JP6675165B2 - 被検物質の検出方法、検出用試薬キットおよび検出用試薬 - Google Patents

被検物質の検出方法、検出用試薬キットおよび検出用試薬 Download PDF

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Description

本発明は、被検物質の検出方法、検出用試薬キットおよび検出用試薬に関する。
被検物質の検出方法として、免疫複合体転移法がある（例えば、特許文献１参照）。特許文献１に記載の方法では、測定対象の抗原と活性成分とを含む免疫複合体を一旦担体上で形成させる。担体の洗浄後、担体から免疫複合体を解離させる。解離した免疫複合体を別の担体に結合させる。担体の洗浄後、担体上の免疫複合体を測定する。
特開平１−２５４８６８号公報
しかし、特許文献１に記載の方法では、試料に含まれる被検物質の量が微量である場合、十分な感度を確保し難いことがある。
本発明は、より高い感度で被検物質を検出することができる被検物質の検出方法、検出キットおよび検出用試薬を提供することを目的とする。
本発明の１つの側面は、（Ａ）被検物質と、被検物質に特異的に結合する第１の捕捉体と、被検物質における第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に特異的に結合する第２の捕捉体と、第２の捕捉体に特異的に結合する第３の捕捉体とを含む第１の複合体を形成する工程、
（Ｂ）第１の複合体から第１の捕捉体を含む一部を分離する工程、
（Ｃ）第１の捕捉体を含む一部を第４の捕捉体で捕捉させ、第２の複合体を形成する工程、および
（Ｄ）第２の複合体に含まれる被検物質を検出する工程
を含み、
第２の捕捉体が、被検物質と結合する結合物質と、支持体と、結合物質と支持体との間を連結するリンカーとを含み、リンカーがポリエチレングリコール鎖より成る、被検物質の検出方法を含む。
本発明の他の側面は、被検物質に結合可能な第１の捕捉体と、被検物質における第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に結合可能な第２の捕捉体と、第２の捕捉体に結合可能な第３の捕捉体とを含み、第２の捕捉体が、被検物質と結合する結合物質と、支持体と、結合物質と支持体との間を連結するリンカーとを含み、リンカーがポリエチレングリコール鎖より成る、被検物質の検出用試薬キットを含む。
本発明のさらに他の側面は、前述した被検物質の検出方法に用いるための被検物質の検出用試薬であって、被検物質に結合可能な第２の捕捉体を含み、第２の捕捉体が、被検物質と結合する結合物質と、支持体と、結合物質と支持体との間を連結するリンカーとを含み、リンカーがポリエチレングリコール鎖より成る、被検物質の検出用試薬を含む。
本発明によれば、高い感度で被検物質を検出することができる、被検物質の検出方法、検出用試薬キットおよび検出用試薬を提供することができる。
第２の捕捉体の概略説明図である。 被検物質の検出方法の手順の一例の工程図である。 検出用試薬キットの構成図である。 実施例１および比較例１において、複合体保持率を調べた結果を示すグラフである。 実施例２および比較例２〜４において、Ｓ／Ｎ比を調べた結果を示すグラフである。 実施例３〜５および比較例５〜７において、Ｓ／Ｎ比を調べた結果を示すグラフである。 実施例６〜８および比較例８において、Ｓ／Ｎ比を調べた結果を示すグラフである。
１．被検物質の検出方法
本実施形態に係る被検物質の検出方法は、（Ａ）被検物質と、被検物質に特異的に結合する第１の捕捉体と、被検物質における第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に特異的に結合する第２の捕捉体と、第２の捕捉体に特異的に結合する第３の捕捉体とを含む第１の複合体を形成する工程、
（Ｂ）第１の複合体から第１の捕捉体を含む一部を分離する工程、
（Ｃ）第１の捕捉体を含む一部を第４の捕捉体で捕捉させ、第２の複合体を形成する工程、および
（Ｄ）第２の複合体に含まれる被検物質を検出する工程
を含む。第２の捕捉体は、被検物質と結合する結合物質と、支持体と、結合物質と支持体との間を連結するリンカーとを含む。本実施形態に係る被検物質の検出方法は、例えば、免疫測定方法などの抗原抗体反応を利用する方法などによって行なうことができる。この場合、第１の捕捉体と前記被検物質とが抗原抗体反応を利用して複合体を形成する。また、前記第２の捕捉体と前記被検物質とが抗原抗体反応を利用して複合体を形成する。
免疫複合体転移法（以下、「ＩＣＴ−ＥＩＡ」ともいう）では、２種類の捕捉体によって被検物質を挟むように捕捉し、免疫複合体を形成させる。従来の免疫複合体転移法では、一部の免疫複合体の解離によって感度が低下することが本発明者らによって見出されている。また、被検物質の量が微量である場合、十分な感度を確保し難いことがある。これに対し、本実施形態の被検物質の検出方法では、結合物質と支持体との間がリンカーで連結された第２の捕捉体が用いられている。したがって、本実施形態の被検物質の検出方法では、第１の捕捉体と第２の捕捉体とによって被検物質を挟むように捕捉し、サンドイッチ複合体を形成させる。これにより、第２の捕捉体による被検物質の捕捉の際に、立体障害の発生が抑制されると考えられる。そのため、第１の捕捉体と被検物質と第２の捕捉体との複合体の解離が抑制され、被検物質の検出の感度を向上させることができると考えられる。
被検物質としては、例えば、抗体、抗原、核酸、生理活性物質、細菌、ウイルス、ペプチド、治療薬剤（血中薬剤）などが挙げられるが、特に限定されない。なお、抗体も抗原になり得る。抗体としては、抗原に対する抗体、抗体に対する抗体などが挙げられるが、特に限定されない。抗原としては、核酸、生理活性物質、細菌、ウイルス、ペプチドなどが挙げられるが、特に限定されない。核酸としては、例えば、疾患原因遺伝子などをコードする核酸、細菌またはウイルスの遺伝子をコードする核酸などが挙げられるが、特に限定されない。生理活性物質としては、例えば、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、酵素、サイトカイン、ホルモン、糖鎖などが挙げられるが、特に限定されない。
第１の捕捉体は、被検物質に特異的に結合する第１の結合物質を含む。本明細書において、「特異的に」とは、特定物質以外の物質に実質的に結合しないか、あるいは特定物質以外の物質と実質的に検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないことをいう。第１の捕捉体は、被検物質の検出容易性を高める観点から、検出可能な標識物質をさらに有することが好ましい。
第１の結合物質としては、例えば、抗体、アプタマー、アフィボディー（アフィボディー社の登録商標）、レクチン、核酸などが挙げられるが、特に限定されない。なお、本明細書において、特に断りのない限り、「抗体」の概念には、「抗体断片」も包含される。第１の結合物質としての抗体は、被検物質に特異的に結合する機能を有する。抗体としては、例えば、マウス由来の抗体、ウサギ由来の抗体、ヤギ由来の抗体、ヒツジ由来の抗体、ギニアピッグ由来の抗体、ウナギ由来の抗体、サメ由来の抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、特に限定されない。また、抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、単鎖抗体〔ｓｃＦｃ〕などが挙げられるが、特に限定されない。アプタマーは、核酸アプタマーおよびペプチドアプタマーのいずれであってもよい。アフィボディー（登録商標）は、プロテインＡの特定ドメインを骨格として有するポリペプチドである。また、アフィボディーは、被検物質に特異的に結合する機能を有する。レクチンは、被験物質としての糖鎖に特異的に結合するタンパク質である。核酸は、被検物質としての核酸に特異的に結合する核酸である。核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ）などが挙げられるが、特に限定されない。これらの結合物質のなかでは、抗体が好ましい。
