CN106290831A - 一种基于抗原‑适配体的竞争法检测试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学检测领域，具体而言，涉及一种基于抗原‑适配体的竞争法检测试纸条，所述试纸条包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜、吸水垫和底板；所述标记物垫包被有检测探针，所述检测探针为标有用于显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体；所述反应膜上设置有检测区和质检区；所述检测区固定包被有靶标物抗原；所述质检区固定包被有质控探针。

Description

一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学检测领域，具体而言，涉及一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条及其应用。

背景技术

核酸适配体(Aptamer)是一种单链的寡核苷酸，多为单链DNA，长度在10～100bp之间，通常是利用特异的靶标从随机序列的寡核苷酸文库中通过体外筛选获得，作为一种新型生物识别分子，可以与靶标物质高亲和力特异性结合。目前文献报道的已经筛选到适配体的靶标有几百种，建立的基于适配体的检测方法主要包括比色法、荧光法、电化学等上百种方法，但到目前为止基于适配体的商品化的检测产品还几乎没有。

胶体金免疫层析试纸条技术是目前最常见最成熟也最受欢迎的快速检测产品形式之一，被广泛应用与临床诊断、食品安全以及环境分析等，比如著名的早孕试纸条、瘦肉精试纸条等。适配体作为一种特异性的识别分子，也可以被用来开发基于试纸条形式的快速检测产品，但是目前有关适配体试纸条的文献报道却很少，仅有几篇文献。这些文献一般采用的原理是在试纸条检测线处固定适配体的互补链，样品中含有靶标时，标记有荧光或胶体金的适配体和样品中的靶标结合，则不能和试纸条检测线处的互补链结合，检测线处荧光信号降低或不出信号；反之，样品中没有靶标时，标记有荧光或胶体金的适配体流经试纸条时和检测线处的互补链结合，检测线处出现较强的信号，从而根据荧光或胶体金信号大小判断样品中靶标含量。

然而，在实际的应用中，由于该检测方法的原理主要是基于适配体-靶标和适配体-互补链的竞争来实现的，因此很难设计比较可靠的检测方法。由于不同适配体长度不同，因此其互补链的长度也不同，从而适配体与互补链的的亲和力也不同。由于适配体链一般比较长，所以适配体与互补链的亲和力经常大于适配体与靶标的亲和力，从而导致无法检测；目前文献的解决方法都是通过将互补链截短，仅将部分互补链固定到检测线上，从而降低互补链和适配体的亲和力，但是这种方法需要繁杂的摸索，且互补链长度过短时适配体无法与互补链杂交，从而也导致无法检测。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述试纸条包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜、吸水垫和底板；

所述标记物垫包被有检测探针，所述检测探针为标有显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体；

所述反应膜上设置有检测区和质检区；

所述检测区固定包被有靶标物抗原；

所述质检区固定包被有质控探针。

本发明提出了利用靶标抗原代替互补链的方法，将靶标抗原固定到试纸条检测线，这样适配体与样品中的靶标和检测线上的靶标亲和力一致，保证了检测方法的可行性和准确性。且实验条件也更简单，摸索起来更容易。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，当所述靶标物为有机物大分子靶标时，所述靶标物抗原即为靶标物本身；

当所述靶标物为无机小分子靶标时，所述靶标物抗原为所述无机小分子靶标与载体蛋白的偶联物。

这里所指的大分子是指可以直接固定到膜上并暴露抗原表位的物质，小分子是指需要通过偶联载体蛋白才能固定到膜上并暴露抗原表位的物质。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述载体蛋白包括酪蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。

鸡卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)由386个氨基酸组成，分子量约43Kd。OVA作为载体蛋白可以协助小分子物质固定到硝酸纤维素膜上并暴露其抗原表位，从而利于抗原与适配体的结合。

同样的，载体蛋白也可选用酪蛋白(Casein)或牛血清白蛋白(BSA)等。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、生物素、放射性同位素、电子致密物、胶体金或酶中的任一种。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述荧光标记包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、CY7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述荧光物质包括PE、CY5、CY7、per-CP、TRITC、Alexa Fluor647以及量子点中的任一种。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述质控探针的核酸序列与所述适配体上连接的序列互补。

