CN110501411B - 一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于核酸适配体无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，属于电化学生物传感器技术领域。本发明基于目标诱导的核酸适配体构象变化及催化发夹自组装扩增（CHA）和链置换策略检测氨苄青霉素，实现了多重的信号放大，降低了检测限，提高了灵敏度，并且金电极简便、小型化、易携带、可多次使用；实现了目标物的，简单，灵敏的检测。制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，并且反应过程不需要酶参与，极大的降低了成本。故适用于食品安全中氨苄青霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于核酸适配体无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，具体涉及一种基于目标诱导的核酸适配体构象变化及催化发夹自组装扩增（CHA）和链置换策略检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用，属于电化学生物传感器技术领域。
背景技术
抗生素具有杀死和摧毁微生物细胞结构的功能，在世界范围内被广泛的应用于各种抗菌药物的制备，但与此同时，抗生素的滥用导致的残留问题已经成为世界范围内急需解决的难题。抗生素的过量使用，可以刺激感染引起的细菌变得耐药性。
氨苄青霉素（Ampicillin），又称氨苄西林，是一种β-内酰胺类抗生素，可治疗多种细菌感染。由于良好杀菌效果，得到了广泛的应用，但导致的环境残留问题亦不能忽视。目前报道的检测氨苄青霉素的方法包括高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面等离子体共振方法和荧光等方法。这些方法有检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，建立一个操作简便、灵敏的高特异性的方法，在食品安全分析和环境监测方面来检测氨苄青霉素及其残留是至关重要的。
发明内容
为了解决现有技术中检测氨苄青霉素的方法特异性和灵敏度都比较低，成本高的问题，本发明提供了一种操作简便、特异性和灵敏度高、成本低的基于目标物诱导的核酸适配体构象变化以及催化发夹自组装扩增（CHA）和链置换策略检测氨苄青霉素的电化学生物传感器。本发明另一目的在于提供一种上述电化学生物传感器的制备方法和在检测氨苄青霉素中的应用。
一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，包括：
由适配体Aptamer和引物Primer杂交组合而成的拱形探针（probe），发卡引物（HP1），发卡引物（HP2），由信号探针（SP）、封闭探针（BK）、辅助探针（AS）杂交组合而成的双链探针（DP），燃料探针（fuel），PBS缓冲液，H2O2，血红素，金电极；
所述的PBS缓冲液含有K+；
所述的适配体Aptamer序列如SEQ No.1所示；
所述的引物Primer序列如SEQ No.2所示；
所述的发夹引物HP1序列如SEQ No.3所示；所述的HP1的3’端连接-SH；
所述的发卡引物HP2序列如SEQ No.4所示；
所述的信号探针SP序列如SEQ No.5所示；所述的SP的3’端连接-SH；
所述的封闭探针BK序列如SEQ No.6所示；
所述的辅助探针AS序列如SEQ No.7所示；
所述的燃料探针fuel序列如SEQ No.8所示。
所述的金电极，需要在其表面修饰HP1、DP，采用以下方法制备获得：
a）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用超纯水反复冲洗；
b）将HP1和DP溶液滴在a）处理后的金电极表面，保温孵育。
所述probe浓度为10-200 nM；HP1浓度为100 nM-2 μM；HP2浓度为100 nM-2 μM；所述DP浓度为1-20 μM；所述fuel的浓度为1-20 μM。
所述probe优选的终浓度为100 nM；所述HP1优选的终浓度为1 µM；所述HP2优选的终浓度为1 µM；所述DP优选的终浓度为10 μM；所述fuel优选的终浓度为10 μM。
上述电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成探针Probe；将SP，BK，AS在PBS缓冲液中杂交成DP；
（2）将DP，HP1在金电极上恒温孵育；
（3）将Probe、HP2、氨苄青霉素溶液混合后滴加到修饰有HP1和DP的金电极上恒温孵育；
（4）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（3）中的电极；
（5）在含有10 mM H2O2的PBS缓冲液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电信号变化；
（6）根据氨苄青霉素标准溶液的电信号作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测液电信号计算待测液中氨苄青霉素的浓度。
所述步骤（1）具体工艺为：将12 μL 灭菌水，4 μL 5×PBS，2 μL 1 μM Aptamer链和2 μL 1 μM Primer混合震荡，在95°C下孵育5 min，缓慢冷却至室温，得到探针Probe；同时，将10 μL 灭菌水，4 μL 5×PBS， 2 μL 100 μM BK，SP，AS混合震荡，在95 °C下孵育5min，缓慢冷却至室温，得到DP。
上述电化学生物传感器的工作原理如下：
所述的核酸序列如下：
| Oligonucleotide name | Sequence (5’ to 3’) description |
| 适配体（Aptamer） | GCGGGCGGTTGTATAGCGG |
