CN109725165A - 一种基于多胞嘧啶的核酸适配体检测可卡因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于多胞嘧啶的核酸适配体检测可卡因的方法。本发明使用多胞嘧啶修饰可卡因核酸适配体并荧光标记，氧化石墨烯对修饰后的可卡因核酸适配体进行物理性吸附，吐温20去除GO表面对可卡因的吸附，以此来检测可卡因；加入吐温20后荧光恢复明显优于没有加入吐温20时，利用GO吸附具有Poly‑C的可卡因适配体，无需额外化学修饰DNA，还能有效固定DNA进行淬灭，poly‑C修饰的可卡因适配体能有效降低合成成本，方法简单、快速准确且灵敏性高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于多胞嘧啶的核酸适配体检测可卡因的方法。
背景技术
可卡因是一种能严重危害人类身心健康的兴奋剂，会造成一系列精神性疾病，甚至死亡。寻找高灵敏的检测方法对治疗以及预后等具有十分重要的意义，目前，传统的可卡因检测主要通过色谱、光谱及电化学等技术。但是，这些方法存在程序复杂，耗时长，成本高等不足之处。随着科技的发展，DNA功能化纳米材料吸引了广泛的研究兴趣，传感器领域对可卡因的检测包括电化学传感器、酶联免疫传感器、压电传感器、场效应晶体管传感器等。这些传感器同样存在一些问题，如背景信号强，检测极限低，操作复杂，成本高。
发明内容
针对以上问题，本发明的目的是针对现有的可卡因检测方法的缺陷，提供一种操作简便、灵敏度高、选择性强、成本低的检测可卡因的方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
提供一种检测可卡因的方法，使用多胞嘧啶(Poly-C)修饰可卡因核酸适配体并荧光标记，氧化石墨烯（GO）对修饰后的可卡因核酸适配体进行物理性吸附，吐温20去除GO表面对可卡因的吸附，以此来检测可卡因的方法；具体包括如下步骤：
（1）使用Poly-C以及羧基荧光素（FAM）对可卡因核酸适配体进行修饰和荧光标记，加入到磷酸缓冲盐溶液中配置成Poly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液；
（2）加入氧化石墨烯（GO）对Poly-C修饰及荧光标记后的可卡因核酸适配体的DNA进行淬灭，得到Poly-C-GO可卡因核酸适配体；
（3）在步骤（2）中得到的Poly-C-GO可卡因核酸适配体中加入吐温20进行修饰，并测量其在520nm处的荧光强度F0；
（4）吐温20修饰后的Poly-C-GO可卡因核酸适配体中加入不同浓度可卡因标准溶液，进行荧光恢复，并测量在520nm处加入可卡因后的荧光强度F；
（5）计算加入可卡因前后的荧光增长率F/F0–1，以可卡因标准溶液浓度为横坐标，以荧光增长率为纵坐标，得到可卡因浓度的标准曲线；
（6）将待测可卡因样本按照步骤（1）-步骤（4）的方法获得加入待测可卡因后的荧光强度值F’，代入到步骤（5）得到的标准曲线中，获得待测可卡因样本的浓度。
按上述方案，步骤（1）中所述的修饰是对可卡因核酸适配体片段进行Poly-C修饰，Poly-C修饰后的可卡因核酸适配体片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，即：5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3。所述的序列由上海生工合成并进行荧光修饰，之后加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）。
按上述方案，步骤（2）中所述的GO的浓度为5-7µg/mL。
按上述方案，步骤（3）中所述的吐温20浓度为0.01%-1%。
按上述方案，步骤（4）中所述的荧光恢复温度为室温，时间为20-40min。
按上述方案，步骤（5）中所述，所述标准曲线在0.01-50 nM范围内，线性回归方程为：F/F0=4.54157C+0.82081，线性相关系数为0.99263，C为可卡因浓度，单位为nM。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明检测可卡因的方法利用poly-C和末端用FAM修饰的可卡因适配体结合，形成一条单核苷酸链，当单核苷酸链与GO结合后，产生荧光能量共振转移，荧光淬灭，加入吐温20进行修饰，吐温20覆盖在GO表面，可以阻止传感器表面的非特异性吸附，提高检测灵敏性；在此基础上加入可卡因以后，可卡因和poly-C修饰的可卡因适配体结合，形成发夹结构，相对远离GO表面，荧光恢复，从荧光的恢复情况来检测可卡因的含量；本发明加利用GO吸附具有Poly-C的可卡因适配体，无需化学修饰DNA，能有效固定DNA进行淬灭，poly-C修饰的可卡因适配体能有效降低合成成本，方法简单、快速准确且灵敏性高。
附图说明
图1是吐温20（0.05%）存在下Poly-C可卡因核酸适配体对不同浓度可卡因的灵敏性分析图；其中，图1（A）为加入不同浓度可卡因之后的荧光强度对照图；1（B）为可卡因浓度荧光增长率的三次测定平均值；
图2是不同浓度的GO对Poly-C可卡因核酸适配体淬灭后的荧光强度对照图；
图3是Poly-C可卡因核酸适配体对不同浓度可卡因的灵敏性分析图；其中，图3（A）为加入不同浓度可卡因之后的荧光强度对照图；3（B）为三次测试中可卡因浓度的[F/F0]测定平均值；
图4是Poly-C-GO可卡因核酸适配体的选择性分析图；
图5是不同浓度的吐温20对Poly-C-GO可卡因核酸适配体的荧光强度对照图；其中，图5（A）中黑色柱状条表示的是加入吐温20的荧光强度，灰色柱状条表示的是加入吐温20及可卡因的荧光强度；5（B）为5（A）中两种柱状条的差值变化。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。
