CN118234864A - 抗EphA4抗体 - Google Patents
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Abstract
[问题]为了提供一种能够与EphA4特异性地结合并以高检测灵敏度检测EphA4的抗体，以及由该抗体赋予特征的用于检测或定量EphA4的方法和试剂盒。[解决方案]本发明提供了一种具有特定的重链CDR序列和轻链CDR序列的抗体和其抗原结合片段，以及由其赋予特征的方法和试剂盒。具体而言，根据本发明的抗体或其抗原结合片段包含：(a)如下重链，其包含：含有SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列的重链CDR1；含有SEQ ID NO.53所示的氨基酸序列的重链CDR2；和含有SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列的重链CDR3；以及如下轻链，其包含：含有SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列的轻链CDR1；含有SEQ ID NO.56所示的氨基酸序列的轻链CDR2；和含有SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(b)如下重链，其包含：含有SEQ ID NO.64所示的氨基酸序列的重链CDR1；含有SEQ ID NO.65所示的氨基酸序列的重链CDR2；和含有SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列的重链CDR3；以及如下轻链，其包含：含有SEQ ID NO.67所示的氨基酸序列的轻链CDR1；含有SEQ ID NO.68所示的氨基酸序列的轻链CDR2；和含有SEQ ID NO.69所示的氨基酸序列的轻链CDR3；或者(c)如下重链，其包含：含有SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列的重链CDR1；含有SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列的重链CDR2；和含有SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列的重链CDR3；以及如下轻链，其包含：含有SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列的轻链CDR1；含有SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列的轻链CDR2；和含有SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列的轻链CDR3。
Description
技术领域
本披露涉及一种与EphA4结合的抗体、编码该抗体的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的细胞、用于产生该抗体的方法、和使用该抗体的EphA4的检测或定量方法、和用于检测或定量EphA4的试剂盒。
背景技术
EphA4是受体型酪氨酸激酶家族的成员，是控制存在于树突上的小刺状结构体即树突棘的分子。作为EphA4的配体，已知A型肝配蛋白(Ephrin)和B型肝配蛋白，若EphA4与作为其配体肝配蛋白结合，则会诱导脱黏着信号，引起树突棘的退缩。EphA4在海马体或大脑皮质中大量表达，其胞外结构域通过基质金属蛋白酶(MMP)或ADAM(a disintegrin andmetalloproteinase，去整合素-金属蛋白酶)而被切割。这些切割的EphA4的片段被释出至细胞外，还存在于血浆中(专利文献1)。
此前，提示EphA4与阿兹海默症(以下也称为“AD”)的病情相关(非专利文献1至4)。例如，已知EphA4于AD患者或AD模型小鼠中被活化(非专利文献2至4)；由于AD中树突棘的密度减少，其程度与AD的临床症状相关(非专利文献5)，因此认为异常的EphA4的活化可能为AD的发病或病情进展的原因之一(非专利文献6)。启示了体内的EphA4作为能够检测AD等特定的神经系统疾病的标记物的可能性，期待能够以高于常规抗体的检测灵敏度检测生物样品中的EphA4或其胞外片段的抗体。
现有技术文献
[专利文献1]WO 2012/147798 A1
[非专利文献1]Rosenberger AF等人,Acta Neuropathol Commun.[神经病理学通讯学报]2014年7月16日；2:79
[非专利文献2]Fu AK等人,Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]2014年7月8日；111(27):9959-64
[非专利文献3]Vargas LM等人,PLoS One[公共科学图书馆·综合].2014年3月21日；9(3)
[非专利文献4]Huang TY等人,J Exp Med.[实验医学杂志]2017年12月4日；214(12):3669-3685。
[非专利文献5]Boros等人,Ann Neurol.[神经病学年鉴]2017年10月；82(4):602-614
[非专利文献6]Vargas LM等人,Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.[生物化学与生物物理学报：疾病的分子基础]2018年4月；1864:1148-1159
发明内容
发明想要解决的问题
本披露的目的在于提供一种抗体，其能够与EphA4特异性地结合并以高检测灵敏度检测EphA4。
本披露的目的还在于提供一种使用该抗体来检测或定量EphA4的方法。
本披露的目的进一步在于提供一种包含抗EphA4抗体的试剂盒，其能够以高检测灵敏度特异性地检测或定量EphA4。
解决问题的技术手段
本发明人为了解决上述问题，发现可由从兔抗体噬菌体文库的筛选获得的众多scFv形成尤其是能够以高检测灵敏度与EphA4特异性地结合的抗体，从而完成抗EphA4抗体。
因此，本披露包括以下的特征。
[1]一种抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
(a)如下重链，其包含由SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQID NO.53所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.56所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；
(b)如下重链，其包含由SEQ ID NO.64所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQID NO.65所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.67所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.68所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.69所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；或者
(c)如下重链，其包含由SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQID NO.41所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[2]如[1]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.53所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.56所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[3]如[2]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[4]如[2]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[5]如[1]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.64所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.65所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.67所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.68所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.69所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[6]如[5]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和
由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[7]如[1]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.41所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
[8]如[7]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和
由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[9]如[1]至[8]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体的重链恒定区为兔IgG的恒定区。
[10]如[9]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该兔IgG的恒定区包含SEQID NO.22所示的氨基酸序列。
[11]如[1]至[10]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体的轻链恒定区为兔Igκ的恒定区。
[12]如[11]所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该兔Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列。
[13]一种抗EphA4抗体，其中该抗体包含：
含有SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列的重链、和
含有SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列的轻链。
[14]一种抗EphA4抗体，其中该抗体包含：
含有SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列的重链、和
含有SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列的轻链。
[15]一种抗EphA4抗体，其中该抗体包含：
含有SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列的重链、和
含有SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列的轻链。
[16]一种抗EphA4抗体，其中该抗体包含：
含有SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列的重链、和
含有SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列的轻链。
[17]如[1]至[16]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段经标记。
[18]一种经分离的核酸，其编码如[1]至[16]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段。
[19]一种载体，其包含如[18]所述的核酸。
[20]一种宿主细胞，其包含如[19]所述的载体。
[21]一种用于产生抗EphA4抗体或其的方法，该方法抗原结合片段包括培养如[20]所述的宿主细胞的步骤。
[22]一种用于产生抗EphA4抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括如下步骤：培养包含编码如[1]至[16]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸的宿主细胞。
[23]一种用于检测或定量生物样品中的人类EphA4的方法，该方法包括使该生物样品与如[1]至[16]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段接触。
[24]如[23]所述的方法，其中该人类EphA4为人类EphA4的N末端片段。
[25]如[23]或[24]所述的方法，其中该生物样品为血液、血清、血浆、或脑脊髓液。
[26]如[23]至[25]中任一项所述的方法，其中该方法为ELISA。
[27]如[23]至[26]中任一项所述的方法，其中该方法为夹心ELISA。
[28]如[23]至[27]中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该生物样品与如[17]所述的经标记的抗EphA4抗体或其抗原结合片段接触。
[29]一种试剂盒，其用于检测或定量人类EphA4，且包含如[1]至[17]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段。
[30]如[29]所述的试剂盒，其中
该试剂盒为夹心ELISA试剂盒，且
包含至少2种该抗EphA4抗体或其抗原结合片段。
[31]如[29]或[30]所述的试剂盒，其包含：
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[32]如[29]或[30]所述的试剂盒，其包含：
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[33]如[29]或[30]所述的试剂盒，其包含：
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
[34]如[29]至[33]中任一项所述的试剂盒，其中该人类EphA4为人类EphA4的N末端片段。
[35]如[29]至[34]中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒包含人类EphA4的N末端片段。
[36]如[29]至[35]中任一项所述的试剂盒，其用于检测或定量生物样品中的人类EphA4。
[37]如[36]所述的试剂盒，其中该生物样品为血液、血清、血浆、或脑脊髓液。
[38]如[1]至[17]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其用于检测或定量人类EphA4。
[39]如[1]至[17]中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其用于检测或定量人类EphA4的N末端片段。
发明效果
根据本披露，提供一种抗体，其能够与EphA4特异性地结合并以高检测灵敏度检测EphA4。
根据本披露，还提供了一种包含抗EphA4抗体的试剂盒，其能够以高检测灵敏度特异性地检测EphA4。
附图说明
