JPWO2006033413A1 - ペプチドの定量方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ホモジニアスオープンサンドイッチ法は、B/F分離(抗原と結合した抗体と、同一液相中の抗原に結合していない抗体とを分離すること)を行わないため、洗浄操作が不要となり、測定時間が短縮される、自動測定装置の簡素化などのメリットを有する(「アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)」、(米国)、2002年、第74巻、第11号、p.2500−2504参照)。
[1]重鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[2]軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[3]重鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
や、(15)モノクローナル抗体が、以下の[1]〜[3]のいずれかのモノクローナル抗体である上記(14)に記載の方法
[1]配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[2]配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[3]配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
や、(16)測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記(1)〜(9)のいずれか1項に記載の方法や、(17)測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記(1)〜(9)のいずれか1項に記載の方法や、(18)測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつVLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記(1)〜(9)のいずれか1項に記載の方法や、(19)配列番号5または7のアミノ酸配列を含むポリペプチドや、(20)配列番号5または7のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAや、(21)配列番号4または6の塩基配列を含む上記(20)に記載のDNAや、(22)上記(20)または(21)に記載のDNAをベクターに挿入して得られる組換えベクターや、(23)上記(22)に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体や、(24)上記(23)に記載の形質転換体を培養液中に培養して、配列番号5または7のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成・蓄積させ、培養液から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法に関する。
[1]重鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[2]軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[3]重鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
や、(39)モノクローナル抗体が、以下の[1]〜[3]のいずれかのモノクローナル抗体である上記(38)に記載の試薬
[1]配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[2]配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[3]配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
や、(40)測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記(25)〜(33)のいずれか1項に記載の試薬や、(41)測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記(25)〜(33)のいずれか1項に記載の試薬や、(42)測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつVLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記(25)〜(33)のいずれか1項に記載の試薬に関する。
本発明のペプチドの非競合的な検出または定量方法を完成させるためには、測定すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体を作製することが必要である。エピトープとなる連続する配列は、好ましくは6以上19以下のアミノ酸の配列である。
本発明に用いる測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体は、例えば以下のようにしてハイブリドーマより産生される抗体として作製することができる。
本発明に用いる測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体は、例えば、測定すべきペプチドを直接免疫原として用いて調製することができるが、測定対象とすべきペプチドの部分配列、好ましくは測定すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する5以上30以下、より好ましくは5以上20以下、特に好ましくは6以上19以下のアミノ酸の配列を含むペプチドを免疫原として調製される。また、測定すべきペプチドのアミノ酸配列のN末端またはC末端の領域の、連続する6以上、好ましくは6以上19以下の配列を含むペプチドを免疫原とすることにより、調製されたモノクローナル抗体が、測定すべきペプチドと特異的に結合する可能性を高くすることができる。
