CN111398389B - 一种dna纳米结构、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种DNA纳米结构、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用,涉及食源性致病菌检测领域。本发明通过滚环扩增反应合成稳定的DNA纳米结构,通过加载血红素作为电化学信号标签,以放大信号;单链DNA捕获探针通过Au‑S键修饰在Au电极表面;食源性致病菌特异性适配体和捕获探针在Au电极上形成双链DNA结构;适配体优先结合食源性致病菌,导致适配体‑捕获探针双链体解离,并释放捕获探针;游离捕获探针通过互补DNA序列与DNA纳米结构杂交;通过DPV法的电化学信号以定量测定食源性致病菌浓度。本发明简单、快速、易于操作、实验成本低、灵敏、特异性强,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及食源性致病菌检测技术领域,具体涉及一种DNA纳米结构、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用。
背景技术
由病原菌引起的传染病每年导致数百万人死亡和住院,并且是全世界主要的死亡原因之一。致病性细菌可以通过食物和饮用水等途径传播,对人类健康构成严重威胁,并造成严重经济损失。因此,在临床微生物学领域中建立快速、可靠和有效的病原菌检测方法至关重要。用于鉴定病原菌的标准培养和菌落计数方法需要几天才能准确检测;另外已经研发了几种基于核酸扩增(例如PCR)或免疫学反应(例如ELISA)的传统检测方法。然而,这些方法具有一些缺点,例如耗时且劳动强度大,并且其应用仍然受到限制。近年来,已经提出生物传感器作为检测和定量病原菌的方法来替代传统检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA纳米结构、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用,以解决目前现有食源性致病菌检测存在的诸多问题。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
本发明提供一种DNA纳米结构的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、退火
在T4 DNA连接酶缓冲液中,将5'-磷酸化线性模板与引物混合,将混合物加热后再冷却至室温,以形成环状模板-引物杂合体;
所述5'-磷酸化线性模板的核酸序列为5’-(PO4 3-)-ACCCGCCCTACCCAAAATATGCCCTCGGTTGTGGTATTATACGGCATTCCTCTCCGGACAACCCTCGCGGCATCTCGTCCACACTGCCTAAATTTTCCCA-3’;
所述引物的核酸序列为5’-TTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAAA-3’;
步骤二、连接
将环状模板-引物杂合体与T4 DNA连接酶混合,经孵育后以连接环状模板缺口;
步骤三、灭酶
经加热后以灭活T4 DNA连接酶;
步骤四、扩增
将上述得到的闭环模板-引物杂合体与dNTPs、Phi29 DNA聚合酶加入到滚环扩增反应缓冲液中;
步骤五、灭酶
经加热后以灭活Phi29 DNA聚合酶;
步骤六、保存
将上述得到的DNA纳米结构悬浮在TE缓冲液中,4℃保存。
作为优选的实施方式,步骤四中,所述滚环扩增反应缓冲液中包括:33mM Tris-HCl,10mM MgCl2,66mM KCl,1mM DTT,0.01%(v/v)Tween 20,pH 7.9。
本发明提供一种DNA纳米结构,该DNA纳米结构中具有多个重复的G-四链体单元。
本发明提供一种功能化Hemin/G-四链体DNAzyme,该功能化Hemin/G-四链体DNAzyme是采用一种DNA纳米结构制备的。
本发明提供一种功能化Hemin/G-四链体DNAzyme的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、将含有DNA纳米结构的TE缓冲液在90℃下处理1min,冷却至4℃,保持60min;
