KR20210110600A - 혼합 결합 도메인 - Google Patents
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Abstract
인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함하고, 가변 영역은 인간 가변 영역과 페어링되는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
Description
본 발명은 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체, 및 이러한 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체는 인간에 대해 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역을 포함하며, 여기서 이러한 가변 영역은 동족 사슬의 인간 가변 영역과 페어링(pairing)된다. 본 발명은 또한 게놈 내에 결합 도메인 또는 다량체, 또는 그의 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함하는, 펩티드 디스플레이에 적합한 파지 또는 다른 유기체에 관한 것이며; 복수의 이러한 유기체를 포함하는 디스플레이 라이브러리 및 이러한 디스플레이 라이브러리의 제조 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 결합 도메인 또는 다량체, 또는 그의 변이체를 생성하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 포함하는 약제학적 조성물; 요법에 의한 인간 또는 동물의 치료에서의 그의 용도; 및 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 사용하여 의학적 징후를 앓고 있는 인간 또는 동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
쾰러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein)에 의한 하이브리도마 기술의 개발은 인간 질병의 예방 및 치료를 위한 항체 사용의 문을 열었고, 마우스는 항체의 생성을 위해 빈번하게 선택되었다.
원래, 인간 치료를 위해 마우스 항체를 직접 사용하려는 시도가 있었다. 인간에 대한 마우스 항체 투여에 대해 면역원성 반응을 일으켜 질병 및 잠재적 사망을 초래하는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 경험한 후, 항체를 생성할 수 있는, 인간 가변 및/또는 불변 영역을 인코딩하는 핵산을 보유하는, 면역 시스템을 갖는 형질전환 마우스가 개발되었으며, 이는 이어서 인간 치료제의 개발을 위해 분석될 수 있었다. 유사하게, 파지 디스플레이 라이브러리가 인간 면역글로불린을 인코딩하는 핵산을 사용하여 생성되었다. 이러한 인간화된 마우스 및 파지 디스플레이 라이브러리는 오늘날 시장에서 다수의 성공적인 치료 항체에 기여하였으며, 임상 개발에 더 많은 기여를 하였다.
재배열된 경쇄 또는 중쇄 가변 사슬을 포함하는 인간 공통 면역글로불린 사슬을 인코딩하고, 이러한 동물의 생식세포계열 내의 동족 사슬(들)의 재배열되지 않은 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 보유하는 인간 형질전환 동물도 이전에 설명되었다. 이러한 형질전환 동물은 면역글로불린의 2개의 동족 사슬 중 하나, 예를 들어 B-세포 발달 동안 체세포 재조합을 겪고 항원 노출 후 친화성 성숙을 겪는 재배열되지 않은 중쇄 또는 경쇄를 통해 생성된 다양성을 갖는 항체를 생성할 수 있다. 이들 형질전환 동물, 예컨대 MeMo® 마우스(예를 들어, 국제 특허 공개 WO2009/15771호)는 다수의 항원에 대한 항체의 다양한 레퍼토리를 생성할 수 있으며, 여기서 예를 들어, 상이한 항원 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 대한 이러한 레터토리의 중쇄 가변 영역을 인코딩하거나 기초로 하는 핵산은 이후 이중특이성 항체, 바이오닉스(Biclonics)®의 대형 패널을 인코딩하는 숙주 세포 내에 조합될 수 있다. 이들 세포는, 분화된 새로운 생물학적 특징을 갖는 이중특이성 항체의 효율적인 생성을 위해 용이하게 스크리닝될 수 있다(예를 들어, 국제 특허 공개 WO2017/069628호).
인간화된 형질전환 마우스는 의학적 혁신을 초래하고 추가의 발전 가능성을 제공하지만, 마우스와 인간 사이의 진화적 유사성을 고려할 때, 인간에 대해 면역학적으로 블라인드된 항원(예를 들어, 자가-항원) 상에 에피토프가 존재할 수 있으며, 이는 형질전환 마우스 또는 인간과 진화적으로 유사한 다른 동물에 대해 유사하게 면역학적으로 블라인드될 수 있다. 인간 및 마우스는 주어진 항원에 대해 많은 보존된 도메인을 공유하기 때문에, 이는 이러한 형질전환 동물의 면역화가 형질전환 동물을 변형시키거나 잠재적으로 힘든 면역화 프로토콜에 관여하는 추가의 노력 없이 낮은 수준의 항체를 생성하거나 전혀 생성하지 않을 수 있는 경우를 초래할 수 있다.
유사하게, 형질전환 유기체의 면역화가 항체를 생성하지만, 이러한 항체가 인간 및 형질전환 동물에 대해 교차-반응성이 아니어서, 이러한 항체의 검정 및 시험의 효율이 떨어지는 경우가 있다. 또한, 설치류 또는 마우스와 같은 야생형 동물의 면역화, 및 동일한 표적을 갖는 인간화된 면역 시스템을 이용한 형질전환 동물의 면역화가 종에 걸쳐 유사한 에피토프에 결합하는 항체로 구성된 항체 레퍼토리를 생성할 수 있는 더 드문 경우가 있다.
따라서, 인간 항원 상의 신규한 에피토프를 인식하는 치료적 항체의 생성이 필요하다.
임의의 이론에 구애됨이 없이, 본 발명자들은 인간과 면역화된 동물 사이의 진화적 유사성이, 이러한 동물이 인간에게 진화적으로 근접한 경우, 이러한 동물에서 면역 반응을 유발할 수 있고, 이는 인간 레퍼토리에 의해 생성된 그러한 항체에 대해 동일하거나 유사한 에피토프를 표적으로 하는 항체를 발달시켜, 이러한 형질전환 동물에 의해 식별되지 않는 신규한 에피토프 또는 네오에피토프를 잠재적으로 유도한다고 믿는다. 즉, 일반적으로 진화적 유사성은 전형적으로 종들 사이에 유사하거나 동일한 에피토프를 인식하는 항체가 아니라 종들 사이에서 상이한 에피토프를 인식하는 항체 레퍼토리를 초래한다.
따라서, 가변 영역 및/또는 상보성 결정 영역(CDR), 및 인간과 진화적으로 멀리 떨어져 있는 종의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는, 상기 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 키메라 또는 인간화 결합 도메인 또는 항체를 포함하는, 결합 도메인 또는 항체를 수득하는 것이 유익할 수 있다. 이는 인간 및 더 진화적으로 근접한 종(예를 들어, 설치류 및 다른 포유류 종)으로부터의 가변 영역을 갖는 인간, 인간화 또는 키메라 항체에 의해 쉽게 식별되지 않는 에피토프에 결합할 수 있는 것을 포함하는 신규한 항체가 생성되도록 할 수 있다. 진화적으로 멀리 떨어져 있는 종의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는, 가변 영역을 보유하는 결합 도메인 또는 항체 및 이들을 인코딩하는 핵산의 생성을 위한 이러한 종의 사용은 또한 인간, 쥣과(murine) 및 사이노몰거스(cynomolgus) 교차-반응성인 항체를 생성하는 능력에 있어서 이점을 제공한다.
이러한 가변 영역의 하나의 잠재적인 공급원은 조류, 예를 들어 통제된 환경에서 쉽게 사육되고 면역화될 수 있는 닭, 오리 및 타조와 같은 길들여진 조류일 수 있다. 조류는 3억년 넘게 인간과 공통 조상을 공유하지 않았으며 아르코사우루스(Archosaurs) 군 동물의 몇 안 되는 알려진 생존자 중 하나이다. 인간에 대해 진화적으로 원위에 있는 이러한 군의 가변 영역 및 면역 시스템은, 포유동물(예를 들어, 인간, 설치류, 및 사이노몰거스) 사이에서 보존되고 면역학적으로 블라인드되거나 손상될 수 있는 치료 표적에 결합할 수 있는 항체 역가의 생성에 적합한 면역 반응을 제공한다. 더욱이, 조류, 예를 들어 닭, 오리 및 타조의 면역화를 통해 생성된 항체 레퍼토리는 인간에 진화적으로 가까운 마우스 또는 다른 종(예를 들어, 설치류 및 사이노몰거스)의 면역화를 통해 생성된 항체와 비교할 때 독특한 에피토프를 식별할 수 있다.
임의의 이론에 구애됨이 없이, 이는 인간과 조류, 예컨대 닭 사이의 진화적 거리 때문일 수 있다. 예를 들어, 닭 HCDR3 서열에서 비정상적으로 낮은 티로신 표시 및 비정상적으로 높은 시스테인 표시로 예시되는 바와 같은 닭의 상보성 결정 영역(CDR)에서의 상이한 아미노산 사용량, 및 동일한 항원에 대해 인간(및 진화적으로 더 관련된 종)과 관련하여 발생하는 항원에 대한 레퍼토리의 상이한 면역원성 반응은 인간 면역 반응 또는 이용되는 고전적 형질전환 동물, 예를 들어, 다른 동물 중에서도 마우스, 래트 또는 토끼의 면역 반응과 비교하여 독특한 항체를 생성하는 능력을 제공한다.
이전에는, 인간과 크게 관련이 없는 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역 및/또는 CDR을 보유하는 항체, 예를 들어, 닭 항체의 사용에 의한 면역원성의 위험이, 마우스와 같은 더욱 진화적으로 근접한 종에 비해, 이러한 항체의 사용에 장애가 되는 것으로 이해되었다. 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 서열을 갖는 항체의 폴리펩티드의 인간화로 인해 이러한 항체의 가변 영역 또는 상보성 결정 영역이 인간 항체 포맷에 이식될 수 있으며, 이는 이러한 항체 또는 이러한 가변 영역을 포함하는 항체를 인간 임상 개발 또는 치료 환경에서 사용하는 데 장애가 되는 것으로 이해되었다.
더욱이, 조류(예를 들어, 닭) 항체 가변 영역 또는 항체 도메인을 인간 항체 포맷과 조합하여 키메라 닭/인간 항체를 생성하는 능력은 이러한 레퍼토리로부터의 이러한 항체의 탈안정화 및/또는 친화성 및 효능의 손실 가능성이 있는 힘들고 불확실한 활동으로 간주되어, 이러한 항체 및 숙주를 사용하여 항체를 생성하는 이점의 유용성을 다시 제한한다.
따라서, 적어도 상기에 제공된 이유 때문에, 동족 사슬의 인간 가변 영역과 페어링된, 인간에 대해 진화적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 또는 항체를 포함하는 다량체, 및 그의 변이체; 및 이러한 결합 도메인, 또는 항체를 포함하는 다량체의 제조 방법; 이들을 인코딩하는 핵산; 이러한 결합 도메인의 가변 영역을 표시하는 디스플레이 라이브러리의 생성; 이러한 결합 도메인 또는 항체를 포함하는 다량체의 스크리닝; 이들을 생성하는 숙주 세포의 제조; 및 이들을 포함하는 약제가 매우 바람직하며, 당업계에서의 진보이고, 이러한 발명이 본 명세서에서 기술된다.
다수의 단백질을 다양화시키는 조류와 인간 사이의 진화적 거리에도 불구하고, 그리고 조류 종들의 제한된 수의 기능적 VH 유전자 세그먼트가 1차 아미노산 서열에서 인간 VH 유전자 세그먼트와 유의한 상동성을 공유하지 않는다는 사실에도 불구하고, 본 발명자들은 재배열된 가변 영역을 분석할 때 닭, 오리 및 타조 VH 유전자 세그먼트가 인간 VH 유전자 세그먼트와 상당한 3차 구조적 유사성을 공유함을 확인하였다.
예를 들어, 본 발명자들은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 Her3에 결합하는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 MF3178(PDB 엔트리 5O4O)을 갖는 인간 Fab의 결정 구조에 기초하여 생성되는 인간/닭 하이브리드 Fab의 3D 상동성 모델을 생성하였다. MF3178은 모 VH1-02 가변 유전자 세그먼트로부터 유래되고, 인간 공통 경쇄를 포함한다. 모델에서, 인간 VH 영역을 닭 Fab의 구조에서 가져온 닭 VH 영역의 아미노산 서열에 기초하여 모델링된 VH 영역으로 대체하였다. 모델의 분석은 닭 VH 영역과 인간 공통 경쇄 계면 사이에 존재하는 24개의 비결합 정전기적 상호작용부를 보여준 반면, MF3178 및 경쇄의 완전 인간 계면에서는 20개의 비결합 정전기적 상호작용부가 확인되었다. 이는 닭 VH와 인간 VL 사이의 계면이 상보적이며, 인간/닭 하이브리드 Fab가 이들 상호작용부에 의해 안정화되고, 완전 인간 Fab보다 더 안정적일 수 있음을 나타낸다. 이는, 기능적 닭 V 유전자 세그먼트와 본 명세서에 예시된 MF3178이 유래하는 인간 VH1-02 유전자 세그먼트 사이의 낮은 수준의 1차 아미노산 서열 상동성, 즉 단지 43%의 서열 동일성을 고려하면 특히 놀랍다.
따라서, 본 명세서에서 본 발명자들은 새로운 유형의 하이브리드 또는 키메라 결합 도메인을 형성하기 위해 인간 VL 영역과 직접 페어링된, 조류에 의해 생성된 재배열된 VH 영역을 포함하는 결합 도메인을 기술한다. 이러한 VH 및 VL 영역을 포함하는 Fab가 생성될 수 있으며, 이의 CH1 및 CL 영역은 둘 모두 인간이거나 둘 모두가 인간과 진화적으로 멀리 떨어져 있는 동물(예컨대, 닭, 오리 또는 타조를 포함하는 조류)의 것일 수 있다. CH1 영역은 진화적으로 멀리 떨어져 있는 동물의 것이고, CL 영역은 인간의 것인 것이 또한 가능하다. CH1 영역은 인간의 것이고, CL 영역이 진화적으로 멀리 떨어져 있는 동물의 것인 것이 또한 가능할 수 있다.
예를 들어, 닭 중쇄 가변 영역은 3차 구조 수준에서 인간 중쇄 가변 영역과 상동성을 공유하여, 면역화된 닭으로부터 단리된 닭 재배열된 VH 영역이 결합 도메인, 다량체, 항체, 또는 변이체의 패널을 생성하기 위해 인간 가변 경쇄(VL) 영역, 바람직하게는 공통 사슬로 작용할 수 있는 VL 영역과 직접 페어링될 수 있으며, 여기서 이러한 도메인의 다양성 및 관심 항원에 결합하는 능력은 주로 닭 중쇄 가변 영역으로 인한 것이다. 이러한 혼합 결합 도메인은 B-세포 성숙 동안 조류 가변 영역 및 인간 가변 영역이 공진화할 필요 없이 안정적으로 형성될 수 있지만, 오히려 예를 들어 야생형 재배열된 조류 중쇄 가변 영역을 사용하고 이를 인간 경쇄, 바람직하게는 인간 공통 경쇄와 페어링되게 함으로써 혼합 결합 도메인으로 용이하게 조합될 수 있다. 이러한 기술은 포유류 종에 걸쳐 교차 반응할 수 있는 알려진 항원 및 혼합 결합 도메인의 새로운 결합의 잠재적인 식별을 위해 이러한 혼합 결합 도메인의 대규모 스크리닝을 허용하는 디스플레이 라이브러리의 생성을 허용한다.
이러한 방식으로, 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 인간 공통 중쇄 또는 공통 경쇄 가변 영역과 같은 인간 가변 영역과 조류, 예컨대 닭, 오리 및 타조의 재배열된 가변 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 페어링으로부터 키메라 결합 도메인, 다량체 및 항체를 직접 생성하는 것이 가능하다. 동족 조류 경쇄 가변 영역이 아니라, 인간 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 인간 공통 경쇄 가변 영역의 사용이 바람직하다. 첫째, 인간 공통 경쇄 가변 영역을 사용함으로써, 결합 도메인의 절반이 즉시 인간화된다. 둘째, 인간 공통 경쇄 가변 영역을 사용함으로써, 인간 공통 경쇄 가변 영역과 페어링된 야생형 조류 중쇄 가변 영역이 식별되고, 이어서 항체, 특히 이중특이성 항체, 또는 다가 다량체의 효율적인 생성에 사용될 수 있다.
Fab는 펼쳐지지 않는 도메인 구조를 함께 만들어야 하는 중쇄 및 경쇄 부분으로 구성되고, 진화적으로 멀리 떨어져 있는 종으로부터의 중쇄 및 경쇄가 조합될 때 안정한 결합 도메인을 형성하도록 작용한다는 것은 예상치 못한 일이다. 디스플레이 기술의 사용은 다른 항체/동물/종으로부터 유래된 (공통) 경쇄와 관련하여, (상기 동물을 면역화하기 위해 사용된) 항원과 결합할 수 있는, 인간과 계통 발생적으로 원위적으로 관련된 동물로부터의 중쇄 가변 영역 사슬의 식별을 가능하게 한다.
놀랍게도, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 관심 항원에 결합하는 인간과 원위적으로 관련된 동물로부터의 항체 레퍼토리로부터 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 인간 경쇄와 페어링될 수 있다. 이는 천연 VH/VL 페어링을 포함하는 항체에 의해 결합된 항원에 결합할 수 있는 안정한 VH/VL 계면을 생성한다.
(한 쪽의 조류 가변 영역과 페어링된 다른 쪽의 인간 가변 영역으로 구성된) 이들 결합 도메인을 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 내로 용이하게 통합될 수 있다. 이어서, 이러한 숙주 세포는 공통 인간 경쇄와 함께 하나 이상의 중쇄 가변 도메인을 발현할 수 있으며, 이는 인간 가변 유전자 세그먼트 또는 인간에 더욱 진화적으로 근접한 종, 예컨대 설치류, 및 기타 포유류에 기초하거나 그로부터 유래되는 가변 유전자 세그먼트에 기초하거나 그로부터 유래되는 항체 패널에 의해 쉽게 식별되지 않을 수 있는 에피토프를 표적으로 하는 것을 포함하여, 다양한 항원에 결합할 수 있는 다중특이적 항체를 포함하는 다량체의 대형 패널의 생성을 가능하게 한다. 더욱이, 인간 가변 영역과 페어링된 인간과 원위적으로 관련된 동물로부터의 페어링된 가변 영역으로 구성된 이러한 결합 도메인은 전체 인간 가변 영역, 또는 인간에 계통 발생적으로 더 가까운 면역화된 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역을 갖는 항체보다 다양한 포유 동물(쥣과, 인간 및 사이노몰거스 포함)에 존재하는 항원에 더 용이하게 교차 반응성이다.
출원인들은 2개 이상의 다양한 면역글로불린 가변 사슬(중쇄 또는 경쇄 가변 사슬) 및 공통 가변 사슬(중쇄 또는 경쇄 공통 가변 사슬)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포로부터 이중특이성 및 다중특이성 항체를 발현하는 능력, 및 중쇄 이종이량체의 형성을 유도하는 CH3 조작(engineering)을 포함하는, Fc 영역의 조작을 사용하여 동종이량체 항체보다 이러한 이중특이성 및 다중특이성 항체를 우선적으로 생성하기 위해 이러한 가변 사슬이 페어링될 수 있는 방식(국제 특허 공개 WO2013/157954호)을 이전에 기술하였다. CH3 엔지니어링 차지 디퍼렌셜(engineering charge differential) 또는 노브-인-홀(knob-in-hole)에 의한 것을 포함하여 상이한 중쇄의 이종이량체화를 달성하는 다른 수단이 마찬가지로 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 본 명세서에 개시된 발명은 공통 가변 영역 또는 공통 사슬, 전형적으로 인간 공통 가변 영역 또는 공통 사슬, 및 조류와 같은, 인간에 대해 계통 발생적으로 원위에 있는 유기체의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 동족 가변 영역 또는 동족 사슬을 포함하는, 결합 도메인 및 다량체, 예컨대 항체에 관한 것이다. 예를 들어, 공통 사슬은 공통 경쇄(cLC), 예컨대 인간 공통 경쇄일 수 있고, 동족 가변 영역은 닭, 오리 및 타조를 포함하는 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역(VH)일 수 있다.
인간 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 인간 공통 경쇄 가변 영역을 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산(들)에 의해 인코딩된 VH 영역과 페어링하는 것(또는 그 반대)은 인간 합성 파지 디스플레이 라이브러리, 및 인간화 면역 시스템을 보유한 형질전환 유기체의 사용을 포함하여 전통적인 항체 생성 플랫폼을 통해 접근하거나 결합할 수 없는 에피토프에 접근할 수 있는 결합 도메인, 다량체 및 항체의 생성을 촉진한다.
더욱이, 인간 사슬, 바람직하게는 인간 공통 사슬과 페어링된, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물로부터의, 바람직하게는 닭과 같은 조류로부터의 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 다량체 및 항체의 생성은 항체 및 변이체를 포함하는 이중특이성 및 다중특이성 다량체의 생성에 유용하다. 인간 사슬, 바람직하게는 인간 공통 사슬의 사용은 결합 도메인의 절반이 즉시 인간화될 수 있게 한다. 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물은 본 명세서에서 "본 발명에 사용하기에 적합한 동물"로 지칭될 수 있다.
모든 고등 척추동물에서와 같이, 조류(예컨대, 닭) VH/VL 영역의 주요 다양성은 V(D)J 재조합 후, 친화성 성숙에 의해 생성된다.
V(D)J 재조합에 이용가능한 다수의 기능적 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 갖는 인간 및 포유류, 예컨대 마우스와는 대조적으로, 다양한 조류, 예를 들어, 닭, 오리 및 타조는, 한 세트의 기능적 D 유전자 세그먼트에 더하여, VH, JH, VL 및 JL에 대해 각각 제한된 수의 기능적 유전자 세그먼트만을 함유한다. 실제로, 닭과 타조는 단지 하나의 기능적 V 유전자 세그먼트만을 가진다. 예를 들어, 오리는 1개 또는 2개만큼 적은 기능적 중쇄 V 유전자 세그먼트를 가질 수 있다.
면역 레퍼토리의 추가의 다양화는 재조합된 VH 및 VL 영역이 상응하는 V(D) 서열(의 일부)을 포함하는 한 세트의 위유전자(pseudogene)와의 상동성 재조합을 통해 다양화되는 유전자 변환 공정으로 인해 닭에서 생성된다. 이들 비기능적 위유전자는 재조합 신호 서열, 프로모터, 신호 펩티드 및 코작(Kozak) 번역 개시 부위가 결여되어 있다. 생성된 VH 및 VL 영역의 체세포 과돌연변이와 조합되어, 이 과정은 매우 다양한 CDR을 갖는 닭 항체 레퍼토리를 초래하는 반면, 프레임워크(FW) 서열은 원래의 기능적 유전자와 매우 유사하게 남아 있으며; 닭은 JH/JL 위유전자가 없기 때문에 FW4에는 돌연변이가 도입되지 않거나 제한된 돌연변이가 도입된다. 닭에서, 주요 항체 아이소타입은 IgY이며, 이는 포유류에서 IgG와 구조적 및 기능적으로 유사하므로 종종 IgG로 잘못 표지된다(문헌[Renaud et al., Cell 40, 283-291, 1985]; 문헌[Renaud et al., Cell 48, 379-388, 1987]; 문헌[Renaud et al., Cell 59, 171-183, 1989]; 및 문헌[Wu et al., The Journal of Immunology 188, 322-333, 2012]).
본 발명자들은, Her3에 결합하는, 인간 Fab MF3178(PDB 엔트리 5O4O)의 결정 구조에 기초하여 생성된 인간/닭 하이브리드 Fab의 3D 상동성 모델을 생성하고 본 명세서에 개시하였으며(하기 실시예 참조), 여기서 아미노산 서열에 기초한 VH 영역은 서열 번호 1에 제시된 서열을 갖는다. MF3178은 모 VH1-02 가변 유전자 세그먼트로부터 유래되고, IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 공통 경쇄와 페어링된다.
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDHGSRHFWSYWGFDYWGQGTLVTVSS (서열 번호 1)
모델에서, 인간 VH 영역을 닭 Fab(PDB 4GLR; 문헌[Shih et al. J. Biological Chemistry 287, 44425-44434, 2012])의 구조에서 가져온 닭 VH 영역의 아미노산 서열(서열 번호 2)에 기초하여 모델링된 VH 영역으로 대체하였다. 놀랍게도, 모델의 분석은 닭 VH 영역과 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄 계면 사이에 존재하는 24개의 비결합 정전기적 상호작용부를 보여준 반면, Mf3178(도 4a 참조) 및 경쇄의 완전 인간 계면에서는 20개의 비결합 정전기적 상호작용부가 확인된다. 따라서, 안정한 계면을 형성할 수 있는 많은 수의 접촉 잔기 및 정전기적 상호작용부를 갖는, 인간 동족 가변 영역에 직접 페어링된 야생형 닭 가변 영역으로부터 수득되는 혼합 결합 도메인이 본 명세서에 기술된다.
키메라 닭 VH 영역/인간 cLC 계면에서, 정전기적 상호작용부 중 10개는 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 인간 VH 및 VL 계면의 계면과 비교하여 동일하고, 닭 VH 영역과 인간 공통 경쇄 사이의 상호작용부 중 2개는 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 인간 VH 영역 및 닭 VH 영역 내의 동등한 위치에서 발견되는 상동성 잔기들 사이에 형성된다. 또한, 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 인간 VH/VL 상호작용부와 비교하여 더 많은 수소 결합(6개 대신 12개)이 닭 VH 영역/인간 공통 경쇄 계면에 존재하고, 이는 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 완전한 인간 결합 도메인에 대해서보다 닭 VH 영역과 인간 VL 계면 사이의 더 큰 안정성 잠재력을 나타낸다.
