CN114113267B

CN114113267B - 基于TdT和G4/hemin模拟酶扩增技术的适配体传感器的构建方法及应用

Info

Publication number: CN114113267B
Application number: CN202111621532.3A
Authority: CN
Inventors: 邹丽娜; 吕瑞丽; 王寒潇
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114113267A

Abstract

本发明属于生物分析领域，涉及氨苄青霉素的检测，特别是指基于TdT和G4/hemin模拟酶扩增技术的适配体传感器的构建方法及应用。以一种新型的Au NPs@SnIn₄S₈‑GR敏化结构作为光电活性材料获得了强烈的基础光电流；目标物氨苄青霉素存在时，由链置换得到P1引入到电极表面后，在TdT和hemin存在下形成大量的G4/hemin；随后，具有辣根类过氧化酶活性的G4/hemin催化H₂O₂氧化4‑CN在修饰电极表面生成4‑CD沉淀，严重阻碍了电子转移，有效抑制了光电流输出，通过测量光电流信号即可实现对氨苄青霉素的定量分析；灵敏度高，稳定性好，选择性好，在生物分析和环境监测中具有很好的应用前景。

Description

基于TdT和G4/hemin模拟酶扩增技术的适配体传感器的构建方法及应用

技术领域

本发明属于生物分析领域，涉及氨苄青霉素的检测，特别是指基于TdT和G4/hemin模拟酶扩增技术的适配体传感器的构建方法及应用。

背景技术

氨苄青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，可治疗多种细菌感染，经常被用于畜牧业和农业，因此造成动物源性食品和环境中氨苄青霉素残留。长期接触氨苄青霉素残留会增强机体内细菌的耐药性，加重对肝肾等功能的损害。因此，需要建立一种简单、灵敏度和特异性高的方法用于检测氨苄青霉素。

专利201910874445.5中公开了一种无酶检测氨苄青霉素的电化学生物传感器及其制备方法和应用，该专利基于目标诱导的核酸适配体构象变化及催化发夹自组装扩增（CHA）和链置换策略检测氨苄青霉素；专利201911010589.2公开了基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器，该传感器处理Au，用HP修饰，发夹探针H1和发夹探针H2混合均匀滴到电极表面，HCR反应发生，然后TdT缓冲液、dATP、dGTP、TdT，混合均匀，滴于电极表面，TdT扩增反应发生，再依次滴加Pb²⁺、hemin、DAB、H₂O₂标记为IP/G4/HCR/Au，用于EIS检测。在传感器制备过程中，改变Pb²⁺浓度探究所制备的一系列传感器对电化学阻抗信号的影响。与其他检测手段相比，本申请的光电化学(PEC)适配体传感器由于具有快速响应，操作简单，背景噪声低，设备便宜等诸多优点而被广泛用于环境监测和生物分析。在PEC适配体传感器的构建中，光电活性材料作为基底的选择至关重要，对传感器的分析性能有很大的影响，光电转换效率高的敏化结构可以提高PEC适配体传感器的性能。同时在适配体传感器的实际应用中，被测物如抗生素及核酸等往往含量很低，通常需要信号放大技术的参与以提高检测的灵敏度。所以如何制备得到理想的光电活性材料、设计高灵敏度的扩增放大策略具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种基于TdT和G4/hemin模拟酶扩增技术的适配体传感器的构建方法及应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

基于TdT和G4/hemin模拟酶扩增技术的适配体传感器的构建方法，步骤如下：

（1）DNA链的预处理

设计并合成适配体链Apt，碱基序列为5’-NH₂-(CH₂)₆-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’，引物链P1，碱基序列为5’-GCGTATACAACCGCCCGC-3’，S1，碱基序列为5’-GGCGGTTGTATACGC-(CH₂)₆-SH-3’，使用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，含有 10 mM Tris-base，1 mM EDTA和10 mM KCl）将适体链配制为所需浓度，在S1中加入100 mM TCEP，以剪切S-S键，将DNA链在95℃下变性5 min，冷却至室温，保存于4℃条件下备用。

（2）Au NPs@SnIn₄S₈-GR的制备

将10 mg GO分散在70 mL超纯水中，0.6 mmol SnCl₄·5H₂O溶于2 mL CH₃COOH后加入以上溶液，加入2.4 mmol InCl₃·4H₂O和0.021 mmol SDBS（十二烷基苯磺酸钠），超声10min，搅拌30 min，然后加入4.8 mmol TAA（硫代乙酰胺），搅拌30 min，倒入反应釜180℃反应12 h，冷却至室温，离心，洗涤，烘干后得到SnIn₄S₈-GR。将30 mg SnIn₄S₈-GR溶于30 mL超纯水中，加入375 μL柠檬酸钠（0.01 g mL^-1），搅拌加热至沸腾，快速加入500 μL氯金酸（1%wt），沸腾10 min后关闭热源，继续搅拌冷却至室温。离心，洗涤，烘干。取3 mg Au NPs@SnIn₄S₈-GR分散到1 mL超纯水中备用。