步骤二、将步骤一所得产物与Hemin溶液共同加入到Tris-HCl缓冲液中,37℃下孵育60min,以使Hemin包埋在DNA纳米结构的G-四链体单元中,形成功能化的DNA纳米结构,即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme;4℃以下保存。
本发明提供一种电化学适配体生物传感器体系,包括一种功能化Hemin/G-四链体DNAzyme和适配体修饰后的电极。
作为优选的实施方式,所述适配体修饰后的电极采用以下方法制备:
步骤一、Au电极预处理
将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光,再用食人鱼溶液处理后用超纯水洗涤,再用无水乙醇和超纯水依次超声处理,然后在H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描,直到获得Au氧化还原峰,最后用超纯水洗涤Au电极后用氮气干燥;
步骤二、将硫醇化的捕获探针CP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键;将适配体AP加热后冰浴,以折叠形成功能结构;
所述硫醇化的捕获探针CP的核酸序列为5’-(SH-C6)-AAATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCC-3’;
所述适配体AP的核酸序列为5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTT-3’;
步骤三、电极修饰
将硫醇化的捕获探针CP滴在预处理后的Au电极上,经孵育后将MCH铺在Au电极上,再经孵育后将适配体AP滴在Au电极上,经孵育后获得适配体修饰后的电极。
作为优选的实施方式,在步骤一、步骤二、步骤三之后,均采用超纯水洗涤Au电极表面3次。
本发明提供一种采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法,包括以下步骤:
步骤一、功能化Hemin/G-四链体DNAzyme的制备
(1)将含有DNA纳米结构的TE缓冲液在90℃下处理1min,冷却至4℃,保持60min;
(2)将步骤(1)所得产物与Hemin溶液共同加入到Tris-HCl缓冲液中,37℃下孵育60min,以使Hemin包埋在DNA纳米结构的G-四链体单元中,形成功能化的DNA纳米结构,即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme;4℃以下保存;
步骤二、适配体修饰后的电极的制备
(1)Au电极预处理
将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光,再用食人鱼溶液处理后用无水乙醇和超纯水依次超声处理,然后在H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描,直到获得Au氧化还原峰,最后用超纯水洗涤Au电极后用氮气干燥;
(2)将硫醇化的捕获探针CP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键;将适配体AP加热后冰浴,以折叠形成功能结构;
所述硫醇化的捕获探针CP的核酸序列为5’-(SH-C6)-AAATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCC-3’;
所述适配体AP的核酸序列为5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTT-3’;
(3)电极修饰
将硫醇化的捕获探针CP滴在预处理后的Au电极上,经孵育后将MCH铺在Au电极上,再经孵育后将适配体AP滴在Au电极上,经孵育后获得适配体修饰后的电极;
步骤三、靶标捕获
将步骤二得到的适配体修饰后的电极浸入到不同浓度的待测样品中进行孵育;
步骤四、信号标记
将步骤一得到的功能化Hemin/G-四链体DNAzyme滴加到步骤三经孵育后的电极上,经孵育后采用差分脉冲伏安法对食源性致病菌进行定量检测。
作为优选的实施方式,在步骤二(1)、(2)、(3)之后,均采用超纯水洗涤Au电极表面3次。
发明原理:
如图1A所示,本发明利用滚环扩增反应,在G-四链体序列编码的引物启动下制备了一种茧状的DNA纳米结构(RCA NCs),其中富含大量G-四链体重复单元。然后将RCA NCs与Hemin一起孵育形成过氧化物酶模拟的DNAzyme结构即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme,可以作为优越的电催化信号标签。