標識物質としては、酵素、蛍光物質、放射性物質などが挙げられるが、特に限定されない。酵素としては、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、プロピジウムイオダイド（ＰＩ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（モレキュラ・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社の登録商標）シリーズの色素などが挙げられるが、特に限定されない。放射性物質としては、３２Ｐ、３５Ｓなどが挙げられるが、特に限定されない。標識物質は、好ましくは酵素、より好ましくはβ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼである。
第２の捕捉体は、被検物質における第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に特異的に結合する。したがって、第２の捕捉体は、被検物質との結合の際に第１の捕捉体と競合しない。第２の捕捉体は、被検物質と結合する第２の結合物質と、支持体と、リンカーとを含む。リンカーは、第２の結合物質と支持体との間を連結する。支持体は、第１の反応基と第２の反応基とを有する。
第２の結合物質は、被検物質における第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に結合する物質である。第２の結合物質としては、例えば、抗体、アプタマー、アフィボディー（アフィボディー社の登録商標）、レクチン、核酸などが挙げられるが、特に限定されない。第２の結合物質としての抗体は、被検物質に特異的に結合する機能を有する。抗体としては、例えば、マウス由来の抗体、ウサギ由来の抗体、ヤギ由来の抗体、ヒツジ由来の抗体、ギニアピッグ由来の抗体、ウナギ由来の抗体、サメ由来の抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、特に限定されない。
支持体としては、例えば、ポリペプチド、デキストラン、カゼインなどが挙げられるが、特に限定されない。ポリペプチドは、第１の捕捉体の結合部位を有していないポリペプチドである。ポリペプチドは、被検物質の種類などによって異なる。ポリペプチドとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンなどが挙げられるが、特に限定されない。
第１の反応基としては、第３の捕捉体の結合が可能な物質であれば、特に限定されない。第１の反応基としては、例えば、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）基、ビオチン、抗体、抗原、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。
第２の反応基としては、第４の捕捉体の結合が可能な物質であれば、特に限定されない。第２の反応基としては、例えば、ＤＮＰ基、ビオチン、抗体、抗原、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられる。なお、第２の反応基は、第１の反応基である。
本明細書において、「リンカー」とは、第２の結合物質と支持体との間を連結する分子をいう。リンカーとしては、置換基、酸素原子、硫黄原子および窒素原子からなる群より選ばれた少なくとも１つを有していてもよいポリマー鎖などが挙げられるが、特に限定されない。ポリマー鎖としては、例えば、炭素数２〜６のオキシアルキレン基を有するポリアルキレングリコール鎖、式（Ｉ）：
（式中、Ｘは窒素原子、酸素原子、硫黄原子、炭素数１〜４のアルキレン基、−ＮＨＣＯ−基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基または置換基を有していてもよい炭素数３〜８のシクロアルキル基、ｍ、ｎおよびｐは互いに独立しており、２以上の正の整数を示す）
で表わされるポリマー鎖などが挙げられるが、特に限定されない。なお、式（Ｉ）で表わされるポリマー鎖は、一方の末端に第２の結合物質が連結される。また、ポリマー鎖の他方の末端には支持体が連結される。式（Ｉ）で表わされるポリマー鎖は、結合物質または支持体と結合させるための官能基を介して第２の結合物質または支持体と結合させてもよい。
ポリアルキレングリコール鎖において、オキシアルキレン基の炭素数は、２〜６、好ましくは２〜４である。また、ポリアルキレングリコール鎖において、オキシアルキレン基の平均付加モル数は、２〜１００、好ましくは２〜２０である。ポリアルキレングリコール鎖の質量平均分子量は、好ましくは１１６〜１２０００、より好ましくは１１６〜２０００である。炭素数２〜６のオキシアルキレン基としては、例えば、オキシエチレン基、オキシプロピレン基などが挙げられるが、特に限定されない。ポリアルキレングリコール鎖としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどが挙げられるが、特に限定されない。ポリアルキレングリコール鎖は、単独重合体、交互共重合体、ブロック共重合体およびランダム共重合体のいずれであってもよい。なお、「質量平均分子量」は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって求められた値である。
式（Ｉ）において、Ｘは窒素原子、酸素原子、硫黄原子、炭素数１〜４のアルキレン基、−ＮＨＣＯ−基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリール基または置換基を有していてもよい炭素数３〜８のシクロアルキル基である。アリール基の炭素数は、６〜１２、好ましくは６〜８、より好ましくは６〜７である。アリール基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチル基、オキソ基、カルボキシル基、アミノ基などが挙げられるが、特に限定されない。アリール基としては、フェニル基、トリル基などが挙げられるが、特に限定されない。シクロアルキル基の炭素数は、３〜８、好ましくは４〜６である。シクロアルキル基が有していてもよい置換基は、アリール基が有していてもよい置換基と同様である。シクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられるが、特に限定されない。
これらのリンカーのなかでは、サンドイッチ複合体形成時における被検物質の解離などを抑制する観点から、炭素数２〜６のオキシアルキレン基を有するポリアルキレングリコール鎖が好ましく、炭素数２〜６のオキシアルキレン基の平均付加モル数が２〜１００であるポリアルキレングリコール鎖がより好ましい。ポリアルキレングリコール鎖のなかでは、サンドイッチ複合体形成時における被検物質の解離などをより確実に抑制する観点から、ポリエチレングリコール鎖が好ましく、オキシエチレン基の平均付加モル数が２〜１００であるポリエチレングリコール鎖がより好ましい。