| 引物 （Primer） | CCGCTATACACGTGCTTGCCCGC |
| 发夹探针1（HP1） | GCGGGCAAGCACGTGTATAGCGGCCATGCGTAGACC-SH |
| 发夹探针2（HP2） | ATAGCGGTCTACACACATGGCCGCTATACACGTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGGCCATGTGTAGA |
| 封闭探针（BK） | CGCCCAACCCTCTCGATCTACACATGGCCGC |
| 辅助探针（AS） | ATGTGTAGATCGAGA |
| 燃料探针（Fuel） | ATGTGTAGATCGAGAGGGTTGGGCG |
| 信号探针（SP） | GGGTTGGGCGGGATGGGTTTTTT-SH |
Aptamer能够与Primer通过部分碱基配对结合成拱形探针（Probe）。如图所示，当目标物氨苄青霉素存在时，氨苄青霉素与Aptamer结合从而将Primer释放下来。释放的Primer打开修饰在电极上的HP1,HP1暴露的部分将HP2打开，并释放下Primer，释放下的Primer将继续打开剩余的HP1。同时，打开的HP2的3’末端将与修饰在金电极上DP暴露的部分杂交，发生链置换反应将AS释放下来；同时，暴露出一段新的支点，fuel将结合到这段支点上并同时释放下HP2和SP，释放的HP2继续结合DP，释放的SP一端固定在金电极上并且富含有鸟嘌呤的序列可以在K+和血红素存在的条件下形成G-四联体/血红素复合物，该复合物有着辣根过氧化物酶的作用可以催化过氧化氢，产生电流信号。在一定浓度范围内，通过测量电化学信号来间接定量检测氨苄青霉素。
本发明具有以下优点：
1、特异性好，检测限低
本发明的电化学生物传感器利用适配体与氨苄青霉素的特异性识别，实现了对目标物氨苄青霉素的高特异性检测，且检测下限为0.76 pM。
2、灵敏度高
该生物传感器利用催化发夹自组装和链置换策略实验了多重的信号放大，降低了检测限，提高了灵敏度，并且金电极简便、小型化、易携带、可多次使用；实现了目标物的，简单，灵敏的检测。
3、成本低廉，适合产业化
本申请的制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，并且反应过程不需要酶参与，极大的降低了成本。故适用于食品安全中氨苄青霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。
附图说明
图1为本电化学生物传感器的工作原理示意图；
图2为修饰不同浓度HP1的金电极测定的电信号曲线图；
图3为不同浓度DP测定的电信号曲线图；
图4为不同浓度HP2测定的电信号曲线图；
图5为不同浓度Fuel测定的电信号曲线图；
图6为系列氨苄青霉素标准溶液的电信号图；
图7为测定氨苄青霉素的直线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例中， PBS缓冲液含Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM)，NaCl (140 mM)，KCl(1 mM)，MgCl2 (1 mM)，CaCl2 (1 mM)，pH值为7.4。
另外的，所述probe浓度为10-200 nM, HP1浓度为100 nM-2 μM；HP2浓度为100nM-2 μM；所述DP浓度为1-20 μM；所述fuel的浓度为1-20 μM；
所述probe优选的终浓度为100 nM；所述HP1优选的终浓度为1 µM；所述HP2优选的终浓度为1 µM；所述DP优选的终浓度为10 μM；所述fuel优选的终浓度为10 μM。
实施例1 修饰DP和HP1的金电极的制备。
a）金电极抛光处理：将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，超纯水反复冲洗5次；
b）将HP1和DP溶液滴在a）处理后的金电极表面，37°C保温孵育2 h。
实施例2 不同HP1浓度对检测氨苄青霉素的影响。
（1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成Probe（100 nM）；
（2）将Probe、HP2、fuel、10 nM氨苄青霉素标准溶液混合后滴到修饰有10 µM DP和不同HP1（终浓度为0.1 μM，0.5 μM，1 μM，1.5 μM，2 μM）的电极S1-S5上37 °C恒温孵育2 h；
（3）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到金电极上，然后37 °C恒温孵育30 min；
（4）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（3）中的电极3次；
（5）在含H2O2（10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06s。
以HP1浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作修饰不同浓度HP1的金电极测定的电信号曲线图，如图2所示。由图2可知，检测到的电流信号随着HP1的浓度在0-1 μM区间内增大而增大，当浓度超过1 μM后，电流趋于稳定。
实施例3 不同DP浓度对检测氨苄青霉素的影响。
（1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成Probe（100 nM）；
（2）将Probe、HP2、fuel、10 nM氨苄青霉素标准溶液混合后滴到修饰有1 μM HP1不同浓度DP（终浓度为1 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）的电极上37 °C恒温孵育2 h；