（3）复合物MBs-Apt-P1的制备

通过酰胺键将Apt固定在MBs上：取100 μL MBs，磁分离后用200 μL PBS buffer（pH 7.0，含有0.1 M NaH₂PO₄，0.1 M Na₂HPO₄和0.1 M NaCl）洗涤3次。在200 μL PBS中加入10 mg NHS和20 mg EDC并与MBs混合，37℃下振荡30 min以活化MBs表面的COOH，PBS 洗涤后加入500 μL浓度为1 μM的Apt，37℃振荡过夜反应。反应结束后磁分离除去多余的Apt得到MBs-Apt，然后将500 μL浓度为1 μM的P1与MBs-Apt溶液混合，在37℃下振荡过夜。磁分离洗涤后，将制得的MBs-Apt-P1重新分散于250 μL PBS中，保存在4℃条件下备用。

（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳

首先制备12%的聚丙烯酰胺凝胶。即将超纯水，5×TBE，丙烯酰胺 (30%)，TEMED 和APS (10%)按比例混匀。然后将P1和G-rich ssDNA（均为7 μL， 5 μM）分别与2 μL 6×Loading buffer及2 μL Sybr gold混合，再分别注入到凝胶胶孔中。整个电泳实验在1×TBE缓冲溶液中进行，电泳仪电压为80 V，电泳时间为80 min。实验结束后，采用UVP凝胶成像系统拍摄凝胶图像。

（5）比色法验证G4/hemin的类过氧化酶活性

验证了 G4/hemin 在 H₂O₂存在下对过氧化物酶底物TMB的催化活性。将5 μL氨苄青霉素（20 nM）与5 μL MBs-Apt-P1混合，37℃下反应75 min以发生链置换反应置换出P1。磁分离后，在10 μL上清液中加入0.5 μL浓度为20 U μL^-1的TdT，2 μL TdT buffer，3 μL浓度为10 mM的dATP，4.5 μL浓度为10 mM的dGTP，混匀后37℃孵育1 h。然后加入1 μL浓度为21 μM的hemin，避光下37℃孵育35 min形成G4/hemin。将21 μL浓度为5 mM的TMB和H₂O₂加入到上述溶液中，室温孵育20 min后用紫外可见分光光度计检测。

（6）适配体传感器的制备及氨苄青霉素检测

将10 μL Au NPs@SnIn₄S₈-GR (3 mg mL^-1) 滴涂在干净的ITO电极表面，在红外灯下烘干。随后，通过Au-S键将S1固定到电极表面，即将10 μL浓度为1 μM的S1滴在电极表面，4℃下孵育过夜，用Tris-HCl缓冲液洗涤除去多余S1。为减少电极表面的非特异性吸附，将10 μL浓度为1 mM的MCH在电极表面25℃孵育30 min。在复合物MBs-Apt-P1溶液中加入不同浓度氨苄青霉素标准溶液，37℃震荡75 min后，取上清液P1（10 μL，1 μM）滴到电极表面，37℃孵育1 h。洗涤后滴加0.5 μL浓度为20 U μL^-1的TdT，2 μL TdT buffer，3 μL浓度为10 mM的dATP，4.5 μL浓度为10 mM的dGTP，混匀后37℃孵育1 h得到G-rich ssDNA。

洗涤后加入1 μL浓度为21 μM的hemin（血红素），避光下37℃孵育35 min 在电极表面形成G4/hemin。将21 μL浓度为2 mM的4-CN和H₂O₂滴加到电极上，室温孵育20 min。在4mL含有0.1 M AA的PBS（pH 7.0，10 mM）中测得光电流值，建立光电流值与氨苄青霉素浓度之间的定量关系。

