KR20120077154A - 카나마이신에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 - Google Patents

카나마이신에 특이적으로 결합하는 ｄｎａ 앱타머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카나마이신(kanamycin)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 무작위 ssDNA 라이브러리로부터 선별된 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머는 무작위 ssDNA 라이브러리로부터 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)기술을 이용하여 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 결합력을 분석하였다. 따라서, 본 발명의 DNA 앱타머는 카나마이신을 효과적으로 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

카나마이신에 특이적으로 결합하는 ＤＮＡ 앱타머{DNA aptamer binding to kanamycin with specificity}
본 발명은 항생제 검출 앱타머(aptamer)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 카나마이신(kanamycin)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머에 관한 것이다.
항생제는 미생물을 죽이거나 억제하기 위해 널리 사용되어왔다. 그러나 항생제의 남용은 사람에게서 다양한 종류의 부작용을 일으키는 문제점을 낳았고, 항생제에 내성을 가진 슈퍼박테리아가 출연하게 되었다. 따라서, 적합한 양의 항생제의 바른 용법이 대단히 중요시되며, 시장에서 배포 또는 판매전에 농약잔류허용기준(Maximum Residue Limits; MRL)을 초과하는 항생제의 잔류를 포함하는 식품인지 아닌지 확인하여야한다. 식품에서 항생제의 잔류의 초과량이 심각한 문제를 발생시키기 때문에, 보다 믿을만하고, 정확한, 쉬운 탐지 시스템이 요구된다.
카나마이신(kanamycin)은 아미노글로코시드계 항생물질(aminoglycoside antibiotic)로서 다양한 감염에 치료용으로 사용되고 있다. 카나마이신은 원핵세포 리보솜의 30S 서브유닛과 상호작용하여 오역(mistranslation)을 유도하고 전좌(translocation)를 막는다. 그러나 음식 또는 과 처방된 약을 통해 섭취하여 사람에게 남용되면 카나마이신은 청력의 손실 및 콩팥의 독성화를 포함하는 심각한 부작용을 초래한다.
앱타머(aptamer)는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA이다. 앱타머는 타겟에 대한 친화도가 높고 열 안정성이 우수하며 시험관내(in vitro)에서 합성이 가능하기 때문에 비용면에서도 기존의 센서 분야에서 이용되는 감지물질보다도 우위에 있다. 또한, 타겟물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자, 환경호르몬 또는 항생제와 같은 작은 유기화학 물질, 그리고 박테리아 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머가 합성될 수 있다. 이렇게 타겟물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템, 및 바이오센스 등의 분야에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다.
기존 바이오센스 분야에서 이용되는 다양한 감지물질 중 민감도 면에서 우위에 있는 것이 항체를 이용한 타겟물질의 검출이다. 이는 검출하고자하는 타겟물질(항원)을 동물의 몸에 주입하여 생체의 면역시스템을 통해 만들어지는 항체를 확보한 후 정제 과정을 거치기 때문에 시간이 많이 들고 고비용이라는 점이 첫 번째 문제점이라 할 수 있다. 또한, 타겟물질에 있어 제약이 거의 없는 앱타머에 비해 항원으로 사용할 수 있는 타겟물질이 제한적이어서 독성물질과 같은 저분자 화합물질들에 대한 항체의 제작에 어려움이 있다. 일반적으로 항체는 그 크기가 150 KDa 이상인 매우 큰 단백질이기 때문에 전기화학 기반 등의 바이오센서로 응용 시에 신호 검출 부분에 있어 제약이 있고, 열 안전성이 DNA나 다른 화학물질에 비해 현저히 떨어지는 문제가 있다. 그러므로 기존의 혈중 바이오마커의 진단에 있어 항체를 이용한 기술은 비용과 시간 면에서 효율적이지 않고, 적용범위가 다양하지 않으며 바이오센서로 응용하는 데에 있어 제한적인 문제점들이 있다. 이러한 문제점들을 개선하기 위한 새로운 감지물질로서 다양한 타겟물질에 대해 특이적으로 높은 친화도 및 안전성을 보이며, 항체에 비해 화학적 합성 및 변경이 쉬운 앱타머를 이용하는 연구가 많이 이루어지고 있다. 또한, 1990년 Gold's 그룹 및 Ellington's 그룹에 의해 the Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment(SELEX)이 개발된 이후로, 단백질과 같은 주로 거대분자가 주된 실험 표적이었으나, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 모세관 전기이동(capillary electrophoresis) 및 자성비드(magnetic beads)를 이용한 진화된 SELEX 기술의 발달로 인해 크기가 작아서 항체를 만들기 어려운 호르몬 또는 유기분자와 같은 작은 분자를 포함하는 표적 분자의 다양화를 가능하게 하였다. 따라서, 작은 분자를 위한 앱타머를 선별하여 다양한 분야에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다.
