CN112114134A - 靶物质检测方法、靶物质检测试剂盒以及靶物质检测系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶物质检测方法、靶物质检测试剂盒以及靶物质检测系统，在一个方式中，提供一种使用与固定侧(支承体侧)和检测侧(报告物质侧)均间接结合的捕获用物质的靶物质检测方法。一种检测试样中的靶物质的方法，包括：反应工序，使所述试样、支承体、报告物质、第一捕获用物质和第二捕获用物质反应，所述支承体具备第一结合部分，所述报告物质具备第二结合部分，所述第一捕获用物质具备能够与所述第一结合部分结合的第一结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合，所述第二捕获用物质具备能够与所述第二结合部分结合的第二结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合；以及检测工序，检测来自所述报告物质的信号。

Description

靶物质检测方法、靶物质检测试剂盒以及靶物质检测系统
技术领域
本公开涉及使用捕获用物质来检测靶物质的方法、试剂盒以及系统。
背景技术
作为检测靶物质的方法，已知有免疫层析法、ELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay，酶联免疫吸附测定法)法、流通法、SPR(Surface PlasmonResonance，表面等离子体共振)法以及珠分析法等，例如，在免疫层析检测法中，为了捕获试样中的被检测物(靶物质)，使用了抗原或抗体等蛋白质(日本专利特开2012-533064号公报)。以高灵敏度化为目的，也开始开发使用了核酸适体的免疫层析检测法(日本专利特表平10-512751号公报)。
关于核酸适体的固定化方法，在与被检测物特异性结合的核酸适体的末端实施NH2、生物素、地高辛配基(Digoxigenin)等的修饰，使其固定在硝基纤维素膜上或与检测用物质结合(Pathogens.2014年6月；3(2)：341-355)。在核酸适体对固相化载体的直接结合中采用UV(Ultraviolet，紫外线)照射法。在间接结合中，如果是生物素修饰适体，则采用链霉抗生物素蛋白。如果是地高辛配基修饰适体，则采用抗地高辛配基抗体。在不使用蛋白质的对固相化载体的间接核酸适体结合中，也有将具有与核酸适体互补的序列的单链DNA或单链RNA与固相化载体结合，通过互补结合使核酸适体与固相化载体结合的方法(日本专利特开平10-48216号公报)。
发明内容
在以往的检测靶物质的方法(所谓的夹心法)中，在固定侧(支承体侧)或检测侧(报告物质侧)的至少一方上预先直接固定捕获用物质后，使含有靶物质的样品与支承体或报告物质接触。因此，在靶物质变更的情况下，需要变更固定在与该靶物质对应的捕获用物质上的捕获用物质，但是为了进行这个变更，需要对固定有捕获用物质的每个支承体和/或报告物质重新设计捕获用物质，必须再次进行固定捕获用物质的研究。
但是，在以往的直接固定捕获用物质的检测方法中，由于对捕获用物质进行固定时的化学反应等，捕获用物质自身也受到反应。由此，产生捕获用物质对靶物质的识别功能丧失或降低等问题。因此，需要进行固定化的反应条件研究，探索最佳条件。仅该条件研究也需要大量试样，需要研究的时间。并且，在捕获用物质探索的初期阶段，需要对多个捕获用物质候选进行条件研究，存在需要大量时间的问题。
例如，作为核酸适体对载体的固定化方法，存在化学共价结合、利用UV照射的物理能量的共价结合等固定化方法(日本专利特开平10-48216号公报)。但是，这些固定化处理会对核酸适体主体产生损伤，成为核酸适体与靶物质的结合力降低或不具有功能的原因。
因此，本公开在一个方式中提供了一种靶物质检测方法，其中，固定侧(支承体侧)与捕获用物质可以间接结合，并且检测侧(报告物质侧)与捕获用物质可以间接结合。
另外，在以往的免疫层析法中，在进行使用两种结合物质(例如抗体或半抗原)捕获靶物质的夹心法的情况下，上述两种结合物被设计成一方与固定侧(支承体侧)特异性结合，另一方与检测侧(报告物质侧)特异性结合。例如，在使用两种不同的单克隆抗体而通过夹心法捕获靶物质的情况下，根据抗体，已知有优选作为固定侧(支承体侧)的抗体、或优选作为检测侧(报告物质侧)的抗体。
作为免疫层析的检测对象之一，可以列举出流感病毒。为了识别流感病毒的亚型或耐药株，除了核蛋白质以外，还需要以血凝素(HA)、神经氨酸酶或RNA聚合酶等为靶的抗体或核酸适体等捕获用物质，但是这些病毒蛋白质容易变异，为了维持灵敏度，必须改变捕获用物质。另外，不限于流感病毒，伴随变异的病毒、细菌、真菌等也同样。
在将适体应用于免疫层析的情况下或将针对新的靶物质或变异的靶物质得到的适体应用于免疫层析的情况下，根据以往的方法，需要针对一种适体而设计用于固定侧(支承体侧)和用于检测侧(报告物质侧)的两种适体探针。
另外，如果与靶结合的两种适体探针中，一个限定为用于固定侧(支承体侧)、另一个限定为用于检测侧(报告物质侧)，则认为与支承体或报告物质的结合反应效率(靶物质的捕获效率)降低。
因此，本公开在另一个方式中提供一种使用适体探针的免疫层析检测法，所述适体探针能够间接地结合到固定侧(支承体侧)和检测侧(报告物质侧)。
本公开在一个方式中涉及一种检测试样中的靶物质的方法，包括：反应工序，使所述试样、支承体、报告物质、第一捕获用物质和第二捕获用物质反应，形成支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质复合体或支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质复合体，所述支承体具备第一结合部分，所述报告物质具备第二结合部分，所述第一捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第一结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合，所述第二捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第二结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合；以及检测工序，检测信号，所述信号来自所述复合体中的所述报告物质。以下，该方法也称为“本公开涉及的第一检测方法”。
本公开在另一个方式中涉及用于进行上述方法的靶物质检测系统，上述方法检测样品中的靶物质。以下，该系统也称为“本公开涉及的第一检测系统”。
本公开在另一个方式中涉及通过免疫层析法检测试样中的靶物质的方法，包括：使用适体探针，在支承体上，在用支承体-适体探针-靶物质-适体探针-报告物质表示的结合状态下，捕获靶物质和报告物质，所述适体探针具备能够与所述靶物质结合的适体部分、以及能够与固定在所述支承体上(且形成支承体的一部分)的结合部分和固定在所述报告物质上(且形成报告物质的一部分)的结合部分这两者结合的结合配偶体部分；以及检测来自所述报告物质的信号。以下，该方法也称为“本公开涉及的第二检测方法”。
本公开在另一个方式中涉及一种利用免疫层析法的靶物质的检测系统，包括：免疫层析试验片，具备固定有结合部分的检测区域；报告物质，固定有结合部分；以及适体探针，具备能够与检测区域的结合部分和报告物质的结合部分这两者结合的结合配偶体部分、以及能够与靶物质结合的适体部分。以下，该系统也称为“本公开涉及的第二检测系统”。