（7）样品中氨苄青霉素含量的检测

将样品预处理后，按照上述步骤（6）测得光电流值，结合光电流值与氨苄青霉素浓度之间的回归方程计算待测样品中所含氨苄青霉素的浓度。

本申请传感器的工作原理为：

首先在ITO电极上修饰了优异的Au NPs@SnIn₄S₈-GR材料，得到了理想的光电流信号，这是由SnIn₄S₈自身的可见光吸收能力及能带间隙决定的。单独的SnIn₄S₈在可见光区表现出强烈的吸收，同时SnIn₄S₈也具有较窄的能带，为1.95 eV。在可见光照射下，SnIn₄S₈的VB的电子跃迁到CB，产生光生电子空穴对，VB上的空穴被给电子体AA捕获，CB上的电子流向电极，从而产生光电流信号。P1通过与S1杂交固定到电极表面，与TdT反应后生成大量长短不同的富G序列，能够和hemin形成更多的G4/hemin，从而提供较多的模拟酶催化4-CN与H₂O₂的反应，在电极表面产生生物催化沉淀，电极上的绝缘层可以极大地改变界面电子转移特征，抑制固液界面上的电子转移，阻碍光对Au NPs@SnIn₄S₈-GR的照射，阻碍AA的扩散，从而影响光电流。

综上，PEC生物传感器的超灵敏性归因于以下因素：（1）具有优异的光电转换效率的Au NPs@SnIn₄S₈-GR提供了理想的初始电流；（2）引入了具有优秀信号放大能力的TdT；（3）MECP反应可以有效地减弱目标物存在时的光电流响应。

本发明具有以下有益效果：

本发明基于TdT实现信号放大，结合Au NPs@SnIn₄S₈-GR敏化结构的高光电流转换效率和G4/hemin催化反应，设计了一种用于氨苄青霉素检测的无标记PEC适配体传感器。AuNPs@SnIn₄S₈-GR敏化结构表现出了非凡的光电性能，提供了极大的初始光电流。G4/hemin催化反应得到的4-CD沉淀物可有效猝灭敏化结构的光电流强度。将TdT辅助信号放大策略与生物催化沉淀反应相结合，显著地提高了传感器的检测灵敏度，为氨苄青霉素的检测开辟了新的途径，并在灵敏检测其他分析物方面显示出相当大的潜力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的检测原理示意图。

图2为SnIn₄S₈（a），SnIn₄S₈-GR（b）和Au NPs@ SnIn₄S₈-GR（c）的XRD图谱。

图3为SnIn₄S₈（A），SnIn₄S₈-GR（B）和Au NPs@ SnIn₄S₈-GR（C）的SEM图谱。

图4A为G-rich ssDNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征及H₂O₂ + TMB（a），泳道1:marker，泳道2: P1，泳道3: G-rich ssDNA；图4B为G4/hemin + H₂O₂ + TMB （b）在HAC-NaAC缓冲溶液（pH 4.0）中的紫外-可见光谱。

图5为用于表征TdT介导的延伸产物P1+TdT (a)和P1+TdT+K⁺ (b)的圆二色谱图。

图6为不同修饰材料和电极组装过程的表征；其中（A）EIS图和（B）光电流响应曲线：ITO（a），ITO/SnIn₄S₈（b），ITO/SnIn₄S₈-GR（c）和ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR（d）；（C）EIS图和（D）光电流响应曲线：ITO（a），ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR（b），ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR/S1（c），ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR/S1/MCH（d），ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR/S1/MCH/P1（e），ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR/S1/MCH/P1/G4/hemin（f）和ITO/Au NPs@ SnIn₄S₈-GR/S1/MCH/G4/hemin/4-CN（g），不同电极的光电流信号均在0.00V偏置电位下测得。

图7为本申请构建传感器的PEC机制及ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR（a）和ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR/S1/MCH/G4/hemin/4-CN（b）的光电流响应曲线图，不同电极的光电流信号均在0.00V偏置电位下测得。

图8为SnIn₄S₈的紫外-可见漫反射光谱（A）和SnIn₄S₈的Tacus曲线（B）。

图9为实验参数优化图，其中（A）外加电压优化；（B）S1浓度优化；（C）AMP和MBs-Apt-P1结合时间的优化；（D）P1链延长时间的优化；（E）G4/hemin形成时间的优化和（F）MECP反应时间的优化（A到F中误差棒均为三次平行实验的标准偏差）。

图10为传感器的性能检测图，其中（A）适配体传感器对5 fM、10 fM、30 fM、300fM、1 pM、10 pM、100 pM、1 nM、10 nM、30 nM、100 nM和1 μM AMP的PEC响应曲线；（B）光电流与目标物AMP 浓度的对数的线性拟合曲线（误差棒为三次平行测定结果的标准偏差）；（C）PEC适配体传感器对不同干扰物 (1 μM) 以及干扰物与AMP的混合物 (10 nM) 的光电信号；（D）PEC适配体传感器ITO/Au NPs@SIS-GR（a）和ITO/Au NPs@SIS-GR/S1/MCH/G4/hemin/4-CN（b）在连续10次开/关光照下的光电响应曲线（AMP 为 10 nM）。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

