JP2020527950A - 単鎖vh及び重鎖抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
US 8754287 B2は、CH1ドメインを欠く重鎖抗体を産生するマウス、及びCH1ドメインをコードする核酸を欠失させる生殖系列修飾を含むトランスジェニックマウスを開示する。
VJCLノックアウトニワトリにおける関連軽鎖を有さない重鎖のみの抗体の発現が、Schusserらによって記載される(Eur. J. Immunol., 46:2137, 2016)。
Kleinら(Biochemistry,18:1473,1979)は、軽鎖の単離された可変ドメイン及び定常ドメインと、免疫グロブリンGのFd'フラグメントとの相互作用を記載する。
前述の目的に従って、HCAbを産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
この目的は、本特許請求の範囲の主題によって解決され、及び本明細書にさらに記載されるようにして解決される。
例示的なscVHAbの構造を図2Aに示す。
特定の態様によれば、L1及びL2のいずれか1つ又は両方は、人工ペプチド、好ましくはグリシン及び/又はセリンリッチリンカーである。
a)任意の組合せのグリシン及び/又はセリンの配列;又は
b)VHフレームワーク配列からなる。
具体的には、L1は複数のグリシン及びセリン残基を含むか、又は3、4、5、6、7、8、9、10、40までの連続アミノ酸の少なくともいずれか、又は代替アミノ酸を含む同じ長さのペプチドからなる。
例えば、以下の配列のいずれかが、ペプチドリンカーL2として適切に使用される:(GlyGlyGlyGlySer[配列番号35])n(n=4〜16)。
具体的には、VHは、VH-CDR配列の親和性成熟抗原結合部位又はナイーブコンフォメーションを含む。
例示的なHCAbの構造を、図2Bに示す。
scVHAbの場合はVH-CL-L2-CH1、HCAbの場合はVH-CL-L2-CH1-ヒンジ-CH2-CH3。これらの場合におけるVHエクソンは、プレB細胞における重鎖遺伝子座でのVDJ再構成の間に形成され、そして個々のB細胞において異なる。例えば、他のエレメントのヌクレオチド配列は、以下の通りである:CL[Cκ(配列番号10)、Cλ1(配列番号36)、Cλ2(配列番号37)、又はCλ3(配列番号38)]、L2(配列番号11として同定される配列の4〜16反復配列)、CH1(配列番号12)、ヒンジ(配列番号14)、CH2(配列番号15)、及びCH3(配列番号16)。
別の特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載のHCAbをコードする核酸分子を提供する。
a)該抗体をコードする遺伝子は、非免疫又は免疫化マウスのB細胞に由来するか、又は
b)該抗体は、哺乳動物形質細胞、好ましくはげっ歯類起源、特にマウス起源のものによって分泌される。
a)VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々の1つ以上を含む可変重鎖領域、
b)CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含む定常重鎖領域、及び
c)連結領域
これらの領域は、本明細書中に記載されるscVHAb又は本明細書中に記載されるHCAbを発現するように操作される。
具体的には、定常重鎖領域は、CH2及びCH3ドメインをコードするエクソンをさらに含む。
具体的には、前記遺伝子座は、動物に由来する組換え遺伝子座であり、少なくとも1つの外因性エレメント、例えば、前記遺伝子座の調節エレメントと天然には関連しない1つ以上の外因性重鎖領域をさらに含む。
特定の態様によれば、本発明は、本明細書に記載の遺伝子座でトランスフェクトされた宿主細胞、又は本明細書に記載のベクターを提供する。
好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物は、げっ歯類、好ましくはマウスである。
a)非ヒト動物細胞を提供すること;
b)本明細書に記載のscVHAb又はHCAbをコードするエクソンを含む1つ以上のベクターを提供すること;
c)前記非ヒト動物細胞へ前記1つ以上のベクターを導入すること;
d)前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込むこと、及び、前記エクソンが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある標的部位(前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における第一CHエクソンの5'側)で、前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること;及び
