CN110967389B - 一种基于双嵌段dna的电化学适配体传感器的构筑及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的构筑方法，将含有Poly‑C和卡那霉素适配体序列的双嵌段DNA与氧化石墨烯混合制得含Poly‑C的双嵌段DNA‑氧化石墨烯复合物，将其滴涂在多壁碳纳米管修饰的玻碳电极表面，再用质量百分数为1~2%的牛血清白蛋白进行修饰，得到双嵌段DNA的电化学适配体传感器。本发明基于Poly‑C与氧化石墨烯的物理吸附作用，设计了一种一端含有Poly‑C序列，另一端含有卡那霉素适配体序列的双嵌段DNA，从而构筑了一种电化学适配体传感器，该传感器的构筑方法简便，不需要任何标记物来修饰，制作成本低，实现了对卡那霉素灵敏，快速，高效的检测。

Description

一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的构筑及应用
技术领域
本发明涉及一种基于双嵌段DNA电化学适配体传感器的构建，主要用于卡那霉素的检测，属于电化学传感器和分析检测领域。
背景技术
卡那霉素(KAN)具有强的杀菌作用，因此，它被广泛应用于动物疾病的治疗。然而，卡那霉素的过量使用会使得它在动物源性食品中残留，进而危害人体健康，例如，引发肾脏中毒以及对人听力造成损伤。所以，急需发展一种快速，灵敏检测抗生素残留的方法。
近年来，已经有许多文献报道了检测抗生素残留的方法，比如比色分析法，荧光分析法，高效液相色谱分析法以及免疫分析法等。但是，以上检测技术存在实验成本过高，干扰过大，耗时以及免疫分析中所用抗原抗体的制备复杂等一系列缺点。相比而言，适配体的合成技术简单，易于修饰，特异性高，已逐渐发展成为研究者们优先选择的识别探针。因此，如何在不损害适配体活性的前提下，将其完美的修饰在电极表面是一个重要挑战。根据相关文献，15个重复的胞嘧啶序列(Poly-C)与氧化石墨烯可以完成最佳的吸附，相比于化学的共价结合作用，物理吸附能够最大限度地避免对适配体活性的损伤。因此，设计一端含有Poly-C，另一端含有目标物适配体的双嵌段DNA，该双嵌段DNA在传感器的构筑中具有大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的构筑方法；
本发明的另一目的是提供上述构筑的双嵌段DNA电化学适配体传感器在卡那霉素检测中的应用。
本发明构筑的基于双嵌段DNA电化学适配体传感器的方法，首先是将多壁碳纳米管(MWCNTs)滴涂在经过清洗处理的玻碳电极表面；然后，将含有15个重复的胞嘧啶序列(Poly-C)和卡那霉素适配体序列的双嵌段DNA与氧化石墨烯混合，制得含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物，将其滴涂在多壁碳纳米管修饰的玻碳电极表面，为减小非特异性吸附，再用质量百分数为1~2%的牛血清白蛋白(BSA)进行修饰，得到双嵌段DNA的电化学适配体传感器。本发明构筑的传感器不仅通过Poly-C与氧化石墨烯的吸附作用固定了卡那霉素适配体，而且还通过多壁碳纳米管的修饰提高了传感器的灵敏度，实现对卡那霉素的高效检测。其具体构筑方法，包括以下工艺步骤：
一、基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的构筑
（1）含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物的制备：将含Poly-C的双嵌段DNA序列与氧化石墨烯加入pH=7.5的缓冲溶液中，于室温下反应10~12h，离心，洗涤，得到含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物。其中，氧化石墨烯与含Poly-C的双嵌段DNA序列的质量比为1:0.1~1:0.11；缓冲溶液组分为：120~150 mM NaCl，0.8~1 mM MgCl2，20~25 mMHEPES。
玻碳电极在进行修饰之前，先以Al2O3为抛光剂，将玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，再用无水乙醇:超纯水=1:1（v:v）的混合溶液及超纯水依次超声清洗5min，最后用氮气吹干。
（2）多壁碳纳米管在玻碳电极上的修饰：将酸化的多壁碳纳米管超声分散在壳聚糖溶液中，采用滴凃法将其滴凃于玻碳电极表面，自然晾干。其中，壳聚糖的质量百分数为0.5~1%；酸化的多壁碳纳米管分散在壳聚糖溶液中的浓度为1~2mg/mL；多壁碳纳米管的酸化：将多壁碳纳米管加入浓硫酸与浓硝酸的混合溶液中，于55~60℃加热搅拌6~8h，过滤，洗涤，干燥，即得酸化的多壁碳纳米管；浓硝酸与浓硫酸的体积比为1:1~1:3。
（3）含Poly-C双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物的固定：将含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物滴涂在步骤（2）制备的修饰玻碳电极表面，并将修饰电极于0~4℃条件下密封进行干燥。
（4）牛血清白蛋白的修饰：将质量百分数为1~2%的牛血清白蛋白滴加到步骤（3）制备的修饰玻碳电极表面，在室温下孵育1~2h，即得双嵌段DNA电化学适配体传感器。