图1示出了实例1中产生的各抗人类EphA4单克隆抗体对各人类Eph受体家族的结合活性的评价结果。
图2示出了实例1中产生的各抗人类EphA4单克隆抗体对各种EphA4的结合活性的评价结果。
图3示出了实例1中产生的各抗人类EphA4单克隆抗体对人类EphA4的各结构域的结合活性的评价结果。
图4示出了针对人类EphA4胞外结构域的组合实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体使用的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的评价结果S-N((接种10ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)-(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))。
图5示出了针对人类EphA4胞外结构域的组合实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体使用的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的评价结果S/N((接种10ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)/(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))。
图6示出了针对人类EphA4胞外结构域的组合实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体使用的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的评价结果S-N((接种1ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)-(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))。
图7示出了针对人类EphA4胞外结构域的组合实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体使用的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的评价结果S/N((接种1ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)/(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))。
图8示出了KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18各抗体对人类EphA4的代表性的结合反应曲线。
图9示出了KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18各抗体对各人类Eph受体家族的结合特异性。
图10示出了KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18各抗体对小鼠、大鼠、兔、猴和人类EphA4的反应性的结果。
图11示出了KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18各抗体对人类EphA4的胞外结构域(ECD)、配体结合结构域(LBD)、纤连蛋白III型结构域1(FN1)、纤连蛋白III型结构域2(FN2)、和麦芽糖结合蛋白(MBP)的反应性的结果。
图12示出了使用抗体KPEP11_10与HRP标记抗体KPEP11_18的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果。
图13示出了使用抗体KPEP11_10与HRP标记抗体KPEP11_18的夹心ELISA对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图14示出了使用抗体KPEP11_18与HRP标记抗体KPEP11_10构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果。
图15示出了使用抗体KPEP11_18与HRP标记抗体KPEP11_10构建的夹心ELISA对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图16示出了使用抗体KPEP11_10与HRP标记抗体KPEP11_04构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果。
图17示出了使用抗体KPEP11_10与HRP标记抗体KPEP11_04构建的夹心ELISA对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图18示出了使用抗体KPEP11_18与HRP标记抗体KPEP11_08构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果。
图19示出了使用抗体KPEP11_18与HRP标记抗体KPEP11_08构建的夹心ELISA对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图20示出了评价使用抗体KPEP11_10与HRP标记抗体KPEP11_04、HRP标记抗体KPEP11_18、HRP标记EphA4抗体(Sino或R&D)构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果。
图21示出了评价使用抗体KPEP11_10与HRP标记抗体KPEP11_04、HRP标记抗体KPEP11_18、HRP标记EphA4抗体(Sino或R&D)构建的夹心ELISA对人类血浆中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图22示出了评价使用抗体KPEP11_10与HRP标记抗体KPEP11_04、HRP标记抗体KPEP11_18、HRP标记EphA4抗体(Sino或R&D)构建的夹心ELISA对人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图23示出了评价使用抗体KPEP11_18与HRP标记抗体KPEP11_08、HRP标记抗体KPEP11_10、HRP标记EphA4抗体(Sino或R&D)构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果。
图24示出了评价使用抗体KPEP11_18与HRP标记抗体KPEP11_08、HRP标记抗体KPEP11_10、HRP标记EphA4抗体(Sino或R&D)构建的夹心ELISA对人类血浆中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图25示出了评价使用抗体KPEP11_18与HRP标记抗体KPEP11_08、HRP标记抗体KPEP11_10、HRP标记EphA4抗体(Sino或R&D)构建的夹心ELISA对人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果。
图26示出了基于通过LC-MS分析的人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量结果与通过利用ELISA分析进行的定量分析1分析的人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量结果实施的相关分析的结果。
图27示出了基于通过LC-MS分析的人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量结果与通过利用ELISA分析进行的定量分析2分析的人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量结果实施的相关分析的结果。
具体实施方式
通过本文中使用的SEQ ID NO.而被特定或编码的区域如下所示：
本披露涉及一种与EphA4结合的抗EphA4抗体。
根据本披露的抗EphA4抗体是能够特异性地识别EphA4并与其结合的抗体。抗EphA4抗体可为完整抗体，或者只要具有与EphA4的结合亲和力，则还可为合成抗体(例如重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体等)。于本文中，EphA4可理解为指源自人类、小鼠、大鼠、兔或猴的EphA4。源自人类、小鼠、大鼠、兔和猴的EphA4可自美国国家生物技术信息中心所提供的Genbank等登录有序列信息的公共的数据库获取，或者可基于处于近缘关系的动物种类的EphA4的碱基序列信息设计引物，从由所需的动物种类提取的RNA进行克隆，借此获取EphA4基因的序列信息。例如，人类、小鼠、大鼠、兔和猴的EphA4的碱基序列信息分别在数据库上登录为基因库登录号NM_004438.5、NM_007936.3、NM_001162411.1、XM_002712496.3、NM_001260870.1。
在本披露的一方面中，EphA4包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或所述氨基酸序列中取代/添加/缺失一个或多个氨基酸的氨基酸序列。本文中，“多个”只要保持与原本的序列同等的功能特性，则无限定，为2个-100个、例如2个-90个、2个-80个、2个-70个、2个-60个、2个-50个、2个-40个、2个-30个、2个-20个、2个-10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个，或者为氨基酸序列中的氨基酸数的10％或更少、例如9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少或1％或更少。
本披露中，术语“特异性结合”该技术领域中的技术人员熟知的术语，并且用于确定抗体或其抗原结合片段对抗原或表位的特异性结合的方法也是熟知的。在一个实施例中，“特异性结合”可理解为：相较于与其他靶分子结合，抗EphA4抗体或其抗原结合片段能够以更大的结合亲和力、结合活性，更迅速地、和/或持续更长时间地通过免疫学反应与EphA4结合。在另一个实施例中，“特异性结合”可通过对EphA4具有至少约10-7M、或至少约10-8M、或至少约10-9M、或至少10-10M或其以下的KD的抗体表示。另外，在进而另一个实施例中，“特异性结合”可理解为通过免疫学反应与EphA4结合，但不与Eph受体的其他家族分子(例如EphA1、EphA2、EphA3、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4、EphB6)实质性结合。
“抗原结合片段”只要为维持针对EphA4的特异性结合性的抗EphA4抗体的片段，则无特别限定，包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv。
该技术领域内本领域技术人员熟知的方法可用作测量抗EphA4抗体或其抗原结合片段对抗原的结合特性(例如结合亲和力和种间交叉反应性)的方法。例如，结合亲和力可使用(但不限于)BiacoreTM生物传感器、KinExA生物传感器、临近闪烁测定法、ELISA、ORIGEN免疫测定法(IGEN公司)、流式细胞术、荧光淬灭、荧光转移、酵母展示、和/或免疫染色进行测量。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段可为如IgG、IgA或IgM(或者其亚类)等任何类别，并不限定于特定类别。根据重链(还有时称为H链)的恒定区的抗体氨基酸序列，将免疫球蛋白分类为不同的类别。5个主要的免疫球蛋白类别有：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几个类别可进一步细分为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、以及IgA1和IgA2等亚类(同种型)。不同类别免疫球蛋白所对应的重链的恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。此外，抗体的轻链(还有时称为L链)的种类存在λ链和κ链。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段可为IgG抗体。根据本披露的抗EphA4抗体视情形可为单体、二聚体或多聚体的形式。
根据本披露的抗体或其抗原结合片段的可变区可意指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区，抗体的恒定区可意指抗体轻链的恒定区和/或抗体重链的恒定区。重链和轻链的可变区各自由通过还称为互补决定区的三个CDR连接的4个架构区(FR)组成。各链中的CDR通过FR而保持在附近，与另一链中的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。用以确定的CDR的技术包括但不限于例如：(1)基于跨物种序列可变性的方法(例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学感兴趣的蛋白质的序列],第5版,1991,National Institutes of Health[国立卫生研究院],Bethesda MD[马里兰州贝塞斯达])；和(2)基于本抗原-抗体复合物的晶体结构研究的方法(Al-lazikani等人,1997J.Molec.Biol.[分子生物学杂志]273:927-948)。还可将这些方法和其他方法组合使用。
在根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段中，例如可使用源自人类、小鼠、大鼠、兔或猴的重链序列和/或轻链序列，但不限于此。在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段具有源自兔的重链序列和轻链序列。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段可根据需求进行修饰。抗EphA4抗体或其抗原结合片段的修饰可为改变(a)例如片状或螺旋构型等修饰区中的氨基酸序列的三维结构；(b)靶位点上的分子的电荷或疏水性的状态；或者(c)对维持侧链体积的修饰的效果的修饰；或者还可为无法明确观察到这些改变的修饰。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的修饰例如可通过构成的氨基酸残基的取代、缺失、添加等达成。
本说明书中，氨基酸是以其最广义的含义使用，不仅包括天然的氨基酸、例如丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、和脯氨酸(Pro)，还包括非天然氨基酸，例如氨基酸变体和衍生物。鉴于此宽泛的定义，本领域技术人员当然可理解本文中的氨基酸包括例如L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变体、氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等在体内不会成为蛋白质的构成材料的氨基酸；和本领域技术人员熟知的具有氨基酸的特性的化学合成的化合物等。非天然氨基酸的实例包括例如：α-甲基氨基酸(如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸(如D-天冬氨酸、D-谷氨酸)、组氨酸样氨基酸(如2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸)、侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)和侧链中的羧酸官能团氨基酸经磺酸基取代的氨基酸(如氧化半胱氨酸)。
