KR101841046B1

KR101841046B1 - 환원 그래핀 산화물을 이용한 카나마이신 검출용 앱타 센서 및 이의 응용

Info

Publication number: KR101841046B1
Application number: KR1020160108223A
Authority: KR
Inventors: 윤문영; 하나름
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2018-03-23
Also published as: KR20180024055A

Abstract

본 발명은 환원 그래핀 산화물을 이용한 카나마이신 검출용 앱타 센서 및 이의 응용에 관한 것으로, 환원 그래핀 산화물과 형광 표지된 단일가닥 DNA 앱타머의 결합에 의한 소광이 카나마이신과 단일가닥 DNA 앱타머의 복합체 형성을 통해 형광이 다시 나타나게 되는 신호 변화를 측정하여 가축의 도축 전에 잔류하는 카나마이신의 존재 또는 농도를 측정하는 효과를 제공한다.

Description

환원 그래핀 산화물을 이용한 카나마이신 검출용 앱타 센서 및 이의 응용{Novel reduced graphene oxide-based aptasensor for detecting kanamycin and use thereof}

본 발명은 환원 그래핀 산화물을 이용한 카나마이신 검출용 앱타 센서 및 이의 응용에 관한 것이다.

카나마이신(Kanamycin)은 아미노글리코사이드 계열의 항생물질(Aminoglycoside antibiotics)로서 다양한 감염의 치료용으로 사용되고 있다. 아미노글리코사이드 계열 항생물질은 그람 음성균(Gram negative bacteria)의 외막에 있는 포린(porine)이라는 구멍 단백 통로를 통하여 세포질 주위 공간으로 이동하며, 이후 능동적인 운반에 의하여 세포 내로 이동한다. 카나마이신은 원핵세포의 리보솜의 30s 서브유닛과 상호작용하여 오역(mistranslation)을 유도하고 전좌(translocation)를 막음으로써 단백질 합성을 억제하여 살균작용을 나타낸다. 대부분 그람 음성균에 항균력이 좋지만 혐기성 세균에는 향균력이 없으며, 경구 투여 시 위장관에서의 흡수가 거의 일어나지 않으며, 콩팥의 독성화 및 이(耳)독성(청력 손실) 등의 심각한 부작용을 초래하기 때문에 신장 기능이 저하된 환자에게는 혈중 농도를 측정해가면서 주의해서 투여해야 한다.

식품에 대한 소비자의 안전을 강화하기 위하여 우리나라에서는 우유 내 존재하는 카나마이신 잔류 허용 기준을 0.1 mg/kg으로 설정하여 관리하고 있어, 축산식품에 잔류하는 아미노글리코사이드 계열 항생물질을 분석하기 위해서 감도가 높고 안정적인 분석 방법이 필요하다. 카나마이신을 포함한 아미노글리코사이드 계열 항생물질은 구조상 발색단(chromophore)이 없고, UV 흡광도가 약해 자외선 검출기로 분석하기 어려운 문제점이 있다. 이를 보완하기 위해서 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)와 잔류 물질의 특이 이온 확인이 가능한 LC-MS(Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry)를 많이 이용하고 있는 추세이다.

잔류 항생물질의 검출을 위해 많이 이용되는 HPLC와 잔류 물질의 특이 이온의 확인까지 가능한 LC-MS 분석법은 높은 특이성, 고감도, 선택성이 뛰어나 매우 낮은 농도까지 정량할 수 있다는 장점이 있지만, 분석시간이 오래 걸리며 분석을 위한 고가의 장비가 필요하기 때문에 현장에서 빠르게 검출하기 어렵다는 문제점이 있다.

따라서, 실험실 수준의 정확도를 갖고 측정 시간도 빠르게 검출 가능한 바이오센서 연구가 많이 진행되고 있는 추세이다. 바이오센서는 복잡한 혼합물 시료 내에서 특정 분석 대상물질의 농도를 측정하는 분석기기이다. 특정 대상물질과 선택적으로 반응하는 분자 인지도구와 이들의 분석 대상물질의 상호작용에 의한 변화를 정량적인 신호로 변환함으로써, 높은 선택성과 극미량의 시료 측정을 위한 높은 민감도의 구현이 가능한 장점을 갖는다.

항체는 현재 바이오센서에 사용되는 대표적인 분자인지물질이다. 일반적으로, 인체의 면역계는 비자기(non-self) 물질이 체내에 침입하면 이에 대한 항체를 생산하며, 외부 물질(항원)과 선택적으로 결합하여 인체 보호를 위한 일련의 과정을 일으키는 역할을 한다. 바이오센서는 항체가 특정 물질을 항원으로 인식하여 결합을 일으키는 특성을 분자인지도구로 이용한다. 특정 분석 대상물에 대한 항체는 실험 동물에 주입하여 생산이 가능하며, 생물 유래 물질이 아닌 인공유기물에 대해서도 항체를 생산할 수 있는 장점으로 인해 바이오센서의 분자인지물질로 널리 사용되고 있다. 그러나, 항체를 이용한 진단용 바이오센서는 분자 구조가 큰 항체로 인해 항체를 생산하는데 어려움이 있으며 변형 또한 용이하지 못하다는 단점이 있다. 또한, 항체는 동물이나 세포를 이용하여 만들기 때문에 대량 생산에 많은 시간과 비용이 들고, 만든 시기에 따라 기능성이 달라질 수 있다는 단점이 있어 항체 기반의 바이오센서의 정확도에 많은 영향을 미친다. 뿐만 아니라, 항체는 실온에서 보관이나 운반이 어려워 장시간 또는 반복 사용이 요구되는 진단용 바이오센서로 사용하는데 문제가 있다.