유사하게, 본 발명자들은 제한된 기능적 V 유전자 세그먼트를 갖는 오리에 대해, 재배열된 중쇄 가변 영역이 인간 cLC와 계면을 형성하여 다양한 접촉점 및 정전기적 상호작용부를 생성한다는 것을 입증한다. 인간 VH를 진뱅크(Genbank) 등록 번호 A46529의 아미노산 1 내지 133(서열 번호 3)의 구조체로부터 취해진 오리 VH의 아미노산 서열에 기초하여 모델링된 VH로 대체하였다.
놀랍게도, 모델의 분석은, 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 완전 인간 계면에서 확인되는 20개의 비결합 정전기적 상호작용부와 비교하여, 오리 VH 영역과 인간 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄 가변 영역 계면 사이에 존재하는 28개의 비결합 정전기적 상호작용부를 나타내었고(도 10a 참조), 오리 중쇄/인간 경쇄를 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 동일한 위치에서 발견되는 인간 중쇄/인간 경쇄와 비교할 때, 이들 상호작용부 중 12개가 동일하고 1개가 동등하였다.
제한된 기능적 V 유전자 세그먼트를 갖는 타조에 대해, 타조의 재배열된 중쇄 가변 영역이 인간 cLC와 계면을 생성하여 다양한 접촉점 및 정전기적 상호작용부를 생성한다는 것이 추가로 입증된다. 인간 VH는 진뱅크 등록 번호 AFN02388.1(서열 번호 4)의 구조체로부터 취해진 타조 VH 영역의 아미노산 서열에 기초하여 모델링된 VH 영역으로 대체되었고, 14개의 비결합 정전기적 상호작용부가 타조 VH 영역과 공통 경쇄 계면 사이에 존재한다.
키메라 타조 VH 영역/인간 cLC 계면에서, 정전기적 상호작용부 중 7개는 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 인간 VH 및 VL과 비교하여 동일하고, 타조 VH 영역과 인간 VL 사이의 상호작용부 중 1개는 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 동일한 위치에서의 인간 중쇄/인간 경쇄에서 발견되는 상동성 잔기들 사이에 형성된다.
따라서, 본 발명자들은, 조류의 재조합되고 친화성 성숙된 중쇄 가변 영역, 예를 들어 닭 중쇄 가변 영역은 인간 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 공통 경쇄 가변 영역 또는 공통 경쇄, 더욱 바람직하게는 생식세포계열 경쇄 가변 영역 또는 경쇄, 예를 들어, IgVK1-39*01/IGJK1*01과 직접 페어링되어, 예를 들어 형질전환 유기체에서 발생하는 B-세포 발달 및 친화성 성숙, 또는 광범위한 항체 조작을 통해 닭 VH 및 인간 VL의 공진화가 필요 없이, 2가 및 다가 항체 및 다른 다량체의 생성을 위한 것을 포함하는 기능적 결합 도메인, 예를 들어 Fab, F(ab')n 또는 scFv 도메인을 수득할 수 있음을 입증하였다.
원칙적으로, 본 명세서에 제시된 기술 및 교시에 따라, 임의의 진화적으로 멀리 떨어져 있는 동물, 예를 들어 조류, 예컨대 닭을 취하고 동족 닭 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인간 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 특히 인간 공통 경쇄 또는 인간 공통 경쇄 가변 영역으로 대체할 수 있다.
따라서, 조류의 재조합되고 친화성 성숙된 중쇄 가변 영역과 경쇄, 특히 공통 경쇄의 인간 가변 영역 사이의 구조적 상동성은 조류의 중쇄 가변 영역이 친화성 및 특이성에 대해 우세한 항체가 선택될 수 있는 키메라 라이브러리가 생성되도록 한다. 인간 공통 사슬로 구성되고 야생형 조류 재배열된 사슬과 페어링된 라이브러리의 생성은, 그의 야생형 동족 사슬과 페어링되지 않고 관심 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 후자의 사슬을 식별할 수 있게 한다. 따라서, 이러한 라이브러리는 이중특이성 항체 또는 다가 다량체의 효율적인 생성을 위해 상기 중쇄와 이들을 인코딩하는 핵산의 식별을 가능하게 한다.
즉, 본 명세서에 개시된 발명은, 예를 들어, 다량체 또는 항체의 형태를 취할 수 있는 새로운 혼합 결합 도메인을 포함하며, 이는 인간 VL 영역과 페어링된, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 예컨대 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 VH 영역을 포함한다. 전형적으로, 이러한 동물은 오직 V 유전자 세그먼트의 제한된 레퍼토리만, 예를 들어 1개, 2개, 3개 또는 4개의 중쇄 V 유전자 세그먼트만 갖는 것이다. 예를 들어, 이것은 또한 인간 V 영역에 대한 구조적 유사성을 갖는 V 영역을 갖는 동물일 수 있다.
바람직하게는, 이러한 결합 도메인은 인간 경쇄, 예를 들어 인간 공통 경쇄, 더욱 바람직하게는 생식세포계열 경쇄 가변 영역 또는 경쇄, 예를 들어 IgVK1-39*01/IGJK1*01을 포함한다. 이러한 결합 도메인, 또는 이러한 결합 도메인을 포함하는 항체, 다량체 또는 변이체는 치료제로서 사용하기에 직접적으로 적합할 수 있거나, CDR 이식 및 다른 변형을 포함하는 추가의 인간화를 거칠 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물("본 발명에 사용하기에 적합한 동물")의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 그의 변이체가 제공되며, 가변 영역은 인간 가변 영역과 페어링된다. 이러한 결합 도메인에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 동물의 VH 영역과 인간 VL 사이의 접촉점의 수는, 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab에 대해 본 명세서에 예시된 바와 같이, 인간 VH 영역과 인간 VL 결합 도메인 사이에 존재하는 것과 실질적으로 유사하고/하거나 바람직하게는 적어도 그만큼 많을 수 있다.
이러한 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 변이체의 레퍼토리를 예를 들어 라이브러리 형태로 만들 수 있다. 이러한 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 변이체의 레퍼토리는 또한 예를 들어, 본 발명에 사용하기에 적합한 동물의 항체의 동족 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인간 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 특히 인간 공통 경쇄 또는 인간 공통 경쇄 가변 영역으로 대체함으로써 제조될 수 있다. 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 변이체는 원하는 특이성을 갖도록 선택될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 개시된 발명에 따르면, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 그의 변이체가 제공되며, 가변 영역은 인간 가변 영역과 페어링된다. 본 발명은 또한 이러한 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 변이체의 레퍼토리를 포함한다.
따라서, 본 명세서에 개시된 발명에 따르면, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는, 인간 가변 영역과 페어링된 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 그의 변이체가 제공되며, 이러한 결합 도메인은, 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab에 대해 본 명세서에 예시된 바와 같이, 결합 도메인의 인간 중쇄/인간 경쇄 가변 영역 계면에 존재하는 정전기적 상호작용부와 동일하거나 동등한 4개, 바람직하게는 5개, 바람직하게는 8개 및 더욱 바람직하게는 10개 이상의 정전기적 상호작용부를 포함한다.
인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 상기 동물은 전술된 바와 같은 조류, 바람직하게는 닭, 오리 및 타조일 수 있다.
본 발명은 또한 혼합 결합 도메인의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 예컨대 조류를 항원에 노출시키는 단계;
- 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 이러한 동물로부터 단리하는 단계; 및
단리된 핵산에 의해 인코딩되는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 영역과 페어링되게 하여 혼합 결합 도메인을 형성하는 단계를 포함한다.
혼합 결합 도메인은 항체 또는 그의 변이체, 특히 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이적 또는 삼중특이적 항체의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 항체 또는 그의 변이체의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은:
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 예컨대 조류를 항원에 노출시키는 단계;
- 항원에 결합할 수 있는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 이러한 동물로부터 단리하는 단계; 및
중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 단리되거나, 유래되거나 수득되는 유전 물질에 의해 인코딩되는 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하며, 상기 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 혼합 결합 도메인을 형성하는 인간 동족 사슬 가변 영역과 페어링된다.
상기 라이브러리는 파지, 효모, 리보솜, 또는 당업계에 공지된 펩티드 디스플레이를 위한 다른 용기로 구성될 수 있다.
본 발명의 라이브러리, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리는 동족 사슬 가변 영역과 결합할 수 있는 조류로부터의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 식별하거나 선택하는 데 사용될 수 있다. 선택은, 인간 (공통) 경쇄 또는 중쇄와 조합될 때, 라이브러리 내에서 조류로부터의 어느 중쇄 또는 경쇄가 조류를 면역화하는 데 궁극적으로 사용되는 항원에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해 수행된다.
본 발명은 또한 하기를 제공한다:
- 게놈 내에 하기를 포함하는 본 발명의 파지: 조류의 중쇄 영역에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열; 및 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열;
- 본 발명의 복수의 파지를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리;
- 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법으로서,
조류를 항원으로 면역화하는 단계;
항원에 결합할 수 있는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산 서열을 이러한 동물로부터 단리하는 단계; 및
핵산 서열을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하여,
파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는, 방법;
- 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법으로서,
항원으로 조류를 면역화하는 단계 - 이러한 동물은 VH/VL 계면에서 인간 VL 가변 영역과의 5개, 바람직하게는 8개 및 더욱 바람직하게는 10개의 정전기적 상호작용부를 포함하는 기능적 VH 유전자 세그먼트를 포함함 -;
항원에 결합할 수 있는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산 서열을 이러한 동물로부터 단리하는 단계; 및
핵산 서열을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하여,
파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는, 방법;
- 본 발명의 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 식별하는 방법;
- 인간 경쇄와 페어링된 에피토프에 결합할 수 있는, 조류의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 2개 이상의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포 - 바람직하게는 각각의 인코딩된 중쇄 가변 영역은 표적 상의 동일하거나 상이한 표적 또는 에피토프에 결합할 수 있음 -;
- 인간 경쇄와 페어링된 에피토프에 결합할 수 있고 가변 결합 도메인, 바람직하게는 다량체, 항체 또는 그의 변이체, 및 더욱 바람직하게는 다중특이성 다량체, 항체 또는 그의 변이체를 형성하기 위해 발현 및 다량체화할 수 있는, 조류의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 2개 이상의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산;
- 본 발명에 따른 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물;
- 요법에 의한 인체 또는 동물체의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체; 및
- 본 발명의 항체의 치료적 유효량을 의학적 징후를 앓고 있는 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 또는 동물의 치료 방법.
도 1은 얼라인X(AlignX)를 통해 얻어진 7개의 VH 패밀리 각각을 나타내는 47개의 인간 생식세포계열 VH 유전자 세그먼트와 하나의 기능적 닭 VH 유전자 세그먼트(VH1)에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 각각의 인간 VH 유전자 세그먼트에 대한 동일성 백분율이 괄호 사이에 주어져 있다. 얼라인X는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 구성요소이고, 정렬은 디폴트 설정을 사용하여 얻어진다.
도 2는 닭 VH1 유전자 세그먼트 및 인간 VH1-02 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트(Kabat) 넘버링에 따른 CDR 잔기는 파선으로 나타나 있다.
도 3은 유일한 기능적 닭 JH 및 6개의 인간 JH 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 잔기는 파선으로 나타나 있다.
도 4는 닭 VH 영역과 인간 공통 경쇄 영역 사이의 계면 모델의 구조 분석을 제공한다.
도 4a는 중쇄 가변 영역(서열 번호 1) 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7)을 포함하는 Her3을 표적으로 하는 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공하고, 이를 MF3178의 인간 VH의 아미노산 서열이 닭 VH 영역의 상응하는 서열(서열 번호 2; PDB 4GLR)로 대체된 하이브리드 상동성 모델과 비교한다. 별표는 인간 Fab 계면에서의 아미노산들 사이의 상호작용이 키메라 Fab 내의 닭 VH 영역의 아미노산(서열 번호 2)과 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역의 아미노산(서열 번호 7) 사이의 상호작용과 동일하거나 동등한 경우를 나타낸다. 닭 VH 영역과 인간 공통 경쇄 가변 영역 사이의 24개의 정전기적 상호작용부는 인간 VH/인간 cLC 계면에서 20개의 상호작용부와 비교하여 관찰되며, 이때, 닭 VH/인간 cLC 계면 사이의 상호작용부 중 13개는 MF3178의 인간 VH/인간 cLC와 동등하거나 동일하다. 상부 표는 하이브리드 모델에 대한 VH 및 VL(닭 VH-인간 VL), 및 인간 Fab에 대한 VH 및 VL(인간 VH-인간 VL) 사이의 총 비결합 상호작용부(수소 결합, 염 다리(salt bridge) 및 소수성 상호작용부)를 나타낸다. 이는 동일한 상호작용부(정확히 동일한 잔기가 수반됨) 및 등가물(상이한 잔기를 갖는 동일한 위치)을 나열한다. 사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다.
도 4b) 좌: MF3178의 인간 VH/인간 cLC 계면의 3차 구조의 구조 정렬이 제공되고(PDB 5O4O; 연회색) 닭 VH 영역/인간 VL 계면의 하이브리드 상동성 모델(암회색)에 중첩되어 높은 수준의 구조적 유사성을 입증한다. VH 영역 및 VL로부터의 잔기들 사이의 비결합 상호작용부는 파선으로 나타나 있다(MF3178에 대해 흑색, 상동성 모델에 대해 회색).
도 4b) 우: 상동성 모델에서 Thr110과 Gln12 사이에 형성된 수소 결합의 묘사가 제공되어 MF3178(PDB 5O4O; 연회색)의 인간 VH/인간 cLC 계면의 3차 구조를 비교하고, 닭 VH 영역/인간 cLC 계면의 하이브리드 상동성 모델(암회색)에 중첩된다. 닭 Fab(PDB 4GLR)의 VH의 모델은 I110T 위치 변화를 반영하도록 변형되며, 이는 핵산 수준에서 BstEII 클로닝 부위의 도입을 반영하도록 행해진다. I110T 위치 변화의 도입은 반대 베타 가닥 상에서 Gln12와 형성된 수소 결합을 보존한다.
도 4c) 연회색의 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O) 및 암회색의 닭 Fab(PDB 4GLR)의 VL-VH 영역의 구조 정렬이 제공되며, MF3178의 인간 VH/VL과 키메라 닭 VH(서열 번호 2) 및 Vk1-39 cLC의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7) 계면 사이의 유사한 형태 상호작용을 입증한다.
도 5는 얼라인X를 통해 얻어진 7개의 VH 패밀리 각각을 나타내는 47개의 인간 생식세포계열 VH 유전자 세그먼트와 하나의 추정 기능적 타조 VH 유전자 세그먼트(XP_009669322.1 - 서열 번호 13)에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 각각의 인간 VH 유전자 세그먼트에 대한 동일성 백분율이 괄호 사이에 주어져 있다. 얼라인X는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 구성요소이고, 정렬은 디폴트 설정을 사용하여 얻어진다.
도 6은 타조 VH 유전자 세그먼트(XP_009669322.1 - 서열 번호 13) 및 인간 VH3-23 및 인간 VH3-74 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 잔기는 밑줄이 그어져 있다.
도 7a는 중쇄 가변 영역(서열 번호 1) 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7)을 포함하는 Her3을 표적으로 하는 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공하고, 이를 Mf3178의 인간 VH 영역의 아미노산 서열이 타조 VH 영역의 상응하는 서열(서열 번호 4)로 대체된 하이브리드 상동성 모델과 비교한다. 별표는 MF3178 계면에서의 아미노산들 사이의 상호작용이 타조 VH 영역의 아미노산(서열 번호 4)과 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역의 아미노산(서열 번호 7) 사이의 상호작용과 동일하거나 동등한 경우를 나타낸다. 타조 VH 영역과 인간 공통 경쇄 영역 사이의 14개의 정전기적 상호작용부는 인간 VH/인간 cLC 계면에서 20개의 상호작용부와 비교하여 관찰되며, 이때, 타조 VH/인간 cLC 계면 사이의 상호작용부 중 8개는 MF3178의 인간 VH/인간 cLC와 동등하거나 동일하다. 상부 표는 하이브리드 모델에 대한 VH 및 VL(닭 VH-인간 VL), 및 인간 Fab에 대한 VH 및 VL(인간 VH-인간 VL) 사이의 총 비결합 상호작용부(수소 결합, 염 다리 및 소수성 상호작용부)를 나타낸다. 이는 동일한 상호작용부(정확히 동일한 잔기가 수반됨) 및 등가물(상이한 잔기를 갖는 동일한 위치)을 나열한다. 사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다.
도 7b는 타조 중쇄 가변 영역, 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 5 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 키메라 결합 도메인을 나타낸다.
도 7c는 타조 중쇄 가변 영역, 인간 공통 경쇄 영역 계면에서의 정전기적 상호작용부를 나타내고, 도 7a에 제시된 상호작용부의 그래픽 표현을 보여준다.
도 8은 얼라인X를 통해 얻어진 7개의 VH 패밀리 각각을 나타내는 47개의 인간 생식세포계열 VH 유전자 세그먼트와 하나의 추정 기능적 오리 VH 유전자 세그먼트(XP_021132877.1 - 서열 번호 12)에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 각각의 인간 VH 유전자 세그먼트에 대한 동일성 백분율이 괄호 사이에 주어져 있다. 얼라인X는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 구성요소이고, 정렬은 디폴트 설정을 사용하여 얻어진다.
도 9는 오리 VH 유전자 세그먼트(XP_021132877.1 - 서열 번호 12) 및 인간 VH4-59, VH4-61, VH4-39 및 VH4-31 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 잔기는 밑줄이 그어져 있다.
도 10a는 중쇄 가변 영역(서열 번호 1) 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7)을 포함하는 Her3을 표적으로 하는 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공하고, 이를 MF3178의 인간 VH 영역의 아미노산 서열이 오리 VH 영역의 상응하는 서열(서열 번호 3)로 대체된 하이브리드 상동성 모델과 비교한다. 별표는 MF3178 계면에서의 아미노산들 사이의 상호작용이 오리 VH의 아미노산(서열 번호 3)과 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역의 아미노산(서열 번호 7) 사이의 상호작용과 동일하거나 동등한 경우를 나타낸다. 오리 VH 영역과 인간 공통 경쇄 영역 사이의 28개의 정전기적 상호작용부는 인간 VH/인간 cLC 계면에서 20개의 상호작용부와 비교하여 관찰되며, 이때, 오리 VH/인간 cLC 계면 사이의 상호작용부 중 13개는 MF3178의 인간 VH/인간 cLC와 동등하거나 동일하다. 상부 표는 하이브리드 모델에 대한 VH 및 VL(오리 VH-인간 VL), 및 인간 Fab에 대한 VH 및 VL(인간 VH-인간 VL) 사이의 총 비결합 상호작용부(수소 결합, 염 다리 및 소수성 상호작용부)를 나타낸다. 이는 동일한 상호작용부(정확히 동일한 잔기가 수반됨) 및 등가물(상이한 잔기를 갖는 동일한 위치)을 나열한다. 사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다.
도 10b는 오리 중쇄 가변 영역, 및 가변 영역 IgVK1-39*01/IGJK1*01(서열 번호 5)을 포함하는 인간 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 혼합 결합 도메인을 나타낸다.
도 10c는 오리 중쇄 가변 영역, 인간 공통 경쇄 가변 영역 계면에서의 정전기적 상호작용부를 나타내고, 도 10a에 제시된 상호작용부의 그래픽 표현을 보여준다.
도 11은 단일 기능적 닭 VH 유전자 세그먼트(NCBI 등록 번호 M30319)를 포함하는 게놈 DNA 서열을 나타낸다. VH 리더를 인코딩하는 DNA는 연회색으로 강조되어 있고; 성숙 VH를 인코딩하는 DNA는 암회색으로 강조되어 있다. 성숙 서열은 VH 유전자 세그먼트의 아미노산 서열에서 리더 서열을 뺀 것이다. 강조된 영역의 상류 및 하류의 서열은 유전자간 서열을 나타낸다.
도 12는 기능적 닭 JH 유전자 세그먼트(NCBI 등록 번호 M30320)를 포함하는 게놈 DNA 서열을 나타낸다. JH를 인코딩하는 DNA는 밑줄이 그어져 있다. JH 세그먼트의 DNA는 시작과 끝에 부분 코돈을 포함하므로 아미노산 번역보다 더 크다는 것에 유의한다.
도 13은 cDNA로부터 이러한 VH 유전자를 증폭시키는 데 사용되는 정방향 프라이머 chVH-FW의 주석 달린 서열을 나타낸다. 성숙 VH의 시작을 인코딩하는 DNA는 회색으로 강조되어 있다.
도 14는 정방향 프라이머 chVH-FW(서열 번호 15), 기능적 닭 VH의 일부, 및 벡터 MV1511의 일부의 DNA 정렬을 나타낸다. SfiI 클로닝 부위가 표시되어 있다. 성숙 VH의 첫 번째 코돈은 밑줄이 그어져 있다.
도 15는 cDNA로부터 이러한 VH 유전자를 증폭시키는 데 사용되는 역방향 프라이머 chVH-RV(서열 번호 16)의 주석 달린 역보체 서열을 나타낸다. JH의 말단을 인코딩하는 DNA(사실상 전체 프라이머 서열)는 연회색으로 강조되어 있다. 닭 JH 유전자 세그먼트로부터 벗어난 돌연변이는 밑줄이 그어져 있다.
도 16은 역방향 프라이머 chVH-RV의 역보체(rc), 기능적 닭 JH의 일부, 및 벡터 MV1511의 일부의 DNA 정렬을 나타낸다. BstEII 클로닝 부위가 표시되어 있다.
도 17a: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk1의 아미노산 서열(서열 번호 5).
도 17b: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk1의 공통 경쇄 가변 도메인 DNA 서열(서열 번호 6) 및 아미노산 서열(서열 번호 7).
도 17c: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk1의 경쇄 불변 영역 DNA 서열(서열번호 8) 및 아미노산 서열(서열번호 9).
도 17d: 인간 공통 경쇄 가변 도메인 IGKV1-39/jk5의 아미노산 서열(서열 번호 10).
도 17e: IGKV1-39의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 11).
도 18은 파지 디스플레이 벡터 MV1511의 개략도를 나타낸다.
도 19a: 인간 공통 경쇄 IGKV3-15/jk1의 아미노산 서열(서열 번호 87).
도 19b: 인간 공통 경쇄 IGKV3-20/jk1의 아미노산 서열(서열 번호 88).
도 19c: 인간 공통 경쇄 IGLV3-21/jl3의 아미노산 서열(서열 번호 89).
도 19d: IGKV3-15의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 90).
도 19e: IGKV3-20의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 91).
도 19f: 4GLR의 닭 가변 중쇄 영역 및 인간 CH1 영역의 아미노산 서열(서열 번호 92).
도 19g: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk5 및 카파 불변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 93).
도 19h: 인간 공통 경쇄 IGKV3-15/jk1 및 카파 불변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 94).
도 19i: 인간 공통 경쇄 IGKV3-20/jk1 및 카파 불변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 95).
도 19j: 인간 공통 경쇄 IgVλ3-21/IGJλ3 및 람다 불변 영역의 아미노산 서열(서열번호 96).
도 19k: IGLV3-21의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 97)
도 20은 Her3을 표적으로 하는 MF3178(PDB 5O4O; 서열번호 1) 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 인간 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄(서열 번호 5)를 포함하는 인간 Fab(인간 VH - 인간 VL로 표시된 칼럼)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공한다. 인간 VH - 인간 CH1 및 인간 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄 사이에 35개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 24개는 VH-VL 계면에 존재한다. 이는 하기와 비교된다:
1) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 닭 VH 영역 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 동족 닭 VL 및 인간 카파 불변 영역을 포함하는 Fab의 상동성 모델(닭 VH - 닭 VL로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 닭 VL - 인간 카파 불변 영역 사이에 50개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 29개는 VH-VL 계면에 존재한다.
2) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vk3-15/JK1의 아미노산 서열(서열 번호 94)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(Vk3-15/JK1/Ckappa로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vk3-15/JK1 사이에 31개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 19개는 VH-VL 계면에 존재한다;
3) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vk3-20/JK1의 아미노산 서열(서열 번호 95)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(VK3-20/JK1/Ckappa로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vk3-20/JK1 사이에 47개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 25개는 VH-VL 계면에 존재한다;
4) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vk1-39/JK5의 아미노산 서열(서열 번호 93)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(VK1-39/JK5/Ckappa로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vk1-39/JK5 사이에 45개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 21개는 VH-VL 계면에 존재한다;
5) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vl3-21/Jl3의 아미노산 서열(서열 번호 96)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(VL3-21/JL3/Clambda로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vl3-21/Jl3 사이에 44개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 23개는 VH-VL 계면에 존재한다.
사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다. VH와 VL 사이의 상호작용부는 이탤릭체로 표시되어 있다.
도 21은 환원된(R) 조건 및 비-환원된(N) 조건 하에서의 SDS-PAGE 블롯을 나타낸다. 키메라 Fab는 1, 4, 및 6으로 표시되어 있으며; 인간 Fab는 10으로 표시되어 있다. C는 Fab의 존재에 대한 양성 대조군으로 작용하는 인간 Fab이다.
도 22는 인간 대조군 Fab 내의 VH의 아미노산 서열(서열 번호 98)을 제공한다.
도 23a는 환원된(R) 조건 및 비-환원된(N) 조건 하에서의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 정제된 키메라 Fab를 레인 3 및 4에 로딩하고, 비-정제된 키메라 Fab를 레인 7 및 8에 로딩한다. 정제된 인간 Fab를 레인 1 및 2에 로딩하고 비-정제된 인간 Fab를 레인 5 및 6에 로딩한다. Fab는 ProtL-HRP를 사용하여 식별된다.
도 23b는 환원된(R) 조건 및 비-환원된(N) 조건 하에서의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 정제된 키메라 Fab를 레인 3 및 4에 로딩하고, 비-정제된 키메라 Fab를 레인 7 및 8에 로딩한다. 정제된 인간 Fab를 레인 1 및 2에 로딩하고 비-정제된 인간 Fab를 레인 5 및 6에 로딩한다. Fab는 α-myc-HRP를 사용하여 식별된다.