本公开在另一个方式中涉及一种试剂盒，用于进行本公开涉及的第二检测方法，所述试剂盒包括：免疫层析试验片，具备固定有结合部分的检测区域；报告物质，固定有结合部分；以及适体探针，具备能够与检测区域的结合部分和报告物质的结合部分这两者结合的结合配偶体部分、以及能够与靶物质结合的适体部分。以下，该试剂盒也称为“本公开涉及的第二检测试剂盒”。
根据本公开涉及的第一方式(本公开涉及的第一检测方法和检测系统)，例如，能够提供使用捕获用物质的靶物质检测方法，所述捕获用物质能够与固定侧(支承体侧)和检测侧(报告物质侧)均间接结合。
由此，通过预先规定第一结合部分和第二结合部分，即使有多个捕获用候选物质，也可以不进行用于固定捕获用候选物质的条件研究，直接应用多个捕获用候选物质进行测定，能够削减研究用试样的量，并且能够大幅度缩短研究时间。特别是，在SELEX法等捕获用物质的选定阶段中筛选多个捕获用物质的情况下，通过使用本公开，能够发挥大幅度缩短期间和削减成本的效果。
另外，由于不实施将捕获用物质固定在支承体或报告物质上的处理，因此能够将固定化处理对捕获用物质的损伤抑制在最小限度，能够在保持对靶物质的识别功能的状态下进行测定。
并且，通过经由固定侧的第一结合部分固定捕获用物质，能够保持捕获用物质的取向性。由此，例如能够提高捕获用物质对靶物质的捕获效率。例如，能够通过在捕获用物质的与靶物质识别部位(与靶物质结合的部分)不同的部分设置结合配偶体部分，使该结合配偶体部分与固定侧的第一结合部分结合，从而间接地将捕获用物质固定在固定侧来进行经由了固定侧的第一结合部分的捕获用物质的固定化。由此，捕获用物质的靶物质识别部位不用于与支承体的结合，因此在捕获用物质能够与靶物质结合的状态(捕获用物质的靶物质识别部位露出并保持取向性的状态)下将捕获用物质能够固定在支承体上。
根据本公开涉及的第二方式(本公开涉及的第二检测方法、检测系统和检测试剂盒)，例如能够实现使用了适体探针的免疫层析检测法，所述适体探针能够与固定侧(支承体侧)和检测侧(报告物质侧)均结合。
在未被限定的一个或多个实施方式中，在靶物质能够结合多个适体的情况下，通过准备一种适体，免疫层析检测法变为可能。
附图说明
图1是第一方式或第二方式的一个实施方式，是报告物质1和靶物质6经由两种适体探针4及7(第一捕获用物质和第二捕获用物质)而被捕获在支承体11上的情形的概略图，适体探针4及7虽然适体部分不同，但是结合配偶体部分5是共同的，结合配偶体部分5既可以与固定在报告物质1上的结合部分探针2的结合部分3结合，也可以与固定在支承体11上的结合部分探针10的结合部分3结合，此时，结合部分3与结合配偶体部分5间接地结合(即，非共价结合)，适体探针4及7间接地固定在报告物质1或支承体11上(即，非共价结合)。
图2是第二方式的一个实施方式，是报告物质1和靶物质6经由一种适体探针4及7而被捕获在支承体11上的情形的概略图。适体探针4及7在适体部分和结合配偶体部分5中是相同的。靶物质6是能够结合多个相同适体的(多价的)物质。结合配偶体部分5既可以与固定在报告物质1上的结合部分探针2的结合部分3结合，也可以与固定在支承体11上的结合部分探针10的结合部分3结合，此时，结合部分3与结合配偶体部分5间接地结合(即，非共价结合)，适体探针4及7间接地固定在报告物质1或支承体11上。
图3是实施例中使用的免疫层析试验片的概略图。
图4是示出在使用两种适体探针的本公开涉及的第二检测方法中检测出H3蛋白质的结果的一个例子的曲线图。
图5是示出在使用一种适体探针的本公开涉及的第二检测方法中检测出H3蛋白质的结果的一个例子的曲线图。
具体实施方式
[第一方式]
在使用捕获用物质的靶物质检测方法中，在捕获用物质与支承体或报告物质直接结合的情况下，在靶物质变更时，不仅仅是捕获用物质，对于每个被固定的支承体和报告物质，也需要重新设计捕获用物质，需要成本和/或时间和精力等，针对这样的问题，发现了如下解决方法：即使在根据靶物质的变更而使用新的捕获用物质的情况下，也能够通过预先规定用于将捕获用物质固定在支承体和报告物质上的结合方式(结合部分或结合配偶体部分)，无需进行将捕获用物质固定在支承体和报告物质上的研究，能够直接利用新的捕获用物质。本公开涉及的第一方式是基于上述情况而完成的。
根据第一方式，在一个或多个实施方式中，捕获用物质通过某种结合方式间接地固定在支承体或报告物质上，由此即使在靶物质变更的情况下，也可以不变更具备第一结合部分的支承体、具备第二结合部分的报告物质，而仅变更具备第一结合配偶体部分的第一捕获用物质和具备第二结合配偶体部分的第二捕获用物质，能够做成与成为靶的靶物质相符合的靶物质检测方法，能够提供成本和/或时间和精力少的靶物质检测方法。
第一检测方法
本公开涉及的第一检测方法是检测试样中的靶物质的方法，包括：
反应工序，使所述试样、支承体、报告物质、第一捕获用物质以及第二捕获用物质反应，形成“支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质”复合体或“支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质”复合体，所述支承体具备第一结合部分，所述报告物质具备第二结合部分，所述第一捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第一结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合，所述第二捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第二结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合；以及
检测工序，检测信号，所述信号来自所述复合体中的所述报告物质。
本公开中的支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质复合体包括支承体、第一捕获用物质、靶物质、第二捕获用物质和报告物质，是指支承体、第一捕获用物质、靶物质、第二捕获用物质和报告物质按照该顺序直接或间接结合。支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质复合体中，支承体与第一捕获用物质直接或间接结合，第一捕获用物质与靶物质直接或间接结合，靶物质与第二捕获用物质直接或间接结合，第二捕获用物质与报告物质直接或间接结合。如上所述，第一和第二结合配偶体部分可以与第一和第二结合部分结合。此外，这并不是指同时结合，而是结合配偶体部分能够与第一结合部分结合，并且另外能够与第二结合部分结合。
第一捕获用物质
在第一方式中，“第一捕获用物质”包括：靶物质识别部位，具有经由靶物质识别部位而选择性结合靶物质或仅结合靶物质的功能；以及第一结合配偶体部分，能够与固定在支承体上的第一结合部分结合。
这里的捕获用物质是指，具有经由靶物质识别部位而捕获靶物质的功能的物质，而不是被靶物质捕获的物质。
靶物质识别部分可以列举出抗体、低分子抗体、肽和适体等，从能够获得与靶物质对应的物质为止的时间的观点出发，优选适体。
第一结合配偶体部分可以是第一捕获用物质预先具备的部分，也可以是通过化学修饰等而附加的部分。例如，也可以将抗体预先具备的Fc部分或糖链作为第一结合配偶体部分。