（3）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到金电极上，然后37 °C恒温孵育30 min；
（4）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（3）中的电极3次；
（5）在含H2O2（10 mM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06s。
以DP浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作修饰不同浓度DP的金电极测定的电信号曲线图，如图3所示。由图3可知，检测到的电流信号随着DP的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。
实施例4 不同HP2浓度对检测氨苄青霉素的影响。
（1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成Probe（100 nM）；
（2）将Probe、HP2（终浓度为0.1 μM，0.5 μM，1 μM，1.5 μM，2 μM）、fuel、1 nM氨苄青霉素标准溶液混合后滴到修饰有1 μM HP1 10 mM DP的电极上37 °C恒温孵育2 h；
（3）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到金电极上，然后37 °C恒温孵育30 min；
（4）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（3）中的电极3次；
（5）在含H2O2（10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06s。
以HP2浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作修饰不同浓度HP2的金电极测定的电信号曲线图，如图4所示。由图4可知，检测到的电流信号随着HP2的浓度在0-1 μM区间内增大而增大，当浓度超过1 μM后，电流趋于稳定。
实施例5 不同Fuel浓度对检测氨苄青霉素的影响。
（1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成Probe（100 nM）；
（2）将Probe、HP2、fuel（终浓度为1 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）、10 nM氨苄青霉素标准溶液混合后滴到修饰有1 μM HP1 10 mM DP的电极上37°C恒温孵育2 h；
（3）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到金电极上，然后37 °C恒温孵育30 min；
（4）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（3）中的电极3次；
（5）在含H2O2（10 mM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06s。
以HP2浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作修饰不同浓度HP2的金电极测定的电信号曲线图，如图5所示。由图5可知，检测到的电流信号随着HP2的浓度在0-1 μM区间内增大而增大，当浓度超过1 μM后，电流趋于稳定。
实施例6 对氨苄青霉素的检测。
（1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成Probe（100 nM）；
（2）将Probe、HP2、fuel、氨苄青霉素(终浓度为0、1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000 pM)标准溶液混合后滴到修饰有1 μM HP1 10 mM DP的电极上37 °C恒温孵育2 h；
（3）将5 μL血红素溶液（10 μM）滴加到金电极上，然后37 °C恒温孵育30 min；
（4）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（3）中的电极3次；
（5）在含H2O2（10 mM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到- 0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06s。
（6）根据氨苄青霉素标准溶液的电信号作标准曲线，如图6所示，计算回归方程为I(μA) =0.71567+0.51644 lg(C ampicillin /pM)，相关系数为0.99402；同时，我们在1 pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于1 pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为0.76 pM。
序列表
<110> 济南大学
<120> 一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
gcgggcggtt gtatagcgg 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
ccgctataca cgtgcttgcc cgc 23
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 3
gcgggcaagc acgtgtatag cggccatgcg tagacc 36
<210> 4
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 4