動物、例えば3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記(1)に記載の方法で調製した免疫原を投与し免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫原となるペプチドとキャリア蛋白質のコンジュゲート蛋白質の1〜50μg/mLの濃度の溶液を96ウェルのEIA用プレートに50〜100μL/ウェルずつ分注し、4℃で一晩ないしは室温で30分以上放置してプレートにコートする。次いで、1%BSAを含むPBS溶液(以下、BSA−PBSと記す)などを100〜200μL/ウェルずつ分注し、室温1〜2時間または、4℃で一晩以上放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基をブロッキングする。その後、BSA−PBSを捨て、PBSでよく洗浄した後、第一抗体として被免疫動物血清、抗ペプチドモノクローナル抗体のハイブリドーマ培養上清もしくは精製抗体1〜10μg/mLを50〜100μL/ウェルに分注し、4℃で一晩ないしは室温で30分以上放置する。PBSまたはツイーン(Tween)20などの界面活性剤を含むPBS(以下、Tween−PBSと記す)で、よく洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した抗イムノグロブリン抗体1〜50μg/mLを50〜100μL/ウェルずつ分注し、室温で1〜2時間または、4℃で一晩以上放置する。Tween−PBSでよく洗浄した後、第二抗体の標識酵素により発色する基質を加えて反応を行ない、プレートリーダーにより吸光度を測定して発色量を測定し、抗体量の指標とする。
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。例えば、8−アザグアニン耐性マウス(BALB/c由来)骨髄腫細胞株P3−X63−Ag8−U1(Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1-7, 1978)、NS1/1−Ag4−1(Eur. J. Immunol., 6, 511-519, 1976)、SP2/O−Ag14(Nature, 276, 269-270, 1978)、P3−X63−Ag8.653(J.Immunol., 123, 1548-1550, 1979)、P3−X63−Ag8(Nature, 256, 495-497, 1975)などが用いられる。これらの細胞株は、8−アザグアニン培地〔正常培地(RPMI−1640培地に1.5mmol/Lグルタミン、50μmol/L2−メルカプトエタノール、10μg/mLゲンタマイシンおよびウシ胎児血清(FCS)を加えた培地)に、15μg/mL8−アザグアニンを加えた培地〕などで継代するが、細胞融合の数日前に正常培地に継代し、融合当日7×106個以上の細胞数を確保するのが好ましい。
上記(2)で免疫した抗体産生細胞と上記(4)で得られた骨髄腫細胞を、PBS(phosphate buffered saline、1.83g/Lリン酸二ナトリウム、0.21g/Lリン酸一カリウム、7.65g/L塩化ナトリウム、pH7.2)などでよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜10:1になるよう混合し、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、ポリエチレングリコール−1000(以下、PEG−1000と略す)、MEMまたはRPMI−1640培地、およびジメチルスルホキシドの混液を108個の抗体産生細胞当たり0.2〜1mLを加え、MEMまたはRPMI−1640培地を徐々に数回に分けて全量がおよそ50mLになるように滴下する。遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、HAT培地(正常培地に100μmmol/Lヒポキサンチン、15μmol/Lチミジンおよび0.4μmol/Lアミノプテリンを加えた培地)およそ100mL中に、メスピペットによる吐出吸引でゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を96ウェル培養用プレートにおよそ100μL/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で7〜14日間程度培養する。
上記(3)の酵素免疫測定法において、第1抗体を25〜50μL/ウェルで分注する前あるいは同時に、抗原ペプチド5〜50μg/mLを25〜50μL/ウェルで分注し、混和したものを4℃で一晩ないしは室温で30分以上放置する。以降の操作は前述(3)の酵素免疫測定法と同一である。陰性対照ウェルとしては、ペプチドをコンジュゲートしたキャリア蛋白質をコートしないウェルを作製し、陽性対照ウェルとして、抗原ペプチド溶液ではなく、抗原ペプチドを含まない溶液を分注したウェルを作製する。ハイブリドーマの培養上清を測定試料としたとき、陰性対照ウェルで発色がみられず、陽性対照ウェルで発色がみられ、しかも抗原ペプチドを分注したウェルでは陽性対照ウェルの発色が阻害されるような培養上清には、抗原ペプチドに特異的に結合する抗体が含まれることが確認できる。
0.5mLのプリスタン(pristane、2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン)を腹腔内に投与し、2週間飼育した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、(5)で得られた抗ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射する。10〜21日程度でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、40〜50%硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、DEAE−セファロースカラム、プロテインA−カラム、ゲル濾過カラム等による精製を行なう。
本発明においてVHポリペプチドとは、抗体のVH領域を含み、VL領域を含まないポリペプチドを意味し、VLポリペプチドとは抗体のVL領域を含み、VH領域を含まないポリペプチドを意味する。
PCRの方法としては、NASBA法(カイノス社)、TMA法(バイエルメディカル社)、SDA(strand displacement amplification)法(ベクトン・ディキンソン社)、ICAN法(宝酒造社)、LAMP(Loop-mediated Isothermal Amplification)法(栄研化学社)などの等温PCRと呼ばれる一連の方法あるいはこれらの方法の変法を用いてもよい。以下に、組換えベクターと形質転換体の作製および形質転換体の培養、ポリペプチドの単離について記載する。
発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、宿主細胞中で可変領域ポリペプチドをコードするDNAからmRNAを転写できるプロモーターを含有しているものが用いられる。
可変領域ポリペプチドをコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、可変領域ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より可変領域ポリペプチドを採取することにより、可変領域ポリペプチドを製造することができる。