作为适体，可以是核酸适体，也可以是肽适体。核酸适体只要是核酸即可，作为核酸，可以列举出RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)、DNA(DeoxyriboNucleic Acid，脱氧核糖核酸)、以及它们的修饰物或类似物，优选为RNA。
第一捕获用物质中，靶物质识别部分与第一结合配偶体部分可以直接结合，也可以经由接头结合。另外，第一捕获用物质可以预先与固定在支承体上的第一结合部分结合。
第二捕获用物质
在第一方式中，“第二捕获用物质”包括：靶物质识别部位，具有经由靶物质识别部位而选择性结合靶物质或仅结合靶物质的功能；以及第二结合配偶体部分，能够与报告物质所具备的第二结合部分结合。
这里的捕获用物质是指，具有经由靶物质识别部位而捕获靶物质的功能的物质，而不是被靶物质捕获的物质。
第二结合配偶体部分可以是第二捕获用物质预先具备的部分，也可以是通过化学修饰等而附加的部分。例如，也可以将抗体预先具备的Fc部分或糖链作为第二结合配偶体部分。
靶物质识别部分可以列举出抗体、低分子抗体、肽和适体等，优选为适体。
作为适体，可以是核酸适体，也可以是肽适体，但是优选为核酸适体。核酸适体只要是核酸即可，作为核酸，可以列举出RNA、DNA以及它们的修饰物或类似物，优选为RNA。
第二捕获用物质中，靶物质识别部分与第二结合配偶体部分可以直接结合，也可以经由接头结合。另外，第二捕获用物质还可以预先与固定在报告物质上的第二结合部分结合。
作为所述第一或第二结合配偶体部分与所述第一或第二结合部分的结合，在一个或多个实施方式中，可以列举出抗体或其抗原结合部分与抗原的结合、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白与生物素的结合、二硝基苯酚(DNP)与抗DNP抗体的结合、地高辛(Digoxin)与抗地高辛抗体的结合、地高辛配基(Digoxigenin)与抗地高辛配基抗体的结合、半抗原与抗半抗原的结合、多糖与多糖结合部分的结合、凝集素与其受体的结合、配体与其受体的结合、荧光素与抗荧光素抗体的结合、以及互补核酸的结合，特别优选互补核酸的结合。
作为结合配偶体部分，在一个或多个实施方式中，可以举出抗体或其抗原结合部分、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、二硝基苯酚(DNP)、地高辛、地高辛配基、半抗原、多糖、凝集素、配体、荧光素、以及结合部分的互补核酸等。
作为结合部分，在一个或多个实施方式中，可以举出抗原、生物素、抗DNP抗体、抗地高辛抗体、抗地高辛配基抗体、抗半抗原、多糖结合部分、凝集素的受体、配体(结合配偶体部分)的受体、抗荧光素抗体、以及结合配偶体部分的互补核酸等。
也可以将第一结合配偶体部分和第二结合配偶体部分设为相同的结合配偶体部分，将第一结合部分和第二结合部分设为相同的结合部分。由此，例如，通过仅变更第一捕获用物质和第二捕获用物质的靶物质识别部分，但不变更支承体和报告物质而直接使用，由此能够变更靶物质。
上述结合是间接结合，本公开中的间接结合是指，通过氢键、离子键以及疏水性相互作用等非共价结合性相互作用进行的结合。另一方面，关于直接结合，在一个或多个实施方式中是指共价结合。
在一个或多个实施方式中，当靶物质识别部分是核酸适体时，可以列举出结合配偶体部分也是核酸，在该情况下，可以列举出结合部分也是所述核酸的互补核酸。当捕获用物质是核酸适体探针时，在一个或多个实施方式中，作为结合配偶体部分与结合部分的组合，可以列举出聚A与聚dT、聚U与聚dA等。在该情况下，当通过SELEX(system evolution ofligands by exponential enrichment，配体指数富集的系统进化)法获得核酸适体时，通过设计具有成为结合配偶体部分的序列和随机序列的核酸池，能够将所得到的核酸适体直接应用于本公开的检测方法，并且能够削减选定捕获用候选物质时所需的条件研究，因此特别优选。
此外，在本公开中，在结合配偶体部分和结合部分是核酸、且它们是互补的序列的情况下，两者的序列可以是形成完全互补链的序列，也可以不是在两者能够结合的范围内形成完全互补链的序列。
反应工序
本公开中的反应工序是，在支承体上，使第一捕获用物质、靶物质、第二捕获用物质和报告物质的各要素(或者这些要素的子集或已形成的这些要素的复合体)反应，各要素结合，形成由各要素构成的复合体的工序。在一个或多个实施方式中，各要素的结合可以举出基于非共价结合性相互作用的结合。此时，复合体中的各要素的顺序没有特别限制，例如，形成“支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质”复合体或“支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质”复合体。
检测工序
本公开中的检测工序是检测信号的工序，该信号来自在支承体上形成并固定的上述复合体中的靶物质。例如，作为来自靶物质的信号，可以列举出荧光等，可以使用荧光免疫层析器等进行检测，但是没有特别限制。信号的存在表示试样中的靶物质的存在。
本公开涉及的第一检测方法是如下方法：在一个或多个实施方式中，所述第一结合配偶体部分能够与所述第二结合部分结合(同样，能够与所述第一结合部分结合)，且所述第二结合配偶体部分能够与所述第一结合部分结合(同样，能够与所述第二结合部分结合)，所述反应工序形成“支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质”复合体或“支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质”复合体，所述检测工序使用信号来检测所述靶物质，所述信号来自所述复合体中的所述报告物质。
在一个“支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质”复合体或“支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质”复合体中含有两个以上的捕获用物质，该两个以上的捕获用物质可以是相同种类的物质，也可以是不同种类的物质。相同种类的捕获物质具有相同的结合配偶体部分和相同的靶物质识别部分。优选的是，相同种类的捕获物质为相同。不同种类的捕获物质具有相同的结合配偶体部分，但具有不同的标记物质识别部分。
形成复合体的顺序
当形成“支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质”复合体时，形成“支承体-第一捕获用物质”结合、“第一捕获用物质-靶物质”结合、“靶物质-第二捕获用物质”结合和“第二捕获用物质-报告物质”结合，但这些结合可以以任何顺序形成，并且这些结合也可以同时形成。在形成“支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质”复合体的情况下也同样。
本公开涉及的第一检测方法是如下方法：在一个或多个实施方式中，所述第一捕获用物质和所述第二捕获用物质是相同的捕获用物质，并且所述靶物质是能够在两个以上的部分与所述相同的捕获用物质结合的靶物质。
本公开涉及的第一检测方法是如下方法：在一个或多个实施方式中，第一捕获用物质与支承体所具备的所述第一结合部分结合。
支承体
作为支承体，在一个或多个实施方式中，可以列举出硝化纤维素、尼龙或聚酰胺、纸和玻璃纤维等膜(Membrane)，具体而言，可以列举出横向流动型的免疫层析带(试验片)的固定化用膜(也称为反应膜)。