其中,Hemin即血红素(原卟啉IX)是与过氧化物酶类似的物质。它是类血红蛋白的活性中心,例如细胞色素、过氧化物酶、肌红蛋白和血红蛋白。Hemin具有特定的氧化还原特性,对H2O2、O2和硫化物等具有良好的催化还原作用。然而,由于Hemin的氧化自降解的化学性质,将其用作优良的氧化催化剂仍然是重大挑战。血红素分子在碱性水溶液中的聚集可以催化惰性二聚体的形成,而氧化性介质导致氧化淬灭反应,从而降低了其催化活性。因此,为克服这一缺点,可将Hemin固定在高表面积材料上,保持催化活性和稳定性,以改善其传感性能。
如图1B所示,硫醇化的捕获探针CP通过Au-S键固定在Au电极上。适配体AP(适配体AP是一种单链寡核苷酸序列,通过形成独特的二级结构和三级结构,对靶标分子产生高亲和力和特异性。与传统抗体相比,适配体AP具有稳定性好、体积小、无免疫原性和易于化学修饰的优点,可潜在地用于确定病原细菌)通过部分互补序列与硫醇化的捕获探针CP杂交成双链体结构,其中使用MCH封闭活性位点以减少非特异性吸附。当引入靶标大肠杆菌O157:H7后,适配体AP发生构象变化以特异性结合到大肠杆菌O157:H7的细胞膜蛋白表面,从而在Au电极上被释放出来。因此,在Au电极上的硫醇化的捕获探针CP通过这种反向链置换从原始杂交双链体中被暴露出来。此时,功能化Hemin/G-四链体DNAzyme可以通过互补序列与Au电极上暴露的硫醇化的捕获探针CP杂交,以捕获在Au电极表面,从而发挥信号标签的功能。该传感策略可以实现生物大分子的菌体靶标到寡核苷酸探针水平的转换,可以有效提高信号灵敏性。信号标签中具有过氧化物酶活性的DNAzyme结构即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme催化H2O2的电还原反应以产生非常强的电流信号,即可用于食源性致病菌的定量检测。
本发明的有益效果是:
本发明通过滚环扩增反应(RCA)产生的长链DNA在G-四链体序列编码的引物启动下组装成茧状的DNA纳米结构(RCA NCs),其中富含大量G-四链体重复单元。这样的组装方式不依赖于Watson-Crick相互作用,也不需要特定的DNA序列,还可以对RCA进行编程,以生成各种功能性DNA纳米结构。并且,所获得的茧状DNA纳米结构(RCA NCs)可以增加电化学表面积,从而增强离子渗透到电极中并加速电化学转移动力学。
本发明首次将RCA NCs与Hemin一起孵育形成过氧化物酶模拟的DNAzyme结构即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme,使用血红素Hemin负载DNA纳米结构作为优越的电催化信号标签,开发了一种灵敏且选择性良好的电化学适配体生物传感器体系,用于食源性致病菌的定量检测。本发明的具有氧化物酶模拟的DNAzyme结构即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme的制备独立于检测程序之外,不仅可以简化实验过程,还可以提高Hemin的负载以极大的发挥其信号放大能力。通过RCA获得的具有大量G-四链体重复单元的超长链DNA纳米结构可以积累更多的Hemin,这可以诱导显著改善的电化学信号,以满足高灵敏度分析的要求。
本发明的检测策略将生物大分子检测转变为核酸水平检测,而无需复杂的检测程序,例如靶标细菌的核酸提取,具有简单、快速、易于操作、实验成本低、灵敏、特异性强等优点,本发明的的电化学适配体生物传感器体系可以扩展到各种病原细菌的检测,具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的制备流程和检测原理图。其中,图1A为本发明的制备流程图,图1B为本发明的检测原理图。
图2为实施例5中电化学适配体传感界面表征的EIS图和CV图。其中,图2A为电化学适配体传感界面表征的EIS图,图2B为电化学适配体传感界面表征的CV图。
图3为实施例4中DPV检测不同浓度大肠杆菌O157:H7(0~107CFU/mL)下的电流强度关系图。
图4为实施例4中不同浓度大肠杆菌O157:H7的DPV电流强度与大肠杆菌O157:H7的浓度对数的线性关系图。
图5为试验例2中本发明的电化学适配体生物传感器体系对浓度为105CFU/mL的不同菌株进行DPV检测的电流强度对比图。
