WO2006033413A1 - ペプチドの定量方法 - Google Patents

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WO2006033413A1
WO2006033413A1 PCT/JP2005/017528 JP2005017528W WO2006033413A1 WO 2006033413 A1 WO2006033413 A1 WO 2006033413A1 JP 2005017528 W JP2005017528 W JP 2005017528W WO 2006033413 A1 WO2006033413 A1 WO 2006033413A1
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WO
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polypeptide
peptide
amino acid
seq
acid sequence
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Application number
PCT/JP2005/017528
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Ueda
Tatsuya Shinoda
Original Assignee
Kyowa Medex Co., Ltd.
The University Of Tokyo
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Publication date
Application filed by Kyowa Medex Co., Ltd., The University Of Tokyo filed Critical Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority to JP2006536427A priority Critical patent/JPWO2006033413A1/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the present invention relates to a method for non-competitive detection and quantification of peptides.
  • VH region in the present invention
  • VL region the heavy chain variable region of a single monoclonal antibody
  • VH polypeptide and VL polypeptide present In the present invention, these are called VH polypeptide and VL polypeptide, respectively
  • One method is to immobilize the VL polypeptide on a solid phase, label the VH polypeptide with an enzyme or a fluorescent substance, and capture and quantify the antigen by the sandwich method.
  • peptides and VL polypeptides are labeled with two types of fluorescent substances having different fluorescence wavelengths and excitation wavelengths, and fluorescence resonance energy transfer caused by antigen capture is detected and quantified (see JP-A-10-78436).
  • the former is called an open sandwich ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) method.
  • the open sandwich ELISA method has the advantage that the measurement procedure is simpler and faster than the conventional method because the reaction between the antibody and the antigen is only one time (“Journal of immunological methods”).
  • the open sandwich method is a superior measurement method compared to conventional immunoassay methods. Only HyHEL-10 is known as a measurement example for force peptide molecules. In other words, it was not clear whether there was any measurement example showing that antigens of peptide molecules other than HEL can be measured by the open sandwich method.
  • the amino acids in HEL involved in the specific binding of HyHEL-10 and HEL are the 15th histidine, the 16th glycine, 19th asparagine, 20th tyrosine, 21st arginine, 63rd ⁇ dip fan, 73rd arginine, 75th leucine, 89th threon, 93 # asunoragin, 96 # Eye !; Gin, 97 # Eye !; Gin, 100 # Sejin, 101th Aspartate, 102nd Glycine, 103th Asparagine ("Journal 'Ob' Biological 'Chemistry (Journal of Biological Chemistry), (USA), 1999, No.
  • HyHEL-10 recognizes the tertiary structure of HEL, rather than using the continuous amino acid sequence of HEL as an epitope. Therefore, is there any actual measurement example that shows that the antigen peptide can be measured by the open sandwich method using a VH polypeptide or VL polypeptide derived from a monoclonal antibody having a sequence of consecutive amino acids of an antigen peptide as an epitope? It was unknown.
  • the antigen cannot be sandwiched by two antibodies at the same time, such as a low molecular weight compound, it cannot be measured by the usual sandwich ELISA method.
  • the open sandwich method can be used for non-competitive measurement because it can be sandwiched simultaneously with the VH and VL polypeptides of one antibody. It has been reported that the low molecular weight compound 4-hydroxy-3--tro-acetic acid can be measured by open-sandwich ELISA, and the force is more sensitive than the competitive method! 'Journal of immunological meth ods' (Netherlands), 1999, 224, p. 171–184).
  • Peptide epitopes are generally known to require a minimum of 6 to 10 amino acid residues when attempting to produce monoclonal antibodies against peptides.
  • osteocalcin is also referred to as bone Gla protein (BGP) or vitamin K-dependent calcium binding protein, and it has 49-50 amino acids that are biosynthesized by osteoblasts. It is a collagenic protein (molecular weight of about 6,000; human and ushi are 49, and rat is also composed of 50 amino acids, respectively), and is present in bone protein at about 1-2%. In the osteocalcin molecule, there are three ⁇ -carboxyglutamic acid residues (Gla residues; also present at positions 17, 21, and 24, counting the terminal force) and one S—S bond. Three Gla residues are thought to play an important role in binding to hydroxyapatite. Osteocalcin is a marker peptide that serves as an index of bone formation, and is also used for diagnosis of osteoporosis and bone metastasis of cancer.
  • An object of the present invention is to provide a non-competitive detection or quantification method for peptides, and a VH polypeptide or a VL polypeptide used in the method.
  • the present invention includes (1) a heavy chain variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to the peptide to be measured and uses a continuous sequence of the amino acid sequence of the peptide as an epitope and is variable in light chain.
  • a polypeptide that does not contain a region VH polypeptide
  • a polypeptide that contains the light chain variable region of the monoclonal antibody and does not contain the heavy chain variable region Non-competitive detection or quantification of the peptide to be measured, characterized by using (VL polypeptide), or (2) immobilizing either VH polypeptide or VL polypeptide on a solid phase.
  • the immobilized polypeptide is labeled, and the other is labeled with a labeling substance to form a labeled polypeptide.
  • the sample containing the peptide to be measured and the labeled polypeptide are brought into contact with the immobilized polypeptide, and the immobilized polypeptide.
  • VH polypeptide or VL polypeptide is labeled with a labeling substance to form a labeled polypeptide, and the other polypeptide and labeled polypeptide are used in the presence of a solid phase.
  • the labeling substance is a filamentous phage, an enzyme, a fluorescent substance or piotin, or the method according to (2) or (3) (5) VH polypeptide or VL polypeptide power A polypeptide to which a peptide (tag peptide) that is immunologically distinguished from VH polypeptide and VL polypeptide is added, and the VH polypeptide or VL polypeptide Immobilizing force on the solid phase
  • a VH polypeptide or VL polypeptide immobilized on a solid phase is a maltose-binding protein.
  • (7) The method described in (2) above, wherein (7) the VH polypeptide is labeled with a labeling substance 1 to form a labeled VH polypeptide, and the VL polypeptide is labeled with a different labeling substance 2 A labeled VL polypeptide is used, and the sample containing the peptide to be measured is brought into contact with the labeled VH polypeptide and the labeled VL polypeptide, and the amount of change in the interaction between labeled substance 1 and labeled substance 2 is detected.
  • the sequence according to any one of (1) to (9) above which is an antibody that specifically binds to a peptide that also has a sequence of 6 to 19 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (11)
  • Monoclonal antibody power The present invention relates to the method according to any one of (1) to (9) above, wherein the antibody specifically binds to a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the present invention also relates to (12) the method according to any one of (1) to (9) above, wherein the peptide to be measured is human osteocalcin, and (13) the peptide force to be measured.
  • the peptide to be measured is human osteocalcin, and (13) the peptide force to be measured.
  • it is a peptide comprising the amino acid sequence of 2 or human osteocalcin, which is a monoclonal antibody obtained by immunizing an animal using the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 as an antigen.
  • the method according to any one of (1) to (9) above, or (14) the peptide to be measured is a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or human osteocalcin, and the monoclonal antibody Power of [1] ⁇ [3] below!
  • CDRs 1, 2 and 3 of the heavy chain variable region comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 8, 9 and 10, respectively, and CDRs 1, 2 and 3 of the light chain variable region are SEQ ID NOs: 11, 12, and Monoclonal antibody containing 13 amino acid sequences
  • a monoclonal antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • a monoclonal antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • Antibody having a light chain variable region comprising
  • the peptide to be measured is a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or human osteocalcin, and the VL polypeptide is SEQ ID NO: 7.
  • the VH polypeptide is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the VL polypeptide is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • the method according to any one of 9) (19) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 and (20) a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 DNA or (21) a combination obtained by inserting the DNA described in (20) above containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 6 or (22) the DNA described in (20) or (21) above into a vector (23) a transformant obtained by introducing the recombinant vector described in (22) above into a host cell, or (24) a transformant described in (23) above in a culture solution.
  • a polypeptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 is produced and accumulated, and the culture fluid is collected.
  • the present invention relates to a method for producing
  • the present invention includes (25) a heavy chain variable region of a monoclonal antibody that specifically binds to the peptide to be measured and uses a continuous sequence of amino acid sequences of the peptide as a epitope, and includes a light chain variable region.
  • a polypeptide (VL polypeptide) comprising the light chain variable region of the monoclonal antibody and not the heavy chain variable region (VL polypeptide) Either a reagent for non-competitive detection or quantification of a peptide, or (26) either a VH polypeptide or a VL polypeptide is a labeled polypeptide labeled with a labeling substance and the other is on a solid phase.
  • the reagent according to (25) above which is an immobilized polypeptide, or (27) a polypeptide to which the immobilized polypeptide is added a tag peptide, wherein the immobilized polypeptide is immobilized.
  • Solid phase I spoon to have, and antibody immobilized I spoon to a solid phase specifically binds to the tag peptide and the tag peptide.
  • the reagent according to (26) above which is an immobilization via the binding of (28), (28) the reagent according to (26) above, wherein the immobilized polypeptide is a polypeptide to which a maltose binding protein is added, ( 29)
  • One of the VH polypeptide and VL polypeptide is a labeled polypeptide labeled with a labeling substance, the other is a polypeptide to which a tag peptide is added, and is a solid that specifically binds to the tag peptide.
  • the reagent according to (26) above which contains an antibody immobilized on a phase, and (30) of (26) to (29) above, wherein the labeling substance is a filamentous phage, enzyme, fluorescent substance or piotine.
  • the reagent according to item 1 or (31) a labeled VH polypeptide in which the VH polypeptide is labeled with the labeling substance 1, and a labeled VL polypeptide labeled with the labeling substance 2 in which the VL polypeptide is different.
  • the above (25) (32) The reagent according to any one of (25) to (31) above, wherein the VH polypeptide and VL polypeptide are gene recombination products, or (33) to be measured Monoclonal antibody strength S that specifically binds to a peptide and uses a continuous sequence of the amino acid sequence of the peptide as an epitope, and a peptide comprising an amino acid sequence of 6 to 19 consecutive amino acid sequences of the peptide as an antigen.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is continuous.
  • the reagent according to any one of (25) to (33) above which is an antibody that specifically binds to a peptide having a sequence strength of 6 to 19 amino acids, and (35) monoclonal antibody strength SEQ ID NO: 1 Or 2 amino acids
  • CDRs 1, 2 and 3 of the heavy chain variable region comprise the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 8, 9 and 10, respectively, and CDRs 1, 2 and 3 of the light chain variable region are SEQ ID NOs: 11, 12, and Monoclonal antibody containing 13 amino acid sequences
  • a monoclonal antibody having a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • a monoclonal antibody having a light chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7
  • (40) Peptide force to be measured The peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or osteocalcin, wherein the VH polypeptide is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the reagent according to any one of (33) and (41) the peptide to be measured is a peptide or human osteocalcin comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the VL polypeptide is SEQ ID NO: 7
  • the reagent according to any one of the above (25) to (33), or (42) a peptide comprising the amino acid sequence of the peptide force sequence number 1 to be measured or human osteocar The above (25), wherein the VH polypeptide is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and is a polypeptide comprising the amino acid sequence of the VL polypeptide SEQ ID NO: 7.
  • the VH polypeptide is a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • FIG. 1 shows the structure downstream of the promoter of the recombinant spFv phagemid vector pKST2ZKTM219.
  • FIG. 2 is a calibration curve of osteocalcin by ELISA using phage displaying VH polypeptide and VL polypeptide derived from KTM-219.
  • FIG. 3 is a calibration curve of osteocalcin by open sandwich ELISA using KTM-219-derived VH polypeptide and VL polypeptide.
  • FIG. 4 is a calibration curve of OC-1 peptide by open sandwich ELISA using KTM-219-derived VH polypeptide and VL polypeptide.
  • FIG. 5 is a calibration curve of OC-1 peptide by competitive inhibition ELISA using KTM-219.
  • FIG. 6 is a calibration curve for osteocalcin by sandwich E LISA using immobilized KTM-219 and labeled KTM-223.
  • FIG. 7 is a calibration curve for osteocalcin by sandwich E LISA using bound KTM-223 and labeled KTM-219.
  • FIG. 8 shows the downstream structure of the promoter of the VH-AP fusion protein expression plasmid pET-VH219-AP.
  • FIG. 9 shows the structure downstream of the promoter of MBP-VL fusion protein expression plasmid pMAL-VL219.
  • FIG. 10 is a calibration curve of osteocalcin (country) and OC-1 peptide ( ⁇ ) by open sandwich ELISA using KTM-219 VH-AP fusion protein and MBP-VL fusion protein.
  • the heavy chain variable of a monoclonal antibody that specifically binds to the peptide to be measured and uses a contiguous sequence of the amino acid sequences of the peptide as a epitope.
  • the method to be used is not particularly limited, and the kit for non-competitive detection or quantification of the peptide to be measured of the present invention specifically binds to the peptide to be measured, and A polypeptide (VH containing a heavy chain variable region and a light chain variable region of a monoclonal antibody whose epitope is a contiguous sequence of the amino acid sequence of the peptide. Polypeptide) and the light chain variable region of the monoclonal antibody and the heavy chain variable region.
  • peptide means a substance in which two or more amino acids are linked by peptide bonds, and is not particularly limited as long as it is a kit having a polypeptide (VL polypeptide). Also includes a polypeptide in which several tens or more amino acids are linked by peptide bonds.
  • VL polypeptide a polypeptide in which several tens or more amino acids are linked by peptide bonds.
  • a monoclonal antibody having an epitope as a continuous sequence of the amino acid sequence of the peptide to be measured.
  • the continuous sequence serving as an epitope is preferably a sequence of 6 to 19 amino acids.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the peptide to be measured used in the present invention and uses a continuous sequence of the amino acid sequence of the peptide as an epitope is prepared as an antibody produced from a hyperidoma, for example, as follows. be able to.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the peptide to be measured used in the present invention and that uses a continuous sequence of amino acid sequences of the peptide as an epitope can be prepared using, for example, the peptide to be measured directly as an immunogen.
  • the partial sequence of the peptide to be measured preferably the amino acid sequence of the peptide to be measured is preferably 5 or more and 30 or less, more preferably 5 or more and 20 or less, particularly preferably 6 or more and 19 or less amino acids.
  • a peptide containing the sequence is prepared as an immunogen.
  • the monoclonal antibody strength prepared by using as a immunogen a peptide containing a sequence of 6 or more, preferably 6 or more and 19 or less, in the N-terminal or C-terminal region of the amino acid sequence of the peptide to be measured.
  • the possibility of specifically binding to the peptide to be measured can be increased.
  • a chemical synthesis method As a method for producing a peptide serving as an immunogen, a chemical synthesis method, an enzyme method, a gene recombination method, etc. can be mentioned (for example, “Peptide and Protein Engineering, edited by Masahiko Fujino, Kodansha Scientific)”. However, chemical synthesis methods are preferably used. Peptide chemical synthesis is based on functional group In this method, peptides are synthesized by sequentially reacting protected amino acids. Generally, a liquid phase synthesis method and a solid phase synthesis method are known. In particular, in the solid phase synthesis method, synthesis by an automatic peptide synthesizer is possible.
  • the enzymatic method is a method in which peptide bond formation is performed by utilizing a reverse reaction of a proteolytic enzyme. Enzymatic methods are sometimes effective when several amino acids at the end of a peptide are changed.
  • an expression vector containing cDNA encoding an immunogen peptide is introduced into Escherichia coli (hereinafter referred to as E.col), yeast, insect cells, animal cells, and the like. And a method for obtaining a recombinant peptide.
  • E.col Escherichia coli
  • yeast yeast
  • insect cells insect cells
  • animal cells and the like.
  • a method for obtaining a recombinant peptide examples include a method in which PCR is performed using a primer containing a base sequence encoding the peptide.
  • a peptide having a sequence of 6 to 19 amino acids (hereinafter referred to as an OC epitope sequence) of the amino acid sequence of human osteocalcin (SEQ ID NO: 3), for example, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, is immunized.
  • an OC epitope sequence of the amino acid sequence of human osteocalcin (SEQ ID NO: 3)
  • SEQ ID NO: 3 an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2
  • non-competitive detection or quantification of the peptide containing the osteocalcin and the OC epitope sequence of the peptide used as the immunogen can be performed by the method of the present invention. it can.
  • a method of immunizing an animal with the peptide itself as an immunogen is also possible, but it is a more preferable embodiment to use a peptide conjugated with a carrier protein as an immunogen.
  • a carrier protein for example, rabbit serum albumin (hereinafter abbreviated as “BSA”), kimono hole “Limpet”, hemocyanin (hereinafter abbreviated as “KLH”) and the like are used.
  • the method of conjugating a peptide and a carrier protein can be performed by a reaction in which a covalent bond is formed between functional groups via a linker or not.
  • the functional group include a carboxyl group, a amide group, a glycidyl group, a thiol group, a hydroxyl group, an amide group, an imino group, a hydroxysuccinyl ester group, and a maleimide group. It is possible to carry out the reaction.
  • a coupling method without using a linker for example, 1-ethyl 3- (3-dimethylamino) is used. And a method using a carpositimide compound such as propyl) carposimide hydrochloride (hereinafter abbreviated as EDC). As a substance that enhances the reaction, N-hydroxysuccinimide (hereinafter abbreviated as NHS) or a derivative thereof can be used.
  • EDC propyl carposimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the linker may be any molecule as long as it binds the functional groups of the carrier protein and the side chain of the peptide to each other.
  • a first reactive group capable of reacting with an amino acid residue of a carrier protein and a second reactive group capable of reacting with a functional group of a side chain of a peptide are simultaneously used. It is preferable that the first reactive group and the second reactive group are different groups.
  • reactive groups include allylic azide, carbodiimide, hydrazide, hydroxymethyl phosphine, imide ester, isocyanate, maleimide, NHS-ester, pentafluorophenol (PFP) -ester, psoralen, pyridyl disulfide, bursulfone. And each reactive group.
  • a peptide having a cysteine at either the N-terminus or C-terminus of the peptide In order to efficiently perform conjugation with a carrier protein, it is also preferable to use a peptide having a cysteine at either the N-terminus or C-terminus of the peptide.
  • a method for synthesizing a peptide having a cysteine at the terminal the above-described chemical synthesis method, enzyme method, gene recombination method, or the like can be used.
  • the peptide and peptide conjugate protein thus obtained are used as immunogens in the production of the following antibody-producing cells.
  • screening of antibody-producing cells It can also be used as a standard substance in the confirmation of the monoclonal antibody produced, or in the detection method or quantification method of the peptide to be measured.
  • An animal such as a mouse, rat or hamster of 3 to 20 weeks of age is immunized with the immunogen prepared by the method described in (1) above, and antibody production in the spleen, lymph nodes and peripheral blood of the animal is produced.
  • Harvest cells An animal such as a mouse, rat or hamster of 3 to 20 weeks of age is immunized with the immunogen prepared by the method described in (1) above, and antibody production in the spleen, lymph nodes and peripheral blood of the animal is produced.
  • Immunization is performed by administering an immunogen together with an appropriate adjuvant into the animal subcutaneously, intravenously, or intraperitoneally.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide gel, Bordetella pertussis Kuching and so on.
  • the immunogen is administered, for example, 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. After each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, for example, on days 3 to 7, and serum is prepared. The amount of antibody that specifically binds to the antigenic peptide contained in the serum is measured by the enzyme immunoassay shown in (3) below. Check by law.
  • the source of antibody-producing cells is a mouse, rat or hamster whose serum shows a sufficient antibody titer against the immunogen used for immunization.
  • the spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster, and the spleen cells are collected.
  • the spleen is shredded in a medium such as MEM (minimum essential medium) or RPMI-1640, loosened with tweezers, centrifuged to settle the cells, the supernatant is discarded, and a buffer solution such as Tris Treat with salt-ammonium buffer (pH 7.65) or commercially available red blood cell lysis buffer for 1-2 minutes to remove erythrocytes, wash with the above medium and provide as antibody-producing cells.
  • MEM minimum essential medium
  • RPMI-1640 loosened with tweezers
  • a buffer solution such as Tris Treat with salt-ammonium buffer (pH 7.65) or commercially available red blood cell lysis buffer for 1-2 minutes to remove erythrocytes, wash with the above medium and provide as antibody-producing cells.
  • BSA-PBS PBS solution containing 1% BSA
  • Tween—PBS PBS containing detergent such as Tween 20
  • Tween-PBS add a substrate that develops color with the labeling enzyme of the second antibody, react, measure the absorbance with a plate reader, measure the color development, and use it as an indicator of the amount of antibody.
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used.
  • 8-azaguanine resistant mouse (BALBZc-derived) myeloma cell line P3—X63—Ag8—Ul (Curr. To p. Microbiol. Immunol, 81, 1-7, 1978), NSlZl—Ag4—l (Eur. J. Immunol, 6, 5 11-519, 1976), SP2 / 0—Agl4 (Nature, 276, 269-270, 1978), P3—X63—Ag8.653 (j.Immunol., 123, 1548—1550, 1979), P3-X63-Ag8 (Nature, 256, 495-49 7, 1975).
  • These cell lines contain 8 azaguanine medium (normal medium (RPMI-1640 medium with 1.5 mmol / L glutamine, 50 mol / L2-mercaptoethanol, 10 ⁇ g ZmL gentamicin and urinary fetal serum (FCS)).
  • the medium can be subcultured with a medium containing 15 gZmL8-azaguanine), etc. Passed to normal medium several days before cell fusion, and ensure that the number of cells is at least 7 x 10 6 on the day of fusion. Is preferred.
  • PEG-1000 polyethylene glycol 1000
  • MEM or RPMI-1640 medium dimethyl sulfoxide with stirring at 37 ° C.
  • the hybridoma corresponding to the selected culture supernatant is repeated 2 to 3 times by limiting dilution (first time is HT medium (with HAT medium power excluding aminopterin), and the second and subsequent times are normal. Use a medium], and select those with stable and strong antibody titers as anti-peptide monoclonal antibody-producing antibodies and hybridoma strains.
  • the culture supernatant of hybridoma When the culture supernatant of hybridoma was used as the measurement sample, no color was observed in the negative control well, color was seen in the positive control well, and the positive control well was in the well where the antigen peptide was dispensed. It can be confirmed that the culture supernatant in which color development is inhibited contains an antibody that specifically binds to the antigenic peptide.
  • pristane pristane, 2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane
  • 8 ⁇ obtained in (5) to LO-week old mice or nude mice
  • Hypridoma becomes ascites tumor in about 10-21 days.
  • This mouse also collects ascites and removes solids by centrifugation, followed by salting out with 40-50% ammonium sulfate, force prillic acid precipitation method, D EAE-Sepharose column, Protein A-column, gel filtration Purify using a column.
  • the subclass of the antibody can be determined by enzyme immunoassay using, for example, a subclustering kit.
  • the amount of protein can be determined by, for example, the Raleigh method or absorbance at 280 nm.
  • mouse monoclonal antibody KTM-219 obtained using as an antigen a partial peptide (OC-1 peptide) having the C-terminal 12 amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of human osteocalcin (SEQ ID NO: 1).
  • OC-1 peptide partial peptide having the C-terminal 12 amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of human osteocalcin
  • a mouse monoclonal antibody KTM-223 obtained using a peptide (OC-2 peptide) consisting of a sequence (SEQ ID NO: 2) with the cysteine added to the C-terminal of the N-terminal 13 amino acid sequence of human osteocalcin I can give you.
  • KTM-219 specifically binds to human osteocalcin and a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and has a continuous amino acid sequence from positions 38 to 49 of SEQ ID NO: 3 in the epitope. It binds specifically to a peptide containing ocalcin and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and has a continuous amino acid sequence at position 113 of SEQ ID NO: 3 in the epitope.
  • the binding of monoclonal antibodies to antigenic peptides is determined by the amino acid sequences of the VH and VL regions, and the amino acid sequences of complementarity determining regions (CDR) 1, CDR2 and CDR3 are particularly important.
  • Monoclonal antibody with the same amino acid sequence of the VH region of KTM-219, monoclonal antibody with the same amino acid sequence of the VL region of KTM-219, CDR1 of the VH region, CTM A monoclonal antibody in which the amino acid sequence of DR2 and CDR3 is the same as that of CDR1, CDR2, and CDR3 in the VH region of KTM—219.
  • the amino acid sequence of CDR1, CDR2, and CDR3 in the VL region is VL of KTM—219.
  • a monoclonal antibody with the same amino acid sequence as CDR1, CDR2, and CDR3 in the region detects or quantifies the OC-1 peptide and osteocalcin of the present invention, as in KTM-219. It can be used in the preparation of the VH polypeptide and VL polypeptides for use in that method.
  • the monoclonal antibody having the same amino acid sequence in the VH region of the VH region as the amino acid sequence in the VH region of the VTM region the monoclonal antibody having the same amino acid sequence in the VL region of the VL region as the amino acid sequence in the VH region, CDR1 , CDR2 and CDR3 amino acid sequence power KT M— Monoclonal antibody identical to the CDRH, CDR2 and CDR3 amino acid sequences of 223 VH region, VL region CDR1, CDR2 and CDR3 amino acid sequence strength KTM — 223 VL region
  • the VH polypeptide means a polypeptide containing the antibody VH region and not the VL region
  • the VL polypeptide means a polypeptide containing the antibody VL region but not the VH region.
  • the VH polypeptide that can be used in the present invention may be any polypeptide that has a VH region and does not have a VL region.
  • the polypeptide may be any polypeptide as long as it has a VL region and does not have a VH region. That is, the VH polypeptide or VL polypeptide may contain all or part of the constant region that is a part other than the variable region, which may be part of the antibody. However, when it contains a part other than the variable region, the cysteine residue that forms the disulfide bond between the heavy chain (H chain) and the light chain (L chain) can be converted to another amino acid by the method described later. preferable.
  • VH polypeptide or VL polypeptide in which a peptide (hereinafter referred to as a tag peptide) immunologically distinguished from the VH polypeptide or VL polypeptide is added to the VH region or VL region. Since the VH region or VL region is a variable region part of an antibody, in the present invention, the VH polypeptide and VL polypeptide may be collectively referred to as a variable region polypeptide.
  • the combination of the VH polypeptide and the VL polypeptide suitable for the method of detecting or quantifying the peptide of the present invention can include, for example, a combination of the VH polypeptide and VL polypeptide derived from the monoclonal antibody KTM-219. .
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 which is the amino acid sequence of the VH region of KTM-219 or the amino acid sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of the VH region of KTM-219, SEQ ID NO: A VH polypeptide derived from a monoclonal antibody containing the amino acid sequences of 8, 9 and 10 as the CDR1, CDR2 and CDR3 sequences of the VH region, and (ii) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 which is the amino acid sequence of the VL region of KTM-219 A polypeptide containing the sequence or the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 11, 12, and 13, which is the amino acid sequence of 1 ⁇ -219 in the $ 1 ⁇ region, CDR2 and CDR3, and CDR1, CDR2 and CDR3 A combination of monoclonal antibody-derived VL polypeptides included as a sequence of These VH polypeptides and polypeptides can be used in the method of
  • VH polypeptide and L polypeptide derived from KTM-219 can be obtained by a genetic recombination technique as described later.
  • SpFv phagemid vector P KST2 / KTM219 for prokaryotic expression of VH polypeptide and VL polypeptide derived from KTM—219 is a National Institute of Advanced Industrial Science and Technology based on the Budapest Treaty as of September 14, 2004. It has been deposited as FERM BP-10120 at the Biological Depositary Center (T305-8566, Tsukuba Sakai Higashi 1-chome, 1-chome, 1-Chuo 6th).
  • variable region polypeptide can be prepared from a monoclonal antibody.
  • Variable region polypeptides can be produced by using an appropriate protease to separate the VH and VL polypeptides. Endopeptidase is suitable as the protease.
  • the disulfide bond can be cleaved by treating with a reducing agent to separate the VH and VL polypeptides. Examples of reducing agents include 2-mercaptoethanol dithiothreitol.
  • Another embodiment for separating VH and VL polypeptides is to form a disulfide bond between the H and L chains, within the H or L chain! /, Conversion of one or both cysteine residues to another suitable amino acid residue.
  • amino acids for example, neutral amino acids such as serine, glycine, and alanine are suitable.
  • mRNA is obtained from a hybridoma producing a peptide-specific monoclonal antibody, and then an antibody containing a VH region or a VL region is obtained from the mRNA.
  • Prepare cDNA that encodes part of the antibody convert the cysteine codon that forms the disulfide bond between the H and L chains to another appropriate amino acid codon by a known method, and convert this VH region.
  • it can be produced by introducing and expressing an antibody containing a VL region or cDNA encoding a part of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, respectively.
  • 3 ⁇ 4 paper (Rule 91)
  • any method can be used as long as it can accurately introduce a base substitution into a desired codon, but a method using PCR is preferable.
  • a more preferred embodiment for producing the variable region polypeptide of the present invention is a method for producing it as a gene recombination product.
  • mRNA is obtained from a hybridoma producing a peptide-specific monoclonal antibody, and then a fragment containing the VH region of cDNA encoding the H chain from the mRNA, and the VL region of cDNA encoding the L chain are included.
  • the fragment is cloned and inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector to prepare a recombinant vector, and a host cell is transformed with the recombinant vector.
  • the transformant is cultured, and the VH polypeptide or VL polypeptide is expressed and produced and accumulated in the culture, and the VH polypeptide or VL polypeptide accumulated in the culture is collected. Can be manufactured.
  • PCR is suitable as a method for cloning the cDNA. Since the N-terminal region of the VH region and VL region is a framework region (FR), the cDNA sequences are relatively conserved if they are of the same class of the same animal species. Therefore, degenerate primers based on the conserved 17-30 nucleotide sequence can be designed as a forward primer. Such degenerate primers include DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 or 15 corresponding to the FR1 sequence of mouse IgG, and SEQ ID NO: 17 or 20 corresponding to the FR1 sequence of mouse ⁇ chain.
  • a reverse primer can be designed based on the sequence of the constant region.
  • Such reverse primers include DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 corresponding to the sequence of the constant region of mouse IgGl, and D consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 corresponding to the sequence of the constant region of mouse ⁇ chain. NA.
  • the ability of hybridomas to produce peptide-specific monoclonal antibodies can also be obtained from RNA, synthesized from this RNA using reverse transcriptase, and reverse-transcribed using the resulting cDNA as a cage.
  • Perform PCR (RT—PCR) using the forward and reverse primers described above. Isolation of RNA from wild hybridoma f, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, old spring Harbo r It can be performed based on the description of laboratory documents such as Laboratory Press, 2001.
  • RT—PCR can be performed based on the description of experimental documents such as “Loning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold bpnng Haroor Laboratory Press, 2001”. Also, use a kit such as QIAGEN OneStep RT-PCR Kit.
  • PCR methods include NASBA (Kaynos), TMA (Bayer Medical), SDA (strand displacement amplification) (Betaton Dickinson), ICAN (Takara Shuzo), LAMP (Loop-mediated) Use a series of methods called isothermal PCR, such as Isothermal Amplification (Eiken Chemical Co., Ltd.), or variations of these methods.
  • Isothermal Amplification Eiken Chemical Co., Ltd.
  • an expression vector one that can autonomously replicate in a host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter capable of transcribing DNA force mRNA encoding a variable region polypeptide in the host cell is used.
  • any strain that can express a variable domain polypeptide such as a prokaryote, a yeast, an animal cell, an insect cell, or a plant cell, can be used.