上記形質転換体の培養物中に蓄積した可変領域ポリペプチドを単離精製するには、以下のような通常の蛋白質の単離精製法を用いればよい。
本発明のペプチドの検出または定量方法や、ペプチドの検出または定量用のキットは、前記のとおり、測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体のVHポリペプチドと、該モノクローナル抗体のVLポリペプチドを用いる測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法や、上記VHポリペプチドとVLポリペプチドを備えた測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量用のキットであれば特に制限はないが、例えばオープンサンドイッチELISA法、2種類の標識物質を用いるホモジニアスオープンサンドイッチ法などの方法や、そのためのキットがあげられる。
本発明のペプチドの検出または定量方法として、測定すべきペプチドを固相へ捕捉するためにVHポリペプチドまたはVLポリペプチドのいずれか一方(以下、第1の可変領域ポリペプチドという)を固相へ固定化し、他方(以下、第2の可変領域ポリペプチドという)を測定すべきペプチドを検出するために標識することを特徴とする方法があげられる。この方法では、測定すべきペプチドを、固相に固定化された第1の可変領域ポリペプチド(固定化ポリペプチド)および標識された第2の可変領域ポリペプチド(標識化ポリペプチド)に接触させて結合させ、測定すべきペプチドを介して固定化ポリペプチドと結合した標識化ポリペプチドの標識物質を検出または定量することにより、測定すべきペプチドを検出または定量することが可能である。固定化ポリペプチドへの測定すべきペプチドの接触と、標識化ポリペプチドの測定すべきペプチドへの接触は同時ではなく順次行なうこともできる。また、本発明のペプチドの検出または定量方法として、第1の可変領域ポリペプチドと標識された第2の可変領域ポリペプチド(標識化ポリペプチド)を、固相の存在下で測定すべきペプチドと接触させることによって、固相、第1の可変領域ポリペプチド、標識化ポリペプチドおよび測定すべきペプチドからなる複合体を形成せしめ、同時に第1の可変領域ポリペプチドを同相に固相化させ、固相に結合した、該複合体の標識物質を検出または定量することにより、測定すべきペプチドの検出または定量をする方法もあげられる。第1の可変領域ポリペプチドを固相に固定化させる方法としては、例えば、第1の可変領域ポリペプチドとして、タグペプチドが付加した可変領域ポリペプチドを用い、固相として、該タグペプチドに特異的に結合する抗体を固定化した固相を用いる方法や、第1の可変領域ポリペプチドとして、マルトース結合蛋白質(MBP)が付加した可変領域ポリペプチド(MBPと融合させた可変領域ポリペプチド)を用いて固定化した固相を用いる方法があげられる。
標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、繊維状ファージ、タグ配列を含むポリペプチドなどがあげられる。
抗ペプチドモノクローナル抗体由来可変領域ポリペプチドを固定化するための担体としては、抗体を結合させて保持できるものであればいかなるものも包含されるが、各種高分子素材を用途に合うように成形した素材が用いられる。
上記の可変領域ポリペプチドを固定化させた固相は、ブロッキングにより、担体上に残存する官能基を保護する。免疫学的測定法のブロッキングに用いられる物質としては、通常蛋白質、界面活性剤およびブロックエース(大日本製薬株式会社製)等の市販のブロッキング試薬などが用いられる。ブロッキングに用いることができる蛋白質としては、正常動物血清、ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶液などが好適であるが、これには限らない。正常動物血清に用いられる動物としては、ヒトまたはマウス以外ではすべての動物種が使用できるが、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタなどが好適である。血清濃度は0.1〜20%の範囲で任意に選ぶことが可能であるが、1〜5%が最も好適である。ウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶液などの濃度は0.1〜20%の範囲で任意に選ぶことが可能であるが、1〜5%が最も好適である。ブロッキングに用いることができる界面活性剤の種類としては、トライトンX−100、ツイーン20などを用いることができる。ブロッキング温度は4℃〜37℃の範囲で自由に設定できる。ブロッキング時間は反応温度にしたがって適切に設定可能であるが、室温の場合には10分以上1時間以内などの条件が好ましい。
また、本発明の検出または定量方法はすなわち、抗原ペプチドが存在するときに抗原ペプチドを介してVHポリペプチドとVLポリペプチドが会合することを特徴とする測定系であるが、該測定系をより性能のよいものにするためには、抗原ペプチドが存在しないときに、抗原ペプチドを介さずVHポリペプチドとVLポリペプチドが会合することはバックグランドの値を上昇することになるため避けるような工夫が施されることがより好ましい。このような工夫としては、例えば抗原ペプチドを介さずVHポリペプチドとVLポリペプチドが会合することを妨げる凝集阻害剤の添加が考えられる。凝集阻害剤としては例えば、界面活性剤があげられる。本発明に好適な界面活性剤としては、蛋白質の溶解性を増す化合物であれば何でもよく、例えば、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型の陰イオン界面活性剤、あるいはエステル型、エーテル型、エステルエーテル型、アルカノールアミド型の非イオン界面活性剤、あるいはアルキルアミン塩型、第4級アンモニウム塩型の陽イオン界面活性剤、カルボキシベタイン型、2−アルキルイミダゾリンの誘導型、グリシン型の両性界面活性剤があげられる。
本発明のオープンサンドイッチ法はモノクローナル抗体を得るために抗原として用いられたペプチドを検出、定量するばかりでなく、該ペプチドを一部に有する分子であればどのようなものも検出、定量するために適した方法である。該分子としては、該ペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、糖、脂質、核酸、有機化合物、無機化合物、高分子ポリマーなど天然に存在、または人工的に創製可能な物質であれば何であってもよい。
物理学的結合としては、例えば物理吸着、静電的結合、水素結合、疎水結合などがあげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合などがあげられる。