e)前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること。
a)非ヒト動物細胞を提供し、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一CHエクソンの5'側の位置に、部位特異的リコンビナーゼの認識配列が隣接するリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)標的部位を組み込むこと;
b)本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbをコードするエクソンを含む1つ以上のベクターを提供すること、このエクソンは、部位特異的リコンビナーゼのさらなる認識部位と、細胞ゲノムへのベクターの標的化組み込みを選択するための1つ以上のマーカーとに隣接し、ここで、前記さらなる認識部位は、前記RMCE標的部位と組換え可能である;
c)前記1つ以上のベクターと、前記RMCE標的部位及びさらなる認識部位を認識する部位特異的リコンビナーゼとを、前記非ヒト動物細胞へ導入すること;
d)前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込み、前記RMCE標的部位で前記エクソンが前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること;及び
e)前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること。
a)内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の第一CHエクソンの5'側標的部位を含む非ヒト動物細胞を提供すること;
b)本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbをコードするエクソン(このエクソンは、前記標的部位に相同なDNA配列に隣接する)、及び、細胞ゲノムへのベクターの標的化相同組換えを選択するための1つ以上のマーカーを含む1つ以上のベクターを提供すること;
c)前記非ヒト動物細胞へ前記1つ以上のベクターを導入すること;
d)前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込み、前記標的部位で前記エクソンが前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること;及び
e)前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること。
a)非ヒト動物において異種免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現すること、この遺伝子座は
i)VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々を1つ以上含む可変重鎖領域、
ii)CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含む定常重鎖領域、及び
iii)連結領域
を含み、これらの領域は本明細書中に記載されるscVHAb又はHCAbを発現するように操作及び配置され、ここで、この非ヒト動物は、内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座を発現しない
b)前記scVHAb及び前記HCAbそれぞれである抗体を産生するか、又は前記scVHAb又は前記HCAbの少なくともVHドメインをそれぞれ含む抗体を産生すること。
具体的には、前記非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼ技術、又はCRISPR/Cas9技術を用いて、適切な遺伝子標的化技術(例えば、指向性相同組換え)によって、遺伝子座を取り込むように処置される。
具体的には、前記非ヒト動物は、内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座を発現しないが、これは前記内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座が、欠失又はサイレンシングされているか、さもなければ機能喪失のために変異されているからである。
他の実施形態は、遺伝子改変動物の操作された部分に由来する免疫グロブリン重鎖遺伝子から転写された免疫グロブリンタンパク質の一部又は全部;及び遺伝子改変動物の細胞に由来する操作された免疫グロブリンタンパク質の一部又は全部を含む。
本発明のこれら及び他の態様、目的及び特徴は、以下により詳細に記載される。
図9は、配列GGGGS(配列番号35)の反復に言及する。