具体实施方式
本发明的一种DNA纳米结构的制备方法,主要是通过滚环扩增反应合成DNA纳米结构(RCA NCs),包括以下步骤:
步骤一、退火
在T4 DNA连接酶缓冲液(40mM Tris-HCl,10mM MgCl2,10mM DTT,0.5mM ATP,pH7.8)中,将5'-磷酸化线性模板与引物混合,将混合物加热后再冷却至室温,以形成环状模板-引物杂合体;
其中,5'-磷酸化线性模板的核酸序列为5’-(PO4 3-)-ACCCGCCCTACCCAAAATATGCCCTCGGTTGTGGTATTATACGGCATTCCTCTCCGGACAACCCTCGCGGCATCTCGTCCACACTGCCTAAATTTTCCCA-3’;
其中,引物的核酸序列为5’-TTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAAA-3’;
步骤二、连接
将环状模板-引物杂合体与T4 DNA连接酶混合,经孵育后以连接环状模板缺口;
步骤三、灭酶
经加热后以灭活T4 DNA连接酶;
步骤四、扩增
将上述得到的闭环模板-引物杂合体与dNTPs、Phi29 DNA聚合酶加入到滚环扩增反应缓冲液(33mM Tris-HCl,10mM MgCl2,66mM KCl,1mM DTT,0.01%(v/v)Tween 20,pH7.9)中;
步骤五、灭酶
经加热后以灭活Phi29 DNA聚合酶;
步骤六、保存
将上述得到的DNA纳米结构悬浮在TE缓冲液中,4℃保存。
采用上述制备方法获得的DNA纳米结构中具有大量重复的G-四链体单元。
采用上述获得的DNA纳米结构制备一种功能化Hemin/G-四链体DNAzyme,主要包括以下步骤:
步骤一、将含有DNA纳米结构的TE缓冲液在90℃下处理1min,冷却至4℃,保持60min;
步骤二、将步骤一所得产物与Hemin(血红素)溶液共同加入到Tris-HCl缓冲液中,37℃下孵育60min,以使Hemin(血红素)包埋在DNA纳米结构的G-四链体单元中,形成功能化的DNA纳米结构,即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme;4℃以下保存。具有过氧化物酶模拟的DNAzyme活性的RCA NCs可以催化底物H2O2的还原,从而产生电化学信号。
本发明的一种电化学适配体生物传感器体系,包括上述获得的功能化Hemin/G-四链体DNAzyme和适配体修饰后的电极。
其中,适配体修饰后的电极的制备方法具体包括以下步骤:
步骤一、Au电极预处理
在修饰电极之前,将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光,以获得光滑的表面;再用食人鱼溶液(H2SO4/H2O2,体积比为3:1)处理后,并用超纯水彻底洗涤以去除其表面上的有机物,再用无水乙醇和超纯水依次超声处理以除去杂质,然后在H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描,直到获得典型的稳定Au氧化还原峰,最后用超纯水洗涤Au电极后用高纯度氮气干燥;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
步骤二、将硫醇化的捕获探针CP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键;将适配体AP加热后立即冰浴,以折叠形成功能结构;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
其中,硫醇化的捕获探针CP的核酸序列为5’-(SH-C6)-AAATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCC-3’;
其中,适配体AP的核酸序列为5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTT-3’。
步骤三、电极修饰
为了制造电化学传感界面,首先将硫醇化的捕获探针CP滴在预处理后的Au电极上,经孵育后将MCH铺在Au电极上,再经孵育后将适配体AP滴在Au电极上,经孵育后获得适配体修饰后的电极;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
本发明的一种采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法,主要包括以下步骤:
步骤一、功能化Hemin/G-四链体DNAzyme的制备
(1)将含有DNA纳米结构的TE缓冲液在90℃下处理1min,冷却至4℃,保持60min;
(2)将步骤(1)所得产物与Hemin(血红素)溶液共同加入到Tris-HCl缓冲液中,37℃下孵育60min,以使Hemin(血红素)包埋在DNA纳米结构的G-四链体单元中,形成功能化的DNA纳米结构,即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme;4℃以下保存。具有过氧化物酶模拟的DNAzyme活性的RCA NCs可以催化底物H2O2的还原,从而产生电化学信号。
步骤二、适配体修饰后的电极的制备
(1)Au电极预处理
在修饰电极之前,将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光,以获得光滑的表面;再用食人鱼溶液(H2SO4/H2O2,体积比为3:1)处理后,并用超纯水彻底洗涤以去除其表面上的有机物,再用无水乙醇和超纯水依次超声处理以除去杂质,然后在H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描,直到获得典型的稳定Au氧化还原峰,最后用超纯水洗涤Au电极后用高纯度氮气干燥;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
(2)将硫醇化的捕获探针CP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键;将适配体AP加热后立即冰浴,以折叠形成功能结构;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
其中,硫醇化的捕获探针CP的核酸序列为5’-(SH-C6)-AAATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCC-3’;
其中,适配体AP的核酸序列为5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTT-3’。
(3)电极修饰
为了制造电化学传感界面,首先将硫醇化的捕获探针CP滴在预处理后的Au电极上,经孵育后将MCH铺在Au电极上,再经孵育后将适配体AP滴在Au电极上,经孵育后获得适配体修饰后的电极;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
步骤三、靶标捕获
将步骤二得到的适配体修饰后的电极浸入到不同浓度的待测样品中进行孵育;
步骤四、信号标记
将步骤一得到的功能化Hemin/G-四链体DNAzyme滴加到步骤三经孵育后的电极上,经孵育后采用差分脉冲伏安法(DPV)对食源性致病菌进行定量检测。DPV测量在含有8mMH2O2的PBS(10mM,pH 7.0)中进行,振幅和脉冲周期分别为50mV和0.5s,根据食源性致病菌在不同浓度下的电流值得到DPV工作曲线,对待测样品中食源性致病菌进行定量检测。
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1DNA纳米结构的合成与制备
(1)退火
在T4 DNA连接酶缓冲液(40mM Tris-HCl,10mM MgCl2,10mM DTT,0.5mM ATP,pH7.8)中,将0.3μM的5'-磷酸化线性模板与0.6μM的引物混合,将混合物在90℃下加热5min后,在3h内逐渐冷却至室温,以形成环状模板-引物杂合体;
5'-磷酸化线性模板的核酸序列为5’-(PO4 3-)-ACCCGCCCTACCCAAAATATGCCCTCGGTTGTGGTATTATACGGCATTCCTCTCCGGACAACCCTCGCGGCATCTCGTCCACACTGCCTAAATTTTCCCA-3’;
引物的核酸序列为5’-TTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAAA-3’。
(2)连接
将环状模板-引物杂合体与10U的T4 DNA连接酶混合,在16℃下孵育16h,以连接环状模板缺口。
(3)灭酶
在65℃下加热10min以灭活T4 DNA连接酶。
(4)扩增