이에, 본 발명자는 카나마이신에 대해 새로운 앱타머를 개발하기 위해 노력한 결과, 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 카나마이신에 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머를 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술을 이용하여 선별하였고, 상기 DNA 앱타머들의 서열 및 구조를 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 카나마이신(kanamycin)에 특이적으로 결합하는 신규 DNA 앱타머(aptamer), 이의 제조 방법, 및 상기 DNA 앱타머를 이용한 카나마이신 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 카나마이신(kanamycin)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 카나마이신(kanamycin)을 비드(bead)에 고정시키는 단계;
2) 카나마이신이 고정된 비드와, 양말단에 보존된 PCR용 프라이머 영역을 가지고 중앙에 30 - 50개의 임의의 염기를 가지는 ssDNA 라이브러리를 반응시켜 결합을 유도하는 단계;
3) 카나마이신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA를 분리하는 단계;
4) 분리된 카나마이신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA로부터 ssDNA를 분리하는 단계; 및
5) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 카나마이신에 특이적으로 결합하는 ssDNA를 증폭하는 단계,
를 포함하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 무작위 ssDNA 라이브러리로부터 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술을 이용하여 카나마이신(kanamycin)에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보이는 DNA 앱타머를 개발하였다. 본 발명에 따르면 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 DNA 앱타머를 이용하면 기존에 사용되고 있는 항체 기반 분석보다 더 민감하고 정확하게 카나마이신을 측정할 수 있을 것으로 기대되며, 또한 상기 DNA 앱타머는 항체에 비해 생산비용이 적고 표면에 고정화하기가 쉬우므로 바이오센서 칩 제작에 유리하고 인체, 식품 및 상하수원등에 잔류하는 극미량의 카나마이신 검출용 조성물 및 키트(kit) 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 SELEX를 수행하는 과정을 개략적으로 보여주는 그림이다.
도 2는 선별과정 후 선별된 ssDNA를 확인하기 위해, 12.5% 요소(urea) PAGE 분석법을 수행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 반복되는 선별 과정에서 각 단계마다 선별되는 앱타머(aptamer)의 결합력을 나타낸 그래프이다.
도 4는 SELEX를 통해 선별된 DNA 앱타머를 염기서열과 구조적 유사성으로 분리해 놓은 그림이다.
도 5는 형광물질이 표지된 DNA 앱타머를 이용하여 카나마이신(kanamycin)과의 결합정도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명은 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 카나마이신(kanamycin)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer)를 제공한다.