도 24는 마우스 CXCR4의 야생형 아미노산 전장 서열을 제공한다.
도 25a 및 도 25b는 각각 마우스 CXCR4 양성 대조군 및 인간 CXCR4 양성 대조군을 나타낸다. 도 25c 내지 도 25e는 마우스 및 인간 CXCR4에 대한 3개의 상이한 닭 VH-인간 VL Fab의 결합에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸다.
도 26a는 마우스 및 인간 CXCR4에 결합하는 인간 VL과 페어링된 닭 VH를 포함하는 제1 키메라 Fab의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 100)을 제공한다.
도 26b는 마우스 및 인간 CXCR4에 결합하는 인간 VL과 페어링된 닭 VH를 포함하는 제2 키메라 Fab의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 101)을 제공한다.
도 26c는 마우스 및 인간 CXCR4에 결합하는 인간 VL과 페어링된 닭 VH를 포함하는 제3 키메라 Fab의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 102)을 제공한다.
도 27a는 PDB 5O4O의 인간 중쇄 가변 영역, 및 IgVK1-39/IGJK1 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 5 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27b는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVK3-15/IGJK1 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 26 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27c는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVK3-20/IGJK1 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 95 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27d는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVK1-39/IGJK5 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 93 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27e는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVL3-21/IGJl3 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 96 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 2는 닭 VH1 유전자 세그먼트 및 인간 VH1-02 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트(Kabat) 넘버링에 따른 CDR 잔기는 파선으로 나타나 있다.
도 3은 유일한 기능적 닭 JH 및 6개의 인간 JH 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 잔기는 파선으로 나타나 있다.
도 4는 닭 VH 영역과 인간 공통 경쇄 영역 사이의 계면 모델의 구조 분석을 제공한다.
도 4a는 중쇄 가변 영역(서열 번호 1) 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7)을 포함하는 Her3을 표적으로 하는 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공하고, 이를 MF3178의 인간 VH의 아미노산 서열이 닭 VH 영역의 상응하는 서열(서열 번호 2; PDB 4GLR)로 대체된 하이브리드 상동성 모델과 비교한다. 별표는 인간 Fab 계면에서의 아미노산들 사이의 상호작용이 키메라 Fab 내의 닭 VH 영역의 아미노산(서열 번호 2)과 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역의 아미노산(서열 번호 7) 사이의 상호작용과 동일하거나 동등한 경우를 나타낸다. 닭 VH 영역과 인간 공통 경쇄 가변 영역 사이의 24개의 정전기적 상호작용부는 인간 VH/인간 cLC 계면에서 20개의 상호작용부와 비교하여 관찰되며, 이때, 닭 VH/인간 cLC 계면 사이의 상호작용부 중 13개는 MF3178의 인간 VH/인간 cLC와 동등하거나 동일하다. 상부 표는 하이브리드 모델에 대한 VH 및 VL(닭 VH-인간 VL), 및 인간 Fab에 대한 VH 및 VL(인간 VH-인간 VL) 사이의 총 비결합 상호작용부(수소 결합, 염 다리(salt bridge) 및 소수성 상호작용부)를 나타낸다. 이는 동일한 상호작용부(정확히 동일한 잔기가 수반됨) 및 등가물(상이한 잔기를 갖는 동일한 위치)을 나열한다. 사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다.
도 4b) 좌: MF3178의 인간 VH/인간 cLC 계면의 3차 구조의 구조 정렬이 제공되고(PDB 5O4O; 연회색) 닭 VH 영역/인간 VL 계면의 하이브리드 상동성 모델(암회색)에 중첩되어 높은 수준의 구조적 유사성을 입증한다. VH 영역 및 VL로부터의 잔기들 사이의 비결합 상호작용부는 파선으로 나타나 있다(MF3178에 대해 흑색, 상동성 모델에 대해 회색).
도 4b) 우: 상동성 모델에서 Thr110과 Gln12 사이에 형성된 수소 결합의 묘사가 제공되어 MF3178(PDB 5O4O; 연회색)의 인간 VH/인간 cLC 계면의 3차 구조를 비교하고, 닭 VH 영역/인간 cLC 계면의 하이브리드 상동성 모델(암회색)에 중첩된다. 닭 Fab(PDB 4GLR)의 VH의 모델은 I110T 위치 변화를 반영하도록 변형되며, 이는 핵산 수준에서 BstEII 클로닝 부위의 도입을 반영하도록 행해진다. I110T 위치 변화의 도입은 반대 베타 가닥 상에서 Gln12와 형성된 수소 결합을 보존한다.
도 4c) 연회색의 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O) 및 암회색의 닭 Fab(PDB 4GLR)의 VL-VH 영역의 구조 정렬이 제공되며, MF3178의 인간 VH/VL과 키메라 닭 VH(서열 번호 2) 및 Vk1-39 cLC의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7) 계면 사이의 유사한 형태 상호작용을 입증한다.
도 5는 얼라인X를 통해 얻어진 7개의 VH 패밀리 각각을 나타내는 47개의 인간 생식세포계열 VH 유전자 세그먼트와 하나의 추정 기능적 타조 VH 유전자 세그먼트(XP_009669322.1 - 서열 번호 13)에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 각각의 인간 VH 유전자 세그먼트에 대한 동일성 백분율이 괄호 사이에 주어져 있다. 얼라인X는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 구성요소이고, 정렬은 디폴트 설정을 사용하여 얻어진다.
도 6은 타조 VH 유전자 세그먼트(XP_009669322.1 - 서열 번호 13) 및 인간 VH3-23 및 인간 VH3-74 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 잔기는 밑줄이 그어져 있다.
도 7a는 중쇄 가변 영역(서열 번호 1) 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7)을 포함하는 Her3을 표적으로 하는 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공하고, 이를 Mf3178의 인간 VH 영역의 아미노산 서열이 타조 VH 영역의 상응하는 서열(서열 번호 4)로 대체된 하이브리드 상동성 모델과 비교한다. 별표는 MF3178 계면에서의 아미노산들 사이의 상호작용이 타조 VH 영역의 아미노산(서열 번호 4)과 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역의 아미노산(서열 번호 7) 사이의 상호작용과 동일하거나 동등한 경우를 나타낸다. 타조 VH 영역과 인간 공통 경쇄 영역 사이의 14개의 정전기적 상호작용부는 인간 VH/인간 cLC 계면에서 20개의 상호작용부와 비교하여 관찰되며, 이때, 타조 VH/인간 cLC 계면 사이의 상호작용부 중 8개는 MF3178의 인간 VH/인간 cLC와 동등하거나 동일하다. 상부 표는 하이브리드 모델에 대한 VH 및 VL(닭 VH-인간 VL), 및 인간 Fab에 대한 VH 및 VL(인간 VH-인간 VL) 사이의 총 비결합 상호작용부(수소 결합, 염 다리 및 소수성 상호작용부)를 나타낸다. 이는 동일한 상호작용부(정확히 동일한 잔기가 수반됨) 및 등가물(상이한 잔기를 갖는 동일한 위치)을 나열한다. 사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다.
도 7b는 타조 중쇄 가변 영역, 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 5 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 키메라 결합 도메인을 나타낸다.
도 7c는 타조 중쇄 가변 영역, 인간 공통 경쇄 영역 계면에서의 정전기적 상호작용부를 나타내고, 도 7a에 제시된 상호작용부의 그래픽 표현을 보여준다.
도 8은 얼라인X를 통해 얻어진 7개의 VH 패밀리 각각을 나타내는 47개의 인간 생식세포계열 VH 유전자 세그먼트와 하나의 추정 기능적 오리 VH 유전자 세그먼트(XP_021132877.1 - 서열 번호 12)에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 각각의 인간 VH 유전자 세그먼트에 대한 동일성 백분율이 괄호 사이에 주어져 있다. 얼라인X는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 구성요소이고, 정렬은 디폴트 설정을 사용하여 얻어진다.
도 9는 오리 VH 유전자 세그먼트(XP_021132877.1 - 서열 번호 12) 및 인간 VH4-59, VH4-61, VH4-39 및 VH4-31 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. 카바트 넘버링에 따른 CDR 잔기는 밑줄이 그어져 있다.
도 10a는 중쇄 가변 영역(서열 번호 1) 및 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역(서열 번호 7)을 포함하는 Her3을 표적으로 하는 인간 Fab MF3178(PDB 5O4O)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공하고, 이를 MF3178의 인간 VH 영역의 아미노산 서열이 오리 VH 영역의 상응하는 서열(서열 번호 3)로 대체된 하이브리드 상동성 모델과 비교한다. 별표는 MF3178 계면에서의 아미노산들 사이의 상호작용이 오리 VH의 아미노산(서열 번호 3)과 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄의 경쇄 가변 영역의 아미노산(서열 번호 7) 사이의 상호작용과 동일하거나 동등한 경우를 나타낸다. 오리 VH 영역과 인간 공통 경쇄 영역 사이의 28개의 정전기적 상호작용부는 인간 VH/인간 cLC 계면에서 20개의 상호작용부와 비교하여 관찰되며, 이때, 오리 VH/인간 cLC 계면 사이의 상호작용부 중 13개는 MF3178의 인간 VH/인간 cLC와 동등하거나 동일하다. 상부 표는 하이브리드 모델에 대한 VH 및 VL(오리 VH-인간 VL), 및 인간 Fab에 대한 VH 및 VL(인간 VH-인간 VL) 사이의 총 비결합 상호작용부(수소 결합, 염 다리 및 소수성 상호작용부)를 나타낸다. 이는 동일한 상호작용부(정확히 동일한 잔기가 수반됨) 및 등가물(상이한 잔기를 갖는 동일한 위치)을 나열한다. 사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다.
도 10b는 오리 중쇄 가변 영역, 및 가변 영역 IgVK1-39*01/IGJK1*01(서열 번호 5)을 포함하는 인간 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 혼합 결합 도메인을 나타낸다.
도 10c는 오리 중쇄 가변 영역, 인간 공통 경쇄 가변 영역 계면에서의 정전기적 상호작용부를 나타내고, 도 10a에 제시된 상호작용부의 그래픽 표현을 보여준다.
도 11은 단일 기능적 닭 VH 유전자 세그먼트(NCBI 등록 번호 M30319)를 포함하는 게놈 DNA 서열을 나타낸다. VH 리더를 인코딩하는 DNA는 연회색으로 강조되어 있고; 성숙 VH를 인코딩하는 DNA는 암회색으로 강조되어 있다. 성숙 서열은 VH 유전자 세그먼트의 아미노산 서열에서 리더 서열을 뺀 것이다. 강조된 영역의 상류 및 하류의 서열은 유전자간 서열을 나타낸다.
도 12는 기능적 닭 JH 유전자 세그먼트(NCBI 등록 번호 M30320)를 포함하는 게놈 DNA 서열을 나타낸다. JH를 인코딩하는 DNA는 밑줄이 그어져 있다. JH 세그먼트의 DNA는 시작과 끝에 부분 코돈을 포함하므로 아미노산 번역보다 더 크다는 것에 유의한다.
도 13은 cDNA로부터 이러한 VH 유전자를 증폭시키는 데 사용되는 정방향 프라이머 chVH-FW의 주석 달린 서열을 나타낸다. 성숙 VH의 시작을 인코딩하는 DNA는 회색으로 강조되어 있다.
도 14는 정방향 프라이머 chVH-FW(서열 번호 15), 기능적 닭 VH의 일부, 및 벡터 MV1511의 일부의 DNA 정렬을 나타낸다. SfiI 클로닝 부위가 표시되어 있다. 성숙 VH의 첫 번째 코돈은 밑줄이 그어져 있다.
도 15는 cDNA로부터 이러한 VH 유전자를 증폭시키는 데 사용되는 역방향 프라이머 chVH-RV(서열 번호 16)의 주석 달린 역보체 서열을 나타낸다. JH의 말단을 인코딩하는 DNA(사실상 전체 프라이머 서열)는 연회색으로 강조되어 있다. 닭 JH 유전자 세그먼트로부터 벗어난 돌연변이는 밑줄이 그어져 있다.
도 16은 역방향 프라이머 chVH-RV의 역보체(rc), 기능적 닭 JH의 일부, 및 벡터 MV1511의 일부의 DNA 정렬을 나타낸다. BstEII 클로닝 부위가 표시되어 있다.
도 17a: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk1의 아미노산 서열(서열 번호 5).
도 17b: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk1의 공통 경쇄 가변 도메인 DNA 서열(서열 번호 6) 및 아미노산 서열(서열 번호 7).
도 17c: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk1의 경쇄 불변 영역 DNA 서열(서열번호 8) 및 아미노산 서열(서열번호 9).
도 17d: 인간 공통 경쇄 가변 도메인 IGKV1-39/jk5의 아미노산 서열(서열 번호 10).
도 17e: IGKV1-39의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 11).
도 18은 파지 디스플레이 벡터 MV1511의 개략도를 나타낸다.
도 19a: 인간 공통 경쇄 IGKV3-15/jk1의 아미노산 서열(서열 번호 87).
도 19b: 인간 공통 경쇄 IGKV3-20/jk1의 아미노산 서열(서열 번호 88).
도 19c: 인간 공통 경쇄 IGLV3-21/jl3의 아미노산 서열(서열 번호 89).
도 19d: IGKV3-15의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 90).
도 19e: IGKV3-20의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 91).
도 19f: 4GLR의 닭 가변 중쇄 영역 및 인간 CH1 영역의 아미노산 서열(서열 번호 92).
도 19g: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk5 및 카파 불변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 93).
도 19h: 인간 공통 경쇄 IGKV3-15/jk1 및 카파 불변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 94).
도 19i: 인간 공통 경쇄 IGKV3-20/jk1 및 카파 불변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 95).
도 19j: 인간 공통 경쇄 IgVλ3-21/IGJλ3 및 람다 불변 영역의 아미노산 서열(서열번호 96).
도 19k: IGLV3-21의 V-영역의 아미노산 서열(서열 번호 97)
도 20은 Her3을 표적으로 하는 MF3178(PDB 5O4O; 서열번호 1) 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 인간 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄(서열 번호 5)를 포함하는 인간 Fab(인간 VH - 인간 VL로 표시된 칼럼)에서의 비공유, 정전기적 상호작용의 분석을 제공한다. 인간 VH - 인간 CH1 및 인간 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄 사이에 35개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 24개는 VH-VL 계면에 존재한다. 이는 하기와 비교된다:
1) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 닭 VH 영역 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 동족 닭 VL 및 인간 카파 불변 영역을 포함하는 Fab의 상동성 모델(닭 VH - 닭 VL로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 닭 VL - 인간 카파 불변 영역 사이에 50개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 29개는 VH-VL 계면에 존재한다.
2) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vk3-15/JK1의 아미노산 서열(서열 번호 94)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(Vk3-15/JK1/Ckappa로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vk3-15/JK1 사이에 31개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 19개는 VH-VL 계면에 존재한다;
3) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vk3-20/JK1의 아미노산 서열(서열 번호 95)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(VK3-20/JK1/Ckappa로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vk3-20/JK1 사이에 47개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 25개는 VH-VL 계면에 존재한다;
4) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vk1-39/JK5의 아미노산 서열(서열 번호 93)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(VK1-39/JK5/Ckappa로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vk1-39/JK5 사이에 45개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 21개는 VH-VL 계면에 존재한다;
5) (닭 Fab PDB 4GLR로부터의) 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는 VH 영역, 및 인간 CH1 영역을 포함하는 중쇄, 및 공통 경쇄 Vl3-21/Jl3의 아미노산 서열(서열 번호 96)을 포함하는 경쇄를 포함하는 Fab의 하이브리드 상동성 모델(VL3-21/JL3/Clambda로 표시된 칼럼). 닭 VH - 인간 CH1 및 인간 공통 경쇄 Vl3-21/Jl3 사이에 44개의 정전기적 상호작용부가 관찰되며, 이 중 23개는 VH-VL 계면에 존재한다.
사슬 A는 경쇄이다. 사슬 B는 중쇄이다. 카바트 넘버링이 사용되었다. VH와 VL 사이의 상호작용부는 이탤릭체로 표시되어 있다.
도 21은 환원된(R) 조건 및 비-환원된(N) 조건 하에서의 SDS-PAGE 블롯을 나타낸다. 키메라 Fab는 1, 4, 및 6으로 표시되어 있으며; 인간 Fab는 10으로 표시되어 있다. C는 Fab의 존재에 대한 양성 대조군으로 작용하는 인간 Fab이다.
도 22는 인간 대조군 Fab 내의 VH의 아미노산 서열(서열 번호 98)을 제공한다.
도 23a는 환원된(R) 조건 및 비-환원된(N) 조건 하에서의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 정제된 키메라 Fab를 레인 3 및 4에 로딩하고, 비-정제된 키메라 Fab를 레인 7 및 8에 로딩한다. 정제된 인간 Fab를 레인 1 및 2에 로딩하고 비-정제된 인간 Fab를 레인 5 및 6에 로딩한다. Fab는 ProtL-HRP를 사용하여 식별된다.
도 23b는 환원된(R) 조건 및 비-환원된(N) 조건 하에서의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 정제된 키메라 Fab를 레인 3 및 4에 로딩하고, 비-정제된 키메라 Fab를 레인 7 및 8에 로딩한다. 정제된 인간 Fab를 레인 1 및 2에 로딩하고 비-정제된 인간 Fab를 레인 5 및 6에 로딩한다. Fab는 α-myc-HRP를 사용하여 식별된다.
도 24는 마우스 CXCR4의 야생형 아미노산 전장 서열을 제공한다.
도 25a 및 도 25b는 각각 마우스 CXCR4 양성 대조군 및 인간 CXCR4 양성 대조군을 나타낸다. 도 25c 내지 도 25e는 마우스 및 인간 CXCR4에 대한 3개의 상이한 닭 VH-인간 VL Fab의 결합에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸다.
도 26a는 마우스 및 인간 CXCR4에 결합하는 인간 VL과 페어링된 닭 VH를 포함하는 제1 키메라 Fab의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 100)을 제공한다.
도 26b는 마우스 및 인간 CXCR4에 결합하는 인간 VL과 페어링된 닭 VH를 포함하는 제2 키메라 Fab의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 101)을 제공한다.
도 26c는 마우스 및 인간 CXCR4에 결합하는 인간 VL과 페어링된 닭 VH를 포함하는 제3 키메라 Fab의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(서열 번호 102)을 제공한다.
도 27a는 PDB 5O4O의 인간 중쇄 가변 영역, 및 IgVK1-39/IGJK1 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 5 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27b는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVK3-15/IGJK1 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 26 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27c는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVK3-20/IGJK1 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 95 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27d는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVK1-39/IGJK5 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 93 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
도 27e는 PDB 4GLR의 닭 중쇄 가변 영역, 및 IgVL3-21/IGJl3 공통 경쇄의 가변 영역(서열 번호 96 - CL 영역을 포함하는 전장 공통 경쇄 서열)을 포함하는 공통 경쇄와 페어링된 인간 CH1로 구성된 결합 도메인을 나타낸다.
"항체"는 항원 상의 에피토프와 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유하는, 단백질의 면역글로불린 부류에 속하는 단백질성 분자이며, 여기서 그러한 도메인은 항체의 가변 영역으로부터 유래되거나 그와 서열 상동성을 공유한다.
항체 결합은 특이성 및 친화성을 포함하여 다양한 특성을 갖는다. 특이성은 어느 항원 또는 그의 에피토프가 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는지를 결정한다. 친화성은 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합의 강도에 대한 척도이다. 본 명세서에서, 항체의 '특이성'은 특정 항원에 대한 그의 선택성을 지칭하는 반면에, '친화성'은 항체의 항원 결합 부위와 이것이 결합하는 에피토프 간의 상호작용 강도를 지칭한다는 것에 주목하는 것이 편리하다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 "결합 특이성"은 항원결정기와 반응하는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체의 결합 부위는 Fab 부분에 위치하고, 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역으로 구성된다.
"친화성"은 단일 항원 결합 부위와 이의 항원 사이의 상호작용 강도이다. 항원에 대한 본 발명의 항체의 단일 항원-결합 부위는 해리 상수(Kd)로 나타낼 수 있다. 전형적으로, 치료적 응용을 위한 항체는 1x10-10 M까지 이르는 Kd의 친화성 또는 더 높은 친화성(즉, 더욱 더 낮은 Kd)을 가질 수 있다.
"항원"은 숙주 생물에서 (항체를 생성하기 위해) 면역반응을 유도할 수 있고/있거나 항체에 의해 표적화될 수 있는 분자이다. 분자 레벨에서, 항원은 항체의 항원 결합 부위에 의해 결합되는 그의 능력을 특징으로 한다. 또한, 항원의 혼합물은 '항원'으로 간주될 수 있는데, 즉, 당업자는 때때로 종양 세포 용해물 또는 바이러스 입자가 '항원'으로 표시될 수 있는 반면에, 이러한 종양 세포 용해물 또는 바이러스 입자 제제는 많은 항원결정기가 존재한다는 것을 인식할 것이다. 항원은 하나 이상의, 그러나 종종 더 많은 에피토프를 포함한다.
"에피토프" 또는 "항원결정기"는 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원 상의 부위이다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩(tertiary folding)에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다(각각, 직선상 및 입체구조 에피토프라고 함). 연속 선형 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시에 보유되는 반면, 3차 폴딩 입체구조에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간 입체구조 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산을 포함할 수 있다.
용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 용어 "중쇄 가변 도메인"은 달리 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 프레임 워크(FR) 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR 및 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인(N 말단에서 C 말단까지) 다음에, CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능적 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있고, 하나 이상의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.
용어 "경쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 또는 VL(또는 이의 기능적 단편); 및 면역글로불린 불변 도메인, 또는 CL(또는 이의 기능적 단편) 서열을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "경쇄"는 인간 카파, 람다 및 이들의 조합으로부터 선택되는 경쇄를 포함할 수 있다. 경쇄 가변(VL) 도메인은 달리 명시되지 않는 한, 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 N 말단에서 C 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 경쇄는 예를 들어, 중쇄에 의해 선택적으로 결합된 에피토프에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다.
본 발명의 항체에 사용하기에 적합한 경쇄는 기존 항체 라이브러리(습식 라이브러리 또는 인실리코(in silico))에서 가장 일반적으로 사용되는 경쇄를 스크리닝하여 확인될 수 있는 것과 같은 공통 경쇄(cLC)를 포함하며, 경쇄는 중쇄의 에피토프-결합 도메인의 친화성 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않지만, 다수의 중쇄와 페어링되는 데에도 적합하다. 예를 들어, 적합한 경쇄는 게놈에 통합된 공통 경쇄를 갖는 형질전환 동물, 예컨대 MeMo®로부터의 것을 포함하고, 이는 중쇄에 다양성을 갖고 상기 항원에 노출시 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 공통 경쇄 항체의 대형 패널을 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 용어 "공통 경쇄"는 동일할 수 있거나, 본 발명의 항체의 결합 특이성에 영향을 주지 않으면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있으며, 즉, 상기 차이가 기능적 결합 영역의 형성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 경쇄를 지칭한다.
예를 들어, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 공통 경쇄의 정의의 범위 내에서는, 예를 들어 보존적 아미노산 변화, 동족 사슬과 페어링할 때에 결합 특이성에 기여하지 않거나 단지 부분적으로 기여하는 영역 내에서의 아미노산의 변화 등을 도입 및 시험함으로써, 동일하지 않지만 여전히 기능적으로 등가인 가변 사슬을 제조하거나 찾아내는 것이 가능하다. 따라서, 이러한 변이체는 또한 다양한 동족 사슬에 결합하고, 기능적 항원 결합 도메인을 형성할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 용어 '공통 경쇄'는 동일할 수 있거나, 중쇄와 페어링한 후에 생성된 항체의 결합 특이성을 유지하면서 일부 아미노산 서열 차이를 가질 수 있는 경쇄를 지칭한다. 특정 공통 경쇄와 이러한 기능적으로 동등한 변이체의 조합은 용어 "공통 경쇄" 내에 포함된다. 공통 경쇄의 사용에 대한 상세한 설명을 위해 국제 특허 공개 WO2004/009618호 및 국제 특허 공개 WO2009/157771호를 참조한다.
"Fab"는 가변 영역을 포함하는 결합 도메인, 전형적으로 페어링된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인을 의미한다. Fab는 불변 경쇄 도메인(CL) 및 VL 도메인과 페어링된 CH1 및 VH 도메인을 포함하는 불변 영역 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 페어링은 예를 들어, CH1 및 CL 도메인에서의 다이설파이드 가교를 통한 공유결합으로서 일어날 수 있다.
"단쇄 가변 단편"(scFv)은 링커, 예를 들어 펩티드 링커, 예를 들어 약 10 내지 약 25개의 아미노산 길이의 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 결합 도메인을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "연결된"은 일차 아미노산 서열을 통해 서로 결합되는 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 베이스 항체 부분은 링커를 통해 추가의 결합 도메인(또는 추가의 결합 도메인에 대한 추가의 결합 도메인)에 연결될 수 있다. 유사하게, CH1 도메인은 가변 중쇄 영역에 연결될 수 있고, CL 도메인은 가변 경쇄 영역에 연결될 수 있다.
"페어링"은 다량체화할 수 있도록 하는 본 발명의 폴리펩티드들 사이의 상호작용을 지칭한다. 혼합 결합 도메인과 같은 항체 사슬 또는 폴리펩티드의 도메인은 공유 또는 비공유 상호작용, 예를 들어 반 데르 발스 힘(Van der Waals force), 수소 결합, 물-매개 수소 결합, 염 다리 또는 다른 정전기력, 방향족 측쇄들 사이의 인력 상호작용, 이황화 결합의 형성, 또는 당업자에게 공지된 다른 힘을 통해 상호작용하고 페어링되어 계면을 형성할 수 있다.