第３の捕捉体は、第２の捕捉体に特異的に結合する。第３の捕捉体は、第２の捕捉体に結合する第３の結合物質と、結合物質を保持する固相とを含むことが好ましい。第３の捕捉体における第３の結合物質は、第２の捕捉体中の被検物質の結合部位とは異なる部位に結合する。第３捕捉体における第３の結合物質としては、例えば、抗体、アプタマー、アフィボディー（アフィボディー社の登録商標）、レクチン、核酸、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどが挙げられるが、特に限定されない。第３の結合物質としての抗体は、被検物質に特異的に結合する機能を有する。抗体としては、例えば、マウス由来の抗体、ウサギ由来の抗体、ヤギ由来の抗体、ヒツジ由来の抗体、ギニアピッグ由来の抗体、ウナギ由来の抗体、サメ由来の抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、特に限定されない。固相としては、例えば、粒子、プレートなどが挙げられるが、特に限定されない。粒子としては、例えば、磁性粒子、ラテックス粒子などが挙げられるが、特に限定されない。プレートとしては、例えば、ポリスチレン製プレートなどが挙げられるが、特に限定されない。なお、第２の捕捉体における第１の反応基と第３の捕捉体における第３の結合物質との組み合わせとしては、例えば、ハプテンと抗ハプテン抗体との組み合わせ、その他の抗原と抗体との組み合わせなどが挙げられるが、特に限定されない。ハプテンと抗ハプテン抗体との組み合わせとしては、例えば、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体、ビオチン−抗ビオチン抗体などが挙げられるが、特に限定されない。
第４の捕捉体は、第１の捕捉体を含む一部を捕捉する。ここで、「第１の捕捉体を含む一部」とは、第１の捕捉体の量と被検物質の量との間の相関性を確保するのに十分な部分をいう。第１の捕捉体を含む一部は、好ましくは第１の複合体における第３の捕捉体以外の部分である。第１の捕捉体を含む一部としては、例えば、第１の捕捉体と被検物質との複合体、第１の捕捉体と被検物質と第２の捕捉体との複合体などが挙げられる。第４の捕捉体は、第１の捕捉体を含む一部と結合する第４の結合物質と、固相とを含むことが好ましい。第４の結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー、アフィボディー（アフィボディー社の登録商標）、レクチン、核酸、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、第２の捕捉体中の支持体が有する反応基に結合する物質などが挙げられる。固相は、第４の結合物質を固定して保持する。第４の捕捉体における固相としては、第３の捕捉体における固相と同様のものが挙げられる。第２の捕捉体における第２の反応基と第４の捕捉体における第４の結合物質との組み合わせとしては、例えば、ハプテンと抗ハプテン抗体との組み合わせ、その他の抗原と抗体との組み合わせなどが挙げられるが、特に限定されない。ハプテンと抗ハプテン抗体との組み合わせとしては、例えば、ＤＮＰ−抗ＤＮＰ抗体、ビオチン−抗ビオチン抗体などが挙げられるが、特に限定されない。第２の反応基と第４の捕捉体との組み合わせは、第１の反応基と第３の捕捉体との組み合わせと異なる組み合わせである。
第２の捕捉体の一例を図１に示す。図１に示される第２の捕捉体２は、第２の結合物質５１としてのＦａｂ’と、支持体５２と、リンカー５３とを含む。第２の結合物質５１と支持体５２とは、リンカー５３によって連結されている。支持体５２の表面には、第１の反応基５４と第２の反応基５５とを有している。第１の反応基５４は、第３の捕捉体の結合または脱離が可能な部分である。また、第２の反応基５５は、第４の捕捉体の結合が可能な部分である。
第３の捕捉体における第３の結合物質は、図１における第２の捕捉体２中の支持体５２が有する第１の反応基５４に結合する物質であってもよい。図１における第１の反応基５４に結合する物質は、図１における第１の反応基５４の種類に応じて適宜選択することができる。図１における第１の反応基５４と第３の捕捉体における第３の結合物質との組み合わせとしては、例えば、ＤＮＰ基と抗ＤＮＰ抗体との組み合わせ、トリニトロフェニル（ＴＮＰ）基と抗ＴＮＰ抗体との組み合わせ、ビオチンとアビジンとの組み合わせなどが挙げられるが、特に限定されない。
また、図１における第２の反応基５５に結合する物質は、図１における第２の反応基５５の種類に応じて適宜選択することができる。第２の反応基５５と第４の捕捉体における第４の結合物質との組み合わせとしては、例えば、ＤＮＰ基と抗ＤＮＰ抗体との組み合わせ、ＴＮＰ基と抗ＴＮＰ抗体との組み合わせ、ビオチンとアビジンとの組み合わせ、ビオチンとストレプトアビジンとの組み合わせなどが挙げられるが、特に限定されない。
つぎに、本実施形態に係る被検物質の検出方法の手順の一例を説明する。本実施形態に係る被検物質の検出方法の手順の一例を図２に示す。図２においては、図２（ａ）に示される被検物質Ｓと夾雑物質Ｆとを含む試料中の被検物質Ｓを検出する場合を例に挙げて説明する。なお、図２において、第１の捕捉体１、第２の捕捉体２、第３の捕捉体３などの種類などは、特に限定されない。ここで、「夾雑物質」とは、被検物質以外の物質をいう。なお、図２においては、被検物質Ｓに、第１の捕捉体１、第２の捕捉体２および第３の捕捉体３をこの順で接触させることによって第１の複合体１３を形成している。しかし、被検物質Ｓ、第１の捕捉体１、第２の捕捉体２および第３の捕捉体３の混合順は、特に限定されない。
工程（Ａ）において、被検物質Ｓと、第１の捕捉体１と、第２の捕捉体２と、第３の捕捉体とを含む第１の複合体１３を形成させる。具体的には、まず、図２（ａ）および（ｂ）に示されるように、第１の捕捉体１と、被検物質Ｓと夾雑物質Ｆとを含む試料とを接触させる。これにより、第１の捕捉体１と被検物質Ｓとの複合体１１が形成される。つぎに、図２（ｃ）に示されるように、複合体１１と第２の捕捉体２とを接触させる。これにより、サンドイッチ複合体１２が形成される。サンドイッチ複合体１２は、被検物質Ｓが第１の捕捉体１と第２の捕捉体２とによって挟まれるように第１の捕捉体１および第２の捕捉体２と結合した複合体である。その後、サンドイッチ複合体１２と第３の捕捉体３とを接触させる。これにより、図２（ｄ）に示されるように、第１の複合体１３が形成される。第１の複合体１３は、第１の捕捉体１と被検物質Ｓと第２の捕捉体２と第３の捕捉体３とを含んでいる。図２（ｄ）において、第３の捕捉体３は、固相６１と固相６１上に固定された第３の結合物質６２とを含む。第１の複合体１３の形成に際しては、図２（ｄ）に示されるように、第３の捕捉体３中の第３の結合物質６２が第２の捕捉体２中の第１の反応基５４に結合している。
第１の複合体１３は、例えば、抗原抗体反応などを利用することなどによって形成させることができる。第１の複合体１３の形成は、被検物質Ｓに対する特異性を高め、感度を向上させる観点から、抗原抗体反応を利用することが好ましい。この場合、第１の捕捉体１が抗原抗体反応によって被検物質Ｓと特異的に結合する物質を含むことが好ましい。また、第２の捕捉体２が抗原抗体反応によって被検物質Ｓと特異的に結合する物質を第２の結合物質として含むことが好ましい。被検物質Ｓが抗原である場合、抗原に特異的に結合する抗体、この抗体を断片化した抗体断片などを用いることができる。一方、被検物質Ｓが抗体である場合、この抗体の抗原、当該抗体に特異的に結合する抗体などを用いることができる。