상기 DNA 앱타머는 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 DNA 앱타머는 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
1) 카나마이신을 비드(bead)에 고정시키는 단계;
2) 카나마이신이 고정된 비드와 양말단에 보존된 PCR용 프라이머 영역을 가지고 중앙에 30 - 50개의 임의의 염기를 가지는 ssDNA 라이브러리를 반응시켜 결합을 유도하는 단계;
3) 카나마이신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA를 분리하는 단계;
4) 분리된 카나마이신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA로부터 ssDNA를 분리하는 단계; 및
5) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 카나마이신에 특이적으로 결합하는 ssDNA를 증폭하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 비드는 세파로즈 비드(sepharose bead) 또는 자성비드(magnetic bead) 인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계2)의 PCR용 프라이머 영역은 서열번호 14 및 서열번호 15인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3) 내지 단계 5)의 단계를 추가적으로 5회 내지 15회 반복하여 실시하는 것이 바람직하고, 8회 내지 13회 반복하여 실시하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 카나마이신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하기 위하여, 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 항생물질인 카나마이신에 대해 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)기술을 이용하여 앱타머 후보 ssDNA를 선별하였다(도 1 내지 도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 선별된 앱타머 후보 ssDNA로부터 서열분석 및 구조를 분석한 후, 서열 및 구조적 유사성을 갖는 카나마이신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였다(도 4 및 표 1 참조).
아울러, 본 발명자들은 각각의 DNA 앱타머의 결합정도를 확인하기 위해, 항생제가 고정화된 자성비드와 FAM 형광물질로 고정화된 DNA 앱타머를 이용하여 결합력을 분석한 결과, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머의 결합정도가 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 DNA 앱타머는 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 SELEX기술을 이용하여 항생물질인 카나마이신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 결합력을 분석을 통해, 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 확인하였다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물을 제공한다.
상기 DNA 앱타머는 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 DNA 앱타머는 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 SELEX 기술을 이용하여 항생물질인 카나마이신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 결합력을 분석을 통해, 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 확인하였으므로, 이를 포함하는 카나마이신 검출 또는 제거용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 키트(kit)를 제공한다.
상기 DNA 앱타머는 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 DNA 앱타머는 화학적으로 합성된 ssDNA 라이브러리로부터 SELEX기술을 이용하여 항생물질인 카나마이신에 대해 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 선별하였고, 선별된 DNA 앱타머들의 염기서열, 특성 및 결합력을 분석을 통해, 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 확인하였으므로, 이를 포함하는 카나마이신 검출용 키트로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 본 발명의 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브 또는 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일 또는 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명은 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> ssDNA ( single strand DNA ) 라이브러리의 제조
양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 보존된 프라이머의 결합서열을 가지고, 가운데 무작위의 40개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 합성 ssDNA 라이브러리[5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGATCCGA(서열번호:14)-N40-CTGGCTCGAACAAGCTTGC(서열번호:15)-3']을 설계하였다. 또한, PCR 증폭 및 ssDNA 생성을 위하여 정방향 프라이머(forward primer)[5'-CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3'(서열번호:16)], 역방향 프라이머(reverse primer)[5'-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3'(서열번호:17)] 및 비오틴이 결합된 역방향 프라이머[5'-Biotin-GCAAGCTTGTTCGAGCCAG-3'(서열번호:18)]을 사용하였고, 결합 분석을 위하여 FAM이 표지된 정방향 프라이머[5'-FAM- CACCTAATACGACTCACTATAGCGGA-3'(서열번호:19)]를 사용하였다. 또한, 모든 올리고뉴클레오티드는 바이오닉스 사(한국)에서 합성 및 PAGE-정제하였다.
< 실시예 2> 카나마이신 ( Kanamycin )이 고정된 비드의 제조
CNBr(cyanogen bromide)로 활성화된 세파로즈 비드(sepharose bead)(Amersham Pharmacia Biotech, 미국) 표면에 시아노기(-CN)와 카나마이신의 1차 아민기(-NH2)와의 반응을 이용해 카나마이신(Generay Biotech, 캐나다)을 비드에 고정하였다.