図14:ステップ1 ジェネレーション又はRMCEアクセプター対立遺伝子。(A)RMCEターゲティングベクターの構造。(B)標的とする内因性マウスIgh遺伝子座の領域。(C)得られた標的化マウスIgh遺伝子座。
図15:ステップ2 CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMベクターを用いて、RMCE改変アクセプター対立遺伝子を標的とする。(A)RMCEターゲティングベクターの構造。(B)RMCE改変Igh遺伝子座。(C、D)得られた標的化Igh遺伝子座。C及びDとラベル付けされ、図中の破線によって連結されたセグメントは、in vivoで近接している。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、特に、1つ又は複数の連結配列又はヒンジ領域を有する定常抗体ドメインとの組み合わせで、単一可変抗体ドメインとしてVHを含む抗体構築物(例えば、重鎖抗体)を指すものとし、1つ又は2つの単鎖から構成され、各単鎖は、定常領域に連結された可変重鎖領域(又はVH)を含むか、又はそれからなる。例示的な抗体は、本明細書にさらに記載されるscVHAb又はHCAbのいずれかを含むか、又はそれらからなる。本明細書中に記載される抗体は、IgG型(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4サブタイプ)、IgA1、IgA2、IgD、IgE、又はIgM型、又はそれらのマウス対応物、IgG1、IgG2a/c、IgG2b、IgG3、IgA、IgD、IgE、又はIgMである抗体ドメインを含んでもよく、又はそれらからなってもよい。
用語「抗体」はさらに、完全ヒト抗体にも適用される。
マウス免疫グロブリンは、好ましくはIgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3及びIgMからなる群より選択又は誘導される。
具体的には、用語「抗体」は、ヒト抗原結合領域及び非ヒト(例えば、マウス)定常領域又はフレームワーク配列を含む、トランスジェニック非ヒト動物(例えば、マウス)によって産生される抗体に適用される。
a)親CDR配列における1個、2個又は3個の点変異、好ましくは、各CDR配列における点変異の数は、0、1、2、又は3のいずれかである;及び/又は
b)親CDR配列の、4つのC末端アミノ酸又は4つのN末端アミノ酸、又は4つの中心アミノ酸位置のいずれかにおける1個又は2個の点変異;及び/又は
c)親CDR配列との少なくとも60%の配列同一性;
ここで、好ましくは、前記機能的に活性な変異抗体は、本明細書中に記載されるような機能的に活性なCDR変異体の少なくとも1つを含む。具体的には、1つ以上の機能的に活性なCDR変異体を含む前記機能的に活性な変異抗体は、親抗体と同じエピトープに結合する特異性を有する。
a)追加のドメイン内ジスルフィド結合により抗体ドメインを安定化するために、及び/又は
b)CLドメインとCH1ドメインとの間のドメイン間ジスルフィド架橋によってドメイン対(例えば、本明細書中にさらに記載される抗体構築物中の)を安定化するために、及び/又は
c)追加の鎖間ジスルフィド架橋によって抗体ドメインの2つの鎖を安定化するために、
追加のドメイン間又は鎖間ジスルフィド架橋を形成することができる、新しい(追加の)アミノ酸残基(例えば、Cys残基)の組み込みを含んでもよい。
a)ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入又は染色体導入した動物(例えば、マウスなどの非ヒト動物)又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体、
b)抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体(例えば、トランスフェクトーマから)、
c)組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び
d)任意の他の手段(例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む)によって、調製され、発現され、作製され、または単離された抗体。
このような組換え抗体は、例えば、抗体成熟の間に生じる再構成及び変異を含むように操作された抗体を含む。
a)組換え部位に隣接する予め選択された核酸の欠失;
b)組換え部位に隣接する予め選択された核酸のヌクレオチド配列の逆位、及び
c)異なる核酸分子上に位置する組換え部位に近接する核酸領域の相互交換。核酸セグメントのこの相互交換は、核酸分子の一方又は両方が円形である場合、組み込み事象を生じることが理解されるべきである。