本発明のホモジニアスオープンサンドイッチ法としては、VHポリペプチドに標識物質1を、VLポリペプチドに標識物質1とは異なる標識物質2をそれぞれ結合し、標識物質1と標識物質2の相互作用の変化量を検出する方法によっても可能である。該標識物質の好適な態様としては例えば、蛍光物質があげられる。励起光を受光することによって生じた蛍光エネルギーが、近接する異なる蛍光物質の蛍光エネルギーとして利用される。この現象は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET:fluorescence resonance energy transfer)と呼ばれ、2種類の蛍光物質が1〜10nmまで近接することにより起こる現象である。FRETが起きる蛍光物質の組み合わせとしては、一方の蛍光波長のスペクトルが、他方の励起波長のスペクトルと重なりがあることが必要である。物質としては、低分子有機蛍光色素、無機化合物、ポリペプチドなどがあげられる。低分子有機蛍光色素としては、例えばCy3とCy5の組み合わせがあげられる。無機化合物としては例えばquantum dot(Science, 281,2016-2018, 1998)があげられる。ポリペプチドとしては、蛍光蛋白質があげられ、例えばクラゲの発光蛋白質あるいはこれらの改変蛋白質があげられる。
(1)免疫原の調製
ヒトオステオカルシンの部分ペプチドとして、配列番号1および2それぞれのアミノ酸配列からなるペプチド(以下、それぞれOC−1ペプチド、OC−2ペプチドとする。また、両者をまとめてOCペプチドと表記する)を株式会社ペプチド研究所にて委託合成をした。配列番号1は、ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列(配列番号3)のC末端部分38〜49位のアミノ酸12残基からなる配列、配列番号2は、ヒトオステオカルシンのアミノ酸配列のN末端部分1〜13位の配列のC末端にシステインを付加したアミノ酸14残基からなる配列にそれぞれ相当する。OC−1ペプチドおよびOC−2ペプチドをそれぞれ以下の方法でKLHにコンジュゲートした。OCペプチド4.8mgを1mlの0.1mol/Lリン酸バッファー(pH7.0)に溶解し、ここに0.1mol/Lリン酸バッファー(pH 7.0)にKLHを20mg/mLになるよう溶解した溶解液を1mL添加し、攪拌した。60mgのEDCと、11.5mg/mLになるようNHSをN,N−ジメチルフォルムアミドに溶解した液150μLを順次添加し、室温で8時間転倒混和した後、PBSで、4℃で3回透析した。得られたOCペプチドコンジュゲートKLHの濃度は、280nmの吸光度で測定した。
実施例1(1)で得られた2種類のOCペプチドコンジュゲートKLHそれぞれをPBS 1mLに溶解し、フロイントの完全アジュバンド〔MPバイオメディカルズ(MP Biomedicals)社製〕とともに、1匹あたり0.4mgのOCペプチドコンジュゲートKLHを5週令雌マウス(Balb/c)の腹腔内に投与した。3週間後に最終免疫として再び、フロイントの不完全アジュバンド(MPバイオメディカルズ社製)とともに1匹あたり0.5mgのOCペプチドコンジュゲートKLHを腹腔内に投与した。上記の免疫マウスより採血し、その血清抗体価を以下(3)に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫の3日後に脾臓を摘出した。
アッセイ用の抗原として、実施例1(1)のOCペプチドコンジュゲートKLHの作製と同様な方法で、BSAをKLHの代わりに用いて、OCペプチドコンジュゲートBSAを作製した。96ウェルの酵素免疫測定法(EIA)用プレートに、PBSに溶解した10μg/mLのOCペプチドコンジュゲートBSAを50μL/ウェルずつ分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。洗浄後、1%のBSA含有PBSを100μL/ウェルずつ加え、室温1時間反応させた。BSA含有PBSを捨て、0.1%のBSA含有PBSにて適宜希釈した被免疫マウス抗血清を50μL/ウェルずつ分注し室温で1時間反応させた。0.1%のツイーン20含有PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(ダコ社)を50μL/ウェルずつ加えて室温で1時間反応させた。ツイーン20含有PBSで洗浄後、過酸化水素含有o−フェニレンジアミン基質液(シグマ社製)を50μL/ウェルずつ加えて発色させ、次いで2.5mol/L硫酸を50μL/ウェルずつ加えて反応を停止させた。492nmの吸光度(以下、OD492などと表記する)をプレートリーダー(MTP−120;コロナ電機社製)にて測定した。対照波長は660nmとした。
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3−X63−Ag8−U1(Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1-7, 1978)を正常培地で培養し、細胞融合時に7×106以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。
実施例1(2)で得られたマウス脾細胞と(4)で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、1200rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、37℃で、PEG−1000 2g、MEM 2mLおよびジメチルスルホキシド 0.7mLの混液を1×108個マウス脾細胞当たり0.2〜1mLを加え、1〜2分間毎にMEM 1〜2mLを数回加えた後、MEMを加えて全量が50mLになるようにした。900rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をHAT培地100mL中に懸濁した。