二、基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的表征
1、扫描电镜
图1为多壁碳纳米管修饰的玻碳电极(A)与含Poly-C的双嵌段DNA序列修饰的玻碳电极(B)的扫描电镜图。由图1(A)可看出，多壁碳纳米管具有相对光滑的形貌，并且在玻碳电极表面呈现出高度缠绕的状态。图1(B)为含Poly-C的双嵌段DNA序列修饰的玻碳电极扫描电镜图，从图中可以明显看到DNA已吸附在褶皱状的氧化石墨烯上，这说明Poly-C与氧化石墨烯之间具有较强的吸附作用。
2、循环伏安曲线
将裸玻碳电极(GCE)，多壁碳纳米管修饰的玻碳电极(MWCNTs/GCE)、含Poly-C的双嵌段DNA修饰的玻碳电极(Poly-C DNA/MWCNTs/GCE)、牛血清白蛋白修饰的玻碳电极(BSA/Poly-C DNA/MWCNTs/GCE)和结合了卡那霉素(500pM)的电极(KAN/BSA/Poly-C DNA/MWCNTs/GCE)分别在浓度为0.2 M，pH =7.4的磷酸缓冲液中进行循环伏安检测，该磷酸缓冲溶液中含有5.0 mM [Fe(CN)6]3-/4- 和0.1 M KCl。电压范围设置为: -0.2-0.6V，扫描速率为：0.05V/s。
裸电极(GCE)(a)和不同修饰电极MWCNTs/GCE(b)、Poly-C DNA/MWCNTs/GCE(c)、BSA/Poly-C DNA/MWCNTs/GCE(d)、KAN/BSA/Poly-C DNA/MWCNTs/GCE(e)的循环伏安曲线如图2所示。从图中可以看出，GCE的峰电流是最小的(曲线a)，然而，在玻碳电极被修饰上多壁碳纳米管之后，它的峰电流是最大的(曲线b)。这一现象主要由多壁碳纳米管良好的电化学属性所引起，因为它具有大的比表面积和快速的电子转移速率。但是，当依次修饰上含Poly-C的DNA序列以及牛血清白蛋白之后，峰电流又开始降低(曲线c，d)，这是由于含Poly-C的DNA序列和牛血清白蛋白的修饰降低了电极表面的电子转移速率。而且，在修饰电极捕获目标物卡那霉素之后，卡那霉素-适配体复合物的形成进一步阻碍电子转移，造成峰电流信号的降低(曲线e)。
三、基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器对卡那霉素的检测
1、检测条件与方法：采用微分脉冲伏安法，扫描电位为-0.1-0.4V，脉冲幅度为50mV，脉冲周期为50 ms，在含有5.0 mM [Fe(CN)6]3-/4- 和0.1 M KCl的浓度为0.2 M，pH =7.4的磷酸缓冲液中对不同浓度的卡那霉素进行检测。在每次进行检测之前，都需要将滴涂有卡那霉素的双嵌段DNA电化学适配体传感器在一个密闭容器中孵育40min，这是为了让卡那霉素能够与其适配体达到最佳的结合。
2、结果判断：不同卡那霉素浓度下所得的微分脉冲伏安曲线图如图3所示，从图中可以看出，卡那霉素浓度在0.05 pM-100 nM的范围内，随着卡那霉素浓度的逐渐增大，微分脉冲伏安曲线(a~h)的峰电流值逐渐减小，将不同卡那霉素浓度下所对应的峰电流与浓度的对数值进行线性拟合得到线性回归曲线(图4)，可以看出不同卡那霉素浓度所对应的峰电流与浓度的对数值呈现良好的线性关系，其线性回归方程为I(μA) = -130.466+3.089lgC[KAN] (pM)(R2=0.997)，检测限为0.0476 pM。
综上所述，本发明基于Poly-C与氧化石墨烯的物理吸附作用，设计了一种一端含有Poly-C序列，另一端含有卡那霉素适配体序列的双嵌段DNA，从而构筑了一种电化学适配体传感器。该传感器的构筑方法简便，不需要任何标记物来修饰，制作成本低。该传感器实现了对卡那霉素灵敏，快速，高效的检测。
附图说明
图1为多壁碳纳米管修饰的玻碳电极(A)与含Poly-C的双嵌段DNA序列修饰的玻碳电极(B)的扫描电镜图。
图2为裸电极(GCE)(a)和不同修饰电极MWCNTs/GCE(b)、Poly-C DNA/MWCNTs/GCE(c)、BSA/Poly-C DNA/MWCNTs/GCE(d)、KAN/BSA/Poly-C DNA/MWCNTs/GCE(e)的循环伏安曲线图。
图3为不同卡那霉素浓度下双嵌段DNA电化学适配体传感器的微分脉冲伏安曲线图。
图4为不同浓度的卡那霉素所对应的峰电流与浓度的对数值进行线性拟合得到的线性回归曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对于本发明双嵌段DNA电化学适配体传感器的构建方法及应用作进一步说明。
1、基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的构筑
（1）含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物的制备：首先，利用Tri-HCl (pH=8.0)溶液将含Poly-C的双嵌段DNA序列稀释至100μM，将100μL的氧化石墨烯(5mg/mL) 加入到离心管中，然后加入50μL双嵌段DNA序列(100μM)，用150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 25 mMHEPES (pH =7.5)缓冲溶液定容至500μL，于室温条件下反应12h，反应完成后在8000 rpm条件下，用上述缓冲液离心洗涤三次，每次6min，得到含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物。