第１の複合体１３の形成は、被検物質Ｓ、第１の捕捉体１、第２の捕捉体２および第３の捕捉体３それぞれの種類に応じた条件下に行なうことができる。第１の複合体１３の形成は、溶液中で行なうことができる。溶液は、第１の捕捉体１と被検物質Ｓと第２の捕捉体２と第３の捕捉体３との結合に適した溶液であればよい。第１の複合体１３の形成温度は、第１の捕捉体１と被検物質Ｓと第２の捕捉体２と第３の捕捉体３との結合に適した温度であればよい。第１の複合体１３の形成時間は、第１の捕捉体１と被検物質Ｓと第２の捕捉体２と第３の捕捉体３との結合を行なうのに十分な時間であればよい。
感度の向上の観点から、工程（Ａ）と後述の工程（Ｂ）との間に、遊離状態の第１の捕捉体１および遊離状態の第２の捕捉体２の除去する工程（以下、「第１の除去工程」ともいう）をさらに行なうことができる。第１の除去工程では、例えば、緩衝液などを用いた洗浄などを行なうことができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、リン酸ナトリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが挙げられるが、特に限定されない。緩衝液のｐＨは、第１の複合体１３を安定に保持することができる範囲であればよい。なお、第１の除去工程では、遊離状態の夾雑物質Ｆも除去される。
工程（Ｂ）において、図２（ｅ）に示されるように、第１の複合体１３から第１の捕捉体１を含む一部を分離する。第１の捕捉体１を含む一部は、分離の容易性および十分な定量性を確保する観点から、好ましくは複合体１１およびサンドイッチ複合体１２、より好ましくはサンドイッチ複合体１２である。なお、図２（ｅ）において、第１の複合体１３から、第１の捕捉体１を含む一部としてサンドイッチ複合体１２を分離している。しかし、第１捕捉体１を含む一部は、サンドイッチ複合体１２以外であってもよい。
分離は、例えば、第１の複合体１３に含まれる結合の種類などに応じた分離方法によって行なうことができる。第１の複合体１３に含まれる結合としては、例えば、第１の捕捉体１と第２の捕捉体２との結合、第２の捕捉体２と第３の捕捉体３との結合、複合体１１に含まれる結合、サンドイッチ複合体１２に含まれる結合などが挙げられる。第１の複合体に含まれる結合としては、具体的には、例えば、ジスルフィド結合を介した結合、ＤＮＰ基を介した結合などが挙げられるが、特に限定されない。ジスルフィド結合を介した結合としては、例えば、ジスルフィド結合を介した抗原と抗体との結合、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジンとの結合などが挙げられるが、特に限定されない。ＤＮＰ基を介した結合としては、例えば、ＤＮＰと抗ＤＮＰ抗体との結合などが挙げられるが、特に限定されない。分離には、第１の捕捉体１を切断せず、かつ第１の複合体１３から少なくとも第３の捕捉体３を分離するための分離試薬を用いることができる。第１の複合体１３が、その第１の捕捉体１を除く部分にジスルフィド結合を有する場合、分離試薬としてジスルフィド結合を切断する試薬を用いることができる。ジスルフィド結合を切断する試薬としては、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールなどが挙げられるが、特に限定されない。また、第１の複合体１３が、その第１の捕捉体１を除く部分にＤＮＰ基を介した結合を有する場合、分離試薬としてジニトロフェニルアミノ酸を用いることができる。ジニトロフェニルアミノ酸としては、例えば、ジニトロフェニルリジンなどが挙げられるが特に限定されない。
なお、第１の除去工程の後、遊離状態の第１の捕捉体１および遊離状態の第２の捕捉体２が残存している場合がある。そこで、感度の向上の観点から、工程（Ｂ）と後述の工程（Ｃ）との間に、遊離状態の第１の捕捉体１および遊離状態の第２の捕捉体２を除去する工程をさらに行なうことができる。
工程（Ｃ）において、図２（ｆ）に示されるように、第１の捕捉体１を含む一部を第４の捕捉体４で捕捉させる。これにより、第２の複合体１４を形成させる。図２（ｆ）において、第４の捕捉体４は、固相７１と固相７１上に固定された第４の結合物質７２とを含む。第２の複合体１４の形成に際しては、図２（ｄ）に示されるように、第４の捕捉体４中の第４の結合物質７２が第２の捕捉体２中の第２の反応基５５に結合する。第２の複合体１４の形成は、工程（Ａ）における第１の複合体１３の形成と同様の手法によって行なうことができる。
なお、感度の向上の観点から、工程（Ｃ）と後述の工程（Ｄ）との間に、遊離状態の第４の捕捉体を除去する工程をさらに行なうことができる。
工程（Ｄ）において、図２（ｇ）に示されるように、第２の複合体１４に含まれる被検物質Ｓを検出する。被検物質の検出は、第１の捕捉体１が標識物質を含む場合、第１の捕捉体１に含まれる標識物質に基づく信号を検出することによって行なうことができる。信号としては、例えば、発光、蛍光、発色、放射線などが挙げられるが、特に限定されない。信号は、検出が容易であることから、好ましくは発光、蛍光および発色である。標識物質に基づく信号の検出は、標識物質の種類に応じた検出方法によって行なうことができる。標識物質が酵素である場合、酵素反応によって酵素基質から生じる生成物の量を測定することなどによって信号の検出を行なうことができる。酵素基質は、生成物の量の測定が容易であることから、好ましくは発色基質および化学発光基質である。酵素基質は、酵素の種類に応じて適宜選択することができる。標識物質が蛍光物質である場合、蛍光物質に基づく蛍光の強度、蛍光波長のシフトなどを測定することによって信号の検出を行なうことができる。標識物質が放射性物質である場合、放射性物質から生じる放射線量をすることによって信号の検出を行なうことができる。
２．被検物質の検出用試薬キット
本実施形態に係る検出用試薬キットは、被検物質に結合可能な第１の捕捉体と、被検物質における第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に結合可能な第２の捕捉体と、第２の捕捉体に結合可能な第３の捕捉体とを含み、第２の捕捉体が、被検物質と結合する結合物質（前述の第２の結合物質）と、支持体と、結合物質と支持体との間を連結するリンカーとを含む。第１の捕捉体、第２の捕捉体、第３の捕捉体、第４の捕捉体、結合物質（前述の第２の結合物質）、支持体およびリンカーは、前述の被検物質の検出方法で用いられるものと同様である。第１の捕捉体、第２の捕捉体、第３の捕捉体および第４の捕捉体は、適切な溶媒に溶解させた状態で提供することができる。第１の捕捉体、第２の捕捉体および第３の捕捉体と、第４の捕捉体とは、夾雑物質の非特異的な検出を抑制する観点から、別々の容器に収容することが好ましい。第１の捕捉体、第２の捕捉体、第３の捕捉体および第４の捕捉体は、それぞれ別々の容器に収容されていてもよい。また、第１の捕捉体、第２の捕捉体および第３の捕捉体は、２種以上を同じ容器にいれてもよい。また、第１の捕捉体、第２の捕捉体および第３の捕捉体は、２種以上を同じ容器にいれてもよい。
本実施形態に係る検出用試薬キットは、助剤をさらに含有してもよい。助剤としては、例えば、第１の捕捉体、第２の捕捉体、第３の捕捉体および第４の捕捉体を安定的に維持するための保存剤または安定化剤、第１の捕捉体と第２の捕捉体と第３の捕捉体とを含む第１の複合体の形成のための試薬、分離試薬、第１の捕捉体を含む一部と第４の捕捉体とを含む第２の複合体の形成のための試薬などが挙げられるが、特に限定されない。助剤としては、例えば、緩衝液などが挙げられる。