将上述得到的2mM的闭环模板-引物杂合体与2mM的dNTPs、0.1U/μL的Phi29 DNA聚合酶加入到滚环扩增反应缓冲液(33mM Tris-HCl,10mM MgCl2,66mM KCl,1mM DTT,0.01%(v/v)Tween 20,pH 7.9)中。
(5)灭酶
在65℃下加热10min以灭活Phi29 DNA聚合酶。
(6)保存
将获得的含有大量重复的G-四链体单元的RCA NCs悬浮在TE缓冲液中,并保存在4℃下直至使用。
实施例2RCA NCs的Hemin/G-四链体DNAzyme功能化
(1)将25μL含有RCA NCs的TE缓冲液在90℃下处理1min,冷却至4℃,保持60min。
(2)将步骤(1)所得产物与100μM的Hemin(血红素)溶液共同加入到50μL的Tris-HCl缓冲液中,37℃下孵育60min,以使Hemin(血红素)包埋在RCA NCs的G-四链体单元中,形成功能化的RCA NCs,即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme。
(3)将制备的功能化Hemin/G-四链体DNAzyme储存在4℃以下。具有过氧化物酶模拟的DNAzyme活性的RCA NCs可以催化底物H2O2的还原,从而产生电化学信号。
实施例3适配体修饰后的电极的制备
(1)Au电极预处理
在修饰电极之前,将Au电极在麂皮垫上用0.05μm氧化铝浆料抛光,以获得光滑的表面;再用食人鱼溶液(H2SO4/H2O2,体积比为3:1)处理30min后,并用超纯水彻底洗涤以去除其表面上的有机物,再用无水乙醇和超纯水依次超声处理5min以除去杂质,然后在0.5M的H2SO4溶液中以100mV/s的扫描速率对Au电极进行循环电位扫描(-0.2~1.4V),直到获得典型的稳定Au氧化还原峰,最后用超纯水洗涤Au电极后用高纯度氮气干燥;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
(2)将硫醇化的捕获探针CP与1mM的TCEP在室温下孵育20min以减少交联的二硫键;将适配体AP在90℃下加热3min后立即冰浴,以折叠形成功能结构;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
其中,硫醇化的捕获探针CP的核酸序列为5’-(SH-C6)-AAATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCC-3’;
其中,适配体AP的核酸序列为5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTT-3’。
(3)电极修饰
为了制造电化学传感界面,首先将10μL、0.2μM的硫醇化的捕获探针CP滴在预处理后的Au电极上,并在25℃下孵育2h,然后将5μL、0.6μM的MCH铺在Au电极上,并在25℃下孵育1h以封闭未结合的位点,最后将10μL、2μM的适配体AP滴在Au电极上,经孵育后获得适配体修饰后的电极;采用超纯水洗涤Au电极表面3次,以去除未结合的物质。
实施例4大肠杆菌O157:H7的检测
(1)DNA纳米结构的合成与制备
同实施例1。
(2)功能化Hemin/G-四链体DNAzyme的制备
同实施例2。
(3)适配体修饰后的电极的制备
同实施例3。
(4)靶标捕获
将步骤(3)得到的适配体修饰后的电极浸入到不同浓度的待测样品中,并在37℃下孵育60min。
(5)信号标记
将步骤(2)得到的10μL的功能化Hemin/G-四链体DNAzyme滴加到步骤(4)经孵育后的电极上,并在37℃下孵育40min,采用差分脉冲伏安法(DPV)对大肠杆菌O157:H7进行定量检测。DPV测量在含有8mM H2O2的PBS(10mM,pH 7.0)中进行,振幅和脉冲周期分别为50mV和0.5s,根据大肠杆菌O157:H7在不同浓度下的电流值得到DPV工作曲线,对待测样品中大肠杆菌O157:H7进行定量检测。
DPV信号与大肠杆菌O157:H7浓度(0~107CFU/mL)之间的灵敏度对应关系如图3所示。从图3中可以观察到,氧化峰值电流随着大肠杆菌O157:H7浓度的增加而增加。由图4可知,DPV响应的峰值电流强度与大肠杆菌O157:H7浓度(对数标度)在101和106CFU/mL之间存在良好的线性关系(R2=0.9843)。回归方程为Y=6.993X-2.142,其中Y和X分别代表电流强度和大肠杆菌浓度。由此证明,本发明可用于未知待测样品中食源性致病菌浓度的检测。