另外，本公开涉及的支承体包括第一结合部分。在一个或多个实施方式中，结合部分可以被固定在支承体上。在其他方式中，结合部分可以形成支承体的一部分。在一个或多个实施方式中，第一结合部分通过诸如化学共价结合、利用UV照射的物理能量的共价结合等固定方法来固定。
报告物质
作为报告物质，可以使用免疫层析中使用的报告物质(检测剂)，在一个或多个实施方式中，可以列举出酶、铁蛋白、荧光/吸光二氧化硅颗粒、荧光/吸光胶乳颗粒、半导体微粒以及金胶体颗粒等。可以适当地进行它们与结合部分探针的固定化。
从报告物质得到信号的方法可以根据报告物质适当选择。关于伴随荧光、发光或显色的物质，能够使用目视、适当的读取装置或拍摄装置而对信号进行检测或记录，并根据需要进行分析。本公开的报告物质具有第二结合部分。在一个方式中，结合部分可以固定在报告物质上。在其他方式中，结合部分可以形成报告物质的一部分。作为检测来自报告物质的信号的其他方法，在一个或多个实施方式中，可以举出显微镜、分光光度计和比色计等。
靶物质
作为靶物质，在一个或多个实施方式中，可以列举出抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配体、受体、肽、蛋白质、化学物质、病原体或其一部分等。作为含有靶物质的试样，可以列举出血清、血液、血浆、唾液、尿、眼泪、鼻腔液及其他体液、培养细胞的培养液、以残留农药检查为目的的食物来源的样品、以水质检查为目的的水类样品或它们的稀释物，但没有特别限制。
本公开涉及的第一检测方法可用于免疫层析法、ELISA法、流通法、SPR法和珠分析法等。
本公开涉及的免疫层析法是指利用支承体中的毛细管现象来进行的全部测定法。在一个或多个实施方式中，本公开涉及的免疫层析法包括横向流动检测法。本公开涉及的免疫层析法也包括捕获用物质捕获靶物质的原理不是免疫反应的方法。例如，本公开涉及的免疫层析法也包括捕获用物质是适体探针的测定方法。
第一检测系统
另外，本公开在其他一个方式中涉及用于进行上述方法的靶物质检测系统，上述方法检测试样中的靶物质。在一个或多个实施方式中，本公开涉及的第一检测系统包括：支承体，具备第一结合部分；报告物质，具备第二结合部分；第一捕获用物质，具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第一结合配偶体部分，且能够与所述靶物质结合；以及第二捕获用物质，具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第二结合配偶体部分，且能够与所述靶物质结合。
本公开涉及的第一检测系统可用于本公开涉及的第一检测方法。
[第二方式]
本公开涉及的第二方式是如下情况下的实施方式：第一方式中的捕获用物质的结合配偶体部分可以结合到支承体的结合部分，也可以结合到报告物质的结合部分，并且，检测法是免疫层析检测法，并且，靶物质识别部分是适体。
本公开涉及的第二方式基于如下情况：在使用了适体的免疫层析检测法中，关于如固定侧(支承体侧)用适体和检测侧(报告物质侧)用适体那样、适体的结合方向(结合位置)限于固定侧(支承体侧)用或检测侧(报告物质侧)用的情况，发现了下面的问题。
1.适体设计上的问题
(1)根据适体，如抗体那样，到底适合于检测侧(报告物质侧)和固定侧(支承体侧)中的哪一个可能会不同。
(2)根据以往的免疫层析检测法，在获取适体的阶段，需要准备固定侧(支承体侧)用和检测侧(报告物质侧)用的两种适体，花费时间和精力和/或成本。
例如，在用SELEX那样的方法获取核酸适体的情况下，可以通过一次SELEX获取多种适体(捕获被检测物(靶物质)的区域的序列不同，但具有相同的结合配偶体的序列)，但在需要具有用于固定侧(支承体侧)和用于检测侧(报告物质侧)的两种结合配偶体的序列的适体的情况下，需要在不同的两种适体候选序列中的某一个附加与另一个不同的结合配偶体序列的工序。
2.反应效率上的问题
由于与报告物质结合的适体和与支承体结合的适体各自能够结合的部位受限制，因此“适体-靶物质-适体”复合体与报告物质和支承体结合的反应效率会降低。即，“固定侧用适体-靶物质-检测侧用适体”与“能够与固定侧和检测侧双方结合的适体-靶物质-能够与固定侧和检测侧双方结合的适体”相比，与支承体(或报告物质)结合的反应效率差。
在一个方式中，本公开涉及的第二检测方法是通过免疫层析法检测试样中的靶物质的方法，是使用适体探针的方法，所述适体探针包括能够与靶物质结合的适体部分、以及能够与固定在支承体上的结合部分和固定在报告物质上的结合部分这两者结合的结合配偶体部分。
根据本公开涉及的第二检测方法，在一个或多个实施方式中，无需分别准备结合方向限于固定侧(支承体侧)用或检测侧(报告物质侧)用的两种适体探针，能够进行免疫层析检测法。
适体探针
在本公开涉及的第二方式中，“适体探针”包括：适体部分(靶物质识别部分)，其作为与靶物质结合的适体来发挥功能；以及结合配偶体部分，其能够与固定在支承体上的结合部分和固定在报告物质上的结合部分两者结合。
适体探针中，适体部分与结合配偶体部分可以直接结合，也可以经由接头结合。
作为适体部分的适体，可以是核酸适体，也可以是肽适体。核酸适体只要是核酸即可，作为核酸，可以列举出RNA、DNA、以及它们的修饰物或类似物，但优选为RNA。
结合配偶体部分是能够与固定在支承体上的结合部分和固定在报告物质上的结合部分这两者结合的部分。
如果结合配偶体部分是可结合的，则固定在支承体上的结合部分和固定在报告物质上的结合部分可以相同，也可以不同。
结合配偶体部分也可以被认为与适体结合的标签(tag)部分。
作为结合部分与结合配偶体部分的组合(结合配偶体部分与结合部分的组合)，在一个或多个实施方式中，可以列举出抗体或低分子抗体与靶物质的组合、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白/中性抗生物素蛋白与生物素的组合、二硝基苯酚(DNP)与抗DNP抗体的组合、地高辛与抗地高辛抗体的组合、地高辛配基与抗地高辛配基抗体的组合、半抗原与抗半抗原的组合、多糖与多糖结合部分的组合、凝集素与其受体的组合、配体与其受体的组合、荧光素与抗荧光素抗体的组合、以及互补核酸的组合。
作为结合配偶体部分和结合部分，如上所述。
在一个或多个实施方式中，在适体部分为核酸的情况下，可以列举出结合配偶体部分也是核酸，在该情况下，可以列举出结合部分也是所述核酸的互补核酸。在核酸适体探针的情况下，在一个或多个实施方式中，作为结合配偶体部分与结合部分的组合，可以列举出聚A与聚dT、聚U与聚dA等。
结合部分探针
如果支承体或报告物质在初期状态下不具有结合部分，则能够利用结合部分探针来固定结合部分。在一个或多个实施方式中，结合部分探针包括结合部分和能够进行对支承体或报告物质的结合或交联反应的官能团。在另一个或多个实施方式中，结合部分探针可以在结合部分与官能团之间具有接头。
此外，在本公开中，即使支承体本身原本具有结合部分，该结合部分也包含在“固定在支承体上的结合部分”中。同样地，即使报告物质本身原本具有结合部分，该结合部分也包含在“固定在报告物质上的结合部分”中。
作为上述官能团，在一个或多个实施方式中，可以列举出氨基、羧基、NHS(N-Hydroxysuccinimide，N-羟基丁二酰亚胺)酯基、酰亚胺酯基、马来酰亚胺基、卤代乙酸、吡啶基二硫化物基、巯基、醛基、酰肼基和烷氧基胺基等。