대한민국 공개특허 제2014-0146302호 (2014.12.26)

본 발명의 목적은 항체를 대체할 수 있는 분자인지물질로 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 앱타머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 카나마이신을 분리 및 검출할 수 있는 상기 앱타머의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 환원 그래핀 산화물 기반의 상기 앱타머를 이용한 카나마이신의 검출방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 1에 기재되고, 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 단일가닥 핵산 앱타머를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 센서를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1에 기재되고, 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 단일가닥 핵산 앱타머를 시료와 접촉시켜 카나마이신-앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 카나마이신-앱타머 복합체로부터 신호를 측정하는 단계를 포함하는 카나마이신의 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 내지 5 중 어느 하나에 기재되고, 카나마아신에 특이적으로 결합 가능한 형광 핵산 앱타머와 환원 그래핀 산화물(reduced graphene oxide)을 시료와 접촉시켜 카나마이신-앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 카나마이신-앱타머 복합체로부터 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 카나마이신의 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 이용하여 시료에서 카나마이신을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 분리용 키트를 제공한다.

본 발명은 카나마이신 특이적 단일가닥 DNA 앱타머를 이용하여 카나마이신을 검출하는 효과를 제공한다.

또한, 본 발명은 환원 그래핀 산화물과 형광 표지된 단일가닥 DNA 앱타머의 결합에 의한 소광이 카나마이신과 단일가닥 DNA 앱타머의 복합체 형성을 통해 형광이 다시 나타나게 되는 신호 변화를 측정하여 가축의 도축 전에 잔류하는 카나마이신의 존재 또는 농도를 측정하는 효과를 제공한다.

상기의 앱타머-환원 그래핀 산화물 기반의 앱타 센서는 항생물질 외에도 환경호르몬, 중금속과 같은 환경유해물질 검출 시스템으로 이용될 수 있다.

도 1은 카나마이신 검출용 핵산 앱타머 Apt 3-1(45-mer)에 대해 추가적인 변형이 가해진 Apt 3-1(39-mer)의 염기서열 및 2차 구조 예측도를 나타낸 것이다.
도 2는 분자 도킹 프로그램을 이용한 2차 변형된 Apt 3-1과 카나마이신의 결합 부위 예측 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 형광 표지된 카나마이신 검출용 DNA 앱타머 2(60-mer)와 본 발명의 DNA 앱타머 3-1(39-mer)의 카나마이신과의 결합력 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 DNA 앱타머 3-1과 환원 그래핀 산화물을 형광 앱타 센서로 사용하기 위한 환원 그래핀 산화물의 농도, 환원 그래핀 산화물 반응시간, 앱타머-카나마이신 반응 시간, 최적 반응 pH 조건을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 DNA 앱타머 3-1과 환원 그래핀 산화물을 이용한 형광 앱타 센서의 원리를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 형광 앱타 센서를 이용한 카나마이신 검출 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 형광 앱타 센서의 특이도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 형광 앱타 센서의 혈청 수준에서의 특이도 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 형광 앱타 센서의 전처리/ 실제 우유 내에서의 카나마이신 검출 분석 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본 명세서에서, 용어 "핵산 앱타머(Aptamer)"란, 특정 분자에 고친화성 및 특이성을 결합할 수 있는 핵산 분자를 의미하며, 상기 핵산은 DNA, RNA 또는 핵산 변형체를 의미한다. 본 발명의 핵산 앱타머는 단일가닥 DNA, RNA 등의 형태로 제공되며, 본 발명의 핵산 앱타머는 SEQ ID NO: 1 내지 5의 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 핵산 앱타머는 전형적으로는 타겟 분자의 결합에 대한 시험관내 선택법에 의해 얻을 수 있다. 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선택하는 방법은 당 분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 유기 분자, 뉴클레오타이드, 아미노산, 폴리펩타이드, 세포 표면상의 마커분자, 이온, 금속, 염, 다당류가 각 리간드에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머를 분리하는 적절한 타겟 분자가 될 수 있다. 앱타머의 선별은 SELEX(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment) 방법으로 공지된 생체내 또는 시험관내 선택 기술을 이용할 수 있다(Ellington et al., Nature 346, 818-22, 1990; 및 Tuerk et al., Science 249, 505-10, 1990). 앱타머의 선별 및 제조에 대한 구체적인 방법은 미국특허 5,582,981, WO 00/20040, 미국특허 5,270,163, Lorsch and Szostak, Biochemistry, 33:973(1994), Mannironi et al.,Biochemistry 36:9726 (1997), Blind, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610 (1999), Huizenga and Szostak, Biochemistry, 34:656-665 (1995), WO 99/54506, WO 99/27133, WO 97/42317 및 미국특허 5,756,291에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

SELEX는 무작위 서열(randomized sequences)로 구성된 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 풀(pool) 또는 라이브러리를 필요로 한다. 본 발명에서의 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 100개 미만의 핵산을 포함하는 핵산 중합체를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드는 변형 또는 변형되지 않은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드 풀은 100% 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열이 무작위 서열 부위에 포함된 무 작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 풀은 5' 및/또는 3'말단이 올리고뉴클레오타이드 풀의 모든 분자에서 공유되는 서열로 구성될 수 있는 적어도 하나의 고정된 서열 및/또는 보존 서열을 포함하는 무작위 또는 부분적 무작위 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레이타이드 풀은 바람직하게는 무작위 서열 부분뿐만 아니라. 효과적인 복제를 위해 필수적인 고정된 서열(fixed sequences)을 포함한다.

초기 풀의 올리고뉴클레오타이드는 고정된 5'및 3' 말단 서열을 포함하는데 그 내부에 대략 20-50개의 무작위 뉴클레오타이드가 삽입된다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 30개의 무작위 뉴클레오타이드가 삽입된 라이브러리를 이용하였으며, 서열 증폭 과정에서 상기 뉴클레오타이드 서열 길이는 변화될 수 있다. 무작위 뉴클레오타이드는 화학적 합성 및 무작위로 절단된 세포 내 핵산으로부터 선택함으로써 생산할 수 있다.