实施例5电化学适配体传感界面的表征
电化学适配体传感界面的表征包括循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱法(EIS)。采用传统的三电极系统,其中以Au电极作为工作电极,以铂丝作为辅助电极,以Ag/AgCl电极作为参比电极。CV和EIS测量的电解液为含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-的PBS(10mM,pH 7.0)。CV测量的电位范围为-0.2V~0.6V,扫描速率为50mV/s。EIS测量的频率范围为0.05Hz~100kHz,幅度为5mV。
如图2A所示,修饰电极EIS的奈奎斯特,裸Au电极(曲线a)的Rct较低,表明Au电极表面具有良好的电荷转移能力。通过Au-S键将硫醇化的捕获探针CP修饰到Au电极上后,阻抗电弧的直径显着增大(曲线b),表明硫醇化的捕获探针CP已成功固定到Au电极表面,从而导致了电荷转移限制。将Au电极与MCH一起孵育后,半圆的直径继续增大(曲线c),表明MCH封闭了Au电极的未结合位点并降低了电子转移能力。在将适配体AP组装到Au电极上之后,电弧直径显着增加(曲线d),表明适配体AP通过互补碱基成功结合到硫醇化的捕获探针CP上。将目标大肠杆菌O157:H7引入Au电极后,电弧直径变小(曲线e),表明通过捕获靶标,适配体AP成功地从Au电极表面脱离,从而增加了电子探针在界面处的扩散和电子传递。将功能化的RCA NCs添加到Au电极后,电弧的直径明显变大(曲线f),表明功能化的RCA NCs与硫醇化的捕获探针CP有效耦合,具有长链DNA的RCA NCs进一步阻碍了电荷转移过程。
如图2B所示,从CV测量获得的结果与EIS的结果一致。使用裸Au电极观察到一对[Fe(CN)6]3-/4-的典型氧化还原峰(曲线a),表明电化学适配体传感界面具有高效的电子传输能力。硫醇化的捕获探针CP修饰后,在Au电极表面形成带负电荷的DNA单层,结果显示,氧化还原峰显著降低(曲线b)。当MCH被阻断时,观察到氧化还原峰进一步降低(曲线c)。在适配体AP修饰Au电极表面后,带负电荷的DNA磷酸盐主链进一步阻碍了电子介体向Au电极表面的扩散,氧化还原峰的电流继续减小(曲线d)。当引入大肠杆菌O157:H7时,适配体AP捕获了目标并从Au电极表面脱离,导致电活性位点暴露,因此氧化还原峰的电流增加(曲线e)。当将功能化的RCA NCs引入电化学适配体传感界面时,电子传输受到极大阻碍,氧化还原峰显著降低(曲线f)。
上述测试结果表明:本发明的电化学适配体生物传感器体系已经按照工作机制的设计发挥功能。
试验例1
为了评估本发明的电化学适配体生物传感器体系对实际样品检测的适用性,使用加标灭菌牛奶样品进行回收实验,该样品中添加了密度为103CFU/mL、104CFU/mL和105CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。
检测结果如表1所示,本发明的检测方法的回收率从85±3.9%到104±3.7%。表明,本发明的电化学适配体生物传感器体系可为初步的实际应用提供可行和可靠的食源性致病菌测量。
表1
初始值(CFU/mL) | 添加值(CFU/mL) | 检测值(CFU/mL) | 回收率±RSD(%) |
0 | 1×10<sup>3</sup> | 0.85×10<sup>3</sup> | 85±3.9 |
0 | 1×10<sup>4</sup> | 0.92×10<sup>4</sup> | 92±2.9 |
0 | 1×10<sup>5</sup> | 1.04×10<sup>5</sup> | 104±3.7 |
试验例2
使用大肠杆菌O157:H7(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Sal.t)、金黄色葡萄球菌(S.aur)和单核细胞增生性李斯特菌(List.m)测试了本发明的电化学适配体生物传感器体系的DPV响应,以评估该检测方法的特异性。
结果如图5所示,从图中可以看出,105CFU/mL大肠杆菌O157:H7引发了强烈的DPV响应电流强度,而105CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌、105CFU/mL金黄色葡萄球菌和105CFU/mL单核细胞增生李斯特菌,显示的电流强度不大,类似于空白对照(PBS)。从这些数据可以看出,本发明的电化学适配体生物传感器体系对食源性致病菌大肠杆菌O157:H7具有很高的特异性。