96ウェルのEIA用プレートに、PBSに溶解した10μg/mLのOCペプチドコンジュゲートBSAを50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。陰性対照ウェルとして、OCペプチドコンジュゲートBSAを吸着させないウェルを作製した。洗浄後、1%のBSA含有PBSを100μL/ウェルで加え、室温1時間反応させた。BSA含有PBSを捨て、0.1%BSA含有PBSにて適宜希釈したOCペプチド含有液(25μL/ウェル)と、0.1%BSA含有PBSにて適宜希釈した抗OCペプチドモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体(50μL/ウェル)を分注し室温で1時間反応させた。陽性対照ウェルとして、OCペプチドを含有しない0.1%BSA含有PBS(25μL/ウェル)と、0.1%BSA含有PBSにて適宜希釈した抗OCペプチドモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体(50μL/ウェル)を分注し室温で1時間反応させた。Tween−20含有PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスイムノグロブリン(ダコ社)を50μL/ウェルで加えて室温、1時間反応させ、Tween−20含有PBSで洗浄後過酸化水素含有o−フェニレンジアミン基質液(シグマ社)を50μL/ウェルで加えて発色させ、次いで2.5mol/L硫酸を50μL/ウェルで加えて反応を停止させた。492nmの吸光度(以下、OD492などと表記する)をプレートリーダー(MTP−120;コロナ電機社)にて測定した。対照波長は660nmとした。
プリスタン処理した8週令ヌード雌マウス(Balb/c)に実施例1(5)で得られたハイブリドーマ株を5〜20×106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取(1〜8mL/匹)し、遠心分離(3000rpm、5分)して固形分を除去した。得られた腹水は、カプリル酸沈殿法[Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,(1988)]により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
(1)KTM−219のVHポリペプチドおよびVLポリペプチドをそれぞれコードするDNAの調製
KTM−219のVHポリペプチドおよびVLポリペプチドをそれぞれコードするDNAを、以下のようにして調製した。まず、KTM−219を産生するハイブリドーマKTM−219株より常法に基づき、RNAを抽出精製した。このRNAを鋳型とし、下記のプライマーを用いて、キアゲン・ワンステップRT−PCRキット(QIAGEN OneStep RT-PCR Kit)により、添付のプロトコルに従って逆転写PCR(RT−PCR)を行った。
フォワードプライマーとしてマウスイムノグロブリン重鎖のフレームワーク1(FR1)領域に対する縮重プライマーMH1Back(配列番号14)およびMH2Back(配列番号15)の等量混合物を、リバースプライマーとしてマウスIgG重鎖定常領域に対するプライマーであるマウスIgG VH3’−2(配列番号16、Novagen-Merck社製、マウスIgプライマーセット)を用いて、マウスIgGの重鎖定常領域の一部を含むVHポリペプチドをコードするDNAを増幅した。またフォワードプライマーとしてマウスイムノグロブリンκ鎖のFR1領域に対する縮重プライマーであるVk4BkFL2(配列番号17)を、リバースプライマーとしてマウスイムノグロブリンκ鎖定常領域に対するプライマーであるMKCFor(配列番号18)を用いて、マウスイムノグロブリンκ鎖定常領域の一部を含むVLポリペプチドをコードするDNAを増幅した。プライマーは、それぞれの配列番号の配列からなるDNAを化学合成したものを用いた。なおRT−PCRの反応条件は50℃で30分間の逆転写反応の後、94℃で15分間の変性反応を行い、その後94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で1分間を1サイクルとする反応を30サイクル行い、最後に72℃で6分間の伸張反応を行った。そして、それぞれのRT−PCRで増幅された約450bpのcDNA断片を1.5%アガロースゲル電気泳動で分離し、ウィザードSVゲル・アンドPCRクリーンアップ・システム(Wizard SV gel and PCR Clean-Up System、プロメガ社製)を用いて精製した。
KTM−219のVHポリペプチドおよびVLポリペプチドをM13ファージを利用して発現させるため、以下のようにしてspFvファージミドベクターpKST2(Anal. Chem., 75, 4057-4064, 2003)にサブクローニングした。pKST2は、プロモーターの下流に、リボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする配列、SfiIサイト、NotIサイト、His−mycタグをコードする配列、アンバー終止コドン、M13ファージコート蛋白質p7をコードする配列を有する。pKST2のsfiIとNotI間にVHポリペプチドをコードする配列、M13ファージコート蛋白質p9をコードする配列、リボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする配列、VLポリペプチドをコードする配列を挿入することにより、プロモーターの下流に(A)リボゾーム結合配列−シグナルペプチド/VHポリペプチド/p9融合蛋白質をコードする配列および(B)リボゾーム結合配列−シグナルペプチド/VLポリペプチド/His−mycタグをコードする配列−アンバー終止コドン−p7をコードする配列を有するファージミドが構築できる。得られたファージミドでE.coliを形質転換した後、ヘルパーファージ感染により、ファージ粒子を得ることができる。E.coliがアンバーサプレッサー株の場合、アンバー終止コドンが一定の割合でグルタミンに翻訳されるため、VHポリペプチド/p9の融合蛋白質と共に、VLポリペプチド/His−mycタグ/p7の融合蛋白質がファージ粒子上に提示される。一方、非サプレッサー株の場合は、VHポリペプチド/p9の融合蛋白質はファージ粒子上に提示されるが、VLポリペプチド/His−mycタグはp7との融合蛋白質にはならないため、ファージ粒子上には提示されず、培地中に分泌される。
前項で得たspFvファージミドベクターpKST2/KTM219を、アンバーサプレッサー株であるE. coliTG1株(supE, hsdΔ5, thi, Δ(lac-proAB),/F’[traD36, proAB+, lacIq, lacZΔM15])あるいは非サプレッサー株であるHB2151株(ara, Δ(lac-proAB), thi/F'proAB+, lacIq, lacZΔM15)(アマシャム・バイオサイエンシズ社)に形質転換した。形質転換細胞を2×TYAG(16g/Lトリプトン、10g/Lイーストエキス、5g/L塩化ナトリウム、100μg/mLアンピシリン、1%グルコース、pH7.0)アガープレート(1.5%寒天を含む2×TYAG)で37℃で一晩培養したのち、シングルコロニーのいくつかをそれぞれ4mLの2×TYAG培地で37℃で一晩培養した。この一部を新鮮な2×TYAG培地に移して、37℃で600nmの吸光度(OD600)が約0.5になるまで振盪培養した。ここでヘルパーファージM13KO7をm.o.i (multiplicity of infection)が20になるように加え、37℃で30分間静置した。その後菌体を2,000gで15分遠心して回収し、2×TYAK培地(16g/Lトリプトン、10g/Lイーストエキス、5g/L塩化ナトリウム、100μg/mLアンピシリン、50μg/mLカナマイシン)に再懸濁して250rpmで30℃、16時間振盪培養した。