올리고뉴클레오타이드는 소정의 길이의 무작위 서열 부분을 포함하고, 리보뉴클레오타이드 및/또는 디옥시리보뉴클레오타이드로 구성될 수 있으며, 변형 또는 변형되지 않은 자연형 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 아날로그일수 있다(U.S. Patent No. 5,958,691; U. S. Patent No. 5,660,985; U.S. Patent No. 5,958,691; U.S. Patent No. 5,698, 687; U.S. Patent No. 5,817, 635; U.S. Patent No. 5,672,695, 및 PCT Publication WO 92/07065). 무작위 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 잘 알려진 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-연결 뉴클레오타이드로부터 합성할 수 있다(Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467(1986), Froehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578(1986)). 또한, 무작위 올리고뉴클레오타이드는 트리에스테르 합성 방법과 같은 액체상 방법을 이용하여 합성할 수 있다(Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557(1977), Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449(1978)).

본 명세서에서, 용어 "바이오센서(Biosensor)"란 생체감지물질(bioreceptor)과 신호변환기(transducer)로 구성되어 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지할 수 있는 센서 제품을 말한다. 생체감지물질로는 특정 물질과 선택적으로 반응 및 결합할 수 있는 효소, 항체, 항원, 멤브레인, 수용체, 세포, 조직 및 DNA (앱타머) 등이 쓰이고 있으며, 신호변환방법으로는 전기화학(electrochemical), 형광, 발색, 광학, 압전 등 다양한 물리화학적 방법을 사용하고 있다. 바이오센서가 기존의 센서와 구별되는 점은 생체물질의 선택적인 반응 및 결합을 이용하는 것으로, 의료(임상적 진단), 환경, 식품 등 다양한 응용분야에 적용 가능하다.

본 명세서에서, 용어 "그래핀"은 독특한 기계적, 전기적, 광학적 성질을 갖는 탄소(C)로 이루어진 물질로서, 최근에는 그래핀의 다양한 화학적 성질(그래핀의 형광물질 소광능력과 그래핀에 의해 촉진되는 세포의 분화 및 성장)을 이용한 바이오센서로의 응용 연구가 많이 이루어지고 있다. 흑연(Graphite)의 산화를 이용한 화학적 박리를 통해 얻을 수 있는 산화 그래핀(Graphene Oxide, GO)는 뛰어난 수용성, 양친매성, 손쉬운 표면 기능화, 형광 소광 능력 등의 특성을 가지고 있어 생물학적 응용에 유망한 물질로 평가되고 있다. 더욱이 환원 그래핀 산화물(Reduced graphene oxide, RGO)의 경우, 산화 그래핀(GO)을 다시 한번 환원시킨 형태로, 산화 그래핀(GO)에 비해 우수한 형광 소광 능력을 갖고 있어, 형광 신호 변환을 통한 바이오센서로의 적용에 많이 이용된다. 산화 그래핀(GO) 및 환원 그래핀 산화물(RGO)를 이용한 다수의 바이오센싱 플랫폼들은 그래핀이 이중가닥 DNA 보다 단일가닥 DNA와 우선적으로 상호작용하는 특성에 의한 것들이다. 단일가닥 DNA 내의 노출된 핵염기(nucleobase)들은 GO/RGO 표면에 강하게 흡착되어 형광 라벨된 단일가닥 DNA의 경우 형광 소광 현상이 나타나게 된다. 반면, 이중가닥 내의 핵염기들은 DNA의 나선형 구조 내에 효과적으로 숨겨지기 때문에 GO/RGO 표면과 핵염기간의 직접적인 상호작용이 저해되어 형광 소광 현상이 나타나지 않게 된다. 본 발명에서는 이러한 원리를 기반으로, 저분자 타겟 물질인 카나마이신과 이와 높은 결합력 및 특이도로 결합하는 단일가닥 DNA 앱타머를 이용하여 앱타머와 타겟 물질이 결합된 상태에서는 이중가닥 DNA와 같은 효과를 유도하여 GO/RGO 표면과의 상호작용이 적어 타겟이 없을 때 소광되어 있던 형광이 다시 나타나게 되는 형광 앱타 센서 시스템을 개발하였다. 더욱이 본 발명에서는 산화 그래핀(GO)에 비해 우수한 형광 소광 능력을 가진 환원 그래핀 산화물(RGO)를 이용하여 형광 앱타 센서의 효율성을 증진시키고자 하였다.

본 명세서에서, 용어 "시료"는 카나마이신을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물로, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 SEQ ID NO: 1에 기재되고, 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 단일가닥 핵산 앱타머에 관한 것이다.