碱基的种类根据适配体的核苷酸序列进行选择，以不出现与适配体发生内部的互补配对，且不影响适配体与靶标结合的效率的核苷酸序列为准。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述适配体上连接的序列为PolyA、PolyT、PolyG或PolyC中的一种。

优选的，碱基的数量为6～24个。

优选的，适配体上连接的序列在适配体核苷酸序列的5'端。

优选的，如上所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，所述适配体上连接的序列为PolyT18。

与上述适配体上连接的序列配对的质控探针的核酸序列为：

5'-biotin-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-3'。

如上所述的抗原-适配体的竞争法检测试纸条在检测黄曲霉毒素B1和凝血酶中的应用。

优选的，如上所述的应用，包括：

1)、用试纸条检测靶标物标准品，得到标准品在试纸条的检测区和质控区的信号强度比值，制作靶标标准品的浓度对应信号强度比值的线性回归曲线，计算回归方程；

2)、用试纸条检测待测样品，得到待测样品在试纸条的检测区和质控区的信号强度比值，根据步骤1)得到回归方程，得到所述待测样品中靶标物的含量。

用上述的试纸条检测靶标标准品或待测样品，得到标准品在所述试纸的检测区和质控区的荧光或显色信号比值包括如下步骤：取靶标标准品或待测样品滴加到试纸的样品吸收垫上，10分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光或显色信号强度；将检测区的荧光信号强度(T)比上质控区的荧光信号强度(C)，得到T/C值，为检测区和质控区的荧光信号比值。

本发明基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条具有设计简单、结果可靠、灵敏度高、精确定量、特异性强、简单方便和检测时间短的优点。与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、由于以抗原代替了目前试纸条检测区中的适配体的互补链，彻底避免了由于适配体-靶标和适配体-互补链亲和力差异使得过于杂交或杂交不上带来的检测误差，提高了检测方法的稳定性；

2)、本发明避免了目前适配体试纸条繁杂的互补链截短设计，利用抗原代替互补链使得基于适配体的试纸条设计开发更为容易简单；

3)、本发明试纸条通过设置检测区/质控区信号比值作为数据归一化方法，降低了不同纸条间不同操作人员乃至不同仪器扫描的实验误差，将不同纸条测得的样品值代入标准曲线，即可以达到精确定量的效果；

4)、由于采用了适配体作为识别分子，基于适配体对靶标的高亲和力和高特异性，因此本发明试纸条具有高灵敏高特异性的优点；

5)、核酸适配体具有非常好的热稳定性，因此本发明的试纸条还可以常温储运，具有货架期长、结果可靠等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的试纸条的结构示意图；

图2为不同AFB1浓度下检测区处荧光强度检测结果图；第一个波峰代表检测区信号值(箭头所示)；

图3为本申请实施例1中AFB1浓度与T/C值线性关系的标准曲线；

图4为本申请实施例1中对AFB1试纸特异性的检测结果图；第一个波峰代表检测区信号值(箭头所示)；

图5为本申请实施例2中不同浓度凝血酶与试纸条反应时的质控区和检测区信号值；

图6为本申请实施例2中凝血酶浓度与T/C值线性关系的标准曲线。

附图标记：

1 样品吸收垫；

2 标记物垫；

3 反应膜；

4 吸水垫；

5 底板；

6 检测区；

7 质控区；

8 待检靶标；

9 标有用于显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体；

10 固定包被在检测区的靶标物抗原；

11 固定包被在质控区的质控探针。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1检测黄曲霉毒素B1试纸条的制备及在检测黄曲霉毒素B1(AFB1)中的应用

一、检测黄曲霉毒素B1试纸条的制备

1、检测探针和质控探针的合成

分别设计合成荧光素标记的检测探针和生物素标记的质控探针。

其中检测探针为荧光素Cy5标记的带有连接序列PolyT18的黄曲霉毒素B1适配体；黄曲霉毒素B1适配体可以和检测区的黄曲霉毒素B1半抗原结合，黄曲霉毒素B1适配体的核苷酸序列如下：