구체적으로, 2 g의 CNBr로 활성화된 세파로즈 비드를 100 mL의 1 mM HCl에서 팽창시켰다. 팽창된 세파로즈 비드와 400 mg의 카나마이신을 커플링 버퍼(coupling buffer)(0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 9.0)에서 혼합한 후, 4시간 동안 실온에서 배양하였다. 커플링 버퍼로 세 번 세척한 후, 상기 커플링된 세파로즈 비드를 2 시간 동안 실온에서 블로킹 버퍼(blocking buffer)(1 M Tris-Base, 0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 9.0)에서 배양하였다. 낮은 pH 워싱 버퍼(Washing buffer)(0.1 M acetic acid, 0.5 M NaCl, pH 4.0) 및 커플링 버퍼를 이용한 세척 단계는 연속적으로 2번 수행하였다. 상기 카나마이신이 고정화된 세파로즈 비드는 5 mL의 결합버퍼(binding buffer)(20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 8.0)에 재현탁 시킨다음, 양성 친화성 컬럼에 적재하였다. 또한, 음성 친화성 컬럼으로서 카나마이신이 없는 CNBr-세파로즈 비드를 음성선별을 위해 준비하였다.
< 실시예 3> 카나마이신에 특이적인 앱타머 선별
카나마이신에 특이적인 앱타머를 선별하기 위해 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 수행하였다(도 1).
구체적으로, 먼저 세파로즈 비드에 비-특이적으로 결합하는 ssDNA를 제거하기 위해, 100 mL의 결합 버퍼(binding buffer)에 녹아있는 ssDNA 라이브러리(500 pmole)를 85℃에서 3분 동안, 그런 다음 4℃에서 1시간 동안 전-배양하였다. 그 후, 상기 ssDNA 라이브러리를 포함하는 전-배양된 용액을 음성 친화성 컬럼인 세파로즈 비드로 채워진 컬럼으로 적재하였다. 이때, 상기 음성 친화성에 결합하지 않고 통과하는 ssDNA 라이브러리만을 취해서 선별과정을 진행한 후, 카나마이신이 고정화된 세파로즈 비드로 채워진 컬럼에 적재한 후, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 컬럼을 워싱 버퍼(20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.01 % tween 20, pH 8.0)로 2번 세척한 후, 용출 버퍼(elution buffer)(20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 8.0, 10 mM 카나마이신)로 용출하였다. 상기 용출된 ssDNA는 에탄올을 이용하여 침전시킨 후, 100 ㎕의 증류수에 용해한 다음, 상기 <실시예 1>의 정방향 프라이머 및 비오틴이 결합 된 역방향 프라이머를 이용하여 pfu -중합효소(pfu-polymerase)(인트론 바이오테크놀로지, 한국)를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 다음 선별과정을 위한 ssDNA를 생성하기 위해, 비오틴이 결합된 PCR 산물을 스트렙타아비딘(streptavidin)이 코팅된 자성비드(magnetic beads)와 함께 배양하였다. 상기 선별된 ssDNA는 기본 조건하에서 외부 자석을 이용하여 수집하였다. 상기 선별된 ssDNA 라이브러리는 12.5% 요소(urea) PAGE 분석법을 이용하여 확인하였다. 또한, 첫 번째 선별 후, 상기 선별된 ssDNA를 다음 선별에 사용하였고, 이런 선별을 반복하였다. 이때 ssDNA의 양 및 카나마이신에 고정된 비드에 ssDNA의 배양시간은 엄격한 선별을 위해 보다 감소시켰으며, 반복되는 각 선별에서 용출된 ssDNA를 UV 분광광도계(UV spectrometer, Biochrom Libra S22 spectrometer)로 그 농도를 측정하여 남아있는 ssDNA의 카나마이신 결합정도를 확인하며 선별과정을 진행하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 결합력(%)을 각 선별과정의 단계마다 하기 <수학식 1>을 통해 계산한 결과, 8번째 선별과정까지 각 단계마다의 결합력을 확인하였다(도 3).