핵산 앱타머는 단일가닥 DNA 또는 RNA로서 제공되는 것으로서, 본 발명에서 상기 핵산이 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U로 표시되며, 이러한 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 SELEX 공정을 통해 선별된 카나마이신에 결합하는 핵산 앱타머(45-mer)에 대해 5‘ 및 3’ 말단에서 특정 구조를 형성하지 않는 6개의 염기를 제거하여 39-mer 길이의 2차 변형된 핵산 앱타머를 사용하였다. 상기 변형된 핵산 앱타머에 대해 M-Fold 프로그램을 통해 2차 구조를 예측하고(도 1), 분자 도킹 프로그래미을 사용하여 카나마이신과의 결합 부위를 예측하였다(도 2). 그 결과, 2차 변형된 DNA 앱타머의 7, 9번째 사이토신(C7)과 카나마이신의 41번째에 수소가 서로 수소결합으로 결합함을 확인할 수 있었고, 2차 변형된 DNA 앱타머의 6번째 구아닌(G6)는 카나마이신과 소수성 상호작용을 하는 것을 확인하였다. 2차 변형된 DNA 앱타머와 카나마이신 간의 결합 에너지는 - 7.2 Kcal/mol 이었다. 39-mer 길이의 2차 변형된 DNA 앱타머의 5‘ 말단에 형광물질을 표지하여 카나마이신과의 결합력을 측정한 결과, 대조군으로 사용한 카나마이신 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 2(60mer)의 경우 24.44 nM, 2차 변형된 39-mer 길이의 앱타머는 65.28 nM의 결합력을 나타내었다. 길이 변형 없이 형광을 연결한 앱타머 2의 경우, 결합력 측면에서 비오틴을 연결하였을 때의 결합력(13.63 nM)과 큰 차이가 없었으나, 2차 변형된 39-mer 길이의 앱타머의 경우, 변형하기 전(89.7 nM)에 비해 더 우수한 결합력 수치를 보이는 것을 확인함으로써, 2차 변형된 39-mer 길이의 앱타머는 효과적으로 카나마이신을 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 2차 변형된 39-mer 길이의 앱타머는 카나마이신과 구조가 유사한 스트렙토마이신, 디하이드로스트렙토마이신 뿐만 아니라, 테트라싸이클린, 앰피실린 등과의 특이도 분석에서, 카나마이신 특이적 검출을 나타내었다.

상기 2차 변형된 39-mer 길이의 앱타머는 바람직하게는, SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명의 앱타머는 이 기술분야에서의 자체 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다.

본 발명의 앱타머는, 카나마이신에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기(예, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것이어도 좋다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2'부위, 3'부위 및/또는 4'부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화, O-알킬화(예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화(예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화(예, -NH)를 들 수 있다. 이러한 당잔기의 변형은, 자체 공지의 방법에 의해 행할 수 있다(예컨대 Sproat et al.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl . Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145 참조).

본 발명의 앱타머는 또한 카나마이신에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기(예, 퓨린, 피리미딘)가 변형(예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5부위 피리미딘 변형, 6 및/또는 8부위 퓨린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다.

또한, 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성이도록, 본 발명의 앱타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR₂(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH₂(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH₂-CH₂-)으로 치환되어 있어도 좋다여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다〕. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.

본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다.

변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(Myristoyl), 리쏘콜릭-올레일(Lithocolic-oleyl), 도코사닐(Docosanyl), 라우로일(Lauroyl), 스테아로일(Stearoyl), 팔미토일(Palmitoyl), 올레오일(Oleoyl), 리놀레오일(Linoleoyl), 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 이러한 변형에 대해서는, 예컨대 미국특허 제5,660,985호, 미국특허 제5,756,703호를 참조한다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 핵산 앱타머는 검출 가능한 표지가 부착되어 있을 수 있다. 핵산 앱타머에 검출 가능한 표지를 부착시킴으로써, 타겟과 핵산 앱타머의 결합 여부 및 결합 정도를 용이하게 관찰 및 측정 가능하다. 상기 검출 가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 모이어티일 수 있고, 특별히 한정되지 않는다.

상기 검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기 화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이다. 상기 표지는 앱타머의 특정 염기 또는 3' 말단 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. 상기 광학적 표지는 예를 들면, 형광물질일 수 있다. 상기 형광물질은 플로레세인(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(cyanine 2), Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 알렉사 플로어, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br 2, 보디피 530/550, 이의 콘쥬게이트화물 및 이들의 배합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 형광 물질은 플로레세인, Cy3 또는 Cy5일 수 있다. 또한, 상기 광학적 표지는, 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 발색소 및 형광 수용자 발색소를 포함하고 도너의 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 형광공명에너지전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍일 수 있다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그의 여기 스펙트럼이 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 또한, 상기 수용자는 넓은 범위의 도너를 켄칭(quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다. 상기 전기화학적 표지는 당업계에 알려진 전기화학적 표지를 포함한다. 예를 들면, 상기 전기화학적 표지는 메틸렌 블루일 수 있다.

본 발명의 카나마이신 검출용 조성물은 상술한 핵산 앱타머 외에도 핵산 앱타머의 안정적인 보관 및 보존을 위한 당업계에 공지된 담체 및/또는 보존제, 안정제 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 환원 그래핀 산화물(reduced graphene oxide)을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 환원 그래핀 산화물이 형광 표지된 핵산 앱타머와 결합하는 경우 형광 소거 변화가 일어나나, 카나마이신의 존재에 의해 앱타머-카나마이신의 복합체를 형성하는 경우, 형광 표지된 핵산 앱타머가 환원 그래핀 산화물의 표면에 흡착하지 못하여 형광 소거 변화가 일어나지 않는다. 이러한 형광 소거의 회복을 통해 카나마이신의 검출이 가능하다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 센서에 관한 것이다.

상기 센서는 핵산 앱타머가 기판, 수지, 플레이트(예, 멀티웰 플레이트), 필터, 카트리지, 컬럼 또는 다공질재의 고상 담체에 고정 형태를 갖는 것일 수 있다.

상기 기판은 DNA 칩이나 단백질 칩 등에 사용되고 있는 것 등일 수 있고, 예컨대 니켈-PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌) 기판이나 유리 기판, 아파타이트(apatite) 기판, 실리콘 기판, 금, 은 또는 알루미나 기판 등으로, 이들의 기판에 폴리머 등의 코팅을 실시한 것을 들 수 있다.

