CN104914151A - 一种用于氨苄西林和磺胺地索辛电化学传感器自组装钝化层的形成方法及其电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于氨苄西林和磺胺地索辛检测的，基于信号探针链取代的核酸适配体电化学传感器(SD-EAB)自组装钝化层的形成方法及其电化学传感器。本发明中氨苄西林SD-EAB的制备包括三个步骤：首先将末端修饰巯基的捕获探针与其互补的有二茂铁标记的核酸适配体信号探针进行杂交，然后通过自组装固定在金电极上，最后利用OEG6-OMe作为自组装钝化层分子对电极进行封闭。本发明中磺胺地索辛SD-EAB的制备与上述三个步骤类似。本发明可以解决当SD-EAB中使用现有技术中常用的MCH自组装钝化层无法实现对氨苄西林和磺胺地索辛进行检测的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于氨苄西林和磺胺地索辛电化学传感器自组装钝化层的形成方法及其电化学传感器，属于生物分析技术领域。
背景技术
核酸适配体(Aptamer)是通过体外筛选获得的DNA(脱氧核糖核酸)或者RNA(核糖核酸)序列，能够与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，与抗体相比具有能够人工合成、稳定性好、方便化学修饰和工程设计等多种优势，因此在生物传感器领域具有很好的应用前景。
抗生素类药物在治疗感染性疾病方面发挥着极其重要的作用,但由于近些年来严重滥用,导致动物性食品的抗生素残留问题突出。这些残留的抗生素会在人体内蓄积,致使人体产生耐药菌株,或因大量蓄积而对机体产生毒害作用。2014年，世卫组织的一份新报告首次报道了全球的抗菌素耐药情况，其中包括抗生素的耐药性，表明这种严重的威胁不再是对未来的一种预测，而是目前世界上所有地区正在发生，有潜力影响每个人的，无论其年龄或国籍。当细菌发生变异时，抗生素对需要用这种药物治疗感染的人们不再有效，就称之为抗生素的耐药，现在这种情况已对公共卫生构成重大威胁。由于形势严峻，多个国家已经提出相关规定，食品与环境中抗生素残留的检测方法也得到发展。高效液相色谱、毛细管电泳等色谱分析法以及免疫测定的方法，尤其是酶联免疫吸附分析是定量检测和筛选抗生素使用最广泛的方法。其中色谱方法需要精密的仪器、有经验的实验人员、耗时长并且不适于现场检测，食品及环境中的抗生素的现场检测问题亟待解决。免疫测定的方法操作方便、灵敏度高、高特异性和耗时短的特性优于仪器测量的方法，免疫方法可以检测到纳摩尔级。然而，免疫方法需要昂贵的抗体并且受到保质期的限制。因此，发展一种能够实现快 速，低廉，便于实施的检测体系尤为重要，尤其是在发展中国家。
抗生素通常可根据作用机制、分子结构及光谱活性进行分类。氨苄西林属于青霉素类，属于β-内酰胺类抗生素大种，此类抗生素抑制细菌细胞壁的合成，并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用，使细菌迅速破裂溶解。氨苄西林是青霉素类药中分解最快、过敏反应发生率最高的一种，与青霉素联用时极易发生青霉素脑病，不宜与其他抗生素联用，容易产出耐药性。抗生素滥用会导致严重的副作用，包括损失听力和损害肾脏。我国农业部1163号公告中指出，在牛奶中的定量限为4μg/L，在动物性肌肉组织、肝脏等中定量限为10μg/kg。氨苄西林核酸适配体已被筛选出来，但是基于核酸适配体的氨苄西林传感器技术报道较少，其中仅有比色传感器(Analytical Bioanalytical Chemistry 2012,402:2153-2161)、电化学传感器(Biosensors and Bioelectronics 2013,43，315-320)。磺胺地索辛是磺胺类药物中的一种,常用于饲料添加剂及畜禽疾病的治疗和预防,由于存在滥用和不遵守休药期的使用,造成了在动物性食品中有一定的残留,可引起人的过敏反应，重者导致急性血管性水肿、休克甚至死亡。日本规定牛奶中磺胺地索辛的最大残余限量为：0.025mg/kg(80.5nM)。同时，关于磺胺地索辛传感器只有少数报道，包括荧光传感器(Biosensors and Bioelectronics,2012,33,113-119)、比色传感器(Biosensors and Bioelectronics,2013,42,419-425)。然而，这些传感器的一些缺点限制了其实际应用，如制备过程复杂，灵敏度低，动力学区间窄等。