Figure pat00001
< 실시예 4> 클로닝 및 염기서열 분석
9번째의 반복 선별된 ssDNA는 변형되지 않은 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 PCR 과정을 통해 증폭하였고, pENTR/TOPO 벡터(TOPO TA Cloning kit, Invitrogen, 미국)에 클로닝한 후, 상기 벡터를 Escherichia coli(E. coli) TOP10 세포(Invitrogen, 미국)에 형질전환하였다. ssDNA가 삽입된 클론을 miniprep 키트(GeneAll, 한국)를 이용하여 정제한 후, 염기서열을 분석(COSMO Genetech, 한국)하였다. 상기 서열분석 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 카나마이신에 높은 친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 DNA의 염기서열을 확인하였다.
서열번호 염기서열
서열번호 1 TGTCCAAGTGGTCTTGAGGTTATAAGCGGCGGCCGATCA
서열번호 2 AGATGGGGGTTGAGGCTAAGCCGACCGTAAGTTGGGCCGT
서열번호 3 CTGTAGGGTTGGCAGGGGCTTAAGCCTTCGTGGTCGGGTA
서열번호 4 CGAGATGGAGTACGTGATTTGGAGGTCGAAGTACTTGGGG
서열번호 5 TGCAGTGGTCTAGTCCCTTATGGTACTTTGAAGGGTTGTTA
서열번호 6 AGCGCCGAGCGTGCGGGATCTAGGGGGGAGGATAGGGTTG
서열번호 7 GTTACTAAAAAAGTTCAGGTGCGGCAATAGCACTCGAAGA
서열번호 8 ACGTTGTGGCAGTGAGTGCAGGCATGGCGCGACCACTTGA
서열번호 9 GTTGATAGATATAGAAGCTCCTCGGCCGTCAGCGCTTGGA
서열번호 10 GAGATGGGAGGGGTGATTTCCTGTTGCCATCTGGGACAGC
서열번호 11 TGGTAATCGAAGTAAAGAAGGCTTGAGGGGTGTATGCGCC
서열번호 12 ACTATTAAGAAGTTGCGTTGGAAGGCACGAATTCGCCGCG
서열번호 13 CATGTGCTGTGTCGACCTGGCGGTTGAACTGAGCGGTGGT
또한, 선별된 ssDNA의 구조적 유사성을 분석하기 위하여, Mfold 프로그램 (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/dna-form1.cgi)을 이용하여 2차 구조를 조사하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 'T-GG-A'의 염기서열이 포함된 stem-loop의 구조가 존재하는 DNA 앱타머를 분석할 수 있었고, loop의 길이, '-GG-'의 위치 및 stem의 길이에 따라 5개의 그룹으로 나눌 수 있었다(도 4).
< 실시예 5> ssDNA 의 결합력 확인
선별된 ssDNA의 카나마이신에 대한 결합력을 확인하기 위하여, 형광 측정을 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 5 mg의 카나마이신을 30 mg 자성비드(megnetic bead)와 혼합한 후, 1 mL의 커플링 버퍼(0.1 M borate, 0.67 M (NH4)2SO4, pH 9.5)에서 부드럽게 교반하며 37℃에서 20시간 동안 배양한 다음, 카나마이신과 반응하지 않고 남은 자성 비드 표면에 tosyl기의 반응을 멈추기 위해 1 mL의 블로킹 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 0.05 % tween 20, pH 7.4)에서 37℃로 1시간 동안 배양하여 Tosyl-활성화된 자성비드(Invitrogen, 미국)에 카나마이신이 고정되었다. 상기 카나마이신이 고정된 자성비드는 1 mL의 워싱 버퍼(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, 0.01 % tween 20, pH 7.4)로 2번 세척한 후, 0.6 mg의 상기 카나마이신이 고정된 자성 비드를 100 mL의 결합버퍼에서 부드럽게 교반하면서 실온에서 1시간 동안 FAM이 표지된 ssDNA 앱타머와 함께 배양하고, 결합하지 않은 앱타머는 세척을 통해 제거하였다. 카나마이신이 고정된 자성비드에 결합된 FAM이 표지된 ssDNA 앱타머의 양은 자석을 이용하여 카나마이신에 결합된 FAM이 표지된 ssDNA만을 분리하여 형광측정(1420 Victor multilabel counter, PerkinElmer, USA)을 통해 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 구조적 유사성으로 나뉜 각 그룹에서 하나씩 DNA 앱타머의 결합정도를 비교한 결과, 서열번호 2, 서열번호 4 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 DNA 앱타머의 결합정도가 유의적으로 높은 것을 확인하였다.(도 5).