상기 수지는 아가로스(agarose) 입자, 실리카입자, 아크릴아미드와 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체, 폴리스티렌 가교 디비닐벤젠입자, 덱스트란을 에피클로로히드린으로 가교한 입자, 셀룰로오스파이버, 알릴덱스트란과 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 가교폴리머, 단분산계 합성폴리머, 단분산계 친수성폴리머, 세파로오스(Sepharose) 또는 토요펄(Toyopearl) 등을 들 수 있고, 또한 이들의 수지에 각종 관능기를 결합시킨 수지를 사용할 수 있다.

상기 센서는 카나마이신의 분리, 정제, 검출 또는 정량에 유용할 수 있다.

본 발명의 앱타머는 공지의 방법에 의해 고상 담체에 고정할 수 있다. 예컨대, 친화성 물질이 나 소정의 관능기를 본 발명의 앱타머에 도입하고, 계속해서 이 친화성 물질이나 소정의 관능기를 이용하여 고상 담체에 고정화하는 방법을 들 수 있다. 소정의 관능기는 커플링 반응에 제공하는 것이 가능한 관능기일 수 있고, 예컨대 아미노기, 티올기, 히드록실기, 카르복실기를 들 수 있다. 예를 들어, 상기 앱타머의 말단에 바이오틴을 결합시켜 복합체를 형성하고, 상기 칩 등의 기판 표면에 스트렙타비딘을 고정화시켜, 상기 바이오틴과 기판 표면에 고정화된 스트렙타비딘의 상호작용에 의하여 상기 앱타머를 기판 표면에 고정화시킬 수 있다.

앱타머가 고정화된 고상 담체를 이용하여 카나마이신을 검출하는 방법은, 예를 들어, 본 발명의 핵산 앱타머를 칩(chip) 상에 검출 가능한 표지와 함께 스팟팅 시킨 후 대상 시료를 반응시킴으로써 검출 시료, 예를 들어, 혈액, 우유 등에 포함된 미량의 카나마이신의 수준을 신속하게 측정할 수 있다. 또 다른 방법으로는 자성 비드에 상기 핵산 앱타머를 고정화시켜 카나마이신을 결합시키게 되면 결합된 핵산 앱타머-카나마이신 복합체를 자석을 이용하여 분리할 수 있게 되고, 이 복합체로부터 다시 카나마이신을 분리함으로써 카나마이신 만을 선택적으로 검출할 수 있게 된다. 본 발명의 실시예에 기술된 방법 이외에도 본 발명의 핵산 앱타머와 연결자로 연결된 센서를 이용하여 혈액 중의 카나마이신을 검출하는 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 상술한 핵산 앱타머가, 예를 들어 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스, 니트로셀룰로스 또는 유리 슬라이드 등의 지지체 상에 고정화되어 이용될 수 있다. 지지체의 형태에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어 유리 슬라이드와 같이 손으로 잡을 수 있는 박판(薄板) 형태뿐만 아니라, 튜브 형태 또는 액체에 혼합하여 이송할 수 있는 0.1 ㎜ 이하 크기의 비드 형태일 수 있다. 지지체의 표면은 알데히드기, 카복실기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기, N-하이드록시석신이미딜기, 활성화 에스터기 등의 작용기, 특히 에폭시기로 기능화될 수 있다. 다만, 프로브가 고정된 후에는 배경신호 감소를 위해, 잔여 작용기를 블록킹시키는 처리를 통해 안정화시킬 수 있다.

상기 키트는 필요에 따라 완충용액 및 검출의 수행과 분석을 위한 용기들을 포함할 수 있는데, 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, NOS 그룹이 코팅된 DNA BIND 플레이트에 카나마이신을 고정시킨 후, 형광 표지된 SEQ ID NO: 1의 핵산 앱타머를 농도별로 처리하여 형광 강도를 분석한 결과, 농도 의존적으로 우수한 결합력을 보였다.

따라서, 본 발명의 핵산 앱타머는 검출 가능한 표지가 부착되어 있고, 카나마이신과 공유결합 또는 비공유결합을 통해 복합체를 형성함으로써 검출 신호의 변화를 측정하여 카나마이신을 검출할 수 있다. 상기 복합체에 의한 신호 측정은 사용된 검출 신호의 특성에 따라 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있고, 대조군에 비해 증가된 신호를 보이는지 여부를 판단하여 카나마이신의 존재를 확인할 수 있다.

상기 시료는 물, 토양, 폐기물, 식품, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 형광 표지된 SEQ ID NO: 1의 핵산 앱타머는 환원 그래핀 산화물(0.1 mg/mL)과의 상온에서의 반응에서 형광 소광이 확인되었다. 또한, 형광 표지된 핵산 앱타머와 카나마이신을 약 30분 이상 반응시킨 후, 환원 그래핀 산화물을 상기 반응물에 첨가하여 추가 반응시키는 경우, 약 25분 이후 형광이 회복되었다. 아울러, 상기 형광 앱타 센서의 최적 반응 pH는 7.5 내지 9.5 범위에서 최대 형광 회복을 확인할 수 있었다. 이러한 카나마이신 검출은 약 100 nM의 핵산 앱타머의 농도에서 1pM의 카나마이신의 검출 한계를 나타내었다.

따라서, 본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 내지 5 중 어느 하나에 기재되고, 카나마아신에 특이적으로 결합 가능한 형광 핵산 앱타머와 환원 그래핀 산화물(reduced graphene oxide)을 시료와 접촉시켜 카나마이신-앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 카나마이신-앱타머 복합체로부터 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 카나마이신의 검출 방법을 제공한다.

상기 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 표시되는 핵산 앱타머는 SELEX 과정을 통해 선별된 SEQ ID NO:1의 핵산 앱타머의 변형 전 카나마이신 특이 핵산 앱타머이며, SEQ ID NO: 3 내지 5의 핵산 앱타머는 SELEX 과정을 통해 선별된 카나마이신 특이 핵산 앱타머들의 서열 일부가 절단되어 스템-루프 구조만 가지고 있는 앱타머들로, 카나마이신에 대해 우수한 결합력을 가지므로 본 발명의 카나마이신의 검출 방법에 사용할 수 있다. 각 앱타머의 카나마이신에 대한 결합력은 다음과 같다.