在支承体为硝化纤维素膜或其他分析膜、结合部分为DNA的情况下，作为上述官能团，可以列举出氨基。在支承体上配置氨基修饰后的DNA(结合部分探针)，通过照射UV，能够将结合部分探针固相化在支承体上(Pathogens.2014年6月；3(2)：341-355)。
当报告物质包含胶乳颗粒、且结合部分为DNA时，作为上述官能团，可以列举出氨基。能够用碳化二亚胺等而使胶乳颗粒表面的羧基活性化，而形成羧基-胺交联。
但是，结合部分探针的对支承体或报告物质的结合和交联方法不限于此，能够适当选择交联方法，根据该交联方法选择官能团。
支承体
作为支承体，可以列举出展开液能够展开且结合部分探针能够固定化的膜。在一个或多个实施方式中，可以列举出硝化纤维素、尼龙或聚酰胺、纸、玻璃纤维等的膜(Membrane)，具体而言，可以列举出用于固定横向流动型的免疫层析带(试验片)的膜(也称为反应膜)。在一个或多个实施方式中，作为支承体，可以列举出硝化纤维素膜。
报告物质
作为报告物质，可以使用免疫层析中使用的报告物质(检测剂)。作为报告物质，在一个或多个实施方式中，可以列举出酶、铁蛋白、荧光/吸光二氧化硅颗粒、荧光/吸光胶乳颗粒、半导体微粒、金胶体颗粒等。可以适当地进行它们与结合部分探针的固定化。
从报告物质得到信号的方法可以根据报告物质适当选择。关于伴随荧光、发光或显色的物质，能够使用目视、适当的读取装置或拍摄装置而对信号进行检测或记录，并根据需要进行分析。作为检测来自报告物质的信号的其他方法，在一个或多个实施方式中，可以举出显微镜、分光光度计和比色计等。
靶物质
作为靶物质，在一个或多个实施方式中，可以列举出抗原、抗体、DNA、RNA、糖、糖链、配体、受体、肽、蛋白质、化学物质、病原体或其一部分等。作为含有靶物质的试样，可以列举出血清、血液、血浆、唾液、尿、眼泪、鼻腔液及其他体液、培养细胞的培养液、以残留农药检查为目的的食物来源的样品、以水质检查为目的的水类样品或它们的稀释物，但是没有特别限制。
免疫层析检测法
在一个方式中，本公开涉及的第二检测方法是使用上述的本公开涉及的适体探针的基于免疫层析法的检测方法，该方法包括在支承上，在用“支承体-适体探针-靶物质-适体探针-报告物质”表示的结合状态下，捕获所述靶物质和所述报告物质。该方式中的“捕获”是指，经由捕获物质将靶物质和报告物质固定在支承体上。
换言之，在一个方式中，本公开涉及的第二检测方法是使用上述的本公开涉及的适体探针的基于免疫层析法的检测方法，该方法包括在支承体上形成“支承体-适体探针-靶物质-适体探针-报告物质”复合体。
在免疫层析试验片的检测区域(固定有结合部分的支承体部分)内展开液流动后，形成“支承体-适体探针-靶物质-适体探针-报告物质”复合体，如果从上述报告物质中检测出信号，则检测出试样中的靶物质。
因此，在一个方式中，本公开涉及的第二检测方法是进一步包括检测来自报告物质的信号的方法。
使用两种以上的适体探针的实施方式(实施方式1)
作为本公开涉及的第二检测方法的一个或多个实施方式，可以列举出使用两种以上的适体探针的实施方式。这里涉及的不同种类的适体探针具有相同的结合配偶体部分，但具有不同的靶物质识别部分、即不同的适体部分。在使用这样的适体的方法中，使用一个以上的适体探针。
使用图1的概略图，说明该实施方式。本实施方式是使用两种不同的适体探针4及7的方法。适体探针4、7的适体部分不同，分别可与靶部分6的不同部分结合。另外，适体探针4、7具有共同的结合配偶体部分5。换句话说，适体探针4、7具有相同的结合配偶体部分5。结合部分3经由结合部分探针2而固定在报告物质1上。在支承体11上也经由结合部分探针10而固定有结合部分3。即，报告物质1和支承体11都具有相同的结合部分3。适体探针4及7都可以通过结合配偶体部分5与结合部分3的结合而结合到报告物质1和支承体11上。
如果着眼于“适体探针4-靶物质6-适体探针7”复合体，则可以认为两处结合配偶体部分5能够与支承体11结合，与在适体探针4及7中结合配偶体部分5不同的情况相比，被支承体捕获的效率提高。
使用一种适体探针的实施方式(实施方式2)
作为本公开涉及的第二检测方法的一个或多个实施方式，可以列举出使用一种适体探针的实施方式。这里涉及的相同种类(1种类)的适体探针具有相同的结合配偶体部分、且具有相同的靶物质识别部分、即相同的适体部分。在使用这样的适体的方法中，使用一个适体。
使用图2的概略图，说明该实施方式。本实施方式是靶物质能够结合多个相同适体的情况(例如形成2个以上的多聚体的情况下)，是使用一种适体探针4及7的方法。适体探针4及7在适体部分和结合配偶体部分5中相同。适体探针4及7都可以通过结合配偶体部分5与结合部分3的结合而结合到报告物质1和支承体11上。
如果着眼于“适体探针4-靶物质6-适体探针7”复合体，则可以认为与实施方式1同样地，两处结合配偶体部分5能够与支承体11结合，与在适体探针4及7中结合配偶体部分5不同的情况相比，被支承体捕获的效率提高。
1液的展开液的实施方式(实施方式3)
作为本公开涉及的第二检测方法的一个或多个实施方式，可以列举出在免疫层析试验片的检测区域(固定有结合部分的支承体部分)内展开含有试样、适体探针和报告物质的展开液的实施方式。本说明书中涉及的那样“展开”是指，在存在相关联的结合配偶体的情况下，可以使接触的要素形成复合体。
在本实施方式中，适体探针可以是使用两种以上适体探针的实施方式(实施方式1)，也可以是使用一种适体探针的实施方式(实施方式2)。
根据本实施方式，可以使用一种展开液来进行本公开涉及的第二检测方法。
2液的展开液的实施方式(实施方式4)
作为本公开涉及的第二检测方法的一个或多个实施方式，可以列举出首先在免疫层析试验片的检测区域(固定有结合部分的支承体部分)内展开含有试样和适体探针的展开液(不含报告物质的展开液)，然后在上述检测区域内展开含有报告物质的展开液的实施方式。
在本实施方式中，适体探针可以是使用两种以上适体探针的实施方式(实施方式1)，也可以是使用一种适体探针的实施方式(实施方式2)。
根据本实施方式，可以使“适体探针-靶物质-适体探针”复合体在报告物质之前与检测区域(固定有结合部分的支承体部分)接触。由此，例如可以认为能够提高对检测区域的捕获效率。
第二检测系统
本公开在其他方式中涉及靶物质的免疫层析法检测系统。本公开涉及的第二检测系统包括：免疫层析试验片，其具备固定有结合部分的检测区域；报告物质，其固定有结合部分；以及本公开涉及的适体探针。
本公开涉及的第二检测系统能够进行本公开涉及的第二检测方法。
在本公开涉及的第二检测系统中，报告物质和适体探针可以与免疫层析试验片不同、一起或独立地以展开液的形态存在。另外，报告物质和适体探针也可以以干燥状态配置在免疫层析试验片上。
另外，报告物质和适体探针也可以以展开液的形态一起或独立地配置在免疫层析试验片上。
第二检测试剂盒
本公开在其他方式中涉及用于进行本公开涉及的第二检测方法的试剂盒。本公开涉及的第二检测试剂盒包括：免疫层析试验片，其具备固定有结合部分的检测区域；报告物质，其固定有结合部分；以及本公开涉及的适体探针。
在本公开涉及的第二检测试剂盒中，报告物质和适体探针可以与免疫层析试验片不同、一起或独立地以展开液的形态存在。
另外，报告物质和适体探针也可以以干燥状态配置在免疫层析试验片上。
此外，报告物质和适体探针可以以展开液的形态一起或独立地配置在免疫层析试验片上。
本公开可涉及以下未被限定的一个或多个实施方式。
〔1〕一种检测试样中的靶物质的方法，包括：