（1）DNA链的预处理

设计并合成适配体链Apt，碱基序列为5’-NH₂-(CH₂)₆-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’，引物链P1，碱基序列为5’-GCGTATACAACCGCCCGC-3’，S1，碱基序列为5’-GGCGGTTGT ATACGC-(CH₂)₆-SH-3’，使用10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0, 含有10 mM Tris-base, 1 mM EDTA和10 mM KCl）将适体链配制为所需浓度，在S1中加入100 mM TCEP，以剪切S-S键，将DNA链在95℃下变性5 min，冷却至室温，保存于4℃条件下备用。

（2）Au NPs@SnIn₄S₈-GR的制备

将10 mg GO分散在70 mL超纯水中, 0.6 mmol SnCl₄·5H₂O溶于2 mL CH₃COOH后加入以上溶液，加入2.4 mmol InCl₃·4H₂O和0.021 mmol SDBS（十二烷基苯磺酸钠），超声10 min，搅拌30 min，然后加入4.8 mmol TAA（硫代乙酰胺），搅拌30 min，倒入反应釜180℃反应12 h，冷却至室温，离心，洗涤，烘干后得到SnIn₄S₈-GR。将30 mg SnIn₄S₈-GR溶于30 mL超纯水中，加入375 μL柠檬酸钠（0.01 g mL^-1），搅拌加热至沸腾，快速加入500 μL氯金酸（1% wt），沸腾10 min后关闭热源，继续搅拌冷却至室温。离心，洗涤，烘干。取3 mg Au NPs@SnIn₄S₈-GR分散到1 mL超纯水中备用。合成材料的晶相信息通过XRD图谱如图2所示进行研究。原始SnIn₄S₈的衍射峰位于2θ=23.35°、27.50°、33.33°、43.74°和47.80°（曲线a），分别对应于立方相 SnIn₄S₈的（220）、（311）、（400）、（333）和（440）晶面（PDF # 42-1305）。此外，未检测到杂质峰，表明SnIn₄S₈纯度高。在SnIn₄S₈-GR和Au NPs@SnIn₄S₈-GR复合材料中，除了SnIn₄S₈的衍射峰外，新的衍射峰出现在2θ=26.46°和38.30°、64.50°、77.40°（曲线b，曲线c），对应于GR的（002）面和Au的（111）、（220）和（311）面（PDF # 04-783）。XRD结果表明AuNPs@SnIn₄S₈-GR的合成是成功的。

如图3所示，观察了SnIn₄S₈和Au NPs@SnIn₄S₈-GR的微观形貌，通过EDS能谱确定了Au NPs@SnIn₄S₈-GR的元素组成。从图3A可以看出，原始的SnIn₄S₈是尺寸相对较小的不规则片状结构。在GR和Au NPs修饰后，原始SnIn₄S₈的形态没有被破坏（图3B）。而且由于GR的存在，原本聚合的SnIn₄S₈变得相对分散。图3C中的EDS能谱证明Au NPs@SnIn₄S₈-GR中含有Sn、In、S、C和Au元素，表明其合成成功。

（3）复合物MBs-Apt-P1的制备

通过酰胺键将Apt固定在MBs上。取100 μL MBs，磁分离后用200 μL PBS buffer（pH 7.0，含有 0.1 M NaH₂PO₄，0.1 M Na₂HPO₄和 0.1 M NaCl）洗涤3次。在200 μL PBS中加入10 mg NHS和20 mg EDC并与MBs混合，37℃下振荡30 min以活化MBs表面的COOH，PBS 洗涤后加入500 μL 浓度为1 μM的Apt，37℃振荡过夜反应。反应结束后磁分离除去多余的Apt得到MBs-Apt，然后将500 μL浓度为1 μM的P1与MBs-Apt溶液混合，在37℃下振荡过夜。磁分离洗涤后，将制得的MBs-Apt-P1重新分散于250 μL PBS中，保存在4℃条件下备用。

（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳

首先制备12%的聚丙烯酰胺凝胶。即将超纯水，5×TBE，丙烯酰胺 (30%)，TEMED 和APS (10%)按比例混匀。然后将P1和G-rich ssDNA（均为7 μL， 5 μM）分别与2 μL 6×Loading buffer及2 μLSybr gold混合，再分别注入到凝胶胶孔中。整个电泳实验在1×TBE缓冲溶液中进行，电泳仪电压为80 V，电泳时间为80 min。实验结束后，为了验证TdT聚合产物为G-rich ssDNA，进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）实验。采用UVP凝胶成像系统拍摄凝胶图像。