SEQ ID NO: 1, 변형된 Apt 3-1: Kd=65.28±42.61 nM

SEQ ID NO: 2, Apt 3-1: Kd=89.7 nM

SEQ ID NO: 3, Apt 1-2: Kd=677 nM

SEQ ID NO: 4, Apt 2-2: Kd=674 nM

SEQ ID NO: 5, Apt 3-2: Kd=252 nM

상기 Kd(Dissociation constant) 값은 카나마이신에 반응시킨 압타머의 해당 농도에 따른 형광 강도를 450 nm에서 측정하여 나타낸 포화곡선으로 정한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 SEQ ID NO:1의 핵산 앱타머는 형광 염료에 의해 표지되어 있어 핵산 앱타머와 환원 그래핀 산화물과의 반응에서 형광이 소광되나, 카나마이신을 첨가하는 경우, 카나마이신-핵산 앱타머의 복합체가 형성되면서 핵산 앱타머는 환원 그래핀 산화물에 제대로 흡착되지 못하여 형광이 회복된다.

바람직하게는, 본 발명의 카나마이신의 검출 방법은 pH 7.5 내지 9.5의 완충용액에서 핵산 앱타머와 환원 그래핀 산화물을 20분 내지 60분 동안 반응시키고, 카나마이신을 함유할 것으로 예상되는 시료를 상기 반응물에 부가하여 10분 내지 60분간 반응시켜 카나마이신-앱타머의 복합체가 형성되도록 할 수 있다.

상기 카나마이신-앱타머의 복합체 형성에 따른 형광 변화를 측정하여 카나마이신을 검출할 수 있다.

상기 형광 변화의 측정은 형광 강도의 증가를 측정하는 것으로, 면역학적 방법과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 예컨대, 효소 면역 측정법(EIA)(예, 직접 경합 ELISA, 간접 경합 ELISA, 샌드위치 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 형광 면역 측정법(FIA), 웨스턴 블롯(blot)법(예, 웨스턴 블롯법에서의 2차 항체 대신에 사용), 면역조직 화학적 염색법, 셀 소팅(cell sorting)법 등의 방법에 의해, 검출 및 정량을 행할 수 있다.

본 발명에 따른 카나마이신에 특이적으로 결합하는 앱타머는 또한, 카나마이신 만을 특이적으로 검출하는바, 이를 포함하여 카나마이신의 분리용 조성물을 제공할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 자명한 것이다.

따라서, 본 발명은 상기 핵산 앱타머를 이용하여 시료에서 카나마이신을 분리하는 방법 및 상기 핵산 앱타머를 포함하는 카나마이신 분리용 키트를 제공한다.

본 발명의 카나마이신의 분리 방법은 상기 핵산 앱타머가 고정된 고상 담체에 시료를 접촉시키고, 상기 고상 담체에 결합된 카나마이신을 용출액에 의해 용출시켜 분리할 수 있다.

상기 고상 담체로의 카나마이신의 결합은 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예컨대 카나마이신을 함유하는 시료(예, 박테리아 또는 세포의 배양물 또는 배양상청, 혈액)를 본 발명의 고상 담체 또는 그 함유물에 도입한다.

카나마이신의 용출은 중성 용액 등의 용출액을 이용하여 수행할 수 있다. 중성 용출액은 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어, pH 약 6∼약 9, 바람직하게는 약 6.5∼약 8.5, 보다 바람직하게는 약 7∼약 8일 수 있다. 상기 중성 용액은 칼륨염(예, NaCl, KCl), 마그네슘염(예, MgCl), 계면활성제(예, 트윈 20, 트리톤, NP40), 또는 글리세린을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 분리방법은 카나마이신의 결합 후, 세정액을 이용하여 고상 담체를 세정하는 과정을 포함할 수 있다. 세정액으로서는 요소, 킬레이트제(예, EDTA), Tris, 산 또는 알칼리 등을 포함하는 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 분리방법은 고상 담체를 가열 처리하는 과정을 포함할 수 있다. 이러한 공정에 의해 고상 담체의 재생, 멸균이 가능하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 카나마이신 검출용 단일가닥 DNA 앱타머와 타겟물질 간의 결합 부위 예측 및 형광 표지 DNA 앱타머와 카나마이신 간의 결합력 분석

GO-SELEX 과정에 의해 선별된 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 핵산 앱타머(Apt 3-1: 45-mer)에 대해 추가적인 변형을 유도하였다. Apt 3-1의 5‘ 및 3’ 말단에서 특정 구조를 형성하지 않는 6개의 염기를 제거하여 39-mer 길이의 2차 변형된 Apt 3-1(Mod. Apt 3-1)을 사용하였고, M-Fold 프로그램을 통한 변형된 Apt 3-1의 2차 구조 예측을 진행하였다(도 1).

Apt 3-1(45-mer): 5'-ACCAACGGAAGCGCGCCACCCCATCGGCGGGCGCGAAGCTTGCGC-3'

2차 변형된 Apt 3-1(39-mer): 5'-CGGAAGCGCGCCACCCCATCGGCGGGCGCGAAGCTTGCG-3'

또한, 분자 도킹 프로그램을 통하여 해당 단일가닥 DNA 앱타머와 카나마이신 간의 결합 부위를 예측하였다(도 2).