  • the expression vector is capable of autonomous replication in the host prokaryote, and a promoter and a DNA encoding a ribosome binding sequence and a variable region polypeptide downstream thereof are used. Use the one that has the crawling site to be inserted. Although not always necessary, it is preferable to place a transcription termination sequence immediately after the cloning site. In addition, for selection of transformants, a sequence that expresses the best gene such as a drug resistance gene should be included. Insert the DNA encoding the variable region polypeptide into the cloning site downstream of the ribosome binding sequence. It is preferable that the distance between the ribosome binding sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases in the case of an E. coli host vector).
  • the promoter may be any as long as it can be expressed in the host cell.
  • E. coli when E. coli is used as the host, trp promoter, lac promoter, PL promoter Promoters derived from E. coli and phage, such as promoters, T7 promoters and PR promoters.
  • artificially modified promoters such as a promoter in which two trp promoters are connected in series, a tac promoter, a T71ac promoter, a letl promoter, and the like can be used.
  • Bacillus subtilis When Bacillus subtilis is used as a host, the promoters of Bacillus subtilis, such as SPOl and SP02, and the PenP promoter can be mentioned.
  • Examples of expression vectors include pGEMEX-l (Promega), pQE-30 (Kagen), PKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem “53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pTrS 30 [E.coli JM109 / pTrS30 (FERM BP-5407) Preparation], pGEX-5X-3 (Amersham's Biosciences), ⁇ ⁇ 14 (Novagen), pPROTet. E (Clontech) pRSET A (Invitrogen) and the like can be exemplified.
  • host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Syudomonas, etc., for example, E.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • the electoral position method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988) ]
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982)]
  • protoplast method [JP-A 63-248394; Mol. Gen. Genet ., 168, 111 (1979)].
  • a phagemid vector having a DNA replication base of filamentous butterophage such as M13 phage or fl phage can also be used.
  • a thread-replacement vector is introduced using E. coli having F factor as a host.
  • the DNA encoding the variable region polypeptide is linked to the DNA encoding the phage coat protein to express a fusion protein of the variable region polypeptide and the coat protein.
  • infection with helper phage can also release phage particles displaying the variable region polypeptide on the surface in the culture solution.
  • the phage particle itself can be used as a variable region polypeptide labeled with phage for the detection or quantification of the peptide described later in 3. by the open sandwich method.
  • Expression vectors when yeast is used as a host cell include promoters that perform transcription in the host yeast, transcription termination sequences, and genes that serve as transformation markers in yeast, such as drug resistance genes, TRP1, HIS3, Those containing a sequence capable of expressing an amino acid synthesis gene such as LEU2 are used. Also, in order to facilitate the creation and maintenance of expression vectors, those that can express drug resistance genes that serve as autonomous replication and gene transfer markers are also preferred in E. coli.
  • any promoter can be used as long as it can perform transcription in yeast.
  • promoters such as Saccharomyces cerevisiae anoleconole dehydrogenase gene AD Hl, galactose metabolic system genes GAL1 and GAL10, etc.
  • Acid phosphatase gene PH05 promoter Acid phosphatase gene PH05 promoter, phosphoglycerate kinase gene PGK promoter, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene GAP promoter, heat shock protein gene promoter, ⁇ -mating factor gene MF a 1 promoter, copper metamouthoneine gene CUP1 A promoter, the promoter of Pichiapastoris alcohol oxidase gene AOX1, and the like are used.
  • Saccharomyces As the host cell, Saccharomyces, Schizosaccharomyces genus, it is possible to increase the yeast strain belonging to the genus Pichia and the like, specifically, Saccharomyces cerevisiae ⁇ Schizosacch aromycespombe, it opens the Pichia pastoris such as force 21 e Monkey.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it introduces DNA into yeast.
  • the electopore position method [Methods EnzymoL, 194, 182 (1991)]
  • the spheroplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)]
  • lithium acetate Method [J. BacterioL, 153, 163 (1983)] and the like.
  • an expression vector containing a promoter for transcription in the host animal cell and a signal sequence for termination of transcription and polyadenylation of the transcript is used. Also, in order to facilitate the production and maintenance of vectors, it is desirable to be able to express drug resistance genes that serve as autonomous replication and gene transfer markers in E. coli.
  • any promoter can be used as long as it can transcribe in animal cells, but the SV40 early promoter, the human cytomegalovirus IE (immediate early) gene promoter and Enhancer, Rous sarcoma quinores, Human T-cell leukemia virus I, retrovirus LTR and other virus-derived sequences such as Moro-1 mouse leukemia virus, or promoters of genes derived from animal cells such as the metamouthonein gene,
  • promoters obtained by artificially combining these promoters such as the SRa promoter that combines the SV40 early promoter and the human T-cell leukemia virus I LTR, are also used.
  • a constitutive variable region polypeptide-expressing cell in which a DNA encoding a variable region polypeptide is incorporated into host chromosomal DNA is a variable region polypeptide comprising a sequence capable of expressing a gene resistant to drugs such as G418 and hygromycin.
  • the expression vector can be selected by introducing it into a host cell and culturing it in the presence of a drug.
  • a constant expression vector of the variable region polypeptide containing a sequence capable of expressing the dihydrofolate reductase (dhfr) gene is introduced into the host cell.
  • the copy number of the DNA encoding the variable region polypeptide can be amplified together with the dhfr gene.
  • a host cell for performing gene amplification using this dhfr gene a cell, such as CHOZdhfr— (ATCC: CRL-9096), which is capable of functioning dhfr gene, is used.
  • Specific expression vectors include, for example, pEGFP-C2 (Clontech), Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, silkworm nuclear polyhedrosis virus and the like are used.
  • Insect cells include Spodopterafrugiperda cells Sf 9 and Sf 21 [Baculovirus Expressi on Vectors: A Laboratory Manual, WH Freeman and company, New York (1992)], Trichoplusia ni cells High5 (manufactured by Invitrogen), etc. Can be used.
  • the transfer vector includes a polyhedrin promoter and a baculovirus-derived sequence for causing homologous recombination, and a sequence for carrying out genetic manipulation such as maintenance / propagation of the vector and integration of foreign genes in E. coli. (An autonomously replicable sequence in E.
  • Host cells include HeLa, which is a human cell, Namalwa, 293, COS-1 and COS-7, which are African green monkey kidney cells, CHO and BHK, which are hamster cells, and mouse fetal cells. Examples include cell lines such as NHI3T3, mouse myeloma cells SP2Z0 and NS0, and rat myeloma cells YB2Z0.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnol., 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate And the ribofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • baculovirus expression system Bactet al. (1985)
  • Baculovirus Expression Vectors A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1 992); Bio / Technology, 6, 47 (1988)] Is used. That is, after inserting a DNA encoding a variable region polypeptide into a transfer vector, the vector and baculovirus are simultaneously introduced into an insect cell, and a DNA encoding a variable region polypeptide under the polyhedrin gene promoter, which is a strong promoter.
  • variable region polypeptide can be expressed by infecting insect cells again with this recombinant baculovirus.
  • baculoviruses include Autographa californica nuclear polyhedrosis virus and silkworm nuclear polyhedrosis virus. Insect cells include Spodoptera frugiperda cells S19 and S12l LBaculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusia ni cells High5 (manufactured by Invitrogen), etc. Can be used.
  • the transfer vector includes a polyhedrin promoter and a baculovirus-derived sequence for causing homologous recombination, and a sequence for carrying out genetic manipulation such as maintenance of the vector and propagation of foreign genes and integration of foreign genes (E. coli Examples include pVL1392, pVL1393, pBlueBac4.5 (both manufactured by Invitrogen), pBac PAK9 (manufactured by Clontech), and the like.
  • variable region polypeptide In order for the variable region polypeptide to retain specific binding to the antigenic peptide as an immunogen, it encodes a polypeptide in which a signal peptide of a secretory protein is added to the N-terminus of the variable region polypeptide.
  • a recombinant expression vector by inserting a sequence encoding a signal peptide between a sequence encoding a promoter and a variable region polypeptide.
  • a transformant introduced with such a recombinant expression vector secretes a variable region polypeptide from which the signal peptide has been cleaved and removed into the culture medium.
  • the N of the fusion protein when expressing a fusion protein between a variable region polypeptide described below and a polypeptide other than an antibody, if the polypeptide other than the antibody is a protein on the cell membrane or a phage coat protein, the N of the fusion protein By constructing a recombinant expression vector that encodes a polypeptide with a signal peptide at the end, the fusion protein is displayed on the cell surface of the phage particles that have been transformed or transformed.
  • the signal peptide it is preferable to use a prokaryotic secreted protein or membrane protein when the host is prokaryotic, and a eukaryotic secreted protein or a signal peptide of membrane protein when the host is eukaryotic.
  • variable region polypeptide in which a tag peptide is added to the VH region or VL region, that is, a fusion protein of the tag peptide and the variable region polypeptide, an antibody against a cDNA fragment encoding the variable region polypeptide is used.
  • a method of adding and expressing cDNA encoding a polypeptide other than the above is preferred.
  • the tag peptide a desired peptide can be selected, and it is preferable to select a polypeptide in order to improve the performance of the embodiment of the present invention.
  • Performance includes, for example, improving the sensitivity of the measurement method of the present invention, improving stability, improving reproducibility, simplifying the operations used in the present invention, shortening the operation time, For example, it is easy to change the necessary experimental equipment to a simple one, to facilitate the recovery and purification of the fusion protein, and to enable fixation to a solid phase.
  • the variable region polypeptide labeling substance is a polypeptide
  • a fusion protein of the variable region polypeptide and the labeling polypeptide can be produced in the same manner. It can be used as a variable region polypeptide labeled with a fusion protein.
  • MBP maltose binding protein
  • GST dartathione S transferase
  • purified antibody VH with the addition of a VH polypeptide or VL polypeptide fusion protein, or a histidine repeat structure (generally histidine hexamers are used), a purified antibody epitope peptide, etc.
  • examples include polypeptides or VL polypeptides.
  • fusion protein expression systems include, for example, the PinPointTM Xa Protein Purification System (Promega), which uses a piotin-tagged fusion protein expression system, and a bio-ease expression system that uses a sequence in which a specific lysine residue is biotinylated. (Invitrogen), Impact CN system or Impact TWIN system (Daiichi Kagaku) expressed as a fusion protein with chitin-binding protein.
  • the detection or quantification method of the present invention can be constructed without purifying the fusion protein.
  • an amber codon may be placed between the gene containing the VH polypeptide or VL polypeptide and the phage surface protein, and transformed into a non-suppressor strain, E. coli, to be expressed as a soluble protein. It is possible.
  • a microorganism or animal cell-derived transformant having a recombinant vector incorporating a DNA encoding a variable region polypeptide is cultured according to a normal culture method to produce and accumulate the variable region polypeptide, and the culture.
  • a variable region polypeptide can be produced by collecting a variable region polypeptide.
  • a medium for culturing a transformant using an animal cell as a host a commonly used RPMI 1640 medium [J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)], Eagle's ME M (Mimimum Essential Medium) [Science, 122, 501 (1952)], Danolecco modified Eagle medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to these mediums can be used.
  • an antibiotic such as penicillin or streptomycin may be added to the medium. Cultivation usually takes 1-7 days under conditions of pH 6-8, 30-40 ° C, 5% CO, etc.
  • a medium for culturing a transformant obtained by using insect cells as host cells a commonly used TNM-FH medium (manufactured by Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Invitrogen) Excell400, ExCell405 (all manufactured by JRH Biosciences), Grace's insect medium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
  • the culture conditions are as follows: pH 6-7, culture temperature 25-30 ° C.
  • the culture time is usually 1-5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryotic organism such as E. coli or a eukaryotic microorganism such as yeast as a host a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, etc. that the organism can assimilate are used. Any of a natural medium and a synthetic medium may be used as long as it is a medium that can efficiently cultivate transformants.
  • the carbon source may be glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolyzate, acetic acid, propionic acid, etc. as long as the organism can assimilate. Alcohols such as organic acids, ethanol, and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphates such as ammonium phosphates, and others. Nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • dipotassium hydrogen phosphate potassium dihydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride salt, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. are used. be able to.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the culture period of 15 to 40 ° C is usually 16 to 96 hours.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, or aqueous ammonia. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture period.
  • an inducer may be added to the medium as needed during the culture.
  • inducers include isopropyl galactoside that induces the lac promoter, indole acrylic acid that induces the trp promoter, and the like.
  • variable region polypeptide accumulated in the transformant culture In order to isolate and purify the variable region polypeptide accumulated in the transformant culture, the following normal protein isolation and purification methods can be used.
  • variable region polypeptide When the variable region polypeptide is secreted extracellularly, the variable region polypeptide accumulates in the medium. Therefore, after completion of the culture, collect only the medium that does not contain cells by a method such as centrifugation. From this medium, ordinary protein isolation and purification methods, that is, solvent extraction methods, salting out methods such as ammonium sulfate, desalting methods, precipitation methods using organic solvents, DEAE Sepharose, DIAI ON HP A-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) ), Mono-Q (Mono Q, manufactured by Amersham Biosciences) and other anion exchange chromatography methods, and resin such as SP Sepharose (Amersham 'Biosciences) Hydrophobic chromatograph using resin such as cation exchange chromatography method, butyl sepharose, ferrule sepharose Single methods, gel filtration methods using molecular sieves, affinity chromatography methods, chromatophoretic singing methods, and electrophoresis methods such as isoelectric focusing
  • variable region polypeptide When the variable region polypeptide accumulates in the cells of the transformant, the cells of the transformant are recovered from the culture after completion of the culture by a method such as centrifugation, and suspended in a buffer solution. Thereafter, the cells are crushed by an ultrasonic crusher, a French press or the like to obtain a cell-free extract.
  • a purified sample is obtained from the supernatant obtained by centrifuging the cell-free extract in the same manner as in the purification and isolation from the medium described above. Can be obtained.
  • variable region polypeptide When the variable region polypeptide is present in the form of an insoluble substance in the cell, the cell-free extract is centrifuged, and the insoluble substance of the variable region polypeptide is recovered as a precipitate fraction. After solubilizing the insoluble matter of the variable region polypeptide with a protein denaturing agent, the solubilized solution is diluted to such an extent that the protein denaturing agent does not denature, or does not contain a protein denaturing agent. Alternatively, after dialyzing into a dilute solution to the extent that the protein denaturant does not denature the protein, the variable region polypeptide is restored to its normal three-dimensional structure, and then the purified sample is isolated by the same isolation and purification method as above. Obtainable.
  • Variable region polypeptides can be produced using a translation system. That is, DNA encoding a variable region polypeptide is ligated downstream of a promoter such as SP6, T7, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3, etc., and RNAs encoding a large amount of variable region polypeptide are reacted in vitro by reacting with a specific RNA polymerase of each promoter. After synthesis, the variable region polypeptide can be produced using a cell-free translation system, for example, a translation system using a rabbit reticulocyte lysate lye wheat germ extract.
  • a promoter such as SP6, T7, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3, etc.
  • variable region polypeptide The structure analysis of the purified variable region polypeptide is described in a method commonly used in protein chemistry, for example, "Protein structure analysis for gene cloning" (Hirano Hisashi, published by Tokyo Kagaku Dojin, 1993). This method can be implemented.
  • Peptide detection or quantification method and detection or quantification kit As described above, the method for detecting or quantifying a peptide of the present invention and the kit for detecting or quantifying a peptide specifically bind to the peptide to be measured, and the peptide sequence of the amino acid sequence of the peptide is an epitope.
  • the kit is not particularly limited as long as it is a non-competitive detection or quantification kit. For example, open sandwich ELISA method, homogenous open sandwich method using two kinds of labeling substances, and kits therefor are listed. .
  • a VH polypeptide or a VL polypeptide (hereinafter referred to as a first variable region polypeptide) is used as a solid phase in order to capture the peptide to be measured on the solid phase.
  • the other (hereinafter referred to as the second variable region polypeptide) is labeled to detect the peptide to be measured.
  • the peptide to be measured is divided into a first variable region polypeptide immobilized on a solid phase (an immobilized polypeptide) and a second labeled variable region polypeptide (labeled polypeptide).
  • the peptide to be measured can be detected or quantified by detecting or quantifying the labeling substance of the labeling polypeptide bound to the immobilized polypeptide via the peptide to be measured. Is possible.
  • the contact of the peptide to be measured with the immobilized polypeptide and the contact of the labeled polypeptide with the peptide to be measured can be performed sequentially rather than simultaneously.
  • the first variable region polypeptide and the second variable region polypeptide labeled (labeled polypeptide) should be measured in the presence of a solid phase.
  • a complex consisting of the solid phase, the first variable region polypeptide, the labeled polypeptide and the peptide to be measured is formed, and at the same time, the first variable region polypeptide is immobilized in the same phase.
  • Another example is a method for detecting or quantifying the peptide to be measured by detecting or quantifying the labeled substance of the complex bound to the solid phase.
  • a method for immobilizing the first variable region polypeptide on the solid phase for example, a variable region polypeptide to which a tag peptide is added is used as the first variable region polypeptide, and the tag vector is used as the solid phase.
  • MBP maltose binding protein
  • the open sandwich ELISA can be performed by the following procedure. After the first variable region polypeptide is immobilized on the solid phase, it is blocked with a blocking agent. After discarding the blocking agent and thoroughly washing with a washing solution, add a peptide preparation with a known concentration or a test sample with an unknown concentration to react. After thoroughly washing with the washing solution, the second variable region polypeptide labeled with the labeling substance is reacted. After washing again with a washing solution, a reaction according to the labeling substance is performed. The concentration of the test sample can be calculated from a calibration curve prepared by serially diluting peptide standards with known concentrations.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the peptide to be measured and uses the continuous amino acid sequence of the peptide as an epitope VH polypeptide, a VL polypeptide derived from the monoclonal antibody, a carrier as a solid phase for immobilizing the first variable region polypeptide, a solid phase on which the first variable region polypeptide is immobilized ( First variable region polypeptide immobilized on a solid phase), labeled second variable region polypeptide used for detection, or labeled VH polypeptide labeled with labeling substance 1 and labeling substance 2 Labeled VL polypeptide, etc., and if necessary, a blocking agent, a biological sample diluent, a reaction buffer solution, a washing solution, a labeling substance detection reagent or It may be in the form of a kit containing the standard substance of the peptide.
  • labeling substance examples include enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, radioisotopes, piotin, digoxigenin, filamentous phage, and polypeptides containing tag sequences.
  • any known enzyme label (edited by Yuji Ishikawa et al., Enzyme immunoassay, Medical School) can be used.
  • alkaline phosphatase peroxidase
  • galactosidase galactosidase
  • glucuronidase glucuronidase
  • luciferase luciferase
  • any known (Akira Kawaio, fluorescent antibody method, Soft Science) firefly A light material can be used.
  • FITC tag, RITC tag, etc. can be used.
  • other fluorescent materials include quantum dots (Science, 281,2016-2018, 198).
  • a fluorescent protein such as phycoerythrin protein such as phycoerythrin, GFP (Green Fluorescent Protein), RFP (Red fluorescent Protein), YFP (Yellow fluorescent Protein;, BFP (Blue fluorescent Protein), or related proteins thereof. It may be white matter.
  • any known luminescent material label [Kazuhiro Imai, Bioluminescence and Chemiluminescence, Yodogawa Shoten; Clinical Examination 42 (1998)] can be used.
  • ataridium and its derivative label ruthenium complex compound label, mouth fin label and the like can be used.
  • the ruthenium complex compound is preferably the one shown in Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539 (1991). This compound emits electrochemically together with an electron donor.
  • radioisotope Any known substance can be used as the radioisotope.
  • 14 C, 35 S, 32 P, 33 P, 125 I, 51 Cr and the like can be mentioned.
  • Examples of low molecular weight compounds include piotin and digoxigenin.
  • Examples of filamentous phages include M13 phage and fl phage.
  • Examples of polypeptides containing a tag sequence include FLAG peptide (FLAG tag, Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Asp Lys), polyhistidine (His tag, His His His His His His), myc epitope peptide (myc tag, Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu), hemagglutinin peptide top peptide (HA tag, Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala).
  • a genetic binding method or a chemical binding method is used as a method for labeling the variable region polypeptide with the above-mentioned labeling substance.
  • the genetic engineering method should be performed according to the method described in the literature (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974, 1996; Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 93, 7826, 1996). Can do.
  • the chemical bonding can be performed according to the method described in the literature (Science, 261, 212, 1993).
  • the method of chemically binding radioisotopes can be performed according to the method described in the literature (Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990;).
  • the labeling substance is a polypeptide
  • a known genetic recombination technique Molecular Clonin g: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001
  • labeling substances suitable for such embodiments include phycobiliproteins such as phycoerythrin, GFP (Green fluorescent Protein), RFP (Red flu orescent Protein), YFP (Yellow fluorescent Protein), BFP (Blue fluorescent Protein)
  • a fluorescent protein such as a related protein thereof, an enzyme such as alkaline phosphatase, peroxidase, galactosidase, glucuronidase, and luciferase, avidin, a constant region of an antibody, a polypeptide containing a tag sequence, and the like can be mentioned.
  • DNA encoding the variable region polypeptide of the present invention and the labeling substance are cloned by PCR or the like, and each DNA is subjected to ligase reaction.
  • a primer is designed so that a marginal portion is provided on the PCR fragment of each DNA, the first PCR is performed with this primer, and then the obtained PCR fragment is aligned at the marginal portion.
  • a method of performing the second PCR is also suitable. During the second PCR, primers designed at both ends or outside of the fusion gene may be added to facilitate amplification of the fusion gene.
  • the method of conjugating the peptide and the labeling substance can be performed by a reaction that causes a covalent bond between the respective functional groups, with or without a linker.
  • the functional group include a carboxyl group, a amide group, a glycidyl group, a thiol group, a hydroxyl group, an amide group, an imino group, a hydroxysuccinyl ester group, a maleimide group, and an isothiocyanate group. It is possible to carry out a condensation reaction in between.
  • Examples of the binding method without using a linker include a method using a carpositimide compound such as EDC.
  • NHS or its derivatives can also be used as substances that enhance the reaction.
  • the condensation reaction between the isothiocyanate group and the amino group does not require any other reagent, and can be combined only by mixing under neutral to weakly alkaline conditions.
  • the linker may be any molecule as long as it is a molecule that binds the functional groups of the side chains of the carrier protein and the peptide to each other.
  • Preferred embodiments include, for example, a first reactive group capable of reacting with an amino acid residue of a carrier protein and a side chain of the peptide. It is a molecule having a second reactive group simultaneously capable of reacting with the functional group, and the first reactive group and the second reactive group are preferably different groups.
  • reactive groups include allylazide, carbodiimide, hydrazide, hydroxymethylphosphine, imide ester, isocyanate, maleimide, NHS-ester, PFP-ester, psoralen, pyridyldisulfide, bursulfone, and isothiocyanate.
  • an appropriate one can be selected according to the labeling substance.
  • the labeling substance when the labeling substance is a coloring substance, that is, a substance that absorbs light of a certain wavelength, a spectrophotometer, a multiwell plate reader, or the like can be used.
  • a spectrophotometer When the labeling substance is a fluorescent substance, a fluorometer or a fluorescent multiwell plate reader can be used.
  • a luminescent substance When the labeling substance is a luminescent substance, a luminescence photometer or a luminescent multiwell plate reader can be used.
  • the labeling substance is a radioisotope
  • the amount of radioisotope can be determined by measuring the radioactivity with a scintillation counter or the like.
  • the amount of the label can be measured by reacting the enzyme substrate with the enzyme and measuring the produced substance.
  • the amount of beloxidase can be measured by, for example, an absorbance method or a fluorescence method.
  • a method for measuring the amount of peroxidase by the absorbance method for example, a reaction between peroxidase and its substrate hydrogen peroxide and a chromogenic chromogen is performed, and the absorbance of the reaction solution is measured with a spectrophotometer or a multimeter.
  • a method using a well plate reader examples of the oxidative coloring chromogen include a leuco chromogen and an acid-coupling chromogen.
  • Leuco-type chromogens are substances that are converted into pigments alone in the presence of peracid-active substances such as peracid hydrogen and peroxidase.
  • peracid-active substances such as peracid hydrogen and peroxidase.
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • MCDP 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine
  • Oxidative coupling chromogens are substances in which two compounds are acid-coupled to form a dye in the presence of peroxidative substances such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • Examples of the combination of the two compounds include a combination of a coupler and an aryline (Trinder reagent), a combination of a coupler and a phenol.
  • Examples of couplers include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine.
  • peroxidase for example, a method of measuring the intensity of fluorescence generated by a fluorometer, a fluorescent multi-well plate reader, etc.
  • the fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, 3 (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and coumarin.
  • a method for measuring the amount of peroxidase by the luminescence method for example, a reaction of peroxidase with a combination of hydrogen peroxide and its luminescent substance, which is a substrate thereof, is performed with a luminescence intensity meter or a luminescence multiwell plate reader.
  • a method of measuring the intensity of generated luminescence for example, a method of measuring the intensity of generated luminescence.
  • the luminescent substance include a luminol compound and a lucigenin compound.
  • the amount of alkaline phosphatase can be measured by, for example, a luminescence method.
  • a luminescence method examples include a method in which alkaline phosphatase is reacted with its substrate and the luminescence intensity of the generated luminescence is measured with a luminescence intensity meter or a luminescence multiwell plate reader.
  • AMPPD 3-(2'-spiroadamantane) 4-methoxy-1- (3'-phosphoryloxy) ferro- 1,2 dioxetane disodium salt
  • the amount of ⁇ D galactosidase can be measured by, for example, an absorbance method (colorimetric method), a luminescence method, or a fluorescence method.
  • an absorbance method colorimetric method
  • a luminescence method luminescence method
  • a fluorescence method fluorescence method.
  • the method for measuring the amount of ⁇ D galactosidase by the absorbance method include ⁇ -nitrofol j8-D-galactopyranoside.
  • j8-D galactosidase and its substrate are reacted, and the luminescence intensity of the reaction solution is measured by a luminescence intensity meter or a luminescent multiwell plate.
  • a method of measuring with a der examples include Galacton-Plus (Applied Biosystems) or its similar compounds.
  • Examples of the method for measuring the amount of j8-D-galactosidase by the fluorescence method include a method in which ⁇ D galactosidase and its substrate are reacted and the fluorescence of the reaction solution is measured with a fluorometer or a fluorescence multiwell plate reader. Can be given.
  • Examples of the substrate for ⁇ -D-galactosidase include 4-methylumbellifere 13 D-galactopyranoside.
  • the amount of luciferase can be measured by, for example, a luminescence method.
  • the method for measuring the amount of luciferase by the luminescence method include a method of reacting luciferase with its substrate and measuring the luminescence intensity of the reaction solution with a luminescence intensity meter or a luminescence multiwell plate reader.
  • luciferase substrates include luciferin and coelenterazine.
  • the labeling substance is other than the fluorescent substance, the coloring substance, the luminescent substance, the radioisotope and the enzyme
  • the substance that specifically binds to the labeling substance is the fluorescent substance, the coloring substance, the luminescent substance, the radioactive isotope or A fluorescent substance, a chromogenic substance, a luminescent substance, a radioactive isotope, which is labeled with a substance that specifically binds to the labeling substance, is bound with a labeling substance that labels the second variable region polypeptide and labeled with an enzyme or the like. Detection is performed in the same manner as described above using elements or enzymes.
  • the substance that specifically binds to the labeling substance examples include an antibody that specifically binds the labeling substance, and when the labeling substance is piotin, avidin and streptavidin can be mentioned.
  • the antibody, avidin or streptavidin that specifically binds to the labeling substance is not labeled, but is bound to the labeling substance that labels the second variable region polypeptide, and then specifically to the constant region of the antibody.
  • the antibody used for these detections an antibody that specifically binds to avidin or streptavidin or a labeling substance, an antibody that specifically binds to a constant region of an antibody, an avidin or a strain
  • the antibody that specifically binds to butavidin may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, or Fab, Fab, ⁇ F (ab), ⁇ F (ab,), scFv, dsFv, Diab
  • a peptide containing ody and CDR can be used.
  • the carrier for immobilizing the variable region polypeptide derived from the anti-peptide monoclonal antibody includes any substance that can bind and retain the antibody. Molded material is used.
  • the shape of the carrier on which the variable region polypeptide is immobilized is a tube, a bead, a plate, a fine particle such as a latex, or a force such as a stick.
  • the material is polystyrene, polycarbonate, polybutyltoluene, polypropylene, polyethylene, poly. Examples include polymeric materials such as butyl chloride, naphthalene, polymetatalylate, gelatin, agarose, cellulose, and polyethylene terephthalate, glass, ceramics, magnetic particles, and metals.
  • a method for immobilizing a variable region polypeptide a known method such as a method using physical binding, a method using physical binding, or a combination thereof may be used.
  • physical bonds include physical adsorption, electrostatic bonds, hydrogen bonds, and hydrophobic bonds.
  • chemical bond include a covalent bond and a coordination bond.
  • a polystyrene-based immunoassay microterplate obtained by hydrophobically fixing a variable region polypeptide can be used.
  • variable region polypeptide may be directly immobilized on the solid phase, or the variable region polypeptide may be immobilized on the solid phase via piotin-avidin or the like.
  • the variable region polypeptide when a variable region polypeptide is added with a tag peptide, the antibody against the tag peptide is immobilized on a solid phase, and then the variable region polypeptide is immobilized. Is possible.
  • variable region polypeptide may be immobilized on a solid phase via a linker.
  • linker for example, any molecule can be used as long as it binds the functional groups of the protein and the side chains of the solid phase to each other.
  • a preferred embodiment is, for example, a molecule having a first reactive group capable of reacting with an amino acid residue of a protein and a second reactive group capable of reacting with a functional group on a side chain of a solid phase simultaneously.
  • the first reactive group and the second reactive activity It is preferred that the groups are different groups.
  • reactive groups include allyl azide, carbodiimide, hydrazide, hydroxymethylphosphine, imide ester, isocyanate, maleimide, NHS-ester, PFP-ester, psoralen, pyridyl disulfide, and bisulfone. Is mentioned.
  • the functional groups on the side chain of the solid phase suitable for immobilization by covalent bond include carboxy group, amide group, glycidyl group, thiol group, hydroxyl group, amide group, imino group, hydroxy succinyl ester group. It is desirable to have a group that can be chemically bonded by reaction, such as a maleimide group.
  • the solid phase on which the above variable region polypeptide is immobilized protects the functional groups remaining on the carrier by blocking.
  • blocking reagents such as proteins, surfactants and Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) are usually used.
  • the protein that can be used for blocking is not limited to normal animal serum, urine serum albumin, skim milk, casein solution, and the like. Suitable animals that can be used for normal animal sera are eagle, hidge, rabbit, pig, etc. that can be used by all animal species other than humans or mice.
  • the serum concentration is most preferably a force of 1 to 5%, which can be arbitrarily selected in the range of 0.1 to 20%.
  • the concentration of urine serum albumin, skim milk, casein solution and the like is most preferably a force of 1 to 5%, which can be arbitrarily selected within the range of 0.1 to 20%.
  • As the types of surfactants that can be used for blocking Triton X-100, Tween 20 and the like can be used.
  • the blocking temperature can be freely set in the range of 4 ° C to 37 ° C.
  • the blocking time can be set appropriately according to the reaction temperature. In the case of room temperature, conditions such as 10 minutes or more and 1 hour or less are preferable.
  • Examples of the diluted solution of the biological sample include an aqueous solution containing a stabilizer in a surfactant, a buffering agent, and the like.
  • the aqueous solution should be prepared as an isotonic solution with salts, sugars, buffers, etc., in order to prevent changes in serum component concentration due to expansion and contraction of blood cells such as red blood cells.