如图4A所示，泳道3的迁移速度与泳道2相比非常缓慢，表明TdT实现了P1的末端聚合，形成了G-rich ssDNA。

（5）比色法验证G4/hemin的类过氧化酶活性

验证了G4/hemin 在H₂O₂存在下对过氧化物酶底物TMB的催化活性。将5 μL氨苄青霉素（20 nM）与5 μL MBs-Apt-P1混合，37℃下反应75 min以发生链置换反应置换出P1。磁分离后，在10 μL上清液中加入0.5 μL浓度为20 U μL^-1的TdT，2 μL TdT buffer，3 μL浓度为10 mM的dATP，4.5 μL浓度为10 mM的dGTP，混匀后37℃孵育1 h。然后加入1 μL浓度为21μM的hemin，避光下37℃孵育35 min 形成G4/hemin。将21 μL浓度为5 mM的TMB和H₂O₂加入到上述溶液中，室温孵育20 min后用紫外可见分光光度计检测。

结果见图4B，在G4/hemin存在下，溶液颜色变为蓝色，在紫外-可见光谱中TMB_ox的典型吸收出现650 nm附近，这表明G4/hemin可以催化H₂O₂诱导的TMB氧化，并且具有优异的过氧化物模拟酶活性。除此之外，也用圆二色谱表征了TdT合成的G-rich ssDNA所形成的G4的结构。如图5(b)所示，240 nm附近的负吸收峰和260 nm附近的正吸收峰说明形成了平行结构的G4。

（6）适配体传感器的制备及氨苄青霉素检测

将10 μL Au NPs@SnIn₄S₈-GR (3 mg mL^-1) 滴涂在干净的ITO电极表面，在红外灯下烘干。随后，通过Au-S键将S1固定到电极表面，即将10 μL浓度为1 μM的S1滴在电极表面，4℃下孵育过夜，用Tris-HCl缓冲液洗涤除去多余S1。为减少电极表面的非特异性吸附，将10 μL浓度为1 mM的MCH在电极表面25℃孵育30 min。在复合物MBs-Apt-P1溶液中加入不同浓度氨苄青霉素标准溶液，37℃震荡75 min后，取上清液P1（10 μL，1 μM）滴到电极表面，37℃孵育1 h。洗涤后滴加0.5 μL浓度为20 U μL^-1的TdT，2 μL TdT buffer，3 μL浓度为10 mM的dATP，4.5 μL浓度为10 mM的dGTP，混匀后37℃孵育1 h得到G-rich ssDNA。洗涤后加入1μL浓度为21 μM的hemin，避光下37℃孵育35 min在电极表面形成G4/hemin。

如图6A所示，与原始SnIn₄S₈和SnIn₄S₈-GR相比，Au NPs@SnIn₄S₈-GR的电荷转移电阻（R_ct）最小，表明它具有卓越的电子传输能力，相应的光电流也是最大的（图6B）。构建的适配体传感器的逐步组装过程的 EIS图如图6C所示，在ITO电极上修饰光电活性材料后，R_ct增加（曲线b），表明它阻碍了电荷转移。S1通过Au-S键固定在ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR上，R_ct的增加是由于[Fe(CN)₆]^3-/4-与带负电荷的寡核苷酸链之间的静电排斥（曲线c）。非特异性活性位点被MCH封闭后R_ct的增加是因为生物大分子阻碍了电子的传输（曲线d）。后续P1的引入和G4/hemin的形成都阻碍了电极表面的电荷转移，R_ct依次增加（曲线e，曲线f）。在H₂O₂存在下，4-CN被催化氧化在电极表面形成沉淀，因此R_ct仍然增加（曲线g）。上述结果与电极组装过程中获得的光电流变化一致（图6D），证明设计的适配体传感器构建成功。