第１の捕捉体が、標識物質を有する場合、本実施形態に係る検出用試薬キットは、標識物質に基づく信号の検出に必要な試薬をさらに含有していてもよい。信号の検出に必要な試薬は、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。信号の検出に必要な試薬としては、例えば、酵素基質、発色剤などが挙げられるが、特に限定されない。
本実施形態に係る検出用試薬キットの一例としては、図３に示される検出用試薬キット２００などが挙げられるが、特に限定されない。図３に示される試薬キット２００は、第１試薬容器２０１と、第２試薬容器２０２と、第３試薬容器２０３とを含む。第１試薬容器２０１は、被検物質に結合可能な第１の捕捉体を収容する。第２試薬容器２０２は、被検物質における第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に結合可能な第２の捕捉体を収容する。第３試薬容器２０３は、第２の捕捉体に結合可能な第３の捕捉体を収容する。本実施形態に係る検出用試薬キットは、添付文書をさらに含んでもよい。添付文書は、本実施形態に係る検出用試薬キットを用いて上述した前述の被検物質の検出方法を行なう操作手順などの記載を含んでもよい。
３．被検物質の検出用試薬
本実施形態に係る被験物質の検出用試薬は、前述した被検物質の検出方法に用いるための被検物質の検出用試薬である。本実施形態に係る被験物質の検出用試薬は、被検物質に結合可能な第２の捕捉体を含む。第２の捕捉体は、被検物質と結合する結合物質（前述の第２の結合物質）と、支持体と、結合物質（前述の第２の結合物質）と支持体との間を連結するリンカーとを含む。第２の捕捉体、結合物質（前述の第２の結合物質）、支持体およびリンカーは、前述の被検物質の検出方法で用いられるものと同様である。
本実施形態に係る検出用試薬は、助剤をさらに含有してもよい。助剤としては、例えば、第２の捕捉体を安定的に維持するための保存剤または安定化剤などが挙げられるが、特に限定されない。助剤としては、例えば、緩衝液などが挙げられる。
以下において、各略語の意味は、以下のとおりである。
＜略語＞
ＢＳＡ： ウシ血清アルブミン
ＤＮＰ： ２，４−ジニトロフェニル基
Ｂｉｏ： ビオチニル基
ＥＭＣＳ： Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド
ＳＨ： チオール基
ｍａｌ： マレイミド基
ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰ： ビオチンとＤＮＰとによって修飾されたＢＳＡ
（ＰＥＧ）8−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰ： ＰＥＧリンカーが付加されたＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰ
ＴＮＦα： 腫瘍壊死因子α
４−ＭＵＧ： ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＰＥＧ： ポリエチレングリコール鎖
（ＰＥＧ）ｎ： オキシエチレン基の付加モル数がｎであるポリエチレングリコール鎖
Ｇａｌ： β−ガラクトシダーゼ
（実施例１）
（１）サンドイッチ複合体の形成
表１に示される捕捉抗体、検出抗体および被検物質としてのＴＮＦα〔アール＆ディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｋｉｔ ｓｔａｎｄａｒｄ〕それぞれの量が、表１に示される量となるように、捕捉抗体と検出抗体とを含有する抗体溶液１００μＬと、被検物質含有溶液１００μＬとをチューブ内で混合した。なお、抗体溶液および被験物質含有溶液の溶媒として、緩衝液Ａ〔０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕を使用した。なお、表１に示される捕捉抗体は、以下のように作製した。慣用の手法に準じ、バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）社製のクローン名：Ｍａｂ１から得られた抗ＴＮＦαマウスＩｇＧをペプシンで断片化してＦ（ａｂ’）２断片を得た。得られたＦ（ａｂ’）２断片を還元してＦａｂ’−ＳＨを得た。また、ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰとリンカー〔ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：ＳＭ（ＰＥＧ）８〕とを反応させて（ＰＥＧ）8−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰを得た。Ｆａｂ’−ＳＨと（ＰＥＧ）8−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰとを反応させることによって捕捉抗体を得た。
また、表１に示される検出抗体は、以下のように作製した。慣用の手法に準じ、アール＆ディーシステムズ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）社製のクローン名：２８４０１から得られた抗マウスＩｇＧ抗体をペプシンで断片化してF（ａｂ’）２断片を得た。得られたＦ（ａｂ’）２断片を還元してＦａｂ’−ＳＨを得た。ＧａｌにＥＭＣＳを反応させてＡＬＰ−ｍａｌを得た。Ｆａｂ’−ＳＨとＧａｌ−ｍａｌを反応させることによって検出抗体を得た。
得られた混合物２００μＬを４℃で１２時間インキュベーションすることにより、サンドイッチ複合体を形成させた。
（２）サンドイッチ複合体の捕捉
実施例１（１）で得られたサンドイッチ複合体が入ったチューブに抗ＤＮＰ抗体固相〔イムノケミカル製、商品名：Ｉｍｍｕｎｏ ｂｅａｄ ６．３５φ、抗ＤＮＰ抗体を固定化した固相〕１個を添加した。得られた混合物を２５℃で３０分間インキュベーションすることによって抗ＤＮＰ固相上にサンドイッチ複合体を捕捉した。つぎに、チューブ中の混合物を、洗浄液〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２ｍＬを用いて２回洗浄した。その後、抗ＤＮＰ抗体固相を回収した。
（３）上清および抗ＤＮＰ固相の回収
実施例１（２）で回収された複合体を２ｍＭ ＤＮＰ溶液１５０μＬに添加した。得られた混合物を２５℃で３０分間インキュベーションすることにより、抗ＤＮＰ固相とサンドイッチ複合体との間の結合を切断した。得られた生成物の上清を別のチューブに移した。また、残った抗ＤＮＰ抗体固相を、緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２ｍＬを用いて２回洗浄した。
（４）サンドイッチ複合体の捕捉
実施例１（３）で回収された上清にストレプトアビジン固相〔イムノケミカル製、商品名：Ｉｍｍｕｎｏ ｂｅａｄ ６．３５φ、ストレプトアビジンを固定化した固相〕１個を添加した。得られた混合物を２５℃で３０分間インキュベーションすることによってストレプトアビジン固相上にサンドイッチ複合体を捕捉した。つぎに、チューブ中の混合物を、緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２ｍＬを用いて３回洗浄することにより、ストレプトアビジン固相を回収した。
（５）蛍光強度の測定