  • the salts but for example, alkali metal halide salts such as sodium chloride and potassium salt.
  • the saccharide is not particularly limited, and examples thereof include sugar alcohols such as mannitol and sorbitol.
  • the reaction buffer may be any buffer as long as the variable region polypeptide and the antigen in the biological sample can undergo a binding reaction. If necessary, surfactants, preservatives, stabilizers, reaction accelerators or enzyme activity regulators may be added.
  • any solution can be used as long as it can usually remove and wash unreacted substances and does not affect the reaction between the antigen and the variable region polypeptide.
  • a buffer, a surfactant, a protein, a preservative or a stabilizer may be added.
  • the protein normal animal serum, urine serum albumin, skim milk, casein solution and the like are suitable, but not limited thereto.
  • the concentration of these proteins is most preferably a force of 1 to 5%, which can be arbitrarily selected within the range of 0.1 to 20%.
  • the surfactant Triton X-100, Tween 20 and the like can be used. Concentration ⁇ or 0. 005-0 of the surfactant. 5 0/0 force preferably, preferably from 0.01 to 0.2 0/0 force! / ⁇ .
  • the buffer used in the diluent, reaction buffer, or washing solution of the biological sample is not particularly limited as long as the buffer used in the buffer has a buffering capacity.
  • Good buffering agents include, for example, MES (2-monoreforinoethanesulfonic acid) buffer, bistris [bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane] buffer, ADA [N- (2-acetamido) iminoni.
  • Acetic acid] buffer PIPES [piperazine 1 N, N, 1 bis (2-ethanesnorephonic acid)] buffer, ACES ⁇ 2- [N- (2-acetamido) amino] ethanesulfonic acid ⁇ buffer, MOPSO (3 morpholino 2 Hydroxypropanesulfonic acid) buffer, BES ⁇ 2— [N, N bis (2-hydroxyethyl) amino] ethanesulfonic acid ⁇ buffer, MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid) buffer, T ES ⁇ 2— ⁇ N— [Tris (hydroxymethyl) methyl] amino ⁇ ethanesulfonic acid> buffer, HE PES [N- (2-hydroxyethyl) N,-(2-sulfoethyl) piperazine] buffer, D IPSO ⁇ 3- [N, N bis (2hydroxyethyl) amino] —2 hydroxypropane sulfone Acid ⁇ buffer, TAPSO ⁇ 2-hydroxy-3-3-
  • Examples of the enzyme activity regulator and enzyme stabilizer include metal ions such as magnesium ion, manganese ion and zinc ion.
  • the content of these metal ions in the reagent is not particularly limited as long as the enzyme is stabilized in the measurement.
  • antiseptics include sodium azide and antibiotics.
  • the content of these preservatives in the reagent is not particularly limited as long as it is such a content that the substance to be measured in the sample can be appropriately measured in the measurement.
  • the peptide obtained by chemical synthesis, enzyme synthesis, gene recombination technology, or obtained by biological sample strength, a cell in which the peptide is expressed, a partial peptide of the peptide Or the polypeptide which has this peptide in part is mention
  • it may be a substance obtained by modifying the peptide, a partial peptide of the peptide, or a polypeptide having the peptide in part with a molecule other than peptidic by chemical synthesis or enzymatic synthesis.
  • the detection or quantification method of the present invention is a measurement characterized in that a VH polypeptide and a VL polypeptide are associated with each other through an antigenic peptide when an antigenic peptide is present.
  • the antigen peptide does not exist and sometimes the VH polypeptide and the VL polypeptide do not associate with each other without the antigen peptide. It is more preferable to take measures to avoid the ground value because it will increase.
  • addition of an aggregation inhibitor that prevents the association between the VH polypeptide and the VL polypeptide without using an antigen peptide can be considered.
  • the aggregation inhibitor include surfactants.
  • any compound can be used as long as it increases the solubility of the protein.
  • carboxylic acid type sulfonic acid type, sulfuric acid ester type, phosphoric acid ester type anionic surface activity
  • alkylamine salt type quaternary ammonium salt type cationic surfactants, strong l-poxybetaine type, 2-alkylimidazoline derivative type, glycine type amphoteric surfactants.
  • reaction buffer examples include the embodiment of the reaction buffer described in the section of (A) Open sandwich ELISA.
  • a pH between 4.0 and 10.0 can also find a suitable pH, and a salt concentration of between 0. Olmmol / L to: LOOmmolZL can find a suitable salt concentration.
  • inorganic salts include monovalent ions or divalent ions such as sodium salts, calcium salts, and magnesium salts.
  • the above-described device suitable for the present invention is that the VH polypeptide and the VL polypeptide are associated with each other at any one or both of the VH polypeptide and VL polypeptide without using the antigen peptide. It is also possible to change an amino residue involved in the amino acid to another amino residue. It is clear that the VH or VL framework region (FR) is involved in the conformation that allows CDRs to bind to the antigen and also in the binding of VH polypeptides to VL polypeptides. It has become. For example, Masuda et al.
  • the open sandwich method of the present invention not only detects and quantifies a peptide used as an antigen to obtain a monoclonal antibody, but also detects and quantifies any molecule that has the peptide in part. It is a suitable method.
  • the molecule may be any substance that exists naturally or can be artificially created, such as a peptide containing the peptide, a polypeptide, a sugar, a lipid, a nucleic acid, an organic compound, an inorganic compound, or a polymer. .
  • a method for artificially binding the molecule and the peptide known methods such as a genetic engineering method, a physical method or a chemical method are used.
  • methods for genetic engineering include known gene recombination techniques (Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molecular loning, A Laboratory Manual, and old bpnng Harboi.
  • Examples of the physical bond include physical adsorption, electrostatic bond, hydrogen bond, and hydrophobic bond.
  • Examples of the chemical bond include a covalent bond and a coordination bond.
  • the present invention is also a method suitable for detecting and quantifying cells or tissues having a peptide.
  • the cells or tissues include animals, insects, cells or tissues obtained with microbial strength, or cultured cells in which these biological strengths are established.
  • the cell or tissue having a peptide includes cells or tissues that express / express a peptide, polypeptide, sugar, lipid, nucleic acid, or organic compound containing the peptide.
  • it can also be used to detect or quantify peptides, polypeptides, sugars, lipids, nucleic acids, and organic compounds that are artificially bound to the peptide expressed by cells or tissues.
  • a known method such as a genetic engineering method, a physical method or a chemical method is used as described above.
  • the detection reagent or quantitative reagent of the peptide of the present invention or a molecule having the peptide as a part thereof is used for carrying out the detection method or quantitative method of the present invention, and includes components that can be used for the method.
  • Each component and substance of the peptide detection reagent or quantitative reagent As long as a substance that is substantially the same as or a part of the substance is included, it is included in the reagent of the present invention even if its constitution or form is different.
  • the labeling substance 1 is bound to the VH polypeptide, and the labeling substance 2 different from the labeling substance 1 is bound to the VL polypeptide.
  • a preferred embodiment of the labeling substance is a fluorescent substance. Fluorescence energy force generated by receiving excitation light Used as fluorescence energy of different fluorescent materials in close proximity. This phenomenon is called fluorescence resonance energy transfer (FRET), and is a phenomenon that occurs when two types of fluorescent substances come close to 1-10 nm. As a combination of fluorescent substances in which FRET occurs, it is necessary that there is an overlap with the spectrum power of one fluorescence wavelength and the spectrum of the other excitation wavelength.
  • Examples of the substance include low molecular organic fluorescent dyes, inorganic compounds, and polypeptides.
  • An example of the low molecular organic fluorescent dye is a combination of Cy3 and Cy5.
  • An example of an inorganic compound is quantum dot (Science, 281,2016-2018, 1998).
  • Examples of the polypeptide include a fluorescent protein, such as a jellyfish photoprotein or a modified protein thereof.
  • BRET bioluminescence resonance energy tran sfer
  • Rluc Renilla luciferase
  • GFP Green Fluorescence Protein
  • the combination of the labeling substances may be a combination of substances that cause enzyme activity when the labeling substance 1 and the labeling substance 2 are close to each other and bonded with a certain orientation.
  • the j8 galactosidase subunit is used as a combination of labeling substances.
  • one of the VH polypeptide or VL polypeptide is a fusion protein of the ⁇ a subunit of
  • Rluc can be divided into two domains (N-terminal domain and C-terminal domain), and each is a fusion protein of VH polypeptide or VL polypeptide (Anal. Chem. , 75, 4176-41 81, 2003) o
  • the components of the detection reagent or quantitative reagent using the homogenous open sandwich method using two types of labeling substances include VH polypeptide derived from labeled anti-peptide monoclonal antibody, labeled anti-antibody VL polypeptides derived from peptide monoclonal antibodies, etc., and in the form of kits containing biological sample dilutions, reaction buffers, peptide standards, nonspecific reaction inhibitors, etc., as necessary. There may be. If the labeling substance is an enzyme, an enzyme substrate is added.
  • the best mode of the measurement kit of the present invention is, for example, in the reaction fields of a labeled VH polypeptide-containing solution, a labeled VL polypeptide-containing solution, a test sample, and two types of labeled polypeptides. It may be composed of three solutions with a certain reaction buffer, but it may be a mixed solution in which the two kinds of labeled polypeptide-containing solutions are mixed together. It may be a mixed liquid in which three liquid agents are mixed.
  • the non-specific reaction inhibitor may be added to the two kinds of containing solutions, or may be added to other reagents constituting the measurement kit (reagents other than the two kinds of containing solutions and the reaction buffer solution). May be. Each reagent constituting the measurement kit is contained in a container or the like, and is appropriately diluted when used in the practice of the present invention.
  • Any nonspecific reaction inhibitor may be used as long as it has an inhibitory effect on protein aggregation.
  • proteins such as gelatin and albumin; glycols; polyarones; N, N— Dialkylamides; lower alkyl sulfoxides, surfactants, chelating agents, reducing agents and the like.
  • Any compound can be used as the surfactant.
  • Tween 20 and Triton X-100 As a chelating agent, there is a force that can use any compound, for example, EGTA, EDTA or an analog thereof.
  • the reducing agent include SH compounds such as dartathione, mercaptoethanol, dithiolite.
  • any one of the embodiments described in (1) Open Sandwich ELISA can be selected depending on the type of enzyme.
  • the enzyme is j8-D-galatatosidase, an embodiment in which absorbance is measured using ⁇ --tropel D-galactopyranoside as a substrate, 4-methylumbelliferyl
  • fluorescence is measured using D-galactopyranoside or the like as a substrate.
  • the enzyme is Rluc
  • the detection means for the labeling substance an appropriate one can be selected according to the labeling substance.
  • the labeling substance when the labeling substance is a coloring substance, that is, a substance that absorbs light of a certain wavelength, a spectrophotometer, a multiwell plate reader, or the like can be used.
  • a spectrophotometer When the labeling substance is a fluorescent substance, a fluorometer or a fluorescent multiwell plate reader can be used.
  • a luminescent substance When the labeling substance is a luminescent substance, a luminescence photometer or a luminescent multiwell plate reader can be used.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of human osteocalcin (SEQ ID NO: 3) C-terminal part 38-49 amino acid sequence of amino acid 12 residues
  • SEQ ID NO: 2 is the human osteocalcin amino acid sequence N-terminal part Amino with cysteine added to the C-terminus of sequences 1-13 Each sequence corresponds to 14 residues of acid.
  • OC-1 peptide and OC-2 peptide were each conjugated to KLH in the following manner. Dissolve 4.8 mg of OC peptide in 1 ml of 0.1 ml ImolZL phosphate buffer (pH 7.0), and dissolve KLH in 0 ml ImolZL phosphate buffer (pH 7.0) to 20 mgZmL. Add lmL and stir. Add 60 L of EDC and 150 L of NHS dissolved in N, N-dimethylformamide to 11.5 mg / mL, mix by inverting at room temperature for 8 hours, and then with PBS at 4 ° C. Dialyzed 3 times. The concentration of the obtained OC peptide conjugate KLH was measured at an absorbance of 280 nm.
  • Example 1 Each of the two OC peptide conjugates KLH obtained in (1) was dissolved in 1 mL of PBS and 0% per animal together with Freund's complete adjuvant (MP Biomedica Is). 4 mg of OC peptide conjugate KLH was administered intraperitoneally to a 5-week old female mouse (BalbZc). Three weeks later, 0.5 mg of OC peptide conjugate KLH per mouse was administered intraperitoneally again with Freund's incomplete adjuvant (MP Biomedicals) as the final immunization. Blood was collected from the above immunized mice, and the serum antibody titer was examined by the enzyme immunoassay shown in (3) below. The spleen was removed 3 days after the final immunization for the mouse force that showed a sufficient antibody titer.
  • the spleen was chopped in MEM (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, and centrifuged (1200 rpm, 5 minutes) to sediment the cells. Discard the supernatant and treat the cells with Tris-salt ammonium buffer (PH7.65) for 1-2 minutes to remove erythrocytes, then wash 3 times with MEM and (5) cell fusion Used for.
  • MEM manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • OC peptide conjugate BSA was prepared in the same manner as in the preparation of OC peptide conjugate KLH of Example 1 (1), using BSA instead of KLH.
  • EIA enzyme immunoassay
  • 10 g ZmL of OC peptide-conjugated BSA dissolved in PBS was dispensed in 50 ⁇ LZ wells and allowed to stand at 4 ° C for adsorption.
  • 1% BSA-containing PBS was added in 100 / z LZ wells and allowed to react for 1 hour at room temperature. Discard the BSA-containing PBS and dilute appropriately with 0.1% BSA-containing PBS.
  • the immunized mouse antiserum was dispensed in 50 LZ wells and allowed to react for 1 hour at room temperature. After washing with PBS containing 0.1% Tween 20, peroxidase-labeled Usagi anti-mouse immunoglobulin (Dako) was added in an amount of 50 LZ wells and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing with PBS containing Tween 20, add 50 ⁇ LZ of peroxyhydrogen containing o-phenol-diamine substrate solution (manufactured by Sigma) to develop color, and then add 2.5 molZL sulfuric acid in 50 ⁇ LZ wells. In addition, the reaction was stopped. Absorbance at 492 nm (hereinafter referred to as OD492 or the like) was measured with a plate reader (MTP-120; manufactured by Corona Electric Co., Ltd.). The reference wavelength was 660 nm.
  • Example 1 The mouse spleen cells obtained in (2) and the myeloma cells obtained in (4) were mixed at a ratio of 10: 1, centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and the precipitate was precipitated. Thoroughly disintegrate the cells, and mix at 37 ° C with PEG-1000 2g, MEM 2mL and dimethyl sulfoxide 0.7mL at a concentration of 0.2 to 1mL per 1 x 10 8 mouse splenocytes. In addition, 1-2 mL of MEM was added several times every 1-2 minutes, and then the MEM was added so that the total volume became 50 mL. After centrifuging at 900 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, the cells were loosened gently, and the cells were suspended in lOOmL of HAT medium gently by suctioning and sucking with a pipette.
  • the cells were cultured at 37 ° C for 10-14 days in a 2 incubator.
  • the culture supernatant was examined by the competitive inhibition method described in (6) below, and the cells of the wells in which the reaction with the OC peptide conjugate BSA was inhibited by the OC peptide were selected, and the HT medium followed by the normal medium was selected. Cloning twice was used to establish anti-OC peptide monoclonal antibody producing hybridomas.
  • OC-1 peptide and OC-2 peptide were used as antigenic peptides, respectively.
  • a hybridoma that produces an antibody that specifically binds to the OC-1 peptide and a single hybridoma that produces an antibody that specifically binds to the OC-2 peptide were established. Named 219 shares and KTM-223 shares.
  • monoclonal antibodies that specifically bind to the OC-1 peptide produced by the hybridoma KTM-219 strain specifically bind to KTM-219 and the OC-2 peptide produced by the hyperidoma KTM-223 strain. This monoclonal antibody is designated as KTM-223.
  • KTM-219 and KTM-223 are monoclonal antibodies that specifically bind to human osteocalcin, and KTM-219 is the amino acid sequence of human osteocalcin (SEQ ID NO: 3) at positions 38 to 49.
  • the continuous amino acid sequence, KTM-223, has an epitope in the sequence of amino acids 1 to 13 in the amino acid sequence of human osteocalcin (SEQ ID NO: 3).
  • a phenamine amine substrate solution (Sigma) was developed with 50 ⁇ L Zwell to develop color, and then 2.5 mol / L sulfuric acid was added with 50 LZ to stop the reaction.
  • Absorbance at 492 nm (hereinafter referred to as OD4 92, etc.) was measured with a plate reader (MTP-120; Corona Electric Co., Ltd.). The reference wavelength was 660 nm.
  • Nipridoma strain obtained in Example 1 (5) was intraperitoneally injected into 8 weeks old nude female mice (BalbZc) treated with pristane at 5 to 20 ⁇ 10 6 cells / animal. Ten to 21 days later, the hybridoma developed ascites tumor. Ascites was collected from mice with ascites (1-8 mLZ) and centrifuged (3000 rpm, 5 minutes) to remove solids. The obtained ascites was purified by the force prillic acid precipitation method [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (198 8)] to obtain a purified monoclonal antibody.
  • the subclass of the antibody was determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit (ZYMED). For both KTM-219 and KTM-223, the antibody subclass was IgG1 for the H chain and ⁇ for the L chain.
  • RNA was extracted and purified from the hybridoma KTM-219 strain producing KTM-219 according to a conventional method. Using this RNA as a saddle type, reverse transcription PCR (RT-PCR) was performed from QIAGEN OneStep RT-PCR Kit according to the attached protocol using the following primers.
  • RT-PCR reverse transcription PCR
  • Vk4BkFL2 (SEQ ID NO: 17), which is a degenerate primer for the FR1 region of murine immunoglobulin ⁇ chain, is used as a forward primer
  • M is a primer for the murine immunoglobulin ⁇ chain constant region, which is a reverse primer
  • KCFor (SEQ ID NO: 18) was used to amplify DNA encoding a VL polypeptide containing a part of the murine immunoglobulin ⁇ chain constant region.
  • the primer used was a DNA-synthesized DNA having the sequence power of each SEQ ID NO.
  • RT-PCR reaction conditions were reverse transcription at 50 ° C for 30 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 15 minutes, then 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 Thirty cycles of reaction at 1 ° C for 1 minute were performed, and finally, extension reaction was performed for 6 minutes at 72 ° C.
  • the approximately 450 bp cDNA fragments amplified by each RT-PCR were separated by 1.5% agarose gel electrophoresis, and the Wizard SV gel and PCR Clean-Up Sy system was used. stem, manufactured by Promega).
  • the region coding for VH of KTM-219 has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, coding for the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, coding for VL This region has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 and was found to encode the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • CDR1, 2 and 3 in the VH region of KTM-219 are regions 31 to 35, 50 to 66 and 99 to 105 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, respectively, and CDR1, 2 and 3 of the VL region 3 was the region of positions 24 to 39, 55 to 61 and 94 to 102 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, respectively.
  • the amino acid sequences of CDR1, 2 and 3 in the VH region of KTM—219 and CDR1, 2 and 3 in the VL region are shown in SEQ ID NOs: 8 to 13, respectively.
  • spFv phagemid vector pKST2 (Anal. Chem., 7 5, 4057-4064, 2003) was used as follows. Subcloned. pKST2 contains a ribosome binding sequence, a signal peptide encoding sequence, a Sfil site, Notl site, a sequence encoding a His-myc tag, an amber stop codon, and a sequence encoding M13 phage coat protein p7 downstream of the promoter. Have.
  • VH polypeptide By inserting a sequence encoding VH polypeptide between sfil and Notl of pKST2, M13 phage coat protein p9 encoding sequence, ribosome binding sequence, signal peptide encoding sequence, and VL polypeptide encoding sequence.
  • Ribosome binding sequence downstream of promoter Signal peptide ZVH polypeptide A phagemid having a sequence encoding a Zp9 fusion protein and
  • B a ribosome binding sequence signal peptide ZVL polypeptide ZHis—a sequence encoding a myc tag
  • a sequence encoding an amber stop codon p7 can be constructed.
  • phage particles can be obtained by infection with helper phage.
  • Ecoli is an amber suppressor strain
  • the amber stop codon is translated into glutamine at a constant rate, so the fusion protein of the VL polypeptide ZH is—myc tag Zp7 is put on the phage particle together with the fusion protein of VH polypeptide Zp9.
  • the fusion protein of VH polypeptide Zp9 is displayed on the phage particle.
  • the VL polypeptide ZHis—myc tag does not become a fusion protein with p7. Is not presented and is secreted into the medium.
  • the DNA encoding the VH polypeptide of KTM-219 obtained in (1) was converted into a saddle shape, the forward primer MH2Back (SEQ ID NO: 15) and the reverse primer VHlFor — 2X (SEQ ID NO: 19, Anal. Chem. , 75, 4057-4064, 2003), and the forward primer MkBack (DNA) encoding the DNA encoding the VH polypeptide or the DNA encoding the VL polypeptide of KTM—219 obtained in (1) above.
  • SEQ ID NO: 20) and reverse primer MJK2FONX SEQ ID NO: 21, Antibody Engineering: a Practical Approach, IR L Press, 1996).
  • PCR reaction conditions were as follows: a denaturation reaction at 94 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute for 1 cycle. Finally, an extension reaction was performed at 72 ° C for 6 minutes.
  • a linker DNA containing a sequence encoding ⁇ 9, a ribosome binding sequence and a sequence encoding an OmpA signal peptide was converted into a forward primer 01inkBack2 (SEQ ID NO: 22) and a reverse primer OlinkFor (SEQ ID NO: 23).
  • pKST2 HyHEL10 (Anal. Chem., 75, 4057-4064, 2003) as a saddle type. As in (1), the amplified fragments were separated by agarose gel electrophoresis and purified.
  • the DNA encoding the VH polypeptide, the DNA encoding the VL polypeptide, and the linker DNA are mixed, PCR is performed without adding a primer, and after a denaturation reaction at 94 ° C for 3 minutes, Eight cycles of a reaction at 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 90 seconds, and finally the extension reaction at 72 ° C for 8 minutes.
  • a DNA fragment having a structure in which the fragments were bound in the order of VH-linker VL was amplified.
  • primers MH2Backsfi SEQ ID NO: 24
  • JK2NotlO SEQ ID NO: 25
  • the amplified fragments were separated by agarose gel electrophoresis and purified.
  • the purified amplified fragment was cleaved with restriction enzymes Sfil and Notl, separated again by agarose gel electrophoresis, and purified.
  • FIG. 1 shows the downstream structure of the pKST2ZKTM219 promoter.
  • the primers used in Example 2 are shown in Table 1.
  • the spFv phagemid vector pKST2ZKTM219 obtained in the previous section was transformed into the E. coli TGl strain (supE, hsd A 5, thi, ⁇ (lac-proAB), / F '[traD36, proAB +, laclq, lacZ A M15])
  • non-suppressor strain HB2151 (ara, ⁇ (lac-proAB), thi / F'proAB +, laclq, lacZ A M15) (Amersham Biosciences) was transformed.
  • 2 XTYAG (16gZL tryptone, lOgZL yeast extract, 5gZ After culturing at 37 ° C with L sodium chloride, 100 gZmL ampicillin, 1% glucose, pH 7.0) agar plate (2 XTYAG containing 1.5% agar), 4 mL of each single colony 2 Cultured at 37 ° C in XTYAG medium. Transfer a portion of this to fresh 2 XTYAG medium and the absorbance at 600 nm (OD) at 37 ° C is approximately 0.5.
  • helper phage M13K07 was added so that m. O. I (multiplicity of infection) was 20, and allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes.
  • the cells are then collected by centrifugation at 2,000 g for 15 minutes, resuspended in 2 XTYAK medium (16 g ZL tryptone, 10 g ZL yeast extract, 5 g ZL sodium chloride, 100 g ZmL ampicillin, 50 g ZmL kanamycin), and 30 ° C at 250 rpm. And cultured with shaking for 16 hours.
  • the culture solution was centrifuged at 10,800 g for 10 minutes, and a supernatant containing M13 phage displaying VH and VL polypeptides was recovered. Into this supernatant was added 1Z5 volume of 20% polyethylene glycol Z2.5 mol / L NaCl to precipitate the phage. After standing at 4 ° C for 1 hour, the mixture was centrifuged at 11,500 g for 15 minutes, and the pellet was resuspended in PBS and stored at 4 ° C.
  • the culture solution is centrifuged at 10,800 g for 10 minutes, and the supernatant containing M13 phage displaying VH polypeptide and the VL polypeptide with His-myc tag is added at 4 ° C. Saved with.
  • Example 2 (3) the VH polypeptide obtained by using the M13 phage (hereinafter referred to as VHZVL-displayed phage) displaying the VH polypeptide and VL polypeptide obtained using E. coli TGI strain as the host was used. It was confirmed by the following ELISA that the specific binding of VL polypeptide to human osteocalcin was maintained.
  • 96-well microphone mouth plate (Falcon 3914, Betaton Dickinson) put each concentration of human osteocalcin (Prinston BioMolecules) dissolved in 100 ⁇ L PBS per well, 37 ° This was left to stand for 1 hour to adsorb it.
  • Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) diluted to 25% with PBS (hereinafter referred to as 25% BPB) The non-specific adsorption site was blocked at 37 ° C for 1 hour.
  • PBST PBS containing 0.1% Tween-20
  • VHZVL-displayed phage diluted 100-fold with 10% BPBS was added to each well.
  • the reaction was performed at ° C for 90 minutes.
  • 100 L of peroxidase-labeled mouse anti-M13 antibody (Amersham Biosciences) diluted 5000-fold with 10% BPBS was added to each well and reacted at 25 ° C for 90 minutes.
  • the microphone mouthplate was washed 6 times with PBST, and 100 ⁇ L of substrate solution (lOOmM sodium acetate, 100 ⁇ g / mL3, 3, 5, 5, 5, 5, monotetramethylbenzidine (hereinafter abbreviated as TMB) Sigma's Aldrich), 0.04 Add 0) and wait for 10-30 minutes.
  • the reaction was stopped with 50 L of ImolZL sulfuric acid per well, and absorbance at 450 nm was measured using a model 680 microplate reader (Bio-Rad) with 655 nm as a control.
  • the results are shown in FIG. As a result, the absorbance increased depending on the concentration of human osteocalcin, confirming that the KH-219 VH and VL polypeptides have specific binding properties to human osteocalcin. .
  • Example 2 (3) the M13 phage displaying the VH polypeptide of KTM-219 obtained from E. coli HB2151 strain transformed with pKST2ZKTM219, that is, the VH polypeptide labeled with M13 phage.
  • human sandwich calcin and OC-1 peptide were measured by open sandwich ELISA as follows. .
  • the peroxidase-labeled anti-M13 antibody diluted 5000-fold in 100 ⁇ L of 10% BPBS was reacted at 25 ° C for 90 minutes.
  • a substrate solution containing 100 L of TMB was added for 10 to 30 minutes per well.
  • the reaction was stopped with 50 ⁇ L of ImolZL sulfuric acid per well, and the absorbance at 450 nm was measured using a model 680 microplate reader with 655 nm as the control wavelength.
  • Fig. 3 shows the measurement results for human osteocalcin
  • Fig. 4 shows the measurement results for OC-1 peptide.
  • the absorbance values were 0.278 for human osteocalcin and 0.143 for OC-1 peptide, respectively.
  • the absorbance increased in a concentration-dependent manner in the measurement sample, confirming that it could be measured by open-sandwich ELISA.
  • the measurement range of osteocalcin was 1 to 500 ngZmL
  • the measurement range of OC-1 peptide was 0.1 to 50 ngZmL.
  • the plate was washed three times with PBS T, and reacted with peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody 100 / z L diluted to 0.2 g / mL in 10% BPBS at 25 ° C for 90 minutes. After washing 6 times with PBST, enzyme reaction and absorbance measurement were performed in the same manner as in Example 3 (1). The experimental results are shown in Fig. 5. did. In the experiment of Fig. 5, the absorbance value was 2.28 when no OC-1 peptide was present in the measurement sample. From Fig. 5, the measurement range of OC-1 peptide is 5 to 2000 ng Z mL, 7 in total.
  • the open sandwich ELISA method has a low minimum detection sensitivity and a wider measurement range than the competitive inhibition ELISA method.
  • FIG. 7 shows the results when KTM-223, which is a monoclonal antibody immobilized on a plate, is applied in the same manner as described above, followed by the addition of piotin-labeled monoclonal antibody KTM-219. From Fig. 6, the measurement range of sandwich ELISA when KTM-219 is immobilized and labeled KTM 223 is used is 0.01 to 5 ngZmL. From Fig. 7, KTM-223 is immobilized and labeled KTM- 219 The measurement range of sandwich ELISA when using was 0.05 to 5 ngZmL.
  • the concentration at the upper limit of the measurement range was higher than that of the sandwich ELISA, and the width of the measurement range was the same or wider.
  • the actual reference value for measuring osteocalcin in blood is about 2.5 ngZmL. In pathological conditions, the concentration of blood osteocalcin is expected to be even higher.
  • Open The Netherwich ELISA method is simpler and requires fewer steps than the conventional sandwich ELISA method, and is more suitable because the concentration of osteocalcin in the blood and the measurement range match, so there is no need to dilute the sample. It was considered.
  • VH-AP fusion protein VH-alkaline phosphatase fusion protein fused with alkaline phosphatase
  • VH-AP fusion protein an enzyme label that binds to the VH polypeptide.
  • the reaction of the anti-Ml 3 antibody is considered unnecessary. Therefore, it is considered that the process of the open sand switch method can be simplified by using both.
  • VH-AP fusion protein and MBP-VL fusion protein were prepared as follows.
  • a VH-AP fusion protein expression plasmid pET-VH219-AP was constructed as follows. Using the spFv phagemid vector pKST2ZKTM219 prepared in Example 3 in a cage form, PCR using the primers MH2Back—EcoRV (SEQ ID NO: 26) and VHlFor2—HindIII (SEQ ID NO: 27) encodes the VH polypeptide of KTM—219. Amplified DNA. The amplified fragment was digested with EcoRV and Hindlll, separated by agarose gel electrophoresis, purified, and fragmented with plasmid pPhoA (J. Immunol.
  • pPhoA is a plasmid prepared by inserting a 1450 bp fragment encoding E. coli alkaline phosphatase into the Notl site of vector pET-20b (Novagen, manufactured by EMD Biosciences). The ligation product was transformed into E. coli XL10-Gold (Stratagene) and LBAG agar medium (lOgZL tryptone, 5gZL yeast extract, lOgZL sodium chloride, lOgZL glucose, 100 g / mL ampicillin, pH 7.2, 1.
  • VH219 named AP.
  • pET VH219—AP has the structure shown in FIG. 8 downstream of the promoter, and is used to express the VH-AP fusion protein with the KTM-219 VH polypeptide Z al force phosphatase ZHis tag force in the host periplasm. It is a plasmid.
  • E. coli BL21 (DE3) pLysS was transformed with this plasmid pET-VH219-AP and cultured on LBAG agar medium at 37 ° C, and then single colonies were cultured in 4 mL of LBAC liquid medium (lOgZL tryptone). , 5gZL yeast extract, lOgZL sodium chloride, 100 gZmL ampicillin, 34 gZmL chloramphee-col, pH 7.2) at 30 ° C— ⁇ , transfer 3 mL of this culture to two 150 mL LBAC liquid media, 30 ° C was cultured until the OD600 reached 0.6 to 0.8. The culture solution was supplemented with IPTG at a final concentration of 0.2 mmol / L to induce expression of the VH-AP fusion protein, and further cultured at 20 ° C. for 18-24 hours.