本申请适配体传感器的检测机理，如图7所示：基于TdT末端聚合和G4/hemin MECP反应的信号放大的PEC适配体传感器的机制。首先，将优异的Au NPs@ SnIn₄S₈-GR材料修饰在ITO电极上，得到理想的光电流信号（图7B，曲线a）。光电流信号由可见光吸收能力和SnIn₄S₈的能带间隙决定。如图8所示，原始SnIn₄S₈在可见光区域表现出强吸收，并且SnIn₄S₈也具有较窄的带隙，为1.95 eV。SnIn₄S₈的带隙（E_g）可由公式（αhν）^n/1 = A（hν–E_g）计算，α为光吸收系数，h为普朗克常数，ν为频率，A为常数，E_g是半导体的禁带宽度，直接带隙半导体n= 1/2。SnIn₄S₈的E_g可以通过将（αhν）²与hν的关系图外推到（αhν）² = 0 得到。此外，SnIn₄S₈的价带（VB）电位和导带（CB）电位通过公式E_VB = χ− E^e + 0.5E_g和E_CB = E_VB − E_g计算，其中E_VB是VB带边电位，E_CB是CB带边电位，χ是半导体的绝对电负性，E^e是氢标度下自由电子的能量（4.5 eV），SnIn₄S₈的χ为4.88 eV。因此，SnIn₄S₈的E_VB和E_CB分别为1.35eV和-0.60 eV（vs.NHE）。在可见光照射下，SnIn₄S₈的VB中的电子跃迁到CB并产生光生电子-空穴对。VB上的空穴被电子供体AA捕获，CB上的电子流向电极，从而产生光电流信号。P1通过与S1杂交固定在电极表面，并在TdT作用下生成大量不同长度的G-rich ssDNA，可以与hemin形成更多的G4/hemin，从而提供更多的模拟酶来催化4-CN与H₂O₂的反应并在电极表面产生沉淀。电极上的绝缘层会严重影响界面电子转移特性，抑制固液界面电子转移，阻碍光对Au NPs@SnIn₄S₈-GR的照射，抑制AA的扩散，从而影响光电流信号（图7B，曲线b）。PEC适配体传感器的超灵敏归因于以下因素：（1）具有优异光电转换效率的Au NPs@SnIn₄S₈-GR提供了理想的初始光电流；（2）引入具有信号放大能力的TdT；（3）MECP反应可以有效降低目标物存在下的光电流响应。

实验条件对传感器的分析性能至关重要，因此优化了几个关键实验参数，包括外加电压、S1浓度、AMP和MBs-Apt-P1杂交的反应时间、P1链延长时间、G4/hemin形成时间和MECP反应时间，后续实验均在优化的实验条件下完成。外加电位的优化如图9A所示，ITO/AuNPs@ SnIn₄S₈-GR的光电流随着外加电压的增加先增加后减小，光电流在0.15 V时达到最大值，因此选择0.15 V作为外加电压。引入到电极表面的S1的量对后续实验非常重要，因此对S1的浓度进行了优化。随着S1浓度的增加，ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR/S1的光电流逐渐降低，并在1 μM后逐渐变的平缓（图9B），因此选择1 μM作为S1的浓度。如图9C所示，随着AMP和MBs-Apt-P1杂交反应时间从30 min增加到105 min，75 min后光电流下降并趋于稳定，表明此时杂交完成，因此选择75 min作为 AMP和MBs-Apt-P1杂交的反应时间。本实验中G4/hemin的形成与MECP反应直接影响光电信号变化，因此对P1的延伸时间、G4/hemin的形成时间和MECP反应时间进行了优化。随着P1的延伸时间从30 min增加到80 min，光电流减小并在60 min时达到最小值（图9D）。同样，当G4和hemin反应35 min时，光电流趋于平缓（图9E），MECP反应在20 min时完成（图9F）。因此，选择60 min和35 min作为P1链延伸时间和G4/hemin形成时间，选择20 min作为合适的MECP反应时间。

（7）AMP的定量

将21 μL浓度为2 mM的4-CN和H₂O₂滴加到电极上，室温孵育20 min。在4 mL含有0.1M AA 的PBS（pH 7.0，10 mM）中测得光电流值，建立光电流值与氨苄青霉素浓度之间的定量关系，得到氨苄青霉素标准溶液的工作曲线I (μA) = 2.125 lgC (nM) – 27.14，R² =0.9959，检出限（LOD）为4.97 fM（S/N = 3），见下表1。

表1 氨苄青霉素标准溶液工作曲线

随着AMP浓度从30 fM增加到100 nM，光电流逐渐降低。也就是说，随着靶标量的增加，会产生更多的P1，并且在引入电极表面后会形成更多的G4/hemin，导致光电流降低。从图10B可以看出，对于C_AMP，光电流在30 fM-100 nM范围内与其对数呈线性相关。线性方程为I (μA) = 2.125 lg C (nM) – 27.14，R² = 0.9959，检出限（LOD）为4.97 fM（S/N = 3）。