（2）多壁碳纳米管在玻碳电极上的修饰：将酸化的多壁碳纳米管用质量百分数为1%的壳聚糖溶液超声分散，配制成2mg/mL的溶液，用移液枪移取10μL酸化的多壁碳纳米管，将其滴涂在玻碳电极上，在室温条件下自然晾干。
多壁碳纳米管的酸化：称取0.5g多壁碳纳米管，将其加入到250mL的圆底烧瓶中，再加入100mL体积比为1:3的浓硝酸与浓硫酸的混合溶液，于60℃下搅拌8 h，待冷却至室温后，将所得溶液用聚四氟乙烯滤膜(0.22μm)进行过滤，并用去离子水洗涤，洗至滤液无色透明，且呈中性，于80 ℃下干燥并研成粉末，得酸化的多壁碳纳米管。
（3）含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物的固定：将10μL由步骤（1）制备含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物滴涂在步骤（2）制备的多壁碳纳米管修饰的玻碳电极表面，然后将修饰电极放置在4℃的密闭条件下，让其干燥。
（4）牛血清白蛋白的修饰：将10μL质量百分数为1%的牛血清白蛋白滴加到步骤（3）制备的修饰电极表面，让其在室温条件下孵育1小时，即得双嵌段DNA电化学适配体传感器。
2、基于双嵌段DNA电化学适配体传感器对卡那霉素的检测
采用微分脉冲伏安法，扫描电位为-0.1-0.4V，脉冲幅度为50 mV，脉冲周期为50ms，在含有5.0 mM [Fe(CN)6]3-/4- 和0.1 M KCl的浓度为0.2 M，pH =7.4的磷酸缓冲液中对配制的浓度为50pM的卡那霉素进行检测，测定峰电流为-125.157μA，并通过线性回归方程为I(μA) = -130.466+3.089 lgC[KAN] (pM)(R2=0.997)，计算卡那霉素的浓度为52.33pM。

Claims (8)

1.一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的制备方法，包括以下工艺步骤：
（1）含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物的制备：将含有15个重复的胞嘧啶序列和卡那霉素适配体序列的双嵌段DNA与氧化石墨烯混合，加入到pH=7.5的缓冲溶液中，于室温下反应10~12h，离心，洗涤，得到含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物；
（2）多壁碳纳米管在玻碳电极上的修饰：将酸化的多壁碳纳米管超声分散在壳聚糖溶液中，采用滴涂法将其滴涂于玻碳电极表面，自然晾干；
（3）含Poly-C双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物的固定：将步骤（1）制备的含Poly-C的双嵌段DNA-氧化石墨烯复合物滴涂在步骤（2）制备的修饰玻碳电极表面，于0~4℃条件下密封进行干燥；
（4）牛血清白蛋白的修饰：将质量百分数为1~2%的牛血清白蛋白滴加到步骤（3）制备的修饰玻碳电极表面，在室温下孵育1~2h，即得双嵌段DNA电化学适配体传感器。
2.如权利要求1所述一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，氧化石墨烯与含Poly-C的双嵌段DNA序列的质量比为1:0.1~1:0.11。
3.如权利要求1所述一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，缓冲溶液组分为：120~150 mM NaCl，0.8~1 mM MgCl2，20~25 mM HEPES。
4.如权利要求1所述一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，壳聚糖的质量百分数为0.5~1%；酸化的多壁碳纳米管分散在壳聚糖溶液中的浓度为1~2mg/mL。
5.如权利要求1所述一种基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，多壁碳纳米管的酸化：将多壁碳纳米管加入浓硫酸与浓硝酸的混合溶液中，于55~60℃加热搅拌6~8h，过滤，洗涤，干燥，即得酸化的多壁碳纳米管；浓硝酸与浓硫酸的体积比为1:1~1:3。
6.如权利要求1所述方法制备的基于 双嵌段DNA的 电化学适配体传感器在检测卡那霉素中的应用。
7.如权利要求6所述基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器在检测卡那霉素中的应用，其特征在于：电化学工作站电压为-0.1~0.4V的条件下，在含有5.0 mM [Fe(CN)6]3-/4-和0.1M KCl的浓度为0.2 M，pH =7.4的磷酸缓冲液中，采用微分脉冲伏安法进行检测：电流在卡那霉素浓度为0.05 pM ~100 nM范围内与卡那霉素浓度的对数值呈现良好的线性关系。
8.如权利要求7所述基于双嵌段DNA的电化学适配体传感器在检测卡那霉素中的应用，其特征在于：电流与卡那霉素浓度的对数值的线性回归方程如下：
I = -130.466+3.089 lgC(R2=0.997)
I——电流，单位：μA
C——卡那霉素浓度，单位：pM。
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