  • LBAC liquid medium lOgZL tryptone
  • the culture broth after completion of the culture was centrifuged at 6000 rpm and 4 ° C for 10 minutes, and the cells were collected.
  • the resulting cells are resuspended in 40 mL of osmotic shock solution (30 mmol ZL Tris-HCl, 20% sucrose, ImmolZL EDTA, pH 8.0) and mixed gently at room temperature for 10 minutes, then 8000 g, 4 ° C. Centrifuge for 10 minutes. The supernatant was discarded, and 10 mL of ice-cooled 5 mmol Z L MgS04 was added to the cells and resuspended immediately to release the periplasmic fraction of VH-AP fusion protein to the outside of the cell.
  • osmotic shock solution (30 mmol ZL Tris-HCl, 20% sucrose, ImmolZL EDTA, pH 8.0) and mixed gently at room temperature for 10 minutes, then 8000 g, 4 ° C. Centrifuge for 10 minutes. The supernatant was discarded, and 10 mL of ice-cooled 5 mmol Z L MgS04 was added to the cells and resuspended immediately to release
  • the suspension was placed on ice with occasional mixing for 20 minutes, and then centrifuged at 8 000 g, 4 ° C for 15 minutes, and the supernatant containing the VH-AP fusion protein was recovered.
  • the supernatant was dialyzed against 1 L column buffer (10 mmol / L Tris-HCl, 50 mmol / L NaH2P04, lOOmmol / L NaCl, pH 7.4) at 4 ° C, and then ImL of Talon metal. Purification was performed using a chelate column (Clontech) according to the manufacturer's manual.
  • VH-AP fusion protein showed a single band near the estimated molecular weight of 61.9 kDa on SDS-PAGE, and the yield was about 1.5 mg from the 300 mL culture.
  • the MBP-VL fusion protein expression plasmid pMAL-VL219 was prepared as follows. Using the spFv phagemid vector pKST2 / KTM219 in a saddle shape, PCR with primers MkBackES (SEQ ID NO: 28) and MycForHd (SEQ ID NO: 29) was performed to obtain DNA encoding the KTM — 219 VL polypeptide and His—Myc tag Amplified.
  • the amplified fragment was cleaved with EcoRI and Hindlll, separated by agarose gel electrophoresis, purified, and then the MBP fusion protein expression plasmid pMAL—p2 (manufactured by New England 'Biolabs) cut with EcoRI and Hindlll. I ligated.
  • the ligation product was transformed into E. coli XLIO-Gold and cultured at 37 ° C in an LBAG agar medium.
  • a plasmid was prepared from several colonies obtained, and a plasmid having the correct sequence was selected and named pMAL VL219.
  • pMAL-VL219 has a structure shown in FIG. 9 downstream of the promoter, and is a plasmid for expressing an MBP-VL fusion protein that also has the VL polypeptide ZHis-Myc tagaka of MBPZKTM-219 in the host periplasm.
  • E. coli TGI strain After transformation of E. coli TGI strain with this plasmid pMAL-VL219 and culturing on LBA G agar medium at 37 ° C, single colonies were cultured in 4 mL of LBAG liquid medium (lOgZL tryptone, 5 gZL yeast extract, lOgZL chloride). The cells were incubated at 30 ° C. with sodium, lOgZL glucose, 100 / zg / mL ampicillin, pH 7.2).
  • the culture broth after completion of the culture was centrifuged at 6000 rpm and 4 ° C for 10 minutes to recover the cells.
  • the obtained cells were resuspended in 50 mL of osmotic shock solution, mixed gently for 10 minutes at room temperature, and then centrifuged at 8000 g and 4 ° C for 10 minutes. Discard the supernatant and add 15 mL of ice-cold 5 mmol / L MgS04 to the cells. L fusion protein was released out of the cell.
  • the suspension was placed on ice with occasional mixing for 20 minutes, then centrifuged at 8000 g, 4 ° C for 15 minutes, and the supernatant containing the MBP-VL fusion protein was collected.
  • MBP-VL fusion protein was isolated using a Talon metal chelate column in the same manner as the VH AP fusion protein of (1). Purification was performed. The purified MBP-VL fusion protein showed a single band around 56.5 kDa, the estimated molecular weight, on SDS-PAGE, and the yield was about 0.7 mg from the 500 mL culture.
  • Example 4 A 5 ⁇ g ZmL solution (solvent TBS) of the purified MBP-VL fusion protein obtained in (2) was prepared, and 100 L per well was dispensed into a 96-well microphone mouthplate. After standing at 4 ° C to adsorb the MBP-VL fusion protein, discard the solution and dilute the block ace to 25% with TBS (hereinafter referred to as X% BTBS Was blocked for 2 hours at room temperature. 0. After cleaning once with TBS containing 05% Tween 20 (hereinafter referred to as TB ST), each well is measured with 0.01%, 0.05, 0.1, 0.5 with 10% BTBS.
  • Tris-HCU 10 mmol / L MgC12, 50 ⁇ mol / L ZnC12, pH 9.5) was added to each well, reacted at room temperature for 30 minutes, and then the absorbance at 405 nm (OD405) was measured.
  • the present invention provides a method for non-competitive detection or quantification of peptides, a reagent therefor, and a VH polypeptide or VL polypeptide used in the method. Then, when using a VH polypeptide and a VL polypeptide derived from a monoclonal antibody that recognizes the tertiary structure of the peptide to be measured, such as HyHEL-10, the peptide to be measured is contained in the measurement sample.
  • the present invention is particularly effective for osteocalcin in blood. It is suitable for the concentration measurement.

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Abstract

 ペプチドの非競合的な検出または定量方法、そのためのキット、および該方法に使用するＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドを提供するものである。測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をエピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＨポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まないポリペプチド（ＶＬポリペプチド）を用い、ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのいずれか一方を固相に固定化して固定化ポリペプチドとし、他方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、測定すべきペプチドを含有する検体および標識化ポリペプチドを固定化ポリペプチドと接触させ、固相に結合した標識物質を検出または定量する。

Description

ペプチドの定量方法
技術分野
[0001] 本発明は、ペプチドの非競合的な検出および定量方法に関する。
背景技術
[0002] 従来の免疫測定法を改良し、簡便かつ迅速な測定方法として、単一のモノクローナ ル抗体の重鎖可変領域 (本発明ではこれを VH領域と呼ぶ）、軽鎖可変領域 (本発明 ではこれを VL領域と呼ぶ）をそれぞれ別のポリペプチド (本発明ではこれらをそれぞ れ VHポリペプチド、 VLポリペプチドと呼ぶ）として発現し、両分子を利用したオーブ ンサンドイッチ法が考案されている。オープンサンドイッチ法としては、 -ヮトリ卵白リ ゾチーム（以下、 HELと省略する）に対するモノクローナル抗体 HyHEL— 10由来の VHポリペプチド、 VLポリペプチドを利用した 2種の測定方法が開示されている。 1つ は、 VLポリペプチドを固相へ固定ィ匕し、 VHポリペプチドを酵素または蛍光物質など で標識し、サンドイッチ法によって抗原を捕捉、定量する方法であり、他の 1種類は、 VHポリペプチド、 VLポリペプチドを蛍光波長と励起波長の異なる 2種の蛍光物質で 標識し、抗原補足によって起きる蛍光共鳴エネルギー移動を検出、定量する方法で ある（特開平 10— 78436号公報参照)。 2種類の測定方法のうち、前者はオープン サンドイッチ ELISA (Enzyme— linked immunosorbent assay)法と呼ばれている。ォー プンサンドイッチ ELISA法は抗体と抗原の反応が 1回で済むので測定操作が従来 法に比べて簡便かつ迅速となるメリットを有する（「ジャーナル ·ォブ ·ィムノロジカル · メソッズ（Journal of immunological methods)」、（オランダ）、 1999年、第 224卷、 p. 1 71— 184参照）。また、後者はホモジ-ァスオープンサンドイッチ法と呼ばれている。 ホモジ-ァスオープンサンドイッチ法は、 BZF分離 (抗原と結合した抗体と、同一液 相中の抗原に結合して!/、な!、抗体とを分離すること)を行わな 、ため、洗浄操作が不 要となり、測定時間が短縮される、自動測定装置の簡素化などのメリットを有する（「ァ ナリティカル 'ケミストリー（Analytical Chemistry)」、（米国）、 2002年、第 74卷、第 11 号、 p. 2500— 2504参照）。 [0003] 上記のようにオープンサンドイッチ法は従来の免疫測定法と比べて優れた測定方 法である力 ペプチド性分子に対する測定例は、 HyHEL— 10のみしか知られてい ない。すなわち、 HEL以外のペプチド性分子の抗原をオープンサンドイッチ法で測 定できることを示す測定例はなぐ実際に測定できるかどうかは不明であった。
[0004] HyHEL- 10と HELとの複合体の X線結晶構造解析の結果から、 HyHEL— 10と HELの特異的結合に関与する HEL内のアミノ酸は、 15番目のヒスチジン、 16番目 のグリシン、 19番目のァスパラギン、 20番目のチロシン、 21番目のアルギニン、 63番 目の卜ジプ卜ファン、 73番目のアルギニン、 75番目のロイシン、 89番目のスレオ-ン、 93#目のァスノ ラギン、 96#目の!;ジン、 97#目の!；ジン、 100#目のセジン、 101 番目のァスパラギン酸、 102番目のグリシン、 103番目のァスパラギンであると報告さ れている（「ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル 'ケミストリー（Journal of Biological Chem istry)」、（米国）、 1999年、第 274卷、第 39号、 p. 27623— 27631参照）。このこと から、 HyHEL— 10は HELの連続するアミノ酸配列をェピトープとするのではなぐ HELの 3次構造を認識しているといえる。したがって、ある抗原ペプチドの連続する アミノ酸の配列をェピトープとするモノクローナル抗体由来の VHポリペプチド、 VLポ リペプチドを利用したオープンサンドイッチ法で前記抗原ペプチドを測定できることを 示す測定例はなぐ実際に測定できるかどうかは不明であった。
[0005] 低分子化合物のように分子量的に抗原を 2つの抗体で同時にサンドイッチできない 場合には、通常のサンドイッチ ELISA法での測定はできないため、競合阻害法によ る測定が行われて 、たが、オープンサンドイッチ法は 1種類の抗体の VHポリべプチ ドと VLポリペプチドで同時にサンドイッチできるため、非競合的に測定することが可 能である。低分子化合物 4 ヒドロキシ 3— -トロフエ-ル酢酸に対してオープンサ ンドイッチ ELISA法による測定が可能で、し力も競合法よりも感度がよ!、ことが報告さ れている (「ジャーナノレ 'ォブ'ィムノロジカノレ'メソッズ (Journal of immunological meth ods)」、（オランダ）、 1999年、第 224卷、 p. 171— 184参照）。
[0006] ペプチドに対するモノクローナル抗体を製造しょうとするとき、ペプチドェピトープは 最低 6から 10数個のアミノ酸残基が必要であると一般に知られて 、る。異なるェピト ープを認識する 2種類以上の抗体を作製するのに、最低必要なペプチドの長さとし ては 20個以上のァミノ残基が必要であると考えられる。したがって、アミノ残基数が 1 9個以下のペプチドの測定も通常は競合法で行われて 、た。オープンサンドイッチ法 力 このようなアミノ残基数が 19個以下のペプチドの測定に用いることができるかどう かは、測定例がなく不明であった。
[0007] 他方、ォステオカルシンは、ボーン'グラ'プロテイン（bone Gla protein, BGP)また はビタミン K依存性カルシウム結合蛋白質とも称され、骨芽細胞によって生合成され る 49〜50個のアミノ酸力もなる非コラ一ゲン性蛋白質 (分子量約 6, 000 ;ヒトおよび ゥシは 49個、ラットは 50個のアミノ酸力もそれぞれ構成される）であり、骨の蛋白質中 に 1〜2%程度存在する。ォステオカルシンの分子中には、 3つの γ カルボキシグ ルタミン酸残基 (Gla残基; Ν末端力も数えて 17位、 21位および 24位に存在する）と 1 つの S— S結合が存在し、この 3つの Gla残基がハイドロキシアパタイトとの結合に重 要な役割を演じているものと考えられている。ォステオカルシンは、骨形成の指標と なるマーカーペプチドであり、骨粗鬆症や癌の骨転移等の診断にも用いられる。
[0008] 検体中のォステオカルシンを測定する方法としては、ヒトォステオカルシンの C末端 部（37位〜 49位）に対する抗体を用いる方法（「ボーン (Bone)」、（米国）、 1985年、 第 6卷、第 1号、 p. 9— 13参照）、ゥシとヒトのォステオカルシンの共通アミノ酸配列を 利用し、 2種類の抗ゥシォステオカルシンモノクロ ナル抗体を用 、たサンドイッチ E LISA法 (特許 2613067号明細書参照）などが報告されている。しかし、ヒトォステオ カルシンのオープンサンドイッチ法はこれまで報告されて 、な 、。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の目的は、ペプチドの非競合的な検出または定量方法、および該方法に使 用する VHポリペプチドまたは VLポリペプチドを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] すなわち本発明は、（1)測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドの アミノ酸配列の連続する配列をェピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域 を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド (VHポリペプチド）と、前記モノク ローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まな 、ポリペプチド（ VLポリペプチド)を用いることを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出ま たは定量方法や、（2) VHポリペプチドまたは VLポリペプチドのいずれか一方を固相 に固定ィ匕して固定ィ匕ポリペプチドとし、他方を標識物質で標識して標識化ポリべプチ ドとし、測定すべきペプチドを含有する検体および標識化ポリペプチドを固定化ポリ ペプチドと接触させ、固定化ポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識化ポリべ プチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出ま たは定量することを特徴とする上記（1)に記載の方法や、（3) VHポリペプチドまたは VLポリペプチドの 、ずれか一方を標識物質で標識して標識ィ匕ポリペプチドとし、他 方のポリペプチドおよび標識ィ匕ポリペプチドを、固相の存在下で測定すべきペプチド を含有する検体に接触させ、固相、他方のポリペプチド、測定すべきペプチドおよび 標識化ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識 物質を検出または定量することを特徴とする上記（1)に記載の方法や、（4)標識物質 が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはピオチンである上記（2)または（3)に記載 の方法や、（5) VHポリペプチドまたは VLポリペプチド力 VHポリペプチドおよび VL ポリペプチドと免疫学的に区別されるペプチド (タグペプチド）が付加したポリべプチ ドであって、 VHポリペプチドまたは VLポリペプチドの固相への固定化力 VHポリべ プチドまたは VLペプチドに付加した該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結 合する固相に固定ィ匕した抗体との結合を介した固定ィ匕である上記（2)〜 (4)のいず れカ 1項に記載の方法や、（6)固相に固定ィ匕する VHポリペプチドまたは VLポリぺプ チドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである上記（2)に記載の方法 や、（7) VHポリペプチドを標識物質 1で標識して標識化 VHポリペプチドとし、 VLポ リペプチドを異なる標識物質 2で標識して標識化 VLポリペプチドとし、測定すべきぺ プチドを含有する検体を標識化 VHポリペプチドおよび標識化 VLポリペプチドへ接 触させ、標識物質 1と標識物質 2の相互作用の変化量を検出することを特徴とする上 記（1)に記載の方法や、（8) VHポリペプチドおよび VLポリペプチドが遺伝子組換え 産物である上記（1)〜（7)の 、ずれか 1項に記載の方法や、 (9)測定すべきペプチド に特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をェピトープとす るモノクローナル抗体力 該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 6以上 19以下のアミ ノ酸の配列力 なるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクロ ーナル抗体である、上記 (1)〜（8)のいずれか 1項に記載の方法 y、（10)モノクロ一 ナル抗体力 配列番号 3のアミノ酸配列の連続する 6以上 19以下のアミノ酸の配列 力もなるペプチドに特異的に結合する抗体である、上記（1)〜（9)のいずれか 1項に 記載の方法や、（11)モノクローナル抗体力 配列番号 1または 2のアミノ酸配列から なるペプチドに特異的に結合する抗体である上記 (1)〜（9)のいずれか 1項に記載の 方法に関する。
また本発明は、（12)測定すべきペプチドが、ヒトォステオカルシンである上記（1) 〜（9)のいずれか 1項に記載の方法や、（13)測定すべきペプチド力 配列番号 1ま たは 2のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオカルシンであって、モノクロ一 ナル抗体力 配列番号 1または 2のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物を 免疫することにより得られるモノクローナル抗体である上記（1)〜（9)の 、ずれか 1項 に記載の方法や、（14)測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むぺ プチドまたはヒトォステオカルシンであって、モノクローナル抗体力 以下の [1]〜[3] の！ヽずれかのモノクローナル抗体である上記（1)〜（9)の!、ずれ力 1項に記載の方 法
[1]重鎖可変領域の相補性決定領域 (CDR) 1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[2]軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のアミ ノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[3]重鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のァミノ 酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
や、（15)モノクローナル抗体力 以下の [1]〜[3]のいずれかのモノクローナル抗体 である上記（14)に記載の方法
[1]配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[2]配列番号 7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[3]配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号 7のアミノ酸配列 を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
や、（16)測定すべきペプチド力 配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒ トォステオカルシンであって、 VHポリペプチドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含む ポリペプチドである上記（1)〜（9)の 、ずれか 1項に記載の方法や、 (17)測定すベ きペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオカルシン であって、 VLポリペプチドが、配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上 記（1)〜（9)のいずれか 1項に記載の方法や、（18)測定すべきペプチド力 配列番 号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオカルシンであって、 VHポリぺプ チドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつ VLポリペプチドが 、配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（1)〜（9)の 、ずれか 1項 に記載の方法や、（19)配列番号 5または 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドや、（2 0)配列番号 5または 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする DNAや、（21) 配列番号 4または 6の塩基配列を含む上記（20)に記載の DNAや、 (22)上記（20) または (21)に記載の DNAをベクターに挿入して得られる組換えベクターや、（23)上 記（22)に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体や、 (2 4)上記（23)に記載の形質転換体を培養液中に培養して、配列番号 5または 7のアミ ノ酸配列を含むポリペプチドを生成 ·蓄積させ、培養液力 該ポリペプチドを採取す ることを特徴とする、ポリペプチドの製造方法に関する。
さらに本発明は、（25)測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドの アミノ酸配列の連続する配列をェピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域 を含んでかつ軽鎖可変領域を含まないポリペプチド (VHポリペプチド）と、該モノクロ ーナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まな 、ポリペプチド (V Lポリペプチド）とを含有することを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出 または定量用の試薬や、（26) VHポリペプチドまたは VLポリペプチドのいずれか一 方が、標識物質で標識された標識ィ匕ポリペプチドであり、他方が固相に固定化され た固定化ポリペプチドである上記（25)に記載の試薬や、 (27)固定化ポリペプチドが タグペプチドを付加したポリペプチドであって、固定化ポリペプチドの固相への固相 ィ匕が、該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定ィ匕した抗体と の結合を介した固定ィ匕である上記（26)に記載の試薬や、 (28)固定化ポリペプチド が、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである上記（26)に記載の試薬や 、（29) VHポリペプチドまたは VLポリペプチドのいずれか一方力 標識物質で標識 された標識化ポリペプチドであり、他方がタグペプチドを付加したポリペプチドであり、 さらに該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定ィ匕した抗体を含有する上記（2 6)に記載の試薬や、（30)標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはピオ チンである上記（26)〜（29)の!、ずれか 1項に記載の試薬や、（31) VHポリペプチド が標識物質 1で標識された標識化 VHポリペプチドであり、 VLポリペプチドが異なる 標識物質 2で標識された標識化 VLポリペプチドであることを特徴とする上記 (25)に 記載の試薬や、 (32) VHポリペプチドおよび VLポリペプチドが遺伝子組換え産物で ある上記（25)〜（31)の 、ずれか 1項に記載の試薬や、 (33)測定すべきペプチドに 特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をェピトープとする モノクローナル抗体力 S、該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 6以上 19以下のァミノ 酸配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナ ル抗体である、上記（25)〜（32)のいずれ力 1項に記載の試薬や、（34)モノクロ一 ナル抗体力 配列番号 3のアミノ酸配列の連続する 6以上 19以下のアミノ酸の配列 力もなるペプチドに特異的に結合する抗体である、上記（25)〜（33)の 、ずれか 1項 に記載の試薬や、（35)モノクローナル抗体力 配列番号 1または 2のアミノ酸配列か らなるペプチドに特異的に結合する抗体である上記（25)〜（33)の 、ずれか 1項に 記載の試薬や、（36)測定すべきペプチド力 ヒトォステオカルシンである上記（25) 〜（33)のいずれか 1項に記載の試薬や、（37)測定すべきペプチド力 配列番号 1 または 2のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオカルシンであって、モノクロ ーナル抗体力 S、配列番号 1または 2のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として動物 を免疫することにより得られるモノクローナル抗体である上記（25)〜（33)の 、ずれ か 1項に記載の試薬や、（38)測定すべきペプチド力 配列番号 1のアミノ酸配列を 含むペプチドまたはヒトォステオカルシンであって、モノクローナル抗体力 以下の [1 ]〜[3]の!、ずれかのモノクローナル抗体である上記（25)〜（33)の!、ずれか 1項に 記載の試薬 [1]重鎖可変領域の相補性決定領域 (CDR) 1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[2]軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のアミ ノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[3]重鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のァミノ 酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
や、（39)モノクローナル抗体力 以下の [1]〜[3]のいずれかのモノクローナル抗体 である上記（38)に記載の試薬
[1]配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[2]配列番号 7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[3]配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号 7のアミノ酸配列 を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
や、（40)測定すべきペプチド力 配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒ トォステオカルシンであって、 VHポリペプチドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含む ポリペプチドである上記（25)〜（33)の 、ずれか 1項に記載の試薬や、（41)測定す べきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオカルシ ンであって、 VLポリペプチドが、配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである 上記（25)〜（33)のいずれか 1項に記載の試薬や、（42)測定すべきペプチド力 配 列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオカルシンであって、 VHポリ ペプチドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、かつ VLポリべプチ ドカ 配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドである上記（25)〜（33)の!ヽず れカ 1項に記載の試薬に関する。
図面の簡単な説明
[図 1]組換え spFvファージミドベクター pKST2ZKTM219のプロモーターの下流の 構造を示す。
[図 2]KTM— 219由来の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを提示したファージ を用いた ELISAによるォステオカルシンの検量線である。 [図 3]KTM— 219由来の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを用いたオープン サンドイッチ ELISAによるォステオカルシンの検量線である。
[図 4]KTM— 219由来の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを用いたオープン サンドイッチ ELISAによる OC— 1ペプチドの検量線である。
[図 5]KTM— 219を用 、た競合阻害 ELISAによる OC - 1ペプチドの検量線である
[図 6]固定ィ匕した KTM— 219および標識ィ匕した KTM— 223を用いたサンドイッチ E LISAによるォステオカルシンの検量線である。
[図 7]結合性した KTM— 223および標識ィ匕した KTM— 219を用いたサンドイッチ E LISAによるォステオカルシンの検量線である。
[図 8]VH—AP融合蛋白質発現プラスミド pET—VH219—APのプロモーターの下 流の構造を示す。
[図 9]MBP— VL融合蛋白質発現プラスミド pMAL— VL219のプロモーターの下流 の構造を示す。
[図 10]KTM— 219の VH— AP融合蛋白質および MBP— VL融合蛋白質を用 、た オープンサンドイッチ ELISAによるォステオカルシン（國）および OC— 1ペプチド（參 )の検量線である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法としては、測定す べきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列を ェピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を 含まないポリペプチド (VHポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領 域を含んでかつ重鎖可変領域を含まな 、ポリペプチド (VLポリペプチド）を用いる方 法であれば特に制限されるものではなぐまた、本発明の測定すべきペプチドの非競 合的な検出または定量用のキットとしては、測定すべきペプチドに特異的に結合し、 かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をェピトープとするモノクローナル抗 体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変領域を含まな 、ポリペプチド (VHポリぺプ チド)と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含 まな 、ポリペプチド (VLポリペプチド）を有するキットであれば特に制限されるもので はなぐ本発明において「ペプチド」とは、 2以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した 物質を意味し、力かるペプチドには数十個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した ポリペプチドも含まれる。以下、上記モノクローナル抗体の作製、 VHポリペプチドお よび VLポリペプチドの調製、ペプチドの検出または定量方法や検出または定量用の 試薬について順次説明する。
[0015] 1.測定すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をェピトープとするモノクロ一 ナル抗体の作製
本発明のペプチドの非競合的な検出または定量方法を完成させるためには、測定 すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する配列をェピトープとするモノクローナル抗 体を作製することが必要である。ェピトープとなる連続する配列は、好ましくは 6以上 1 9以下のアミノ酸の配列である。
本発明に用いる測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸 配列の連続する配列をェピトープとするモノクローナル抗体は、例えば以下のように してハイプリドーマより産生される抗体として作製することができる。