为了评估PEC信号响应的稳定性，ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR（曲线a）和ITO/Au NPs@SnIn₄S₈-GR/S1/MCH/G4/hemin/4-CN（曲线b）分别连续经过10次重复测量，PEC信号基本保持不变（图10D），这表明此传感器在信号响应方面具有良好的稳定性。为了探索该方法的选择性，对两种β-内酰胺类抗生素（CEP和AMO）、两种氨基糖苷类抗生素（Kana和TOB）、两种四环素类抗生素（OXY和TET）及其与AMP的混合物在相同的条件进行了PEC响应分析（图10C）。其他抗生素的PEC响应与空白接近，表明对AMP的检测具有良好的特异性。

应用例1：牛奶样品中氨苄青霉素含量的检测

将10 μL Au NPs@SnIn₄S₈-GR (3 mg mL^-1) 滴涂在干净的ITO电极表面，在红外灯下烘干。随后，通过Au-S键将S1固定到电极表面，即将10 μL浓度为1 μM的S1滴在电极表面，4℃下孵育过夜，用Tris-HCl缓冲液洗涤除去多余S1。为减少电极表面的非特异性吸附，将10 μL浓度为1 mM的MCH在电极表面25℃孵育30 min。在复合物MBs-Apt-P1溶液中加入经过前处理后的牛奶样品，37℃震荡75 min后，取上清液P1（10 μL，1 μM）滴到电极表面，37℃孵育1 h。洗涤后滴加0.5 μL浓度为20 U μL^-1的TdT，2 μL TdT buffer，3 μL浓度为10 mM的dATP，4.5 μL浓度为10 mM的dGTP，混匀后37℃孵育1 h得到G-rich ssDNA。洗涤后加入1 μL浓度为21 μM的hemin，避光下37℃孵育35 min 在电极表面形成G4/hemin。将21 μL浓度为2mM的4-CN和H₂O₂滴加到电极上，室温孵育20 min。在4 mL含有0.1 M AA的PBS（pH 7.0，10mM）中测得光电流值，结合光电流值与氨苄青霉素浓度之间的回归方程计算牛奶中所含氨苄青霉素的浓度。

检测结果表明，牛奶样品中无氨苄青霉素残留检出。继续向上述牛奶样品中加入不同浓度的氨苄青霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表2。

表2 牛奶样品溶液的加标回收实验结果

从上表2可以看出，本实施例2测试结果的相对标准偏差（RSD）为6.3-10.4 %，加标回收率为96.1-102.0 %，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。

应用例2：湖水样品中氨苄青霉素含量的检测

将10 μL Au NPs@SnIn₄S₈-GR (3 mg mL^-1) 滴涂在干净的ITO电极表面，在红外灯下烘干。随后，通过Au-S键将S1固定到电极表面，即将10 μL浓度为1 μM的S1滴在电极表面，4℃下孵育过夜，用Tris-HCl缓冲液洗涤除去多余S1。为减少电极表面的非特异性吸附，将10 μL浓度为1 mM的MCH在电极表面25℃孵育30 min。在复合物MBs-Apt-P1溶液中加入经过前处理后的湖水样品，37℃震荡75 min后，取上清液P1（10 μL，1 μM）滴到电极表面，37℃孵育1 h。洗涤后滴加0.5 μL浓度为20 U μL^-1的TdT，2 μL TdT buffer，3 μL浓度为10 mM的dATP，4.5 μL浓度为10 mM的dGTP，混匀后37℃孵育1 h得到G-rich ssDNA。洗涤后加入1 μL浓度为21 μM的hemin，避光下37℃孵育35 min 在电极表面形成G4/hemin。将21 μL浓度为2mM的4-CN和H₂O₂滴加到电极上，室温孵育20 min。在4 mL含有0.1 M AA的PBS（pH 7.0，10mM）中测得光电流值，结合光电流值与氨苄青霉素浓度之间的回归方程计算湖水中所含氨苄青霉素的浓度。

检测结果表明，湖水样品中无卡氨苄青霉素残留检出。继续向上述湖水样品中加入不同浓度的氨苄青霉素标准溶液，进行加标回收实验，实验结果见下表3。

表3湖水样品溶液的加标回收实验结果

从上表3可以看出，本实施例3测试结果的相对标准偏差（RSD）为3.1-8.4 %，加标回收率为98.2-106.0 %，说明本实施例的分析方法具有较高的准确度和精密度。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于TdT和G4/hemin模拟酶扩增技术的适配体传感器的构建方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将GO分散在超纯水中，然后加入SnCl₄·5H₂O的CH₃COOH溶液，再依次加入InCl₃·4H₂O和SDBS，超声搅拌后加入TAA，搅拌后倒入反应釜中反应至完全，冷却至室温后，离心、洗涤、烘干得SnIn₄S₈-GR；