自组装单分子层膜(self-assembled monolayers，SAMs)是自组装分子通过化学键自发吸附在异相界面上而形成的单层分子膜，由于其制备简单、有序性高，稳定性好等优点，在过去的十多年里取得了极大的发展，在许多领域如非线性光学、分子器件、分子生物学、微电子学、传感器件、表面材料工程、金属防腐等方面都具有广泛的应用前景。在组装分子与金基底成膜时主要利用硫醇与金相互作用成膜。用于形成SAMs的硫醇的一般结构为HS(CH2)nX。在生物传感器中，硫醇在金表面上形成的自组装单层主要用来解决界面上非特异性吸附问题。其中6-巯基己醇(MCH)在核酸传感器中应用最为广泛，而分子式为HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH3的硫醇所形成的的自组装钝化层是目前减小蛋白质非特异性吸附效果最好。[S-(CH2)2-(OCH2CH2)6-OCH3]2钝化的金为基底 的表面可以有效减少对于牛血清蛋白(BSA)、合成聚合物PEG8000和有机小分子HEMA的非特异性吸附(Sens.Actuator B 2008,129,225-230)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于氨苄西林和磺胺地索辛检测的，基于信号探针链取代的核酸适配体电化学传感器(SD-EAB)自组装钝化层的形成方法及其电化学传感器。以解决当SD-EAB中使用现有技术中常用的MCH自组装钝化层无法实现对氨苄西林和磺胺地索辛进行检测的问题。我们发现，用于氨苄西林检测的SD-EAB，当以最常用的6-巯基己醇(MCH)形成自组装钝化层时，由于自组装钝化层对于氨苄西林很强的非特异性吸附，不能实现对靶标的检测。当以能够有效减小蛋白质非特异性吸附的巯基PEG，HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-COOH形成自组装钝化层时，出现电化学信号偏小且无规律性的现象，也不能够实现对靶标的检测。当以[S-(CH2)2-(OCH2CH2)6-OCH3]2(OEG6-OMe)形成自组装钝化层时，SD-EAB能够实现对氨苄西林高灵敏和宽动力学区间(0.1μM到5mM)，通过进一步的探针(延长核酸适配体到电极表面的距离)和传感器制备步骤(直接将双链DNA组装在金电极上)的优化，其检出限达到0.1nM，动力学区间为0.1nM到1mM。三种自组装钝化层对磺胺地索辛SD-EAB的影响与氨苄西林SD-EAB的效果类似，只有当以[S-(CH2)2-(OCH2CH2)6-OCH3]2(OEG6-OMe)形成自组装钝化层时，SD-EAB能够实现对磺胺地索辛高灵敏和宽动力学区间(1nM到1mM)的检测。
本发明中氨苄西林SD-EAB的制备包括三个步骤：首先将末端修饰巯基的捕获探针与其互补的有二茂铁标记的核酸适配体信号探针进行杂交，然后通过自组装固定在金电极上，最后利用OEG6-OMe作为自组装钝化层分子对电极进行封闭。本发明中磺胺地索辛SD-EAB的制备包括三个步骤：首先将末端修饰巯基的核酸适配体捕获探针与其互补的有二茂铁标记的信号探针进行杂交，然后通过自组装固定在金电极上，最后利用OEG6-OMe作为自组装钝化层分子对电极进行封闭。
上述氨苄西林和磺胺地索辛SD-EAB中，二茂铁基团接近电极表面，从而能够有效地与电极表面发生电子交换产生高电流。当靶分子存在时，由于靶分 子同短互补探针竞相与适配体结合，信号探针和与其具有更高亲和力的靶分子结合，不再与互补探针杂交，远离电极表面，通过电化学方波伏安扫描测定其电流信号下降，由此可定量靶分子的浓度。
本发明中的基于链取代的核酸适配体电化学传感器设计简单，通用性强。选择OEG6-OMe形成自组装钝化层，即可使小分子的非特异吸附干扰降到最低，极大地减小非特异性吸附对氨苄西林和磺胺地索辛与其核酸适配体的分子识别，从而实现对氨苄西林和磺胺地索辛的灵敏检测。说明OEG6-OMe形成自组装钝化层在解决小分子的在电极上的非特异性吸附问题上有着一定的通用性。
本发明中氨苄西林检测传感器SD-EAB A的制作方法包括如下步骤：
(1)金电极的清洁
用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤。打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描36圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定。如观察不到明显的对应氧化还原峰，重新上述步骤打磨金电极再进行活化。