예측 결과, 2차 변형된 DNA 앱타머의 7, 9번째 사이토신(C7)과 카나마이신의 41번째에 수소가 서로 수소결합으로 결합함을 확인할 수 있었고, 2차 변형된 DNA 앱타머의 6번째 구아닌(G6)는 카나마이신과 소수성 상호작용을 하는 것을 확인하였다. 2차 변형된 DNA 앱타머와 카나마이신 간의 결합 에너지는 - 7.2 Kcal/mol 이었다.

39-mer 길이의 2차 변형된 DNA 앱타머의 5‘ 말단에 형광물질(FAM)을 표지하여 카나마이신과의 결합력을 측정하였다. 비교 분석을 위하여 카나마이신 검출용 단일가닥 DNA 앱타머 2(60-mer: 5'-atgcggatcccgcgcgaccaacggaagcgcgccaccccatcggcggcgcgaagcttgcgc-3')의 5’ 말단에도 마찬가지로 형광물질(FAM)을 표지하였다. 이후 NOS 그룹이 코팅된 DNA BIND 플레이트에 카나마이신을 고정시킨 후, 앱타머를 농도별로 처리하여 형광 세기(강도)를 분석함으로써, 결합력을 측정하였다(도 3).

도 3에 나타난 바와 같이, 앱타머 2의 경우 24.44 nM, 2차 변형된 앱타머 3-1은 65.28 nM의 결합력을 나타내었다. 길이 변형 없이 형광을 연결한 앱타머 2의 경우, 결합력 측면에서 비오틴을 연결하였을 때의 결합력(13.63 nM)과 큰 차이가 없었으나, 2차 변형된 앱타머 3-1의 경우는, 변형하기 전(89.7 nM)에 비해 더 우수한 결합력 수치를 보이는 것을 확인함으로써, 2차 변형된 앱타머 3-1 역시 효과적으로 카나마이신을 검출할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 2> 환원 그래핀 산화물(RGO)을 이용한 형광 앱타 센서의 조건 최적화

상기 실시예 1의 2차 변형된 단일가닥 DNA 앱타머의 5‘ 말단에 형광물질(FAM)을 연결하였고, RGO의 농도에 따른 형광 라벨된 DNA 앱타머의 형광 소광 능력을 분석하였다.

도 4A에 나타난 바와 같이, 형광 표지된 DNA 앱타머 100 nM을 다양한 농도의 RGO와 30분간 상온에서 반응 후 형광 세기를 측정한 결과, 0.1 mg/mL의 RGO를 사용하였을 때 형광 소광 현상이 충분히 일어난 것을 확인하였다.

RGO와의 반응시간을 최적화시키기 위하여, 100 nM의 형광 라벨된 DNA 앱타머와 1 μM의 카나마이신을 2시간동안 충분히 반응시킨 후, 0.1 mg/mL의 RGO를 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60분 동안 각각 반응시킨 후 형광세기를 측정하였다.

도 4B에 나타난 바와 같이, RGO와의 반응시간을 25분 이후로 진행한 경우에 형광 세기가 최대로 회복되는 것을 확인하였다.

타겟물질인 카나마이신과 형광 라벨된 단일가닥 DNA 앱타머와의 반응시간을 결정하기 위하여, 카나마이신과 앱타머를 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60분 동안 각각 결합시킨 후, RGO와 25분 동안 추가적인 반응을 유도한 후 형광세기를 측정하였다.

도 4C에 나타난 바와 같이, 카나마이신과 DNA 앱타머의 반응은 30분 내에 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

형광 앱타 센서 측정의 최적 반응 pH를 분석하고자, 1X PBS 의 pH를 6, 7, 7.4, 8, 8.5, 9, 10으로 맞춘 후, 위에 설정된 조건에 맞춰 반응을 진행하고, 형광세기를 측정하였다.

도 4D에 나타난 바와 같이, 1×PBS(pH 8.5)에서 최대로 형광 신호가 회복되는 것을 확인하였다.

<실시예 3> 환원 그래핀 산화물(RGO) 및 2차 변형된 Apt 3-1을 이용한 형광 앱타 센서의 카나마이신 검출

환원 그래핀 산화물(RGO)의 형광 소광 능력을 이용하여, 타겟 물질이 존재하지 않을 때에는 형광 표지된 2차 변형된 Apt 3-1이 RGO 표면에 흡착되어 형광 소광 현상이 나타나게 되지만, 타겟 물질 존재 시에는 타겟물질과 2차 변형된 Apt 3-1이 결합한 형태를 유지하여 RGO 표면에 제대로 흡착되지 못하여 형광 소광 현상이 나타나지 않게 된다(도 5). 이러한 원리를 기반으로 상기 실시예 2에서의 최적화된 조건을 토대로 형광 앱타 센서의 카나마이신 검출 효과를 측정하였다.

도 6에서 나타낸 바와 같이, 카나마이신이 존재하지 않을 때에는 형광 소광 현상이 나타났으며, 카나마이신 농도가 증가함에 따라 점차 많은 양의 형광이 회복되어 증가된 형광 세기가 측정되었으며, 2차 변형된 Apt 3-1 100 nM을 이용한 형광 앱타 센서를 통하여 1 pM의 카나마이신까지 검출 가능하였다.