본 명세서에서 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 언급될 때 "퍼센트(%) 동일성"은 최적의 비교 목적을 위하여 선택된 서열과 후보 서열을 정렬시킨 후, 선택된 서열 내의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 잔기의 백분율로서 정의된다. 핵산 서열을 비교하는 서열 동일성 백분율은 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 프로그램 어드밴스 10.5.2(Vector NTI Program Advance 10.5.2) 소프트웨어의 얼라인X 응용 프로그램을 사용하여 결정되고, 디폴트 설정은 변형된 클러스탈W(ClustalW) 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680]), swgapdnarnt 스코어 매트릭스, 15의 갭 개방 패널티(gap opening penalty) 및 6.66의 갭 연장 패널티(gap extension penalty)를 사용한다. 아미노산 서열은 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 프로그램 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 얼라인X 응용 프로그램을 사용하여 정렬되고, 디폴트 설정은 변형된 클러스탈W 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994]), blosum62mt2 스코어 매트릭스, 10의 갭 개방 패널티 및 0.1의 갭 연장 패널티를 사용한다.
"복수"는 2개 이상을 의미한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 "변이체"는 항체의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 포함할 수 있다. 이는 항체 모방체, 모노바디 및 압타머를 포함한다.
변이체는 전형적으로 항체의 결합 특이성, 예를 들어 이중특이성 항체의 특이성을 유지한다. 변이체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 도메인, 다량체 또는 항체의 기능적 부분 또는 유도체일 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 결합 도메인, 다량체 또는 항체의 기능적 부분은 이러한 결합 도메인, 다량체 또는 항체와 동일한 표적에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 부분이다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 항체의 기능적 유도체는 하나의 표적에 결합하는 가변 도메인 및 연결 영역에 의해 연결된 제2 표적에 결합하는 가변 도메인을 포함하는 단백질이다. 가변 도메인은 그 자체로서의 가변 도메인일 수 있거나, 또는 Fab 단편 또는 링커를 통해 함께 연결된 VH 및 VL을 포함하는 단일쇄 Fv(scFv) 단편과 같은 가변 도메인 유사 분자일 수 있다. 가변 도메인 유사 분자의 다른 예는 이른바 단일 도메인 항체 단편이다. 단일-도메인 항체 단편(sdAb)은 단일 단량체 가변 항체 영역을 갖는 항체 단편이다. 전 항체(whole antibody)와 마찬가지로, 특이적 항원에 선택적으로 결합할 수 있다. 분자량이 단지 12 내지 15 kDa인 단일-도메인 항체 단편은 2개의 단백질 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 공통 항체(150 내지 160 kDa)보다 훨씬 더 작고, 심지어는 Fab 단편(약 50 kDa, 하나는 경쇄이고 절반은 중쇄임) 및 단일쇄 가변 단편(약 25 kDa, 2개의 가변 영역, 하나는 경쇄로부터 유래되고 하나는 중쇄로부터 유래됨)보다 더 작다. 단일-도메인 항체 그 자체는 정상 항체(전형적으로 90 내지 100 kDa임)보다 그다지 작지 않다. 단일-도메인 항체 단편은 대부분 카멜리드(camelid)에서 발견되는 중쇄 항체로부터 조작되며; 이들은 VHH 단편(나노바디즈(Nanobodies)®)으로 불린다. 일부 어류는 또한 중쇄로만 이루어진 항체(IgNAR, '면역글로불린 새로운 항원 수용체')를 가지며, 그로부터 VNAR 단편이라 불리는 단일-도메인 항체 단편이 얻어질 수 있다. 대안적인 접근법은 인간 또는 마우스 유래 공통 면역글로불린 G(IgG)로부터의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할하는 것이다. 단일-도메인 항체에 대한 대부분의 연구는 현재 중쇄 가변 도메인에 기반하고 있지만, 경쇄로부터 유래된 나노바디가 또한 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 가변 도메인-유사 분자의 다른 비제한적인 예는 VHH, 인간 도메인 항체(Human Domain Antibody; dAb) 및 유니바디(Unibody)이다. 바람직한 기능적 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 부분이다. 그러한 가변 도메인의 비제한적인 예는 F(ab)-단편 및 단일쇄 Fv 단편이다. 가변 도메인(-유사) 연결에 대한 이중특이성 포맷은, 예를 들어 2개의 상이한 scFv에 결합된 인간 혈청 알부민(HSA); 이량체화 모티프(dimerization motif) 또는 자기-회합성(self-associating) 2차 구조, 예컨대 나선 번들(helix bundle) 또는 코일드 코일을 통해 함께 결합되어 scFv 단편들의 이량체화를 가져오는 2개의 상이한 scFv를 포함하는 이중특이성 미니-항체이다(문헌[Morrison(2007)Nat. Biotechnol. 25:1233-34]). 적합한 HSA 링커 및 그러한 링커에 scFv를 결합시키는 방법의 예가 국제 특허 출원 공개 WO2009/126920호에 기재되어 있다.
기능적 유도체는 항체 모방체, 폴리펩티드, 압타머 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 단백질 또는 압타머는 전형적으로 하나의 표적에 결합한다. 본 발명의 단백질은 2개 이상의 표적에 결합한다. 이러한 항체, 항체 모방체, 폴리펩티드 및 압타머의 임의의 조합이 당업계에 알려진 방법에 의해 함께 연관될 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 본 발명의 결한 분자는 접합체 또는 융합 단백질이다.
항체 모방체는, 항체와 마찬가지로, 항원과 특이적으로 결합할 수 있지만 항체와 구조적으로 관련 없는 폴리펩티드이다. 항체 모방체는 통상, 몰질량이 약 3 내지 20 kDa인 인공 펩티드 또는 단백질이다. 항체에 비하여 일반적인 이점은 더 우수한 용해성, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성, 및 비교적 낮은 제조 단가이다. 항체 모방체의 비제한적인 예는 애피바디(affibody) 분자(전형적으로, 단백질 A의 Z 도메인을 기반으로 함); 애필린(affilin)(전형적으로, 감마-B 결정질 또는 유비퀴틴을 기반으로 함); 애피머(affimer)(전형적으로, 시스타틴을 기반으로 함); 애피틴(affitin)(전형적으로, 설폴로부스 아시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius) 유래 Sac7d를 기반으로 함); 알파바디(alphabody)(전형적으로, 삼중 나선 코일드 코일(Triple helix coiled coil)을 기반으로 함); 안티칼린(anticalin)(전형적으로, 리포칼린을 기반으로 함); 아비머(avimer)(전형적으로, 다양한 막 수용체의 A 도메인을 기반으로 함); DARPin(전형적으로, 안키린 반복 모티프(ankyrin repeat motif)를 기반으로 함); 피노머(fynomer)(전형적으로, Fyn 7의 SH3 도메인을 기반으로 함); 쿠니츠(kunitz) 도메인 펩티드(전형적으로, 다양한 프로테아제 억제제의 쿠니츠 도메인을 기반으로 함); 및 모노바디(monobody)(전형적으로, 피브로넥틴의 III형 도메인을 기반으로 함)이다.
모노바디는 분자 스캐폴드로서 피브로넥틴 III형 도메인(FN3)을 사용하여 구성되는 합성 결합 단백질이다. 모노바디는 표적-결합 단백질을 생성하기 위한 항체에 대한 간단하고 확실한 대체물이다. 용어 "모노바디"는 인간 피브로넥틴의 10번째 FN3 도메인을 사용하여 모노바디 개념을 보여준 최초의 논문을 발표한 Koide 그룹에 의해 1998년에 만들어졌다.
모노바디 및 다른 항체 모방체는 전형적으로 조합 라이브러리(combinatorial library)로부터 생성되는데, 조합 라이브러리에서는 스캐폴드의 일부분들이 분자 디스플레이 및 지향 진화(directed evolution) 기술, 예컨대 파지 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 효모 표면 디스플레이를 사용하여 다양화된다. 다수의 항체 모방체는 그들 각각의 표적에 대해 높은 친화성 및 높은 특이성을 갖는다.
압타머는 특이적 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 압타머는 통상, 대형 랜덤 서열 풀(sequence pool)로부터 그것을 선택함으로써 생성되지만, 천연 압타머가 또한 리보스위치(riboswitch) 내에 존재한다. 압타머는 거대분자로서 기초 연구 및 임상 목적 둘 모두에 사용될 수 있다.
"비결합" 상호작용"은 공유 결합에 의해 연결되지 않는 원자들 사이에서 작용한다. 따라서, 이들은 전자의 공유를 수반하지 않고 오히려 분자 간 또는 분자 내의 전자기 상호작용의 더 분산된 변화를 포함하는 결합이다. 비결합 상호작용은 수소 결합, 이온 상호작용 및 할로겐 결합과 같은 정전기적 상호작용을 포함한다. 반 데르 발스 힘은 영구 또는 유도 쌍극자(또는 다중극)를 수반하는 정전기적 상호작용의 서브세트이다. 이들은 하기를 포함한다: 영구 쌍극자-쌍극자 상호작용, 쌍극자-유도 쌍극자 상호작용 및 유도 쌍극자-유도 쌍극자 상호작용. 염 다리는 2가지 비공유 상호작용, 즉 수소 결합과 이온 결합의 조합이다. 소수성 상호작용은 더 강한 물-물 상호작용으로 인해 함께 가압되는 비극성(이온화 불가능) 탄화수소 분자의 상호작용부이다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다(comprise)", "포함하다(include)" 및 "갖는" 및 변형체, 예컨대 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)" 및 "포함하는(including)"은 포괄적으로 해석되어야 한다. 즉, 이러한 단어는 문맥상 허용되는 경우, 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소 또는 정수의 포함 가능성을 전달하고자 한다.
관사("a" 및 "an")는 본 명세에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상(즉, 하나 또는 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미할 수 있다.
가변 영역, 결합 도메인, 다량체 및 항체
본 발명은 결합 도메인 및 결합 도메인을 포함하는 항체와 같은 다량체 또는 이의 임의의 변이체에 관한 것이다. 전형적으로, 본 발명의 결합 도메인은 인간에 대해 계통 발생적으로 원위에 있는 유기체, 예를 들어 조류, 바람직하게는 닭, 오리 또는 타조의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 전형적으로 인간 가변 영역과 페어링된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 본 발명의 결합 도메인은 키메라 또는 인간화된 또는 혼합 결합 도메인일 수 있다.
전형적으로, 가변 영역은 조류, 바람직하게는 닭, 오리 또는 타조의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되고, 인코딩된 가변 영역은 경쇄 가변 영역인 인간 가변 영역과 안정적으로 페어링될 수 있는 중쇄 가변 영역이다. 대안적으로, 조류, 바람직하게는 닭의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역은 중쇄 가변 영역일 수 있는 인간 가변 영역과 페어링될 수 있는 경쇄 가변 영역일 수 있다.
핵산과 관련하여, "~에 기초하여"는, 특정 코돈이 기반이 되는 핵산 서열 또는 공급원과 일치하는지에 관계없이, 핵산 서열이 기반이 되는 핵산과 동일한 아미노산을 인코딩하며, 이는 동일한 잔기를 인코딩하는 대체 코돈을 제공하는 유전 코드의 중복성을 설명한다. "~로부터 유래된"은 핵산이 관심 유기체의 핵산으로부터 클로닝되거나, 그 공급원의 서열 정보와 일치하도록 합성적으로 생성될 수 있음을 의미한다.
결합 도메인은 가변 영역, Fv 도메인, Fab 도메인, 변형된 Fab 도메인 또는 scFv 또는 이의 임의의 기능적 단편을 포함할 수 있다.
조류
본 명세서에 기술된 발명의 결합 도메인은 닭, 칠면조, 뇌조(grouse), 신대륙 메추라기, 구대륙 메추라기, 들꿩(ptarmigan), 자고새(partridge), 꿩, 멧닭(junglefowl), 봉관조과의 새, 거위, 백조, 오리 또는 타조와 같은 닭목(Galliform)을 포함하는 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 면역글로불린 가변 영역, 또는 이의 일부를 포함한다.
본 명세서에 기술된 발명의 결합 도메인은 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역, 바람직하게는 중쇄 가변 영역을 포함하며, 이러한 가변 영역은 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 것과 같이 인간 VH 및 VL 계면 사이에 존재하는 것과 실질적으로 동일한 수의 비결합 정전기적 상호작용부를 포함하며(도 4a 참조), 바람직하게는 이러한 상호작용부를 더 많이 포함한다.
바람직하게는, 본 명세서에 기술된 발명의 결합 도메인은 인간 사슬, 바람직하게는 인간 VL과 페어링된, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역, 바람직하게는 중쇄 가변 영역을 포함하는 혼합 결합 도메인이고, VH/VL 계면은 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 동일한 위치에서 발견되는 인간 VH 및 공통 VL과 비교하여 상동적이고, 바람직하게는 동일한 VH/VL 계면에서 적어도 5개, 바람직하게는 10개 이상의 상호작용부를 갖는다.
본 명세서에 기술된 발명의 결합 도메인은 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되고 인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함한다.
본 명세서에 기술된 발명의 결합 도메인은 인간 경쇄 영역과 계면을 형성하는, 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 VH 영역을 포함할 수 있고, 상기 결합 도메인의 VH/VL 계면은 인간 VH 영역/인간 VL 영역 결합 도메인 계면의 정전기적 접촉점과 동일하거나 동등한 VH 영역 및 인간 VL 영역 사이의 적어도 4개, 바람직하게는 5개, 바람직하게는 8개, 및 더욱 바람직하게는 10개의 정전기적 접촉점을 포함하며, 바람직하게는 상기 인간 VL은 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄(서열 번호 : 7)의 것; IgVK1-39/IGJK5 공통 경쇄(서열 번호 10)의 것; IgVK3-15/IGJK1 공통 경쇄(서열 번호 87)의 것; IgVK3-20/IGJK1 공통 경쇄(서열 번호 88)의 것; 또는 IgVλ3-21/IGJλ3 공통 경쇄(서열 번호 89)의 것이고, 가장 바람직하게는 인간 VL은 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄(서열 번호 7)의 것이고, 바람직하게는 비교(comparator) 인간 결합 도메인은 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab이다.
대안적으로, 본 명세서에 기술된 발명의 결합 도메인은, 인간 경쇄 영역과 계면을 형성하는, 조류의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 VH 영역을 포함하고, 상기 결합 도메인의 VH/VL 계면은 VH 영역 및 인간 VL 영역 사이에 적어도 14개 및 더욱 바람직하게는 24개의 정전기적 접촉점, 및 더욱 바람직하게는 28개의 정전기적 접촉점을 포함하고, 바람직하게는 상기 인간 VL은 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄(서열 번호 7)의 것; IgVK1-39/IGJK5 공통 경쇄(서열 번호 10)의 것; IgVK3-15/IGJK1 공통 경쇄(서열 번호 87)의 것; IgVK3-20/IGJK1 공통 경쇄(서열 번호 88)의 것; 또는 IgVλ3-21/IGJλ3 공통 경쇄(서열 번호 89)의 것이고, 가장 바람직하게는 인간 VL은 IgVK1-39*01/IGJK1*01 공통 경쇄(서열 번호 7)의 것이다.
본 명세서에 개시된 발명에 따르면, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함하는 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체, 또는 그의 변이체가 있으며, 인간 가변 영역과 페어링될 때 이러한 가변 영역은, 바람직하게는 VH, VL 계면에서 인간 VL 가변 영역, 바람직하게는 IgVK1-39*01/IGJK1*01 경쇄, IgVK1-39/IGJK5 경쇄, IgVK3-15/IGJK1 경쇄, IgVK3-20/IGJK1 경쇄, 또는 IgVλ3-21/IGJλ3 공통 경쇄, 가장 바람직하게는 IgVK1-39*01/IGJK1*01 또는 IgVK1-39*01/IGJK1*05 경쇄와의 4개, 바람직하게는 5개, 바람직하게는 8개 및 더욱 바람직하게는 10개의 정전기적 상호작용부를 포함하는, 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab에서와 같이, 인간 VH 및 인간 VL 계면의 경우에 존재하는 것과 실질적으로 동일한 정전기적 접촉점을 가변 영역 계면에 포함하며, 이러한 동물은 닭, 타조 또는 오리이다.
본 발명의 결합 도메인, 다량체 또는 항체의 불변 영역은 전형적으로 인간 불변 영역(예를 들어, CH1, CH2, CH3 및 CL)이지만, 설치류의 불변 영역 또는 다른 키메라의 불변 영역 또는 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역과 동일한 유기체 또는 공급원으로부터의 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체, 또는 변이체는 B-세포 발달을 통한 것 및/또는 이러한 동물의 항원 노출에 반응하는 것을 포함하는 V(D)J 재조합을 겪은 조류 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 가변 영역이 인코딩되는 것일 수 있다. 상기 결합 도메인은 상기 가변 영역이 인간 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 공통 경쇄, 더욱 바람직하게는 IgVK1-39*01/IGJK1*01 경쇄(서열 번호 5), IgVK1-39/IGJK5 경쇄(서열 번호 93), IgVK3-15/IGJK1 경쇄(서열 번호 94), IgVK3-20/IGJK1 경쇄(서열 번호 95), 또는 IgVλ3-21/IGJλ3 공통 경쇄(서열 번호 96), 가장 바람직하게는 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 공통 경쇄(서열 번호 5)와 페어링된 중쇄 가변 영역인 것일 수 있다.
본 발명의 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체, 또는 그의 변이체는 이러한 동물의 항원 노출에 반응하는 것을 포함하는 V(D)J 재조합을 겪은 조류 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 가변 영역이 인코딩되는 것일 수 있다. 상기 결합 도메인은 상기 가변 영역이 인간 중쇄 가변 영역, 바람직하게는 공통 중쇄와 페어링된 경쇄 가변 영역인 것일 수 있다.
본 발명의 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체, 또는 그의 변이체는 가변 영역이 인간화 되어, CDR이 B-세포 발달을 통한 것 및/또는 이러한 동물의 항원 노출에 반응하는 것을 포함하는 V(D)J 재조합을 겪은 조류 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 다량체는 본 명세서에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 결합 도메인을 포함한다. 본 발명에 따른 다량체는 1가, 2가 또는 다가 다량체 또는 항체일 수 있다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 2가 또는 다가 항체 또는 다량체는 1개, 2개 또는 바람직하게는 2개 초과의 표적에 결합할 수 있으며, 여기서 표적은 항원 또는 주어진 항원의 에피토프일 수 있다.
동물의 면역화
본 발명의 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체, 또는 그의 변이체는 관심 항원 또는 에피토프로 면역화된, 인간에 대해 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 예를 들어 조류의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함한다. 이와 같이, 가변 영역은 상기 항원 또는 에피토프에 대한 특이성을 갖는다.
조류, 예를 들어 닭, 오리 또는 타조를 포함하는 다양한 동물을 면역화하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 적합한 면역화 프로토콜은 전형적으로 B 세포의 선택적 확장을 유발하는 것이며, 이는 1차 및 부스터 면역화가 관심 항원 또는 에피토프에 결합하는 항체를 생성하는 B 세포의 선택적 확장을 유발하도록 설계됨을 의미한다. 면역화 프로토콜은 예를 들어 1차 면역화 및 각각의 후속 부스터 면역화 동안 항원의 상이한 형태 또는 단편을 사용할 수 있다. 예를 들어, 항원은 세포막, 재조합 단백질, 다른 단백질에 융합된 재조합 단백질, 단백질의 도메인 또는 단백질의 펩티드 상에서 발현될 수 있다. 면역화 프로토콜은 1차 및/또는 부스터 면역화 동안 보조제의 사용을 포함할 수 있다.
보조제는 1차 면역화 동안 방관자 B 세포의 비특이적 확장의 정도를 제한하기 위해서만 사용될 수 있다. 방관자 B 세포는 B 세포의 표면 상에 발현되는 항체 수용체에 항원이 결합하는 단계 없이 활성화되는 세포이다. 예를 들어 Fc-융합 단백질을 사용한 면역화는 종종 모든 B 세포의 최대 약 70%가 관심 항원보다는 융합 단백질의 Fc 부분에 반응하는 강력한 항-Fc 반응을 초래한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 면역화 프로토콜은 면역화에 사용되는 항원에 의해 활성화된 B 세포를 우선적으로 확장시키기 위해 보조제 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 결합 도메인에 사용하기에 적합한 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 임의의 적합한 조직, 예를 들어 알로부터, 림프 조직으로부터 또는 골수로부터(즉, B 세포를 생성하는 조직으로부터) 회수될 수 있다.
따라서, 본 발명의 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 생성하는 방법은 적어도 항체의 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 예를 들어, B 세포의 집단, 또는 조류로부터 얻은 알 또는 혈청으로부터 단리하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 조류는 관심 항원 또는 에피토프와 반응하는 B 세포의 선택적 클론 확장이 우선적으로 유도되도록 항원으로 면역화된 것이다. 적합한 동물, 예컨대 조류는 단백질 형태 또는 핵산 서열 형태의 항원으로 면역화될 수 있으며, 핵산 서열은 조류가 상기 핵산 서열로 면역화될 때 항원을 발현할 수 있다.
조류는, 예를 들어, 근육내 백신접종에 의해 또는 유전자-총(Gene-Gun) 플라스미드-면역화에 의해, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 수단에 의해 면역화될 수 있다. B 세포의 선택적 클론 확장을 유도하는 바람직한 방법은 DNA 문신 백신접종(tattoo vaccination)이다. 용어 "DNA 문신 백신접종"은 피부에 반복적으로 구멍을 뚫는, 플라스미드 DNA가 로딩된 고체 진동 바늘을 수반하여, 표피와 상피 둘 모두에 상처를 내고 피부 염증을 일으킨 후 치유하는 침습적 절차를 지칭한다(문헌[Bins et aI., Nat Med 11:899-904, 2005]; 문헌[Pokorna et al., Genet. Vaccines Ther. 6: 4, 2008]). 상기 DNA는 조류에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있고, 유전자 침묵을 방지하도록 설계된 서열을 포함할 수 있다.
닭에 대한 면역화 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Schade et al., ATLA Altern. Lab. Anim. 24 (1996) 925-934]을 참조한다. 또한 http://gallusimmunotech.com/igy-polyclonal-antibodies-immunization-protocol 및 https://Www.thermofisher.com/nl/en/home/life-science/antibodies/custom-antibodies/custom-antibody-production/custom-polyclonal-antibody-production/custom-chicken-polyclonal-antibody-production-protocols.html을 참조한다. 닭 면역화를 수행하는 상업적으로 이용가능한 회사에는 예를 들어, 애브스 랩스 인크.(Aves Labs Inc.), 데이비드 바이오(Davids Bio), 크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs), 랩파이어 바이오로지컬 래보래토리즈(Lampire Biological Laboraties), 인테그랄 몰레큘라(Integral Molecular), 알데브론(Aldevron), 이노바젠(Innovagen) 및 카프라로직스(Capralogics)가 포함된다.
또한, 오리 및 타조가 유사하게 면역화될 수 있다. 간단히 말해서, 항원과 프로인트(Freund's) 완전 보조제를 함유하는 혼합물을 오리 및 타조에 피하 또는 근육내 주사할 수 있다. 이어서, 항원과 프로인트 불완전 보조제의 혼합물을 사용하여 부스터 샷을 투여할 수 있다.
첫 번째 오리 면역화 1주 후, 오리알을 수집하기 시작하고 4℃에서 보관할 수 있다. 부스터 샷을 4주마다 반복할 수 있고, 각 부스터 주사 7일 후에 혈청을 분석할 수 있다. 후속 절차는 난황으로부터 IgY의 물 추출에 대한 짧은 프로토콜을 수반하며, 이어서 탈지, 염석, 탈염 및 농축이 이어진다. 항체 용액의 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정될 수 있다.
첫 번째 타조 면역화 1주 후, 경정맥으로부터 얻은 혈액 샘플로부터 혈청 항체 수준을 측정할 수 있다. 부스터는 격주로 투여될 수 있다. 4주차에, 아가로스 겔에서의 침전 반응에 의해 난황 항체 수준을 측정할 수 있다. 오리의 면역화 및 항체 단리는, 예를 들어 미국 특허 제6680376 B2호 및 호주 특허 제784900호 및 문헌[Chiou et al., Clinical Toxicology. 2008, 46: 539-544]에 기재되어 있고, 타조의 면역화 및 단리는, 예를 들어 문헌[Adachi et al., Exp Ther Med. 2011, 2:41-45] 및 국제 특허 공개 WO2007026689호에 기재되어 있다.
대표적인 면역화 프로토콜은 면역화를 위해 적어도 하나의 알(egg) 또는 혈청을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 이들 알로부터 회수된 IgY는 대조군으로서 사용될 수 있다. 0일차에, 예를 들어 0.02 내지 0.5 mg의 항원을 (예를 들어, 프로인트 완전 보조제 스페콜(Freund's complete adjuvant Specol), 리포펩티드(Pa㎥-Cys-Ser-[Lys]4), 예를 들어 250 ㎍의 양과 함께) 다수의 부위에서 닭의 흉부 조직 내로 피하 및/또는 근육 내 주사한다. 항원/보조제의 총 부피는 약 1 ml일 수 있으며, 이때 보조제는 부피의 절반 내지 2/3를 구성한다. 토끼를 면역화하는 데 사용되는 것과 비슷한 양의 항원이 사용된다. 항원의 면역원성에 따라, 단지 1회 또는 2회 또는 3회 또는 4회 이상의 부스트 면역화 후에 높은 항체-역가(최대 1:100,000 내지 1:1,000,000)가 달성될 수 있다. 따라서, 부스터 면역화는 불완전 프로인트 보조제 및 (초기 면역화와 비교하여) 약 절반의 양의 항원을 사용하여 10일차, 20일차 및 30일차에 수행될 수 있다. 30일차까지 알 또는 혈청에서 특이적 항체가 검출되어야 한다. 장기적인 항체 생성을 위해, 닭은, 예를 들어 추가의 부스터 면역화를 받을 수 있다. 닭과 같은 조류의 경우, 암탉은 보통 약 72주 동안 연속적으로 알을 낳고 그 후에 산란 능력이 감소한다. 알 또는 혈청이 필요에 따라 수집될 수 있으며, 항체는 알로부터, 전형적으로 난황으로부터 회수될 수 있다.