(2)捕获探针1与信号探针2的杂交
0.5μM末端巯基修饰的捕获探针1(AC-SH，表1)与2.5μM与AC-SH互补的标记二茂铁的核酸适配体信号探针2(AA-Fc，表1)以1：5摩尔比混合在缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.4)中95℃水浴10min，然后缓冷至室温，使得AC-SH与AA-Fc杂交形成双链。然后加入三[2-羧乙基]膦(TCEP)，TCEP与AC-SH的摩尔比为10：1，室温还原1小时。
(3)捕获探针1与信号探针2双链在金电极表面上的组装
将清洁的金电极浸入杂交液，置于37℃，过夜反应。用缓冲液A冲洗三遍。
(4)金电极的表面钝化
将(3)的电极浸入1mM OEG6-OMe中，37℃封闭1小时。用缓冲液A冲洗三遍，制得的传感器在杂交液中4℃保存备用。
本发明中使用SD-EAB A检测氨苄西林时的应用方法包括如下步骤：
用缓冲液A稀释成一定浓度的氨苄西林，将组装好的金电极浸泡于其中，37℃，反应30min。缓冲液C洗三次。用带SWV分析方法的恒电位仪扫描并分析结果。
本发明中氨苄西林检测传感器SD-EAB B的制作方法包括如下步骤：
(1)金电极的清洁
用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤。打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描36圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定。如观察不到明显的对应氧化还原峰，重新上述步骤打磨金电极再进行活化。
(2)捕获探针3与信号探针4的杂交
0.5μM末端巯基修饰的捕获探针3(ACT-SH，表1)与2.5μM与ACT-SH互补的标记二茂铁的核酸适配体信号探针4(AAT-Fc，表1)以1：5摩尔比混合在缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.4)中95℃水浴10min，然后缓冷至室温，使得ACT-SH与AAT-Fc杂交形成双链。然后加入三[2-羧乙基]膦(TCEP)，TCEP与ACT-SH的摩尔比为10：1，室温还原1小时。
(3)捕获探针3与信号探针4双链在金电极表面上的组装
将清洁的金电极浸入杂交液，置于37℃，过夜反应。用缓冲液A冲洗三遍。
(4)金电极的表面钝化
将(3)的电极浸入1mM OEG6-OMe中，37℃封闭1小时。用缓冲液A冲洗三遍，制得的传感器在杂交液中4℃保存备用。
本发明中使用SD-EAB B检测氨苄西林时的应用方法包括如下步骤：
用缓冲液A稀释成一定浓度的氨苄西林，将组装好的金电极浸泡于其中，37℃，反应30min。缓冲液C洗三次。用带SWV分析方法的恒电位仪扫描并分析结果。
本发明中磺胺地索辛检测传感器SD-EAB C的制作方法包括如下步骤：
(1)金电极的清洁
用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤。打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描35圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定。如观察不到明显的金的氧化还原峰，重新上述步骤打磨金电极再进行活化。
(2)捕获探针5与信号探针6的杂交
0.5μM末端巯基修饰的核酸适配体捕获探针5(SC-SH，表1)与5μM与SA-SH互补的标记二茂铁的信号探针(SA-Fc，表1)以1：10摩尔比混合在缓冲液C(20mM Tris–HCl,50mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH 8.0)中95℃水浴10min，然后缓冷至室温，使得SC-SH与SA-Fc杂交形成双链。然后加入三[2-羧乙基]膦(TCEP)，TCEP与SC-SH的摩尔比为10：1，室温还原1小时。
(3)捕获探针3与信号探针4双链在金电极表面上的组装
将清洁的金电极浸入杂交液，置于37℃，反应过夜。用缓冲液C(20mM Tris–HCl,50mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH 8.0)冲洗三遍。