本发明公开了一种DNA纳米结构、电化学适配体生物传感器体系及其制备方法和应用,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
Claims (4)
1.一种采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法,用于非疾病诊断目的,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、功能化Hemin/G-四链体DNAzyme的制备
(1)DNA纳米结构的制备
①退火
在T4 DNA连接酶缓冲液中,将5'-磷酸化线性模板与引物混合,将混合物加热后再冷却至室温,以形成环状模板-引物杂合体;
所述5'-磷酸化线性模板的核酸序列为5’-(PO4 3-)-ACCCGCCCTACCCAAAATATGCCCTCGGTTGTGGTATTATACGGCATTCCTCTCCGGACAACCCTCGCGGCATCTCGTCCACACTGCCTAAATTTTCCCA-3’;
所述引物的核酸序列为5’-TTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGAAAA-3’;
②连接
将环状模板-引物杂合体与T4 DNA连接酶混合,经孵育后以连接环状模板缺口;
③灭酶
经加热后以灭活T4 DNA连接酶;
④扩增
将得到的闭环模板-引物杂合体与dNTPs、Phi29 DNA聚合酶加入到滚环扩增反应缓冲液中;
⑤灭酶
经加热后以灭活Phi29 DNA聚合酶;
⑥保存
将得到的DNA纳米结构悬浮在TE缓冲液中,4℃保存;
(2)将含有DNA纳米结构的TE缓冲液在90℃下处理1min,冷却至4℃,保持60min;
(3)将步骤(2)所得产物与Hemin溶液共同加入到Tris-HCl缓冲液中,37℃下孵育60min,以使Hemin包埋在DNA纳米结构的G-四链体单元中,形成功能化的DNA纳米结构,即功能化Hemin/G-四链体DNAzyme;4℃以下保存;
步骤二、适配体修饰后的电极的制备
(1)Au电极预处理
将Au电极在麂皮垫上用氧化铝浆料抛光,再用食人鱼溶液处理后用无水乙醇和超纯水依次超声处理,然后在H2SO4溶液中对Au电极进行循环电位扫描,直到获得Au氧化还原峰,最后用超纯水洗涤Au电极后用氮气干燥;
(2)将硫醇化的捕获探针CP与TCEP在室温下孵育以减少交联的二硫键;将适配体AP加热后冰浴,以折叠形成功能结构;
所述硫醇化的捕获探针CP的核酸序列为5’-(SH-C6)-AAATCCGTCACACCTGCTCTACGGCGCTCCCAACAGGCC-3’;
所述适配体AP的核酸序列为5’-ATACGGGAGCCAACACCATAATATGCCGTAAGGAGAGGCCTGTTGGGAGCGCCGTAGAGCAGGTGTGACGGATTT-3’;
(3)电极修饰
将硫醇化的捕获探针CP滴在预处理后的Au电极上,经孵育后将MCH铺在Au电极上,再经孵育后将适配体AP滴在Au电极上,经孵育后获得适配体修饰后的电极;
步骤三、靶标捕获
将步骤二得到的适配体修饰后的电极浸入到不同浓度的待测样品中进行孵育;
步骤四、信号标记
将步骤一得到的功能化Hemin/G-四链体DNAzyme滴加到步骤三经孵育后的电极上,经孵育后采用差分脉冲伏安法对食源性致病菌进行定量检测。
2.如权利要求1所述的一种采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法,其特征在于,步骤一④中,所述滚环扩增反应缓冲液中包括:33mM Tris-HCl,10mMMgCl2,66mM KCl,1mM DTT,0.01%v/v Tween 20,pH 7.9。
3.如权利要求1所述的一种采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法,其特征在于,所述DNA纳米结构中具有多个重复的G-四链体单元。
4.如权利要求1所述的一种采用电化学适配体生物传感器体系检测食源性致病菌的方法,其特征在于,在步骤二(1)、(2)、(3)之后,均采用超纯水洗涤Au电极表面3次。
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