다양한 IgY 추출 방법이, 예를 들어 드 뮬레나에르(De Meulenaer) & 휘게바에르트(Huyghebaert)에 의해 상세하게 검토된다(문헌[Food Agricult. Immunol. 2001;13:275-288]; 또한 검토를 위해 문헌[Schade et al. Altern. Lab Anim. 2005;33:129-154] 참조). 일반적으로, 이들 방법은 3개의 주요 그룹으로 나뉠 수 있다:
1.
침전 방법: 암모늄 또는 소듐 설페이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 카프릴산 및 카라기난을 포함한다.
2.
크로마토그래피 방법: 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친황성(thiophilic) 상호작용 크로마토그래피, 및 겔-여과 크로마토그래피.
3.
한외여과.
IgY 제제의 순도는 여러 방법의 조합에 의해 증가될 수 있는데; 예를 들어, PEG 침전은 친화성 크로마토그래피와 조합될 수 있거나, 암모늄 설페이트 침전은 이온 교환 크로마토그래피와 조합될 수 있다. 일부 경우에, 최종 응용에 따라, IgY의 물 추출이면 충분할 수 있다. 적합한 방법들의 임의의 조합을 사용하여 IgY 제제를 회수할 수 있다.
형질전환 동물
본 발명의 이점은 본 발명에 적합한 면역화된 동물의 가변 영역 및 핵산이 인간 가변 영역과 직접 페어링되어 혼합 결합 도메인을 직접 형성할 수 있기 때문에, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 형질전환 동물의 생성에 대한 필요성을 배제한다는 것이다. 따라서, 인간 Ig 유전자좌 또는 DNA를 포함하는 동물의 형질전환 품종(variety)을 생성할 필요 없이, 혼합 결합 도메인의 파지 디스플레이 라이브러리가 본 발명에 사용하기에 적합한 동물의 야생형 항체 레퍼토리로부터 직접 생성될 수 있다. 파지는 면역화된 동물로부터의 가변 영역 및 동족 인간 가변 영역을 포함하는 혼합 결합 도메인을 표시한다.
선택적으로, 본 발명의 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체가 생성될 수 있도록 면역화된 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물은, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 형질전환 조류의 생성에 의한 형질전환 동물일 수 있다. 이러한 형질전환 동물은 적어도 그의 B 세포 계통에 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
형질전환 조류는 중쇄 또는 경쇄 인코딩 서열에 DNA 재배열 및/또는 체세포 과돌연변이에 대한 저항성을 부여하는 수단이 제공된 것일 수 있다.
핵산은 바람직하게는 인간, 인간-유사 또는 인간화 면역글로불린 사슬을 인코딩한다. 바람직하게는, 형질전환 동물은 핵산 서열이 인간 VK 서열 또는 인간 V 람다 서열인 경쇄 인코딩 서열을 인코딩하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 경쇄는, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같이, 인간 공통 경쇄이다.
예를 들어, 닭은 중쇄 유전자좌 및 람다 경쇄 유전자좌를 갖지만, 카파 경쇄 유전자좌는 갖지 않는다. 인간 공통 경쇄는, 예를 들어, 닭의 중쇄 유전자좌 또는 람다 경쇄 유전자좌 내에 통합될 수 있다.
조류와 같은 비인간 동물의 제조 방법은 본 명세서에 참고로 포함되는 국제 특허 공개 WO2009/15771호에 이전에 기재되어 있다. 형질전환 닭의 생성 방법은 문헌[Ching et al., MABS 2018, 10(1), 71-80]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 결합 도메인, 다량체, 예컨대 항체, 또는 그의 변이체의 제조 방법
본 발명은 본 발명의 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체의 제조 방법에 관한 것이며, 이 방법은:
- 본 발명에 사용하기에 적합한 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 항원에 결합하는 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 상기 동물로부터 단리하는 단계; 및
- 상기 핵산에 의해 인코딩된 가변 영역을 수득하고 상기 가변 영역을 동족 인간 가변 영역과 페어링하는 단계를 포함하여,
혼합 결합 도메인, 다량체, 항체 또는 그의 변이체를 제조한다.
이러한 페어링은, 인코딩된 가변 영역들이 페어링되어 결합 도메인을 생성할 수 있도록, 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하거나 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산 및 동족 인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 발현함으로써 수행될 수 있다.
이는 상기 결합 도메인을 발현하는 적합한 세포에서 결합 도메인의 2개의 가변 영역을 인코딩하는 2개의 핵산을 발현시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 다양한 혼합 결합 도메인을 표시하는 디스플레이 라이브러리의 제조 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 발명의 혼합 결합 도메인을 인코딩하는 핵산을 유기체, 예컨대 파지 또는 효모, 또는 펩티드 디스플레이를 위한 다른 용기에 통합하는 단계를 포함하고, 상기 유기체는 상기 유기체 또는 용기의 표면 상에 상기 결합 도메인을 발현하고 표시한다. 다수의 결합 도메인, 전형적으로 다수의 상이한 결합 도메인이 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 다수의 유기체, 예컨대 파지(각 파지는 하나의 결합 도메인을 표시함)의 표면 상에 표시될 수 있다.
따라서, 디스플레이 라이브러리에서, 면역화된 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 복수의 가변 영역은 복수의 인간 가변 영역과 페이링되거나 인간 공통 사슬 가변 영역과 페어링된다. 디스플레이 라이브러리는, 예를 들어, Fab 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리 내의 파지는 면역화된 동물로부터의 가변 영역 및 동족 인간 가변 영역을 포함하는 혼합 결합 도메인을 표시한다.
파지 디스플레이는 인간으로부터의 동족 가변 영역과 페어링될 수 있는 면역화된 동물로부터의 가변 영역을 선택할 수 있게 한다. 따라서, 결합 도메인은 이 과정에서 반(half) 인간화된다. 면역화된 동물로부터의 가변 영역이 항원에 대한 결합을 야기하는 결합 도메인은, 예를 들어 항원을 사용하여 선택될 수 있다.
세포 및 파지 디스플레이 라이브러리에서의 결합 도메인의 발현이 하기에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
본 발명은 또한 항체 또는 그의 단편의 혼합 결합 도메인의 생성 방법을 제공하며, 이 방법은 인간 경쇄 가변 영역, 특히 인간 공통 경쇄 가변 영역을 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 예컨대 조류에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역과 조합하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 이 방법은 인간 중쇄 가변 영역, 특히 인간 공통 중쇄 가변 영역을 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 예컨대 조류에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 경쇄 가변 영역과 조합하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 형질전환 동물을 사용하여 키메라 면역글로불린 결합 도메인을 인코딩하는 핵산을 생성하는 방법을 제공하며, 이 방법은:
(a) 게놈이 그의 생식세포계열에 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트 및 인간 재배열된 공통 경쇄를 포함하는 동물을 제공하는 단계 - 항원에 반응하는 동물은 재배열된 면역글로불린 중쇄 가변 영역에 의해 인코딩되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 생성함 -;
(b) 동물을 항원에 노출시킴으로써 동물에서 면역 반응을 자극하는 단계;
(c) 항체의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계;
(d) 항체의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 세포 내의 인간 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결하는 단계;
(e) 상기 인간 재배열된 공통 경쇄를 인코딩하는 DNA를 상기 세포 내로 통합하는 단계;
(f) 세포가, 페어링될 수 있는, 중쇄 가변 영역 및 인간 중쇄 불변 영역과 인간 공통 경쇄를 포함하는 결합 도메인을 발현하도록 하는 조건 하에서 세포를 성장시키는 단계; 및
(g) 결합 도메인을 회수하는 단계를 포함한다.
이러한 방법은 재배열된 가변 영역을 사용하여 본 발명의 결합 도메인을 생성하기에 적합한 동물의 식별을 포함할 수 있으며, 이는 상기 동물의 핵산에 의해 인코딩되는 재배열된 가변 영역과 인간 VL 영역 계면 사이의 접촉점의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 Fab의 계면 - 상기 계면에서 인간 VL 영역과의 4개, 바람직하게는 5개, 바람직하게는 8개 및 더욱 바람직하게는 10개의 정전기적 상호작용부를 포함함 - 에서와 같이, 인간 VH 및 인간 VL 계면의 경우에 존재하는 것과 실질적으로 동일한 정전기적 접촉점을 인간/동물 가변 영역 계면에서 포함하는 가변 영역을 인코딩하는 핵산이 바람직하게 선택된다.
디스플레이 라이브러리 기술
특히 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이를 포함하는 다양한 형태의 디스플레이 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 기술된 결합 도메인의 사용을 위해 본 명세서에 기술된 본 발명에 포함된다.
하기의 논의는 파지 디스플레이에 초점을 두지만, 그러한 설명은 제한적이지 않으며, 본 명세서에 제공된 설명에 기초하여, 다른 형태의 디스플레이 기술에 용이하게 적용될 수 있다.
파지 디스플레이는 박테리아를 감염시키는 바이러스인 박테리오파지를 사용하는 단백질-단백질, 단백질-펩티드, 및 단백질-DNA 상호작용의 연구를 포함하여 사용되는 탁월한 기술이다. 본 명세서에 기술된 프로토콜 중 다수는 파지 디스플레이 라이브러리의 구축 및 관심 항원에 결합하기 위한 파지의 패닝(panning)에 대한 표준 프로토콜이며, 문헌[Antibody Phage Display: Methods and Protocols](저자(들): Philippa M. O'Brien, Robert Aitken)에 기재되어 있다. 라이브러리는 당업계에 공지된 절차에 따라, 예를 들어, VCSM13(스트라타진)을 헬퍼 파지 균주로서 사용하는 크라머(Kramer) 등(2003)(문헌[Kramer et al. 2003 Nucleic Acids Res.31(11): e59])에 의해 기재된 바와 같이 성장 및 수확될 수 있다. 파지는 당업계에 공지된 절차에 따라, 예를 들어, VCSM13을 헬퍼 파지 균주로서 사용하는 크라머 등(2003)(문헌[Kramer et al. 2003 Nucleic Acids Res. 31(11): e59)에 의해 기재된 바와 같이 성장 및 처리될 수 있다.
예시적인 기술에서, 관심 단백질을 인코딩하는 핵산, 예를 들어 가변 영역을 인코딩하는 핵산은 파지 코트 단백질 유전자에 통합되어, 파지가 그의 외부에 단백질을 "표시"하면서 그의 내부에 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하게 한다. 이러한 방식으로, 유전자형과 표현형 사이의 연결이 확립된다.
항체 발견과 관련하여, 파지 디스플레이에서, VH 및/또는 VL 영역의 대형 집단(라이브러리)은 이들이 페어링되어 결합 도메인을 형성하도록 사상(filamentous) 박테리오파지 입자의 표면 상에서 발현될 수 있다. 이들 라이브러리로부터, 파지는 항원 및 표시된 결합 도메인과의 결합 상호작용을 통해 선택될 수 있다.
따라서, 디스플레이 파지를 다른 단백질, 펩티드 또는 DNA 서열, 또는 다른 형태의 표적 부분에 대하여 스크리닝하여, 디스플레이된 VH, VL 또는 결합 도메인과 이러한 다른 부분 사이의 상호작용을 검출할 수 있다. 이러한 방식으로, VH, VL 또는 결합 도메인의 대형 라이브러리는 자연 선택과 유사한 시험관내 선택으로 불리는 과정에서 스크리닝되고 증폭될 수 있다.
따라서, 본 발명의 결합 도메인은 파지 상에 표시될 수 있으며, 전형적으로, 이러한 결합 도메인 내의 가변 영역들 중 하나는 본 명세서에 기술된 바와 같은 면역화된 동물의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되고, 또한 인간 가변 영역, 바람직하게는 공통 사슬, 더욱 바람직하게는 공통 경쇄를 포함한다. 따라서, 결합 도메인을 표시하는 파지는 동물을 면역화하기 위해 사용된 항원을 사용하여 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 인간에 대해 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 바람직하게는 조류, 더욱 바람직하게는 닭, 오리 또는 타조의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 제1 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열; 및 제2 인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 게놈 내에 포함하는 파지를 제공한다. 바람직하게는, 제2 가변 영역은 상기 제1 가변 영역과 페어링될 수 있다.
본 발명은 또한, 인간에 대해 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 바람직하게는 조류, 더욱 바람직하게는 닭, 오리 또는 타조의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 제1 가변 영역; 및 상기 제1 가변 영역과 페어링될 수 있는 제2 인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 게놈 내에 포함하는 파지의 제조 방법을 제공한다. 이러한 방법은:
- 조류를 항원으로 면역화하는 단계;
- 제1 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 상기 동물로부터 단리하는 단계; 및
- 상기 핵산 및 제1 가변 영역과 페어링될 수 있는 제2 인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 파지의 게놈에 통합하는 단계를 포함하여,
파지를 제조한다.
더 일반적으로, 본 발명에 따르면, 파지 디스플레이를 사용하여 결합 도메인을 생성하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은:
(a) 본 명세서에 기술된 바와 같이 항원으로 적합한 동물, 예컨대 조류를 면역화하는 단계,
(b) 가변 영역을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 동물로부터 수득하는 단계,
(c) 하나 이상의 핵산을 동족 인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산과 함께 하나 이상의 파지에 통합하여, 각각의 파지가 페어링될 수 있는 2개의 가변 영역을 표시하도록 하는 단계;
(d) (a)에서 사용된 항원에 결합할 수 있는 결합 도메인을 표시하는 파지를 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
하기는 원하는 표적 단백질 또는 DNA 서열에 높은 친화성으로 결합하는 폴리펩티드, 이 경우에는 페어링된 가변 도메인을 포함하는 결합 도메인을 식별하기 위해 파지 디스플레이 스크리닝에서 따를 수 있는 단계를 더 상세히 설명한다. 이 과정은 면역 선택을 모방할 수 있고, 다수의 상이한 결합 특이성을 갖는 항체가 이러한 접근법을 이용하여 단리되었다(문헌[Hoogenboom, H. R., et al. (2005). Nat. Biotechnol., 23, 1105]).
1. 표적 단백질(즉, 동물을 면역화하는 데 사용되는 항원)은 전형적으로 예를 들어 마이크로타이터 플레이트의 웰에 고정된다.
이 단계에서, 표적 단백질은, 동물을 면역화하는 데 사용되며 항체를 생성하는 데 요구되는 임의의 항원일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 동물의 유형 및 이를 면역화하는 방법은 본 명세서에 기술되어 있다.
2. 가변 서열을 인코딩하는 하나 이상의 핵산은 표적 단백질로 면역화된 동물로부터 단리된다.
그러나, 전형적으로, 관심 항원과 결합할 수 있는 상이한 가변 영역을 인코딩하는 다수의 핵산 서열이 동물로부터 단리된다. 전형적으로 단리된 핵산은 VH 서열을 인코딩하는 핵산이다.
동물로부터 핵산의 단리는 전형적으로 동물로부터 적절한 조직, 예를 들어 비장, 골수 또는 림프절 조직, 즉 B 세포를 포함하는 조직을 회수하는 것으로 시작된다. 세포 현탁액이 이러한 조직으로부터 제조될 수 있고, 이어서, 가변 서열을 인코딩하는 핵산이 세포 현탁액으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어 트라이졸을 사용하여 적합한 세포 현탁액을 제조하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 원한다면, 비장 B 세포 분획 비장 B 세포는, 예를 들어 CD19 선택에 기초하여 양성 선택에 의해 정제될 수 있다. 이어서, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 상기 RNA로부터 합성된 세포 및 cDNA로부터 RNA가 제조될 수 있다.
이어서, cDNA로부터 가변 영역을 인코딩하는 서열을 특이적으로 증폭하는 PCR 프라이머 세트가 사용된다(전형적으로 VH 인코딩 서열이 증폭됨). 이러한 접근법은 문헌[De Haard et al. (J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30)]에 기재되어 있고, 닭에 대한 특정 프라이머 세트는 실시예에 기재되어 있다. 전형적으로, 프라이머는 VH를 인코딩하는 증폭된 핵산의 5' 및 3' 말단에 고유한 제한 효소 부위를 도입하여 적합한 파지 디스플레이 벡터, 예를 들어 파지미드 내로의 핵산의 클로닝을 용이하게 하도록 설계되었다.
3.
동물로부터 수득되는 가변 영역, 예컨대 VH 영역을 인코딩하는 핵산은 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있다.
파지미드 벡터는 박테리아 세포 내에서 또는 파지의 표면에서 본 발명의 결합 도메인의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 파지미드는 f1 파지로부터의 f1 복제 원점을 포함하는 플라스미드이다. 이것은 사상 파지 M13과 조합되어 일종의 클로닝 벡터로서 사용될 수 있다. 파지미드는 플라스미드로서 복제될 수 있으며, 또한 바이러스 입자 내에 단일 가닥 DNA로서 패키징될 수 있다. 파지미드들은 이중 가닥 복제를 위한 복제 원점(ori) 뿐만 아니라 f1 원점을 포함하여 단일 가닥 복제 및 파지 입자 내로의 패키징을 허용한다.
따라서, 파지미드는 DNA 단편을 클로닝하는 데 사용될 수 있고 형질전환 및 전기천공과 같은 다양한 기술에 의해 박테리아 숙주 내로 도입될 수 있다. 파지미드를 함유하는 박테리아 숙주를 '헬퍼' 파지로 감염시키는 것은 단일 가닥 DNA 복제 및 파지 입자 내로의 파지미드 DNA의 패키징을 허용하는 데 필요한 바이러스 성분을 제공한다. '헬퍼' 파지는 먼저 숙주 세포의 선모(pilus)에 부착한 다음 부착 후에 파지 게놈을 숙주 세포의 세포질 내로 수송함으로써 박테리아 숙주를 감염시킨다. 세포 내에서, 파지 게놈은 세포질 내에서 단일 가닥 파지미드 DNA의 생성을 촉발한다. 이어서, 이 파지미드 DNA는 파지 입자 내에 패키징된다. ssDNA를 함유하는 파지 입자는 박테리아 숙주 세포로부터 세포외 환경으로 방출된다.
따라서, 본 발명에 적합한 면역화된 동물로부터 단리된 가변 영역을 인코딩하는 (또는 이러한 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는) 핵산은 동족 가변 영역을 인코딩하는 핵산과 함께 파지미드 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 즉, 각각의 파지미드는 동물로부터 단리된 가변 영역을 인코딩하는 핵산 및 그의 동족 가변 영역, 예를 들어 cLC의 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 파지미드가 파지 내로 패키징될 때 Fab 단편이 표시될 수 있도록 불변 영역이 또한 존재하는 것이 바람직할 수 있다.
라이브러리를 생성하기 위해 적합한 박테리아 세포 내로 다수의 파지미드가 형질전환되거나 형질감염될 수 있다. 라이브러리로부터 파지를 구출(rescue)하기 위해, 헬퍼 파지, 예를 들어 VCSM13이 박테리아 세포에 첨가되고, 후속하여 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 파지는 회수된다.
4.
이어서, 생성된 파지-디스플레이 라이브러리는 관심 표적, 즉 항원을 함유하는 마이크로타이터 플레이트에 첨가될 수 있고, 파지가 상기 표적에 결합할 시간을 허용한 후, 접시가 세척될 수 있다.
5.
표적 분자와 상호작용하는 파지-표시 단백질은 접시에 부착된 채로 남아 있는 반면, 다른 모든 것은 세척된다.
6.
부착된 파지는 용출되고, 적합한 박테리아 숙주의 감염에 의해 더 많은 파지를 생성하는 데 사용될 수 있다. 새로운 파지는 초기 혼합물에 존재했던 것보다 상당히 더 적은 무관한(즉, 비-결합) 파지를 함유하는 농축된 혼합물을 구성한다.
7.
단계 4 내지 단계 6은 선택적으로 1회 이상 반복되어, 결합 단백질에서 파지 라이브러리를 더욱 농축할 수 있다.
8.
상호작용하는 파지 내의 핵산(본 발명에 적합한 동물의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역을 인코딩함)은 상호작용하는 단백질 또는 단백질 단편을 식별하기 위해 서열분석될 수 있다.
따라서, 특히, 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법으로서, 이 방법은
- 조류 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 복수의 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산을 상기 동물로부터 단리하는 단계; 및
- 상기 핵산을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계 - 상기 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역의 적어도 일부는 인간 가변 영역과 페어링됨 - 를 포함하여,
Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 제조한다.
따라서, 본 발명의 일 태양은 결합 도메인의 집단을 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 적어도 하기 단계들을 포함한다:
a) B 세포의 집단을 제공하는 단계
b) 상기 B 세포로부터 핵산을 단리하는 단계
c) 상기 샘플 내의 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 증폭시키는 단계
d) 본질적으로 모든 증폭 생성물을 적어도 부분적으로 서열분석하는 단계
e) 단계 d)로부터의 모든 서열의 빈도 분석을 수행하는 단계
f) 원하는 VH 서열을 선택하는 단계
g) 상기 원하는 VH 서열 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 하나의 벡터 및 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 숙주 세포에 제공하는 단계
h) 상기 숙주 세포를 배양하고 VH 및 VL 폴리펩티드가 발현되게 하는 단계
i) 상기 결합 분자를 수득하는 단계.
대안적으로, 단계 c) 및 단계 d)는 대안적인 단계 c'및 d'로 대체될 수 있다: c') VH 영역 서열에 특이적인 핵산 프로브로 프로빙(probing)함으로써 VH 영역 특이적 DNA 서열에 대해 스크리닝된 cDNA 라이브러리를 구축하는 단계 및 d') VH 삽입물을 함유하는 클론을 적어도 부분적으로 서열분석하는 단계.
본 발명은 관심 표적에 결합하는 가변 영역을 식별하기 위한 파지 디스플레이 라이브러리 개발 및 스크리닝 시 항체의 생성을 추가로 포함한다. 본 방법은:
a) 상기 항원에 결합할 수 있는 결합 도메인을 표시하는 파지의 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 단리하는 단계;
b) 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 인간 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결하는 단계;
c) 상기 가변 영역 DNA 및 인간 공통 경쇄를 인코딩하는 DNA를 숙주 세포 내로 통합하는 단계;
d) 페어링될 수 있는, 인간 공통 경쇄와 페어링된 인간 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 가변 영역을 포함하는 항체를 세포가 발현하도록 하는 조건 하에서 세포를 성장시키는 단계; 및
e) 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
종종, 파지 디스플레이 라이브러리로부터 얻은 항체는 고 친화성 항체를 얻기 위해 시험관내 친화성 성숙을 거친다(문헌[Hoogenboom, H. R., et al.(2005). Nat. Biotechnol., 23, 1105]).
본 발명의 파지, 예를 들어 상기에 제시된 절차에 의해 식별된 것은 전형적으로, 조류의 핵산에 적어도 부분적으로 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역 및 인간 가변 영역을 표시할 것이며, 상기 가변 영역은 서로 페어링된다.
본 발명에 따른 파지 디스플레이 라이브러리는 복수의 파지미드 또는 파지를 포함한다. 본 발명의 파지 디스플레이 라이브러리는 조류로부터의 상이한 가변 영역을 각각 인코딩하는 최대 1010개의 핵산, 예를 들어 조류로부터의 상이한 가변 영역을 각각 인코딩하는 최대 109개 또는 최대 108개의 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 파지 디스플레이 라이브러리에서, 실질적으로 모든 파지는 본 발명의 결합 도메인을, 예를 들어 Fab의 형태로 표시한다.
당업자에게 잘 알려진 방법에 따라, 예를 들어 FACS 분석을 사용하여 파지 라이브러리를 스크리닝하여, 면역화에 사용되는 항원에 결합할 수 있는 결합 도메인을 식별할 수 있다. 따라서, 동물을 면역화하는 데 사용되는 항원에 대해 친화성 및 특이성을 갖는 결합 영역은 상기 항원을 사용하는 스크리닝에 의해 식별될 수 있다. 라이브러리에 표시된 결합 영역의 일부는 면역화에 사용되는 항원에 실제로 결합할 수 있다. 면역화된 동물로부터 유래된 일부 가변 영역은 항원에 결합하지 않을 수 있고(즉, 상이한 특이성을 가짐), 다른 경우, 대안적인 VH-VL CDR 페어링으로 인해 결합 영역이 친화성 또는 특이성을 상실한 VH/VL 페어링이 형성될 수 있다.
공통 사슬
본 발명의 바람직한 태양은, 본 발명의 결합 도메인 또는 이의 다량체, 예컨대 항체가, 인간에 대해 계통 발생적으로 원위에 있는 동물, 바람직하게는 조류, 더욱 바람직하게는 닭의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 다수의 중쇄 가변 영역과 조합될 수 있는 공통 경쇄(가변 영역)를 가져서, 기능적 항원 결합 도메인을 갖는 항체를 형성하는 것이다(국제 특허 공개 WO2004/009618호, 국제 특허 공개 WO2009/157771호).