(1)VHポリペプチドとVLポリペプチドの結合性の確認
実施例2(3)で、E. coli TG1株を宿主として得られたVHポリペプチドおよびVLポリペプチドを提示するM13ファージ(以下、VH/VL提示ファージと表記する)を用いて、VHポリペプチドおよびVLポリペプチドのヒトオステオカルシンに対する特異的な結合性が保持されていることを、以下のELISAで確認した。
実施例2(3)で、pKST2/KTM219で形質添加したE. coli HB2151株から得られた、KTM−219のVHポリペプチドを提示するM13ファージ、すなわちM13ファージで標識したVHポリペプチドおよびHis−mycタグが付加したKTM−219のVLポリペプチド含む培養上清を用いて、ヒトオステオカルシンおよびOC−1ペプチドのオープンサンドイッチELISAによる測定を、以下のようにして行った。
ファルコン3914マイクロプレートに1ウェルあたり100μLのPBSで希釈した2μg/mLヒトオステオカルシンを加え、37℃で1時間おいた後、25%BPBSで37℃1時間ブロッキングし、PBSTにより1回洗浄した。測定試料として10%BPBSで段階希釈したOC−1ペプチドと、0.5μg/mLのKTM−219溶液を混合させた後,混合液各100μLをマイクロプレートに2ウェルずつアプライし,室温で2時間反応させた。PBSTにより3回洗浄し,10%BPBS中0.2μg/mLに希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体100μLを加え25℃90分間反応させた。6回のPBSTによる洗浄の後、実施例3の(1)と同様に酵素反応と吸光度測定を行った。実験結果を図5に示した。図5の実験において測定試料中にOC−1ペプチドが存在しないときの吸光度の値はそれぞれ2.28であった。図5よりOC−1ぺプチドの測定範囲は5〜2000ng/mLであった。
実施例1で得られた、エピトープの異なるヒトオステオカルシンと特異的に反応するモノクローナル抗体KTM−219およびKTM−223を利用して、ヒトオステオカルシンのサンドイッチELISAを行い、オープンサンドイッチELISAと比較した。
VLポリペプチドとして、VLにMBPが付加したMBP−VL融合蛋白質を用いることにより、VLポリペプチドを抗Hisタグ抗体を介さずに、物理的に直接プレートに固定化できると考えられる。また、標識したVHポリペプチドとして、アルカリフォスファターゼと融合させたVH−アルカリフォスファターゼ融合蛋白質(以下、VH−AP融合蛋白質と省略する)を用いることにより、VHポリペプチドと結合する酵素標識した抗M13抗体の反応が不要となると考えられる。したがって、両者を用いることでオープンサンドイッチ法の工程を簡略化することができると考えられる。このようなオープンサンドイッチ法によるオステオカルシンの測定を目的として、以下のように、VH−AP融合蛋白質およびMBP−VL融合蛋白質の調製を行った。
以下のようにして、VH−AP融合蛋白質発現プラスミドpET−VH219−APを作製した。実施例3で作製したspFvファージミドベクターpKST2/KTM219を鋳型にして、プライマーMH2Back−EcoRV(配列番号26)およびVH1For2−HindIII(配列番号27)を用いたPCRにより、KTM−219のVHポリペプチドをコードするDNAを増幅した。増幅断片をEcoRVとHindIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離後、精製し、同じくEcoRVとHindIIIで切断したプラスミドpPhoA(J. Immunol. Methods, 224, 171-84, 1999)の断片とライゲーションした。pPhoAは、E. coliアルカリフォスファターゼをコードする1450bp断片をベクターpET−20b(ノバジェン、EMDバイオサイエンシズ社製)のNotIサイトに挿入して作製されたプラスミドである。ライゲーション産物をE. coli XL10−Gold(ストラタジーン社製)に形質転換し、LBAG寒天培地(10g/Lトリプトン、5g/Lイーストエキス、10g/L塩化ナトリウム、10g/Lグルコース、100μg/mLアンピシリン、pH7.2、1.5%寒天)にて37℃一晩培養した。得られた数個のコロニーよりプラスミドを調製し,正しい配列を持つものを選択して、pET−VH219−APと名付けた。pET−VH219−APはプロモーターの下流に図8に示す構造を有し、宿主のペリプラズムに、KTM−219のVHポリペプチド/アルカリフォスファターゼ/HisタグからなるVH−AP融合蛋白質を発現するためのプラスミドである。
以下のようにして、MBP−VL融合蛋白質発現プラスミドpMAL−VL219を作製した。spFvファージミドベクターpKST2/KTM219を鋳型にして、プライマーMkBackES(配列番号28)およびMycForHd(配列番号29)を用いたPCRにより、KTM−219のVLポリペプチドおよびHis−MycタグをコードするDNAを増幅した。増幅断片をEcoRIとHindIIIで切断し、アガロースゲル電気泳動で分離後、精製し、同じくEcoRIとHindIIIで切断したMBP融合蛋白質発現プラスミドpMAL−p2(ニュー・イングランド・バイオラブズ社製)の断片とライゲーションした。ライゲーション産物をE. coli XL10−Goldに形質転換し、LBAG寒天培地にて37℃一晩培養した。得られた数個のコロニーよりプラスミドを調製し,正しい配列を持つものを選択して、pMAL−VL219と名付けた。pMAL−VL219はプロモーターの下流に図9に示す構造を有し、宿主のペリプラズムにMBP/KTM−219のVLポリペプチド/His−MycタグからなるMBP−VL融合蛋白質を発現するためのプラスミドである。
このプラスミドpMAL−VL219でE. coli TG1株を形質転換し、37℃で一晩LBAG寒天培地で培養した後、シングルコロニーを4mLのLBAG液体培地(10g/Lトリプトン、5g/Lイーストエキス、10g/L塩化ナトリウム、10g/Lグルコース、100μg/mLアンピシリン、pH7.2)で30℃一晩培養した。この培養液を2本の250mLの0.2%グルコースを含むLBA培地(10g/Lトリプトン、5g/Lイーストエキス、10g/L塩化ナトリウム、100μg/mLアンピシリン、pH7.2)に添加し、30℃でOD600が0.6〜0.8になるまで培養した。培養液に終濃度1mmol/LのIPTGを添加して、MBP−VL融合蛋白質の発現を誘導した後、さらに5時間27℃で培養した。