リンカー2(L2、図2)は、CL(Cκ又はCλ)をCH1に接続する。図3に示すFab構造[PDB 2XKN、EGFR(上皮増殖因子受容体)抗体7A7、IgG1κ mAbのFabフラグメントの結晶構造]に基づくと、CκのCOOH末端とCH1のNH2末端とを連結するために架橋される間隔は、40.9Åである(図3に破線で示す)。Cκ及びCH1の相対位置に起因して、リンカーはC末端及びN末端を連結するために、より長くなければならない。(GGGGS[配列番号35])4リンカーの理論長さは76Åであり、これは、2つの末端間の距離のカバレージの2倍(81.8Å)未満である。したがって、このケースで示唆される最小リンカー長は、(GGGGS[配列番号35])4であり、最大は(GGGGS[配列番号35])16である。
scVHAb又はHCAbを発現するトランスジェニックマウスを作製する前に、膜貫通型及び分泌型のHCAbをコードする種々の発現ベクターを構築し、インビトロでの発現について試験した。これらの種々の構築物は、いくつかの点で異なる−L2の長さ、CLの組成(Cκ、Cλ1又はCλ2)、CHの組成(IgG1又はIgG2a)、ならびにコードされたHCAbタンパク質におけるCL及びCH1ドメインの順序(NH-VH-Cκ-L2-CH1-CH2-CH3-TM-COOH これに対して NH-VH-CH1-L2-Cκ-CH2-CH3-TM-COOH)。いくつかの陽性及び陰性対照ベクターも構築し、試験した:細胞表面上で発現することが知られている陽性対照−従来のH2L2 IgG抗体、CH1ドメイン及びいかなるLCも欠くラクダ様IgG、連結されたVκ及びVHを有するがCL又はCH1を有さないscFV IgG抗体。細胞表面上で発現されない陰性対照−従来のIgG抗体であるが、LCを有さない (H2L0)。
図4は、実験の第1ラウンドで使用した発現ベクターを示す。
陽性対照:1.従来のH2L2 IgG抗体、2.CH1ドメイン及びLCを欠くラクダ様IgG、3.連結されたVκ及びVHを有するがCL又はCH1を有さないscFV IgG抗体。
本明細書に記載のHCAb:4.NH-VH-Cκ-L2-CH1-CH2-CH3-TM-COOH
Cκ及びCH1ドメインの順序がHCAbにおいて逆であることを除いて、本明細書中に記載のHCAb:5.NH-VH-CH1-L2-Cκ-CH2-CH3-TM-COOH
陰性対照:LCを含まない従来のIgG抗体(H2L0)。
軽鎖を有さない従来のIgG1である陰性対照(6)は、細胞表面上で発現されなかった。予想通り、表面mIgκの発現は、構築物1及び4でのみ観察された(それらがCκを有する表面発現HCAbであるため)。細胞表面mIgG1発現の欠如が、タンパク質が細胞内で分解されているためではないことを確実にするために、トランスフェクタントを固定し、透過処理し、同じ抗体パネルを用いて細胞内タンパク質について染色した(図6、これらのサンプルについての細胞内mIgG1染色のMFIを、表2に示す)。構築物5及び6でトランスフェクトされた細胞は、豊富な細胞内mIgG1重鎖を含有したが、それは細胞表面上で発現されなかった。したがって、いくつかの活性メカニズムが、これらの分子を細胞の内部に保持しているはずである。構築物6によってコードされるH2L0 HCAbについて、この保持は部分的に折り畳まれていないCH1ドメインとERシャペロンBiPとの会合によって引き起こされることが知られている(Haas and Wabl, Nature, 306:387, 1983;Bole, et al., J Cell Biol. 102:1558, 1986)。
HCAb中のCLドメインを変更する影響についても、図7Aに描写される構築物を使用して試験した。陽性対照構築物1は、ラクダ様IgG1をコードし、構築物2〜4はそれぞれCκ、Cλ1及びCλ2を有する本明細書に記載のHCAbをコードする。MFIは変化したが(表3)、全てのHCAbは細胞表面上で発現した(図8、中央の列)。Cλ3はここでは試験されなかったが、Cλ2及びCλ3のアミノ酸配列はほぼ同一である(99%アミノ酸同一性)ので、結果はCλ2と同じであると予想される。構築物3をコードする融合遺伝子の概略を、図7Bに示す。この構築物中のVHエクソンは、VH3-11、DH2-21及びJH4によってコードされ、CLエクソンは、Cλ1によってコードされ、CH及びヒンジ(H)エクソンは、IgG1由来である。当業者は、任意のVH、DH、JH、CL又はCH遺伝子を挿入して、ここに示されている構築物のそれぞれの構成要素と置き換えることができることを認識するであろう。
HEK 293T細胞はまた、WB(図9及び図10)及び酵素結合免疫測定法(ELISA、図12)によってHCAb分泌を試験するために、図7に描写される構築物の分泌形態でトランスフェクトされた。L2長さを6から10反復に変更し、CHドメインをIgG1からIgG2aに変更する影響もこれらの実験で調べた。トランスフェクション効率のためのWBコントロール(抗Myc抗体)及びローディングコントロール(抗GAPDH抗体)を図11に示す。
HCAbの生成のためにCL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TM遺伝子カセットを導入するための例示的な方法を、図13に示す。