본 발명의 다가 항체에 사용되는 공통 경쇄(가변 영역)는 바람직하게는 인간 경쇄(가변 영역)이다. 공통 경쇄(가변 영역)는 바람직하게는 생식세포계열 서열을 갖는다. 바람직한 생식세포계열 서열은, 인간 레퍼토리에서 빈번하게 사용되고 우수한 열역학적 안정성, 수율 및 용해성을 갖는 경쇄 가변 영역이다. 바람직한 생식세포계열 경쇄는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01이다(도 17a; 서열 번호 5). 공통 경쇄 가변 영역은 바람직하게는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01의 가변 영역이다(도 17b; 서열 번호 6 및 서열 번호 7). 공통 경쇄는 바람직하게는, 0 내지 5개의 아미노산 삽입, 결실, 치환, 첨가 또는 이들의 조합을 갖는, 도 17b 또는 도 17d(각각, 서열 번호 7 또는 서열번호 10)에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 공통 경쇄는 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39/IGJκ5D(도 19g; 서열 번호 25)이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39/IGJκ5의 가변 영역을 포함한다.
추가의 바람직한 공통 경쇄는 인간 카파 경쇄 IgVκ3-15/IGJκ1(도 19h; 서열 번호 94)이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 카파 경쇄 IgVκ3-15/IGJκ1의 가변 영역을 포함한다.
추가의 바람직한 공통 경쇄는 인간 카파 경쇄 IgVκ3-20/IGJκ1(도 19i; 서열 번호 95)이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 카파 경쇄 IgVκ3-20/IGJκ1의 가변 영역을 포함한다.
추가의 바람직한 공통 경쇄는 인간 람다 경쇄 IgVλ3-21/IGJλ3(도 19 j; 서열 번호 96)이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간 카파 경쇄 IgVλ3-21/IGJλ3의 가변 영역을 포함한다.
공통 경쇄는 바람직하게는 경쇄 불변 영역, 바람직하게는 카파 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 공통 경쇄를 인코딩하는 핵산은 공통 경쇄 단백질을 발현하는 데 사용되는 세포 시스템에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 인코딩 핵산은 생식세포계열 핵산 서열로부터 벗어날 수 있다.
본 발명의 결합 도메인 또는 그의 다량체, 예컨대 다가 항체에 사용하기 위한 공통 경쇄(가변 영역)는 람다 경쇄, 예컨대 인간 람다 경쇄 IgVλ3-21/IGJλ3(도 19j)일 수 있으며, 따라서 이것은 또한 본 발명과 관련하여 제공된다. 본 발명의 공통 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄의 불변 영역을 포함할 수 있다. 그것은 바람직하게는 카파 경쇄의 불변 영역이며, 바람직하게는 상기 공통 경쇄는 생식세포계열 경쇄, 바람직하게는 IgVK1-39 유전자 단편을 포함하는 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄, 예를 들어 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVK1-39*01/IGJK1*01(도 17a); 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39/IGJκ5(도 19g); 인간 카파 경쇄 IgVκ3-15/IGJκ1(도 19h); 또는 인간 카파 경쇄 IgVκ3-20/IGJκ1(도 19i)이다. 당업자는 "공통"이 또한 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 기능적 등가물을 지칭함을 인식할 것이다. 상기 경쇄의 많은 변이체가 존재하는데, 이러한 변이체에는 기능적 결합 영역의 형성에 실질적으로 영향을 주지 않는 돌연변이(결실, 치환, 첨가)가 존재한다.
IgVκ1-39는 면역글로불린 가변 카파 1-39 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 면역글로불린 카파 가변 1-39; IGKV139; IGKV1-39로도 알려져 있다. 유전자의 외부 Id는 HGNC: 5740; Entrez Gene: 28930; Ensembl: ENSG00000242371이다. IgVκ1-39에 대한 바람직한 아미노산 서열이 도 17에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 도 17은 J-영역과 조합된 IgVκ1-39에 대한 2개의 바람직한 서열을 기술한다. 결합된 서열은 IGKV1-39/jk1 및 IGKV1-39/jk5로 표시되며; 대안적인 명칭은 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 또는 IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹 imgt.org에 따른 명명법)이다. 이들 명칭은 예시적이며 유전자 세그먼트의 대립유전자 변이체를 포함한다.
IgVκ3-15는 면역글로불린 가변 카파 3-15 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 면역글로불린 카파 가변 3-15; IGKV315; IGKV3-15로도 알려져 있다. 유전자의 외부 Id는 HGNC: 5816; Entrez Gene: 28913; Ensembl: ENSG00000244437이다. IgVκ3-15에 대한 바람직한 아미노산 서열이 도 19d(서열 번호 90)에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 도 19a는 J-영역과 조합된 IgVκ3-15에 대한 바람직한 서열을 기술한다. 결합된 서열은 IGKV3-15/jk1로 표시되며; 대안적인 명칭은 IgVκ3-15*01/IGJκ1*01(IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹 imgt.org에 따른 명명법)이다. 이 명칭은 예시적이며 유전자 세그먼트의 대립유전자 변이체를 포함한다.
IgVκ3-20은 면역글로불린 가변 카파 3-20 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 면역글로불린 카파 가변 3-20; IGKV320; IGKV3-20으로도 알려져 있다. 유전자의 외부 Id는 HGNC: 5817; Entrez Gene: 28912; Ensembl: ENSG00000239951이다. IgVκ3-20에 대한 바람직한 아미노산 서열이 도 19e(서열 번호 91)에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 도 19b는 J-영역과 조합된 IgVκ3-20에 대한 바람직한 서열을 기술한다. 결합된 서열은 IGKV3-20/jk1로 표시되며; 대안적인 명칭은 IgVκ3-20*01/IGJκ1*01(IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹 imgt.org에 따른 명명법)이다. 이 명칭은 예시적이며 유전자 세그먼트의 대립유전자 변이체를 포함한다.
IgVλ3-21은 면역글로불린 가변 람다 3-21 유전자에 대한 축약어이다. 이 유전자는 면역글로불린 람다 가변 3-21; IGLV320; IGLV3-21로도 알려져 있다. 유전자의 외부 Id는 HGNC: 5905; Entrez Gene: 28796; Ensembl: ENSG00000211662.2이다. IgVλ3-21에 대한 바람직한 아미노산 서열이 도 19k(서열 번호 97)에 제공되어 있다. 이것은 V-영역의 서열을 열거한다. V-영역은 5개의 J-영역들 중 하나와 조합될 수 있다. 도 19j는 J-영역과 조합된 IgVλ3-21에 대한 바람직한 서열을 기술한다. 결합된 서열은 IGλV3-21/jk3으로 표시되며; 대안적인 명칭은 IgVλ3-21/IGJκ3(IMGT 데이터베이스 월드와이드 웹 imgt.org에 따른 명명법)이다. 이 명칭은 예시적이며 유전자 세그먼트의 대립유전자 변이체를 포함한다.
공통 경쇄를 생성하는 세포는, 예를 들어 재배열된 생식세포계열 인간 카파 경쇄 IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 및 람다 불변 영역에 융합된 언급된 경쇄의 가변 영역을 포함하는 경쇄를 생성할 수 있다. 본 명세서에서 생식세포계열 서열을 언급하는 경우, 가변 영역은 생식세포계열 서열인 것이 바람직하다.
본 발명의 결합 도메인 또는 이의 다량체, 예컨대 항체에 사용하기 위해 바람직한 공통 경쇄는 서열 번호 5에 제시된 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 결합 도메인 또는 이의 다량체, 예컨대 항체에 사용하기 위한 공통 사슬은 또한 중쇄일 수 있으며, 따라서 이것은 또한 본 발명과 관련하여 제공된다. 공통 중쇄가 당업계에서 이중특이성 항체를 제조하는데 사용되어 왔으며, 본 명세서에서 3개 이상의 결합 도메인을 포함하는 다가 항체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 상기 결합 도메인 중 2개 이상은 당업계에 공지된 공통 중쇄를 포함한다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인이 모든 라이브러리 구성원들에 대해 동일하고 따라서 다양성이 경쇄 가변 도메인에 기초하는 항체 라이브러리의 사용이, 예를 들어, PCT/US2010/035619호 및 PCT/US2010/057780호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 공통 중쇄를 갖는 결합 도메인을 생성하는 이들 및 다른 기술은 당업자에 의해 창출될 수 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 다량체의 제조
본 발명의 다량체, 예를 들어 항체는 상기 기술된 것과 같은 다량체를 형성하는 2개 이상, 예를 들어 3개의 단백질을 함께 인코딩하는 하나 이상의 유전자 구조체로 개별 세포를 공동 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 상기 기재된 방법에 따라 본 발명에 적합한 면역화된 동물의 핵산 또는 디스플레이 라이브러리에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 하나 이상의 중쇄 가변 영역 및 공통 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열로 공동 형질감염시켜 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 항체는 하나 이상의 경쇄 가변 영역 및 공통 중쇄를 함께 인코딩하는 하나 이상의 유전자 구축물로 개별 세포를 공동 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 다중특이성 다량체, 예를 들어 이중특이성 항체가 요구되는 경우, 다수의 중쇄 가변 영역 또는 다수의 경쇄 영역이 세포로부터 발현될 수 있다.
다중특이성 항체, 예컨대 이중특이성 항체가 요구되는 경우, 이종이량체인 항체의 생성에 유리한 몇몇 방법이 공개되었다. 본 발명에서, 세포는 각각의 동종이량체의 생성에 비하여 이종이량체의 생성에 유리한 것이 바람직하다. 이는 전형적으로 중쇄의 불변 영역을 변형시켜, 이들이 동종이량체화에 비하여 이종이량체화(즉, 하나의 중쇄와 또 하나의 중쇄의 조합에 의한 이량체화)를 유리하게 함으로써 달성된다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 항체는 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 갖는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄를 포함한다.
양립가능한 이종이량체화 도메인들은 바람직하게는 양립가능한 면역글로불린 중쇄 CH3 이종이량체화 도메인들이다. 야생형 CH3 도메인이 사용되는 경우, 2개의 상이한 중쇄(A 및 B)와 공통 경쇄의 동시발현은 3개의 상이한 항체종, AA, AB 및 BB를 생성할 것이다. AA 및 BB는 2개의 동종이량체 항체에 대한 표기이고, AB는 이종이량체 항체에 대한 표기이다. 원하는 이종이량체 생성물(AB)의 백분율을 증가시키기 위하여, CH3 조작이 사용될 수 있거나, 또는 다시 말하면, 이하에서 정의된 바와 같은 양립가능한 이종이량체화 도메인을 갖는 중쇄를 사용할 수 있다. 당업계에는 그러한 중쇄 이종이량체화가 달성될 수 있는 다양한 방법이 기술되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 '양립가능한 이종이량체화 도메인'은, 조작된 도메인 A'이 조작된 도메인 B'와 함께 이종이량체를 우선적으로 형성하도록 하고 역으로도 성립되도록 하며, A'-A' 및 B'-B' 사이의 동종이량체화는 감소되도록 조작된 단백질 도메인을 지칭한다.
미국 특허 출원 제13/866,747호(현재 미국 특허 제9,248,181호로 허여됨), 미국 특허 출원 제14/081,848호(현재 미국 특허 제9,358,286호로 허여됨), 국제 특허 공개 WO2013/157953호 및 국제 특허 공개 WO2013/157954호에는, 양립가능한 이종이량체화 도메인들을 사용하여 다가 항체를 생성하기 위한 방법 및 수단이 개시되어 있다. 이들 수단 및 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체는 바람직하게는 본질적으로 단지 이중특이성 전장 IgG 분자만을 생성하기 위한 돌연변이를 포함한다. 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인 또는 이에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 L351K 및 T366K(EU 넘버링)('KK-변이체' 중쇄) 및 제2 도메인 또는 이에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환 L351D 및 L368E('DE-변이체' 중쇄)이거나, 또는 역으로도 성립된다. 본 출원인의 미국 특허 제9,248,181호 및 미국 특허 제9,358,286호뿐만 아니라 PCT 출원인 WO2013/157954호에서, DE-변이체와 KK-변이체가 우선적으로 페어링하여, 이종이량체(이른바, 'DEKK' 이중특이성 분자)를 형성하는 것으로 이미 입증되었다. DE-변이체 중쇄의 동종이량체화(DEDE 동종이량체) 또는 KK-변이체 중쇄의 동종이량체화(KKKK 동종이량체)는 동일한 중쇄들 사이의 CH3-CH3 계면에서의 하전된 잔기들 사이의 반발력으로 인해 거의 발생되지 않는다.
국제 특허 공개 WO2019/190327에, 다가 항체, 예를 들어, 상중특이성 또는 다중특이성 항체의 제조 방법이 기재되어있다. 3개 이상의 결합 도메인을 포함하는 다가 항체에 대한 모듈형 포맷이 기술된다: 이들 포맷에서, 적어도 하나의 결합 도메인은 베이스 항체 부분에 연결되고, 상기 베이스 항체 부분은 2개의 결합 도메인을 포함한다. 추가의 결합 도메인은 가변 영역, Fv 도메인, Fab 도메인 또는 변형된 Fab 도메인 또는 이의 임의의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 베이스 항체 부분은 예를 들어, 전장 항체 또는 이의 단편일 수 있지만, 어떤 경우에도 2개의 결합 도메인을 포함한다. 하나 이상의 추가의 결합 도메인은 링커(들)를 통해 베이스 항체 부분에 연결되어, 베이스 항체 부분의 것 이외에도 하나 이상의 결합 부분을 제공한다. 링커는 하나 이상의 추가의 결합 도메인을 베이스 항체 부분에 연결하는 데 사용된다. 링커는 펩티드 영역, 예를 들어 하나 이상의 힌지 영역 및/또는 힌지 영역으로부터 유래된 하나 이상의 영역을 포함한다. 본 발명의 결합 도메인 또는 다량체는 이러한 다가 항체에 통합될 수 있다.
핵산 서열, 폴리펩티드, 벡터 및 세포
본 발명은 본 발명의 다량체, 예컨대 항체의 조립에 사용될 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열; 이러한 핵산 서열을 포함하는 벡터; 본 발명의 다량체, 예컨대 항체를 생성할 수 있는 세포; 및 이러한 세포를 사용하여 항체를 포함하는 이러한 다량체의 제조 방법을 추가로 제공한다.
본 발명에 따른 다량체, 예컨대 항체는 전형적으로 함께 조립되어 본 발명의 다량체, 예컨대 항체를 형성하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 발현하는 세포에 의해 생성된다.
본 발명의 다량체, 예컨대 항체의 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용되는 핵산 서열은 임의의 적합한 발현 벡터에 배치될 수 있으며, 적절한 상황에서 단일 숙주 세포에 2개 이상의 벡터가 배치될 수 있다.
일반적으로, 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열은 적절한 링커 및/또는 불변 영역으로 클로닝되고, 서열은 발현을 위해 적합한 세포주의 적합한 발현 구축물에서 프로모터와 작동가능하게 연결된 상태로 배치된다.
따라서, 본 발명은 또한 다량체, 예컨대 항체의 제조 방법을 제공하며, 이 방법은:
본 발명의 다량체, 예컨대 항체로 조립될 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계; 및
폴리펩티드의 발현 및 다량체, 예컨대 항체로의 조립을 제공하기 위한 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
특히, 세포에는 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나 그로부터 유도되거나 수득되는 하나 이상의 핵산 서열이 제공되며, 이러한 핵산 서열은 면역 글로불린 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩한다. 세포에 면역 글로불린 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 제공되는 경우, 세포는 또한 면역 글로불린 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 본 명세서에 기술된 것과 같은 공통 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 세포에 면역 글로불린 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열이 제공되는 경우, 세포는 또한 면역 글로불린 중쇄 가변 영역, 바람직하게는 공통 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 세포는 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함한다.
본 발명의 숙주 세포는 총 발현된 면역 글로불린을 기준으로 하여, 본 발명의 다량체, 예컨대 항체의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%의 순도로 본 발명의 다량체, 예컨대 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포는 생성된 다가 항체의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%가 모든 결합 부위에 대해 동족 공통 사슬과 페어링된 가변 재배열된 영역을 포함하는, 본 발명의 다량체, 예컨대 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포는 발현된 공통 사슬의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%가 다가 항체에 페어링되고, 유리된 비결합 단백질이 아닌 항체를 생성할 수 있다.
결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체, 또는 그의 변이체의 발현
재조합 숙주 세포에서의 결합 도메인, 다량체, 예컨대 항체, 또는 그의 변이체의 발현은 본 기술 분야에 기재되어 있다. 본 발명의 항체의 경쇄 및 중쇄 및 결합 도메인의 경우 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자는 염색체외 카피로서 존재하고/하거나 숙주 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합될 수 있다. 후자는 유전자 침묵이 없는 것으로 알려진 유전자좌가 표적화될 수 있는 경우에 바람직하다.
본 발명의 다량체, 예컨대 항체로 조립되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 발현을 얻기 위해, 이러한 발현을 유도할 수 있는 서열이 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열에 기능적으로 연결될 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 기능적으로 연결된다는 것은 폴리펩티드 또는 이의 전구체를 인코딩하는 핵산 서열이 발현을 유도할 수 있는 서열에 연결되어, 이들 서열이 폴리펩티드 또는 이의 전구체의 발현을 유도할 수 있음을 설명하고자 한다. 유용한 발현 벡터, 예를 들어 인비트로젠(Invitrogen)의 pcDNA 벡터 시리즈가 당업계에서 이용가능하다. 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 서열이 인코딩된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 좌우하는 서열과 관련하여 적절하게 삽입되는 경우, 생성된 발현 카세트는 발현으로 지칭되는 관심 폴리펩티드를 생성하는 데 유용하다. 발현을 유도하는 서열은 프로모터, 인핸서 등 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이들은 숙주 세포에서 기능을 할 수 있어서, 이들에 기능적으로 연결된 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있어야 한다. 프로모터는 구성적이거나 조절될 수 있으며, 바이러스, 원핵생물 또는 진핵생물 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어질 수 있거나, 인공적으로 설계될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열의 발현은 천연 프로모터 또는 이의 유도체 또는 완전히 이종성인 프로모터로부터 유래될 수 있다. 진핵세포에서의 발현을 위해 잘 알려져 있고 많이 사용되는 일부 프로모터는 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, 예를 들어 E1A 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래된 프로모터, 예를 들어 CMV 전초기(IE) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된 프로모터 등으로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 적합한 프로모터는 또한 진핵세포, 예컨대 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 연장 인자 Ia(EF- Ia) 프로모터, 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 열충격 프로모터 등으로부터 유래될 수 있다. 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있는 임의의 프로모터 또는 인핸서/프로모터가 본 발명에 적합하다. 일 실시 형태에서, 발현을 유도할 수 있는 서열은 CMV 프로모터로부터의 영역, 바람직하게는 CMV 전초기 유전자 인핸서/프로모터의 뉴클레오티드 -735 내지 +95를 포함하는 영역을 포함한다. 당업자는 본 발명에 사용되는 발현 서열이 절연체, 매트릭스 부착 영역, STAR 요소 등과 같은 발현을 안정화하거나 향상시킬 수 있는 요소와 적절하게 조합될 수 있음을 알 것이다. 이는 발현의 안정성 및/또는 레벨을 향상시킬 수 있다.
재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포가 본 발명의 다량체, 예컨대 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 현탁 성장에 적합하다.
본 발명의 다량체, 예컨대 항체는 전형적으로 본 발명의 적합한 세포를 배양하고, 상기 다량체, 예컨대 항체를 상기 배양물로부터 수확함으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 무혈청 배지에서 배양된다. 본 발명의 다량체, 예컨대 항체는 세포로부터 또는 바람직하게는 당업자에게 일반적으로 공지된 방법에 의해 세포 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 다량체, 예컨대 항체를 생성하는 방법에 의해 수득될 수 있는 다량체, 예컨대 항체가 제공된다. 다량체, 예컨대 항체는 바람직하게는 배양 배지로부터 정제된다.
회수 후에, 다량체, 예컨대 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 배양물로부터 정제될 수 있다. 이러한 방법은 침전, 원심분리, 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 양이온 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용, 크로마토그래피 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 다량체, 예컨대 항체를 분리하는 수단으로서 링커 서열을 기반으로 하는 것을 포함하는 친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다.
약제학적 조성물 및 사용 방법
본 발명은 또한 본 발명의 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체 또는 그의 변이체 및 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
따라서, 본 발명은 요법에 의한 인간 또는 동물체의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명의 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체 또는 그의 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체 또는 그의 변이체의 치료적 유효량을 의학적 징후를 앓고 있는 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간 또는 동물의 치료 방법을 제공한다.
환자에게 투여되는 본 발명에 따른 결합 도메인 또는 다량체, 예컨대 항체 또는 그의 변이체의 양은 전형적으로 치료역(therapeutic window) 내에 있어야 하는데, 이는 치료적 효과를 얻는 데 충분한 양이 사용되지만, 그 양은 허용 불가능한 정도의 부작용으로 이어지는 역치를 초과하지 않음을 의미한다.
선행 기술로서 주어진 특허 문서 또는 다른 자료에 대한 본 명세서에서의 언급은, 그 문서 또는 자료가 알려졌거나 그것이 포함하는 정보가 임의의 청구범위의 우선일에 공통적인 일반 지식의 일부임을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
본 명세서에 기술된 각각의 참고문헌의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명의 태양:
1.
인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함하고, 가변 영역은 인간 가변 영역과 페어링되는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
2.
제1 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물은 조류인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
3.
제1 태양 또는 제2 태양에 있어서, 다량체는 항체인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
4.
제3 태양에 있어서, 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
5.
제1 태양 내지 제4 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역은 상기 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 재배열된 VDJ 영역이고, 인간 가변 영역은 경쇄 가변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
6.
제5 태양에 있어서, 공통 경쇄, 예컨대 인간 공통 경쇄를 포함하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
7.
제1 태양 내지 제6 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역은 상기 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 재배열된 VJ 영역이고, 인간 가변 영역은 중쇄 가변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
8.
제7 태양에 있어서, 공통 중쇄를 포함하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
9.
제1 태양 내지 제8 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 조류는 VH/VL 계면에서 인간 VL 영역과 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 8개 및 더욱 바람직하게는 적어도 10개의 정전기적 상호작용부를 포함하는 VH 영역을 인코딩하는 기능적 VH 유전자 세그먼트를 포함하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
10.
제2 태양 내지 제9 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 조류는 닭, 칠면조, 뇌조, 신대륙 메추라기, 구대륙 메추라기, 들꿩, 자고새, 꿩, 멧닭, 봉관조과의 새, 거위, 백조, 오리 또는 타조와 같은 닭목인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
11.
제1 태양 내지 제10 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체는 마우스 및/또는 인간 CXCR4, 바람직하게는 인간 CXCR4에 결합하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
12.
제11 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역은 서열 번호 100; 서열 번호 101 또는 서열 번호 102를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이에 대해 적어도 80%, 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
13.
제1 태양 내지 제12 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역은 인간화된 것인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
14.
제3 태양 내지 제13 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 이중특이성 항체인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
15.
제3 태양 내지 제14 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 다중특이성 항체, 예를 들어, 삼중특이성 항체인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
16.
결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체의 제조 방법으로서,
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 상기 동물로부터 단리하는 단계;
- 상기 단리된 핵산 서열로부터 가변 영역을 수득하는 단계; 및
- 상기 동물로부터의 가변 영역을 인간 가변 영역과 페어링하는 단계를 포함하여,
결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 제조하는, 방법.
17.
제16 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물은 VH/VL 계면에서 인간 VL 가변 영역과의 5개, 바람직하게는 8개 및 더욱 바람직하게는 10개의 정전기적 상호작용부를 포함하는 기능적 VH 유전자 세그먼트를 포함하는, 방법.
18.
제16 태양 또는 제17 태양에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열이고 인간 가변 영역은 경쇄 가변 영역인, 방법.
19.
제16 태양 내지 제18 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물로부터 단리된 핵산 서열에 의해 인코딩되는 가변 영역은 재배열된 VDJ 영역이고, 인간 가변 영역은 경쇄 가변 영역인, 방법.
20.
제18 태양 또는 제19 태양에 있어서, 공통 경쇄를 포함하는, 방법.
21.
제1 태양 내지 제18 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물로부터 단리된 핵산 서열에 의해 인코딩되는 가변 영역은 재배열된 VJ 영역이고, 인간 가변 영역은 중쇄 가변 영역인, 방법.
22.
제21 태양에 있어서, 공통 중쇄를 포함하는, 방법.
23.
제16 태양 내지 제22 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물은 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 뇌조, 신대륙 메추라기, 구대륙 메추라기, 들꿩, 자고새, 꿩, 멧닭, 봉관조과의 새, 거위, 백조, 오리 또는 타조와 같은 닭목인, 방법.
24.
제16 태양 내지 제23 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 다량체는 항체이며, 이는 이중특이성 항체인, 방법.
25.
제16 태양 내지 제24 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 다량체는 다중특이성 항체, 예를 들어, 삼중특이성 항체인, 방법.
26.
제16 태양 내지 제25 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물은 적어도 그의 B 세포 계통에 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환 닭인, 방법.
27.
제26 태양에 있어서, 중쇄 또는 경쇄 인코딩 핵산에는 DNA 재배열 및/또는 체세포 과돌연변이에 대한 저항성을 부여하는 수단이 제공되는, 방법.
28.
제27 태양에 있어서, 경쇄 인코딩 핵산의 서열은 인간 VK 서열인, 방법.
29.
파지로서, 그의 게놈 내에:
인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역을 인코딩하는 핵산; 및
인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 파지.
30.
제29 태양에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열이고 인간 가변 영역은 경쇄 가변 영역인, 파지.
31.
제29 태양 또는 제30 태양에 있어서, 파지는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 표시할 수 있고, 상기 가변 영역은 서로 페어링되는, 파지.
32.
제29 태양 내지 제31 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 가변 영역은 서로 페어링되어 결합 도메인을 형성하는, 파지.
33.
제29 태양 내지 제32 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 결합 도메인은 Fab의 형태인, 파지.
34.
제29 태양 내지 제33 태양 중 어느 한 태양에 따른 파지를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리로서, 적어도 약 106개의 파지를 포함하는, 파지 디스플레이 라이브러리.
35.
파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법으로서,
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산을 상기 동물로부터 단리하는 단계; 및
- 상기 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하여,
파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는, 방법.