実施例4(2)で得られた精製MBP−VL融合蛋白質の5μg/mL溶液(溶媒TBS)を調製し、96ウェルマイクロプレートに、1ウェルあたり100μLずつ分注した。4℃で一晩静置して、MBP−VL融合蛋白質を吸着させた後、溶液を捨て、TBSで25%に希釈したブロックエース(以下、X%のブロックエースを含むTBSをX%BTBSとよぶ)で、室温で2時間ブロッキングした。0.05%ツイーン−20を含むTBS(以下、TBSTとよぶ)により1回洗浄した後、各ウェルに測定試料として、10%BTBSで0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、100、500、1000ng/mLの各濃度になるよう希釈したヒトオステオカルシンあるいはOC−1ペプチド(キアゲン社)を100μLずつ加えた。さらに、実施例4(1)で調製した精製VH−AP融合蛋白質の250μg/mL溶液2μLを加えて混合し、室温で2時間反応させた。TBSTにより3回洗浄し、100μLのアルカリフォスファターゼ基質溶液(1mmol/L p−ニトロフェニルリン酸、1mol/L Tris−HCl、10mmol/L MgCl2、50μmol/L ZnCl2、pH9.5)を各ウェルに加え,室温で30分間反応させた後、405nmの吸光度(OD405)を測定した。
Claims (42)
- 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド(VHポリペプチド)と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド(VLポリペプチド)を用いることを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法。
- VHポリペプチドまたはVLポリペプチドのいずれか一方を固相に固定化して固定化ポリペプチドとし、他方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体および標識化ポリペプチドを固定化ポリペプチドと接触させ、固定化ポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識化ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出または定量することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- VHポリペプチドまたはVLポリペプチドのいずれか一方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドおよび標識化ポリペプチドを、固相の存在下で測定すべきペプチドを含有する検体に接触させ、固相、他方のポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識化ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出または定量することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはビオチンである請求項2または3に記載の方法。
- VHポリペプチドまたはVLポリペプチドが、VHポリペプチドおよびVLポリペプチドと免疫学的に区別されるペプチド(タグペプチド)が付加したポリペプチドであって、VHポリペプチドまたはVLポリペプチドの固相への固定化が、VHポリペプチドまたはVLペプチドに付加した該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体との結合を介した固定化である請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 固相に固定化するVHポリペプチドまたはVLポリペプチドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである請求項2に記載の方法。
- VHポリペプチドを標識物質1で標識して標識化VHポリペプチドとし、VLポリペプチドを異なる標識物質2で標識して標識化VLポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体を標識化VHポリペプチドおよび標識化VLポリペプチドへ接触させ、標識物質1と標識物質2の相互作用の変化量を検出することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- VHポリペプチドおよびVLポリペプチドが遺伝子組換え産物である請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体が、該ペプチドのアミノ酸配列の連続する6以上19以下のアミノ酸の配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- モノクローナル抗体が、配列番号3のアミノ酸配列の連続する6以上19以下のアミノ酸の配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- モノクローナル抗体が、配列番号1または2のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 測定すべきペプチドが、ヒトオステオカルシンである請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1または2のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、配列番号1または2のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の(1)〜(3)のいずれかのモノクローナル抗体である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(1)重鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(2)軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(3)重鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体 - モノクローナル抗体が、以下の(1)〜(3)のいずれかのモノクローナル抗体である請求項14に記載の方法。