[0016] (1)免疫原の調製
本発明に用いる測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸 配列の連続する配列をェピトープとするモノクローナル抗体は、例えば、測定すべき ペプチドを直接免疫原として用いて調製することができるが、測定対象とすべきぺプ チドの部分配列、好ましくは測定すべきペプチドのアミノ酸配列の連続する 5以上 30 以下、より好ましくは 5以上 20以下、特に好ましくは 6以上 19以下のアミノ酸の配列を 含むペプチドを免疫原として調製される。また、測定すべきペプチドのアミノ酸配列の N末端または C末端の領域の、連続する 6以上、好ましくは 6以上 19以下の配列を含 むペプチドを免疫原とすることにより、調製されたモノクローナル抗体力 測定すべき ペプチドと特異的に結合する可能性を高くすることができる。
[0017] 免疫原となるペプチドの製造法としては、化学合成法、酵素法、遺伝子組換え法など 力 Sあげられる (例えば、「ペプチドと蛋白工学、藤野政彦編、講談社サイェンティフイツ ク」参照）が、化学合成法が好適に用いられる。ペプチドの化学合成法は、官能基の 保護されたアミノ酸を順次反応させてペプチドを合成する方法であるが、一般に液相 合成法と固相合成法とが知られている。特に固相合成法では自動ペプチド合成機に よる合成が可能である。酵素法は、蛋白質分解酵素の逆反応を利用してペプチド結 合形成を行わせる方法である。酵素法はペプチドの末端の数個のアミノ酸を変更し た 、ときに有効な方法である。
[0018] 遺伝子組換え法では、免疫原となるペプチドをコードする cDNAを含む発現べクタ 一を大腸菌（Escherichia coli、以下 E.colと表記する）、酵母、昆虫細胞、動物細胞な どに導入してリコンビナントペプチドを得る方法があげられる。免疫原となるペプチド をコードする cDNAを得る方法としては、該ペプチドをコードする塩基配列を含むプ ライマーを用いて PCRを行うなどの方法があげられる。
[0019] また、ヒトォステオカルシンのアミノ酸配列（配列番号 3)の連続する 6〜 19アミノ酸 の配列（以下、 OCェピトープ配列とよぶ）、例えば配列番号 1または 2のアミノ酸配列 力もなるペプチドを免疫原とした場合、ォステオカルシンおよび免疫原としたペプチド の OCェピトープ配列を含むペプチドに特異的に結合し、免疫原としたペプチドの O Cェピトープ配列をェピトープとするモノクローナル抗体を得ることができる。このモノ クローナル抗体の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを利用して、本発明の方法 による、ォステオカルシンおよび免疫原としたペプチドの OCェピトープ配列を含むぺ プチドの非競合的な検出または定量を行うことができる。
[0020] 免疫原となるペプチド自体を動物に免疫する方法も可能であるが、該ペプチドをキ ャリア蛋白質とコンジュゲートしたものを免疫原として利用するのがより好ましい態様 である。キャリア蛋白質としては、例えばゥシ血清アルブミン（以下、 BSAと略す)ゃキ 一ホール'リンペット'へモシァニン（以下、 KLHと略す）などが用いられる。
[0021] ペプチドとキャリア蛋白質とのコンジュゲートの方法は、それぞれの官能基の間で、 リンカ一を介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことが可能である。 官能基としては、例えばカルボキシル基ゃァミノ基、グリシジル基、チオール基、水酸 基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基などがあげられ るが、この官能基同士の間で縮合反応を行わすことが可能である。
[0022] リンカ一を介さない結合方法としては、例えば 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノ プロピル)カルポジイミド塩酸塩（以下、 EDCと略す)などのカルポジイミド化合物を使 う方法があげられる。反応を増強する物質として N—ヒドロキシサクシイミド (以下、 N HSと略す)またはその誘導体を使用することも可能である。
[0023] リンカ一としては、例えば、キャリア蛋白質とペプチドの側鎖の官能基をお互いに結 び付け合う分子であればどのようなものでもよい。好ましいリンカ一としては、例えば、 キャリア蛋白質のアミノ酸残基と反応することができる第 1の反応活性基と、ペプチド の側鎖の官能基と反応することができる第 2の反応活性基とを同時に持つ分子であり 、第 1の反応活性基と第 2の反応活性基が異なる基であることが好ましい。反応活性 基としては例えば、ァリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、ヒドロキシメチルホスフィ ン、イミドエステル、イソシァネート、マレイミド、 NHS—エステル、ペンタフルオロフェ -ル（PFP)—エステル、ソラレン、ピリジルジスルフイド、ビュルスルフォンなどの各反 応基が挙げられる。
[0024] キャリア蛋白質とのコンジュゲートを効率よく行わせるために、ペプチドの N末端ま たは C末端の 、ずれか一方にシスティンを有するペプチドを使用することも好ま ヽ 。末端にシスティンを有するペプチドの合成方法は、上記の化学合成法、酵素法、 遺伝子組換え法などを利用することが可能である。
[0025] この様にして得られたペプチドおよびペプチドのコンジュゲート蛋白質は、以下の 抗体産生細胞を作製する際の免疫原として使用されるが、また、抗体産生細胞のス クリーニング、抗体産生細胞が産生するモノクローナル抗体の確認、あるいは測定す べきペプチドの検出方法または定量方法において、標準物質として使用することもで きる。
[0026] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
動物、例えば 3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターに上記（1)に記載の方法 で調製した免疫原を投与し免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産 生細胞を採取する。
[0027] 免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバントととも に免疫原を投与することにより行う。アジュバントとしては、例えば、フロイントの完全 アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ヮ クチンなどがあげられる。
[0028] 免疫原の投与は、例えば 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 5〜10回行う。各投与 後、例えば 3〜7日目に眼底静脈叢より採血して血清を調製し、その血清に含まれる 抗原ペプチドに特異的に結合する抗体の量を以下の（3)に示す酵素免疫測定法な どで調べる。免疫に用いた免疫原に対しその血清が十分な抗体価を示したマウス、 ラットまたはハムスターを、抗体産生細胞の供給源とする。
[0029] 免疫原の最終投与後例えば 3〜7日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスター より脾臓などを摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を培地、例えば MEM (minimum ess ential medium)あるいは RPMI— 1640などの培地中で細断し、ピンセットでほぐし、 遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨て、緩衝液、例えばトリス一塩ィ匕アンモ- ゥム緩衝液 (pH7. 65)または市販の赤血球溶解緩衝液などで 1〜2分間処理し赤 血球を除去し、上記培地で洗浄して抗体産生細胞として提供する。
[0030] (3)酵素免疫測定法
免疫原となるペプチドとキャリア蛋白質のコンジュゲート蛋白質の 1〜50 gZmL の濃度の溶液を 96ゥエルの EIA用プレートに 50〜100 μ LZゥエルずつ分注し、 4 °Cで一晩ないしは室温で 30分以上放置してプレートにコートする。次いで、 1%BSA を含む PBS溶液（以下、 BSA— PBSと記す）などを 100〜200 μ L/ゥエルずつ分 注し、室温 1〜2時間または、 4°Cで一晩以上放置して、プレート上に残った蛋白質と の結合残基をブロッキングする。その後、 BSA— PBSを捨て、 PBSでよく洗浄した後 、第一抗体として被免疫動物血清、抗ペプチドモノクローナル抗体のノ、イブリドーマ 培養上清もしくは精製抗体 1〜10 g/mLを 50〜： LOO /z L/ゥエルに分注し、 4°C で一晩ないしは室温で 30分以上放置する。 PBSまたはツイーン (Tween) 20などの 界面活性剤を含む PBS (以下、 Tween— PBSと記す)で、よく洗浄した後、第二抗体 としてペルォキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した抗ィムノグロ ブリン抗体 1〜50 μ gZmLを 50〜： LOO μ LZゥエルずつ分注し、室温で 1〜2時間 または、 4°Cで一晩以上放置する。 Tween— PBSでよく洗浄した後、第二抗体の標 識酵素により発色する基質を加えて反応を行ない、プレートリーダーにより吸光度を 測定して発色量を測定し、抗体量の指標とする。 [0031] (4)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。例えば、 8—ァザグ ァニン耐性マウス（BALBZc由来）骨髄腫細胞株 P3— X63— Ag8— Ul (Curr. To p. Microbiol. Immunol, 81, 1-7, 1978)、 NSlZl—Ag4—l (Eur. J. Immunol, 6, 5 11-519, 1976)、 SP2/0— Agl4 (Nature, 276, 269-270, 1978)、 P3— X63— Ag8 . 653 (j.Immunol., 123, 1548—1550, 1979)、 P3—X63— Ag8 (Nature, 256, 495-49 7, 1975)などが用いられる。これらの細胞株は、 8 ァザグァニン培地〔正常培地 (R PMI— 1640培地に 1. 5mmol/Lグルタミン、 50 mol/L2—メルカプトエタノー ル、 10 μ gZmLゲンタマイシンおよびゥシ胎児血清（FCS)をカ卩えた培地）に、 15 gZmL8—ァザグァニンをカ卩えた培地〕などで継代する力 細胞融合の数日前に正 常培地に継代し、融合当日 7 X 106個以上の細胞数を確保するのが好ましい。
[0032] (5)細胞融合とハイプリドーマの選択
上記（2)で免疫した抗体産生細胞と上記 (4)で得られた骨髄腫細胞を、 PBS (phos phate buffered saline, 1. 83gZLリン酸ニナトリウム、 0. 21g/Lリン酸一カリウム、 7 . 65gZL塩ィ匕ナトリウム、 pH7. 2)などでよく洗浄し、細胞数力 抗体産生細胞:骨 髄腫細胞 = 5〜10 : 1になるよう混合し、遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨 て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングリコール 1000 (以下、 PEG— 1000と略す）、 MEMまたは RPMI— 1640培地、およびジメ チルスルホキシドの混液を 108個の抗体産生細胞当たり 0. 2〜lmLを加え、 MEM または RPMI— 1640培地を徐々に数回に分けて全量がおよそ 50mLになるように滴 下する。遠心分離して細胞を沈降した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後 、 HAT培地（正常培地に 100 μ mmolZLヒポキサンチン、 15 molZLチミジンお よび 0. 4 /z molZLアミノプテリンをカ卩えた培地）およそ lOOmL中に、メスピペットによ る吐出吸引でゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を 96ゥエル培養用プレートに およそ 100 LZゥエルずつ分注し、 5%COインキュベータ一中、 37°Cで 7〜14日
2
間程度培養する。
[0033] 培養後、培養上清の一部をとり、前述 (3)の酵素免疫測定法または後述 (6)の競 合阻害法などにより、抗原ペプチドに特異的に結合する抗体が含まれる培養上清を スクリーニングする。ついで、選択された培養上清に対応するハイブリドーマを、限界 希釈法によりクローユングを 2〜3回繰り返し〔1回目は、 HT培地 (HAT培地力もアミ ノプテリンを除いた培地）、 2回目以降は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体 価の認められたものを抗ペプチドモノクローナル抗体産生ノ、イブリドーマ株として選 択する。
[0034] (6)競合阻害法
上記（3)の酵素免疫測定法において、第 1抗体を 25〜50 /z LZゥエルで分注する 前あるいは同時に、抗原ペプチド 5〜50 μ gZmLを 25〜50 μ LZゥエルで分注し、 混和したものを 4°Cで一晩な 、しは室温で 30分以上放置する。以降の操作は前述（ 3)の酵素免疫測定法と同一である。陰性対照ゥエルとしては、ペプチドをコンジュゲ ートしたキャリア蛋白質をコートしないゥエルを作製し、陽性対照ゥエルとして、抗原べ プチド溶液ではなぐ抗原ペプチドを含まない溶液を分注したゥエルを作製する。ノ、 イブリドーマの培養上清を測定試料としたとき、陰性対照ゥエルで発色がみられず、 陽性対照ゥエルで発色がみられ、しカゝも抗原ペプチドを分注したゥエルでは陽性対 照ゥエルの発色が阻害されるような培養上清には、抗原ペプチドに特異的に結合す る抗体が含まれることが確認できる。
[0035] (7)モノクローナル抗体の調製
0. 5mLのプリスタン（pristane、 2, 6, 10, 14ーテトラメチルペンタデカン）を腹腔内 に投与し、 2週間飼育した 8〜： LO週令のマウスまたはヌードマウスに、（5)で得られた 抗ペプチドモノクローナル抗体産生ノ、イブリドーマ細胞を腹腔内注射する。 10-21 日程度でハイプリドーマは腹水癌化する。このマウス力も腹水を採取し、遠心分離し て固形分を除去後、 40〜50%硫酸アンモ-ゥムによる塩析、力プリル酸沈殿法、 D EAE—セファロースカラム、プロテイン A—カラム、ゲル濾過カラム等による精製を行 なう。
[0036] 抗体のサブクラスの決定は、例えばサブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測 定法により行うことができる。蛋白質量の定量は、例えばローリー法または 280nmで の吸光度より算出することができる。
[0037] 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 配列をェピトープとするモノクローナル抗体として、例えば、ヒトォステオカルシンの C 末端 12アミノ酸配列 (配列番号 1)力もなる部分ペプチド (OC— 1ペプチド)を抗原と して得られたマウスモノクローナル抗体 KTM— 219、ヒトォステオカルシンの N末端 1 3アミノ酸の配列の C末にシスティンを付加した配列（配列番号 2)からなるペプチド（ OC— 2ペプチド）を免疫原として得られたマウスモノクローナル抗体 KTM— 223を あげることができる。 KTM— 219はヒトォステオカルシンおよび配列番号 1のアミノ酸 配列を含むペプチドに特異的に結合し、配列番号 3の 38— 49位の連続したアミノ酸 配列をェピトープに有し、 KTM— 223はヒトォステオカルシンおよび配列番号 2のァ ミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合し、配列番号 3の 1 13位の連続したアミ ノ酸配列をェピトープに有する。
また、モノクローナル抗体の抗原ペプチドとの結合性は、 VH領域および VL領域の アミノ酸配列で決定され、特に相補性決定領域 (CDR) 1、 CDR2および CDR3のァ ミノ酸配列が重要であるので、 VH領域のアミノ酸配列力 KTM— 219の VH領域の アミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、 VL領域のアミノ酸配列力 KTM- 2 19の VL領域のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、 VH領域の CDR1、 C DR2および CDR3のアミノ酸配列が、 KTM— 219の VH領域の CDR1、 CDR2およ び CDR3のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体、 VL領域の CDR1、 CDR2 および CDR3のアミノ酸配列が、 KTM— 219の VL領域の CDR1、 CDR2および C DR3のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル抗体は、 KTM— 219と同様に、本発 明の OC—1ペプチドおよびォステオカルシンを検出または定量する方法に用いる V Hポリペプチドおよび VLポリペプチドの調製に用いることができる。また、 VH領域の アミノ酸配列力 KTM— 223の VH領域のアミノ酸配列と同じであるモノクローナル 抗体、 VL領域のアミノ酸配列力 KTM— 223の VL領域のアミノ酸配列と同じである モノクローナル抗体、 VH領域の CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列力 KT M— 223の VH領域の CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列と同じであるモノ クローナル抗体、 VL領域の CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列力 KTM — 223の VL領域の CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列と同じであるモノクロ ーナル抗体は、 KTM— 223と同様に、本発明の OC— 2ペプチドおよびォステオ力 ルシンを検出または定量する方法に用いる VHポリペプチドおよび VLポリペプチドの 調製に用いることができる。
[0039] 2. VHポリペプチドおよび VLポリペプチドの調製
本発明において VHポリペプチドとは、抗体の VH領域を含み、 VL領域を含まない ポリペプチドを意味し、 VLポリペプチドとは抗体の VL領域を含み、 VH領域を含まな いポリペプチドを意味する。
[0040] 本発明で用いることのできる VHポリペプチドとしては、 VH領域を有しかつ VL領域 を有さないポリペプチドであればどのようなものでもよぐまた、本発明で用いることの できる VLポリペプチドとしては、 VL領域を有しかつ VH領域を有さな 、ポリペプチド であればどのようなものでもよい。すなわち、 VHポリペプチドまたは VLポリペプチド は抗体の一部であってもよぐ可変領域以外の部分である定常領域の全部または一 部を含んでいてもよい。ただし、可変領域以外の部分を含む場合は、後述する方法 で重鎖 (H鎖)と軽鎖 (L鎖）間のジスルフイド結合を形成するシスティン残基を別のァ ミノ酸に変換することが好ましい。また、 VH領域または VL領域に VHポリペプチド、 VLポリペプチドとは免疫学的に区別されるペプチド（以下タグペプチドとよぶ）を付 加した VHポリペプチドまたは VLポリペプチドであってもよい。なお、 VH領域または VL領域は抗体の可変領域部分であることから、本発明では、 VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを総称して可変領域ポリペプチドと呼ぶこともある。
[0041] 本発明のペプチドの検出または定量方法に適した、 VHポリペプチドおよび VLポリ ペプチドの組み合わせは、例えばモノクローナル抗体 KTM— 219由来の VHポリべ プチドおよび VLポリペプチドの組み合わせをあげることができる。また、（i)KTM— 2 19の VH領域のアミノ酸配列である配列番号 5のアミノ酸配列を含むポリペプチドま たは KTM— 219の VH領域の CDR1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列である、 配列番号 8、 9および 10のアミノ酸配列をその VH領域の CDR1、 CDR2および CD R3の配列として含むモノクローナル抗体由来の VHポリペプチドと（ii) KTM— 219 の VL領域のアミノ酸配列である配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは 1 1^— 219の¥1^領域のじ01^1、 CDR2および CDR3のアミノ酸配列である、配列 番号 11、 12および 13のアミノ酸配列をその VL領域の CDR1、 CDR2および CDR3 の配列として含むモノクローナル抗体由来の VLポリペプチドの組み合わせをあげる ことができる。これらの VHポリペプチドおよひ ポリペプチドは、ヒトォステオカルシ ンまたは配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドを検出または定量する本発明の 方法に用いることができる。
[0042] KTM— 219由来の VHポリペプチドおよひ Lポリペプチドは、後述するように遺伝 子組換え技術によって得ることができる。 KTM— 219由来の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドの原核生物発現用 spFvファージミドベクター PKST2/KTM219は 平成 16 (2004)年 9月 14日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総 合研究所 特許生物寄託センター（T305— 8566 本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地 1 中央第 6)に FERM BP— 10120として寄託されている。
[0043] 可変領域ポリペプチドはモノクローナル抗体から作製することができる。 VHポリべ プチドと VLポリペプチドを分離するための適切なプロテアーゼを用いることによって 可変領域ポリペプチドを製造することが可能である。プロテアーゼとしてはエンドぺプ チダーゼが好適である。あるいは、 VHポリペプチドと VLポリペプチドを分離するため に還元剤で処理することによって、ジスルフイド結合を開裂することも可能である。還 元剤としては、 2—メルカプトエタノールゃジチオスレィトールなどがあげられる。
[0044] VHポリペプチドと VLポリペプチドを分離する別の態様としては、 H鎖と L鎖の間の ジスルフイド結合を形成する、 H鎖または L鎖内の！/、ずれか一方または両方のシステ イン残基を別の適当なアミノ酸残基に変換することがあげられる。別のアミノ酸として は例えばセリン、グリシン、ァラニンなどの中性アミノ酸が好適である力 Sこれには限ら ない。
[0045] システィン残基を別のアミノ酸残基に変換する方法としては、ペプチド特異的モノク ローナル抗体を生産するハイブリドーマから、 mRNAを取得し、次いで該 mRNAか ら VH領域または VL領域を含む抗体または抗体の一部をコードする cDNAを調製し 、H鎖と L鎖の間のジスルフイド結合を形成するシスティンのコドンを別の適当なァミノ 酸のコドンに公知の方法で変換し、この変換した VH領域または VL領域を含む抗体 または抗体の一部をコードする cDNAを原核生物発現ベクターあるいは真核生物発 現ベクターにそれぞれ導入し、発現させることにより製造することができる。変換の方
され ¾ 紙 (規則 91)· 法としては、所望のコドンに正確に塩基置換を導入できる方法であればどのような方 法でもよ 、が、 PCRを使用する方法が好適である。
[0046] 本発明の可変領域ポリペプチドを製造するより好ましい態様としては、遺伝子組み 換え産物として製造する方法があげられる。まず、ペプチド特異的モノクローナル抗 体を生産するハイブリドーマから、 mRNAを取得し、次いで該 mRNAから H鎖をコー ドする cDNAの VH領域を含む断片、および L鎖をコードする cDNAの VL領域を含 む断片をクローニングし、これを原核生物発現ベクターある 、は真核生物発現べクタ 一にそれぞれ挿入して、組換えベクターを作製し、該組換えベクターで宿主細胞を 形質転換し、得られた形質転換体を培養して、 VHポリペプチドまたは VLポリべプチ ドを発現させて培養物中に生成 ·蓄積させ、該培養物中カゝら蓄積したる VHポリぺプ チドまたは VLポリペプチドを採取することにより製造することができる。
[0047] 上記 cDNAをクローユングする方法としては PCRが好適である。 VH領域および V L領域の N末の領域はフレームワーク領域 (FR)なので、同じ動物種の同じクラスで あれば、その cDNAの配列が比較的保存されている。したがってフォワードプライマ 一として、保存された 17〜30ヌクレオチドの配列に基づく縮重プライマーを設計でき る。このような縮重プライマーとしては、マウス IgGの FR1の配列に対応する配列番号 14または 15の塩基配列からなる DNA、マウス κ鎖の FR1の配列に対応する配列番 号 17または 20の塩基配列からなる DNAがあげられる。また、 VH領域および VL領 域それぞれの直後にある定常領域をコードする cDNAの配列は、動物種と抗体のク ラスが同じであれば保存されているので、この保存された 17〜30ヌクレオチドの定常 領域の配列に基づくリバースプライマーを設計できる。このようなリバースプライマーと しては、マウス IgGlの定常領域の配列に対応する配列番号 16の塩基配列力もなる DNA、マウス κ鎖の定常領域の配列に対応する配列番号 18の塩基配列からなる D NAがあげられる。 cDNA断片の増幅のためには、ペプチド特異的モノクローナル抗 体を生産するハイブリドーマ力も RNAを取得し、この RNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成し、得られた cDNAを铸型とする逆転写 PCR (RT— PCR)を、上記の フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて行う。ノヽイブリドーマからの RNA の単離 fま、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, し old Spring Harbo r Laboratory Press, 2001等の実験書の記載に基づいて行うことができる。 RT— PCR ίま Molecularし loning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold bpnng Haroor Labora tory Press, 2001等の実験書の記載に基づいて行うことができる。また、キアゲン'ワン ステップ RT—PCRキット（QIAGEN OneStep RT- PCR Kit)等のキットを用いて行うこ とちでさる。
PCRの方法としては、 NASBA法（カイノス社）、 TMA法（バイエルメディカル社）、 S DA (strand displacement amplification)法（ベタトン'ディキンソン社）、 ICAN法（宝酒 造社）、 LAMP (Loop- mediated Isothermal Amplification)法（栄研化学社）などの等 温 PCRと呼ばれる一連の方法あるいはこれらの方法の変法を用いてもょ 、。以下に 、組換えベクターと形質転換体の作製および形質転換体の培養、ポリペプチドの単 離について記載する。
[0048] (1)形質転換体の作製
発現ベクターとしては、宿主細胞において自律複製可能ないしは染色体中への組 込が可能で、宿主細胞中で可変領域ポリペプチドをコードする DNA力 mRNAを 転写できるプロモーターを含有して 、るものが用いられる。
[0049] 宿主細胞としては、原核生物、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、可変領 域ポリペプチドを発現できるものであれば!/ヽずれも用いることができる。
[0050] 細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、発現ベクターは宿主原核生物 中で自律複製可能であり、プロモーターおよびその下流にリボソーム結合配列およ び可変領域ポリペプチドをコードする DNAを挿入するクローユングサイトを有するも のを用いる。必ずしも必要ではないが、該クローニングサイトの直後に転写終結配列 を配置する方が好ましい。また、形質転換体の選択のため、薬剤耐性遺伝子等のマ 一力一となる遺伝子を発現する配列を含むようにする。リボソーム結合配列の下流の クロー-ングサイトに可変領域ポリペプチドをコードする DNAを挿入する。リボソーム 結合配列と開始コドンとの間は適当な距離 (例えば、 E.coli宿主のベクターの場合 6 〜18塩基）に調節されていることが好ましい。
[0051] プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい 。例えば E.coliを宿主とした場合は、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 PLプロモー ター、 T7プロモーター、 PRプロモーター等の、 E.coliやファージ等に由来するプロモ 一ター等をあげることができる。また trpプロモーターを 2つ直列させたプロモーター、 tacプロモーター、 T71acプロモーター、 letlプロモーターのように人為的に設計改変 されたプロモーター等も用いることができる。枯草菌を宿主とした場合は、枯草菌のフ ァージである SPOlや SP02のプロモーター、 PenPプロモーター等をあげることがで きる。
[0052] 発現ベクターとしては、例えば、 pGEMEX—l (プロメガ社製）、pQE— 30 (キァゲ ン社製）、 PKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、 pLSAl [Agric. Biol. Che m" 53, 277 (1989)〕、 pGELl〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、 pTrS 30 [E.coli JM109/pTrS30(FERM BP- 5407)より調製〕、 pGEX—5X—3 (アマシャム' バイオサイェンシズ社製）、 ρΕΤ14 (ノバジェン社製）、 pPROTet. E (クロンテック社 製) pRSET A (インビトロジェン社製)等を例示することができる。
[0053] 宿主細胞としては、ェシエリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、 コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シユードモナス属等に属する微生物、例 えば、 E.coli XLl— Blueゝ E.coli XL2— Blueゝ E.coli DH1、 E.coli MC1000、 E.coli KY327 6、 E.coli W1485、 E.coli JM109、 E.coli HB101、 E.coli No.49、 E.coli W3110、 E.coli N Y49、 E.coli BL21 (DE3) pLysS、 Serratiaficaria、 Serratia fonticola、 Serratia liquefacie ns、 Serratiamarcescens、 Bacillus subtilis、 Bacillus amyloliquefaciens、 Brevibacterium ammoniagenes、 Brevibacterium immariophilum ATCC14068、 Brevibacteriumsacchar olyticum ATCC14066、 Corynebacterium glutamicumATCC 13032、 Corynebacterium glutamicum ATCC14067、 Corynebacteriumglutamicum ATCC13869、 Corynebacteri um acetoacidophilumATCC13870、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、 Ps eudomonassp. D- 0110等をあげることができる。
[0054] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であ ればいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Nucleic Acids Res ., 16, 6127 (1988)〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982)〕、プロトプラスト法〔特開昭 63- 248394; Mol. Gen . Genet., 168, 111 (1979)〕等をあげることができる。 [0055] また、発現ベクターとして、 M13ファージゃ flファージ等の繊維状バタテリオファー ジの DNA複製基点を有するファージミドベクターを用いることもできる。ファージミド ベクターを用いる場合は、 F因子を有する E.coliを宿主として糸且換えベクターを導入 する。また、組換えベクターの作製の際に、可変領域ポリペプチドをコードする DNA にファージのコート蛋白質をコードする DNAを連結させて、可変領域ポリペプチドと コート蛋白質との融合蛋白質を発現する構造にして、宿主に導入した後、ヘルパー ファージを感染させることにより、培養液中に、表面に可変領域ポリペプチドを提示し たファージ粒子を放出させることもできる。この場合、ファージ粒子自体を、ファージ で標識された可変領域ポリペプチドとして、 3.に後述するペプチドのオープンサンド イッチ法による検出または定量に用いることができる。
[0056] 酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主酵母で転写を行な うプロモーター、転写の終止配列および酵母での形質転換マーカーとなる遺伝子、 たとえば薬剤耐性遺伝子や TRP1、 HIS3、 LEU2等のアミノ酸合成系の遺伝子を発 現できる配列を含有しているものが用いられる。また、発現ベクターの作製や維持を 容易にするため、 E.coli内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝 子を発現できるものが好ま U、。
[0057] プロモーターとしては、酵母中で転写を行なえるものであればいずれのものを用い てもよく、例えば Saccharomyces cerevisiaeのァノレコーノレデヒドロゲナーゼ遺伝子 AD Hl、ガラクトース代謝系遺伝子 GAL1や GAL10等のプロモーター、酸性フォスファ ターゼ遺伝子 PH05プロモーター、フォスフォグリセレートキナーゼ遺伝子 PGKプロ モーター、グリセルアルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 GAPプロモーター、ヒ ートショック蛋白質遺伝子プロモーター、 α接合因子遺伝子 MF a 1プロモーター、 銅メタ口チォネイン遺伝子 CUP1プロモーター、 Pichiapastorisのアルコールォキシダ ーゼ遺伝子 AOX1のプロモーター等が用いられる。
[0058] 宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピヒア属等に属す る酵母菌株をあげることができ、具体的には、 Saccharomyces cerevisiae^ Schizosacch aromycespombe、 Pichia pastoris等をあけること力 21 eさる。
[0059] 組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であればいずれ も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods EnzymoL, 194, 182 ( 1991)〕、スフエロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)]、酢酸リチ ゥム法〔J. BacterioL, 153, 163 (1983)〕等をあげることができる。
[0060] 動物細胞を宿主として用いる場合の発現ベクターとしては、宿主動物細胞で転写を 行なうプロモーター、転写の終止と転写物のポリアデュル化のシグナルの配列を含 有しているものが用いられる。またベクターの作製や維持を容易にするため、 E.coli 内でも自律複製と遺伝子導入マーカーとなる薬剤耐性遺伝子を発現できるものが望 ましい。プロモーターとしては、動物細胞中で転写を行なえるものであればいずれも 用いることができるが、 SV40の初期プロモーター、ヒトサイトメガロウィルスの IE (imm ediate early)遺伝子のプロモーターおよびェンハンサー、ラウス肉腫ゥイノレス、ヒト T 細胞白血病ウィルス I、モロ-一マウス白血病ウィルス等のレトロウイルスの LTR等の ウィルス由来の配列、あるいはメタ口チォネイン遺伝子や |8—ァクチン遺伝子、伸長 因子 1などの動物細胞由来の遺伝子のプロモーター等をあげることができる。また SV40の初期プロモーターとヒト T細胞白血病ウィルス Iの LTRを組み合わせた SR a プロモーター等これらのプロモーターを人為的に糸且み合わせたプロモーターも用いら れる。
[0061] 宿主染色体 DNAに可変領域ポリペプチドをコードする DNAが組み込まれた恒常 的な可変領域ポリペプチド発現細胞は、 G418、ハイグロマイシン等の薬剤に対する 耐性遺伝子を発現できる配列を含む可変領域ポリペプチド発現ベクターを宿主細胞 に導入し、薬剤の存在下で培養することにより選択することができる。また、宿主細胞 中での可変領域ポリペプチドの生産量を上昇させるために、ジヒドロ葉酸レダクタ一 ゼ (dhfr)遺伝子を発現できるような配列を含む可変領域ポリペプチドの恒常的発現 ベクターを宿主細胞に導入し、 dhfr阻害剤であるメトトレキセート（methotrexate)の濃 度を段階的に上げながら培養することにより、 dhfr遺伝子とともに可変領域ポリぺプ チドをコードする DNAのコピー数を増幅させることもできる。この dhfr遺伝子を用い た遺伝子増幅を行なう場合の宿主細胞としては、 dhfr遺伝子が機能して ヽな 、細胞 、例えば CHOZdhfr— (ATCC:CRL- 9096)などを用いる。
[0062] 具体的な発現ベクターとして、例えば、 pEGFP-C2 (クロンテック社）、 Autographa californica核多角体病ウィルス、カイコ核多角体病ウィルス等が用いられる。昆虫細 胞としては Spodopterafrugiperdaの細胞である Sf 9および Sf 21〔Baculovirus Expressi on Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freeman and company, New York (1992)] 、 Trichoplusia niの細胞である High5 (インビトロジェン社製）等を用いることができる。 トランスファーベクターには、ポリヘドリンプロモーターおよび相同組換えを起こさせる ためのバキュロウィルス由来の配列、ベクターの維持 ·増殖や外来遺伝子の組み込 み等の遺伝子操作を E.coli内で行なうための配列（E.coliでの自律複製可能な配列 および薬剤而性遺伝子 PAGE107〔特開平 3- 22979; CytotechnoL, 3, 133, (1990)〕 、 pAS3- 3 (特開平 2- 227075)、 pCDM8〔Nature, 329, 840, (1987)〕、 pCMV—Tagl (ストラタジーン社製） pcDNA3. 1 ( + ) (インビトロジェン社）、 pREP4 (インビトロジェ ン社製）、 pMSG (アマシャム'バイオサイェンシズ社製）、 pAMo〔J. Biol. Chem., 26 8, 22782 (1993)〕等があげられる。
