：冰浴条件下，将MAX缓慢加入HF中进行反应；然后将所得混合物保持在40～50℃的油浴中并连续搅拌18～36小时，冷却，洗至中性，干燥，得到粉末；再将所得粉末在水中超声处理，获得MXene的悬浮液。
MXene独特的二维结构可以直接结合DNA分子。除此之外，其较大的比表面积为信号分子提供大量的结合位点，起到信号放大的作用。
在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种基于MXene的竞争型电化学适体传感器，其特点是，包括：
上述MXene-DNA信号探针；以及，
表面沉积金纳米粒子(AuNP)的基体电极，所述基体电极通过金纳米粒子连接MUC1适体；
其中，所述MXene-DNA信号探针中的二茂铁或其衍生物修饰的DNA与所述MUC1适体部分互补结合。
用于MUC1的检测时，MXene-DNA信号探针与玻碳电极上的适体结合，会出现明显的二茂铁信号，当一定浓度的MUC1存在时，信号探针会被MUC1替换，二茂铁信号减弱，具体原理如图1所示。
进一步的，所述基体电极为玻碳电极。
进一步的，所述金纳米粒子连接巯基MUC1适体，可通过常规的技术手段实现，例如，MUC1适体5′端修饰巯基，二者通过Au-S键连接。
进一步的，所述基体电极使用前可进行预处理，处理采用氧化铝浆料对基体电极进行抛光，然后在乙醇和水的混合溶液中进行超声浴处理，干燥，即得预处理后的基体电极。
在本公开的第四个典型的实施方式中，提供所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
首先将基体电极沉积金纳米粒子(AuNP)，然后连接MUC1适体，再加入所述的MXene-DNA信号探针，即可得到基于MXene的竞争型电化学适体传感器。
进一步的，基体电极沉积金纳米粒子(AuNP)的方法为：将AuNP电沉积在HAuCl4溶液中的基体电极上，施加电势为-0.4～-0.2V，持续100～120秒。
在本公开的第五个典型的实施方式中，提供所述MXene-DNA信号探针或所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器在检测MUC1中的应用。
在本公开的第六个典型的实施方式中，提供非诊断目的的MUC1的检测方法，该方法包括使用所述MXene-DNA信号探针或所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器进行电化学检测的步骤。
上述检测方法为非诊断目的，可为筛选或鉴定MUC1抑制剂提供一种途径。
具体包括以下步骤：
标准溶液的配制：配制一组不同浓度的MUC1标准溶液；
工作曲线的绘制：将所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器置于所述不同浓度的MUC1标准溶液中进行方波伏安法(SWV)测试，得到不同浓度的MUC1标准溶液的响应峰电流，再根据MUC1标准溶液的浓度以及响应峰电流，绘制线性关系曲线；
样品的检测：将所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器置于待测样品中进行方波伏安法(SWV)测试，得到该待测样品的响应峰电流，再根据所述线性关系曲线，得到待测样品中MUC1的浓度。
进一步的，所述线性关系曲线为I＝125.960lgC+95.6357，R2＝0.99973，其中，C为MUC1的浓度。
进一步的，待测样品包括但不限于缓冲液或者其他溶液，例如，生物机体的体液、血液、组织匀浆等。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1MXene的制备
首先，将反应釜和15ml HF在-4℃放置20min。之后，将HF加入反应釜中，并将反应釜置于冰浴中，在缓慢的搅拌下，将1gTi3AlC2缓慢加入釜中并继续搅拌10分钟。接下来，将所得混合物保持在45℃的油浴中并连续搅拌24小时，之后冷却至室温，将混合物用水洗至中性，然后将混合物置于45℃的真空烘箱中12小时，得到深蓝色粉末。将所得粉末分散在100ml去离子水中并连续超声处理10小时。最后，通过离心获得Ti3C2的悬浮液。
实施例2MXene的制备
首先，将反应釜和20ml HF在-4℃放置25min。之后，将HF加入反应釜中，并将反应釜置于冰浴中，在缓慢的搅拌下，将1.5gTi3AlC2缓慢加入釜中并继续搅拌10分钟。接下来，将所得混合物保持在40℃的油浴中并连续搅拌24小时，之后冷却至室温，将混合物用水洗至中性，然后将混合物置于45℃的真空烘箱中12小时，得到深蓝色粉末。将所得粉末分散在150ml去离子水中并连续超声处理10小时。最后，通过离心获得Ti3C2的悬浮液。
实施例3MXene的制备
首先，将反应釜和30ml HF在-4℃放置20min。之后，将HF加入反应釜中，并将反应釜置于冰浴中，在缓慢的搅拌下，将2g Ti3AlC2缓慢加入釜中并继续搅拌20分钟。接下来，将所得混合物保持在45℃的油浴中并连续搅拌24小时，之后冷却至室温，将混合物用水洗至中性，然后将混合物置于45℃的真空烘箱中12小时，得到深蓝色粉末。将所得粉末分散在200ml去离子水中并连续超声处理10小时。最后，通过离心获得Ti3C2悬浮液。
实施例4MXene-DNA信号探针的制备
首先，将实施例1制备的2mL MXene悬浮液与20uL 50uM的cDNA-Fc(5′-TTTTTTCGCTTGCGCATG-3′)混合，然后在室温下振荡1小时形成MXene-DNA聚合物。随后，将MXene上的无活性位点在4℃下用BSA溶液封闭1小时，并通过离心除去未结合的DNA。最后将获得的生物缀合物储存在4℃下。
实施例5适体传感器的制备
在改性电极之前，首先使用0.3和0.5μm氧化铝浆料对玻碳电极(GCE)进行抛光，然后在乙醇和水的混合溶液的超声浴中进行处理。用氮气干燥洗涤过的电极。将AuNP电沉积在HAuCl4溶液中的GCE上，施加电势为-0.2V，持续120秒。