5'-Cy5-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-GTT-GGG-CAC-GTG-TTG-TCT-CTC-TGT-GTC-TCG-TGC-CCT-TCG-CTA-GGC-CCA-CA-3′

质控探针为生物素标记的可以与黄曲霉毒素B1适配体连接序列结合的PolyA18，可以与检测探针连接序列PolyT18通过碱基互补结合。

质控探针的核酸序列为：

5'-biotin-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-AAA-3'

2、AFB1半抗原和载体蛋白BSA的偶联物AFB1-BSA制备

首先经过肟化反应制备AFB1肟(AFB1-O)；然后用碳二亚胺法制备AFB1人工抗原，然后与阳离子化牛血清蛋白(C-BSA)的反应得到偶联产物，即偶联物AFB1-BSA。

3、制备试纸条

1)、标记物垫制备

将检测探针包被在标记物垫(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX101)上(包被浓度为0.1μM)，得到包被检测探针的标记物垫，37度过夜烘干。

2)、反应膜制备

反应膜包括检测区和质控区。

将偶联物AFB1-BSA按照包被浓度为5μM包被在反应膜形成检测区；

质控探针为标记生物素的适配体连接序列的互补序列，其通过链酶亲和素与其上的生物素偶联形成共价键包被在反应膜上形成质控区，包被浓度为1μM。

3)、试纸条组装

试纸条由样品吸收垫(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX111)、上述1)制备的包被检测探针的标记物垫、上述2)制备的反应膜、吸水垫依次按照顺序黏贴在底板上，且反应膜的检测区与标记物垫相邻，反应膜的检质控区与吸水垫相邻，如图1所示。

二、试纸条检测原理

如图1所示，当不含黄曲霉毒素B1的样品加入样品吸收垫1上时，样品在毛细作用下流动到标记物垫2，并带着荧光标记的探针混合物一起继续向前流动。当流动到检测区6时，标有用于显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体9会与检测区6处固定的AFB1-BSA结合，出现荧光信号，经试纸条检测仪器ESEQuant-LR3检测出荧光信号强度；当流动到质控区7时，剩余的标有用于显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体9会与固定包被在质控区的质控探针11互补结合，质控区7也出现荧光信号，经试纸条检测仪器ESEQuant-LR3检测出荧光信号强度。

如图1所示，当含有黄曲霉毒素B1的样品加入样品吸收垫上时，样品在毛细作用下流动到标记物垫，黄曲霉毒素B1与检测探针(适配体)结合，并在毛细作用下一起向前流动。当流动到检测区时，未与黄曲霉毒素B1结合的检测探针会与半抗原结合；当样品中的AFB1越多，结合的检测探针也就越来越多，剩余的游离检测探针就会越来越少，和检测区半抗原结合的检测探针也就越少，荧光强度越低。反之，样品中的黄曲霉毒素B1越少，剩余的游离检测探针就会越来越多，和检测区处半抗原结合也就越多，荧光强度越强，从而可以根据荧光强度的变化判断样品中黄曲霉毒素B1的浓度。

三、试纸条检测方法

1)取黄曲霉毒素B1标准品滴加到试纸的样品吸收垫上，10分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度；将检测区的荧光信号强度(T)比上质控区的荧光信号强度(C)，得到T/C值，制作黄曲霉毒素B1标准品的浓度对应荧光信号T/C比值的线性回归曲线，计算回归方程；

2)将黄曲霉毒素标准品B1替换为待测样品，用上述试纸检测待测样品，记录在所述试纸的检测区和质控区的荧光信号比值，根据步骤(1)的回归方程，得到待测样品中黄曲霉毒素的浓度。