atagcggtct acacacatgg ccgctataca cgtgcttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttgcggc catgtgtaga 80
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 5
gggttgggcg ggatgggttt ttt 23
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 6
cgcccaaccc tctcgatcta cacatggccg c 31
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 7
atgtgtagat cgaga 15
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 8
atgtgtagat cgagagggtt gggcg 25
Claims (8)
1.一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，其特征在于，包括：
由适配体Aptamer和引物Primer杂交组合而成的拱形探针probe，发卡引物HP1，发卡引物HP2，由信号探针SP、封闭探针BK、辅助探针AS杂交组合而成的双链探针DP，燃料探针fuel，PBS缓冲液，H2O2，血红素，金电极；
所述的PBS缓冲液含有K+；
所述的适配体Aptamer序列如SEQ No.1所示；
所述的引物Primer序列如SEQ No.2所示；
所述的发夹引物HP1序列如SEQ No.3所示；所述的HP1的3’端连接-SH；
所述的发卡引物HP2序列如SEQ No.4所示；
所述的信号探针SP序列如SEQ No.5所示；所述的SP的3’端连接-SH；
所述的封闭探针BK序列如SEQ No.6所示；
所述的辅助探针AS序列如SEQ No.7所示；
所述的燃料探针fuel序列如SEQ No.8所示；
当目标物氨苄青霉素存在时，氨苄青霉素与Aptamer结合从而将Primer释放下来；释放的Primer打开修饰在电极上的HP1,HP1暴露的部分将HP2打开，并释放下Primer，释放下的Primer将继续打开剩余的HP1；同时，打开的HP2的3’末端将与修饰在金电极上DP暴露的部分杂交，发生链置换反应将AS释放下来；同时，暴露出一段新的支点，fuel将结合到这段支点上并同时释放下HP2和SP，释放的HP2继续结合DP，释放的SP一端固定在金电极上并且富含有鸟嘌呤的序列可以在K+和血红素存在的条件下形成G-四联体/血红素复合物，该复合物有着辣根过氧化物酶的作用可以催化过氧化氢，产生电流信号；在一定浓度范围内，通过测量电化学信号来间接定量检测氨苄青霉素。
2.根据权利要求1所述的无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，其特征在于，所述的金电极，需要在其表面修饰HP1、DP，包括以下步骤：
a）将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，用超纯水反复冲洗；
b）将HP1和DP溶液滴在a）处理后的金电极表面，保温孵育。
3.根据权利要求1所述的无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，其特征在于，所述probe浓度为10-200 nM；HP1浓度为100 nM-2 μM；HP2浓度为100 nM-2 μM；所述DP浓度为1-20 μM；所述fuel的浓度为1-20 μM。
4.根据权利要求1所述的无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器，其特征在于，所述probe优选的终浓度为100 nM；所述HP1优选的终浓度为1 µM；所述HP2优选的终浓度为1 µM；所述DP优选的终浓度为10 μM；所述fuel优选的终浓度为10 μM。
5.一种权利要求1所述的无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将Aptamer与Primer在PBS缓冲液中杂交成探针Probe；将SP，BK，AS在PBS缓冲液中杂交成DP；
（2）将DP，HP1在金电极上恒温孵育；
（3）将Probe、HP2、氨苄青霉素溶液混合后滴加到修饰有HP1和DP的金电极上恒温孵育；
（4）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（3）中的电极；
（5）在含有10 mM H2O2的PBS缓冲液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电信号变化；
（6）根据氨苄青霉素标准溶液的电信号作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测液电信号计算待测液中氨苄青霉素的浓度。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）具体工艺为：将12 μL 灭菌水，4 μL 5×PBS，2 μL 1 μM Aptamer链和2 μL 1 μM Primer混合震荡，在95°C下孵育5min，缓慢冷却至室温，得到探针Probe；同时，将10 μL 灭菌水，4 μL 5×PBS， 2 μL 100 μMBK，SP，AS混合震荡，在95 °C下孵育5 min，缓慢冷却至室温，得到DP。
7.权利要求1所述的无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器在食品安全上检测氨苄青霉素的应用。
8.权利要求1所述的无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器在环境监测方面检测氨苄青霉素的应用。
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