反应工序，使所述试样、支承体、报告物质、第一捕获用物质和第二捕获用物质反应，形成“支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质”复合体或“支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质”复合体，所述支承体具备第一结合部分，所述报告物质具备第二结合部分，所述第一捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第一结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合，所述第二捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第二结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合；以及
检测工序，检测信号，所述信号来自所述复合体中的所述报告物质。
〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，所述第一捕获用物质或所述第二捕获用物质是适体探针。
〔3〕根据〔1〕所述的方法，其中，所述适体探针是核酸适体。
〔4〕根据〔1〕至〔3〕中任一项所述的方法，其中，所述第一结合配偶体部分或第二结合配偶体部分与所述第一结合部分或第二结合部分的结合全部为基于非共价结合性相互作用的结合。
〔5〕根据〔4〕所述的方法，其中，基于所述非共价结合性相互作用的结合是互补核酸的结合。
〔6〕根据〔1〕至〔5〕中任一项所述的方法，其中，所述第一捕获用物质和所述第二捕获用物质是相同的捕获用物质，所述靶物质是能够在两个以上的部分与所述相同的捕获用物质结合的靶物质。
〔7〕根据〔1〕至〔6〕中任一项所述的方法，其中，通过免疫层析法检测。
〔8〕根据〔1〕至〔7〕中任一项所述的方法，其中，所述第一捕获用物质与支承体所具备的所述第一结合部分结合。
〔9〕根据〔1〕至〔8〕中任一项所述的方法，包括：在所述支承体上展开所述试样、所述第一捕获用物质、所述第二捕获用物质和所述报告物质。
〔10〕根据〔8〕或〔9〕所述的方法，所述反应工序包括：
使所述试样、所述支承体、所述第一捕获用物质和所述第二捕获用物质反应，形成“支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质”复合体或“支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质”复合体；以及
使所形成的复合体与所述报告物质反应。
〔11〕一种靶物质检测系统，用于进行〔1〕至〔10〕中任一项所述的方法。
〔12〕一种通过免疫层析法检测试样中的靶物质的方法，包括：
使用适体探针，在支承上，在用“支承体-适体探针-靶物质-适体探针-报告物质”表示的结合状态下，捕获靶物质和报告物质，所述适体探针具备能够与所述靶物质结合的适体部分、以及能够与固定在所述支承体上的结合部分和固定在所述报告物质上的结合部分这两者结合的结合配偶体部分；以及
检测来自所述报告物质的信号。这样的方法可以通过〔1〕至〔10〕中任一项所述的方法进行，此处，该方法使用免疫层析法以及一个或2个以上的适体探针(适体探针可以是相同的种类或不同的种类)。
〔13〕根据〔12〕所述的方法，其中，作为所述适体探针，使用能够与所述靶物质的不同部分结合的两种以上的适体探针。
〔14〕根据〔12〕所述的方法，其中，所述靶物质是能够在两个以上的部分与相同的适体部分结合的靶物质。
〔15〕根据〔12〕至〔14〕中任一项所述的方法，包括：在固定有所述结合部分的支承上展开含有试样、所述适体探针和所述报告物质的液体。
〔16〕根据〔12〕至〔14〕中任一项所述的方法，包括：
在固定有所述结合部分的支承体上展开含有试样和所述适体探针的液体；以及
然后，在所述支承体上展开含有所述报告物质的液体。
[17]一种利用免疫层析法的靶物质的检测系统，包括：
免疫层析试验片，具备固定有结合部分的检测区域；
报告物质，固定有结合部分；以及
适体探针，具备能够与检测区域的结合部分和报告物质的结合部分这两者结合的结合配偶体部分、以及能够与靶物质结合的适体部分。该系统可以是用于免疫层析法的〔11〕所述的系统。
〔18〕一种试剂盒，用于进行〔12〕至〔16〕中任一项所述的方法，所述试剂盒包括：
免疫层析试验片，具备固定有结合部分的检测区域；
报告物质，固定有结合部分；以及
适体探针，具备能够与检测区域的结合部分和报告物质的结合部分这两者结合的结合配偶体部分、以及能够与靶物质结合的适体部分。
以下，通过实施例，对本公开进行更详细说明，但这些实施例是例示性的，本公开不限于这些实施例。
实施例
实施例1
[两种核酸适体探针的免疫层析检测方法]
使用核酸适体来检测A/Panama(巴拿马)/2007/1999(H3N2)的血凝素(以下称为HA)，所述核酸适体分别将具有结合序列的结合部分探针固定在报告物质和硝基纤维素膜上，并识别A/Panama/2007/1999(H3N2)的HA。
另外，在以下说明中，有时将A/Panama/2007/1999(H3N2)的HA省略为H3/Panama或H3。另外，HA是指流感病毒的包膜上的被称为HA蛋白质的血凝素蛋白质。
<1.单链多核苷酸固定化免疫层析试验片的制作>
(1-1.免疫层析试验片的制作)
免疫层析试验片制作了与图3同样结构的试验片。将硝基纤维素膜(支承体)11、背衬片12和吸收带13贴合，沿着纵轴方向切断为宽度3.9mm，制作了免疫层析试验片。
(1-2.单链多核苷酸固定化免疫层析试验片的制作)
将由以下所示的序列(序列号1)构成的修饰多核苷酸作为结合部分探针，用无核酸酶水(Nuclease Free water)稀释至500μM的浓度，调制结合部分探针溶液。探针使用5’末端经由接头而被氨基修饰的探针。下划线部分的序列相当于固定在支承体上的第一结合部分，该序列是后述的核酸适体探针所具有的结合配偶体部分的互补序列。
单链多核苷酸(2)的序列：
5’-[NH2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(序列号1)
在从上述(1-1)中制作的免疫层析试验片的硝化纤维素膜侧的一端14(在图3中，将该端作为上游端14，将相反侧作为下游端15)离开1.4cm的位置(图3中的2)滴加0.1μL的结合部分探针溶液。对于滴加了结合部分探针溶液的免疫层析试验片，使用UVP公司的UV照射装置(UVGL-58)照射1000mJ/cm2左右的紫外线光(254nm)，将结合部分探针固定在膜11上(图3中的2)。
<2.多核苷酸固定化荧光胶乳颗粒的制作>
(2-1.荧光胶乳颗粒的活性化)
为了使荧光胶乳颗粒上的羧基活性化，分别用2-吗啉代乙烷磺酸(以下称为MES)缓冲液稀释调制成10mg/mL的1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺(以下称为EDC)、50mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(以下称为NHS)。在MES缓冲液215.5μL中添加EDC溶液119.5μL、NHS溶液115μL，再添加Thermo(赛默飞)公司的荧光胶乳颗粒(Fluoro-MaxTM DyedCarboxylate-Modified Microparticles)1％固体(solids)溶液50μL后，用涡旋混合机充分混合。将混合溶液置于振荡器中并在室温下反应30分钟。反应后，将荧光胶乳颗粒以18,300xg离心15分钟，并去除上清液。向所残留的粒料状荧光胶乳颗粒中添加500μL的新MES缓冲液，使用涡旋混合器和超声波清洗机将粒料再悬浮。同样地反复进行2次清洗操作，准备悬浮在500μL的MES缓冲液中的荧光胶乳颗粒溶液。
