JP5452217B2 - 試料中のc型肝炎ウイルスの有無を判定する方法、及びc型肝炎ウイルスの有無を判定するための試薬キット - Google Patents
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また、本発明は、アルカリ性物質を含む第1試薬と、酸性物質を含む第2試薬と、HCVコア蛋白に結合する標識抗体を含む第3試薬と、粒子を含む第4試薬と、HCVコア蛋白に結合する第1抗体を含む第5試薬と、第1抗体及び粒子と結合する第2抗体を含む第6試薬と、第1抗体と結合する物質が固定化された固相と、第1試薬及び第2試薬の少なくとも一つが、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも1つを含有する、C型肝炎ウイルスの有無を判定するための試薬キットを提供する。
が好ましい。
本例で使用する試薬は以下に示す。
カオトロピック剤として尿素を6M、界面活性剤としてBrij35(シグマ社製)を4%、及びアルカリ性物質として水酸化ナトリウムを0.45N含む水溶液を、第1処理試薬とした。
酸性物質としてクエン酸を0.15M含む、以下の第2処理試薬A〜Cの水溶液を調製した。
(第2処理試薬A)
クエン酸 0.15M
(第2処理試薬B)
クエン酸 0.15M
メルカプトエチルアミン 30mM
(第2処理試薬C)
クエン酸 0.15M
メルカプトエチルアミン 30mM
NaCl 0.6mM
ここで、第2処理試薬Bには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第2処理試薬Cには、還元剤としてメルカプトエチルアミン、及び無機塩類としてNaClが含まれている。
標識抗体として、ALPで標識された抗HCV抗体(ALP標識HCF3−807)を用いた。ここで、HCF3−807としては、NITE P−842で受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受託番号NITE P−842で、2009年11月25日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託された細胞である。具体的な標識抗体試薬の作製は、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕(同仁化学)を用いてマレイミド化したALPを混合して、反応させることで標識抗体を調製する。この方法で調製したALP標識抗体20μlを、980μlの希釈液(Tris−HCl(pH7.5) 25mM、NaCl 0.15M、BSA 0.25%、NaN3 0.02%、MgCl2 1mM、ZnCl2 0.1mM)で50倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
第1抗体として、ビオチン及びDNPで修飾された抗体(Biotin/DNP標識HCF4−104)を用いた。ここで、HCF4−104としては、NITE P−841で受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受託番号NITE P−841で、2009年11月25日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託された細胞である。具体的な第1抗体試薬の作製は、ビオチン化試薬(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagents:ピアス社)をBSAに添加して、次いでDNP標識試薬(DNP-X acid SE:ABD Bioquest社)を添加することでBiotin/DNP標識したBSAを調製する。次に、ペプシン消化、及び還元することでFab’に転換した該抗体と、架橋剤としてEMCS〔N-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimido〕(同仁化学)を用いてマレイミド化したBiotin/DNP標識したBSAを混合して、反応させることで第1抗体を調製する。この方法で調製した5 μlの第1抗体を、495 μlの希釈液で100倍に希釈し、第1抗体試薬とした。