（2）将步骤（1）的SnIn₄S₈-GR溶于超纯水中，加入柠檬酸钠溶液后，搅拌加热至沸腾后，迅速加入氯金酸，继续沸腾一段时间后关闭热源，继续搅拌冷却至室温，经离心、洗涤、烘干得Au NPs@SnIn₄S₈-GR；

（3）取MBs经磁分离后用PBS溶液洗涤三次，然后加入到溶有NHS和EDC的PBS溶液中，振荡活化后用PBS溶液洗涤，再加入Apt溶液，振荡过夜，反应结束后经磁分离得MBs-Apt溶液，再与P1溶液混合，振荡过夜，经磁分离洗涤后得MBs-Apt-P1；

（4）配制步骤（2）得到的Au NPs@SnIn₄S₈-GR的超纯水溶液，滴涂在ITO电极表面，在红外灯下烘干，再将S1溶液滴加到烘干后的ITO电极表面，孵育过夜后，用Tris-HCl缓冲液洗涤除去多余的S1，得预处理电极；

（5）将步骤（4）的预处理电极置于MCH溶液中孵育得检测电极，同时将步骤（3）的MBs-Apt-P1分散于PBS溶液中，然后加入不同浓度氨苄青霉素标准溶液，振荡一段时间后，取上清液滴到检测电极表面，孵育后再依次滴加TdT溶液、TdT buffer、dATP溶液和dGTP溶液，混匀后孵育一段时间得G-rich ssDNA，洗涤后加入hemin溶液，避光孵育后在检测电极表面形成G4/hemin；

（6）将4-CN溶液和H₂O₂溶液滴加到经步骤（5）处理的检测电极的表面，室温孵育一段时间，于含有AA 的 PBS溶液中检测光电流值，建立光电流值与氨苄青霉素浓度之间的定量关系，得到氨苄霉素标准溶液的工作曲线；

所述Apt的碱基序列为5’-NH₂-(CH₂)₆-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’，P1的碱基序列为5’-GCGTATACAACCGCCCGC-3’；

所述S1的碱基序列为5’-GGCGGTTGT ATACGC-(CH₂)₆-SH-3’。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）中SnCl₄·5H₂O、InCl₃·4H₂O、

SDBS和TAA的物质的量比为0.6:2.4:0.021:4.8；每10 mg GO添加SnCl₄·5H₂O的量为0.6 mmol；反应釜中反应的条件为180℃反应12h。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中SnIn₄S₈-GR的超纯水溶液的浓度为1 g mL^-1、柠檬酸钠溶液的浓度为0.01 g mL^-1、氯金酸溶液的质量分数为1%wt；三者的体积比为30:0.375:0.5。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中每100 μL MBs添加10mg NHS和20 mg EDC；MBs、Apt溶液和P1溶液的体积比为1:5:5，Apt溶液的浓度为1 μM，P1溶液的浓度为1 μM；振荡的温度为37℃。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（4）中Au NPs@SnIn₄S₈-GR的超纯水溶液的浓度为3 mg mL^-1，S1溶液的浓度为1 μM；Au NPs@SnIn₄S₈-GR的超纯水溶液与S1溶液的体积比为1:1。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（5）中MCH溶液的浓度为1mM，上清液为浓度为1 μM的P1溶液，MCH溶液与上清液的体积比为1:1；TdT溶液的浓度为20U μL^-1，体积为0.5 μL；TdT buffer的体积为2 μL，dATP溶液的浓度为10 mM，体积为3 μL，dGTP溶液的体积为10 mM，体积为4.5 μL，hemin溶液的浓度为21 μM，体积为1 μL；孵育温度为37℃。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述步骤（6）中4-CN溶液和H₂O₂溶液的浓度均为2 mM，体积均为21 μL，PBS溶液的浓度为10 mM，体积为4 mL，pH为7.0，其中AA的含量为0.1 M。

8.权利要求1-7任一项所述的方法构建的适配体传感器作为非疾病诊断目的的检测样品中氨苄青霉素含量的应用，其特征在于，重复步骤（1）-（6）的操作，并将步骤（5）中的不同浓度氨苄青霉素标准溶液替换为样品溶液，测得的光电流值，代入工作曲线即可计算出样品中氨苄青霉素的含量。