实施例1：
对可卡因核酸适配体片段进行Poly-C修饰，Poly-C修饰后的可卡因核酸适配体片段序列如SEQ ID NO.1所示，即为：5’-CCCCCCCCCCCCCCCCCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3，所述的序列由上海生工合成并进行FAM荧光修饰（FAM修饰的DNA在520nm处有特征吸收峰），之后加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）配置成10μM终浓度的Poly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液，-20℃保存；
在600µL含有20nMPoly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液中加入5µg/ml的GO，室温下反应半小时，得到Poly-C-GO可卡因核酸适配体；
向含有6µg/mLGO和20nMPoly-C修饰的Poly-C-GO可卡因核酸适配体溶液中加入浓度为0.05%的吐温20，室温反应30分钟后测量其荧光强度值，吐温20修饰后的Poly-C-GO可卡因核酸适配体中加入浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、20、50nM的标准可卡因溶液，室温反应40min后测量其荧光强度值，并计算出各自浓度下的荧光增长率，建立可卡因检测标准曲线，标准曲线的绘制以可卡因标准溶液浓度为横坐标，以荧光增长率为纵坐标，得到可卡因浓度的工作曲线，对应待测可卡因溶液的增长率反推出待测可卡因的浓度。在0.01-50nM范围内，线性回归方程为：F/F0=4.54157 C + 0.82081，线性相关系数（R2）为0.99263，C为可卡因浓度，单位为nM，当R2越接近1时，表示相关的方程式参考价值越高。
图1是吐温20（0.05%）存在下Poly-C可卡因核酸适配体对不同浓度可卡因的灵敏性分析图；其中，图1（A）为加入不同浓度可卡因之后的荧光强度对照图；图1（B）为可卡因浓度荧光增长率的三次重复测定平均值；由图1可见，荧光强度出现了较明显的恢复；在0.05％吐温20存在下，荧光强度的校准曲线随可卡因浓度的增加而增加；由检测极限的计算公式3σ/slope可知，用吐温20对Poly-C修饰的Poly-C-GO可卡因核酸适配体进行修饰后，检测极限由0.0873nM提高到2.456pM，检测极限明显提高。
实施例2：
一种基于多胞嘧啶的核酸适配体检测可卡因的方法，包括以下步骤：
（1）对可卡因核酸适配体片段进行Poly-C修饰，Poly-C修饰后的可卡因核酸适配体片段序列如SEQ ID NO.1所示，所述的序列由上海生工合成并进行FAM荧光修饰（FAM修饰的DNA在520nm处有特征吸收峰），之后加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）配置成10μM终浓度的Poly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液，-20℃保存；
（2）在600µL含有20nMPoly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液中加入5µg/ml的GO，室温下反应半小时，得到Poly-C-GO可卡因核酸适配体；
（3）在Poly-C-GO可卡因核酸适配体中加入浓度为0.01%的吐温20进行修饰，室温反应30分钟后进行荧光检测，测量其荧光强度，记为F0；
（4）吐温20修饰后的Poly-C-GO可卡因核酸适配体中加入待测可卡因溶液，进行荧光恢复，并测量加入可卡因后的荧光强度，记为F’；
（5）计算加入可卡因前后荧光强度值在520nm处的荧光增长率（F’/F0-1），带入实施例1中制备的标准曲线得到待测可卡因溶液浓度。
实施例3：
对可卡因核酸适配体片段进行Poly-C修饰，Poly-C修饰后的可卡因核酸适配体片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的序列由上海生工合成并进行FAM荧光修饰（FAM修饰的DNA在520nm处有特征吸收峰），之后加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）配置成10μM终浓度的Poly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液，-20℃保存；
在600µL含有20nMPoly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液中加入浓度分别为0、2、4、5、6、7μg/mL的GO，室温下反应半小时，分别测量其荧光强度（a.u.）。图2是不同浓度的GO对Poly-C可卡因核酸适配体淬灭后的荧光强度对照图；由图2可见，随着GO浓度的增加，荧光强度不断减小，在6µg/mL时，淬灭率达到90%以上。再增加GO浓度荧光变动不大，较高的GO浓度会阻碍荧光恢复，影响检测的灵敏性，可见，GO的浓度为5-7µg/mL时具有较为理想的荧光强度值。
实施例4：
对可卡因核酸适配体片段进行Poly-C修饰，Poly-C修饰后的可卡因核酸适配体片段核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的序列由上海生工合成并进行FAM荧光修饰（FAM修饰的DNA在520nm处有特征吸收峰），之后加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）配置成10μM终浓度的Poly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液，-20℃保存；