例如，天然存在的氨基酸残基可基于一般的侧链特性而分类为以下组：
(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu和Ile；
(2)中性亲水性：Asn、Gln、Cys、Ser和Thr；
(3)酸性：Asp和Glu；
(4)碱性：His、Lys和Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly和Pro；以及
(6)芳香族：Trp、Tyr和Phe。
构成抗体的氨基酸序列的非保守性取代可通过将属于其中一个组的氨基酸更换为属于另一组的氨基酸而进行。更保守性的取代可通过将属于其中一个组的氨基酸更换为同一组的另一氨基酸而进行。同样地，也可适当进行氨基酸序列的缺失或取代。
构成抗体的氨基酸的修饰的实例可以为例如通过糖的糖基化、乙酰化或磷酸化等翻译后修饰。抗体可在其恒定区中的保守位置处进行糖基化。抗体的糖基化通常为N-结合型或O-结合型的任一者。N-连接的意指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的结合。作为三肽序列的天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、和天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中，X为脯氨酸以外的任意的氨基酸)是用以将碳水化合物部分酶促添加到天冬酰胺侧链的识别序列。当这些三肽序列中的任一者存在于抗体中时，存在潜在的糖基化位点。O-结合型糖基化可为N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖的任一者与羟基氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)的结合，在一些情况下，还可以是与5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的结合。本领域的普通技术人员可以根据目的，适当选择糖基化条件目的(如用生物学方法进行糖基化时，宿主细胞或细胞培养基的类型、pH，等)。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段可进一步基于本领域技术人员所熟知的技术常识，通过其他修饰方法单独地或组合地修饰。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段可通过本领域技术人员熟知的方法产生。例如，可通过将编码根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的核酸整合到表达载体、将该表达载体引入宿主细胞，并培养该宿主细胞，从而产生抗体或其抗原结合片段。因此，本披露包括：编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的核酸、包含该核酸的载体、包含该载体的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞的步骤的用于产生抗EphA4抗体或其抗原结合片段的方法。
编码根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的核酸可具有编码信号序列的DNA，还可在编码重链可变区的DNA和编码轻链可变区的DNA的5'末端具有编码信号序列的DNA。信号序列是分泌蛋白或整合膜蛋白在核糖体上合成后穿过脂质双层所必需的、存在于蛋白质N末端的氨基酸残基，并且在本披露中信号序列无特别限制，只要是具有该功能的序列即可。根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段可包含的信号序列包括源自人类、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、狗、猫、酵母等的信号序列。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段可以为根据本领域技术人员熟知的方法分离或纯化的那些。
本说明书中，“经分离”或“经纯化”意指从自然的状态人为地分离或纯化。在分子或组合物是天然存在的情形时，如果其已变化或自原本的环境被去除、或者这两种情况时，则为“经分离”或“经纯化”。分离或纯化的方法的实例包括但不限于：电泳、分子生物学、免疫学或色谱法等，具体而言离子交换色谱、疏水色谱、反相HPLC色谱、等电聚焦、或碱提取法。
在一方面中，根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.41所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在另一方面中，根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.53所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.56所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；
在进而另一方面中，根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段包含以下CDR：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.64所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.65所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.67所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.68所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.69所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
在一个实施例中，抗EphA4抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在一个实施例中，抗EphA4抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在另一个实施例中，抗原结合片段抗EphA4抗体或其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在进而另一个实施例中，抗原结合片段抗EphA4抗体或其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在本披露中，重链的可变区和/或轻链的可变区还可具有对原本的序列取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸的氨基酸序列。本文中，“多个”只要保持对EphA4的结合亲和力，促进EphA4的切割，则无限定，为2个-15个、或2个-10个、例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个，或者氨基酸序列中的氨基酸数的10％或更少、例如9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少或1％或更少。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链包含兔IgG的恒定区。在特定的实施例中，兔IgG的恒定区包含SEQ ID NO.22的氨基酸序列。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的轻链包含兔Igκ的恒定区。在特定的实施例中，兔Igκ的恒定区包含SEQ ID NO.23的氨基酸序列。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列，且抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列，且抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO.29所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列，且抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体的重链包含SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列，且抗EphA4抗体的轻链包含SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列。
在一个实施例中，根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段经标记。在本披露中，“标记”意指与抗体或其抗原结合片段直接地或间接地结合的可检测的化合物或组合物。标记可其本身可检测，或者可通过与其他特异性结合对的组合而可检测，例如，在酶标记的情况下，可通过作用于底物化合物或组合物或者与的反应而产生可检测的信号。
在另一个实施例中，例如，出于减少通过抗体产生细胞而产生的抗体的不均匀性等理由(美国专利申请公开号2010/0297697或Liu H等人,MAbs.[单克隆抗体]2014年9月-10月；6(5):1145-1154)，抗EphA4抗体可缺失位于重链的C末端(羧基末端)的赖氨酸。在本披露中，缺失了重链的C末端赖氨酸的抗EphA4抗体包括使重链的C末端赖氨酸通过基因修饰而缺失的抗EphA4抗体或通过羧肽酶等翻译后切割了重链的C末端赖氨酸的抗EphA4抗体等。此外，在本披露中，缺失了重链的C末端赖氨酸的抗EphA4抗体不仅包括在两条重链中缺失了C末端赖氨酸的抗EphA4抗体，还包括仅在一条重链中缺失了C末端赖氨酸的抗EphA4抗体。
在一方面中，本披露涉及一种编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸。编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸是指编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链和/或轻链的一个或多个核酸分子。在一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链。在另一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的轻链。在进而另一个实施例中，根据本披露的核酸编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链和轻链。根据本披露的核酸包含编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链的第一核酸分子、和编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的轻链的第二核酸分子。
在另一方面中，本披露涉及一种包含编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸的载体。根据本披露的载体是指包含编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸的一个或多个载体。在一个实施例中，根据本披露的载体是包含编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链的核酸和编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸的载体。在另一个实施例中，根据本披露的载体是包含编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链和轻链的核酸的载体。在进而另一个实施例中，根据本披露的载体包括：包含编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的重链的核酸的第一载体、和包含编码抗EphA4抗体或其抗原结合片段的轻链的核酸的第二载体。根据本披露的载体可以是但并不特别限于质粒、粘粒、病毒、噬菌体等。例如根据本披露的载体还包括作为病毒载体的反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体等。
在进而另一方面中，包含根据本披露的载体的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞的步骤的用于产生抗EphA4抗体或其抗原结合片段的方法也包括在本披露中。根据本披露的宿主细胞可以是但并不特别限于大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞等。在一个实施例中，用于产生抗EphA4抗体或其抗原结合片段的方法包括培养宿主细胞的步骤、和自该宿主细胞(或者宿主细胞的培养基)收集分泌的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的步骤。
被上述CDR赋予特征的根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段与EphA4的N末端的任意区域结合。在本披露中，EphA4的“N末端结构域”是指EphA4的胞外结构域(ECD)、或者EphA4被基质金属蛋白酶(MMP)或ADAM(去整合素-金属蛋白酶)切割的情形时的N末端侧的区域。应注意的是，人类EphA4中的ECD是定义为具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列、或者在该氨基酸序列中取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸的氨基酸序列的那些。本文中，“多个”为2个-15个、或者2个-10个、例如9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个，或者为氨基酸序列中的氨基酸数的10％或更少、例如9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少或1％或更少。
根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段能够与EphA4特异性地结合并以高检测灵敏度检测EphA4。因此，在另一方面中，本披露涉及一种用于检测或定量生物样品中的EphA4的方法(下文中还称为根据本披露的方法)，该方法使用根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段。
在根据本披露的方法中，成为测量靶标的“EphA4”除了全长EphA4以外，还包括由EphA4的N末端结构域组成的片段(在本文中还简称为“EphA4 N末端片段”或“EphA4的N末端片段”)。
在根据本披露的方法中，生物样品只要为可包含全长EphA4或EphA4 N末端片段的样品，则无特别限制，例如可以包括例如血液、血清、血浆、脑脊髓液(CSF)、尿、唾液、泪液、汗等源自生物体的液体成分(还称为体液)等。在一个实施例中，生物样品为血液、血清、血浆、或脑脊髓液。此外，生物样品不限于源自人类的生物样品，还包括人类以外的动物的生物样品。这样的动物可以包括但不限于，例如小鼠、大鼠、兔、猴等。
根据本披露的方法包括使生物样品与根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段接触。EphA4的检测或定量可使用该技术领域中熟知的免疫分析实施。
根据本披露的方法可包括使生物样品与根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段(第一抗体)接触后，任何进一步使该生物样品与经标记的抗EphA4抗体或其抗原结合片段(第二抗体)接触。在该方法中，第一抗体与经标记的第二抗体是使用不同抗体。