この実施例は、遺伝的に改変されたマウスが、HCAbの代わりにscVHAbを産生することを除いて、実施例3と全ての点において同一である。これは、CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMの代わりにCL-L2-CH1_S-TMの構造を有するように遺伝子カセット(ターゲティングベクター)を改変することによって達成される。ターゲティングベクターの構造及び配列は、その他の点では実施例3と同じであり、同様に、ベクターをES細胞に導入し、正しい相同組換えについて選択及び分析し、マウスのコロニーを確立するための方法が使用される。(リンカー1を含むカセット、本明細書にも記載の、L1-CL-L2-CH1_S-TMが、同じ方法で導入できることに留意されたい)
ここでの目的は、Eμの下流及びIghmの上流の内因性Igh遺伝子座の領域に、上流に変異FRT部位及び変異LoxP部位が隣接し、下流にWT FRT部位及びWT LoxP部位が隣接するpuro_TK融合遺伝子を導入することである(図14B)。この配置において、変異及びWTのFRT又はLoxP部位は、Flp又はCreリコンビナーゼの存在下で組み換わることはできないが、対応する変異及びWT部位をそれぞれその5'及び3'末端に有するドナーDNAの断片を組み込むことができる(図14A)。puro_TK融合遺伝子は、図13と同じSHA及びLHAを用いた相同組換えによって導入される。ターゲティングベクターのさらなる特徴は、SHAの5'末端上流にジフテリア毒素A(DTA)遺伝子(配列番号34)が存在することである。このエレメントは、ターゲティングベクターを組み込んだが相同組換えによるものではない細胞に対する負の選択のために使用され;このような細胞は、DTA遺伝子を保持し、毒素が発現されると死滅する。
RMCEターゲティングベクター(図15A)は、ベクターが5'末端で変異FRT及び変異LoxP部位によって隣接し、3'末端でWT FRT及びWT LoxP部位に隣接することを除いて、図13A,Bに示す相同領域と配列が同一である。(本明細書中に記載されるL1-CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMカセットもまた、同一の様式で導入できることに留意)
この実施例は、遺伝的に改変されたマウスが、HCAbの代わりにscVHAbを産生することを除いて、実施例5と全ての面において同一である。これは、CL-L2-CH1-H-CH2-CH3_S-TMの代わりにCL-L2-CH1_S-TMの構造を有するようにターゲティングベクターを改変することによって達成される。ターゲティングベクターの構造及び配列は、他の点では実施例5と同じであり、ベクターをES細胞に導入し、正しい相同組換えについて選択及び分析を行い、マウスのコロニーを確立するために使用される方法による。(本明細書に記載されるL1-CL-L2-CH1_S-TMカセットもまた、同一の様式で導入できることに留意)
Claims (20)
- 単鎖VH抗体であって、VHドメインからなる抗原結合部位と、免疫グロブリン定常ドメインCL及びCH1とを、N末端からC末端の順に含む:VH-L1-CL-L2-CH1
ここで、L1及びL2は、それぞれ独立してペプチドリンカーであり;及び、
ここで、CLは、βシート接触によりCH1と対になり、それによりCL/CH1ダイマーとなる
ことを特徴とする単鎖VH抗体(scVHAb)。 - CLが、Cκ又はCλのいずれかであり、好ましくはCλが、Cλ1、Cλ2及びCλ3からなる群より選択される、請求項1に記載のscVHAb。
- L1が、3〜40アミノ酸長のアミノ酸配列であり、好ましくは
a)任意の組合せのグリシン及び/又はセリンの配列;又は
b)VHフレームワーク配列からなり、
及び/又は
L2が、25〜50アミノ酸長のアミノ酸配列であり、好ましくは、任意の組合せのグリシン及び/又はセリンの配列からなる
請求項1又は2に記載のscVHAb。 - 抗原結合部分のC末端が、ヒンジ領域に融合され、さらに、N末端からC末端の順に少なくともCH2-CH3を含む免疫グロブリン定常ドメインに融合される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のscVHAb。
- 請求項4に記載のscVHAbを2つ含む重鎖抗体であって、第1のscVHAbのCH2-CH3ドメインが、第2のscVHAbのCH2-CH3ドメインと対になり、それによってFc領域となる、重鎖抗体(HCAb)。
- 医療用である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のscVHAb、又は請求項5に記載のHCAb。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のscVHAbをコードする核酸分子。