36.
제35 태양에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열인, 방법.
37.
제35 태양 또는 제36 태양에 있어서, 파지 디스플레이 라이브러리 내의 파지는 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
38.
제35 태양 내지 제37 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산은 상기 핵산을 각각 포함하는 복수의 파지를 제조하는 데 사용되는, 방법.
39.
제35 태양 내지 제38 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 파지 디스플레이 라이브러리는 적어도 하나의 파지를 포함하며, 파지는 그의 게놈 내에
인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역을 인코딩하는 핵산; 및
인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 방법.
40.
제39 태양에 있어서, 가변 영역은 서로 페어링되어 결합 도메인을 형성하는, 방법.
41.
제40 태양에 있어서, 결합 도메인은 Fab의 형태인, 방법.
42.
항원에 결합할 수 있는 제1 태양 내지 제15 태양 중 어느 한 태양에 따른 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 식별하는 방법으로서,
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산을 상기 동물로부터 단리하는 단계; 및
- 상기 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계; 및
- 항원에 결합할 수 있는 파지 디스플레이 라이브러리 내의 파지를 식별하는 단계를 포함하여,
항원에 결합할 수 있는 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 식별하는, 방법.
43.
제42 태양에 있어서, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체는 항원에 결합하는, 방법.
44.
제42 태양 또는 제43 태양에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열인, 방법.
45.
제42 태양 내지 제44 태양 중 어느 한 태양에 있어서, 파지 디스플레이 라이브러리 내의 파지는 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
46.
중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 - 이의 핵산 또는 핵산들은 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득됨 -; 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 핵산들.
47.
제46 태양에 있어서, 폴리펩티드들은 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 형성하도록 페어링될 수 있는, 핵산 또는 핵산들.
48.
제46 태양 또는 제47 태양에 있어서, 핵산 또는 핵산들은 중쇄 가변 영역을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드 - 이들 중 적어도 하나는 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득됨 -; 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 핵산 또는 핵산들.
49.
제48 태양에 있어서, 중쇄 가변 영역을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩티드 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드는 다량체로 조립될 수 있는, 핵산 또는 핵산들.
50.
제49 태양에 있어서, 다량체는 항체, 예를 들어 이중특이적 항체 또는 다중특이성 항체인, 핵산 또는 핵산들.
51.
제46 태양 내지 제50 태양 중 어느 한 태양에 따른 핵산 또는 핵산들을 포함하는 숙주 세포.
52. 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물은 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 뇌조, 신대륙 메추라기, 구대륙 메추라기, 들꿩, 자고새, 꿩, 멧닭, 봉관조과의 새, 거위, 백조, 오리 또는 타조와 같은 닭목인, 제29 태양 내지 제33 태양 중 어느 한 태양에 따른 파지, 제34 태양에 따른 파지 디스플레이 라이브러리, 제35 태양 내지 제41 태양 중 어느 한 태양에 따른 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법, 제42 태양 내지 제45 태양 중 어느 한 태양에 따른 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체의 식별 방법 또는 제46 태양 내지 제50 태양 중 어느 한 태양에 따른 핵산 또는 핵산들 또는 제51 태양에 따른 숙주 세포.
53.
제1 태양 내지 제15 태양 중 어느 한 태양에 따른 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체 및 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
54.
제1 태양 내지 제15 태양 중 어느 한 태양에 따른 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
55.
요법에 의한 인체 또는 동물체의 치료에 사용하기 위한 제1 태양 내지 제15 태양 중 어느 한 태양에 따른 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
56.
의학적 징후를 앓고 있는 인간 또는 동물을 치료하는 방법으로서, 제1 태양 내지 제15 태양 중 어느 한 태양에 따른 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체의 치료적 유효량을 인간 또는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
57.
인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물로서, 적어도 그의 B 세포 계통에 인간 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환 동물인, 동물.
58.
제57 태양에 있어서, 닭, 칠면조, 뇌조, 신대륙 메추라기, 구대륙 메추라기, 들꿩, 자고새, 꿩, 멧닭, 거위, 백조, 오리 또는 타조인, 동물.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 키메라 닭 VH - 인간 VL 항체
면역화된 조류, 바람직하게는 닭, 오리 또는 타조의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 VH 영역 - 이러한 VH 영역은 인간 경쇄 가변 영역, 바람직하게는 cLC를 갖는 다량체를 형성함 - 으로 구성되는 결합 도메인을 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위해, VH 영역은 VL 영역과 페어링될 수 있어야 한다.
본 명세서에서, 면역화된 조류, 바람직하게는 닭의 핵산에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 VH 영역의 레퍼토리가 인간 VL과 안정적으로 페어링될 수 있음이 입증된다. 본 명세서에 예시된 인간 VL은 서열 번호 7; 서열 번호 10; 서열 번호 87; 서열 번호 88; 또는 서열 번호 89에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
항체의 Fab는 함께 페어링될 때 펼쳐지지 않는 결합 도메인 구조를 형성하는 중쇄 및 경쇄 부분을 포함한다. 본 명세서에서, 이러한 구조는 가변 영역이 1차 아미노산 수준에서 낮은 상동성을 갖는 V 유전자 세그먼트에서 유래하는 경우에도 상이한 종으로부터의 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 조합될 때에도 조립될 수 있음이 입증된다.
이들 실시예에서 모든 서열 동일성은 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어(써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))의 얼라인X 구성요소를 사용하여 결정되었다. 2개의 핵산 서열 사이의 서열 동일성 백분율은 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 프로그램 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 얼라인X 응용 프로그램을 사용하여 결정되었으며, 디폴트 설정은 변형된 클러스탈W 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J. (1994) Nuc. Acid Res. 22: 4673-4680]), swgapdnarnt 스코어 매트릭스, 15의 갭 개방 패널티 및 6.66의 갭 연장 패널티를 사용한다. 아미노산 서열은 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 프로그램 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 얼라인X 응용 프로그램을 사용하여 정렬되었고, 디폴트 설정은 변형된 클러스탈W 알고리즘(문헌[Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson T.J., 1994]), blosum62mt2 스코어 매트릭스, 10의 갭 개방 패널티 및 0.1의 갭 연장 패널티를 사용한다.
1. 서열 번호 14의 단일 기능적 닭 VH1 유전자 세그먼트는 도 1에 나타낸 단백질 정렬에서 제시된 바와 같이 인간 VH 유전자 세그먼트와 상동성이다. 기능적 닭 VH1 유전자 세그먼트는 인간 유전자 세그먼트와 단지 낮은 상동성을 갖는다는 것을 알 수 있다. 닭 유전자 세그먼트 및 인간 Fab3178의 서열 번호 1을 갖는 중쇄 가변 영역이 유래되는 인간 VH1-02 유전자 세그먼트(하기 참조)는 도 2에 나타낸 단백질 정렬에서 제시된 바와 같이 단지 43%의 아미노산 동일성을 갖는다. 모든 서열 비교는 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 얼라인X 구성요소를 사용하여 수행하였다.
2. 기능적 닭 JH 유전자 세그먼트의 FW4 영역은 인간 JH 유전자 세그먼트의 상응하는 영역에 상동성이며, 도 3에 나타낸 단백질 정렬에서 제시된 바와 같이 전체 73% 아미노산 동일성을 갖는다.
3. 인간/닭 하이브리드 Fab의 3D 상동성 모델을 서열 번호 1을 갖는 MF3178(PDB 엔트리 5O4O; VH1-02 유래 유전자를 포함함, 문헌[Geuijen et al., 2018]) 및 서열 번호 7을 갖는 VL 영역을 포함하는 인간 Fab의 결정 구조에 기초하여 생성하였다(도 4 참조). 상동성 모델링에 사용되는 알고리즘은 모델러(MODELLER)(https://salilab.org/modeller/)였다.. 모든 구조 분석(모델링 포함)은 디폴트 설정을 사용하는 바이오비아 디스커버리 스튜디오 소프트웨어(Biovia Discovery Studio Software)를 사용하여 수행하였다(http://accelrys.com/products/collaborative-science/biovia-discovery-studio/).
모델에서, 인간 VH 영역을 닭 Fab(PDB 4GLR; 문헌[Shih et al., Shih et al. J. Biological Chemistry 287, 44425-44434, 2012])의 구조에서 가져온 닭 VH 영역의 아미노산 서열에 기초하여 모델링된 VH 영역으로 대체하였다. 닭 Fab PDB 4GLR의 중쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:
AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTLSSYQMMWVRQAPGKGLEWVAGITSRGGVTGYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKPALDSDQCGFPEAGCIDAWGHGTEVTVSS (서열 번호 2)
모델의 분석에 따르면 24개의 비결합 정전기적 상호작용부가 닭 VH와 인간 VL 사이에 존재하는 것으로 나타난 반면, 단지 20개만이 완전 인간 주형에서 확인되었다(도 4a 참조). 이들 상호작용부 중, 10개는 두 구조 사이에서 동일하고, 2개는 동일한 위치에서 발견되는 동등한 또는 상동성 잔기들 사이에 형성된다. 흥미롭게도, 인간 VH-인간 VL 계면과 비교하여 더 많은 수소 결합(6개 대신 12개)이 닭 VH-인간 VL 계면에서 발견되며, 이는 닭 VH-cLC 계면에서의 안정한 상호작용을 나타낸다. 상호작용에 대한 상세한 내용이 도 4a에 나타나있다.
추가로, 닭 VH 서열에 I338T 변이를 도입하였다(서열 번호 2). 이러한 변이는 핵산 수준에서 BstEII 클로닝 부위의 도입을 설명하기 위해 추가되었으며, 아래에 추가로 상세하게 설명되는 바와 같이, 이는 야생형 면역화된 닭 중쇄 레퍼토리의 사용 및 직접 파지 디스플레이 라이브러리로의 이러한 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산의 도입을 용이하게 한다. 핵산 내 I110T 변이 및 BstEII 클로닝 부위의 도입은 Q12와 형성된 수소 결합을 유지한다(도 4b 참조). 참고로, 상동성 모델에서, 위치 12 및 110은 각각 FW1 및 FW4에 있다. 인간 및 닭 Fab(PDB 5O4O 및 4GLR)의 VL-VH 영역의 중첩이 도 4c에 나타나 있다. 1.27 Å의 원자 위치의 평균 제곱근 편차(RMSD)를 갖는 구조들은 CDR 및 루프에 주로 위치한 작은 차이로 유사하다. 전체적으로, 상동성 모델 및 구조 분석은 하이브리드 Fab의 폴딩이 인간 Fab의 폴딩과 유사함을 나타내며, 인간 VH 유전자 세그먼트와 닭 VH 유전자 세그먼트 사이의 상동성이 1차 아미노산 수준에서 낮다는 사실에도 불구하고, 닭 VH 도메인과 인간 VL 도메인 사이의 안정한 상호작용을 입증한다.
MF3178 PDB 엔트리 5O4O를 포함하는 인간 Fab의 에너지 최소화 및 측쇄 최소화된 결정 구조를 기반으로 한 다른 모델에서, 서열 번호 92를 갖는 닭 Fab PDB 4GLR(문헌[Shih et al. J. Biological Chemistry 287, 44425-44434, 2012)의 중쇄 영역을 서열 번호 94; 서열 번호 95; 서열 번호 93; 또는 서열 번호 96을 갖는 인간 경쇄 영역에 대하여 모델링하였으며, 결과가 도 20에 나타나 있다.
모델의 분석에 따르면, 31개의 비결합 정전기적 상호작용부가 닭 VH-인간 CH1과 서열 번호 94의 인간 VL-CL 사이에 존재하는 반면, 50개의 상호작용부가 완전 닭 주형에서 확인되었고, 35개의 상호작용부가 완전 인간 주형에서 확인되었다. 닭 VH-인간 CH1은 서열 번호 95의 인간 VL-CL과 47개의 비결합 정전기적 상호작용부; 서열 번호 93의 인간 VL-CL과 45개의 비결합 정전기적 상호작용부; 및 서열 번호 96의 인간 VL-CL과 44개의 비결합 정전기적 상호작용부를 추가로 갖는다.
이 데이터는 닭 VH 영역이 여러 상이한 인간 VL 영역과 페어링될 수 있음을 나타낸다.
실시예 2. 키메라 오리 VH-인간 VL 항체
닭 중쇄 가변 영역을 인간 공통 경쇄와 직접 페어링하는 능력 및 인간 VH-VL 계면과 비교하여 혼합 VH-VL 계면에서 훨씬 더 많은 수의 안정한 상호작용부를 생성하는 능력을 입증할 때, 추가의 조류 종, 아나스 플라티린코스(Anas platyrynchos(청둥오리))를 닭 VH에 대해 상기에 기재된 바와 같이 모델링하였다.
오리 VH 유전자 세그먼트 XP_021132877.1(서열 번호 12)에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 도 8에 나타낸 단백질 정렬에서 제시된 바와 같이 인간 VH 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에 상동성이다. 오리 추정 기능적 VH 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 가장 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 인간 VH 유전자 세그먼트는 도 9에 나타낸 단백질 정렬에서 제시된 바와 같이 41% 아미노산 동일성을 갖는 인간 VH4-59, VH4-61, VH4-39 및 VH4-31이다. 모든 서열 비교는 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 얼라인X 구성요소를 사용하여 수행하였다.
인간/오리 하이브리드 Fab의 3D 상동성 모델을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 서열 번호 1을 갖는 MF3178(PDB 엔트리 5O4O; VH1-02 유래 유전자를 포함함, 문헌[Geuijen et al., 2018])을 포함하는 인간 Fab의 결정 구조에 기초하여 생성하였다(도 10 참조).
모델에서, 인간 VH를 진뱅크 등록 번호 A46529에서 가져온 오리 VH의 아미노산 서열에 기초하여 모델링된 VH로 대체하였다. 중쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:
AETLDESGGGLVSPGGSLTLVCKGSGFTFSSNEMYWVRQAPGKGLEWVAGITTGGYTGYAPAVKGRFTISRNNGQSTLTLQMNSLKAEDTATYYCAKITGYANCAGYGCAADIDLWGHGTEVTVSS (서열 번호 3)
모델의 분석에 따르면 28개의 비결합 상호작용부가 오리 VH와 인간 VL 계면 사이에 존재하는 것으로 나타난 반면, 단지 20개만이 완전 인간 주형에서 확인되었다(도 10a 참조). 이들 상호작용부 중, 12개는 두 구조 사이에서 동일하고, 1개는 혼합 VH-VL 계면 및 인간 VH-VL 계면 사이의 동일한 위치에서 발견되는 동등한 또는 상동성 잔기들 사이에 형성된다. 인간 VH-인간 VL 계면과 비교하여 더 많은 수소 결합(7개 대신 12개)이 오리 VH-인간 VL 계면에서 발견되며, 이는 오리 VH-cLC 계면에서의 안정한 상호작용을 나타낸다. 상호작용에 대한 상세한 내용이 도 10a에 나타나있다.
인간 및 오리 Fab의 VL-VH 영역의 중첩이 도 10b에 나타나있다. 1.27 Å의 원자 위치의 평균 제곱근 편차(RMSD)를 갖는 구조들은 CDR 및 루프에 주로 위치한 작은 차이로 유사하다. 전체적으로, 상동성 모델 및 구조 분석은 하이브리드 Fab의 폴딩이 인간 MF3178 주형에 대한 중쇄와 유사함을 나타내며, 오리 VH 도메인과 인간 VL 도메인 사이의 안정한 상호작용을 입증한다.
실시예 3. 키메라 타조 VH-인간 VL 항체
닭과 오리는 생물학적 가금(fowl) 목(order)(계통분기(clade) 갤로안세라(Galloanserae)), 즉 순계목(Galliformes) 및 기러기목(Anseriformes)을 나타낸다. 따라서, (다가 다량체 포맷에서 공통 경쇄로서 사용될 수 있는) 인간 경쇄 가변 영역과 직접 페어링되는 (오리 및 닭에 더 멀리 연관된) 비-가금 조류 종, 즉, 타조(스트루티오 카멜루스(Struthio camelus))의 중쇄 가변 영역의 능력을 상기 실시예 1에서 닭 VH에 대해 기술된 바와 같이 모델링하였다.
타조 VH 유전자 세그먼트 XP_009669322.1(서열 번호 13)에 의해 인코딩된 아미노산 서열은 도 5에 나타낸 단백질 정렬에서 제시된 바와 같이 인간 VH 유전자 세그먼트에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에 상동성이다. 타조 VH 유전자 세그먼트의 인코딩된 아미노산과 가장 높은 상동성을 갖는 아미노산을 인코딩하는 인간 VH 유전자 세그먼트는 도 6에 나타낸 단백질 정렬에서 제시된 바와 같이 76.5% 아미노산 동일성을 갖는 인간 VH3-73 및 VH3-23이다. 모든 서열 비교는 디폴트 설정을 사용하는 벡터 NTI 어드밴스 11.5.2 소프트웨어의 얼라인X 구성요소를 사용하여 수행하였다.
인간/타조 하이브리드 Fab의 3D 상동성 모델을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 서열 번호 1을 갖는 MF3178(PDB 엔트리 5O4O; VH1-02 유래 유전자를 포함함, 문헌[Geuijen et al., 2018])을 포함하는 인간 Fab의 결정 구조에 기초하여 생성하였다(도 7 참조).
모델에서, 인간 VH를 진뱅크 등록 번호 AFN02388에서 가져온 타조 VH의 아미노산 서열에 기초하여 모델링된 VH로 대체하였다. 중쇄 가변 영역 서열은 하기와 같다:
AVQLVESGGGLQQPGGSLRLSCKGTGFTLSSFGMSWIRQAPGKGLEPVAGISSSGSDTYYADAVQGRFTISRDNGQSTLYLQMNGLKAEDTATYYCAKCATDWGSCGPWNLDAWGRGASVTVSS (서열 번호 4)
모델의 분석에 따르면 14개의 비결합 상호작용부가 타조 VH와 인간 VL 계면 사이에 존재하는 것으로 나타났다(도 7a 참조). 이들 상호작용부 중, 7개는 두 구조 사이에서 동일하고, 1개는 인간 VH 및 VL 계면의 동일한 위치에서 발견되는 동등한 또는 상동성 잔기들 사이에 형성된다. 인간 VH-인간 VL 계면과 비교하여 대략 동일한 수의 수소 결합(7개 대신 6개)이 타조 VH-인간 VL 계면에서 발견되며, 이는 타조 VH-cLC 계면에서의 안정한 상호작용을 나타낸다. 상호작용에 대한 상세한 내용이 도 7a에 나타나있다.
인간 및 타조 Fab의 VL-VH 영역의 중첩이 도 7b에 나타나있다. 1.27 Å의 원자 위치의 평균 제곱근 편차(RMSD)를 갖는 구조들은 CDR 및 루프에 주로 위치한 작은 차이로 유사하다. 전체적으로, 상동성 모델 및 구조 분석은 하이브리드 Fab의 폴딩이 인간 Fab의 폴딩과 유사함을 나타내며, 인간 VH 유전자 세그먼트와 타조 VH 유전자 세그먼트 사이의 상동성이 1차 아미노산 수준에서 낮다는 사실에도 불구하고, 타조 VH 도메인과 인간 VL 도메인 사이의 안정한 상호작용을 입증한다.
전체적으로, 실시예 1 내지 실시예 3은 닭, 오리 및 타조로부터의 V 유전자 세그먼트가 1차 아미노산 수준에서 인간 V 유전자 세그먼트와 상대적으로 낮은 상동성을 공유함에도 불구하고, 닭과 인간 가변 영역, 오리와 인간 가변 영역 및 타조와 인간 가변 영역 사이에 3차 구조 수준에서 상당한 양의 상동성이 존재함을 입증한다. 실제로, 오리는 1차 아미노산 수준에서 인간 V 유전자 세그먼트에 대해 닭보다 더 낮은 상동성을 갖지만, (닭과 비교하여) 인간 cLC와의 모델링된 접촉점이 훨씬 더 많으며, 이는 더 높은 정도의 3차 구조 상동성을 나타낸다. 반면에, 타조는 1차 아미노산 수준에서 인간 V 유전자 세그먼트에 대해 닭보다 더 높은 상동성을 갖지만, (닭과 비교하여) 인간 cLC와의 모델링된 접촉점이 더 적다. 따라서, 재배열된 가변 영역들 사이에 안정한 결합 도메인이 형성될 수 있다.
실시예 4: 파지 디스플레이 라이브러리 생성에 사용하거나 숙주 세포에 도입하기 위한 벡터 내로 닭 VH 영역을 도입하기 위한 프라이머의 생성
NCBI 데이터베이스에 등록 번호 M30319로 저장된 단일 기능적 VH 유전자 세그먼트(VH1)를 포함하는 단편(도 11 참조), 및 단일 기능적 JH 유전자 세그먼트를 포함하는 단편(등록 번호 M30320; 도 12 참조)을 포함하여, 상업용 육계(CB) 근교 계통의 게놈 닭 중쇄 유전자좌 서열이 공개되어 있다(문헌[Reynaud et al., Cell 59, 171-183, 1989]).
닭은 단지 하나의 기능적 VH 유전자 세그먼트 및 1개의 기능적 JH 유전자 세그먼트를 포함하기 때문에, 단일 정방향 프라이머 및 단일 역방향 프라이머가 면역화된 닭으로부터 VH 영역 서열을 증폭하기에 충분하다.
chVH-FW로 명명된 정방향 프라이머를 하기와 같이 설계하였다:
5'GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGCCGTGACGTTGGACGAGTCC-3' (서열 번호 15).
chVH-RV로 명명된 역방향 프라이머를 하기와 같이 설계하였다:
5'-GGAGGAGAC G G TGAC C TCGGTCCC-3' (서열 번호 16)
실시예 6에 상세히 기재된 바와 같이, 프라이머 chVH-FW 및 chVH-RV를 사용하여 huPD-1로 면역화된 닭으로부터의 VH 영역을 증폭시키고, 이어서 증폭된 VH 영역을 인간 CH1 유전자 및 인간 cLC를 함유하는 벡터 MV1511 내로 클로닝함으로써 Fab 파지 디스플레이 라이브러리를 제조한다. 이들 라이브러리를 사용하여 실시예 6에 제시된 바와 같은 항-huPD-1 Fab 패널을 생성한다.
실시예 5: 인간 PD-1을 사용한 야생형 닭의 면역화
닭의 DNA 면역화가 수행될 수 있도록 인간 PD-1(huPD-1)의 적어도 일부를 인코딩하는 핵산을 포함하는 적합한 발현 벡터를 생성할 수 있다.
huPD-1을 인코딩하는 핵산은 아래에 서열 번호 17로 제시되어 있다. 그러나, 이 서열은 닭에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있고, 단지 huPD-1의 세포외 도메인만이 발현되도록 서열의 일부만 사용될 수 있다. 세포외 도메인의 발현에 적합한 적합 코돈 최적화된 핵산 서열은 서열 번호 18에 제시되어 있다.
발현 벡터는 면역화 후 닭에서 huPD-1 폴리펩티드의 구동 발현에 적합한 프로모터와 같은 적절한 제어 요소를 포함할 수 있다.
서열 번호 17
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTCCCGGGCCGCACGAGGGACAATAGGAGCCAGGCGCACCGGCCAGCCCCTGAAGGAGGACCCCTCAGCCGTGCCTGTGTTCTCTGTGGACTATGGGGAGCTGGATTTCCAGTGGCGAGAGAAGACCCCGGAGCCCCCCGTGCCCTGTGTCCCTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTGTCTTTCCTAGCGGAATGGGCACCTCATCCCCCGCCCGCAGGGGCTCAGCTGACGGCCCTCGGAGTGCCCAGCCACTGAGGCCTGAGGATGGACACTGCTCTTGGCCCCTCTGATGA
서열 번호 18
GGATCCCCAGGATGGTTCCTGGATAGCCCCGACAGACCATGGAACCCACCAACATTCAGCCCCGCTCTGCTGGTGGTTACCGAGGGCGATAACGCCACCTTCACATGCAGCTTCAGCAACACCAGCGAGAGCTTCGTGCTGAACTGGTACAGAATGAGCCCCAGCAACCAGACCGACAAGCTGGCTGCTTTCCCCGAGGATAGAAGCCAGCCAGGCCAGGACTGCAGATTCAGAGTGACACAGCTGCCCAACGGCAGAGACTTCCACATGTCTGTTGTGCGCGCCAGAAGAAACGACAGCGGCACATATCTGTGCGGCGCCATTAGCCTGGCTCCAAAGGCTCAGATCAAAGAGAGCCTGAGAGCCGAGCTGAGAGTGACAGAGCGCAGAGCTGAAGTGCCCACAGCTCACCCATCTCCATCTCCAAGACCAGCCGGCCAGTTCCAGACACTGGTGCTCGAG
면역화를 위해, 예를 들어 적합한 보조제에 부착함으로써 huPD-1 발현 벡터를 제조할 수 있다. 이어서, 닭, 전형적으로 흰색 레그혼 닭을 huPD-1 DNA로 면역화한다. 면역화는 유전자 총을 사용하여 연속 4주 동안 매주(0일차, 7일차, 14일차 및 21일차에) (보조제 없이) 근육내 또는 피내로 수행될 수 있다. 적합한 양의 DNA, 예를 들어 120 ㎍의 DNA가 각각의 면역화 시점에 적용될 수 있다. 따라서, 1차 면역화는 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 부스터 면역화로 수행될 수 있다. 유전자 총에 의한 닭의 면역화는, 예를 들어 문헌[Witkowski et al., J. Immunol. Methods. 2009;341:146-153]에 기재되어 있다.