免疫分析使用标记成可检测的抗EphA4抗体或其抗原结合片段、或者标记成可检测的抗EphA4抗体或其抗原结合片段(二级抗体)。根据抗体的标记法，分类成酶免疫分析(EIA或ELISA)、放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(FIA)、荧光偏极免疫分析(FPIA)、化学发光免疫分析(CLIA)、电化学发光免疫分析(ECLIA)等，其中任一种均能够用于根据本披露的方法。
在ELISA法中，可使用如氧化酶和碱性磷酸酶等酶，在RIA法中，可使用如125I、131I、35S和3H等放射性物质，在FPIA法中，可使用如荧光异硫氰酸盐、罗丹明、丹磺酰氯、藻红蛋白、异硫氰酸四甲基罗丹明、近红外荧光材料等荧光物质，在CLIA法中，可使用荧如光素酶、β半乳糖苷酶等酶和通过各酶而变成发光物质的发光底物以及如荧光素和水母素等发光物质标记的抗体。此外，还可检测经金胶体和量子点等纳米粒子标记的抗体。
另外，在免疫分析中，还可利用生物素标记抗EphA4抗体或其抗原结合片段，与经酶等标记的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素结合，然后检测和测量EphA4。
在ELISA法中，例如可使用夹心法。将抗EphA4抗体或其抗原结合片段固定于固相支持物，添加经适当处理的生物样品进行反应，然后进一步添加经酶标记的其他抗EphA4抗体或其抗原结合片段进行反应。洗涤后，与酶底物反应并显色，测量吸光度，借此能够定量EphA4或EphA4的N末端片段。
在酶为过氧化物酶的情形时，酶底物可使用3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine；DAB)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine；TMB或TMBZ)、邻联苯胺(o-phenylenediamine；OPD)等，在酶为碱性磷酸酶的情形时，酶底物可使用对硝基苯基磷酸酯(p-nitropheny phosphate；NPP)等。
此外，在上述免疫分析中，能够简便地检测微量的蛋白质的方法包括凝集法。凝集法包括例如使乳胶粒子结合于抗体的乳胶凝集法。
在使抗EphA4抗体或其抗原结合片段结合于乳胶粒子并与生物样品混合时，若存在EphA4，则抗体结合乳胶粒子凝集。因此，可对样品照射近红外光，通过吸光度的测量(比浊法)或散射光的测量(散射比浊法)定量凝集块而确定抗原的浓度。
在一个实施例中，根据本披露的方法是用于检测或定量生物样品中的人类EphA4的方法。
在一个实施例中，根据本披露的方法是用于检测或定量生物样品中的人类EphA4的N末端片段的方法。
在一个实施例中，根据本披露的方法是使用根据本披露的抗体或其抗原结合片段的组合的夹心ELISA用于人类EphA4的检测或定量。
在另一方面中，本披露涉及一种试剂盒(下文中还称为根据本披露的试剂盒)，其包含根据本披露的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，用于检测或定量EphA4。根据本披露的试剂盒可包含检测或定量EphA4时可使用的任意试剂或器具、或者用于使用该试剂盒的说明书。
在根据本披露的试剂盒中，作为测量靶标的“EphA4”包括全长EphA4以及EphA4的N末端片段。
在一个实施例中，根据本披露的试剂盒涉及用于检测或定量人类EphA4的试剂盒。
在一个实施例中，根据本披露的试剂盒涉及用于检测或定量人类EphA4的N末端片段的试剂盒。
在一个实施例中，根据本披露的试剂盒包含可用作产生人类EphA4的校准曲线时的阳性对照的人类全长EphA4或该全长EphA4的阶梯稀释液。
在一个实施例中，根据本披露的试剂盒包含可用作产生人类EphA4的校准曲线时的阳性对照的人类EphA4的N末端片段或该片段的阶梯稀释液。
在一个实施例中，根据本披露的试剂盒包含如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ IDNO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在另一个实施例中，根据本披露的试剂盒包含如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ IDNO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在另一个实施例中，根据本披露的试剂盒包含如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
在进而另一个实施例中，根据本披露的试剂盒包含如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
作为根据本披露的方法、尤其是夹心ELISA中使用的、或者根据本披露的试剂盒中包含的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的具体组合，可例示以下：
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(固相抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
(标记抗体)
如下抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
本领域技术人员应理解，只要技术上不矛盾，则可将本文所述的所有方面的任意一种或多种适当组合来实施本披露。进一步地，本领域技术人员应理解，只要技术上不矛盾，则优选为将本文所述的优选或有利的任意方面和所有方面适当组合来实施本披露。
本文所引用的文献的所有披露内容应视为均通过引用被明确地引用到本文，且本领域技术人员能够根据本文的上下文，在不脱离本披露的精神和范围的情况下，引用这些文献中的相关披露内容作为本说明书的一部分加以理解。
本文所引用的文献仅仅是为了披露本申请的申请日的前的相关技术而提供，不应被解释为本发明人承认由于在先发明或任意其它原因而不具有先于本披露内容的权利。这些文献的所有描述均基于本申请人可获取的信息，并不构成对这些描述内容准确的任何断言。
本文所使用的术语是用来说明特定的实施例，并不旨在限定发明。
除非上下文明确地表明以另外的方式理解，否则本文所用的术语“包含(comprise)”意指存在所描述的项目(例如组分、步骤、要素或数字)，不排除存在其他项目(例如组分、步骤、要素和数字)。术语“由…组成(consist of)”涵盖以术语“由…组成”和/或“基本上由…组成(consist essentially of)”所述的方面。
除非另有定义，否则本文中所使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)的含义与本披露所属技术的技术人员所广泛理解的相同。本文所使用的术语，除非另外明确定义，否则均应解释为与本文和相关技术领域中的含义一致，而不应以理想化或过于形式的含义来解释。
第1、第2等术语是用来表达各种要素，但应理解这些要素不应受这些术语本身所限定。这些术语仅仅是用于将一个要素与另一个要素区分开来，例如在不脱离本披露的范围的情况，能够将第1要素描述为第2要素，同样地，将第2要素描述为第1要素。
在本文说明书中，除非明确指明，否则应理解，用来表示组分含量或数值范围等的数值被术语“约”来修饰。例如，除非明确指出，否则“4℃”理解为意指“约4℃”，当然本领域技术人员可以根据技术常识和本说明书的文意而合理地理解其程度。
除非根据上下文明确指明其它含义，当在本文说明书和权利要求书中使用单数形式表示各方面时，应理解只要在技术上没有冲突，那么也可以是复数形式，反之亦然。
现在将参考实例对本披露更详细地进行说明。然而，本披露可以通过各个方面来实现，不应被解释为限于本文所述的实例。相关技术领域的技术人员可以不改变本披露的精神和范围，进行各种修饰、添加、缺失、取代等来实施本披露。
实例
实例1：抗人类EphA4兔单克隆抗体的产生
为了产生与人类EphA4(基因库登录号NP_004429.1，SEQ ID NO.1)结合的单克隆抗体，通过以下步骤制备将分泌型碱性磷酸酶(SEAP)和组氨酸标签融合于人类EphA4的胞外结构域(位置20-547)(SEQ ID NO.2)而成的蛋白质(以下称为“人类EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白”，SEQ ID NO.3)，将组氨酸标签融合于人类EphA的胞外结构域(位置20-547)(SEQ ID NO.2)而成的蛋白质(以下称为“人类EpA4胞外结构域-His蛋白”，SEQ ID NO.4)，和将麦芽糖结合蛋白(MBP)和组氨酸标签融合于人类EphA4的胞外结构域而成的蛋白质(以下称为“人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白”，SEQ ID NO.5)。
首先，构建pcDNA3.4-人类EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体、pcDNA3.4-人类EphA4胞外结构域-His表达载体、和pcDNA3.4-人类EphA4胞外结构域-MBP-His表达载体。通过Genscript进行编码SEAP-His和人类EphA4胞外结构域的基因的合成。首先，将所合成的编码SEAP-His的基因片段克隆至pcDNA3.4载体(英杰公司(Invitrogen)/生命技术公司(LifeTechnologies))。将所合成的人类EphA4胞外结构域的基因片段克隆至所构建的pcDNA3.4-SEAP-His表达载体，以构建人类EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体。pcDNA3.4-人类EphA4胞外结构域-His表达载体是通过将所合成的人类EphA4胞外结构域的基因片段克隆至具有编码组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.4载体(英杰公司/生命技术公司)来构建的。pcDNA3.4-人类EphA4胞外结构域-MBP-His表达载体是通过PCR将编码人类EphA4的信号序列和胞外结构域的DNA序列进行扩增，然后克隆至具有编码MBP和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.4载体(英杰公司/生命技术公司)来构建的。使用Expi293表达系统(赛默科技公司(Thermo SCIENTIFIC))，将上述各表达载体转染至Expi293F细胞(赛默科技公司)。回收培养液，去除细胞并澄清化。使用TALON树脂(宝生物公司(TaKaRa))进行纯化，通过透析或脱盐柱(赛默科技公司)而将缓冲液置换成PBS(富士胶片和光纯药株式会社(FUJIFILM Wako))。
按照传统方法，将所制备的人类EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白与辅助剂一起使用来对兔(IBL)进行免疫。免疫后，使用RNeasy(凯杰公司(QIAGEN))由所采集的淋巴结细胞制备全RNA，并利用DNA酶(凯杰公司，无RNA酶的DNA酶组)进行处理。使用RNA PCR试剂盒(宝生物公司)，由所述全RNA制备反转录产物。将所获得的反转录产物用作模板，构建兔抗体噬菌体文库。使用人类EphA4蛋白、人类EphA4抗体和兔抗体噬菌体文库实施筛选，获得与人类EphA4特异性结合的兔抗体片段(scFv)。将人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白与人类EphA4抗体捕获到Dynabead磁珠(赛默科技公司)上，添加兔抗体噬菌体文库，在1小时或2小时后，使用PBS-Tween(0.1％v/v)或PBS通过一系列的洗涤循环将未结合噬菌体去除。使结合的噬菌体粒子洗脱后，经由感染将其扩增至大肠杆菌TG1宿主细胞。回收感染的TG1细胞，将其铺板至板上，并于30℃下孵育。使用扩增的噬菌体再一次进行该淘选处理。
在两次淘选后，使用来自感染了浓缩噬菌体的TG1细胞的单一菌落来将其接种在96孔板中的培养基上。添加IPTG来诱导scFv+FLAG标签的表达，并将其在30℃下进行过夜振荡培养。对TG1细胞进行离心(spin-down)，使用包含scFv的大肠杆菌培养上清液，挑取具有对人类EphA4的反应性的孔。
对人类EphA4的反应性是使用人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白，依据以下的步骤通过ELISA进行评价。将抗FLAG抗体(西格玛公司(SIGMA))涂布于96孔板(赛默科技公司)的孔上。于4℃下孵育过夜后，通过2％脱脂乳(BD)，将孔在室温下封闭2小时。利用0.02％Tween 20/PBS洗涤三次后，将人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白(最终浓度20nM)与包含scFv的大肠杆菌培养上清液添加至各孔，并将其在室温下孵育2小时。洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的抗His抗体(MBL)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤五次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育15-20分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(赛默科技公司)读取450nm处的吸光度。根据筛选的结果，选择人类EphA4特异性的兔抗体片段，进行测序，以确定各片段的基因序列。