新たなチューブ中の緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２００μＬに、実施例１（２）で回収された抗ＤＮＰ抗体固相および０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液２００μＬに添加し、反応溶液を得た。得られた反応溶液を３０℃で２時間インキュベーションし、反応生成物を得た。その後、励起波長：３６０ｎｍおよび蛍光波長：４５０ｎｍで、チューブ中の反応生成物の蛍光強度（以下、「蛍光強度Ａ１」という）を測定した。蛍光強度Ａ１の値から０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液のみを添加した際の蛍光強度の値を減じることにより、蛍光強度Ａ２を算出した。３回の測定結果に基づき、蛍光強度Ａ２の平均値（以下、「蛍光強度Ａ」という）を算出した。
新たなチューブ中の緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２００μＬに、実施例１（４）で回収されたストレプトアビジン固相および０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液２００μＬを添加し、反応溶液を得た。得られた反応溶液を３０℃で２０時間インキュベーションし、反応生成物を得た。その後、励起波長：３６０ｎｍおよび蛍光波長：４５０ｎｍで、チューブ中の反応生成物の蛍光強度（以下、「蛍光強度Ｂ１」という）を測定した。蛍光強度Ｂ１の値から０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液のみを添加した際の蛍光強度の値を減じることにより、蛍光強度Ｂ２を算出した。３回の測定結果に基づき、蛍光強度Ｂ２の平均値（以下、「蛍光強度Ｂ」という）を算出した。
新たなチューブ中の緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２００μＬに、実施例１（３）で回収された抗ＤＮＰ抗体固相および０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液２００μＬを添加し、反応溶液を得た。得られた反応溶液を３０℃で２時間インキュベーションし、反応生成物を得た。その後、励起波長：３６０ｎｍおよび蛍光波長：４５０ｎｍで、チューブ中の反応生成物の蛍光強度（以下、「蛍光強度Ｃ１」という）を測定した。蛍光強度Ｃ１の値から０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液のみを添加した際の値を減じることにより、蛍光強度Ｃ２を算出した。３回の測定結果に基づき、蛍光強度Ｃ２の平均値（以下、「蛍光強度Ｃ」という）を算出した。
被検物質が１０ｐｇの場合の蛍光強度Ａ、ＢおよびＣを用い、下記式（ＩＩ）：
にしたがい、複合体保持率を算出した。なお、式（ＩＩ）中、「インキュベーション時間Ｈ」は、反応溶液のインキュベーション時間である。
（比較例１）
捕捉抗体として、Ｆａｂ’−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、複合体保持率を算出した。なお、捕捉抗体は、以下のように作製した。慣用の手法に準じ、バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）社製のクローン名：Ｍａｂ１から得られた抗ＴＮＦαマウスＩｇＧをペプシンで断片化してＦ（ａｂ’）２断片を得た。得られたＦ（ａｂ’）２断片を還元してＦａｂ’−ＳＨを得た。また、ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰとＥＭＣＳとを反応させてＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰ−ｍａｌを得た。Ｆａｂ’−ＳＨとＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰ−ｍａｌとを反応させることによって捕捉抗体を得た。
（結果）
実施例１および比較例１の結果を図４に示す。図４中、レーン１は実施例１における複合体保持率、レーン２は比較例１における複合体保持率を示す。
図４に示された結果から、実施例１における複合体保持率は、５０％を超えていることがわかった。これに対し、比較例１における複合体保持率は、約３５％であることがわかった。これらの結果から、リンカーを含む捕捉抗体を用いることにより、複合体保持率を向上させ得ることがわかった。
（実施例２）
実施例１（１）〜（４）と同様の操作を行ない、ストレプトアビジン固相を回収した。つぎに、新たなチューブ中の緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２００μＬに、回収されたストレプトアビジン固相および０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液２００μＬを添加し、反応溶液を得た。得られた反応溶液を３０℃で２０時間インキュベーションし、反応生成物を得た。その後、励起波長：３６０ｎｍおよび蛍光波長：４５０ｎｍで、チューブ中の反応生成物の蛍光強度Ｂ１を測定した。蛍光強度Ｂ１の値から０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液のみ添加した際の蛍光強度の値を減じることにより、蛍光強度Ｂ２を算出した。３回の測定結果に基づき、蛍光強度Ｂ２の平均値として蛍光強度Ｂを算出した。
被検物質の存在下での蛍光強度Ｂと、被検物質の非存在下での蛍光強度Ｂとを用い、式（ＩＩＩ）：
にしたがって、ＩＣＴ−ＥＩＡのＳ／Ｎ比を算出した。なお、「被検物質の存在下での蛍光強度」として、「被検物質の存在下での蛍光強度Ｂ」を用いた。また、「被検物質の存在下での蛍光強度」として、「被検物質の非存在下での蛍光強度Ｂ」を用いた。
（比較例２）
捕捉抗体として、Ｆａｂ’−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰを用いたことを除き、実施例２と同様の操作を行ない、ＩＣＴ−ＥＩＡのＳ／Ｎ比を算出した。
（比較例３）
（１）サンドイッチ複合体の形成
実施例１（１）と同様の操作を行ない、サンドイッチ複合体を形成させた。
（２）サンドイッチ複合体の捕捉
実施例１（２）と同様の操作を行ない、抗ＤＮＰ抗体固相を回収した。
（３）蛍光強度の測定
新たなチューブ中の緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２００μＬに、比較例３（２）で回収された抗ＤＮＰ抗体固相および０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液２００μＬを添加し、反応溶液を得た。得られた反応溶液を３０℃で２時間インキュベーションし、反応生成物を得た。その後、励起波長：３６０ｎｍおよび蛍光波長：４５０ｎｍで、チューブ中の反応生成物の蛍光強度（以下、「蛍光強度Ａ１」という）を測定した。蛍光強度Ａ１の値から０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液のみ添加した際の値を減じることにより、蛍光強度Ａ２を算出した。３回の測定結果に基づき、蛍光強度Ａ２の平均値としての蛍光強度Ａを算出した。
被検物質の存在下での蛍光強度Ａと、被検物質の非存在下での蛍光強度Ａとを用い、式（ＩＩＩ）にしたがって、サンドイッチＥＬＩＳＡのＳ／Ｎ比を算出した。なお、「被検物質の存在下での蛍光強度」として、「被検物質の存在下での蛍光強度Ａ」を用いた。また、「被検物質の存在下での蛍光強度」として、「被検物質の非存在下での蛍光強度Ａ」を用いた。
（比較例４）
捕捉抗体として、Ｆａｂ’−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰを用いたことを除き、比較例３と同様の操作を行ない、サンドイッチＥＬＩＳＡのＳ／Ｎ比を算出した。