[0063] 宿主細胞としては、ヒト細胞である HeLa、ナマルバ (Namalwa)、 293、アフリカミド リザル腎臓細胞である COS— 1や COS— 7、ハムスターの細胞である CHOや BHK 、マウス胎児細胞である NHI3T3、マウス'ミエローマ細胞である SP2Z0や NS0、ラ ット ·ミエローマ細胞である YB2Z0等の細胞株をあげることができる。
[0064] 組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法〔Cytotechnol.， 3, 133 (19 90)〕、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リボフヱクシヨン法〔Proc. Natl. Acad.S ci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。
[0065] 昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合は、バキュロウィルス発現系〔Baculovirus Ex pression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1 992); Bio/Technology, 6, 47 (1988)〕が用いられる。即ち、トランスファーベクターに可 変領域ポリペプチドをコードする DNAを挿入した後、該ベクターとバキュロウィルスを 昆虫細胞に同時に導入し、強力なプロモーターであるポリヘドリン遺伝子プロモータ 一下に可変領域ポリペプチドをコードする DNAが挿入された組換えバキュ口ウィル スを相同組換えによって作製した後、この組換えバキュロウィルスを再度昆虫細胞に 感染させることにより、可変領域ポリペプチドを発現することができる。 [0066] バキュロウィルスとしては Autographa californica核多角体病ウィルス、カイコ核多角 体病ウィルス等が用いられる。昆虫細胞としては Spodoptera frugiperdaの細胞である S19および S12l LBaculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W. H. Freem an and Company, New York (1992)]、 Trichoplusia niの細胞である High5 (インビトロジ ェン社製)等を用いることができる。トランスファーベクターには、ポリヘドリンプロモー ターおよび相同組換えを起こさせるためのバキュロウィルス由来の配列、ベクターの 維持 ·増殖や外来遺伝子の組み込み等の遺伝子操作を大腸菌内で行なうための配 列 (大腸菌での自律複製可能な配列および薬剤耐性遺伝子)が含まれており、具体 的には pVL1392、 pVL1393、 pBlueBac4. 5 (ともにインビトロジェン社製）、 pBac PAK9 (クロンテック社製)等があげられる。
[0067] 可変領域ポリペプチドが、免疫原とした抗原ペプチドに対する特異的な結合性を保 持するためには、可変領域ポリペプチドの N末に分泌蛋白質のシグナルペプチドが 付加したポリペプチドをコードするように、プロモーターと可変領域ポリペプチドをコー ドする配列の間にシグナルペプチドをコードする配列を挿入して組換え発現ベクター を構築するのが好まし 、。このような組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、 培養液中に、シグナルペプチドが切断され除かれた可変領域ポリペプチドを分泌す る。また、下記に記載した可変領域ポリペプチドと抗体以外のポリペプチドとの融合 蛋白質を発現させる場合に、抗体以外のポリペプチドが細胞膜上の蛋白質やファー ジのコート蛋白質であれば、融合蛋白質の N末にシグナルペプチドが付カ卩したポリべ プチドをコードするように組換え発現ベクターを構築することにより、形質転換体ある いは形質転換体力 放出されたファージ粒子の細胞表面に融合蛋白質が提示され る。シグナルペプチドとしては、宿主が原核生物の場合は原核生物の分泌蛋白質や 膜蛋白質、宿主が真核生物の場合は真核生物の分泌蛋白質や膜蛋白質のシグナ ルペプチドを用いるのが好まし 、。
[0068] VH領域または VL領域にタグペプチドを付加した可変領域ポリペプチド、すなわち タグペプチドと可変領域ポリペプチドとの融合蛋白質を製造する方法としては、上記 可変領域ポリペプチドをコードする cDNA断片に抗体以外のポリペプチドをコードす る cDNAを付加して発現させる方法が好適である。 [0069] タグペプチドは所望のペプチドを選ぶことが可能であり、本発明の態様の性能を向 上させるためにポリペプチドを選ぶことが好ましい。性能とは例えば、本発明の測定 方法の感度を向上させること、安定性を向上させること、再現性を向上させること、本 発明に使われる操作を簡便にすること、操作時間を短縮すること、必要とする実験器 具を簡易なものに変えることを容易にすること、該融合蛋白質の回収，精製を容易に すること、固相への固定ィ匕を可能とすることなどがあげられる。また、 3.に後述するよ うに可変領域ポリペプチドの標識物質がポリペプチドである場合も、同様に可変領域 ポリペプチドと標識用のポリペプチドとの融合蛋白質を製造することができ、得られた 融合蛋白質を標識ィ匕した可変領域ポリペプチドとして用いることができる。
[0070] 具体的には例えば、該融合蛋白質を精製する操作を簡便かつ迅速に行うことを可 能にするために、マルトース結合蛋白質 (MBP)、ダルタチオン S トランスフェラ ーゼ (GST)、精製抗体の認識する蛋白質などと VHポリペプチドまたは VLポリぺプ チドの融合蛋白質、あるいは、ヒスチジンの繰り返し構造（一般にはヒスチジンのへキ サマーが用いられる）、精製抗体のェピトープペプチドなどを付加した VHポリべプチ ドまたは VLポリペプチドがあげられる。その他市販の融合蛋白質発現システムを用 いる方法として、例えば、ピオチンタグ融合蛋白質発現システムを用いる PinPointTM Xa Protein Purification System (プロメガ社）、特定のリジン残基がビォチン化される 配列を利用したバイオイーズ発現システム (インビトロジェン社)、キチン結合蛋白質と の融合蛋白質として発現させるインパクト CNシステムまたはインパクト TWINシステム (第一化学社)などがあげられる。
[0071] また例えば、ファージ表面蛋白質との融合蛋白質として発現することで、該融合蛋 白質を精製することなく本発明の検出または定量法を構築することが可能である。フ ァージコート蛋白質との融合蛋白質として発現させるためには、 VHポリペプチドまた は VLポリペプチドを含む遺伝子をクローユングし、これを任意のファージミドベクター に組換えることで可能である。あるいは、 VHポリペプチドまたは VLポリペプチドを含 む遺伝子とファージ表面蛋白質との間にアンバーコドンを配置し、これを非サプレツ サー株の E.coliへ形質転換することで可溶性蛋白質として発現させることも可能であ る。 [0072] (2)形質転換体の培養
可変領域ポリペプチドをコードする DNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有す る微生物、動物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、可変 領域ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より可変領域ポリペプチドを採取するこ とにより、可変領域ポリペプチドを製造することができる。
[0073] 動物細胞を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている RPMI 1640培地〔J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)〕、イーグル（Eagle)の ME M (Mimimum Essential Medium) [Science, 122, 501 (1952)〕、ダノレべッコ (Dalbecco) 改変イーグル培地 [Virology, 8, 396 (1959)〕、 199培地〔Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)〕またはこれら培地にゥシ胎児血清等を添加した培地等を用いることがで きる。必要に応じてペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間
2
行う。
[0074] 昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に 使用されている TNM—FH培地〔ファーミンジェン（Pharmingen)社製〕、 Sf—900 II SFM培地（インビトロジェン社製）、 ExCell400、 ExCell405〔いずれも JRHバイオサ イエンシズ (JRH Biosciences)社製〕、 Graceの昆虫培地 [Nature, 195, 788 (1962)] 等を用いることができる。培養条件は、 pH6〜7、培養温度 25〜30°Cがよぐ培養時 間は、通常 1〜5日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物 質を培地に添加してもよい。
[0075] E. coli等の原核生物ある 、は酵母等の真核微生物を宿主として得られた形質転換 体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含 有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のい ずれを用いてもよい。
[0076] 炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラクトース、 スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水 化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール 類等を用いることができる。 [0077] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモ-ゥム塩、その他の含窒 素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼィ ン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化 物等を用いることができる。
[0078] 無機塩としては、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸マグネシウム、 硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシ ゥム等を用いることができる。
[0079] 培養は通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度 は 15〜40°Cがよぐ培養期間は、通常 16〜96時間である。培養中 pHは 3. 0〜9. 0に保持する。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシ ゥム、アンモニア水などを用いて行う。必要に応じて、培養期間中にアンピシリンゃテ トラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ 、。
[0080] 誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養すると きには、培養中に必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。インデュー サ一としては、例えば、 lacプロモーターを誘導するイソプロピルガラクトシド、 trpプロ モーターを誘導するインドールアクリル酸等があげられる。
[0081] (3)発現させたポリペプチドの単離精製
上記形質転換体の培養物中に蓄積した可変領域ポリペプチドを単離精製するには 、以下のような通常の蛋白質の単離精製法を用いればょ 、。
[0082] 可変領域ポリペプチドが細胞外に分泌される場合には、培地中に可変領域ポリべ プチドが蓄積する。従って培養終了後、遠心分離等の手法により細胞を含まない培 地のみを回収する。該培地から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、 DEAEセファロース、 DIAI ON HP A- 75 (三菱化学社製）、モノ Q (Mono Q、アマシャム'バイオサイェンシズ 社製)等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 SPセファロース (アマシ ャム 'バイオサイェンシズ社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法 、ブチルセファロース、フエ-ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフ ィ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォ 一力シング法、および等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独ある!/ヽは組 み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
[0083] 可変領域ポリペプチドが、形質転換体の細胞内に蓄積する場合には、培養終了後 の培養物から、形質転換体の細胞を遠心分離等の手法により回収し、緩衝液にけん 濁後、超音波破砕機、フレンチプレス等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。 可変領域ポリペプチドが細胞内で溶解状態で存在する場合には、該無細胞抽出液 を遠心分離することにより得られた上清から、上記の培地からの精製単離と同様にし て精製標品を得ることができる。また、可変領域ポリペプチドが細胞内に不溶体を形 成して存在する場合は、該無細胞抽出液を遠心分離後、沈殿画分として可変領域ポ リペプチドの不溶体を回収する。この可変領域ポリペプチドの不溶体を蛋白質変性 剤で可溶化した後、該可溶化液を、蛋白質変性剤の濃度を蛋白質が変性しない程 度まで希釈するか、あるいは、蛋白質変性剤を含まないかまたは蛋白質変性剤の濃 度が蛋白質が変性しない程度まで希薄な溶液に透析し、可変領域ポリペプチドを正 常な立体構造に復元させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ること ができる。
[0084] また、公知の方法〔J. Biomol. NMR, 6, 129 (1998); Science, 242, 1162 (1988); J.Bi ochem., 110, 166 (1991)〕に準じて、インビトロ転写 ·翻訳系を用いて可変領域ポリべ プチドを生産することができる。すなわち、可変領域ポリペプチドをコードする DNAを SP6、 T7、 Τ3等のプロモーターの下流につなげ、それぞれのプロモーター特異的 な RNAポリメラーゼを反応させることにより大量の可変領域ポリペプチドをコードする RNAをインビトロで合成した後、無細胞系の翻訳系例えばゥサギ網状赤血球ライセ ートゃコムギ胚芽抽出液を用いた翻訳系を利用して、可変領域ポリペプチドを生産 することができる。
[0085] 精製した可変領域ポリペプチドの構造解析は、蛋白質ィ匕学で通常用いられる方法 、例えば「遺伝子クローユングのための蛋白質構造解析」（平野久著、東京化学同人 発行、 1993年）に記載の方法により実施可能である。
[0086] 3.ペプチドの検出または定量方法、及び検出または定量用のキット 本発明のペプチドの検出または定量方法や、ペプチドの検出または定量用のキッ トは、前記のとおり、測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのァミノ 酸配列の連続する配列をェピトープとするモノクローナル抗体の VHポリペプチドと、 該モノクローナル抗体の VLポリペプチドを用いる測定すべきペプチドの非競合的な 検出または定量方法や、上記 VHポリペプチドと VLポリペプチドを備えた測定すべき ペプチドの非競合的な検出または定量用のキットであれば特に制限はな 、が、例え ばオープンサンドイッチ ELISA法、 2種類の標識物質を用いるホモジ-ァスオープン サンドイッチ法などの方法や、そのためのキットがあげられる。
(A)オープンサンドイッチ ELISA法
本発明のペプチドの検出または定量方法として、測定すべきペプチドを固相へ捕 捉するために VHポリペプチドまたは VLポリペプチドのいずれか一方（以下、第 1の 可変領域ポリペプチドという）を固相へ固定ィ匕し、他方 (以下、第 2の可変領域ポリべ プチドという）を測定すべきペプチドを検出するために標識することを特徴とする方法 力 Sあげられる。この方法では、測定すべきペプチドを、固相に固定化された第 1の可 変領域ポリペプチド（固定ィ匕ポリペプチド)および標識された第 2の可変領域ポリぺプ チド (標識ィ匕ポリペプチド）に接触させて結合させ、測定すべきペプチドを介して固定 化ポリペプチドと結合した標識ィ匕ポリペプチドの標識物質を検出または定量すること により、測定すべきペプチドを検出または定量することが可能である。固定化ポリぺプ チドへの測定すべきペプチドの接触と、標識化ポリペプチドの測定すべきペプチドへ の接触は同時ではなく順次行なうこともできる。また、本発明のペプチドの検出または 定量方法として、第 1の可変領域ポリペプチドと標識された第 2の可変領域ポリぺプ チド (標識化ポリペプチド)を、固相の存在下で測定すべきペプチドと接触させること によって、固相、第 1の可変領域ポリペプチド、標識化ポリペプチドおよび測定すべき ペプチドからなる複合体を形成せしめ、同時に第 1の可変領域ポリペプチドを同相に 固相化させ、固相に結合した、該複合体の標識物質を検出または定量することにより 、測定すべきペプチドの検出または定量をする方法もあげられる。第 1の可変領域ポ リペプチドを固相に固定ィヒさせる方法としては、例えば、第 1の可変領域ポリペプチド として、タグペプチドが付加した可変領域ポリペプチドを用い、固相として、該タグべ プチドに特異的に結合する抗体を固定ィ匕した固相を用いる方法や、第 1の可変領域 ポリペプチドとして、マルトース結合蛋白質 (MBP)が付加した可変領域ポリペプチド (MBPと融合させた可変領域ポリペプチド）を用いて固定ィ匕した固相を用いる方法が あげられる。
[0088] オープンサンドイッチ ELISA法は次の手順によって行うことが可能である。固相に 第 1の可変領域ポリペプチドを固定ィ匕した後、ブロッキング剤によりブロッキングする。 ブロッキング剤を捨て洗净液でよく洗净した後、濃度既知のペプチド標品あるいは濃 度未知の被験サンプルを加え反応させる。洗浄液でよく洗浄した後、標識物質で標 識された第 2の可変領域ポリペプチドを反応させる。洗浄液で再び洗浄した後、該標 識物質に応じた反応を行なう。濃度既知のペプチド標準物質を段階的に希釈して作 成した検量線より、被験サンプルの濃度を算出することができる。
[0089] オープンサンドイッチ ELISA法を用いた検出試薬または定量試薬の構成要素とし ては、測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続 する配列をェピトープとするモノクローナル抗体由来の VHポリペプチド、該モノクロ ーナル抗体由来の VLポリペプチド、第 1の可変領域ポリペプチドを固定ィ匕するため の固相となる担体、第 1の可変領域ポリペプチドが固定化された固相（固相に固定さ れている第 1の可変領域ポリペプチド)、検出に用いる標識された第 2の可変領域ポリ ペプチドや、標識物質 1で標識された標識化 VHポリペプチドと標識物質 2で標識さ れた標識化 VLポリペプチドなどがあげられ、また必要に応じ、ブロッキング剤、生体 試料の希釈液、反応緩衝液、洗浄液、標識物質の検出用試薬または該ペプチドの 標準物質などを含む、キットの形態であっても良い。
[0090] (1)可変領域ポリペプチドの標識
標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ピオチン、ジゴキ シゲニン、繊維状ファージ、タグ配列を含むポリペプチドなどがあげられる。
[0091] 酵素としては、任意の公知 (石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院)の酵素標 識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼ、ガラ クトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどを用いることができる。
[0092] 蛍光物質としては、任意の公知 (川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社)の蛍 光物質を用いることができる。例えば、 FITC標識、 RITC標識などを用いることがで きる。その他の蛍光物質として、例えば quantum dot (Science, 281,2016-2018, 19 98)があげられる。または、フィコエリスリンなどのフィコピリ蛋白質、 GFP (Green fluor escent Protein)、 RFP (Red fluorescent Protein)、 YFP (Yellow fluorescent Protein; 、 BFP (Blue fluorescent Protein)あるいはこれの類縁蛋白質のように蛍光を発する蛋 白質であってもよい。
[0093] 発光物質としては、任意の公知 [今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨 床検査 42(1998)]の発光体標識を用いることができる。例えば、アタリジ-ゥムおよび その誘導体標識、ルテニウム錯体ィ匕合物標識、口フィン標識などを用いることができ る。またルテニウム錯体化合物は Clin.Chem.37,9,1534-1539(1991)に示されたものが 好ましく本化合物は電子供与体と共に電気化学的に発光する。
[0094] 放射性同位元素としては、任意の公知の物質を用いることができる。例えば、 、 14 C、 35S、 32P、 33P、 125I、 51Crなどがあげられる。
[0095] 低分子化合物としては、ピオチン、ジゴキシゲニンなどが、繊維状ファージとしては 、 M13ファージゃ flファージなど力 タグ配列を含むポリペプチドとしては FLAGぺ プチド（FLAGタグ、 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys)、ポリヒスチジン（ Hisタグ、 His His His His His His)、 mycェピトープペプチド（mycタグ、 Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu)、へマグルチニンェピトープぺ プチド（HAタグ、 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala)などがあげられ る。
[0096] 可変領域ポリペプチドを上記の標識物質により標識化する方法としては、遺伝子ェ 学的に結合させる方法や、化学的に結合させる方法が用いられる。遺伝子工学的に 結合させる方法は、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 974, 1996; Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 93, 7826, 1996)記載の方法に従って行うことができる。化学的に結合 させる方法は、文献（Science, 261, 212, 1993)記載の方法に従って行うことができる 。また、放射性同位元素をィ匕学的に結合させる方法は、文献 (Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990; )記載の方法に従って行うことができる。
[0097] 標識物質がポリペプチドの場合には、公知の遺伝子組換え技術 (Molecular Clonin g: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) および上記 2.の記載にしたがって、標識物質と可変領域ポリペプチドの融合蛋白質 として製造することができる。このような態様に適した標識物質としては、例えば、フィ コエリスリンなどのフィコビリ蛋白質、 GFP (Green fluorescent Protein)、 RFP (Red flu orescent Protein)、 YFP (Yellow fluorescent Protein)、 BFP (Blue fluorescent Protei n)あるいはこれの類縁蛋白質のように蛍光を発する蛋白質あるいは、アルカリフォス ファターゼ、ペルォキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ などの酵素、アビジン、抗体の定常領域、タグ配列を含むポリペプチドなどがあげら れる。遺伝子組換え技術を用いて融合蛋白質をコードする DNAを作製するには、本 発明の可変領域ポリペプチドおよび標識物質をそれぞれコードする DNAを PCRな どでクロー-ングし、それぞれの DNAをリガーゼ反応で連結する。あるいは、それぞ れの DNAの PCR断片にのりしろの部分を設けるようプライマーを設計し、このプライ マーによって 1回目の PCRを行い、続いて得られた PCR断片をのりしろ部分でァ- 一リングさせ、 2回目の PCRを行う方法も好適である。 2回目の PCRの時に、融合遺 伝子が増幅しやすくなるよう、融合遺伝子の両端または外側に設計されたプライマー を添加する場合もある。
[0098] ペプチドと標識物質とのコンジュゲートの方法は、それぞれの官能基の間で、リンカ 一を介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことが可能である。官能 基としては、カルボキシル基ゃァミノ基、グリシジル基、チオール基、水酸基、アミド基 、イミノ基、ヒドロキシサクシ-ルエステル基、マレイミド基、イソチオシァネート基など 力 Sあげられるが、この官能基同士の間で縮合反応を行わすことが可能である。
[0099] リンカ一を介さない結合方法としては例えば、 EDCなどのカルポジイミドィ匕合物を 使う方法があげられる。反応を増強する物質として NHSまたはその誘導体が使用す ることも可能である。イソチオシァネート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を 必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで結合できる。
[0100] リンカ一としては、例えば、キャリア蛋白質とペプチドの側鎖の官能基をお互いに結 び付け合う分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、キャリア 蛋白質のアミノ酸残基と反応することができる第 1の反応活性基と、ペプチドの側鎖 の官能基と反応することができる第 2の反応活性基を同時に持つ分子であり、第 1の 反応活性基と第 2の反応活性基が異なる基であることが好ま 、。反応活性基として は例えば、ァリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミド エステル、イソシァネート、マレイミド、 NHS—エステル、 PFP—エステル、ソラレン、 ピリジルジスルフイド、ビュルスルフォン、イソチオシァネートなどの各反応基が挙げら れる。
[0101] 標識物質の検出手段としては、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。
すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、 分光光度計やマルチウエルプレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が 蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウエルプレートリーダーなどを用い ることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウエル プレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合 、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーシヨンカウンターなどにより測定す ること〖こより決定することができる。
[0102] 標識が酵素である場合、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定 することにより、標識量を測定することができる。
[0103] 酵素がペルォキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法などによりべ ルォキシダーゼ量を測定することができる。吸光度法によりペルォキシダーゼ量を測 定する方法としては、例えばペルォキシダーゼとその基質である過酸ィヒ水素および 酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマ ルチウエルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。酸化発色型色原 体としては、例えばロイコ型色原体、酸ィ匕カップリング発色型色原体などがあげられる
[0104] ロイコ型色原体は、過酸ィヒ水素およびペルォキシダーゼなどの過酸ィヒ活性物質の 存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、。―フエ-レンジァミン、 10— N—カルボキシメチルカルバモイルー 3, 7—ビス（ジメチルァミノ）— 10H—フエ ノチアジン（CCAP)、 10— N—メチルカルバモイル— 3, 7—ビス（ジメチルァミノ）— 10H—フエノチアジン（MCDP)、 N— (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）—4, 4， —ビス（ジメチルァミノ）ジフエ-ルァミン ナトリウム塩（DA— 64)、 4, 4，—ビス（ジメ チルァミノ）ジフエ-ルァミン、ビス〔3—ビス（4—クロ口フエ-ル)メチル—4—ジメチル ァミノフエ-ル〕ァミン（BCMA)などがあげられる。
[0105] 酸化カップリング発色型色原体は、過酸ィヒ水素およびペルォキシダーゼなどの過 酸化活性物質の存在下、 2つの化合物が酸ィ匕的カップリングして色素を生成する物 質である。 2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとァ-リン類（トリンダー試薬 )との組み合わせ、カプラーとフエノール類との組み合わせなどがあげられる。カプラ 一としては、例えば 4ーァミノアンチピリン (4— AA)、 3—メチルー 2 べンゾチアゾリ ノンヒドラジンなどがあげられる。ァ-リン類としては、 N— (3—スルホプロピル）ァ-リ ン、 N ェチル N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3—メチルァ-リン（T OOS)、 N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）—3, 5—ジメチルァ -リン（MAOS)、 N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3, 5— ジメトキシァ-リン（DAOS)、 N—ェチルー N— (3—スルホプロピル）—3—メチルァ 二リン（TOPS)、 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3, 5—ジメトキシァユリ ン（HDAOS)、 N, N ジメチルー 3—メチルァ-リン、 N, N ジ（3—スルホプロピ ル）—3, 5—ジメトキシァ-リン、 N—ェチル N— (3—スルホプロピル）—3—メトキ シァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3— スルホプロピル）一 3, 5—ジメトキシァ-リン、 N— (3—スルホプロピル）一 3, 5—ジメ トキシァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル）—3, 5—ジメチルァ-リン、 N —ェチルー N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン、 N ェ チル一 N— (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3—メ チルフエ-ル） N，—サクシ-ルエチレンジァミン（EMSE)、 N ェチル N— (3 —メチルフエ-ル） N，一ァセチルエチレンジァミン、 N ェチル N— (2—ヒドロ キシ— 3—スルホプロピル）—4—フルオロー 3, 5—ジメトキシァ-リン（F— DAOS) などがあげられる。フエノール類としては、フエノール、 4—クロ口フエノール、 3—メチ ルフヱノール、 3 ヒドロキシ—2, 4, 6 トリョード安息香酸（HTIB)などがあげられ る。
[0106] 蛍光法によりペルォキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルォキシダー ゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光 度計や蛍光マルチウエルプレートリーダーなどで生成した蛍光の強度を測定する方 法などがあげられる。当該蛍光物質としては、例えば 4ーヒドロキシフエニル酢酸、 3 一（4ーヒドロキシフエ-ル）プロピオン酸、クマリンなどがあげられる。
[0107] 発光法によるペルォキシダーゼ量を測定する方法としては、例えばペルォキシダー ゼとその基質である過酸ィ匕水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強 度計や発光マルチウエルプレートリーダーなどで生成した発光の強度を測定する方 法などがあげられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン 化合物などがあげられる。
[0108] 酵素がアルカリフォスファターゼである場合には、例えば発光法などによりアルカリ フォスファタ一ゼ量を測定することができる。発光法によりアルカリフォスファターゼ量 を測定する方法としては、例えばアルカリフォスファターゼとその基質とを反応させ、 生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウエルプレートリーダーなどで 測定する方法などがあげられる。アルカリフォスファタ一ゼの基質としては、例えば 3 - (2'—スピロアダマンタン） 4—メトキシ一 4— (3'—ホスホリルォキシ）フエ-ルー 1 , 2 ジォキセタン'ニナトリウム塩 (AMPPD)、 2 クロ口一 5— {4—メトキシスピロ [1 , 2 ジォキセタン一 3, 2'— (5'—クロ口）トリシクロ [3. 3. 1. I3' 7]デカン]— 4—ィル }フエ-ルホスフェート 'ニナトリウム塩（CDP— Star™)、 3— {4—メトキシスピロ [1, 2 —ジォキセタン一 3, 2'— (5'—クロ口）トリシクロ [3. 3. 1. I3' 7]デカン]— 4—ィル }フ ェ-ルホスフェート 'ニナトリウム塩（CSPD™)、 [10—メチル—9 (10H)—アタリジ- ルイデン]フエノキシメチルリン酸'ニナトリウム塩 (Lumigen™ APS - 5)などがあげ られる。
[0109] 酵素が β D ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法 (比色法）、発 光法または蛍光法などにより β D ガラクトシダーゼ量を測定することができる。吸 光度法 (比色法）により β D ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えば σ—ニトロフェル j8—D—ガラクトピラノシドなどがあげられる。発光法により j8 -D- ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例えば j8— D ガラクトシダーゼとその 基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウエルプレートリー ダーなどで測定する方法などがあげられる。 j8— D ガラクトシダーゼの基質として は、例えば Galacton-Plus (アプライドバイオシステムズ社)またはその類似化合物など があげられる。蛍光法により j8— D—ガラクトシダーゼ量を測定する方法としては、例 えば β D ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度 計や蛍光マルチウエルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。 β― D—ガラクトシダーゼの基質としては、例えば 4ーメチルゥンベリフェル 13 D—ガラク トピラノシドなどがあげられる。
[0110] 酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法などによりルシフェラーゼ量 を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ量を測定する方法としては、例 えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光 マルチウエルプレートリーダーなどで測定する方法などがあげられる。ルシフェラーゼ の基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジンなどがあげられる。
[0111] 標識物質が蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の 場合は、標識物質に特異的に結合する物質を蛍光物質、発色物質、発光物質、放 射性同位元素または酵素等で標識したものと第 2の可変領域ポリペプチドを標識す る標識物質を結合させ、標識物質に特異的に結合する物質を標識している蛍光物 質、発色物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様 にして検出を行う。標識物質をに特異的に結合する物質としては、標識物質を特異 的に結合する抗体、また標識物質がピオチンの場合は、アビジンやストレブトァビジ ンをあげることができる。また、標識物質に特異的に結合する抗体、アビジンまたはス トレブトアビジンを標識せずに、第 2の可変領域ポリペプチドを標識する標識物質と 結合させた後、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体またはアビジンまたはスト レプトアビジンに特異的に結合する抗体を蛍光物質、発色物質、発光物質、放射性 同位元素または酵素で標識したものを結合させ、これらの抗体を標識して 、る蛍光 物質、発色物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同 様にして検出を行うこともできる。
[0112] これらの検出に用いる抗体、アビジンまたはストレプトアビジンや標識物質に特異的 に結合する抗体、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレ ブトアビジンに特異的に結合する抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナ ル抗体であってもよく、あるいは Fab, Fab，ゝ F (ab)，ゝ F (ab，) 、 scFv、 dsFv、 Diab
2
ody、および CDRを含むペプチドなどを用いることができる。
[0113] (2)可変領域ポリペプチドの固定ィ匕
抗ペプチドモノクローナル抗体由来可変領域ポリペプチドを固定ィヒするための担 体としては、抗体を結合させて保持できるものであればいかなるものも包含されるが、 各種高分子素材を用途に合うように成形した素材が用いられる。