分别将所获得的编码兔抗体片段(scFv)的可变区的DNA序列亚克隆至表达抗体重链和轻链恒定区的载体，而将克隆自scFv转换成IgG形式。产生包含编码抗人类EphA4兔单克隆抗体的基因序列的表达载体(pcDNA3.4)。KPEP11_04的重链可变区的氨基酸序列为SEQID NO.6所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。作为编码KPEP11_04的氨基酸序列的基因序列，重链可变区使用SEQ ID NO.8所示的核酸序列，轻链可变区使用SEQ ID NO.9所示的核酸序列。KPEP11_08的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。作为编码KPEP11_08的氨基酸序列的基因序列，重链可变区使用SEQ ID NO.12所示的核酸序列，轻链可变区使用SEQ ID NO.13所示的核酸序列。KPEP11_10的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列。作为编码KPEP11_10的氨基酸序列的基因序列，重链可变区使用SEQ IDNO.16所示的核酸序列，轻链可变区使用SEQ ID NO.17所示的核酸序列。KPEP11_18的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO.19所示的氨基酸序列。作为编码KPEP11_18的氨基酸序列的基因序列，重链可变区使用SEQ ID NO.20所示的核酸序列，轻链可变区使用SEQ ID NO.21所示的核酸序列。作为KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18的重链恒定区，使用兔IgG的恒定区(SEQ IDNO.22)。作为KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18的轻链恒定区，使用兔Igκ(SEQID NO.23)。KPEP11_04的全长重链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列，全长轻链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列。编码KPEP11_04的全长重链的核酸序列为SEQ ID NO.26所示的核酸序列，编码全长轻链的核酸序列为SEQ ID NO.27所示的核酸序列。KPEP11_08的全长重链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ ID NO.28所示的氨基酸序列，全长轻链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ IDNO.29所示的氨基酸序列。编码KPEP11_08的全长重链的核酸序列为SEQ ID NO.30所示的核酸序列，编码全长轻链的核酸序列为SEQ ID NO.31所示的核酸序列。KPEP11_10的全长重链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ ID NO.32所示的氨基酸序列，全长轻链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ ID NO.33所示的氨基酸序列。编码KPEP11_10的全长重链的核酸序列为SEQ ID NO.34所示的核酸序列，编码全长轻链的核酸序列为SEQ ID NO.35所示的核酸序列。KPEP11_18的全长重链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ ID NO.36所示的氨基酸序列，全长轻链(不含信号序列)的氨基酸序列为SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列。编码KPEP11_18的全长重链的核酸序列为SEQ ID NO.38所示的核酸序列，编码全长轻链的核酸序列为SEQ ID NO.39所示的核酸序列。将这些载体转染至Expi293F细胞(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))。回收上清液，使用MabSelectTM(思拓凡公司(Cytiva))、MabSelectSuRepcc(思拓凡公司)或AmsphereA3(日本合成橡胶公司(JSR))获得抗人类EphA4兔单克隆抗体。
KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18的CDR是依据用于鉴定CDR的Kabat定义确定的。将KPEP11_04的CDR的氨基酸序列与核酸序列分别示于表1与表2。将KPEP11_08和KPEP11_10的CDR的氨基酸序列与核酸序列分别示于表3与表4。将KPEP11_18的CDR的氨基酸序列与核酸序列分别示于表5与表6。
[表1]
KPEP11_04的CDR的氨基酸序列
[表2]
KPEP11_04的CDR的核酸序列
[表3]
KPEP11_08和KPEP11_10的CDR的氨基酸序列
[表4]
KPEP11_08和KPEP11_10的CDR的核酸序列
[表5]
KPEP11_18的CDR的氨基酸序列
[表6]
KPEP11_18的CDR的核酸序列
通过与上述产生方法相同的方法产生抗人类EphA4兔单克隆抗体KPEP11_01、KPEP11_02、KPEP11_05、KPEP11_07、KPEP11_09、KPEP11_12、KPEP11_13和KPEP11_20。KPEP11_01的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.76所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.77所示的氨基酸序列。KPEP11_02的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.78所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.79所示的氨基酸序列。KPEP11_05的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.80所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.81所示的氨基酸序列。KPEP11_07的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.82所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.83所示的氨基酸序列。KPEP11_09的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.84所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.85所示的氨基酸序列。KPEP11_12的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.86所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.87所示的氨基酸序列。KPEP11_13的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.88所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.89所示的氨基酸序列。KPEP11_20的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.90所示的氨基酸序列，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.91所示的氨基酸序列。使用兔IgG的恒定区(SEQ ID NO.22)作为这些抗体的重链恒定区。另外，使用兔Igκ(SEQ ID NO.23)作为这些抗体的轻链恒定区。
产生的各抗体的CDR是依据用于鉴定CDR的Kabat定义确定的。将各抗体的CDR的氨基酸序列分别示于表7至表11。
[表7]
KPEP11_01和KPEP11_09的CDR的氨基酸序列
[表8]
KPEP11_02和KPEP11_05的CDR的氨基酸序列
[表9]
KPEP11_07的CDR的氨基酸序列
[表10]
KPEP11_12和KPEP11_13的CDR的氨基酸序列
[表11]
KPEP11_20的CDR的氨基酸序列
实例2：抗人类EphA4单克隆抗体对人类Eph受体的选择性
针对实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体，依据以下的步骤进行人类Eph受体的结合活性的评价。将小鼠抗6-His抗体(R&D)涂布于96孔板(赛默科技公司)的孔上。在室温下孵育1小时后，利用1％Block Ace(KAC公司)将孔在室温下封闭1小时。利用0.02％Tween 20/PBS洗涤三次后，在各孔中接种人类的各Eph受体胞外结构域-His蛋白(Creativebiomart公司，最终浓度1nM)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加抗人类EphA4兔单克隆抗体(10μg/mL)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体(艾博抗公司(abcam))，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育4分钟30秒。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(赛默科技公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
发现KPEP11_01、KPEP11_02、KPEP11_04、KPEP11_05、KPEP11_07、KPEP11_08、KPEP11_09、KPEP11_10、KPEP11_12、KPEP11_13、KPEP11_18和KPEP11_20与人类Eph受体家族的人类EphA4特异性地结合(图1)。
实例3：抗人类EphA4单克隆抗体对小鼠、大鼠、兔、猴和人类EphA4的反应性
针对实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体，依据以下的步骤进行其与各种EphA4的结合活性的评价。将小鼠抗6-His抗体(R&D)涂布于96孔板(赛默科技公司)的孔上。在室温下孵育1小时后，利用1％ Block Ace(KAC公司)将孔于4℃下封闭过夜。利用0.02％Tween 20/PBS洗涤三次后，在孔中接种小鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、大鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、兔EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、猴EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、人类EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白或SEAP-His蛋白(最终浓度1nM)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加抗人类EphA4兔单克隆抗体(10μg/mL)，并将其在室温下孵育约1小时。洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体(艾博抗公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育3分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(赛默科技公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
KPEP11_01、KPEP11_02、KPEP11_04、KPEP11_05、KPEP11_07、KPEP11_08、KPEP11_09、KPEP11_10、KPEP11_12、KPEP11_13、KPEP11_18和KPEP11_20对猴和人类EphA4具有结合活性(图2)。
实例4：抗人类EphA4单克隆抗体对人类EphA4胞外结构域、配体结合结构域、纤连
蛋白III型结构域1、纤连蛋白III型结构域2的反应性
针对实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体，依据以下的步骤进行其与各种EphA4的结合活性的评价。将小鼠抗6-His抗体(R&D)涂布于96孔板(赛默科技公司)的孔上。在室温下孵育1小时后，利用1％ Block Ace(KAC公司)将孔在室温下封闭1小时。利用0.02％ Tween 20/PBS洗涤三次后，在孔中接种人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白、人类EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白、人类EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白、人类EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白或MBP-His蛋白(最终浓度1nM)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加抗人类EphA4兔单克隆抗体(10μg/mL)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体(艾博抗公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育4分钟30秒。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(赛默科技公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
KPEP11_02、KPEP11_04、KPEP11_05、KPEP11_07、KPEP11_18和KPEP11_20对人类EphA4胞外结构域(ECD)和配体结合结构域(LBD)具有结合活性。KPEP11_01、KPEP11_08、KPEP11_09、KPEP11_10、KPEP11_12、和KPEP11_13对人类EphA4胞外结构域(ECD)具有结合活性(图3)。
实例5：基于夹心ELISA的对人类EphA4胞外结构域的反应性
针对实例1中产生的抗人类EphA4单克隆抗体，依据以下的步骤进行其对人类EphA4胞外结构域的结合活性的评价。使用50mM Tris-HCl(pH 7.5)/0.1％叠氮化钠将各抗人类EphA4单克隆抗体分别制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司(Nunc))的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所(DOJINDO))依据附带的操作指南对作为检测抗体的各抗人类EphA4单克隆抗体分别进行HRP(辣根过氧化物酶)标记。利用洗涤液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％Tween 20/0.2％ Proclin 150(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、1、10ng/mL)，并将其在室温下孵育2小时。洗涤三次后，分别添加利用样品稀释液进行了1500倍稀释的HRP标记的抗人类EphA4单克隆抗体各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司(Molecular Device))读取450nm和620nm处的吸光度。
将各抗人类EphA4单克隆抗体的组合的反应性列表以(1)S-N((接种10ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)-(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))、(2)S/N((接种10ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)/(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))、(3)S-N((接种1ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)-(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))、(4)S/N((接种1ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号)/(接种0ng/mL的EphA4胞外结构域时获得的信号))分别示于图4、图5、图6和图7。获得了多个对EphA4胞外结构域显示强结合活性的抗人类EphA4单克隆抗体的组合。
实例6：抗人类EphA4单克隆抗体对人类EphA4的结合亲和力