<실시예 4> 환원 그래핀 산화물(RGO) 및 2차 변형된 Apt 3-1을 이용한 형광 앱타 센서의 특이도 분석

상기 실시예에서 사용한 환원 그래핀 산화물(RGO) 및 2차 변형된 Apt 3-1을 이용한 형광 앱타 센서의 특이도를 분석하고자 카나마이신과 같은 계열의 항생제인 스트렙토마이신(Streptomycin), 디하이드로스트렙토마이신(Dihydrosrtreptomycin), 다른 계열 항생제인 앰피실린(Ampicillin), 테트라싸이클린(Tetracycline)에 대하여 실험을 진행하였다. 측정 방법은 상기 실시예 3의 방법과 동일하며, 2차 변형된 Apt 3-1 100 nM 및 각각의 항생제 1 μM을 처리하여 형광 세기를 분석하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, 2차 변형된 Apt 3-1의 우수한 특이도로 인해 본 형광 앱타 센서에서도 카나마이신에서만 높은 세기의 형광이 회복되는 것을 확인할 수 있었고, 다른 항생제에 대해서는 형광 회복 정도가 낮았다. 특히 테트라싸이클린 및 앰피실린에 대해서는 무시할 정도의 형광 회복을 나타내었다. 또한, 카나마이신과 구조가 유사한 스트렙토마이신, 디하이드로스트렙토마이신에 대해서도 특이도를 나타냄으로써 아미노글리코사이드 계열 항생제 중에서 카나마이신을 구별하여 검출할 수 있음을 확인하였다.

<실시예 5> 환원 그래핀 산화물(RGO) 및 2차 변형된 Apt 3-1을 이용한 형광 앱타 센서의 혈청 수준에서의 특이도 분석

본 발명은 최종적으로 가축 도축 전 혈액 샘플에 존재하는 카나마이신을 특이적으로 검출할 수 있는 센서시스템 개발을 위한 것으로 이에 상기 실시예 4와 같이 다른 항생제에 대한 특이도 뿐만 아니라 혈액 샘플과 유사한 혈청 수준에서의 특이도도 분석하였다. 혈청 수준에서의 특이도 분석은 BS(Bovine serum, 소혈청), RS(Rabbit serum, 토끼혈청)에 대하여 진행하였다. 실험 방법은 상기 실시예 3에서의 방법과 같으며 각 혈청에 다양한 농도의 카나마이신을 처리하여 만든 샘플을 최종적으로 형광 앱타 센서로 분석하였다.

소 혈청 및 토끼 혈청에 임의적으로 카나마이신을 처리한 경우에 있어서도 카나마이신을 100 pM까지 검출가능하였고, 각 혈청에 대한 형광 앱타 센서의 비특이적 신호가 감지되었으나, 카나마이신 검출에 있어 크게 영향을 미치는 정도는 아님을 확인하였다(도 8).

<실시예 6> 환원 그래핀 산화물(RGO) 및 2차 변형된 Apt 3-1을 이용한 형광 앱타 센서의 우유/전처리 우유 속 카나마이신 검출 분석

본 발명은 최종적으로 가축 도축 전 혈액 샘플에 존재하는 카나마이신을 특이적으로 검출할 수 있는 센서시스템 개발을 위한 것으로 이에 상기 실시예 4와 같이 다른 항생제에 대한 특이도 뿐만 아니라 실시예 5와 같이 혈액 샘플과 유사한 혈청 수준에서의 특이도도 분석하였다. 또한, 다른 생물학적 샘플 내에서의 카나마이신 검출을 확인함으로써 본 발명에서의 환원 그래핀 산화물(RGO) 및 2차 변형된 Apt 3-1을 이용한 형광 앱타 센서의 검출 타당성을 확인하고자 하였다. 이에 시중에서 판매하는 우유와 전처리하는 과정을 통해 단백질 및 지방 등 기타 다양한 성분을 제거한 전처리 상태의 우유에 다양한 농도의 카나마이신을 처리하여 만든 샘플을 최종적으로 형광 앱타 센서로 분석하였다.

전처리를 진행한 우유 샘플에서는 앱타머와 비특이적 결합을 유도할 성분이 적어, 상기 실시예 3에서와 같이 1 pM의 카나마이신까지 검출 가능함을 확인하였다(도 9A). 반면에 실제 우유 샘플에서는 우유 속 다양한 성분과의 비특이적 결합으로 인해 검출한계가 보다 증가된 20 pM까지 검출 가능함을 확인하였다(도 9B).

본 발명에서 개발한 앱타 센서 시스템을 통하여 다양한 샘플 내에서의 카나마이신 검출이 가능함을 확인하였다.

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Novel reduced graphene oxide-based aptasensor for detecting kanamycin and use thereof <130> P16U10C1286 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified aptamer 3-1 for detecting Kanamycin <400> 1 cggaagcgcg ccaccccatc ggcgggcgcg aagcttgcg 39 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-modified aptamer 3-1 for detecting Kanamycin <400> 2 accaacggaa gcgcgccacc ccatcggcgg gcgcgaagct tgcgc 45 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-modified aptamer 1-2 for detecting Kanamycin <400> 3 cgcgccgacg tcagagaggc gcg 23 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-modified aptamer 2-2 for detecting Kanamycin <400> 4 cgccacccca tcggcggcg 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-modified aptamer 3-2 for detecting Kanamycin <400> 5 cgccacccca tcggcgggcg 20

Claims

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SEQ ID NO: 1에 기재되고, 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 단일가닥 핵산 앱타머; 및
환원 그래핀 산화물(reduced graphene oxide)을 포함하는 카나마이신 검출용 조성물.
제2항에 있어서,
핵산 앱타머는 검출 가능한 표지가 부착된 것인, 카나마이신 검출용 조성물.
제3항에 있어서,
검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기 화학적 표지, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합인, 카나마이신 검출용 조성물.
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SEQ ID NO: 1에 기재되고, 카나마이신에 특이적으로 결합 가능한 형광 핵산 앱타머와 환원 그래핀 산화물(reduced graphene oxide)을 시료와 접촉시켜 카나마이신-앱타머 복합체를 형성하는 단계; 및
상기 카나마이신-앱타머 복합체로부터 형광 변화를 측정하는 단계를 포함하는 카나마이신의 검출 방법.
제12항에 있어서,
형광 변화를 측정하는 것은 형광 강도의 증가를 측정하는, 카나마이신의 검출 방법.
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