[0114] 可変領域ポリペプチドを固定ィ匕させる担体の形状としてはチューブ、ビーズ、プレ ート、ラテックスなどの微粒子、スティックなど力 素材としてはポリスチレン、ポリカー ボネート、ポリビュルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビュル、ナイ口 ン、ポリメタタリレート、ゼラチン、ァガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート などの高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属などがあげられる。
[0115] 可変領域ポリペプチドの固定ィ匕の方法としては物理学的結合を利用した方法とィ匕 学的結合を利用した方法またはこれらの併用など、公知の方法が用いられる。物理 学的結合としては、例えば物理吸着、静電的結合、水素結合、疎水結合などがあげ られる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合などがあげられる。例えば 、ポリスチレン製免疫測定用マイクロタープレートに可変領域ポリペプチドを疎水固 定ィ匕したものがあげられる。
[0116] 可変領域ポリペプチドは、直接、固相に固定ィ匕してもよいし、可変領域ポリペプチド をピオチン一アビジンなどを介してから、固相に固定ィ匕してもよい。また、可変領域ポ リペプチドにタグペプチドが付加されて 、る可変領域ポリペプチドにお 、ては、タグ ペプチドに対する抗体を固相に固定ィ匕し、次いで可変領域ポリペプチドを固定ィ匕す ることが可能である。
[0117] あるいは、可変領域ポリペプチドは、リンカ一を介して固相に固定ィ匕してもよい。リン カーとしては、例えば、蛋白質と固相の側鎖の官能基をお互いに結び付け合う分子 であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、蛋白質のアミノ酸残基と 反応することができる第 1の反応活性基と、固相の側鎖の官能基と反応することがで きる第 2の反応活性基を同時に持つ分子であり、第 1の反応活性基と第 2の反応活性 基が異なる基であることが好ましい。反応活性基としては例えば、ァリルアジド、カル ボジイミド、ヒドラジド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシァネート、マレ イミド、 NHS—エステル、 PFP—エステル、ソラレン、ピリジルジスルフイド、ビ-ルス ルフォンなどの各反応基が挙げられる。
[0118] 共有結合によって固定ィ匕することに適した固相の側鎖の官能基としては、カルボキ シル基ゃァミノ基、グリシジル基、チオール基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシ サクシニルエステル基、マレイミド基、など、反応して化学的に結合できる基があるも のが望ましい。
[0119] (3)キットのその他の構成要素
上記の可変領域ポリペプチドを固定ィ匕させた固相は、ブロッキングにより、担体上 に残存する官能基を保護する。免疫学的測定法のブロッキングに用いられる物質と しては、通常蛋白質、界面活性剤およびブロックエース (大日本製薬株式会社製)等 の市販のブロッキング試薬などが用いられる。ブロッキングに用いることができる蛋白 質としては、正常動物血清、ゥシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶液などが 好適である力 これには限らない。正常動物血清に用いられる動物としては、ヒトまた はマウス以外ではすべての動物種が使用できる力 ャギ、ヒッジ、ゥサギ、ブタなどが 好適である。血清濃度は 0. 1〜20%の範囲で任意に選ぶことが可能である力 1〜 5%が最も好適である。ゥシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶液などの濃度は 0. 1〜20%の範囲で任意に選ぶことが可能である力 1〜5%が最も好適である。ブ ロッキングに用いることができる界面活性剤の種類としては、トライトン X— 100、ツイ ーン 20などを用いることができる。ブロッキング温度は 4°C〜37°Cの範囲で自由に設 定できる。ブロッキング時間は反応温度にしたがって適切に設定可能である力 室温 の場合には 10分以上 1時間以内などの条件が好ましい。
[0120] 生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などに安定化剤を含む水溶液な どがあげられる。検体として全血を用いる場合には、水性溶液は、赤血球などの血球 の膨張や収縮による血清中の成分濃度の変化を防止する目的で、塩類、糖類など、 緩衝剤などにより等張液に調製されたものであることが好ましい。塩類としては、特に 制限はないが、例えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウムなどのハロゲン化アルカリ金属塩 などがあげられる。糖類としては、特に制限はないが、例えば、マン-トール、ソルビト ールなどの糖アルコールなどがあげられる。
[0121] 反応緩衝液としては、可変領域ポリペプチドと生体試料中の抗原とが結合反応を することができればいかなるものであってもよい。また、必要に応じて、界面活性剤、 防腐剤、安定化剤、反応促進剤あるいは酵素活性調節剤などを添加してもよい。
[0122] 洗浄液としては、通常未反応の物質を除去、洗浄でき、抗原と可変領域ポリべプチ ドの反応に影響を与えなければ、いかなるものも使用することができる。また、必要に 応じて、緩衝剤、界面活性剤、蛋白質、防腐剤あるいは安定化剤などを添加してもよ い。蛋白質としては、正常動物血清、ゥシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン溶 液などが好適であるが、これには限らない。これらの蛋白質の濃度は、 0. 1〜20% の範囲で任意に選ぶことが可能である力 1〜5%が最も好適である。界面活性剤の 種類としては、トライトン X— 100、ツイーン 20などが用いることができる。界面活性剤 の濃度 ίま 0. 005-0. 50/0力好ましく、 0. 01〜0. 20/0力より好まし!/ヽ。
[0123] 生体試料の希釈液、反応緩衝液あるいは洗浄液などに用いられる緩衝液としては 、緩衝液に用いる緩衝剤は緩衝能を有するものならば特に限定されないが、 ρΗ1〜 11の例えば乳酸緩衝剤、クェン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸 緩衝剤、リン酸緩衝剤 (但し、標識がアルカリフォスファターゼである場合を除く）、トリ エタノールァミン緩衝剤、ジエタノールァミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩 衝剤、トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝 剤、シユウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、 グッド緩衝剤などがあげられる。グッド緩衝剤としては、例えば MES (2—モノレホリノエ タンスルホン酸)緩衝剤、ビス トリス [ビス（2—ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキ シメチル)メタン]緩衝剤、 ADA[N— (2—ァセトアミド)イミノニ酢酸]緩衝剤、 PIPES [ピペラジン一 N, N，一ビス（2—エタンスノレホン酸）]緩衝剤、 ACES {2- [N— (2— ァセトアミド）ァミノ]エタンスルホン酸 }緩衝剤、 MOPSO (3 モルホリノ 2 ヒドロ キシプロパンスルホン酸）緩衝剤、 BES { 2— [N, N ビス（2—ヒドロキシェチル）アミ ノ]エタンスルホン酸 }緩衝剤、 MOPS (3—モルホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤、 T ES〈2— {N— [トリス（ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸〉緩衝剤、 HE PES [N- (2—ヒドロキシェチル） N， - (2—スルホェチル）ピぺラジン]緩衝剤、 D IPSO{3- [N, N ビス（2 ヒドロキシェチル）ァミノ]— 2 ヒドロキシプロパンスル ホン酸 }緩衝剤、 TAPSO〈2 ヒドロキシ— 3— { [N トリス（ヒドロキシメチル)メチル] アミノ}プロパンスルホン酸〉緩衝剤、 POPSO [ピペラジン— N, N，—ビス（2—ヒドロ キシプロパン— 3—スルホン酸）]緩衝剤、 HEPPSO [N- (2—ヒドロキシェチル） N， - (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ピぺラジン]緩衝剤、 EPPS [N—（2 ヒド 口キシェチル） -N' - (3—スルホプロピル）ピぺラジン]緩衝剤、トリシン [N トリス（ ヒドロキシメチル)メチルグリシン]緩衝剤、ビシン [N, N ビス（2—ヒドロキシェチル） グリシン]緩衝剤、 TAPS { 3— [N トリス（ヒドロキシメチル)メチル]ァミノプロパンス ルホン酸 }緩衝剤、 CHES [2- (N シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸]緩衝剤 、 CAPSO [3- (N シクロへキシルァミノ）—2 ヒドロキシプロパンスルホン酸]緩衝 剤、 CAPS [3—（N シクロへキシルァミノ）プロパンスルホン酸]緩衝剤などがあげら れる。
[0124] 酵素活性調節剤、酵素安定化剤としては、例えばマグネシウムイオン、マンガンィ オン、亜鉛イオンなどの金属イオンがあげられる。試薬中のこれらの金属イオンの含 量としては、測定において、酵素が安定ィ匕される含量であれば特に制限はない。
[0125] 防腐剤としては、例えばアジィ匕ナトリウム、抗生物質などがあげられる。試薬中のこ れらの防腐剤の含量としては、測定において、検体中の被測定物質が適切に測定さ れるような含量であれば特に制限はな 、。
[0126] ペプチドの標準物質としては、化学合成、酵素合成、遺伝子組換え技術により取得 された、あるいは生体試料力 取得された該ペプチドや、該ペプチドが発現している 細胞、該ペプチドの部分ペプチドまたは該ペプチドを一部に有するポリペプチドなど があげられる。あるいは、化学合成、酵素合成によって、該ペプチド、または該ぺプ チドの部分ペプチド、該ペプチドを一部に有するポリペプチドをペプチド性以外の分 子で修飾を施した物質であってもよ 、。
[0127] (4)測定系の工夫
また、本発明の検出または定量方法はすなわち、抗原ペプチドが存在するときに抗 原ペプチドを介して VHポリペプチドと VLポリペプチドが会合することを特徴とする測 定系であるが、該測定系をより性能のよいものにするためには、抗原ペプチドが存在 しな 、ときに、抗原ペプチドを介さず VHポリペプチドと VLポリペプチドが会合するこ とはバックグランドの値を上昇することになるため避けるような工夫が施されることがよ り好ましい。このような工夫としては、例えば抗原ペプチドを介さず VHポリペプチドと VLポリペプチドが会合することを妨げる凝集阻害剤の添加が考えられる。凝集阻害 剤としては例えば、界面活性剤があげられる。本発明に好適な界面活性剤としては、 蛋白質の溶解性を増すィ匕合物であれば何でもよぐ例えば、カルボン酸型、スルホン 酸型、硫酸エステル型、リン酸エステル型の陰イオン界面活性剤、あるいはエステル 型、エーテル型、エステルエーテル型、アル力ノールアミド型の非イオン界面活性剤
、あるいはアルキルアミン塩型、第 4級アンモ-ゥム塩型の陽イオン界面活性剤、力 ルポキシベタイン型、 2—アルキルイミダゾリンの誘導型、グリシン型の両性界面活性 剤があげられる。
[0128] また本発明に好適な上記工夫としては、例えば、反応緩衝液の塩濃度あるいは pH を適切に調製することによる方法も可能である。反応緩衝液の種類としては、例えば 、（A)オープンサンドイッチ ELISAの項に記載の反応緩衝液の態様があげられる。 p Hは 4. 0-10. 0の間力も好適な pHを見出すことができ、塩濃度は 0. Olmmol/L 〜： LOOmmolZLの間から好適な塩濃度を見出すことが可能である。塩濃度を調節 するために、無機塩を添加することも好ましい。無機塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩 、マグネシウム塩など 1価イオンまたは 2価イオンの塩などがあげられる。
[0129] さらに本発明に好適な上記工夫としては、 VHポリペプチドまたは VLポリペプチド のどちらか一方または両方のァミノ残基において、抗原ペプチドを介さず VHポリべ プチドと VLポリペプチドが会合することに関与するァミノ残基を別のアミノ残基に変 更することであってもよい。 VHまたは VLのフレームワーク領域（FR)は、 CDRを抗 原に結合することを可能とする立体形成に関与するとともに、 VHポリペプチドと VLポ リペプチドの結合にも関与することが明ら力となっている。例えば、 Masudaら（14th An nual International Antibody Engineering Conference, 2003)および ¾asajimaり (14th A nnual International Antibody Engineering Conference, 2003)の報告【こ基づ ヽて、 FR 2に存在する VHポリペプチドと VLポリペプチドの結合に重要であると特定されたアミ ノ酸残基に変異を入れることで、抗原が存在しな ヽときの VHポリペプチドと VLポリべ プチドが会合することを抑制することができる。
[0130] (5)測定対象となる物質
本発明のオープンサンドイッチ法はモノクローナル抗体を得るために抗原として用 いられたペプチドを検出、定量するばかりでなぐ該ペプチドを一部に有する分子で あればどのようなものも検出、定量するために適した方法である。該分子としては、該 ペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、糖、脂質、核酸、有機化合物、無機化合物、 高分子ポリマーなど天然に存在、または人工的に創製可能な物質であれば何であつ てもよい。
[0131] 該分子と該ペプチドを人工的に結合させる方法としては、遺伝子工学的に結合さ せる方法、物理学的方法または化学的方法など、公知の方法が用いられる。遺伝子 工学的に結合させる方法としては、公知の遺伝子組換え技術 (Sambrook, Fritsch, M aniatis; Molecularし loning, A Laboratory Manual, し old bpnng Harboi 用 、る力法 があげられる。
物理学的結合としては、例えば物理吸着、静電的結合、水素結合、疎水結合などが あげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合などがあげられる。
[0132] また本発明は、ペプチドを有する細胞または組織を検出、定量するためにも適した 方法である。細胞または組織は、動物、昆虫、微生物力 得られた細胞または組織、 あるいはこれらの生物力 樹立された培養細胞などを含む。ペプチドを有する細胞ま たは組織とは、該ペプチドを含むペプチド、ポリペプチド、糖、脂質、核酸、有機化合 物を発現して!/ヽる細胞または組織が含まれる。あるいは細胞または組織が発現して いるペプチド、ポリペプチド、糖、脂質、核酸、有機化合物を人工的に該ペプチドに 結合させたものを検出または定量することにも用いることができる。人工的に該ぺプ チドを結合する方法は、上述と同様に、遺伝子工学的に結合させる方法、物理的方 法または化学的方法など、公知の方法が用いられる。
[0133] 本発明のペプチドまたは該ペプチドを一部に有する分子の検出試薬または定量試 薬は、本発明の検出方法または定量方法を実施するために用いられ、該方法が実 施できる構成要素を含むペプチドの検出試薬または定量試薬の各構成要素と実質 的に同一、またはその一部と実質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形 態が異なっていても、本発明の試薬に包含される。
[0134] (B) 2種類の標識物質を用いるホモジ-ァスオープンサンドイッチ法
本発明のホモジ-ァスオープンサンドイッチ法としては、 VHポリペプチドに標識物 質 1を、 VLポリペプチドに標識物質 1とは異なる標識物質 2をそれぞれ結合し、標識 物質 1と標識物質 2の相互作用の変化量を検出する方法によっても可能である。該 標識物質の好適な態様としては例えば、蛍光物質があげられる。励起光を受光する ことによって生じた蛍光エネルギー力 近接する異なる蛍光物質の蛍光エネルギーと して利用される。この現象は蛍光共鳴エネルギー移動（FRET:fluorescence resonan ce energy transfer)と呼ばれ、 2種類の蛍光物質が l〜10nmまで近接することにより 起こる現象である。 FRETが起きる蛍光物質の組み合わせとしては、一方の蛍光波 長のスペクトル力 他方の励起波長のスペクトルと重なりがあることが必要である。物 質としては、低分子有機蛍光色素、無機化合物、ポリペプチドなどがあげられる。低 分子有機蛍光色素としては、例えば Cy3と Cy5の組み合わせがあげられる。無機化 合物としては例えば quantum dot (Science, 281,2016-2018, 1998)があげられる。 ポリペプチドとしては、蛍光蛋白質があげられ、例えばクラゲの発光蛋白質あるいは これらの改変蛋白質があげられる。
[0135] また、該標識物質の組み合わせの態様として、化学発光を生じる酵素と蛍光物質 の糸且み合わせをめけること力でき 。 BRET (bioluminescence resonance energy tran sfer)はこれに相当する態様である。例えば、ゥミシィタケルシフェラーゼ (Rluc)が基 質を分解して生じる発光のスペクトルが、蛍光物質の励起スペクトルと重なる場合に 可能である。基質として例えば DeepBlueC (パッカードバイオサイエンス社)を使用 すると、 Rlucの分解によって 395nmの光を生じ、これが Green Fluorescence Protein (GFP)に近接する場合エネルギー移動し、 510nmの波長の光として検出することが 可能である。
[0136] また、該標識物質の組み合わせの態様としては、標識物質 1と標識物質 2が近接し て、ある配向性をもって結合したときに酵素活性を生じる物質の組み合わせであって もよい。これは例えば、標識物質の組み合わせとして j8ガラクトシダーゼのサブュ-ッ トの組み合わせ (Yokozeki, Tら、 Anal. Chem., 74, 2500-2504, 2002)をあげることが できる。好適な態様としては、 VHポリペプチドまたは VLポリペプチドの一方を |8ガラ クトシダーゼの Δ aサブユニットの融合蛋白質とし、他方を βガラクトシダーゼの Δ ω サブユニットの融合蛋白質とする態様があげられる。別の態様として、 Rlucを 2つのド メイン (N末端側ドメインと C末端側ドメイン）に分割し、各々を VHポリペプチドまたは VLポリペプチドの融合蛋白質とする態様でも可能である（Anal. Chem. , 75, 4176-41 81 , 2003) o
[0137] 2種類の標識物質を用いるホモジ-ァスオープンサンドイッチ法を用いた検出試薬 または定量試薬の構成要素としては、標識化された抗ペプチドモノクローナル抗体 由来の VHポリペプチド、標識化された抗ペプチドモノクローナル抗体由来の VLポリ ペプチドなどがあげられ、また必要に応じ、生体試料の希釈液、反応緩衝液、該ぺプ チドの標準物質、非特異的反応阻害剤などを含む、キットの形態であっても良い。標 識物質が酵素の場合には、酵素の基質などが追加される。
[0138] 本発明の測定キットの最良の態様としては例えば、標識化 VHポリペプチド含有液 と、標識化 VLポリペプチド含有液と、被験サンプルと 2種の標識ィ匕ポリペプチドの反 応場である反応緩衝液との 3つの液剤で構成されて 、てもよ 、が、前記 2種の標識化 ポリペプチド含有液があらカゝじめ混合された混合液であってもよぐまた、前記 3つの 液剤が混合された混合液であってもよい。非特異的反応阻害剤は、前記 2種の含有 液に添加されて ヽてもよく、あるいは測定キットを構成する他の試薬 (前記 2種の含有 液および前記反応緩衝液以外の試薬）に添加されていてもよい。測定キットを構成す るそれぞれの試薬は容器等に収容され、本発明の実施に供されるときに適宜希釈し て使用される。
[0139] 生体試料の希釈液、反応緩衝液、洗浄液、該ペプチドの標準物質に好適な態様 は、（1)オープンサンドイッチ ELISA法で述べた態様を適応することが可能である。
[0140] 非特異的反応阻害剤としては、蛋白質の凝集抑制効果のあるものであれば何であ つてもよく、例えば、ゼラチン、アルブミン等の蛋白質;グリコール類;ポリア-オン類； N, N—ジアルキルアミド;低級アルキルスルホキシド、界面活性剤、キレート剤、還元 剤などを挙げることができる。界面活性剤としては、任意の化合物が使用可能である 力 例えばツイーン一 20、トライトン X— 100などがあげられる。キレート剤としては任 意の化合物が使用可能である力 例えば EGTA, EDTAあるいはこれらの類縁体が あげられる。還元剤は、ダルタチオン、メルカプトエタノール、ジチォスライトールなど の SH化合物があげられる。
[0141] 酵素の基質としては、酵素の種類によって（1)オープンサンドイッチ ELISA法で述 ベた態様の中から任意の態様を選ぶことができる。例えば、酵素が j8—D—ガラタト シダーゼである場合には、 σ—-トロフエ-ル D—ガラクトピラノシドなどを基質と して吸光度を測定する態様、 4ーメチルゥンベリフェリル |8— D—ガラクトピラノシドな どを基質として蛍光を測定する態様があげられる。あるいは、酵素が Rlucである場合 には、セレンテラジンまたはその類似化合物などを基質として発光度を測定する態様 があげられる。
[0142] 標識物質の検出手段としては、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。
すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、 分光光度計やマルチウエルプレートリーダーなどを用いることができる。標識物質が 蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウエルプレートリーダーなどを用い ることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウエル プレートリーダーなどを用いることができる。
[0143] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0144] 抗ヒトォステオカルシンペプチド抗体の作製
(1)免疫原の調製
ヒトォステオカルシンの部分ペプチドとして、配列番号 1および 2それぞれのアミノ酸 配列からなるペプチド（以下、それぞれ OC— 1ペプチド、 OC— 2ペプチドとする。ま た、両者をまとめて OCペプチドと表記する）を株式会社ペプチド研究所にて委託合 成をした。配列番号 1は、ヒトォステオカルシンのアミノ酸配列（配列番号 3)の C末端 部分 38〜49位のアミノ酸 12残基力もなる配列、配列番号 2は、ヒトォステオカルシン のアミノ酸配列の N末端部分 1〜13位の配列の C末端にシスティンを付加したァミノ 酸 14残基からなる配列にそれぞれ相当する。 OC— 1ペプチドおよび OC— 2ぺプチ ドをそれぞれ以下の方法で KLHにコンジュゲートした。 OCペプチド 4. 8mgを lmlの 0. ImolZLリン酸バッファー（pH7. 0)に溶解し、ここに 0. ImolZLリン酸バッファ 一（pH 7. 0)に KLHを 20mgZmLになるよう溶解した溶解液を lmL添カ卩し、攪拌 した。 60mgの EDCと、 11. 5mg/mLになるよう NHSを N, N—ジメチルフオルムァ ミドに溶解した液 150 Lを順次添加し、室温で 8時間転倒混和した後、 PBSで、 4 °Cで 3回透析した。得られた OCペプチドコンジュゲート KLHの濃度は、 280nmの吸 光度で測定した。
[0145] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
実施例 1 (1)で得られた 2種類の OCペプチドコンジュゲート KLHそれぞれを PBS lmLに溶解し、フロイントの完全アジュバンド〔MPバイオメディカルズ（MP Biomedica Is)社製〕とともに、 1匹あたり 0. 4mgの OCペプチドコンジュゲート KLHを 5週令雌マ ウス (BalbZc)の腹腔内に投与した。 3週間後に最終免疫として再び、フロイントの不 完全アジュバンド（MPバイオメディカルズ社製）ととも〖こ 1匹あたり 0. 5mgの OCぺプ チドコンジュゲート KLHを腹腔内に投与した。上記の免疫マウスより採血し、その血 清抗体価を以下 (3)に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウス 力も最終免疫の 3日後に脾臓を摘出した。
[0146] 脾臓を MEM (日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐした後、遠心分離（12 00rpm、 5分間）して細胞を沈降させた。上清を捨て、細胞をトリス—塩ィ匕アンモ-ゥ ム緩衝液 (PH7. 65)で 1〜2分間処理して赤血球を除去した後、 MEMで 3回洗浄し 、（5)の細胞融合に用いた。
[0147] (3)酵素免疫測定法
アツセィ用の抗原として、実施例 1 (1)の OCペプチドコンジュゲート KLHの作製と 同様な方法で、 BSAを KLHの代わりに用いて、 OCペプチドコンジュゲート BSAを 作製した。 96ゥエルの酵素免疫測定法 (EIA)用プレートに、 PBSに溶解した 10 g ZmLの OCペプチドコンジュゲート BSAを 50 μ LZゥエルずつ分注し、 4°Cでー晚 放置して吸着させた。洗浄後、 1%の BSA含有 PBSを 100 /z LZゥエルずつ加え、 室温 1時間反応させた。 BSA含有 PBSを捨て、 0. 1%の BSA含有 PBSにて適宜希 釈した被免疫マウス抗血清を 50 LZゥエルずつ分注し室温で 1時間反応させた。 0 . 1%のツイーン 20含有 PBSで洗浄後、ペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウスィムノ グロブリン (ダコ社)を 50 LZゥエルずつ加えて室温で 1時間反応させた。ツイーン 2 0含有 PBSで洗浄後、過酸ィ匕水素含有 o—フエ-レンジアミン基質液 (シグマ社製） を 50 μ LZゥヱルずつ加えて発色させ、次いで 2. 5molZL硫酸を 50 μ LZゥエル ずつ加えて反応を停止させた。 492nmの吸光度（以下、 OD492などと表記する）を プレートリーダー（MTP— 120 ;コロナ電機社製）にて測定した。対照波長は 660nm とした。
[0148] (4)マウス骨髄腫細胞の調製
8—ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3— X63— Ag8— Ul (Curr. Top. Mic robiol. Immunol, 81, 1-7, 1978)を正常培地で培養し、細胞融合時に 7 X 106以上の 細胞を確保し、細胞融合に供した。
[0149] (5)ハイブリドーマの作製
実施例 1 (2)で得られたマウス脾細胞と (4)で得られた骨髄腫細胞とを 10： 1になる よう混合し、 1200rpmで 5分間遠心分離した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよく ほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、 PEG— 1000 2g、 MEM 2mLおよびジメチ ルスルホキシド 0. 7mLの混液を 1 X 108個マウス脾細胞当たり 0. 2〜lmLを加え、 1〜2分間毎に MEM l〜2mLを数回加えた後、 MEMをカ卩えて全量が 50mLにな るようにした。 900rpmで 5分間遠心分離した後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐ した後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞を HAT培地 lOOmL中 に懸濁した。
[0150] この懸濁液を 96ゥエル培養用プレートに 100 μ LZゥエルずつ分注し、 5%CO
2ィ ンキュベータ一中、 37°Cで 10〜14日間培養した。この培養上清を下記（6)に記載し た競合阻害法で調べ、 OCペプチドによって OCペプチドコンジュゲート BSAとの反 応が阻害されるゥエルの細胞を選び、さらに HT培地、続いて正常培地を用いる 2回 クロー-ングを行って、抗 OCペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立 した。
[0151] 以上の方法により、 OC— 1ペプチド、 OC— 2ペプチドそれぞれを抗原ペプチドとし て免疫したマウスから、 OC— 1ペプチドに特異的に結合する抗体を産生するハイブ リドーマおよび OC— 2ペプチドに特異的に結合する抗体を産生するノ、イブリドーマ 1 株ずつが確立され、それぞれ KTM— 219株、 KTM— 223株と名付けた。以下、ハ イブリドーマ KTM - 219株が産生する OC— 1ペプチドに特異的に結合するモノクロ ーナル抗体を KTM— 219と、ハイプリドーマ KTM— 223株が産生する OC— 2ぺプ チドに特異的に結合するモノクローナル抗体を KTM— 223と表記する。また、 KTM 219および KTM— 223は、ヒトォステオカルシンに特異的に結合するモノクロ一 ナル抗体であり、 KTM— 219は、ヒトォステオカルシンのアミノ酸配列（配列番号 3) の 38〜49位の連続するアミノ酸の配列、 KTM— 223は、ヒトォステオカルシンのアミ ノ酸配列（配列番号 3)の 1〜 13位の連続するアミノ酸の配列にそれぞれェピトープ を有する。
(6)競合阻害法
96ゥエルの EIA用プレートに、 PBSに溶解した 10 μ g/mLの OCペプチドコンジュ ゲート BSAを 50 /z LZゥエルで分注し、 4°Cで一晩放置して吸着させた。陰性対照ゥ エルとして、 OCペプチドコンジュゲート BSAを吸着させないゥエルを作製した。洗浄 後、 1%の BSA含有 PBSを 100 /z L/ゥエルでカ卩え、室温 1時間反応させた。 BSA 含有 PBSを捨て、 0. 1%BSA含有 PBSにて適宜希釈した OCペプチド含有液（25 /z LZゥエル）と、 0. 1%BSA含有 PBSにて適宜希釈した抗 OCペプチドモノクロ一 ナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体（50 μ LZゥエル)を分注し室 温で 1時間反応させた。陽性対照ゥエルとして、 OCペプチドを含有しない 0. 1%BS A含有 PBS (25 μ LZゥエル）と、 0. 1%BSA含有 PBSにて適宜希釈した抗 OCぺ プチドモノクローナル抗体の培養上清もしくは精製モノクローナル抗体（50 μ LZゥ エル）を分注し室温で 1時間反応させた。 Tween— 20含有 PBSで洗浄後、ペルォキ シダーゼ標識ゥサギ抗マウスィムノグロブリン (ダコ社)を 50 μ LZゥエルでカ卩えて室 温、 1時間反応させ、 Tween— 20含有 PBSで洗浄後過酸化水素含有 o フエ-レ ンジァミン基質液（シグマ社）を 50 μ LZゥエルでカ卩えて発色させ、次いで 2. 5mol/ L硫酸を 50 LZゥエルでカ卩えて反応を停止させた。 492nmの吸光度（以下、 OD4 92などと表記する）をプレートリーダー（MTP— 120 ;コロナ電機社）にて測定した。 対照波長は 660nmとした。
[0153] (6)モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週令ヌード雌マウス（BalbZc)に実施例 1 (5)で得られたノヽィ プリドーマ株を 5〜20 X 106細胞/匹それぞれ腹腔内注射した。 10〜21日後に、ハ イブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（l〜8mLZ匹 )し、遠心分離 (3000rpm、 5分)して固形分を除去した。得られた腹水は、力プリル 酸沈殿法 [Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (198 8) ]により精製し、精製モノクローナル抗体とした。
[0154] 抗体のサブクラスはサブクラスタイピングキット（ZYMED社)を用いて酵素免疫測 定法により行な ヽ決定した。 KTM— 219および KTM— 223はともに抗体サブクラス は H鎖が IgGlでかつ L鎖が κであった。
実施例 2
[0155] VHポリペプチドおよび VLポリペプチドの調製
( 1) KTM— 219の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドをそれぞれコードする DN Aの調製
KTM— 219の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドをそれぞれコードする DNA を、以下のようにして調製した。まず、 KTM— 219を産生するハイブリドーマ KTM— 219株より常法に基づき、 RNAを抽出精製した。この RNAを铸型とし、下記のプライ マーを用いて、キアゲン'ワンステップ RT—PCRキット（QIAGEN OneStep RT- PCR Kit)〖こより、添付のプロトコルに従って逆転写 PCR (RT—PCR)を行った。
フォワードプライマーとしてマウスィムノグロブリン重鎖のフレームワーク 1 (FR1)領域 に対する縮重プライマー MHlBack (配列番号 14)および MH2Back (配列番号 15 )の等量混合物を、リバースプライマーとしてマウス IgG重鎖定常領域に対するプライ マーであるマウス IgG VH3' 2 (配列番号 16、 Novagen- Merck社製、マウス Igプラ イマ一セット）を用いて、マウス IgGの重鎖定常領域の一部を含む VHポリペプチドを コードする DNAを増幅した。またフォワードプライマーとしてマウスィムノグロブリン κ 鎖の FR1領域に対する縮重プライマーである Vk4BkFL2 (配列番号 17)を、リバ一 スプライマーとしてマウスィムノグロブリン κ鎖定常領域に対するプライマーである M KCFor (配列番号 18)を用いて、マウスィムノグロブリン κ鎖定常領域の一部を含む VLポリペプチドをコードする DNAを増幅した。プライマーは、それぞれの配列番号 の配列力もなる DNAをィ匕学合成したものを用いた。なお RT— PCRの反応条件は 5 0°Cで 30分間の逆転写反応の後、 94°Cで 15分間の変性反応を行い、その後 94°C で 30秒間、 56°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間を 1サイクルとする反応を 30サイクル行い 、最後に 72°Cで 6分間の伸張反応を行った。そして、それぞれの RT— PCRで増幅 された約 450bpの cDNA断片を 1. 5%ァガロースゲル電気泳動で分離し、ウイザ一 ド SVゲル'アンド PCRクリーンアップ 'システム（Wizard SV gel and PCR Clean- Up Sy stem,プロメガ社製)を用いて精製した。
[0156] 得られた cDNA断片の塩基配列を決定したところ、 KTM— 219の VHをコードする 領域は配列番号 4の塩基配列を有し、配列番号 5のアミノ酸配列をコードすること、 V Lをコードする領域は配列番号 6の塩基配列を有し、配列番号 7のアミノ酸配列をコ ードすることが明らかになった。また、 KTM— 219の VH領域の CDR1、 2および 3は 、それぞれ配列番号 5のアミノ酸配列の 31〜35位、 50〜66位および 99〜105位の 領域であり、 VL領域の CDR1、 2および 3は、それぞれ配列番号 7のアミノ酸配列の 2 4〜39位、 55〜61位および 94〜102位の領域であった。 KTM— 219の VH領域 の CDR1、 2および 3ならびに VL領域の CDR1、 2および 3のアミノ酸配列を、それぞ れ配列番号 8〜 13に示した。
[0157] (2) spFvファージミドベクターへのクロー-ング
KTM— 219の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを M 13ファージを禾 IJ用して 発現させるため、以下のようにして spFvファージミドベクター pKST2 (Anal. Chem., 7 5, 4057-4064, 2003)にサブクローユングした。 pKST2は、プロモーターの下流に、リ ボゾーム結合配列、シグナルペプチドをコードする配列、 Sfilサイト、 Notlサイト、 Hi s— mycタグをコードする配列、アンバー終止コドン、 M13ファージコート蛋白質 p7を コードする配列を有する。 pKST2の sfilと Notl間に VHポリペプチドをコードする配 列、 M13ファージコート蛋白質 p9をコードする配列、リボゾーム結合配列、シグナル ペプチドをコードする配列、 VLポリペプチドをコードする配列を挿入することにより、 プロモーターの下流に（A)リボゾーム結合配列 シグナルペプチド ZVHポリべプチ ド Zp9融合蛋白質をコードする配列および (B)リボゾーム結合配列 シグナルぺプ チド ZVLポリペプチド ZHis— mycタグをコードする配列 アンバー終止コドン p7 をコードする配列を有するファージミドが構築できる。得られたファージミドで E.coliを 形質転換した後、ヘルパーファージ感染により、ファージ粒子を得ることができる。 E.c oliがアンバーサプレッサー株の場合、アンバー終止コドンが一定の割合でグルタミン に翻訳されるため、 VHポリペプチド Zp9の融合蛋白質と共に、 VLポリペプチド ZH is— mycタグ Zp7の融合蛋白質がファージ粒子上に提示される。一方、非サブレツ サー株の場合は、 VHポリペプチド Zp9の融合蛋白質はファージ粒子上に提示され る力 VLポリペプチド ZHis— mycタグは p7との融合蛋白質にはならないため、ファ ージ粒子上には提示されず、培地中に分泌される。
[0158] まず（1)で得られた、 KTM— 219の VHポリペプチドコードする DNAを铸型にして フォワードプライマー MH2Back (配列番号 15)およびリバースプライマー VHlFor — 2X(配列番号 19、 Anal. Chem., 75, 4057-4064, 2003)を用いて、 VHポリペプチド をコードする DNAを、また（1)で得られた、 KTM— 219の VLポリペプチドコードする DNAを铸型にしてフォワードプライマー MkBack (配列番号 20)およびリバースプラ イマ一 MJK2FONX (配列番号 21、 Antibody Engineering: a Practical Approach, IR L Press, 1996)を用いて VLポリペプチドをコードする DNAをそれぞれ Ex— Taq D NAポリメラーゼ (宝バイオ社)を用いた PCRにより増幅した。 PCRの反応条件は， 94 °Cで 3分間の変性反応の後、 94°Cで 30秒間、 56°Cで 30秒間、 72°Cで 1分間を 1サ イタルとする反応を 30サイクル行い、最後に 72°Cで 6分間伸張反応を行った。またこ れと同時に、 ρ9をコードする配列、リボゾーム結合配列および OmpAシグナルぺプ チドをコードする配列を含むリンカ一 DNAを、フォワードプライマー 01inkBack2 (配 列番号 22)およびリバースプライマー OlinkFor (配列番号 23)、ならびに铸型として pKST2(HyHEL10) (Anal. Chem., 75, 4057-4064, 2003)を用いて同様に増幅した。 (1)と同様に、増幅断片をァガロースゲル電気泳動で分離後、精製した。