- 請求項5に記載のHCAbをコードする核酸分子。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のscVHAb、又は請求項5に記載のHCAbを含む抗体のレパートリーであって、多様な抗体(各々が異なる抗原結合部位を特徴とする)を含み、B細胞から抗体をコードする遺伝子をクローニングすることによって、又は種々の哺乳動物形質細胞によって抗体を分泌することによって得ることができる、抗体のレパートリー。
- 形質細胞がげっ歯類起源である、請求項9に記載のレパートリー。
- 形質細胞がマウス起源である、請求項10に記載のレパートリー。
- a)VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々を1つ以上含む可変重鎖領域、
b)CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含み、任意でCH2及びCH3ドメインをコードするエクソンをさらに含む定常重鎖領域、及び
c)連結領域
を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、
これらの領域が、請求項1〜4のいずれか1項に記載のscVHAb又は請求項5に記載のHCAbを発現するように操作及び配置されている、免疫グロブリン重鎖遺伝子座。 - 請求項10に記載の遺伝子座を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
- マウス、ラット、ウサギ又はニワトリである、請求項13に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 内因性軽鎖遺伝子座カッパもしくはラムダのいずれか、又はその両方の中の特定の遺伝子座もしくは遺伝子を不活性化するか、又は内因性軽鎖遺伝子座カッパもしくはラムダのいずれか、又はその両方を欠失させる機能喪失変異を含む、請求項13又は14に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、
a)非ヒト動物細胞を提供すること;
b)請求項1〜4のいずれか1項に記載のscVHAb、又は請求項5に記載のHCAbをコードするエクソンを含む1つ以上のベクターを提供すること;
c)前記1つ以上のベクターを前記非ヒト動物細胞に導入すること;
d)前記エクソンを前記非ヒト動物細胞のゲノムに組み込み、前記エクソンが、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある標的部位(前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における第一CH1エクソンの5'側)において、前記非ヒト動物細胞の細胞ゲノムに組み込まれているトランスジェニック細胞を選択すること;
e)前記トランスジェニック細胞を利用して、前記トランスジェニック細胞を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製すること;
を含む、トランスジェニック非ヒト動物の作製方法。 - 非ヒト動物細胞が、胚性幹細胞である、請求項16に記載の方法。
- 抗体を製造する方法であって、
a)非ヒト動物において異種免疫グロブリン重鎖遺伝子座を発現すること、この遺伝子座は、
i)VH、DH及びJH遺伝子セグメントの各々を1つ以上含む可変重鎖領域、
ii)CL及びCH1ドメインをコードする定常エクソンを含む定常重鎖領域、及び
iii)連結領域
を含むものであり、
これらの領域は、請求項1〜4のいずれか1項に記載のscVHAb、または請求項5に記載のHCAbを発現するように操作及び配置されており、
ここで、前記非ヒト動物は、内因性カッパ及び/又はラムダ遺伝子座を発現しない;及び
b)請求項1〜4のいずれか1項に記載のscVHAb、又は請求項5に記載のHCAbである抗体、又は少なくとも前記scVHAb又は前記HCAbのVHドメインを含む抗体を産生すること
を含む、抗体の製造方法。 - 請求項13〜15のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の使用であって
a)scVHAb又はHCAb抗体、又はVHドメインを含むそのフラグメントを産生するため;又は
b)scVHAb又はHCAb抗体、又はVHドメインを含むそのフラグメントのナイーブライブラリー、又は前記ナイーブライブラリーをコード又は発現する核酸配列のライブラリーを作るため
の使用。 - 前記scVHAb又はHCAb抗体に含まれる前記VHドメイン、又はそのフラグメントを含む抗体を産生することをさらに含む、請求項19に記載の使用。
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