第2抗体として抗DNP抗体(DNP−1753)を固定化した磁性粒子(Dynabeads M−270;インビトロジェン社製)を用いた。ここで、DNP−1753としては、NITE P−845で受託されているハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体を用いた。該ハイブリドーマは、受託番号NITE P−845で、2009年11月25日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに受託された細胞である。100μlの該磁性粒子を、900μlの希釈液で10倍に希釈し、磁性粒子試薬とした。
<第1処理工程>
40μlのHCV陰性血清と、60μlの第1処理試薬とを混合し、室温にて8分間インキュベーションすることで、第1処理工程を実施した。
<第2処理工程>
第1処理工程で得られた試料に、60μlの第2処理試薬A〜Cをそれぞれ添加し、室温にて5分間インキュベーションすることで、第1処理工程を実施した。なお、第2処理工程後の試料はpH7〜7.5であることをpH試験紙(Whatman社製)により確認した。
<形成工程>
第2処理工程で得られた160μlの試料と、75μlの標識抗体試薬とを、反応キュベット(HISCL用反応キュベット;シスメックス社製)で混合し、室温で10分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、50μlの第1抗体試薬を添加し、室温で10分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、80μlの磁性粒子試薬を添加し、室温で10分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
<分離工程>
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置(MINITUBE MAG SEPARATOR:SPHERO TECH社製)を用いて磁気分離を行った。
++:凝集が認められる。
+:やや凝集が認められる。
−:凝集が認められない。
第2処理工程において、第2処理試薬A〜Cを用いた試料における、反応キュベット内の凝集の評価を表1に示す。
還元剤を含有する第2処理試薬による凝集抑制が、還元剤の種類に依存するものであるかを調べるため、以下の第2処理試薬D〜Fを調製した。また、試料として使用する血清中のHCVの存在の有無が凝集に影響するかを調べるため、本例では、HCV陰性血清に代えて、HCV陽性血清を用いた。
酸性物質としてクエン酸を0.15M含む、以下の第2試薬D〜Fの水溶液を調製した。
(第2処理試薬D)
クエン酸 0.15M
メルカプトエチルアミン 45mM
(第2処理試薬E)
クエン酸 0.15M
ジチオトレイトール 45mM
(第2処理試薬F)
クエン酸 0.15M
システイン塩酸塩 90mM
ここで、第2処理試薬Dには、還元剤としてメルカプトエチルアミンが含まれている。また、第2処理試薬Eには、還元剤としてジチオトレイトールが含まれている。また、第2処理試薬Dには、還元剤としてシステイン塩酸塩が含まれている。
還元剤及び無機塩類を含有する第2処理試薬による凝集抑制が、無機塩類に依存するものであるかを調べるため、以下の第2処理試薬G〜Iを調製した。
酸性物質としてクエン酸を0.15M含む、以下の第2試薬D〜Fの水溶液を調製した。
(第2処理試薬G)
クエン酸 0.15M
塩化ナトリウム 0.6M
(第2処理試薬H)
クエン酸 0.15M
塩化カリウム 0.6M
(第2処理試薬I)
クエン酸 0.15M
硫酸ナトリウム 0.6M
ここで、第2処理試薬Gには、無機塩類として塩化ナトリウムが含まれている。また、第2処理試薬Hには、無機塩類として塩化カリウムが含まれている。さらにまた、第2処理試薬Iには、無機塩類として硫酸ナトリウムが含まれている。
HCV陽性患者から得られた、HCV陽性血清1〜42を用いて、以下の実験を行った。
実施例1と同様の試薬を使用した。
実施例1の第2処理試薬Cと同様の試薬を使用した。
実施例1と同様の操作により調製したALP標識HCF3−807 10μlを、590μlの標識抗体用希釈液(Tris−HCl(pH7.5) 25mM、NaCl 0.15M、BSA 0.25%、NaN3 0.02%、MgCl2 1mM、ZnCl2 0.1mM)で60倍に希釈し、標識抗体試薬とした。
実施例1と同様の操作により調製した5μlのBiotin/DNP標識HCF4−104を、495 μlの希釈液(Tris−HCl(pH7.5) 25mM、NaCl 0.15M、BSA 0.25%、NaN3 0.02%)で100倍に希釈し、第1抗体試薬とした。