<110> iSENS <120> DNA aptamer binding to kanamycin with specificity <130> 10P-11-63 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 1 tgtccaagtg gtcttgaggt tataagcggc ggccgatca 39 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 2 agatgggggt tgaggctaag ccgaccgtaa gttgggccgt 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 3 ctgtagggtt ggcaggggct taagccttcg tggtcgggta 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 4 cgagatggag tacgtgattt ggaggtcgaa gtacttgggg 40 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 5 tgcagtggtc tagtccctta tggtactttg aagggttgtt a 41 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 6 agcgccgagc gtgcgggatc taggggggag gatagggttg 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 7 gttactaaaa aagttcaggt gcggcaatag cactcgaaga 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 8 acgttgtggc agtgagtgca ggcatggcgc gaccacttga 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 9 gttgatagat atagaagctc ctcggccgtc agcgcttgga 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 10 gagatgggag gggtgatttc ctgttgccat ctgggacagc 40 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 11 tggtaatcga agtaaagaag gcttgagggg tgtatgcgcc 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 12 actattaaga agttgcgttg gaaggcacga attcgccgcg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> kanamycin binding DNA aptamer <400> 13 catgtgctgt gtcgacctgg cggttgaact gagcggtggt 40 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preserved region of ssDNA library <400> 14 cacctaatac gactcactat agcggatccg a 31 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preserved region of ssDNA library <400> 15 ctggctcgaa caagcttgc 19 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR amplification and ssDNA generation <400> 16 cacctaatac gactcactat agcgga 26 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR amplification and ssDNA generation <400> 17 gcaagcttgt tcgagccag 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> biotinylated reverse primer for PCR amplification and ssDNA generation <400> 18 gcaagcttgt tcgagccag 19 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAM labeled forward primer for binding assay <400> 19 cacctaatac gactcactat agcgga 26

Claims (7)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 카나마이신(kanamycin)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(aptamer).
  2. 1) 카나마이신(kanamycin)을 비드(bead)에 고정시키는 단계;
    2) 카나마이신이 고정된 비드와, 양말단에 보존된 PCR용 프라이머 영역을 가지고 중앙에 30 - 50개의 임의의 염기를 가지는 ssDNA 라이브러리를 반응시켜 결합을 유도하는 단계;
    3) 카나마이신이 고정화된 비드에 결합된 ssDNA를 분리하는 단계;
    4) 분리된 카나마이신이 고정된 비드에 결합된 ssDNA로부터 ssDNA를 분리하는 단계; 및
    5) 상기 PCR용 프라이머 영역에 상보적인 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 카나마이신에 특이적으로 결합하는 ssDNA를 증폭하는 단계,
    를 포함하는 제 1항의 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 비드는 세파로드비드(sepharose bead) 또는 자성비드(magnetic bead)인 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머의 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서, 단계 2)의 PCR용 프라이머 영역은 N-말단에 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열, 및 C-말단에 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법.
  5. 제 2항에 있어서, 단계 2) 내지 단계 5)의 단계를 추가적으로 8회 이상 반복하여 실시하는 단계를 포함하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 제조방법.
  6. 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물.
  7. 서열번호 1 내지 서열번호 13 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 카나마이신에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 키트.
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