在600µL含有20nMPoly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液中加入6µg/ml的GO，室温下反应半小时，得到Poly-C-GO可卡因核酸适配体，测量其荧光强度值（未加入可卡因）；加入浓度分别为0、0.1、0.5、0.8、5、8、20、50nM的可卡因标准溶液，室温下反应半小时后测量其荧光强度值（加入可卡因后），计算出各自浓度下的荧光增长率。图3是Poly-C可卡因核酸适配体对不同浓度可卡因的灵敏性分析图；其中，图3（A）为加入不同浓度可卡因之后的荧光强度对照图；图3（B）为可卡因浓度荧光增长率的三次重复测定平均值；由图3可见，随着可卡因的浓度增大，荧光增长率越来越大，且可卡因浓度在0.1-0.8nM时，其荧光增长率与浓度存在非常强的线性关系，其线性回归方程可表达为：F/F0=0.30691C+0.10647，R2=0.9895，C为可卡因浓度，单位为nM；R2为决定系数，当R2越接近1时，表示相关的方程式参考价值越高。
实施例5：
向含有6µg/mLGO和20nMPoly-C修饰的Poly-C-GO可卡因核酸适配体中分别加入10nM的可卡因和同浓度的其他小分子腺苷、尿苷、尿酸、葡萄糖；测各组在520nM的荧光强度值并计算各组的荧光增长率。图4是Poly-C-GO可卡因核酸适配体的选择性分析图；由图4可见，可卡因和在同浓度的腺苷、尿苷、尿酸、葡萄糖的存在下，与含可卡因的样品相比，其他四组样品的荧光恢复不明显，可卡因荧光增长率远远超过其他类似物，表明Poly-C-GO可卡因核酸适配体传感器具有较好的可卡因选择性。
实施例6：
向含有6µg/mLGO和20nMPoly-C修饰的Poly-C-GO可卡因核酸适配体溶液中加入浓度分别为0、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%和1%的吐温20，室温反应30分钟后分别检测其荧光强度值；吐温20修饰后的Poly-C-GO可卡因核酸适配体中加入10nM可卡因，室温反应20分钟后进行荧光恢复，并分别测量加入可卡因后的荧光强度值。
图5是不同浓度的吐温20对Poly-C-GO可卡因核酸适配体的荧光强度对照图；其中，图5（A）中黑色柱状条表示的是加入吐温20的荧光强度，灰色柱状条表示的是加入吐温20及可卡因的荧光强度；图5（B）为图4（A）中两种柱状条的差值变化；由图5所示，经吐温20修饰后，GO对荧光的淬灭效果有所降低，但加入可卡因之后，荧光增长率远远高于未加吐温20修饰的Poly-C-GO可卡因核酸适配体。特别是当加入吐温20的浓度为0.05%时，荧光增幅达到最大，过量的吐温20可能会影响适配体和GO复合物的有效形成；可见，吐温20的浓度为0.01%-1%时具有较为理想的荧光强度值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种基于多胞嘧啶的核酸适配体检测可卡因的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccccccccc cccccccata gggagacaag gataaatcct tcaatgaagt gggtctccc 59
Claims (6)
1.一种基于多胞嘧啶的核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：
（1）使用Poly-C以及羧基荧光素对可卡因核酸适配体进行修饰和荧光标记，加入到磷酸缓冲盐溶液中配置成Poly-C可卡因核酸适配体的PBS缓冲液；
（2）加入氧化石墨烯对Poly-C修饰及荧光标记后的可卡因核酸适配体的DNA进行淬灭，得到Poly-C-GO可卡因核酸适配体；
（4）吐温20修饰后的Poly-C-GO可卡因核酸适配体中加入不同浓度可卡因标准溶液，进行荧光恢复，并测量在520nm处加入可卡因后的荧光强度F；
（5）计算加入可卡因前后的荧光增长率F/F0–1，以可卡因标准溶液浓度为横坐标，以荧光增长率为纵坐标，得到可卡因浓度的标准曲线；
（6）将待测可卡因样本按照步骤（1）-步骤（4）的方法获得加入待测可卡因后的荧光强度值F'，代入到步骤（5）得到的标准曲线中，获得待测可卡因样本的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的修饰是对可卡因核酸适配体片段进行Poly-C修饰，Poly-C修饰后的可卡因核酸适配体片段核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述氧化石墨烯的浓度为5-7µg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，吐温20的浓度为0.01%-1%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的荧光恢复温度为室温，时间为20-40min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述标准曲线在0.01-50 nM范围内，线性回归方程为：F/F0=4.54157 C + 0.82081，线性相关系数为0.99263，C为可卡因浓度，单位为nM。
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