（結果）
実施例２および比較例２〜４の結果を図５に示す。図５中、レーン１は実施例２におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン２は比較例２におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン３は比較例３におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン４は比較例４におけるＳ／Ｎ比の相対値を示す。なお、図５において、実施例２および比較例２それぞれにおけるＳ／Ｎ比の相対値は、比較例２におけるＳ／Ｎ比の算出値を１００としたときの値である。また、図５において、比較例３および比較例４におけるＳ／Ｎ比の相対値は、比較例４におけるＳ／Ｎ比の算出値を１００としたときの値である。
図５に示された結果から、ＩＣＴ−ＥＩＡの場合、実施例２におけるＳ／Ｎ比の相対値は、２２０であった。したがって、リンカーを含む捕捉抗体を用いたＩＣＴ−ＥＩＡによれば、リンカーを含まない捕捉抗体を用いたＩＣＴ−ＥＩＡよりも、Ｓ／Ｎ比を向上させ得ることがわかった。これに対し、比較例３におけるＳ／Ｎ比の相対値は、１２０であった。したがって、リンカーを含む捕捉抗体を用いたＩＣＴ−ＥＩＡによれば、リンカーを含む捕捉抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡよりもＳ／Ｎ比を向上させ得ることがわかった。
（実施例３〜５および比較例５〜７）
表１に示される捕捉抗体、検出抗体および被検物質それぞれの量が、表１に示される量となるように、捕捉抗体含有溶液と、検出抗体含有溶液と、被検物質含有溶液とをチューブ内で混合した。被検物質として、インスリン〔アクリス・アンチボディーズ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ）製、商品名：Ｈｕｍａｎ Ｉｎｓｕｌｉｎ〕、ＩＬ−１２／２３ｐ４０〔Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社製、商品名：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｋｉｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ〕、およびＨＢｓＡｇ〔シスメックス（株）製、商品名：ＨＩＳＣＬ ＨＢｓＡｇキャリブレータ〕を用いた。なお、捕捉抗体は、以下のように作製した。表１に示されるクローンから得られたＩｇＧをペプシンで断片化してＦ（ａｂ’）２断片を得た。得られたＦ（ａｂ’）２断片を還元してＦａｂ’−ＳＨを得た。ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰとリンカー〔ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：ＳＭ（ＰＥＧ）８〕とを反応させて（ＰＥＧ）8−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰを得た。また、ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰとＥＭＣＳとを反応させてＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰ−ｍａｌを得た。
Ｆａｂ’−ＳＨと（ＰＥＧ）8−ＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰとを反応させることによって捕捉抗体を得た（実施例３〜５）。また、Ｆａｂ’−ＳＨとＢＳＡ−Ｂｉｏ−ＤＮＰ−ｍａｌとを反応させることによって捕捉抗体を得た（比較例５〜７）。
検出抗体は、以下のように作製した。慣用の手法に準じ、表２に示されるクローンから得られたＩｇＧをペプシンで断片化してF（ａｂ’）２断片を得た。得られたＦ（ａｂ’）２断片を還元してＦａｂ’−ＳＨを得た。ＧａｌにＥＭＣＳを反応させてＡＬＰ−ｍａｌを得た。Ｆａｂ’−ＳＨとＧａｌ−ｍａｌを反応させることによって検出抗体を得た。
得られた混合物を用いたことを除き、実施例１（１）と同様の操作を行ない、サンドイッチ複合体を形成させた。その後、実施例１（２）〜（４）と同様の操作を行ない、ストレプトアビジン固相を回収した。つぎに、新たなチューブ中の緩衝液Ｂ〔０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１質量％ＢＳＡおよび０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）〕２００μＬに、回収されたストレプトアビジン固相および０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液 ２００μＬを添加し、反応溶液を得た。得られた反応溶液を３０℃で２時間インキュベーションし、反応生成物を得た。その後、励起波長：３６０ｎｍおよび蛍光波長：４５０ｎｍで、チューブ中の反応生成物の蛍光強度Ｂ１を測定した。蛍光強度Ｂ１の値から０．２ｍＭ ４−ＭＵＧ水溶液のみ添加した際の値を減じることにより、蛍光強度Ｂ２を算出した。３回の測定結果に基づき、蛍光強度Ｂ２の平均値として蛍光強度Ｂを算出した。
被検物質の存在下での蛍光強度Ｂと、被検物質の非存在下での蛍光強度Ｂとを用い、式（ＩＩＩ）にしたがって、ＩＣＴ−ＥＩＡのＳ／Ｎ比を算出した。なお、「被検物質の存在下での蛍光強度」として、「被検物質の存在下での蛍光強度Ｂ」を用いた。また、「被検物質の存在下での蛍光強度」として、「被検物質の非存在下での蛍光強度Ｂ」を用いた。
（結果）
実施例３〜５および比較例５〜７の結果を図６に示す。図６中、レーン１は実施例３におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン２は比較例５におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン３は実施例４におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン４は比較例６におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン５は実施例５におけるＳ／Ｎ比の相対値、レーン６は比較例７におけるＳ／Ｎ比の相対値を示す。なお、図６において、実施例３および比較例５それぞれにおけるＳ／Ｎ比の相対値は、比較例５におけるＳ／Ｎ比の算出値を１００としたときの値である。図６において、実施例４および比較例６におけるＳ／Ｎ比の相対値は、比較例６におけるＳ／Ｎ比の算出値を１００としたときの値である。図６において、実施例５および比較例７におけるＳ／Ｎ比の相対値は、比較例７におけるＳ／Ｎ比の算出値を１００としたときの値である。
図６に示された結果から、被検物質がインスリンである場合、実施例３におけるＳ／Ｎ比の相対値は、１９０であった。また、被検物質がＩＬ−１２／２３ｐ４０である場合、実施例４におけるＳ／Ｎ比の相対値は、１８０であった。被検物質がＨＢｓＡｇである場合、実施例５におけるＳ／Ｎ比の相対値は、１６０であった。これらの結果から、リンカーを含む捕捉抗体によれば、リンカーを含まない捕捉抗体を用いた場合よりも、Ｓ／Ｎ比をより向上させ得ることがわかった。また、リンカーを含む捕捉抗体を用いたＩＣＴ−ＥＩＡによれば、種々の被検物質を高い感度で検出し得ることがわかった。
（実施例６〜８および比較例８）