四、黄曲霉毒素B1试纸条在检测黄曲霉毒素B1中的应用

1、检测黄曲霉毒素B1灵敏度与线性范围研究

配制图2所示的不同浓度AFB1(Fermentek Ltd，AF028)水溶液，分别用实施例1制备的试纸条进行测定。

用试纸条检测仪器ESEQuant-LR3分别测定检测区和质控区处的荧光强度。结果如图2所示，可以看出，随着AFB1浓度增加，检测区处荧光强度逐渐变小。利用检测区荧光强度与质控区荧光强度比值(表1)，绘制检测黄曲霉毒素B1的标准曲线如图3所示，结果表明，试纸条的灵敏度0.5ng/mL；线性范围为0.5ng/mL～50μg/mL。

表1黄曲霉毒素B1标准品的检测结果

2、特异性研究

配制浓度为100ng/mL的AFB1溶液、100ng/mL的AFM1(百灵威科技有限公司，6795-23-9)溶液、浓度为100ng/mL的黄曲霉毒素G1(百灵威科技有限公司，1165-39-5)、浓度为100ng/mL的黄曲霉毒素B2(百灵威科技有限公司，7220-81-7)、浓度为100ng/mL的赭曲酶毒素Ochratoxin A(OTA，Fermentek Ltd,OC030a)溶液、浓度为100ng/mL的玉米赤酶烯酮Zearalenone(ZEN，百灵威科技有限公司，17924-92-4)溶液，浓度为100ng/mL的呕吐毒素Vomitoxin(DON，百灵威科技有限公司，51481-10-8)溶液和空白样品分别用试纸条进行测定。

用试纸条检测仪器ESEQuant-LR3分别测定检测区和质控区处的荧光强度，结果如图4所示，其中AFM1为AFB1代谢物，结构相似，表现出了近100％的交叉，而AFG1、AFB2、OTA、ZEN、DON以及空白样品等均不能引起检测区处荧光变化，这也说明本方法对黄曲霉毒素B1/M1具有很好的特异性。

五、黄曲霉毒素B1试纸条在花生粕中黄曲霉毒素B1检测中的应用

1、标准曲线绘制

同本实施例第一部分中检测黄曲霉毒素B1灵敏度与线性范围研究中的标准曲线方法，得到的回归方程为：y＝-0.2076x+0.9881，R²＝0.99，为黄曲霉毒素B1标准曲线一元回归方程。

2、样品提取

选择5份经国标方法(LC-MSMS)测定过的花生粕黄曲霉毒素B1样品，用本试纸条进行测定。首先称取2g花生粕于50mL离心管中，加入8mL正己烷和10mL 70％的甲醇水溶液，振荡5min，室温4000转/分离心10min；去除上层液体，取0.5mL下层液体加入0.5mL去离子水，混匀，再取混匀液体0.5mL加入0.5mL 35％的甲醇水溶液，振荡30s；取100μL进行分析(样品稀释倍数为20倍)。

3、样品测定

取上述制备好的待测样品100μL滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；10分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的荧光信号强度；将检测区的荧光信号强度(T)比上质控区的荧光信号强度(C)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中黄曲霉毒素B1的浓度。

4、检测结果：

5份花生粕实际样品检测结果如表2所示。从结果可以看出，本发明试纸条结果与LC-MS方法相比，回收率在110％～115％之间，回收率较好，说明本发明试纸条和LC-MS方法具有非常好一致性，同时可以看出本方法比LC-MS方法整体偏高，避免了可能的假阴性结果。另外本方法标准差小于10％，说明本方法具有很好的稳定性。因此可以用于实际样品中黄曲霉毒素B1的检测。

表2本发明试纸条检测花生粕中AFB1结果与LC-MS方法比较

实施例2检测凝血酶试纸条的制备及在检测凝血酶中的应用

一、检测凝血酶试纸条的制备

1、检测探针和质控探针的合成

分别设计合成胶体金标记的检测探针和生物素标记的质控探针。

其中检测探针为胶体金标记的带有连接序列PolyT20的凝血酶适配体；凝血酶适配体可以和检测区的凝血酶抗原结合，凝血酶适配体的核苷酸序列如下：

5′-SH-TT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GGT TGG TGTGGT TGG-3′