(4)金电极的表面钝化
将(3)的电极浸入1mM OEG6-OMe中，37℃封闭1小时。用缓冲液A冲洗三遍，制得的传感器在杂交液中4℃保存备用。
本发明中使用SD-EAB C检测磺胺地索辛时的应用方法包括如下步骤：
用缓冲液C稀释成一定浓度的磺胺地索辛，将组装好的金电极浸泡于其中，37℃，反应30min。缓冲液C洗三次。用带SWV分析方法的恒电位仪扫描并分析结果。
本发明用于氨苄西林和磺胺地索辛检测的，基于信号探针链取代的核酸适配体电化学传感器(SD-EAB)自组装钝化层的形成方法及其电化学传感器，具有如下的技术效果：
1、本发明用于氨苄西林和磺胺地索辛检测的，基于信号探针链取代的核酸 适配体电化学传感器(SD-EAB)自组装钝化层的形成方法简单、易行。
2、本发明基于核酸适配体链取代反应的电化学传感器(SD-EAB)当以OEG6-OMe形成自组装钝化层时性能显著优于其它自组装钝化层。用于氨苄西林检测的SD-EAB A，当以最常用的6-巯基己醇(MCH)形成自组装钝化层时，由于自组装钝化层对于氨苄西林很强的非特异性吸附，不能实现对靶标的检测。当以能够有效减小蛋白质非特异性吸附的巯基PEG，HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-COOH形成自组装钝化层时，出现电化学信号偏小且无规律性的现象，也不能够实现对靶标的检测。当以OEG6-OMe形成自组装钝化层时，SD-EAB A能够实现对氨苄西林高灵敏和宽动力学区间(0.1μM到5mM)的检测。三种自组装钝化层对磺胺地索辛SD-EAB的影响与氨苄西林SD-EAB的效果类似，只有当以OEG6-OMe形成自组装钝化层时，SD-EAB C能够实现对磺胺地索辛高灵敏和宽动力学区间(1nM到1mM)的检测。
3、通过进一步的探针优化(延长信号探针到电极表面的距离)，SD-EAB B对氨苄西林的检出限可达到0.1nM，动力学区间为0.1nM到1mM。
附图说明
图1是基于链取代的核酸适配体电化学传感器(SD-EAB A和B)检测氨苄西林的原理图。
图2A-图2B是本发明一个实施例中对于自组装钝化层为OEG6-OMe的SD-EAB A(A)和SD-EAB B(B)检测氨苄西林的SWV曲线及标准曲线。
图3是本发明一个实施例中自组装钝化层为MCH的基于适配体链取代的电化学传感器检测氨苄西林的阻抗谱图(左)和SWV曲线(右)。
图4是本发明一个实施例中自组装钝化层为HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-COOH的SD-EAB A(左)和SD-EAB B(右)检测氨苄西林的SWV灵敏度曲线。
图5是本发明一个实施例中基于寡核苷酸链电化学检测的传感器(SD-EAB C)检测磺胺地索辛的SWV曲线及标准曲线。
图6是本发明一个实施例中SD-EAB C靶标选择性的测试结果。所测试的抗生素分别是卡那霉素A(Kana A)、卡那霉素B(Kana B)、氨苄青霉素(Ampi)、磺胺地索辛(Sulf)、链霉素(Stre)
具体实施方式
表1：本发明中使用的核酸探针序列。
Fc:二茂铁
实施例1:用于氨苄西林检测的SD-EAB A的制备，自组装钝化层分别为OEG6-OMe。
用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤。打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描36圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定。如观察不到明显的对应氧化还原峰，重新上 述步骤打磨金电极再进行活化。
0.5μM末端巯基修饰的捕获探针1(AC-SH，表1)与2.5μM与AC-SH互补的标记二茂铁的核酸适配体信号探针2(AA-Fc，表1)以1：5摩尔比混合在缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.4)中95℃水浴10min，然后缓冷至室温，使得AC-SH与AA-Fc杂交形成双链。然后加入三[2-羧乙基]膦(TCEP)，TCEP与AC-SH的摩尔比为10：1，室温还原1小时。将清洁的金电极浸入杂交液，置于37℃，过夜反应。用缓冲液A冲洗三遍。将电极浸入1mM OEG6-OMe中，37℃封闭1小时。用缓冲液A冲洗三遍，制得的传感器在杂交液中4℃保存备用。