実施例1と同様の操作により調製した抗DNP抗体(DNP−1753)を固定化した磁性粒子を使用した。
固相としては、ストレプトアビジンを固定化したプレート(ストレプトアビジンプレート)を用いた。ストレプトアビジンプレートは、C8 WHITE MAXISORPプレート(Nunc社製)に対して、ストレプトアビジン(和光純薬)10μg/mlの溶液100μlを室温で感作させ作製した。
第1抗体及び第2抗体の結合を解離する物質として、DNP−Lysを用いた。DNP−Lysine(東京化成社製)が0.2mMとなるように、希釈液(Tris−HCl(pH7.5) 25mM、NaCl 0.6M、BSA 0.25%、NaN3 0.02%)で希釈し、遊離剤とした。
40μlのHCV陽性血清と、60μlの第1処理試薬とを混合し、室温にて8分間インキュベーションすることで、第1処理工程を実施した。
<第2処理工程>
第1処理工程で得られた試料に、60μlの第2処理試薬を添加し、室温にて5分間インキュベーションすることで、第1処理工程を実施した。なお、第2処理工程後の試料はpH7〜7.5であることをpH試験紙(Whatman社製)により確認した。
<形成工程>
第2処理工程で得られた160μlの試料と、75μlの標識抗体試薬とを、反応キュベット(HISCL用反応キュベット;シスメックス社製)で混合し、室温で10分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、50μlの第1抗体試薬を添加し、室温で10分間インキュベートした。次に、反応キュベットに、80μlの磁性粒子試薬を添加し、室温で10分間インキュベートすることで、形成工程を実施した。
<分離工程>
形成工程で得られた試料を含む反応キュベットを、集磁装置(MINITUBE MAG SEPARATOR:SPHERO TECH社製)を用いて磁気分離を行い、上清を除去し、反応キュベットに380μlのwashing buffer(HISCL wash buffer;シスメックス社製)を添加し、再び磁気分離を行う洗浄を行った。上記洗浄を2回繰り返した後、さらに190μlのwashing bufferによる洗浄を1回行うことで、分離工程を実施した。
<転移工程>
分離工程で得られた試料を含む反応キュベットに、40μlの遊離剤を添加し、室温で4分間インキュベートした。次に、磁気分離を行い、上清を固相に移し、室温で20分間インキュベートした。次に、上清を除去し、300μlのwashing bufferを添加し、再び上清を除去する洗浄を行った。上記の洗浄は5回繰り返し行うことで、転移工程を実施した。
<測定工程>
転移工程で得られた試料を含む固相に、20μlのHISCL R4試薬(シスメックス社製)と20μlのHISCL R5試薬を添加し、42℃で4分間インキュベートした。次に、FLUOstar OPTIMA(BMG LABTECH社製)を用いて測光(3sec at gain 4095)を行い、発光強度(Counts)を測定することで測定工程を実施した。
<判定工程>
測定工程で得られた発光強度の値(測定値)に基づき、試料中に含まれるHCVコア蛋白の有無を判定した。具体的には、各試料の測定値が閾値以上の場合は、試料中にHCVが有ると判定し、測定値が閾値未満の場合は、試料中にHCVが無いと判定した。なお、103のHCV陰性血清に対し、上述の第1処理工程から測定工程までの操作を行って得られた測定値の平均値を算出し、平均値の標準偏差に15を掛けた値を平均値に加算した数値を閾値とした。ここで、測定値の平均値は2054.6、標準偏差は125.3、及び閾値は3934.4であった。
<従来技術によるHCVの有無の判定>
従来技術としてルミスポット栄研HCV抗原(栄研化学製・登録商標)を用いたHCVの有無の判定を行った。上記のHCV陽性血清1〜42を、ルミスポット栄研HCVコア抗原の添付文書に記載されたプロトコールに従って処理し、全自動化学発光酵素免疫測定装置LS−2000(栄研化学製・登録商標)を用いて、各HCV陽性血清中のHCV抗原を検出し、HCVの有無を判定した。なお、ルミスポット栄研HCV抗原によるHCV抗原の検出限界、すなわちHCVの有無の判定の閾値は0.4pg/mlである。
○:試料中にHCVは有ると判定
×:試料中にHCVは無いと判定
−:検出限界未満
Claims (17)
- C型肝炎ウイルスを含む疑いのある試料を、アルカリ性物質を含有する試薬で処理する第1処理工程と、
第1処理工程で得られた試料を、酸性物質を含有する試薬で処理する第2処理工程と、