捕捉抗体として、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：ＥＭＣＳ（比較例８）、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：ＳＭ（ＰＥＧ）２（実施例６）、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：ＳＭ（ＰＥＧ）８、（実施例７）またはライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製、商品名：ＳＭ（ＰＥＧ）２４（実施例８）を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、複合体保持率を算出した。
実施例６〜８および比較例８の結果を図７に示す。図７中、レーン１は比較例８における複合体保持率、レーン２は実施例６における複合体保持率、レーン３は実施例７における複合体保持率、レーン４は実施例８における複合体保持率を示す。
図７に示された結果から、実施例６〜８における複合体保持率は、比較例８における複合体保持率と比べて高かった。これらの結果から、オキシアルキレン基の付加モル数が異なる種々のＰＥＧリンカーを含む捕捉抗体によれば、複合体保持率を向上させ得ることがわかった。
以上説明したように、結合物質と、支持体と、結合物質と支持体との間を連結するリンカーとを含む捕捉体によれば、ＩＣＴ−ＥＩＡにおいて、免疫複合体（すなわち、サンドイッチ複合体）の解離を抑制し、Ｓ／Ｎ比を向上させることができることがわかった。
１ 第１の捕捉体
２ 第２の捕捉体
３ 第３の捕捉体
４ 第４の捕捉体
１１ 複合体
１２ サンドイッチ複合体
１３ 第１の複合体
１４ 第２の複合体
５１ 第２の結合物質
５２ 支持体
５３ リンカー
５４ 第１の反応基
５５ 第２の反応基
６１ 固相
６２ 第３の結合物質
７１ 固相
７２ 第４の結合物質
２００ 検出用試薬キット
２０１ 第１試薬容器
２０２ 第２試薬容器
２０３ 第３試薬容器

Claims (19)

  1. （Ａ）被検物質と、前記被検物質に特異的に結合する第１の捕捉体と、前記被検物質における前記第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に特異的に結合する第２の捕捉体と、前記第２の捕捉体に特異的に結合する第３の捕捉体とを含む第１の複合体を形成する工程、
    （Ｂ）前記第１の複合体から前記第１の捕捉体を含む一部を分離する工程、
    （Ｃ）前記第１の捕捉体を含む一部を第４の捕捉体で捕捉させ、第２の複合体を形成する工程、および
    （Ｄ）前記第２の複合体に含まれる被検物質を検出する工程
    を含み、
    前記第２の捕捉体が、前記被検物質と結合する結合物質と、支持体と、前記結合物質と前記支持体との間を連結するリンカーとを含み、
    前記リンカーがポリエチレングリコール鎖より成る、被検物質の検出方法。
  2. 前記工程（Ａ）と前記工程（Ｂ）との間に、遊離状態の第１の捕捉体および遊離状態の第２の捕捉体を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第４の捕捉体が、前記第１の捕捉体を含む一部と結合する結合物質と、前記結合物質を保持する固相とを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記支持体が、ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ポリペプチドが、アルブミンである、請求項４に記載の方法。
  6. 第１の捕捉体と前記被検物質とが抗原抗体反応を利用して複合体を形成し、前記第２の捕捉体と前記被検物質とが抗原抗体反応を利用して複合体を形成する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記第１の捕捉体が抗原抗体反応によって前記被検物質と結合する物質を含み、前記第２の捕捉体が抗原抗体反応によって前記被検物質と結合する物質を結合物質として含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第１の捕捉体が標識物質を有しており、
    前記工程（Ｄ）において、前記第２の複合体に含まれる前記標識物質に基づく信号を検出する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記第３の捕捉体が、前記第１の捕捉体を含む一部と結合する結合物質と、前記結合物質を保持する固相とを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. 前記工程（Ｂ）において、前記第１の複合体から少なくとも前記第３の捕捉体を分離するための分離試薬によって前記第１の複合体から少なくとも前記第３の捕捉体を分離する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記第１の複合体が、当該第１の複合体中の第１の捕捉体を除く部分にジスルフィド結合を有しており、前記分離試薬が、ジスルフィド結合を切断する試薬である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記第１の複合体が、当該第１の複合体中の第１の捕捉体を除く部分にジニトロフェニル基を介した結合を有しており、前記分離試薬が、ジニトロフェニルアミノ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記標識物質が、酵素、蛍光物質および放射性物質からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項８に記載の方法。
  14. 前記標識物質が、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼである、請求項８または１３に記載の方法。
  15. 前記信号が、発光、蛍光または発色である、請求項８、１３および１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記第１の捕捉体が抗体であり、前記第２の捕捉体は抗体である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記第１の捕捉体を含む一部が、第１の捕捉体と被検物質との複合体または第１の捕捉体と被検物質と第２の捕捉体との複合体である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
  18. 被検物質に結合可能な第１の捕捉体と、
    前記被検物質における前記第１の捕捉体の結合部位とは異なる部位に結合可能な第２の捕捉体と、
    前記第２の捕捉体に結合可能な第３の捕捉体と
    を含み、
    前記第２の捕捉体が、前記被検物質と結合する結合物質と、支持体と、前記結合物質と前記支持体との間を連結するリンカーとを含み、
    前記リンカーがポリエチレングリコール鎖より成る、被検物質の検出用試薬キット。
  19. 請求項１〜１７のいずれかに記載の被検物質の検出方法に用いるための被検物質の検出用試薬であって、
    被検物質に結合可能な第２の捕捉体を含み、
    前記第２の捕捉体が、前記被検物質と結合する結合物質と、支持体と、前記結合物質と前記支持体との間を連結するリンカーとを含み、
    前記リンカーがポリエチレングリコール鎖より成る、被検物質の検出用試薬。
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