[0159] 得られた VHポリペプチドをコードする DNA、 VLポリペプチドをコードする DNAお よびリンカ一 DNAを、プライスオーバーラップ伸張 PCR法（Biotechniques, 8, 528-53 5, 1990)によりリンカ一 DNAの末端の共通する配列を介して VH—リンカ VLの 順に結合した構造の 0. 9kbの断片に一本ィ匕した。具体的には、 VHポリペプチドをコ ードする DNA VLポリペプチドをコードする DNAおよびリンカ DNAを混合し、プ ライマーを添加せずに PCRを、 94°Cで 3分間の変性反応の後、 94°Cで 30秒間、 56 °Cで 45秒間、 72°Cで 90秒間を 1サイクルとする反応を 8サイクル行い、最後に 72°C で 8分間の伸張反応という条件で行い、 3つの DNA断片が VH—リンカ VLの順 に結合した構造の DNA断片を増幅させた。さらに、プライマー MH2Backsfi (配列 番号 24)および JK2NotlO (配列番号 25)を添加し、上記と同様の条件で 30サイク ルの反応の PCRを行い、 5，端に Sfilサイトおよび 3，端に Notlサイトを付カ卩した。増 幅断片をァガロースゲル電気泳動で分離した後、精製した。精製した増幅断片は制 限酵素 Sfilおよび Notlで切断し，再度ァガロースゲル電気泳動で分離した後、精製 した。この増幅断片と同様に Sfilおよび Notlで切断した pKST2とライゲーシヨンさせ KTM— 219の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを発現するための spFvファ ジミドベクター PKST2ZKTM219を作製した。図 1に pKST2ZKTM219のプロ モーターの下流の構造を示した。実施例 2で用いられたプライマーを表 1に示した。
[表 1]
Figure imgf000054_0001
(3) VHポリペプチドおよび VLポリペプチドの調製
前項で得た spFvファージミドベクター pKST2ZKTM219を、アンバーサプレッサ 株である E. coliTGl株（supE, hsd A 5, thi, Δ (lac- proAB), /F' [traD36, proAB+, laclq, lacZ A M15])あるいは非サプレッサー株である HB2151株（ara, Δ (lac-proAB ), thi/F'proAB+, laclq, lacZ A M15) (アマシャム'バイオサイェンシズ社）に形質転換 した。形質転換細胞を 2 XTYAG (16gZLトリプトン、 lOgZLイーストエキス、 5gZ L塩化ナトリウム、 100 gZmLアンピシリン、 1%グルコース、 pH7. 0)ァガープレ 一ト（1. 5%寒天を含む 2 XTYAG)で 37°Cでー晚培養したのち、シングルコロニー のいくつかをそれぞれ 4mLの 2 XTYAG培地で 37°Cでー晚培養した。この一部を 新鮮な 2 XTYAG培地に移して、 37°Cで 600nmの吸光度（OD )が約 0. 5になる
600
まで振盪培養した。ここでヘルパーファージ M13K07を m. o. i (multiplicity of infe ction)が 20になるように加え、 37°Cで 30分間静置した。その後菌体を 2, 000gで 15 分遠心して回収し、 2 XTYAK培地（16gZLトリプトン、 10gZLイーストエキス、 5g ZL塩化ナトリウム、 100 gZmLアンピシリン、 50 gZmLカナマイシン）に再懸濁 して 250rpmで 30°C、 16時間振盪培養した。
[0162] TG1株を宿主とした場合は、培養液を 10, 800gで 10分間遠心分離し、 VHポリべ プチドおよび VLポリペプチドを提示する M13ファージを含む上清を回収した。この 上清に 1Z5容の 20%ポリエチレングリコール Z2. 5mol/L NaClをカ卩えてファー ジを沈殿させた。 4°Cで 1時間放置した後、 11, 500gで 15分間遠心分離し、ペレット を PBSに再懸濁させ 4°Cで保存した。 HB2151株を宿主とした場合は、培養液を 1 0, 800gで 10分間遠心分離し、 VHポリペプチドを提示する M13ファージおよび His —mycタグが付加した VLポリペプチドを含む上清を 4°Cで保存した。
実施例 3
[0163] オープンサンドイッチ ELISA法によるヒトォステオカルシンおよび OC— 1ペプチドの 測定
(1)VHポリペプチドと VLポリペプチドの結合性の確認
実施例 2 (3)で、 E. coli TGI株を宿主として得られた VHポリペプチドおよび VLポ リペプチドを提示する M13ファージ (以下、 VHZVL提示ファージと表記する）を用 Vヽて、 VHポリペプチドおよび VLポリペプチドのヒトォステオカルシンに対する特異的 な結合性が保持されて 、ることを、以下の ELISAで確認した。
[0164] 96ウェルマイク口プレート（ファルコン 3914、ベタトン'ディキンソン社製）に 1ゥエル あたり 100 μ Lの PBSに溶解した各濃度のヒトォステオカルシン（プリンストン 'バイオ モレキュールズ社製)を入れ、 37°Cで 1時間静置してこれを吸着させた。次いで、 PB Sで 25%に希釈したブロックエース（Block Ace、大日本製薬社製）（以下、 25%BPB Sと表記する）で 37°Cで 1時間、非特異吸着サイトのブロッキングを行った。その後マ イク口プレートを 0. 1%ツイーン— 20を含む PBS (以下 PBSTと略す）で 3回洗浄し、 各ゥエルに 10%BPBSで 100倍に希釈した VHZVL提示ファージを 100 μ L加え、 25°Cで 90分間反応させた。次に PBSTによる 3回洗浄のあと各ゥエルに 10%BPBS で 5000倍希釈したペルォキシダーゼ標識マウス抗 M 13抗体 (アマシャム'バイオサ イエンシズ社製）を 100 L加え、 25°Cで 90分間反応させた。最後に PBSTでマイク 口プレートを 6回洗浄し、各ゥエルあたり 100 μ Lの基質溶液（lOOmM酢酸ナトリウム 、 100 μ g/mL3, 3，， 5, 5，一テトラメチルベンジジン（以下 TMBと略す、シグマ'ァ ルドリッチ社製）、 0. 04
Figure imgf000056_0001
0)を加えて 10〜30分おい た。そして反応をゥエルあたり 50 Lの ImolZL硫酸で停止し，モデル 680マイクロ プレートリーダー（バイオラッド社)で 655nmを対照として 450nmの吸光度を測定し た。結果を図 2に示した。その結果、ヒトォステオカルシンの濃度依存的に吸光度の 上昇が見られ、 KTM— 219の VHポリペプチドおよび VLポリペプチドは、ヒトォステ ォカルシンに対する特異的な結合性を有していることが確認された。
[0165] (2)オープンサンドイッチ ELISAによる OC— 1ペプチドおよびヒトォステオカルシン の測定
実施例 2 (3)で、 pKST2ZKTM219で形質添カ卩した E. coli HB2151株力ら得ら れた、 KTM— 219の VHポリペプチドを提示する M13ファージ、すなわち M13ファ ージで標識した VHポリペプチドおよび His— mycタグが付カ卩した KTM— 219の VL ポリペプチド含む培養上清を用いて、ヒトォステオカルシンおよび OC— 1ペプチドの オープンサンドイッチ ELISAによる測定を、以下のようにして行った。
[0166] ファルコン 3914マイクロプレートに、 1ゥエルあたり 100 Lの PBSに溶解した 0. 5 μ gZmL抗 Hisタグ抗体 Penta—His (キアゲン社）を分注し， 4°Cでー晚静置して吸 着させた後、 25%BPBSで 25°C2時間ブロッキングした。 PBSTによる 3回洗浄のあ と各ゥエルに測定試料として、 10%BPBSで各濃度になるよう希釈したヒトォステオ力 ルシンある!/、は OC— 1ペプチド（キアゲン社）を 100 μ Lずつ加えたのち、実施例 2 ( 3)で調製した pKST2ZKTM219で形質添カ卩した E. coli HB2151株の培養上清 を 10 Lずつ加えてゆるやかに振盪させて混合し、室温で 2時間反応させた。この反 応にお 、て、抗 Hisタグ抗体を介して His— mycタグ付加 VLポリペプチドがゥエルに 固定ィ匕され、固定ィ匕された VLポリペプチドに添カ卩したヒトォステオカルシンある ヽは OC— 1ペプチドが結合し、さらにこのヒトォステオカルシンあるいは OC— 1ペプチド に M13ファージで標識された VHポリペプチドが結合する。 PBST〖こより 3回洗浄し、 各 100 μ Lの 10%BPBS中で 5000倍希釈したペルォキシダーゼ標識抗 M13抗体 をカロえ 25°C90分反応させた。 6回の PBSTによる洗浄の後、実施例 3の（1)と同様に 、各ゥエルあたり 100 Lの TMBを含む基質溶液をカ卩えて 10〜30分おいた。そして 反応をゥエルあたり 50 μ Lの ImolZL硫酸で停止し、モデル 680マイクロプレートリ ーダ一で 655nmを対照波長として 450nmの吸光度を測定した。ヒトォステオカルシ ンの測定結果を図 3に、 OC— 1ペプチドの測定結果を図 4に示した。測定試料中に 測定対象のペプチドが存在しないときの吸光度の値はそれぞれヒトォステオカルシン が 0. 278、 OC— 1ペプチドが 0. 143であった。 OC— 1ペプチドおよびヒトォステオ カルシンともに、測定試料中の濃度依存的に吸光度の上昇がみられ、オープンサン ドイッチ ELISA法により測定できることが確認された。図 3よりォステオカルシンの測 定範囲は l〜500ngZmLであり、図 4より OC— 1ペプチドの測定範囲は 0. l〜50n gZmLであった。また、濃度が不明なヒトォステオカルシンまたは OC—1ペプチドを 含む試料を測定する場合は、上記の方法で、ヒトォステオカルシンあるいは OC— 1 ペプチドの代わりに試料を添加して測定を行 ヽ、得られた吸光度と上記で得られた 検量線力も濃度を求めることができる。
(3)競合阻害 ELISAによる OC— 1ペプチドの測定
ファルコン 3914マイクロプレートに 1ゥエルあたり 100 μ Lの PBSで希釈した 2 μ gZ mLヒトォステオカルシンをカ卩え、 37°Cで 1時間おいた後、 25%BPBSで 37°C1時間 ブロッキングし、 PBSTにより 1回洗浄した。測定試料として 10%BPBSで段階希釈し た OC— 1ペプチドと、 0. 5 iu gZmLのKTM— 219溶液を混合させた後，混合液各 100 Lをマイクロプレートに 2ゥエルずつアプライし，室温で 2時間反応させた。 PBS Tにより 3回洗浄し， 10%BPBS中 0. 2 g/mLに希釈したペルォキシダーゼ標識 抗マウス IgG抗体 100 /z Lをカ卩ぇ 25°C90分間反応させた。 6回の PBSTによる洗浄 の後、実施例 3の（1)と同様に酵素反応と吸光度測定を行った。実験結果を図 5に示 した。図 5の実験において測定試料中に OC— 1ペプチドが存在しないときの吸光度 の値はそれぞれ 2. 28であった。図 5より OC—1ペプチドの測定範囲は 5〜2000ng Z mLであつ 7こ。
[0168] 以上より、オープンサンドイッチ ELISA法は、競合阻害 ELISA法に比較して、最小 検出感度が低値にまで及び、測定範囲が広がることが確認された。
[0169] (4)サンドイッチ ELISAによるォステオカルシンの測定
実施例 1で得られた、ェピトープの異なるヒトォステオカルシンと特異的に反応する モノクローナル抗体 KTM - 219および KTM - 223を利用して、ヒトォステオカルシ ンのサンドイッチ ELISAを行 、、オープンサンドイッチ ELISAと比較した。
[0170] ファルコン 3914マイクロプレートに、 1ゥエルあたり 0. 5 gZmLのモノクローナル 抗体 KTM— 219を分注し、 37°Cで 1時間静置して吸着させた後、 25% BPBSで 3 7°C1時間ブロッキングした。 PBSTによる 1回洗浄の後、各ゥエルに測定試料として、 10%BPBSで各濃度になるよう希釈したヒトォステオカルシンを 100 μ Lずつ加え、 室温で 1. 5時間反応させた。 PBSTにより 3回洗浄した後、 10%BPBSで 0. 3 ^ g/ mLの濃度に調製したピオチン標識したモノクローナル抗体 KTM— 223を 100 μ L を加え、室温で 1時間反応させた。 PBSTにより 3回洗浄した後、 10%BPBSで 2000 倍希釈したペルォキシダーゼ標識アビジンを加え室温で 1時間反応させた。 3回の P BSTによる洗浄の後、実施例 3の（1)と同様に酵素反応と吸光度測定を行った。実 験結果を図 6に示した。また、上記と同様の方法で、プレートに固定ィ匕するモノクロ一 ナル抗体を KTM— 223〖こし、ピオチン標識したモノクローナル抗体 KTM— 219を 添カロした場合の結果を図 7に示した。図 6より、 KTM— 219を固定ィ匕し、標識 KTM 223を用いた場合のサンドイッチ ELISAの測定範囲は 0. 01〜5ngZmLであり、 図 7より、 KTM— 223を固定化し、標識 KTM— 219を用いた場合のサンドイッチ EL ISAの測定範囲は 0. 05〜5ngZmLであった。
[0171] オープンサンドイッチ ELISAは、サンドイッチ ELISAと比較して測定範囲の上限の 濃度が高ぐまたその測定範囲の幅は同程度もしくは広いものであった。実際の血中 のォステオカルシンを測定する場合の基準値は 2. 5ngZmL程度であり、病的な状 態では、血中ォステオカルシンの濃度はさらに高くなることが予想される。オープンサ ンドイッチ ELISA法は、通常のサンドイッチ ELISA法と比較して測定の工程が少なく て簡易なうえ、血中のォステオカルシンの濃度と測定範囲が合っているため、試料の 希釈が不要で、より適していると考えられた。
実施例 4
[0172] MBPが付カ卩した VHポリペプチドおよび VLポリペプチドの調製
VLポリペプチドとして、 VLに MBPが付カ卩した MBP—VL融合蛋白質を用いること により、 VLポリペプチドを抗 Hisタグ抗体を介さずに、物理的に直接プレートに固定 化できると考えられる。また、標識した VHポリペプチドとして、アルカリフォスファタ一 ゼと融合させた VH—アルカリフォスファターゼ融合蛋白質（以下、 VH— AP融合蛋 白質と省略する）を用いることにより、 VHポリペプチドと結合する酵素標識した抗 Ml 3抗体の反応が不要となると考えられる。したがって、両者を用いることでオープンサ ンドイッチ法の工程を簡略ィ匕することができると考えられる。このようなオープンサンド イッチ法によるォステオカルシンの測定を目的として、以下のように、 VH—AP融合 蛋白質および MBP— VL融合蛋白質の調製を行った。
[0173] (1)VH— AP融合蛋白質の調製
以下のようにして、 VH—AP融合蛋白質発現プラスミド pET—VH219—APを作 製した。実施例 3で作製した spFvファージミドベクター pKST2ZKTM219を铸型に して、プライマー MH2Back— EcoRV (配列番号 26)および VHlFor2— HindIII ( 配列番号 27)を用いた PCRにより、 KTM— 219の VHポリペプチドをコードする DN Aを増幅した。増幅断片を EcoRVと Hindlllで切断し、ァガロースゲル電気泳動で分 離後、精製し、同じく EcoRVと Hindlllで切断したプラスミド pPhoA(J. Immunol. Met hods, 224, 171-84, 1999)の断片とライゲーシヨンした。 pPhoAは、 E. coliアルカリフ ォスファターゼをコードする 1450bp断片をベクター pET— 20b (ノバジェン、 EMDバ ィォサイエンシズ社製)の Notlサイトに挿入して作製されたプラスミドである。ライゲー シヨン産物を E. coli XL10— Gold (ストラタジーン社製）に形質転換し、 LBAG寒天 培地（lOgZLトリプトン、 5gZLイーストエキス、 lOgZL塩化ナトリウム、 lOgZLグル コース、 100 g/mLアンピシリン、 pH7. 2、 1. 5%寒天）にて 37°C—晚培養した。 得られた数個のコロニーよりプラスミドを調製し，正しい配列を持つものを選択して、 p ET— VH219— APと名付けた。 pET— VH219— APはプロモーターの下流に図 8 に示す構造を有し、宿主のペリプラズムに、 KTM— 219の VHポリペプチド Zアル力 リフォスファターゼ ZHisタグ力 なる VH—AP融合蛋白質を発現するためのプラスミ ドである。
[0174] このプラスミド pET— VH219— APで E. coli BL21 (DE3) pLysS株を形質転換し , 37°Cでー晚 LBAG寒天培地で培養したのち、シングルコロニーを 4mLの LBAC 液体培地（lOgZLトリプトン、 5gZLイーストエキス、 lOgZL塩化ナトリウム、 100 gZmLアンピシリン、 34 gZmLクロラムフエ-コール、 pH7. 2)で 30°C—晚培養 し、この培養液 3mLを 2本の 150mLの LBAC液体培地に移し、 30°Cで OD600が 0 . 6〜0. 8になるまで培養した。培養液に終濃度 0. 2mmol/Lの IPTGを添カ卩して、 VH— AP融合蛋白質の発現を誘導した後、さらに 18〜24時間 20°Cで培養した。
[0175] 培養終了後の培養液を、 6000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離し、菌体を回収した。
得られた菌体を 40mLの浸透圧ショック液（30mmolZL Tris—HCl、 20%スクロ ース、 ImmolZL EDTA、 pH8. 0)に再懸濁し室温で 10分間ゆるやかに混合した のち、 8000g、 4°Cで 10分間遠心分離した。上清を捨て、菌体に氷冷した 5mmolZ L MgS04 10mLをカ卩え、直ちに再懸濁し、ペリプラズム画分の VH— AP融合蛋 白質を細胞外に放出させた。懸濁液を氷上で 20分間時々混ぜながら置いたのち、 8 000g、 4°Cで 15分間遠心分離し、 VH— AP融合蛋白質を含む上清を回収した。こ の上清を 1Lのカラム緩衝液（10mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L NaH2P04 、 lOOmmol/L NaCl、 pH7. 4)に対して 4°Cでー晚透析したのち、 ImL の Talo n金属キレートカラム (クロンテック製)を用いてメーカーのマニュアルに従 ヽ精製を行 つた。溶出緩衝液（200mmolZLイミダゾールを含むカラム緩衝液)を用いて得られ た各 0. 5mLの画分を回収し、 10%SDS— PAGEにより、 VH— AP融合蛋白質を 含む画分を確認した。 VH—AP融合蛋白質を含む画分を集めてトリス緩衝塩溶液 T BS (25mmol/L Tris— HC1、 137mmol/L NaCl、 2. 68mmol/L KC1、 pH 7. 4)で平衡化した PD— 10カラム（アマシャム'バイオサイエンス社製）を用いて、 V H— AP融合蛋白質溶液の溶媒を TBSに交換した。以上のようにして精製された VH —AP融合蛋白質は、蛋白質濃度をブラッドフォード (Bradford)試薬 (バイオラッド社 製)を用いて決定し、小分けして— 80°Cで保存した。精製 VH— AP融合蛋白質は、 SDS— PAGEでは推定分子量である 61. 9kDa付近に単一バンドが認められ、その 収量は培養液 300mL培養から約 1. 5mgであった。
[0176] (2) MBP— VL融合蛋白質の調製
以下のようにして、 MBP— VL融合蛋白質発現プラスミド pMAL— VL219を作製 した。 spFvファージミドベクター pKST2/KTM219を铸型にして、プライマー MkB ackES (配列番号 28)および MycForHd (配列番号 29)を用いた PCRにより、 KTM — 219の VLポリペプチドおよび His— Mycタグをコードする DNAを増幅した。増幅 断片を EcoRIと Hindlllで切断し、ァガロースゲル電気泳動で分離後、精製し、同じ く EcoRIと Hindlllで切断した MBP融合蛋白質発現プラスミド pMAL— p2 (-ュ一 · イングランド 'バイオラブズ社製)の断片とライゲーシヨンした。ライゲーシヨン産物を E. coli XLIO— Goldに形質転換し、 LBAG寒天培地にて 37°C—晚培養した。得られ た数個のコロニーよりプラスミドを調製し，正しい配列を持つものを選択して、 pMAL VL219と名付けた。 pMAL -VL219はプロモーターの下流に図 9に示す構造を 有し、宿主のペリプラズムに MBPZKTM— 219の VLポリペプチド ZHis— Mycタ ダカもなる MBP—VL融合蛋白質を発現するためのプラスミドである。
このプラスミド pMAL— VL219で E. coli TGI株を形質転換し、 37°Cでー晚 LBA G寒天培地で培養した後、シングルコロニーを 4mLの LBAG液体培地（lOgZLトリ プトン、 5gZLイーストエキス、 lOgZL塩化ナトリウム、 lOgZLグルコース、 100 /z g /mLアンピシリン、 pH7. 2)で 30°C—晚培養した。この培養液を 2本の 250mLの 0 . 2%グルコースを含む LBA培地（lOgZLトリプトン、 5gZLイーストエキス、 lOgZL 塩ィ匕ナ卜リウム、 100 /z g/mLアンピシリン、 pH7. 2)に添カロし、 30。Cで OD600力^). 6〜0. 8になるまで培養した。培養液に終濃度 ImmolZLの IPTGを添カ卩して、 MB P—VL融合蛋白質の発現を誘導した後、さらに 5時間 27°Cで培養した。
[0177] 培養を終了した培養液を、 6000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離し、菌体を回収した 。得られた菌体を 50mLの浸透圧ショック液に再懸濁し、室温で 10分間ゆるやかに 混合したのち、 8000g、 4°Cで 10分間遠心分離した。上清を捨て、菌体に氷冷した 5 mmol/L MgS04 15mLを加え、直ちに再懸濁し、ペリプラズム画分の MBP—V L融合蛋白質を細胞外に放出させた。懸濁液を氷上で 20分間時々混ぜながら置い たのち、 8000g、 4°Cで 15分間遠心分離し、 MBP— VL融合蛋白質を含む上清を回 収した。この上清を 1Lのカラム緩衝液に対して 4°Cでー晚透析したのち、（1)の VH AP融合蛋白質と同様にして、 Talon金属キレートカラムを用いて、 MBP—VL融 合蛋白質の精製を行った。精製 MBP—VL融合蛋白質は、 SDS— PAGEでは推定 分子量である 56. 5kDa付近に単一バンドが認められ、その収量は培養液 500mL 培養から約 0. 7mgであった。
実施例 5
[0178] VH— AP融合蛋白質および MBP— VL融合蛋白質を用いたオープンサンドイッチ ELISA法によるヒトォステオカルシンおよび OC— 1ペプチドの測定
実施例 4 (2)で得られた精製 MBP—VL融合蛋白質の 5 μ gZmL溶液 (溶媒 TBS )を調製し、 96ウェルマイク口プレートに、 1ゥエルあたり 100 Lずつ分注した。 4°Cで ー晚静置して、 MBP—VL融合蛋白質を吸着させた後、溶液を捨て、 TBSで 25% に希釈したブロックエース（以下、 X%のブロックエースを含む TBSを X%BTBSとよ ぶ）で、室温で 2時間ブロッキングした。 0. 05%ツイーン 20を含む TBS (以下、 TB STとよぶ）により 1回洗浄した後、各ゥエルに測定試料として、 10%BTBSで 0. 01、 0. 05、 0. 1、 0. 5、 1、 5、 10、 100、 500、 lOOOngZmLの各濃度になるよう希釈し たヒトォステオカルシンあるいは OC— 1ペプチド（キアゲン社）を 100 μ Lずつ加えた 。さらに、実施例 4 (1)で調製した精製 VH— ΑΡ融合蛋白質の 250 /z gZmL溶液 2 Lを加えて混合し、室温で 2時間反応させた。 TBSTにより 3回洗浄し、 100 /z Lの アルカリフォスファタ一ゼ基質溶液（ImmolZL p -トロフエ-ルリン酸、 ImolZL
Tris-HCU 10mmol/L MgC12, 50 μ mol/L ZnC12、 pH9. 5)を各ゥエル に加え，室温で 30分間反応させた後、 405nmの吸光度（OD405)を測定した。
[0179] 測定結果を図 10に示した。 OC— 1ペプチドおよびヒトォステオカルシンともに、測 定試料中の濃度依存的に吸光度の上昇がみられ、オープンサンドイッチ ELISA法 により測定できることが確認された。測定範囲は実施例 3 (2)のファージを用いたォー プンサンドイッチ ELISA法と同程度であった。本実施例のオープンサンドイッチ法で は、実施例 3 (4)に示した従来のサンドイッチ ELISA法、実施例 3 (2)に示したォー プンサンドイッチ ELISA法によるォステオカルシンの測定方法と比較して、測定工程 を簡略ィ匕することができた。
産業上の利用可能性
本発明により、ペプチドの非競合的な検出または定量方法、そのための試薬、およ び該方法に使用する VHポリペプチドまたは VLポリペプチドが提供される。そして、 前記 HyHEL— 10のように、測定すべきペプチドの 3次構造を認識しているモノクロ ーナル抗体に由来する VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを用いた場合、測定 すべきペプチドが測定試料中で正常な 3次元構造を保持していることが要求される 力 測定すべきペプチドの連続するアミノ酸配列をェピトープとするモノクローナル抗 体に由来する VHポリペプチドおよび VLポリペプチドを用いることにより、測定すべき ペプチドが測定試料中で変性状態であっても測定することができる。また、本発明の オープンサンドイッチ ELISAによると、サンドイッチ ELISAと比較して測定範囲の上 限の濃度が高ぐまたその測定範囲の幅は同程度もしくは広くなることから、本発明 は特に血中のォステオカルシンの濃度測定に適している。

Claims

請求の範囲
[1] 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 配列をェピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変 領域を含まないポリペプチド (VHポリペプチド）と、前記モノクローナル抗体の軽鎖可 変領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まな 、ポリペプチド (VLポリペプチド）を用い ることを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量方法。
[2] VHポリペプチドまたは VLポリペプチドのいずれか一方を固相に固定ィ匕して固定ィ匕 ポリペプチドとし、他方を標識物質で標識して標識化ポリペプチドとし、測定すべきぺ プチドを含有する検体および標識ィ匕ポリペプチドを固定ィ匕ポリペプチドと接触させ、 固定ィ匕ポリペプチド、測定すべきペプチドおよび標識ィ匕ポリペプチドからなる複合体 を形成せしめ、固相に結合した該複合体の標識物質を検出または定量することを特 徴とする請求項 1に記載の方法。
[3] VHポリペプチドまたは VLポリペプチドの 、ずれか一方を標識物質で標識して標識 化ポリペプチドとし、他方のポリペプチドおよび標識ィ匕ポリペプチドを、固相の存在下 で測定すべきペプチドを含有する検体に接触させ、固相、他方のポリペプチド、測定 すべきペプチドおよび標識ィ匕ポリペプチドからなる複合体を形成せしめ、固相に結合 した該複合体の標識物質を検出または定量することを特徴とする請求項 1に記載の 方法。
[4] 標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはピオチンである請求項 2または 3 に記載の方法。
[5] VHポリペプチドまたは VLポリペプチドが、 VHポリペプチドおよび VLポリペプチドと 免疫学的に区別されるペプチド (タグペプチド）が付加したポリペプチドであって、 V Hポリペプチドまたは VLポリペプチドの固相への固定化力 VHポリペプチドまたは VLペプチドに付加した該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固相に 固定ィ匕した抗体との結合を介した固定ィ匕である請求項 2〜4のいずれか 1項に記載 の方法。
[6] 固相に固定ィ匕する VHポリペプチドまたは VLポリペプチド力 マルトース結合蛋白質 が付加したポリペプチドである請求項 2に記載の方法。
[7] VHポリペプチドを標識物質 1で標識して標識化 VHポリペプチドとし、 VLポリべプチ ドを異なる標識物質 2で標識して標識化 VLポリペプチドとし、測定すべきペプチドを 含有する検体を標識化 VHポリペプチドおよび標識化 VLポリペプチドへ接触させ、 標識物質 1と標識物質 2の相互作用の変化量を検出することを特徴とする請求項 1に 記載の方法。
[8] VHポリペプチドおよび VLポリペプチドが遺伝子糸且換え産物である請求項 1〜7の!、 ずれか 1項に記載の方法。
[9] 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 配列をェピトープとするモノクローナル抗体力 該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 6以上 19以下のアミノ酸の配列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することに より得られるモノクローナル抗体である、請求項 1〜8のいずれ力 1項に記載の方法。
[10] モノクローナル抗体力 配列番号 3のアミノ酸配列の連続する 6以上 19以下のァミノ 酸の配列力もなるペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項 1〜9のいずれ 力 1項に記載の方法。
[11] モノクローナル抗体力 配列番号 1または 2のアミノ酸配列力 なるペプチドに特異的 に結合する抗体である請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法。
[12] 測定すべきペプチドが、ヒトォステオカルシンである請求項 1〜9のいずれか 1項に記 載の方法。
[13] 測定すべきペプチドが、配列番号 1または 2のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒト ォステオカルシンであって、モノクローナル抗体力 配列番号 1または 2のアミノ酸配 列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗 体である請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法。
[14] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の（1)〜（3)のいずれかのモノクロ一 ナル抗体である請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法。
(1)重鎖可変領域の相補性決定領域 (CDR) 1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(2)軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のァ ミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(3)重鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のァミノ 酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[15] モノクローナル抗体力 以下の（1)〜（3)のいずれかのモノクローナル抗体である請 求項 14に記載の方法。
(1)配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(2)配列番号 7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(3)配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号 7のアミノ酸配列 を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[16] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、 VHポリペプチドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含むポリべプチ ドである請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法。
[17] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、 VLポリペプチドが、配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチド である請求項 1〜9のいずれか 1項に記載の方法。
[18] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、 VHポリペプチドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含むポリべプチ ドであり、かつ VLポリペプチドが、配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドであ る請求項 1〜9のいずれ力 1項に記載の方法。
[19] 配列番号 5または 7のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
[20] 配列番号 5または 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする DNA。
[21] 配列番号 4または 6の塩基配列を含む請求項 20に記載の DNA。
[22] 請求項 20または 21に記載の DNAをベクターに挿入して得られる組換えベクター。
[23] 請求項 22に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
[24] 請求項 23に記載の形質転換体を培養液中に培養して、配列番号 5または 7のァミノ 酸配列を含むポリペプチドを生成 ·蓄積させ、培養液力 該ポリペプチドを採取する ことを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。
[25] 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 配列をェピトープとするモノクローナル抗体の重鎖可変領域を含んでかつ軽鎖可変 領域を含まないポリペプチド (VHポリペプチド）と、該モノクローナル抗体の軽鎖可変 領域を含んでかつ重鎖可変領域を含まな 、ポリペプチド (VLポリペプチド）とを含有 することを特徴とする測定すべきペプチドの非競合的な検出または定量用の試薬。
[26] VHポリペプチドまたは VLポリペプチドのいずれか一方力 標識物質で標識された 標識ィヒポリペプチドであり、他方が固相に固定ィヒされた固定ィヒポリペプチドである請 求項 25に記載の試薬。
[27] 固定化ポリペプチドがタグペプチドを付加したポリペプチドであって、固定化ポリぺプ チドの固相への固相化力 該タグペプチドと該タグペプチドに特異的に結合する固 相に固定ィ匕した抗体との結合を介した固定ィ匕である請求項 26に記載の試薬。
[28] 固定化ポリペプチドが、マルトース結合蛋白質が付加したポリペプチドである請求項 26に記載の試薬。
[29] VHポリペプチドまたは VLポリペプチドのいずれか一方力 標識物質で標識された 標識化ポリペプチドであり、他方がタグペプチドを付加したポリペプチドであり、さらに 該タグペプチドに特異的に結合する固相に固定化した抗体を含有する請求項 26に 記載の試薬。
[30] 標識物質が繊維状ファージ、酵素、蛍光物質またはピオチンである請求項 26〜29 の！、ずれか 1項に記載の試薬。
[31] VHポリペプチドが標識物質 1で標識された標識化 VHポリペプチドであり、 VLポリべ プチドが異なる標識物質 2で標識された標識化 VLポリペプチドであることを特徴とす る請求項 25に記載の試薬。
[32] VHポリペプチドおよび VLポリペプチドが遺伝子糸且換え産物である請求項 25〜31 の！、ずれか 1項に記載の試薬。
[33] 測定すべきペプチドに特異的に結合し、かつ該ペプチドのアミノ酸配列の連続する 配列をェピトープとするモノクローナル抗体力 該ペプチドのアミノ酸配列の連続する
6以上 19以下のアミノ酸配列力もなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより 得られるモノクローナル抗体である、請求項 25〜32のいずれか 1項に記載の試薬。
[34] モノクローナル抗体力 配列番号 3のアミノ酸配列の連続する 6以上 19以下のァミノ 酸の配列力もなるペプチドに特異的に結合する抗体である、請求項 25〜33のいず れか 1項に記載の試薬。
[35] モノクローナル抗体力 配列番号 1または 2のアミノ酸配列力 なるペプチドに特異的 に結合する抗体である請求項 25〜33のいずれか 1項に記載の試薬。
[36] 測定すべきペプチドが、ヒトォステオカルシンである請求項 25〜33のいずれ力 1項 に記載の試薬。
[37] 測定すべきペプチドが、配列番号 1または 2のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒト ォステオカルシンであって、モノクローナル抗体力 配列番号 1または 2のアミノ酸配 列からなるペプチドを抗原として動物を免疫することにより得られるモノクローナル抗 体である請求項 25〜33のいずれ力 1項に記載の試薬。
[38] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、モノクローナル抗体が、以下の（1)〜（3)のいずれかのモノクロ一 ナル抗体である請求項 25〜33のいずれ力 1項に記載の試薬。
(1)重鎖可変領域の相補性決定領域 (CDR) 1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(2)軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のァ ミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
(3)重鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 8、 9および 10のァミノ 酸配列を含み、かつ軽鎖可変領域の CDR1、 2および 3が、それぞれ配列番号 11、 12および 13のアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体
[39] モノクローナル抗体力 以下の（1)〜（3)のいずれかのモノクローナル抗体である請 求項 38に記載の試薬。
(1)配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(2)配列番号 7のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
(3)配列番号 5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号 7のアミノ酸配列 を含む軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体
[40] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、 VHポリペプチドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含むポリべプチ ドである請求項 25〜33のいずれ力 1項に記載の試薬。
[41] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、 VLポリペプチドが、配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチド である請求項 25〜33のいずれ力 1項に記載の試薬。
[42] 測定すべきペプチドが、配列番号 1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはヒトォステオ カルシンであって、 VHポリペプチドが、配列番号 5のアミノ酸配列を含むポリべプチ ドであり、かつ VLポリペプチドが、配列番号 7のアミノ酸配列を含むポリペプチドであ る請求項 25〜33の!ヽずれか 1項に記載の試薬。
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