通过使用Biacore T200(思拓凡公司)的表面等离子共振法(SPR法)确定KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18对人类EphA4的结合亲和力。首先，使用固定用缓冲液(10mM乙酸钠，pH值4.5)将抗His抗体(思拓凡公司，28-9950-56)稀释成10μg/mL，依据Biacore T200附带的操作说明，固定于传感器芯片CM5上。通过使用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、和N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法进行固定，使用乙醇胺用于封闭(传感器芯片或固定化用试剂均来自思拓凡公司)。使用电泳缓冲液HBS-EP+(思拓凡公司)稀释人类EphA4胞外结构域-MBP-His10，泵送至流动池120秒并捕获(约3RU的捕获量)。随后，使用HBS-EP+将KPEP11_04、KPEP11_08或KPEP11_10连续稀释至50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625和0nM的范围以及将KPEP11_18连续稀释至25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125和0nM的范围，添加至传感器芯片120秒，依序观察添加时(结合相，120秒)、和添加结束后(解离相，300秒)的结合反应曲线。在各观察结束后，添加10mM甘氨酸盐酸pH1.5(60秒)和3M的MgCl2(30秒)，使传感器芯片再生。使用系统附带的BIA评价软件，通过1:1结合模型对所获得的结合反应曲线进行拟合分析，计算出对人类EphA4的结合亲和力(KD＝kd/ka)。实施三次上述实验，对各参数算出平均值。
将KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18对人类EphA4的结合亲和力(KD值)分别示于表12、表13、表14和表15。此外，图8示出了代表性的结合反应曲线。
[表12]
KPEP11_04的动力学参数
| ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | Rmax(RU) | Chi2(RU2) | |
| 第1次 | 2.332E+06 | 4.002E-03 | 1.716E-09 | 2.273 | 0.0038 |
| 第2次 | 1.782E+06 | 3.783E-03 | 2.124E-09 | 2.270 | 0.0050 |
| 第3次 | 2.078E+06 | 3.888E-03 | 1.871E-09 | 2.285 | 0.0044 |
| 平均值 | 2.06E+06 | 3.89E-03 | 1.90E-09 | 2.28 | 0.004 |
[表13]
KPEP11_08的动力学参数
| ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | Rmax(RU) | Chi2(RU2) | |
| 第1次 | 1.419E+06 | 2.140E-03 | 1.508E-09 | 2.812 | 0.0029 |
| 第2次 | 1.336E+06 | 2.225E-03 | 1.665E-09 | 2.578 | 0.0064 |
| 第3次 | 1.579E+06 | 2.144E-03 | 1.358E-09 | 2.641 | 0.0035 |
| 平均值 | 1.44E+06 | 2.17E-03 | 1.51E-09 | 2.68 | 0.004 |
[表14]
KPEP11_10的动力学参数
| ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | Rmax(RU) | Chi2(RU2) | |
| 第1次 | 1.440E+06 | 1.964E-03 | 1.364E-09 | 3.153 | 0.0039 |
| 第2次 | 1.577E+06 | 1.936E-03 | 1.228E-09 | 2.694 | 0.0061 |
| 第3次 | 1.530E+06 | 1.985E-03 | 1.298E-09 | 2.725 | 0.0043 |
| 平均值 | 1.52E+06 | 1.96E-03 | 1.30E-09 | 2.86 | 0.005 |
[表15]
KPEP11_18的动力学参数
| ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | Rmax(RU) | Chi2(RU2) | |
| 第1次 | 3.445E+06 | 1.275E-03 | 3.700E-10 | 3.089 | 0.0090 |
| 第2次 | 3.059E+06 | 1.274E-03 | 4.164E-10 | 2.650 | 0.0048 |
| 第3次 | 3.318E+06 | 1.266E-03 | 3.817E-10 | 2.861 | 0.0111 |
| 平均值 | 3.27E+06 | 1.27E-03 | 3.89E-10 | 2.87 | 0.008 |
实例7：抗人类EphA4单克隆抗体对人类Eph受体的选择性
针对KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10、KPEP11_18和抗EphA4多克隆抗体(义翘神州公司(Sino Biological))，依据以下的步骤进行人类Eph受体的结合活性的评价。将小鼠抗6-His抗体(R&D)涂布于96孔板(赛默科技公司)的孔上。在室温下孵育1小时或于4℃下孵育过夜后，利用1％ Block Ace(KAC公司)将孔在室温下封闭1小时或者于4℃下封闭过夜。利用0.02％ Tween20/PBS洗涤三次后，在各孔中接种人类的各Eph受体胞外结构域-His蛋白(Creative biomart公司，最终浓度1nM)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10、KPEP11_18或抗EphA4多克隆抗体(1μg/mL)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体(艾博抗公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤五次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育3-5分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(赛默科技公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
发现KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18与人类Eph受体家族的人类EphA4特异性地结合(图9)。
实例8：抗人类EphA4单克隆抗体对小鼠、大鼠、兔、猴和人类EphA4的反应性
依据以下的步骤产生小鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、大鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、兔EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、猴EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白和人类EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白。通过Genscript进行编码SEAP-His和小鼠EphA4胞外结构域、大鼠EphA4胞外结构域、兔EphA4胞外结构域、猴EphA4胞外结构域和人类EphA4胞外结构域的基因的合成。首先，将所合成的编码SEAP-His的基因克隆至pcDNA3.4载体(英杰公司/生命技术公司)。将所合成的小鼠EphA4胞外结构域、大鼠EphA4胞外结构域、兔EphA4胞外结构域、猴EphA4胞外结构域和人类EphA4胞外结构域的基因分别克隆至所构建的pcDNA3.4-SEAP-His表达载体，以构建小鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体、大鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体、兔EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体、猴EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体和人类EphA4胞外结构域-SEAP-His表达载体。将载体构建中利用的人类EphA4的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.1，将其胞外结构域表示为SEQ ID NO.2，将猴EphA4的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.113，将其胞外结构域表示为SEQ ID NO.114，将兔EphA4的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.115，将其胞外结构域表示为SEQ ID NO.116，将大鼠EphA4的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.117，将其胞外结构域表示为SEQ ID NO.118，将小鼠EphA4的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.119，将其胞外结构域表示为SEQ ID NO.120。使用人类EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体、猴EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体、兔EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体、大鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体和小鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白表达载体，制备各种EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白。使用Expi293表达系统(赛默科技公司)，将上述表达载体转染至Expi293F细胞(赛默科技公司)。四天后回收培养基，去除细胞并澄清化。使用TALON树脂(宝生物公司)进行纯化，通过透析将缓冲液置换为PBS(富士胶片和光纯药株式会社)。
针对KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10、KPEP11_18和EphA4多克隆抗体(义翘神州公司)，依据以下的步骤进行其与各种EphA4的结合活性的评价。将小鼠抗6-His抗体(R&D)涂布于96孔板(赛默科技公司)的孔上。在室温下孵育1小时或于4℃下孵育过夜后，利用1％Block Ace(KAC公司)将孔在室温下封闭1小时或者于4℃下封闭过夜。利用0.02％ Tween20/PBS洗涤三次后，在孔中接种小鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、大鼠EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、兔EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、猴EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白、人类EphA4胞外结构域-SEAP-His蛋白或SEAP-His蛋白(最终浓度1nM)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10、KPEP11_18或EphA4多克隆抗体(0、1.024e-6、0.00000512、0.0000256、0.000128、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10μg/mL)，并将其在室温下孵育约1小时。洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体(艾博抗公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤五次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育3-5分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(赛默科技公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10和KPEP11_18对猴和人类EphA4具有同等的结合活性(图10)。
实例9：抗人类EphA4单克隆抗体对人类EphA4胞外结构域、配体结合结构域、纤连
蛋白III型结构域1、纤连蛋白III型结构域2的反应性
依据以下的步骤产生人类EphA4的胞外结构域(ECD)、配体结合结构域(LBD)、纤连蛋白III型结构域1(FN1)或者纤连蛋白III型结构域2(FN2)与麦芽糖结合蛋白(MBP)和组氨酸标签融合而成的蛋白质(下文称为“人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白”、“人类EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白”、“人类EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白”、和“人类EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白”)。首先，构建pcDNA3.4-人类EphA4胞外结构域、配体结合结构域、纤连蛋白III型结构域1、或者纤连蛋白III型结构域2-MBP-His表达载体。首先，通过PCR扩增编码人类EphA4的信号序列(SEQ ID NO.121)或前胰蛋白酶原的信号序列(SEQ ID NO.122)与人类EphA4的各结构域的DNA序列，克隆至具有编码附有AAA或G4S接头的MBP和组氨酸标签的DNA序列的pcDNA3.4载体(英杰公司/生命技术公司)，从而构建人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白、人类EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白、人类EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白、和人类EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白的表达载体。将载体构建中利用的人类EphA4的氨基酸序列表示为SEQ ID NO.1，将其胞外结构域表示为SEQ ID NO.2，将配体结合结构域表示为SEQ ID NO.123，将纤连蛋白III型结构域1表示为SEQ ID NO.124，将纤连蛋白III型结构域2表示为SEQ ID NO.125，将MBP和组氨酸标签(MBP-His蛋白)表示为SEQ ID NO.126。使用Expi293表达系统(赛默科技公司)，将上述表达载体转染至Expi293F细胞(赛默科技公司)。四天后回收培养基，去除细胞并澄清化。使用TALON树脂(宝生物公司)将人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白或人类EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白进行纯化，通过透析将缓冲液置换成PBS(富士胶片和光纯药株式会社)。使用直链淀粉树脂(NEB)将人类EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白、和人类EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白进行纯化，并使用AKTA Explore10s/Superdex200 10/300GL(思拓凡公司)纯化单体级分。