实施例2:用于氨苄西林检测的传感器的制备，自组装钝化层分别为HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-COOH或MCH。
将实施例1中的自组装分子由OEG6-OMe换为1mM MCH或1mMHS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-COOH。其它步骤相同。
实施例3:用于氨苄西林检测的SD-EAB B的制备，自组装钝化层分别为OEG6-OMe。
用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤。打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描36圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定。如观察不到明显的对应氧化还原峰，重新上述步骤打磨金电极再进行活化。
0.5μM末端巯基修饰的捕获探针3(ACT-SH，表1)与2.5μM与ACT-SH互补的标记二茂铁的核酸适配体信号探针4(AAT-Fc，表1)以1：5摩尔比混合在缓冲液A(10mM磷酸盐缓冲液，1M NaCl,5mM MgCl2,pH 7.4)中95℃水浴10min，然后缓冷至室温，使得ACT-SH与AAT-Fc杂交形成双链。然后加入三[2-羧乙基]膦(TCEP)，TCEP与ACT-SH的摩尔比为10：1，室温还原1小时。 将清洁的金电极浸入杂交液，置于37℃，过夜反应。用缓冲液A冲洗三遍。将电极浸入1mM OEG6-OMe中，37℃封闭1小时。用缓冲液A冲洗三遍，制得的传感器在杂交液中4℃保存备用。
实施例4:利用实施例1-3制备的传感器检测不同浓度的氨苄西林。
使用电化学设备对实施例1-3制备的四种传感器进行方波伏安扫描，对0.2V附近二茂铁对应的氧化峰进行测定，随着靶标浓度的增加，峰电流逐渐降低，实现对不同浓度氨苄西林的检测。
以OEG6-OMe形成自组装钝化层的传感器SD-EAB A和B检测氨苄西林的结果如图2所示。本发明中SD-EAB A动力学区间为0.1μM到5mM，而SD-EAB B相对于SD-EAB A的探针序列均加长了7个碱基的间隔链(见表1)，其检出限达到0.1nM，动力学区间为0.1nM到1mM。对SD-EAB A(图2A)来说，其检出限为0.1μM，与被用作标准方法的液相色谱法或者酶联免疫吸附法相当。而SD-EAB B的检出限为0.1nM(图2B),灵敏度是SD-EAB A的1000倍。相对于SD-EAB A，SD-EAB B的改进在于在探针序列中加长间隔链，这使得核酸适配体能够进行更加灵敏有效的识别氨苄西林。其一，将信号探针和捕获探针序列均加长，使得可与靶标结合的核酸适配体序列完全暴露在自组装钝化层之外，核酸适配体与靶标结合后脱离电极表面时的阻力大大减小，更易离去，电化学信号下降更明显，传感器因而更灵敏。其二，加长的探针长度适中，未明显影响氧化还原信号基团在电极表面的电子传输过程，可以实现其有效信号响应。综上，探针序列中加入一定长度的间隔链使得SD-EAB B的检测灵敏度显著优于SD-EAB A。
用自组装钝化层为MCH的基于核酸适配体链取代的电化学传感器检测氨苄西林。得到结果如图3所示，灵敏度曲线表明有氨苄西林存在的情况下，电流信号始终都高于不存在氨苄西林的情况，这说明在电极表面存在氨苄西林的非特异性吸附。采用该自组装钝化层的传感器无法进行对氨苄西林的特异性检测。同时，对其进行阻抗的检测时发现(图3)，阻抗值随着氨苄西林浓度的升高而逐渐增大，这也说明存在一定的非特异性吸附。分析原因可能为在该检测 条件下，高浓度的氨苄西林会引起较强非特异性吸附，这种特异性吸附在电化学检测中表现为阻抗值增加。
用自组装钝化层为HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH3的传感器SD-EAB A或B检测氨苄西林。得到结果如图4所示，较采用其他自组装钝化层(MCH和OEG6-OMe)的SD-EAB A的电流信号相比，作为信号响应的该SD-EAB A电流信号非常小，不足其余信号一半。且电流信号随着检测氨苄西林浓度的升高，并未呈现逐渐下降的趋势，反而有升高或者重叠的现象，趋势比较混乱且重复性差。造成该结果的主要原因有两点，其一为分子过长，钝化层厚度过大，排列紧密，大大阻碍电子传输的能力，增加氧化还原基团距离电极过远会影响电信号的表达；其二为钝化层分子过长，会封闭住一部分的核酸适配体探针序列，核酸适配体探针序列不能与靶标进行有效接触，从而不能实现对氨苄西林的检测。增加探针序列的间隔链建立SD-EAB B(图4)后，也没有出现信号有明显的下降趋势，信号无规律性，且信号整体大小与该自组装钝化层的SD-EAB A相同。