HCVコア蛋白に結合する標識抗体及び第2処理工程で得られた試料に含まれるHCVコア蛋白を含む複合体を、粒子上に形成する工程と、
形成工程後に、試料中の複合体が形成された粒子を、試料中に含まれる他の成分から分離する工程と、
分離工程で得られた粒子上に形成された複合体を液相に分散する分散工程と、
前記分散された複合体を前記粒子とは異なる固相に転移する工程と、
転移工程で得られた前記粒子とは異なる固相に転移された複合体の標識を測定する工程と、
測定工程の結果に基づいて、試料中のC型肝炎ウイルスの有無を判定する工程と、を含み
第1処理工程及び第2処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも1つを含有する、試料中のC型肝炎ウイルスの有無を判定する方法。 - 前記分離工程の後かつ前記分散工程前に、前記粒子を洗浄液中に分散し、前記洗浄液と前記粒子とを分離することにより前記粒子を洗浄する工程をさらに含み、前記洗浄された粒子を前記分散工程において分散させる、請求項1に記載の方法。
- 第1処理工程で用いられる試薬が、非イオン性界面活性剤を含有する、請求項1または2に記載の方法。
- 非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤から選択される請求項3に記載の方法。
- 第1処理工程で用いられる試薬が、カオトロピック剤を含有する、請求項1〜4いずれかに記載の方法。
- カオトロピック剤が、尿素、グアニジン塩酸塩、サリチル酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素ナトリウム、アセトアミド及びホルムアミドから選択される少なくとも1つである請求項5に記載の方法。
- アルカリ性物質が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化マグネシウムから選択される少なくとも1つである請求項1〜6いずれかに記載の方法。
- 酸性物質が、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、リン酸、ギ酸、フマル酸、酒石酸、塩酸及び硫酸から選択される少なくとも1つである請求項1〜7いずれかに記載の方法。
- 粒子が、磁性粒子である請求項1〜8いずれかに記載の方法。
- 第1処理工程及び第2処理工程で用いられる試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、請求項1〜9いずれかに記載の方法。
- 無機塩類が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも1つである請求項10に記載の方法。
- 形成工程が、標識抗体、HCVコア蛋白、HCVコア蛋白に結合する第1抗体、及び第1抗体と結合する第2抗体を固定した粒子を接触させることで、標識抗体、HCVコア蛋白、第1抗体及び第2抗体からなる複合体を、粒子上に形成する、請求項1〜11いずれかに記載の方法。
- 固相が、第1抗体と結合する物質が固定化された固相であり、
測定工程が、粒子上に形成された複合体における、第1抗体及び第2抗体の結合を解離することで、遊離した標識抗体、HCVコア蛋白及び第1抗体からなる複合体を、粒子から固相に転移し、固相に転移された複合体の標識を測定する、請求項12に記載の方法。 - アルカリ性物質を含む第1試薬と、
酸性物質を含む第2試薬と、
HCVコア蛋白に結合する標識抗体を含む第3試薬と、
粒子を含む第4試薬と、
HCVコア蛋白に結合する第1抗体を含む第5試薬と、
第1抗体及び粒子と結合する第2抗体を含む第6試薬と、
第1抗体と結合する物質が固定化された固相と、
第1試薬及び第2試薬の少なくとも一つが、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、システイン、ジチオエリトリトール、水素化ホウ素ナトリウム及びホスフィンから選択される少なくとも1つを含有する、C型肝炎ウイルスの有無を判定するための試薬キット。 - 第1試薬及び第2試薬の少なくとも一つが、無機塩類を含有する、請求項14に記載の試薬キット。
- 第1試薬が、非イオン性界面活性剤を含有する、請求項14または15に記載の試薬キット。
- 第1試薬が、カオトロピック剤を含有する、請求項14〜16に記載の試薬キット。
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