胶体金合成方法为：加热煮沸100mL浓度为1mM的HAuCl₄溶液，剧烈搅拌下加入10mL浓度为38.8mM的柠檬酸三钠溶液，继续煮沸20分钟，然后室温冷却，得到的胶体金粒径为13nm。

胶体金与适配体偶联方法为：取10μL浓度为100μM巯基修饰的适配体、1μL醋酸钠(pH＝5.20)和0.5μL浓度为10mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐混合避光孵育1小时，13000rpm离心20min后加入1mL合成好的胶体金室温孵育16小时以上。然后加入12μL Tris-Hac缓冲液(pH＝8.2)和100μL浓度1M的NaCl溶液进行盐化一天。然后16,000rpm离心15min去除多余的适配体，然后用缓冲液重悬备用(100mL PB溶液，0.5g PEG20000，1g sucrose，0.1mL Tween-20，0.02g MgSO4，and 0.05g(NH4)2SO4))。

质控探针为生物素标记的可以与凝血酶适配体连接序列结合的PolyT20，可以与检测探针连接序列PolyA20通过碱基互补结合。

质控序列的核苷酸序列为：

5′-AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA-biotin-3′.

2、制备试纸条

1)、标记物垫制备

将检测探针包被在标记物垫(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX101)上(包被浓度为0.1μM)，得到包被检测探针的标记物垫，37度过夜烘干。

2)、反应膜制备

反应膜包括检测区和质控区。

将凝血酶抗原按照包被浓度为1mg/mL包被在反应膜形成检测区；

质控探针为标记生物素的适配体连接序列的互补序列，其通过链酶亲和素与其上的生物素偶联形成共价键包被在反应膜上形成质控区，包被浓度为5μM。

3)、试纸条组装

试纸条由样品吸收垫(上海杰一生物技术有限公司，JY-BX111)、上述1)制备的包被检测探针的标记物垫、上述2)制备的反应膜、吸水垫依次按照顺序黏贴在底板上，且反应膜的检测区与标记物垫相邻，反应膜的检质控区与吸水垫相邻，如图1所示。

二、试纸条检测原理

如图1所示，当不含凝血酶的样品加入样品吸收垫1上时，样品在毛细作用下流动到标记物垫2，并带着胶体金标记的探针混合物一起继续向前流动。当流动到检测区6时，标有用于显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体9会与检测区6处固定的凝血酶抗原结合，出现胶体金红色条带，经试纸条检测仪器ESEQuant-LR3检测出高显色信号强度；当流动到质控区7时，剩余的标有用于显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体9会与固定包被在质控区的质控探针11，质控区7也出现红色条带，经试纸条检测仪器ESEQuant-LR3检测出显色信号强度。

如图1所示，当含有凝血酶的样品加入样品吸收垫上时，样品在毛细作用下流动到标记物垫，凝血酶与检测探针(适配体)结合，并在毛细作用下一起向前流动。当流动到检测区时，未与凝血酶结合的检测探针会与凝血酶抗原结合；当样品中的凝血酶越多，结合的检测探针也就越来越多，剩余的游离检测探针就会越来越少，和检测区凝血酶抗原结合的检测探针也就越少，胶体金显色强度越低。反之，样品中的凝血酶越少，剩余的游离检测探针就会越来越多，和检测区处凝血酶抗原结合也就越多，胶体金显色强度越强，通过纸条检测仪器ESEQuant-LR3检测检测区和质控区显色信号强度的变化即判断样品中凝血酶的浓度。

三、试纸条检测方法

1)取凝血酶标准品滴加到试纸的样品吸收垫上，10分钟后，将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的胶体金显色信号强度；将检测区的显色信号强度(T)比上质控区的显色信号强度(C)，得到T/C值，将得到的T/C值制作凝血酶标准品的浓度对应显色信号比值的线性回归曲线，计算回归方程；