(2-2.单链多核苷酸对荧光胶乳颗粒的致敏)
将由以下所示的序列(序列号1)构成的修饰多核苷酸作为结合部分探针，用无核酸酶水(Nuclease Free water)稀释至16μM，调制结合部分探针溶液。结合部分探针使用5’末端经由接头而被氨基修饰的探针。下划线部分序列相当于固定在报告物质即荧光胶乳上的第二结合部分，该序列是后述的核酸适体探针所具有的结合配偶体部分的互补序列。另外，第一结合部分探针和第二结合部分探针两者都是排列有24个T的序列，是相同的结构。
单链多核苷酸(2)的序列：
5’-[NH2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(序列号1)
在上述(2-1)中准备的荧光胶乳颗粒溶液中加入200μL的结合部分探针溶液，用Vortex(涡旋混合器)混合。将混合溶液置于振荡器中并在室温下反应60分钟。反应后，将荧光胶乳颗粒以18,300xg离心15分钟，并去除上清液。向所残留的粒料状荧光胶乳颗粒中添加500μL的新的Tris-HCl缓冲液，使用涡旋混合器和超声波清洗机使粒料再悬浮。同样地反复进行2次清洗操作，准备悬浮在500μL的Tris-HCl缓冲液中的单链多核苷酸(结合部分)致敏荧光胶乳颗粒溶液。
＜3.H3的检测＞
(3-1.HA添加展开液的调制〕
如下所述，在96孔板上调制了70μL的HA添加展开液。
0.5mg/mL HA溶液
单链多核苷酸致敏荧光胶乳颗粒0.5μL
核酸适体探针两种0.5μL(各0.25μL)
展开液69μL
HA溶液是含有H3作为被检测物(靶物质)、或含有A/California(加利福尼亚)/06/2009(H1N1)的重组HA(以下称为H1)作为阴性对照的溶液。单链多核苷酸致敏荧光胶乳颗粒是固定有上述(2-1)和(2-2)的序列的单链DNA(结合部分)的荧光胶乳颗粒。另外，所使用的核酸适体探针是RNA，序列如下所示，下划线部分表示结合部分的互补序列(结合配偶体部分)。
换言之，核酸适体探针1和核酸适体探针2分别相当于第一捕获用物质和第二捕获用物质。并且，核酸适体探针1的第一结合配偶体部分和核酸适体探针2的第二结合配偶体部分都是排列有24个A的序列，结构相同。即，作为排列有24个A的序列的第一结合配偶体部分与作为排列有24个T的序列的支承体的第一结合部分和报告物质(上述荧光胶乳颗粒)的第二结合部分形成互补链而结合。同样地，作为排列有24个A的序列的第二结合配偶体部分也能够与支承体的第一结合部分和报告物质的第二结合部分形成互补链而结合。在本实施例中，作为第一结合部分和第二结合部分的序列，使用了与第一结合配偶体部分和第二结合配偶体部分形成完全互补链的序列，但是如果第一结合配偶体部分能够与第一结合部分和第二结合部分都结合，则第一结合部分和第二结合部分的序列可以不是与第一结合配偶体部分形成完全互补链的序列。同样地，如果第二结合配偶体部分能够与第一结合部分和第二结合部分都结合，则第一结合部分和第二结合部分的序列可以不是与第二结合配偶体部分形成完全互补链的序列。
核酸适体探针1：
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGAAUAGUAGAAUGAGCUCUGUCGGACCCAGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCUUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(序列号2)
核酸适体探针2：
5’-GGGUUAGCAGUCGGCAUGCGGUACAGACAGACCCUUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(序列号3)
(3-2.H3的检测)
将上述(3-1)中调制的H3添加展开液浸渍在上述(1-1)和(1-2)中制作的免疫层析试验片的前端，使试验片吸收H3添加展开液10分钟后，使用耶拿分析仪器公司(analytikjena公司)的UVP UVGL-25(95-0021-13)来进行目视确认和荧光免疫层析仪(爱科来开发品)中的显色确认。
<4.结果＞
表示免疫层析试验片的H3检测的有无的荧光免疫层析仪中的测定结果如图4所示。纵轴表示免疫层析试验片上出现的荧光信号的强度，横轴表示以图表的右侧为上游端的免疫层析试验片上的硝基纤维素膜的位置，(U)表示上游侧，(D)表示下游侧。
如图4所示，在H3添加展开液中，在固定有单链多核苷酸(结合部分)的位置上能够确认到荧光信号，在H3非添加展开液中未检测到荧光信号。由此表明，通过使用固定有针对核酸适体的互补链(结合部分)的免疫层析试验片、以及固定有与固定在试验片上的互补链相同的互补链(结合部分)的荧光胶乳颗粒，能够捕获作为目标的被检测物H3。
实施例2
[一种核酸适体探针的免疫层析检测方法]
以具有三聚体结构的被检测物为靶物质，确认了仅使用一种核酸适体探针时的免疫层析检测方法的检测能力。此外，HA是形成同型三聚体的蛋白质。
<1.单链多核苷酸固定化免疫层析试验片的制作>
用与实施例1同样的方法(1-1)～(1-2)，准备了固定有核酸适体探针的结合配偶体部分的互补序列(即，结合部分)的免疫层析试验片。但是，利用UV照射的单链多核苷酸的固定化使用耶拿分析仪器美国公司(Analytik Jena US公司)的UV照射装置(UVP CL-100)照射120mJ/cm2左右的紫外线光(254nm)后，在40℃下干燥5～10分钟而固定化。
<2.多核苷酸固定化荧光胶乳颗粒的制作>
通过与实施例1相同的方法(2-1)～(2-2)，准备了固定有结合部分的荧光胶乳颗粒。
＜3.仅用一种核酸适体的多聚体检测能力的评价>
(3-1.HA添加展开液的调制)
如下所述，在96孔板上调制了70μL的HA添加展开液。
HA溶液(H3 2.5μg/mL或非添加)
单链多核苷酸致敏荧光胶乳颗粒0.5μL
一种核酸适体探针0.25μL
展开液69.25μL
HA溶液是含有或不含有H3作为被检测物的溶液。单链多核苷酸致敏荧光胶乳颗粒是固定有实施例1的上述(2-1)和(2-2)的序列的单链DNA(结合部分)的荧光胶乳颗粒。
另外，所使用的核酸适体是RNA适体，序列如下所示，下划线部分表示结合部分的互补序列(结合配偶体部分)。
核酸适体探针2：
5’-GGGUUAGCAGUCGGCAUGCGGUACAGACAGACCCUUUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(序列号3)
(3-2.H3的检测)
将上述(3-1)中调制的H3添加展开液浸渍在上述(1-1)和(1-2)中制作的免疫层析试验片的前端，使H3展开液吸收到试验片中10分钟后，使用耶拿分析仪器公司(analytikjena公司)的UVP UVGL-25(95-0021-13)来进行目视确认和荧光免疫层析仪(爱科来开发品)中的显色确认。
<4.结果＞