实施例5:用于磺胺地索辛检测的SD-EAB C制备。
用超纯水冲洗金圆盘电极(直径为2mm)，依次用1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3抛光粉抛光电极表面(在抛光布上加少量超纯水和固体粉末打磨5-10分钟)，每次打磨后用超纯水冲洗后，在超纯水中超声5分钟，再进行下一个打磨步骤。打磨光滑的电极在多通道电位仪在0.5M H2SO4中以-0.4～1.2V范围以100mV/s作循环伏安扫描35圈，以饱和硫酸亚汞电极为参比电极，铂电极为对电极，直到循环伏安图基本稳定。如观察不到明显的金的氧化还原峰，重新上述步骤打磨金电极再进行活化。
0.5μM末端巯基修饰的核酸适配体捕获探针5(SC-SH，表1)与5μM与SA-SH互补的标记二茂铁的信号探针(SA-Fc，表1)以1：10摩尔比混合在缓冲液C(20mM Tris–HCl,50mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH 8.0)中95℃水浴10min，然后缓冷至室温，使得SC-SH与SA-Fc杂交形成双链。然后加入三[2-羧乙基]膦(TCEP)，TCEP与SC-SH的摩尔比为10：1，室温还原1小时。将清洁的金电极浸入杂交液，置于37℃，反应过夜。用缓冲液C(20mM Tris–HCl,50mM NaCl,5mM KCl,5mM MgCl2,pH 8.0)冲洗三遍。将电极浸入1mM OEG6-OMe中，37℃封闭1小时。用缓冲液A冲洗三遍，制得的传感器在杂交液中4℃保存备用。
实施例6:利用SD-EAB C检测不同浓度的磺胺地索辛。
使用电化学设备对传感器SD-EAB C进行方波伏安扫描，对0.2V附近二茂铁对应的氧化峰进行测定，随着靶标浓度的增加，峰电流逐渐降低，实现对不同浓度磺胺地索辛的检测。得到结果如图5所示，本发明中SD-EAB C传感器动力学区间为1nM到1mM，比现有报道中的磺胺地索辛传感器宽2-5个数量级。对SD-EAB C来说，观察到磺胺地索辛浓度对数对应电流变化在100nM到1mM范围内呈良好的线性关系，相关系数为0.998，检出限为1nM，比报道过的其他基于适配体的磺胺地索辛传感器灵敏5-10倍。
实施例7:对本发明SD-EAB C的靶标选择性测定。
使用与磺胺地索辛有不同化学结构的抗生素以相同方法对SD-EAB C进行选择性测试。各抗生素的测试浓度分别为100nM、10μM和1mM。结果如图6所示，SD-EAB C对其他类型的抗生素包括卡那霉素A、卡那霉素B、链霉素、氨苄西林均具有优良的选择性，能够选择性检测磺胺地索辛。
Claims (5)
1.一种用于氨苄西林和磺胺地索辛检测的，基于信号探针链取代的核酸适配体电化学传感器(SD-EAB)自组装钝化层的形成方法，其特征在于，以[S-(CH2)2-(OCH2CH2)6-OCH3]2(OEG6-OMe)形成自组装钝化层。
2.一种氨苄西林核酸适配体电化学传感器(SD-EAB)制备方法，其特征在于，包括三个步骤：首先将末端修饰巯基的捕获探针与其互补的有二茂铁标记的核酸适配体信号探针进行杂交，然后通过自组装固定在金电极上，最后利用OEG6-OMe作为自组装钝化层分子对电极进行封闭。
3.一种磺胺地索辛核酸适配体电化学传感器(SD-EAB)制备方法，其特征在于，包括三个步骤：首先将末端修饰巯基的核酸适配体捕获探针与其互补的有二茂铁标记的信号探针进行杂交，然后通过自组装固定在金电极上，最后利用OEG6-OMe作为自组装钝化层分子对电极进行封闭。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，还包括延长核酸适配体到电极表面距离的探针优化。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，还包括直接将双链DNA组装在金电极上步骤。
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