2)将凝血酶标准品替换为待测样品，用上述试纸检测待测样品，记录在所述试纸的检测区和质控区的显色信号比值，根据步骤(1)的回归方程，得到待测样品中凝血酶的浓度。

四、凝血酶试纸条在检测凝血酶中的应用

1、检测凝血酶灵敏度与线性范围研究

配制图5所示的不同浓度凝血酶(Sigma，Cat#T6884)水溶液，分别用实施例2制备的试纸条进行测定。

用试纸条检测仪器ESEQuant-LR3分别测定检测区和质控区处的显色强度。结果如图5所示，可以看出，随着AFB1浓度增加，检测区处显色强度逐渐变小。利用检测区显色强度与质控区显色强度比值(表3)，绘制检测凝血酶的标准曲线如图6所示，结果表明，试纸条的灵敏度1nM；线性范围为1nM-100nM。

表3凝血酶标准品的检测结果

2、凝血酶试纸条在血清凝血酶检测中的应用

1)、标准曲线绘制

同本实施例第一部分中检测凝血酶灵敏度与线性范围研究中的标准曲线方法，得到的回归方程为：y＝-1.177x+2.4398，R²＝0.972，为凝血酶标准曲线一元回归方程。

2)、样品制备

取小鼠血清，分别加入终浓度分别为2nM、10nM、50nM的人凝血酶。

3)、样品测定

取上述制备好的待测样品100μL滴加到所述试纸的样品吸收垫上，观察样品层析沿着硝酸纤维素膜流动，直到被上面的吸水垫吸附；10分钟后，观察试纸条显色信号，并将试纸条放入试纸条检测仪器ESEQuant-LR3中，进行检测，分别测定检测区和质控区的显色信号强度；将检测区的显色信号强度(T)比上质控区的显色信号强度(C)，将得到的计算值代入上述步骤1的回归方程，计算得到待测样品中凝血酶的浓度。

4)、检测结果：

3份添加人凝血酶的小鼠血清样品测得结果如表4所示。从结果可以看出，本发明试纸条的回收率在105％～115％之间，标准差小于15％，具有很好的准确度和精密度，因此可以用于实际样品中凝血酶的检测。

表4小鼠血清凝血酶添加回收实验结果

添加浓度	实测浓度	回收率	标准差(％)
				2nM	2.3	115％	12.2
10nM	10.5	105％	9.8.
				50nM	55	110％	8.7

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括样品吸收垫、标记物垫、反应膜、吸水垫和底板；

所述标记物垫包被有检测探针，所述检测探针为标有用于显示信号强度的指示剂的检测靶标物的适配体；

所述反应膜上设置有检测区和质检区；

所述检测区固定包被有靶标物抗原；

所述质检区固定包被有质控探针。

2.根据权利要求1所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，当所述靶标物为有机物大分子靶标时，所述靶标物抗原即为靶标物本身；

当所述靶标物为无机小分子靶标时，所述靶标物抗原为所述无机小分子靶标与载体蛋白的偶联物。

3.根据权利要求2所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，所述载体蛋白包括酪蛋白、牛血清白蛋白或鸡卵清白蛋白。

4.根据权利要求1所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、生物素、放射性同位素、电子致密物、胶体金或酶中的任一种。

5.根据权利要求4所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，所述荧光物质包括PE、CY5、CY7、per-CP、TRITC、Alexa Fluor647以及量子点中的任一种。

6.根据权利要求1所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，所述质控探针的核酸序列与所述适配体上连接的序列互补。

7.根据权利要求6所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，所述适配体上连接的序列为PolyA、PolyT、PolyG或PolyC中的一种。

8.根据权利要求7所述的基于抗原-适配体的竞争法检测试纸条，其特征在于，所述适配体上连接的序列为PolyT18。

9.权利要求1～8任一项所述的抗原-适配体的竞争法检测试纸条在检测黄曲霉毒素B1和凝血酶中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括：

1)、用试纸条检测靶标物标准品，得到标准品在试纸条的检测区和质控区的信号强度比值，制作靶标标准品的浓度对应信号强度比值的线性回归曲线，计算回归方程；

2)、用试纸条检测待测样品，得到待测样品在试纸条的检测区和质控区的信号强度比值，根据步骤1)得到回归方程，得到所述待测样品中靶标物的含量。