针对KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10、KPEP11_18和EphA4多克隆抗体(义翘神州公司)，依据以下的步骤进行其与各种EphA4的结合活性的评价。将小鼠抗6-His抗体(R&D)涂布于96孔板(赛默科技公司)的孔上。在室温下孵育1小时或于4℃下孵育过夜后，利用1％Block Ace(KAC公司)将孔在室温下封闭1小时或者于4℃下封闭过夜。利用0.02％ Tween20/PBS洗涤三次后，在孔中接种人类EphA4胞外结构域-MBP-His蛋白、人类EphA4配体结合结构域-MBP-His蛋白、人类EphA4纤连蛋白III型结构域1-MBP-His蛋白、人类EphA4纤连蛋白III型结构域2-MBP-His蛋白或MBP-His蛋白(最终浓度1nM)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加KPEP11_04、KPEP11_08、KPEP11_10、KPEP11_18或EphA4多克隆抗体(10nM)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体(艾博抗公司)，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育3-5分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(赛默科技公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
KPEP11_04和KPEP11_18对人类EphA4胞外结构域(ECD)和配体结合结构域(LBD)具有结合活性。KPEP11_08和KPEP11_10对人类EphA4胞外结构域(ECD)具有结合活性(图11)。
实例10：基于夹心ELISA的对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液中的EphA4 N
末端片段的反应性1
针对KPEP11_10、KPEP11_18和EphA4抗体(R&D)，依据以下的步骤进行其对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液(CSF)中的EphA4 N末端片段的结合活性的评价。使用50mM Tris-HCl(pH7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_10制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_18和EphA4抗体(R&D)进行HRP标记。利用洗涤液(50mMTris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％ Tween 20/0.2％ Proclin 150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL、图中显示为EphA4)、或者进行了100倍稀释的样品(人类脑脊髓液)，并在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了10000倍稀释的HRP标记KPEP11_18或HRP标记EphA4抗体(R&D)各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
将评价对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果示于图12。与用KPEP11_10与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统相比，用KPEP11_10与HRP标记KPEP11_18构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域具有非常高的反应性。其次，将评价对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果示于图13。发现用KPEP11_10与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统中，几乎未获得反应信号，与此相对，使用KPEP11_10与HRP标记KPEP11_18构建的测量系统中，显示非常高的反应性。
实例11：基于夹心ELISA的对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液中的EphA4 N
末端片段的反应性2
针对KPEP11_10、KPEP11_18和EphA4抗体(R&D)，依据以下的步骤进行其对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液(CSF)中的EphA4 N末端片段的结合活性的评价。使用50mM Tris-HCl(pH7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_18制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_10和EphA4抗体(R&D)进行HRP标记。利用洗涤液(50mMTris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％ Tween 20/0.2％ Proclin 150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL，图中显示为EphA4)、或者进行了100倍稀释的样品(人类脑脊髓液)，并在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了10000倍稀释的HRP标记KPEP11_10或HRP标记EphA4抗体(R&D)各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
将评价对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果示于图14。作为使用KPEP11_18与HRP标记KPEP11_10构建的夹心ELISA，与使用KPEP11_18与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统相比，对人类EphA4胞外结构域具有非常高的反应性。其次，将评价对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果示于图15。可知使用KPEP11_18与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统中，几乎未获得反应信号，与此相对，使用KPEP11_18与HRP标记KPEP11_10构建的测量系统中，显示非常高的反应性。
实例12：基于夹心ELISA的对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液中的EphA4 N
末端片段的反应性3
针对KPEP11_10、KPEP11_04和EphA4抗体(R&D)，依据以下的步骤进行其对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液(CSF)中的EphA4 N末端片段的结合活性的评价。使用50mM Tris-HCl(pH7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_10制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_04和EphA4抗体(R&D)进行HRP标记。利用洗涤液(50mMTris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％ Tween 20/0.2％ Proclin 150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL，图中显示为EphA4)、或者进行了100倍稀释的样品(人类脑脊髓液)，并在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了10000倍稀释的HRP标记KPEP11_04或HRP标记EphA4抗体(R&D)各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
将评价对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果示于图16。作为使用KPEP11_10与HRP标记KPEP11_04构建的夹心ELISA，与使用KPEP11_10与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统相比，对人类EphA4胞外结构域具有非常高的反应性。其次，将评价对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果示于图17。可知使用KPEP11_10与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统中，几乎未获得反应信号，与此相对，使用KPEP11_10与HRP标记KPEP11_04构建的测量系统中，显示非常高的反应性。
实例13：基于夹心ELISA的对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液中的EphA4 N
末端片段的反应性4
针对KPEP11_08、KPEP11_18和EphA4抗体(R&D)，依据以下的步骤进行其对人类EphA4胞外结构域和人类脑脊髓液(CSF)中的EphA4 N末端片段的结合活性的评价。使用50mM Tris-HCl(pH7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_18制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_08和EphA4抗体(R&D)进行HRP标记。利用洗涤液(50mMTris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％ Tween 20/0.2％ Proclin 150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL，图中显示为EphA4)、或者进行了100倍稀释的样品(人类脑脊髓液)，并在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了10000稀释的HRP标记KPEP11_08或HRP标记EphA4抗体(R&D)各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
将评价对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果示于图18。作为使用KPEP11_18与HRP标记KPEP11_08构建的夹心ELISA，与使用KPEP11_18与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统相比，对人类EphA4胞外结构域具有非常高的反应性。其次，将评价对脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果示于图19。可知使用KPEP11_18与HRP标记EphA4抗体(R&D)构建的测量系统中，几乎未获得反应信号，与此相对，使用KPEP11_18与HRP标记KPEP11_08构建的测量系统中，显示非常高的反应性。
实例14：基于夹心ELISA的对人类EphA4胞外结构域、人类血浆中的EphA4 N末端片
段和人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性5
针对KPEP11_04、KPEP11_10、KPEP11_18、EphA4抗体(义翘神州公司，以下记为“EphA4抗体(Sino)”)和EphA4抗体(R&D)，依据以下的步骤进行其对人类EphA4胞外结构域、人类血浆中的EphA4 N末端片段和人类脑脊髓液(CSF)中的EphA4 N末端片段的结合活性的评价。使用50mM Tris-HCl(pH 7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_10制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mMTris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_04、KPEP11_18、EphA4抗体(Sino)和EphA4抗体(R&D)进行HRP标记。利用洗涤液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中分别接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％ Tween 20/0.2％ Proclin150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL，图中显示为EphA4)、进行了50倍稀释的人类血浆、或者进行了100倍稀释的人类脑脊髓液，并在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了50000倍稀释的HRP标记KPEP11_04、KPEP11_18、EphA4抗体(Sino)或EphA4抗体(R&D)各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
将评价对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果、评价对人类血浆中的EphA4 N末端片段的反应性的结果和评价对人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果示于图20、图21和图22。用KPEP11_10与HRP标记KPEP11_18构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域、人类血浆中的EphA4 N末端片段以及人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段均具有非常高的反应性。用KPEP11_10与HRP标记KPEP11_04构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域、人类血浆中的EphA4 N末端片段以及人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段均显示反应性。
实例15：基于夹心ELISA的对人类EphA4胞外结构域、人类血浆中的EphA4 N末端片
段和人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性6