在37℃的条件下，将纳米金修饰的电极浸渍在20ul的适体(5′-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′)中40min，以通过Au-S键组装适体。然后，用PBS溶液洗涤构建的电极以除去未结合到电极表面的适体。将洗涤的适体传感器在40ul BSA溶液中孵育25min以阻断传感界面上的非特异性吸附位点。用PBS洗涤封闭的修饰电极，以从感测界面除去冗余的BSA。然后将适体传感器在50ul实施例5中的MXene-DNA信号探针中于37℃温育40min，并用PBS洗涤修饰的电极，得到适体传感器。
实施例6
一种粘蛋白MUC1的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准溶液的配制：采用PBS缓冲溶液(pH＝7.00)配制一组不同浓度的MUC1标准溶液。
(2)工作曲线的绘制：将所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器置于所述不同浓度的MUC1标准溶液中进行方波伏安法(SWV)测试，得到不同浓度的MUC1标准溶液的响应峰电流，再根据MUC1标准溶液的浓度以及响应峰电流，绘制线性关系曲线，如图2所示；图2显示了MUC1浓度与峰电流之间的关系，图2A为基于MXene的电化学适体传感器在不同MUC1浓度的PBS缓冲溶液(pH＝7.00)中测得的SWV曲线，由图可以看出，随着MUC1浓度的增加，峰电流逐渐降低。图2B是根据图2A中峰电流与浓度的关系得出的线性曲线，由图可知，MUC1的浓度在10pM～0.1nM的范围内呈线性，其线性方程为：Δip/nA＝125.960lgc(pM)+95.6357，R2＝0.99973。
(3)样品的检测：将所述基于MXene的竞争型电化学适体传感器置于待测样品中进行方波伏安法(SWV)测试，得到该待测样品的响应峰电流，再根据所述线性关系曲线，得到待测样品中MUC1的浓度。
可见，本公开利用MXene表面的静电吸引力结合DNA分子形成信号分子探针，制备了一种新型的竞争型电化学适体传感器用于MUC1的检测。通过其电化学结果表明，该适体传器对MUC1的检测具有良好的电化学响应。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学
<120> 基于MXene的竞争型电化学适体传感器用于粘蛋白MUC1的检测
<130> 2018
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序例
<400> 1
gcagttgatc ctttggatac cctgg 25
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttttttcgct tgcgcatg 18

Claims (10)

1.一种用于检测粘蛋白MUC1的MXene-DNA信号探针，其特征是：以MXene为载体，表面通过静电吸引力连接与MUC1适体互补的二茂铁或其衍生物修饰的DNA。
2.如权利要求1所述的MXene-DNA信号探针，其特征是：所述MXene是化学通式Mn+1XnTz所表示的化合物或混合物，其中M指过渡族金属，X指C或/和N，n为1-3，Tz指表面基团。
3.权利要求1或2所述的用于检测粘蛋白MUC1的MXene-DNA信号探针的制备方法，其特征是，该方法包括：以MXene为载体，其表面通过静电吸引力与MUC1适体互补的二茂铁或其衍生物修饰的DNA相连接。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是：具体包括以下步骤：将MXene和二茂铁或其衍生物修饰的DNA混合，然后反应形成MXene-DNA聚合物，将MXene无活性位点用牛血清白蛋白(BSA)封闭，并去除未结合的DNA，得到用于检测MUC1的MXene-DNA信号探针；
进一步的，所述MXene与二茂铁或其衍生物修饰的DNA的添加比例为(1～3)mL：(10～30)uL，所述二茂铁或其衍生物修饰的DNA的浓度为40～60uM。
5.一种基于MXene的竞争型电化学适体传感器，其特征是，包括：
权利要求1或2所述的MXene-DNA信号探针；以及，
表面沉积金纳米粒子(AuNP)的基体电极，所述基体电极通过金纳米粒子连接MUC1适体；
其中，所述MXene-DNA信号探针中的二茂铁或其衍生物修饰的DNA与所述MUC1适体部分互补结合。
6.权利要求5所述的基于MXene的竞争型电化学适体传感器的制备方法，该方法包括以下步骤：
首先将基体电极沉积金纳米粒子(AuNP)，然后连接MUC1适体，再加入所述的MXene-DNA信号探针，即可得到基于MXene的竞争型电化学适体传感器。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，基体电极沉积金纳米粒子(AuNP)的方法为：将AuNP电沉积在HAuCl4溶液中的基体电极上，施加电势为-0.4～-0.2V，持续100～120秒。
8.权利要求1或2所述的MXene-DNA信号探针或权利要求5所述的基于MXene的竞争型电化学适体传感器在检测MUC1中的应用。
9.一种非诊断目的的MUC1的检测方法，其特征是：该方法包括使用权利要求1所述的MXene-DNA信号探针或权利要求5所述的基于MXene的竞争型电化学适体传感器进行电化学检测的步骤。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征是，具体包括以下步骤：
标准溶液的配制：配制一组不同浓度的MUC1标准溶液；
工作曲线的绘制：将权利要求5所述的基于MXene的竞争型电化学适体传感器置于所述不同浓度的MUC1标准溶液中进行方波伏安法(SWV)测试，得到不同浓度的MUC1标准溶液的响应峰电流，再根据MUC1标准溶液的浓度以及响应峰电流，绘制线性关系曲线；
样品的检测：将权利要求5所述的基于MXene的竞争型电化学适体传感器置于待测样品中进行方波伏安法(SWV)测试，得到该待测样品的响应峰电流，再根据所述线性关系曲线，得到待测样品中MUC1的浓度。
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