表示免疫层析试验片的H3检测的有无的荧光免疫层析仪的测定结果如图5所示。纵轴表示免疫层析试验片上出现的荧光信号的强度，横轴表示以图表的右侧为上游端的免疫层析试验片上的硝基纤维素膜的位置，(U)表示上游侧，(D)表示下游侧。
如图5所示，在H3添加展开液中，在固定有单链多核苷酸(结合部分)的位置上能够确认到荧光信号，在H3非添加展开液中未检测到荧光信号。由此表明，通过使用固定有针对核酸适体的互补链(结合部分)的免疫层析试验片、以及固定有相同序列(相同结合部分)的荧光胶乳颗粒，在被检测物采取三聚体结构的情况下，即使是一种核酸适体探针也能够捕获被检测物H3。
符号说明
1：报告物质；2：结合部分探针；3：结合部分；4：适体探针；5：结合配偶体部分；6：靶物质；7：适体探针；10：结合部分探针；11：支承体；12：背衬片；13：吸收带；14：上游端；15：下游端。
序列表
<110> 爱科来株式会社
<120> 靶物质检测方法、靶物质检测试剂盒以及靶物质检测系统
<130> H4739-02
<150> 2019-114031
<151> 2019-06-19
<160> 3
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 结合部分
<400> 1
tttttttttt tttttttttt tttt 24
<210> 2
<211> 99
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸适体探针1.
<400> 2
gggagaauuc cgaccagaag aauaguagaa ugagcucugu cggacccagc cuuuccucuc 60
uccuuccucu ucuuuaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 99
<210> 3
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸适体探针2.
<400> 3
ggguuagcag ucggcaugcg guacagacag acccuuuaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
a 61

Claims (18)

1.一种检测试样中的靶物质的方法，包括：
反应工序，使所述试样、支承体、报告物质、第一捕获用物质和第二捕获用物质反应，形成支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质-报告物质复合体或支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质-报告物质复合体，所述支承体具备第一结合部分，所述报告物质具备第二结合部分，所述第一捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第一结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合，所述第二捕获用物质具备能够与所述第一结合部分和所述第二结合部分结合的第二结合配偶体部分、且能够与所述靶物质结合；以及
检测工序，检测信号，所述信号来自所述复合体中的所述报告物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述第一捕获用物质或所述第二捕获用物质是适体探针。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，
所述适体探针是核酸适体。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中，
所述第一结合配偶体部分或所述第二结合配偶体部分与所述第一结合部分或所述第二结合部分的结合全部为基于非共价结合性相互作用的结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，
基于所述非共价结合性相互作用的结合是互补核酸的结合。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，
所述第一捕获用物质和所述第二捕获用物质是相同的捕获用物质，所述靶物质是能够在两个以上的部分与所述相同的捕获用物质结合的靶物质。
7.根据权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中，
通过免疫层析法检测。
8.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中，
所述第一捕获用物质与支承体所具备的所述第一结合部分结合。
9.根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，包括：
在所述支承体上展开所述试样、所述第一捕获用物质、所述第二捕获用物质和所述报告物质。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，
所述反应工序包括：
使所述试样、所述支承体、所述第一捕获用物质和所述第二捕获用物质反应，形成支承体-第一捕获用物质-靶物质-第二捕获用物质复合体或支承体-第二捕获用物质-靶物质-第一捕获用物质复合体；以及
使所形成的复合体与所述报告物质反应。
11.一种靶物质检测系统，用于进行权利要求1至10中的任一项所述的方法。
12.一种通过免疫层析法检测试样中的靶物质的方法，包括：
使用适体探针，在支承体上，在用支承体-适体探针-靶物质-适体探针-报告物质表示的结合状态下，捕获靶物质和报告物质，所述适体探针具备能够与所述靶物质结合的适体部分、以及能够与固定在所述支承体上的结合部分和固定在所述报告物质上的结合部分这两者结合的结合配偶体部分；以及
检测来自所述报告物质的信号。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，
作为所述适体探针，使用能够与所述靶物质的不同部分结合的两种以上的适体探针。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，
所述靶物质是能够在两个以上的部分与相同的适体部分结合的靶物质。
15.根据权利要求12至14中的任一项所述的方法，包括：
在固定有结合部分的支承体上展开含有试样、所述适体探针和所述报告物质的液体。
16.根据权利要求12至14中的任一项所述的方法，包括：
在固定有结合部分的支承体上展开含有试样和所述适体探针的液体；以及
然后，在所述支承体上展开含有所述报告物质的液体。
17.一种利用免疫层析法的靶物质的检测系统，包括：
免疫层析试验片，具备固定有结合部分的检测区域；
报告物质，固定有结合部分；以及
适体探针，具备能够与检测区域的结合部分和报告物质的结合部分这两者结合的结合配偶体部分、以及能够与靶物质结合的适体部分。
18.一种试剂盒，用于进行权利要求12至16中的任一项所述的方法，所述试剂盒包括：
免疫层析试验片，具备固定有结合部分的检测区域；
报告物质，固定有结合部分；以及
适体探针，具备能够与检测区域的结合部分和报告物质的结合部分这两者结合的结合配偶体部分、以及能够与靶物质结合的适体部分。
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