针对KPEP11_08、KPEP11_10、KPEP11_18、EphA4抗体(Sino)和EphA4抗体(R&D)，依据以下的步骤进行其对人类EphA4胞外结构域、人类血浆中的EphA4 N末端片段和人类脑脊髓液(CSF)中的EphA4 N末端片段的结合活性的评价。使用50mM Tris-HCl(pH7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_18制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％Tween20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_08、KPEP11_10、EphA4抗体(Sino)和EphA4抗体(R&D)进行HRP标记。利用洗涤液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中分别接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％PEG 6000/0.01％ Tween 20/0.2％ Proclin150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL，图中显示为EphA4)、进行了50倍稀释的人类血浆、或者进行了100倍稀释的人类脑脊髓液，并在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了50000倍稀释的HRP标记KPEP11_08、KPEP11_10、EphA4抗体(Sino)或者EphA4抗体(R&D)各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
将评价对人类EphA4胞外结构域的反应性的结果、评价对人类血浆中的EphA4 N末端片段的反应性的结果和评价对人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的反应性的结果分别示于图23、图24和图25。用KPEP11_18与HRP标记KPEP11_08构建的夹心ELISA以及用KPEP11_18与HRP标记KPEP11_10构建的夹心ELISA对人类EphA4胞外结构域、人类血浆中的EphA4 N末端片段以及人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段均具有非常高的反应性。
实例16：基于ELISA和LC-MS的人类脑脊髓液中的EphA4N末端片段的定量分析以及
相关分析
基于LC-MS分析的定量分析
如下进行样品制备。作为标准曲线用的样品，使用利用aCSF(哈佛仪器公司(Harvard Apparatus))稀释成最终浓度500μg/mL的BSA(西格玛公司)溶液进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200ng/mL)各100μL。将50μL的脑脊髓液(CSF)样品与使用aCSF(哈佛仪器公司)稀释成最终浓度500μg/mL的BSA(西格玛公司)溶液50μL混合后，然后使其进行以下操作。依序添加在150μL的50mM TEAB(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))中溶解的10M脲溶液150μL、还有25μL的100mM DTT溶液。将混合溶液在37℃下孵育120分钟后，添加200mM碘乙酰胺(富士胶片和光纯药株式会社)25μL，然后在暗处下在室温将其孵育30分钟。随后，依序添加1250μL的EphA4-NTF-IS和10μL的胰蛋白酶溶液(200μg/mL)，并将其在37℃下孵育18小时。添加20％ TFA 80μL，以淬灭胰蛋白酶消化。使用Oasis HLB 96孔板(沃特世公司(Waters))如下进行样品纯化。将板用500μL的甲醇(富士胶片和光纯药株式会社)洗涤后，用500μL的0.1％ TFA(赛默飞世尔公司)进行平衡。应用上述所制备的样品并使其吸附在柱上后，利用500μL的0.1％ TFA进行洗涤。随后，添加200μL的洗脱液(0.1％ TFA-水中的80％乙腈(富士胶片和光纯药株式会社))，并回收洗脱液。将回收的洗脱液通过SpeedVac系统(赛默飞世尔公司)干燥，使用30μL的0.1％ TFA-水中的5％乙腈以获取最终的再构成溶液，并使该溶液进行LC-MS分析。
基于ELISA分析的定量分析1
人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量分析依据以下的步骤进行。使用50mMTris-HCl(pH 7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_10制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_18进行HRP标记。利用洗涤液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中分别接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％Tween 20/0.2％ Proclin 150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL，图中显示为EphA4)、或者进行了100倍稀释的人类脑脊髓液，并在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了50000倍稀释的HRP标记KPEP11_18各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
基于ELISA分析的定量分析2
人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量分析依据以下的步骤进行。使用50mMTris-HCl(pH 7.5)/0.1％叠氮化钠将KPEP11_18制备成最终浓度1μg/mL，并涂布于96孔板(能肯公司)的孔上各100μL。于4℃下孵育过夜后，利用封闭溶液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))，将孔在室温下封闭1小时以上或于4℃下封闭过夜。使用过氧化物酶标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)，依据附带的操作指南对KPEP11_10进行HRP标记。利用洗涤液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.01％ Tween 20)将封闭的板洗涤三次后，在孔中分别接种利用样品稀释液(50mM Tris-HCl(pH值7.5)/150mM NaCl/0.2％ EDTA-3Na/4％ PEG 6000/0.01％Tween 20/0.2％ Proclin 150(西格玛奥德里奇公司)/5％脱脂乳(富士胶片和光纯药株式会社))进行了连续稀释的人类EphA4胞外结构域(0、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10ng/mL，图中显示为EphA4)、或者进行了100倍稀释的人类脑脊髓液，并将其在室温下孵育2小时。洗涤五次后，添加利用样品稀释液进行了40000倍稀释的HRP标记KPEP11_10各100μL，并将其在室温下孵育1小时。洗涤三次后，于孔中添加TMBZ(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，KPL公司)溶液，并将其在室温下孵育30分钟。于孔中添加等量的淬灭溶液(2N H2SO4，富士胶片和光纯药株式会社)，通过酶标仪(分子装置公司)读取450nm和650nm处的吸光度。
将通过LC-MS分析的人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量结果与分析的人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量结果以及基于利用ELISA分析进行的定量分析1实施的相关分析的结果示于图26。在通过LC-MS定量的EphA4 N末端片段量与通过ELISA定量的EphA4 N末端片段量之间算出斯皮尔曼(Spearman)相关系数(r)，发现它们之间可见显著相关性(p<0.0001)。
将通过LC-MS分析的人类脑脊髓液中的EphA4 N末端片段的定量结果与基于利用ELISA分析进行的定量分析2实施的相关分析的结果示于图27。在通过LC-MS定量的EphA4 N末端片段量与通过ELISA定量的EphA4 N末端片段量之间算出斯皮尔曼(Spearman)相关系数(r)，发现它们之间可见显著相关性(p<0.0001)。
Claims (20)
1.一种抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
(a)如下重链，其包含由SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.53所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.56所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；
(b)如下重链，其包含由SEQ ID NO.64所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.65所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.67所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.68所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.69所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3；或者
(c)如下重链，其包含由SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.41所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
2.如权利要求1所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.52所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.53所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.56所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.57所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
3.如权利要求2所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
4.如权利要求2所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和
由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
5.如权利要求1所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.64所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.65所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.66所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.67所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.68所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.69所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
6.如权利要求5所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和
由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
7.如权利要求1所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
如下重链，其包含由SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列组成的重链CDR1；由SEQ IDNO.41所示的氨基酸序列组成的重链CDR2；和由SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列组成的重链CDR3；以及
如下轻链，其包含由SEQ ID NO.43所示的氨基酸序列组成的轻链CDR1；由SEQ IDNO.44所示的氨基酸序列组成的轻链CDR2；和由SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列组成的轻链CDR3。
8.如权利要求7所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含：
由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区，和
由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
9.如权利要求1至8中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段经标记。
10.一种用于产生抗EphA4抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括如下步骤：培养包含编码如权利要求1至8中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段的经分离的核酸的宿主细胞。
11.一种用于检测或定量生物样品中的人类EphA4的方法，该方法包括：使该生物样品与如权利要求1至8中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段接触。
12.如权利要求11所述的方法，其中该人类EphA4为人类EphA4的N末端片段。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中该生物样品为血液、血清、血浆、或脑脊髓液。
14.如权利要求11至13中任一项所述的方法，该方法进一步包括使该生物样品与如权利要求9所述的经标记的抗EphA4抗体或其抗原结合片段接触。
15.一种试剂盒，其用于检测或定量人类EphA4，且包含如权利要求1至9中任一项所述的抗EphA4抗体或其抗原结合片段。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中该人类EphA4为人类EphA4的N末端片段。
17.如权利要求15或16所述的试剂盒，其包含：
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
18.如权利要求15或16所述的试剂盒，其包含：
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
19.如权利要求15或16所述的试剂盒，其包含：
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及
如下抗EphA4抗体或其抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列组成的重链可变区、和由SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
20.如权利要求15至19中任一项所述的试剂盒，其中该试剂盒包含人类EphA4的N末端片段。
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