(1)配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(2)配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(3)配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体 - 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつVLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号5または7のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 配列番号5または7のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号4または6の塩基配列を含む請求項20に記載のDNA。
- 請求項20または21に記載のDNAをベクターに挿入して得られる組換えベクター。
- 請求項22に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- 請求項23に記載の形質転換体を培養液中に培養して、配列番号5または7のアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成・蓄積させ、培養液から該ポリペプチドを採取することを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
- 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド(VHポリペプチド)と、該モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド(VLポリペプチド)とを含有することを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量用の試薬。
- VHポリペプチドまたはVLポリペプチドのいずれか一方が、標識物質で標識された標識化ポリペプチドであり、他方が固相に固定化された固定化ポリペプチドである請求項25に記載の試薬。
- 固定化ポリペプチドがタグペプチドを付加したポリペプチドであって、固定化ポリペプチドの固相への固相化が、該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体との結合を介した固定化である請求項26に記載の試薬。
- 固定化ポリペプチドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである請求項26に記載の試薬。
- VHポリペプチドまたはVLポリペプチドのいずれか一方が、標識物質で標識された標識化ポリペプチドであり、他方がタグペプチドを付加したポリペプチドであり、さらに該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体を含有する請求項26に記載の試薬。
- 標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはビオチンである請求項26〜29のいずれか1項に記載の試薬。
- VHポリペプチドが標識物質1で標識された標識化VHポリペプチドであり、VLポリペプチドが異なる標識物質2で標識された標識化VLポリペプチドであることを特徴とする請求項25に記載の試薬。
- VHポリペプチドおよびVLポリペプチドが遺伝子組換え産物である請求項25〜31のいずれか1項に記載の試薬。
- 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体が、該ペプチドのアミノ酸配列の連続する6以上19以下のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である、請求項25〜32のいずれか1項に記載の試薬。
- モノクローナル抗体が、配列番号3のアミノ酸配列の連続する6以上19以下のアミノ酸の配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
- モノクローナル抗体が、配列番号1または2のアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体である請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
- 測定すべきペプチドが、ヒトオステオカルシンである請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1または2のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、配列番号1または2のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の(1)〜(3)のいずれかのモノクローナル抗体である請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
(1)重鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(2)軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(3)重鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号8、9および10のアミノ酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域のCDR1、2および3が、それぞれ配列番号11、12および13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体 - モノクローナル抗体が、以下の(1)〜(3)のいずれかのモノクローナル抗体である請求項38に記載の試薬。
(1)配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(2)配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(3)配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体 - 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
- 測定すべきペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトオステオカルシンであって、VHポリペプチドが、配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつVLポリペプチドが、配列番号7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである請求項25〜33のいずれか1項に記載の試薬。
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