0일차에, 면역화된 닭 한 마리당 하나의 알 또는 혈청을 면역전 샘플로서 수집한다. 세 번째 또는 네 번째 부스터 면역화 후, 예를 들어, 하루에 닭 한 마리당 하나의 알 또는 혈청을 수일 동안 수집할 수 있다. 필요한 경우/원하는 경우, 8회 면역화 후 또는 심지어 12회 면역화 후에 알/혈청을 수집할 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여, 혈청 또는 수집된 알의 난황으로부터 IgY 항체를 단리할 수 있다.
IgY가 예를 들어 FACS 분석에 따른 명확한 huPD-1 반응성을 나타내는 닭의 경우, 비장 세포 및 골수 세포를 단리할 수 있으며, 즉 표적 단백질에 대해 상당한 체액성 반응이 관찰되는 닭으로부터 비장 및 골수를 제거한다. 이어서, 비장 및 골수 세포 둘 모두로부터 세포 현탁액을 생성하고, 후속적으로 이들 세포를 트라이졸 LS 시약(Trizol LS Reagent)(써모 사이언티픽 c#10296028)에 용해시키고, 사용 시까지 -80℃에서 저장하여, 존재하는 단백질을 변성시키는 한편, 닭 VH 또는 VL 영역의 레퍼토리를 인코딩하는 핵산의 추출을 가능하게 한다.
FACS 및 ELISA를 사용하여 HuPD-1과의 IgY 반응성을 분석할 수 있다. FACS는 표적 세포로서의 huPD-1을 인코딩하는 발현 벡터, 음성 대조군 세포로서의 비-형질감염 세포, 양성 대조군 항체로서의 항-PD-1 항체, 및 음성 대조군으로서의 항-파상풍 톡소이드(TT) 항체로 일시적으로 형질감염된 적합한 세포를 포함할 수 있다. 인간 IgG를 검출하기 위한 이차 항체로서, PE-접합된 염소 항-인간 IgG(인비트로젠, 카탈로그 번호 H10104)가 사용될 수 있다. 닭 IgY를 검출하기 위한 이차 항체로서, PE-접합된 염소 항-닭 IgY(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 카탈로그 번호 103-117-008)가 사용될 수 있다.
실시예 6: 비장 및 골수(BM)로부터의 라이브러리 생성
닭 VH 영역과 인간 VL 영역의 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위하여, 예를 들어 실시예 5에 기재된 프로토콜에 따라 생성된 huPD-1 면역화된 닭의 비장 및 골수 세포로부터의 트라이졸 샘플을 사용하여 개별 라이브러리를 생성하였다. 샘플을 사용하여 RNA를 단리하고, 이어서 올리고(dT) 프라이머를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 후속 PCR 반응을 위한 충분한 물질을 생성하기 위해 다회의 반응을 수행할 수 있다.
이어서, 생성된 cDNA 샘플을 주형으로서 사용하여 본질적으로 문헌[Marks et al. (J. Mol. Biol. 222(3), 581-97, 1999)]에 기재된 바와 같이 2개의 닭-특이적 프라이머 chVH-FW 및 chVH-RV(도 13 내지 도 16 및 서열 번호 참조)를 사용하여 VH 유전자를 증폭시키고 후속적으로 분해하였다.
각각의 cDNA 샘플에 대해, 후속 단계들을 위해 충분한 PCR 산물을 생성하기 위해 다회의 PCR을 병렬로(모두 chVH-FW 및 chVH-RV를 사용함) 수행할 수 있다. 10회 초과 또는 심지어 20회 초과의 PCR이 필요할 수 있다.
이 절차는 3 ng/μl의 최소 농도에서 각각의 cDNA 샘플에 대해 적어도 20 ng의 정제되고 분해된 VH 삽입물을 생성하기 위해 의도된다.
파지 디스플레이 라이브러리를 플레이트-기반 프로토콜에 따라 제조하였다. 요약하면:
모든 Fab에 사용된 서열 번호 5의 경쇄가 벡터에 의해 인코딩된다는 점을 제외하고는, 본질적으로 문헌[de Haard et al. (J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18218-30)]에 기재된 바와 같이 파지 상의 Fab 단편의 표시를 위한 파지미드 벡터에서 PCR 산물을 클로닝하였다.
VH 영역을 인코딩하는 핵산을 SfiI/BstEII-분해된 벡터 내로 라이게이션시키고, 생성된 라이게이션된 벡터를 TG1 세포로 형질전환시켜 라이브러리당 1E6 cfu(콜로니 형성 단위) 초과를 산출해야한다.
각각의 라이브러리에 대한 클론들의 서브세트에 대해 콜로니 PCR을 수행하여 VH 삽입 빈도를 결정할 수 있다. 또한 라이브러리당 클론들의 서브세트에 대해 DNA 서열분석을 수행하여 VH 서열 다양성을 결정할 수 있다.
실시예 7: Fab 검증
생성될 모든 라이브러리에 대해, 다수의 무작위 클론을 선발(pick)하고 본질적으로 문헌[J. Mol. Bio. 222(3), 581-97, 1991] 및 [J. Biol. Chem. 274(26), 18218-30, 1999]에 따라 가용성 Fab를 제조하는 데 사용하였다. 완전 인간 클론이 참조로서 포함된다. 이 절차는 가용성 Fab를 함유하는 비정제된 주변세포질 추출물을 생성한다.
Fab가 잘 생성되고 단백질 L에 의해 결합될 수 있는지를 확인하기 위해, 기기에 연결된 별도의 컴퓨터에서 옥텟(Octet) 소프트웨어로 제어되는 옥텟 기기를 포함하는 포르테바이오(
) 옥텟-QKe 시스템을 사용할 수 있다. 바이오-층 간섭법(Bio-Layer Interferometry; BLI)을 기반으로 하는 이 시스템은 생체 분자 상호작용의 실시간 정량화 및 동력학적 특성화를 가능하게 하며 실질적으로 제조자의 지침에 따라 사용된다(자세한 내용은 www.fortebio.com 참조). Fab의 정량화는 단백질 L 바이오센서(문헌[
, part. no. 18-5085])를 사용하여 수행된다.
SDS-PAGE 겔 상에서 직접 Fab를 분석할 수 있도록 NAb™ 단백질 L. 스핀 키트(Spin Kit)를 사용하여 상청액으로부터 Fab를 정제하였다. 상청액 및 단백질 L 정제된 샘플의 농도를 측정하였다.
비정제된 Fab의 농도는 일반적인 범위, 약 50 ㎍/ml였다. 이는 닭 VH 및 인간 VL을 포함하는 Fab가 정상 발현 수준을 초래함을 나타낸다.
단백질 완전성을 확인하기 위하여, Fab에 대해 NuPAGE 4-12% 비스-트리스(Bis-Tris) 겔을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 인간 IgG의 CH1 도메인을 인식하는 HRP-표지된 마우스 항체(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 카탈로그 번호 555788)를 검출 항체로서 사용한다. 비-환원 조건에서, 온전한 Fab에 대해서는 닭 중쇄와 인간 공통 경쇄의 올바른 페어링을 입증하는 약 50 kD의 단일 밴드가 예상되는 반면, 환원 조건에서 Fab의 중쇄 단편에 대해서는 약 25 kD의 밴드가 예측된다.
도 21은 정제된 키메라 Fab 및 서열 번호 98의 인간 대조군 Fab가 유사한 결과를 제공함을 보여주며, 이는 키메라 Fab의 올바른 중쇄-경쇄 페어링을 나타낸다. 이러한 Fab의 비-환원된 샘플은 온전한 Fab에 대한 50 kD의 밴드에 더하여 25 kD의 밴드를 함유한다. 25 kD 크기는 단백질 L 정제의 결과로서의 페어링되지 않은 경쇄와 일치한다. 단백질 L 정제는 온전한 Fab와 페어링되지 않은 경쇄의 비를 변경시킬 수 있다. 따라서, 이러한 결과는 검출을 위해 ProtL-HRP (Ab108) 및 α-myc (Ab217)를 사용하는 웨스턴 블로팅에 의해 추가로 확인되었다. 결과가 도 23에 나타나 있다. 키메라 Fab는 서열 번호 98의 인간 대조군과 유사한 결과를 제공하며, 이로써 키메라 Fab의 중쇄 및 경쇄의 올바른 페어링이 확인된다. 온전한 Fab를 나타내는 50 kD의 예상 밴드가 모든 Fab에 대해 존재한다.
실시예 8: 면역화된 닭 라이브러리로부터의 PD-1 Fab의 선택
파지 디스플레이 라이브러리 구출
실시예 6에서 생성된 모든 라이브러리는 이 실시예에서 파지 디스플레이 선택 동안 개별적으로 사용된다.
이 실시예에서 사용된 모든 라이브러리는 하룻밤 성장 후 박테리아를 수확함으로써 구출될 수 있고, 파지는 확립된 프로토콜에 따라 제조될 수 있다(문헌[de Haard et al., J. Biol. Chem., 274(26), 18218-30, 1999]).
파지 디스플레이 선택
예를 들어, 본 실시예에 기재된 바와 같이, 파지를 선택하기 위해 여러 가지 상이한 선택 전략(각각 huPD-1 및 moPD-1에 대해 재조합 단백질 및 세포 선택)을 구현할 수 있다.
모든 선택 전략에 대해, 한 라운드의 선택을 수행할 수 있다. 농축이 관찰되지 않은 경우, 또는 스크리닝 중 적중률이 20% 미만인 경우, 제2 라운드 선택을 수행할 수 있다. 이러한 제2 라운드 선택은 제1 라운드와 동일한 선택 전략을 사용하거나 상이한 포맷을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, huPD-1 재조합 단백질 상에서 제1 라운드 후에, huPD-1 재조합 단백질 상에서, 또는 moPD-1 재조합 단백질 상에서, 또는 심지어 세포-발현된 huPD-1 또는 moPD-1 상에서 다시 제2 라운드를 수행할 수 있다.
재조합 단백질 패닝 선택
여러 종으로부터 PD-1에 융합된 huFc로 이루어진 재조합 단백질뿐만 아니라 비오티닐화된 PD-1 융합 단백질이 선택에 사용하기 위해 표 1에 열거되어 있다. 패닝 선택은 킹피셔 플렉스(KingFisher Flex)를 사용하여 수행된다.
킹피셔 플렉스 자기 입자 프로세서는 마이크로플레이트 포맷에서의 자기 입자의 자동 전달 및 처리를 위해 설계된다. 킹피셔 플렉스 시스템의 기술은 플레이트 및 일회용의 특수하게 설계된 팁 콤(tip comb)으로 덮인 자기 막대의 사용을 기반으로 한다(문헌[Kontermann R. and Dubel S. (2010) Antibody Engineering Vol. 1, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, p270] 참조).
파지 디스플레이 선택은 본질적으로 제조자의 지침에 따라 킹피셔 플렉스를 사용하여 반-자동화된 형태로 수행된다. 2가지 상이한 선택 포맷이 여기에서 설명된다: 1) "용액 내" 선택, 즉 가용성 재조합 단백질 상에서의 선택; 및 2) 비오티닐화된 세포 선택. 항원은 전형적으로 바이오티닐화되고, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 또는 항-비오틴 항체로 코팅된 자기 비드 상에 포획된다.
재조합 비오티닐화된 huPD-1 및 moPD-1, 예를 들어 구매가능한 huPD-1-huFc-비오틴 및 moPD-1-moFc-비오틴(표 1 참조)은 5, 0.5 및 0 ㎍/ml으로 사용할 수 있다(후자는 음성 대조군으로서 사용됨).
재조합 단백질의 huFc 도메인에 특이적인 결합자의 선택을 피하기 위해, 100 ㎍/ml의 hulgG(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 4506)를 라이브러리 인큐베이션 중에 용액에 첨가한다.
결합된 파지를 1 mg/ml 트립신을 사용하여 용출시킨다.
그 후, 킹피셔로부터의 용출 샘플을 5 μl의 4 mg/ml AEBSF(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 카탈로그 번호 A8456)를 함유하는 둥근 바닥 96-웰 플레이트의 열로 옮겨 트립신을 비활성화한다.
스팟 방법에 의한 파지 적정을 사용하여 선택의 농축/출력 역가를 결정할 수 있다. 간단히 말해서, 박테리아를 용출된 파지의 희석 시리즈로 감염시킨 다음, 적절한 항생제를 함유하는 한천 플레이트에서 이들의 방울을 스팟팅하고, 하룻밤 배양 후 출력 역가를 나타내는 콜로니 수를 계수한다.
[표 1]
세포 선택
세포 선택은 하기의 비고/변경 사항과 함께 본질적으로 제조자의 지침에 따라 킹피셔를 사용하여 수행된다:
o
huPD-1을 검출하기 위해, huPD-1을 인식하는 마우스 항체(아브캄(Abcam), 카달로그 번호 ab52587)를 1차 항체로 사용할 수 있으며, PE-접합된 염소 항-moIgG(인비트로젠, 카탈로그 번호 M30004-4)를 2차 항체로 사용할 수 있다.
o
moPD-1을 검출하기 위해, PE-접합된 래트 항-moPD-1 항체(ITK-다이아그노스틱스(ITK-Diagnostics), 카탈로그 번호 109103; 메루스(Merus) Ab0285)를 사용할 수 있다.
[표 2]
스크리닝
클론을 무작위로 선발하고 파지로서 스크리닝한다. 스크리닝은 세포-발현된 huPD-1 또는 moPD-1 상에서 FACS에 의해 수행되는데, 이는 이들이 가장 관련성이 높은 항원 포맷이기 때문이다(재조합 PD-1 단백질에 대한 ELISA에 의한 스크리닝은 세포-발현된 PD-1에 결합하지 않는 클론을 초래할 수 있다).
마스터 플레이트 선발 및 파지 생성
o
음성 대조군으로서, MF1025(항-타이로글로불린 Fab 도메인을 함유하는 파지)를 각 플레이트의 하나의 웰에 접종할 수 있다.
o
각각의 MP의 하나의 웰은 블랭크(박테리아 없음)로 남겨지고, 이는 하기에 기재된 바와 같이 FACS 스크리닝 동안 양성 대조군 항체를 추가하는 데 사용된다.
FACS를 사용한 파지 스크리닝
huPD-1 또는 moPD-1을 인코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질감염된 프리스타일 293-F 세포를 사용하여 파지 FACS를 수행한다. PD-1 발현을 확인하기 위해 하나의 웰을 시판 양성 대조군 항체(표 2)에 사용한다: huPD-1을 검출하기 위해, huPD-1을 인식하는 마우스 항체(아브캄, 카달로그 번호 ab52587)를 1차 항체로 사용할 수 있으며, PE-접합된 염소 항-moIgG (인비트로젠, 카탈로그 번호 M30004-4)를 2차 항체로 사용할 수 있고; moPD-1을 검출하기 위해, PE-접합된 래트 항-moPD-1 항체(ITK-다이아그노스틱스, 카탈로그 번호 109103)를 사용할 수 있다.
서열분석
FACS에서 huPD-1 및/또는 moPD-1에 특이적으로 결합하는 모든 클론의 VH 유전자를 서열분석한다. 서열은 그들의 CDR3 서열에 따라 분석되고 그룹화된다.
실시예 9: 이중특이성 키메라 닭 VH/인간 VL 항체를 발현하는 숙주 세포의 생성
적어도 하나의 키메라 닭 VH-인간 VL을 갖는 이중특이성 항체는 하나의 경쇄 및 이중특이성 항체의 효율적인 이종이량체화 및 형성을 보장하도록 CH3 조작된 2개의 상이한 중쇄를 인코딩하는 플라스미드 또는 플라스미드들의 (일시적) 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 단세포에서의 이들 사슬의 생성은 단일특이성 항체의 형성에 비하여 이중특이성 항체의 유리한 형성으로 이어진다.
따라서, 2개의 상이한 VH를 인코딩하는 핵산을, 이중특이성 항체가 단일 세포에서 발현될 수 있도록 재배열된 huVK1-39 경쇄와 함께 적합한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. VH 영역의 핵산 중 하나 또는 둘 모두는 닭 기원의 것이고 나머지는 인간 기원의 것일 수 있으며, 예를 들어, 1-아암(arm) 닭 VH-인간 VL 및 나머지의 인간 또는 2-아암 닭 VH-인간 VL 또는 임의의 다른 순열일 수 있다.
본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제13/866,747호(현재 미국 특허 제9,248,181호로 허여됨), 미국 특허 출원 제14/081,848호(현재 미국 특허 제9,358,286호로 허여됨) 및 PCT/NL2013/050294호 (국제 특허 출원 공개 WO2013/157954호로 공개됨)에는, 양립가능한 이종이량체화 도메인을 사용하여 이중특이성 항체를 생성하기 위한 방법 및 수단이 개시되어 있다. 이들 수단 및 방법은 또한 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 이중특이성 항체는 바람직하게는 본질적으로 단지 이중특이성 전장 IgG 분자만을 생성하기 위한 돌연변이를 포함한다. 바람직한 돌연변이는 제1 CH3 도메인 내의 아미노산 치환 L351K 및 T366K(EU 넘버링)('KK-변이체' 중쇄) 및 제2 도메인 내의 아미노산 치환 L351D 및 L368E('DE 변이체' 중쇄)이거나, 또는 역으로도 성립된다. 본 출원인의 미국 특허 제9,248,181호 및 미국 특허 제9,358,286호뿐만 아니라 PCT 출원인 WO2013/157954호에서, DE-변이체와 KK-변이체가 우선적으로 페어링하여, 이종이량체(이른바, 'DEKK' 이중특이성 분자)를 형성하는 것으로 이미 입증되었다. DE-변이 중쇄들의 동종이량체화(DEDE 동종이량체)는 동일한 중쇄들 사이의 CH3-CH3 계면에서의 하전된 잔기들 사이의 강한 반발력으로 인해 거의 발생되지 않는다.
이러한 접근법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 본 발명에 사용하기에 적합한 임의의 동물에 적용될 수 있다.
실시예 10: 마우스 CXCR4를 사용한 야생형 닭의 면역화
CXCR4는 GPCR 클래스 A, 서브패밀리 A1의 케모카인 수용체이다. 이는 세포외 N-말단 및 세포내 C-말단을 갖는 7개의 막관통 나선을 갖는다. 이러한 토폴로지는 4개의 세포외 도메인을 생성한다. 마우스 상동체는 인간 CXCR4와 91%의 전체 상동성을 공유하며, 세포외 도메인과 67%의 상동성을 공유한다. 닭 상동체는 인간 CXCR4와 82%의 전체 상동성을 공유하며, 세포외 도메인과 48%의 상동성을 공유한다.
DNA와 리포입자 면역화의 조합을 사용하여 5마리의 닭을 마우스 CXCR4로 면역화하였다. 야생형 전장 서열 마우스 CXCR4(서열 번호 99)는 인테그랄 몰레큘라(Integral Molecular)에 의해 합성되고 클로닝되었다. 플라스미드의 검증은 일시적으로 형질감염된 HEK293 및 QT6 세포의 유세포 분석법에 의해 수행하였으며, 여기서 Mab21651(알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 검출을 위해 사용하였다.
혈액, 골수, 및 비장으로부터의 B 세포를 항체 반응이 가장 높은 닭으로부터 단리하였다. RNA를 백혈구로부터 추출하고, DNA로 합성하고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 DNA를 PCR에 의해 증폭하였다. 증폭된 VH 및 VL 산물을 MV1511 벡터 내로 클로닝하고(도 18), Fab 파지미드를 생성하였다. DNA를 박테리아로 형질전환시켜 파지 라이브러리를 생성하였으며, 여기서 파지는 서열 번호 5의 인간 경쇄를 발현한다.
Fab 파지 라이브러리를 마우스 CXCR4 리포입자 상에서 패닝하였다. 클론을 리포입자 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 결합자를 서열분석하고, CDR3 상동성에 기초하여 패밀리들로 그룹화하였다. 3개의 VHCDR3 패밀리로부터의 Fab를 자연적으로 폴딩된 마우스 CXCR4를 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 유세포 분석법에 의해 검증하였다. 후속하여, 유세포 분석법에 의해 이들 패밀리를 인간 CXCR4에 대한 결합에 대해 시험하였다. 양성 클론을 표준 방법에 따라 IgG 포맷으로 재클로닝하였다. 인간 및 마우스 CXCR4와 교차 반응성인 3개의 VHCDR3 패밀리를 확인하였다. 결과가 도 25에 나타나 있다. 마우스 및 인간 CXCR4 결합 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 31, 서열 번호 32 및 서열 번호 33에 제시되어 있다.
기능적으로 페어링된 중쇄 및 경쇄를 사용하여 닭 VH 및 인간 VL을 포함하는 항원-특이적 키메라 항체를 생성하였다.
[표 3]
SEQUENCE LISTING
<110> Merus N.V.
<120> MIXED BINDING DOMAINS
<130> P121898PC00
<140> PCT/NL2019/050877
<141> 2019-12-27
<150> EP 18215995.4
<151> 2018-12-31
<160> 102
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH region of MF3178
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Gly Ser Arg His Phe Trp Ser Tyr Trp Gly Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of the chicken Fab region PDB 4GLR
<400> 2
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gln Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Ser Arg Gly Gly Val Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Ala Leu Asp Ser Asp Gln Cys Gly Phe Pro Glu Ala Gly
100 105 110
Cys Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 126
<212> PRT
<213> Anas platyrhynchos
<400> 3
Ala Glu Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Val Cys Lys Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Glu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Thr Gly Gly Tyr Thr Gly Tyr Ala Pro Ala Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Gly Gln Ser Thr Leu Thr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Ile Thr Gly Tyr Ala Asn Cys Ala Gly Tyr Gly Cys Ala Ala Asp
100 105 110
Ile Asp Leu Trp Gly His Gly Thr Glu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> Struthio camelus
<400> 4
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Gly Thr Gly Phe Thr Leu Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Pro Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ala Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Cys Ala Thr Asp Trp Gly Ser Cys Gly Pro Trp Asn Leu Asp
100 105 110
Ala Trp Gly Arg Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human kappa light chain IgVk1-39*01/IGJk1*01
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain variable region - IGKV1-39/jk1
<400> 6
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctacttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccaac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain variable region - IGKV1-39/jk1
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain constant region
<400> 8
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain constant region
<400> 9
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 10
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain variable domain - IGKV1-39/jk5
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain variable domain V gene segment - IGKV1-39
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 12
<211> 100
<212> PRT
<213> Anas platyrhynchos
<400> 12
Asn Ile Lys Met Val Ala Ser Gly Pro Lys Glu Gly Lys Ile Leu Gly
1 5 10 15
Ser Leu Pro Leu Thr Cys Thr Val Ile Gly Ala Pro Leu Asp Ser Pro
20 25 30
Arg Tyr Asp Trp Asn Tyr Val Arg Leu Ala Pro Thr Gly Glu Leu Gln
35 40 45
Phe Leu Ala Trp Val Tyr Pro Phe Gly Asn Asn Thr Gly Tyr Ala Pro
50 55 60
Pro Phe Gln Ser Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ala Lys Lys Lys
65 70 75 80
Val Ser Leu Gln Leu His Ala Leu Thr Ala Val Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Phe Cys Ala Arg
100
<210> 13
<211> 98
<212> PRT
<213> Struthio camelus
<400> 13
Ala Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Arg Gln Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Gly Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Asn Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Pro Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 14
<211> 101
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 14
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asp Asn Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Ala Gly
100
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chVH-FW primer
<400> 15
gtcctcgcaa ctgcggccca gccggccatg gccgccgtga cgttggacga gtcc 54
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chVH-RV primer
<400> 16
ggaggagacg gtgacctcgg tccc 24
<210> 17
<211> 870
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540
ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600
ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660
gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720
tgtgtccctg agcagacgga gtatgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780
tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840
gatggacact gctcttggcc cctctgatga 870
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<211> 462
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human PD-1 codon-optimized for expression in chicken
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ggatccccag gatggttcct ggatagcccc gacagaccat ggaacccacc aacattcagc 60
cccgctctgc tggtggttac cgagggcgat aacgccacct tcacatgcag cttcagcaac 120
accagcgaga gcttcgtgct gaactggtac agaatgagcc ccagcaacca gaccgacaag 180
ctggctgctt tccccgagga tagaagccag ccaggccagg actgcagatt cagagtgaca 240
cagctgccca acggcagaga cttccacatg tctgttgtgc gcgccagaag aaacgacagc 300
ggcacatatc tgtgcggcgc cattagcctg gctccaaagg ctcagatcaa agagagcctg 360
agagccgagc tgagagtgac agagcgcaga gctgaagtgc ccacagctca cccatctcca 420
tctccaagac cagccggcca gttccagaca ctggtgctcg ag 462
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
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<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 20
gccgtgacgt tggacgagtc c 21
<210> 21
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-02 (DP-75)
<400> 21
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1 5 10 15
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20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-02 (DP-8)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-08 (DP-15)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-46 (DP-7)
<400> 24
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-03 (DP-25)
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-18 (DP-14)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-45 (DP-4)
<400> 27
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1 5 10 15
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20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg
<210> 28
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-58 (DP-2)
<400> 28
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Ala Val Gln Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Val Val Gly Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Ala
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<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-69 (DP-10)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg
<210> 30
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-e (DP-88)
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 31
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-24 (DP-5)
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
<210> 32
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH1-f (DP-3)
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Val Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr
<210> 33
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH7-81
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly His Glu Val Lys Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Pro Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Phe Asn Thr Tyr Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Met Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
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<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH5-51 (DP-73)
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Ala Arg
<210> 35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH2-05
<400> 35
Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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65 70 75 80
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100
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH2-70 (DP-28)
<400> 36
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
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Cys Ala Arg Ile
100
<210> 37
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH2-26 (DP-26)
<400> 37
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Ala
20 25 30
Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
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Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
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Cys Ala Arg Ile
100
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<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH4-04
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg
<210> 39
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH4-59 (DP-71)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Arg
<210> 40
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH4-61 (DP-66)
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
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<210> 41
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH4-39 (DP-79)
<400> 41
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Arg
<210> 42
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH4-31 (DP-65)
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg
<210> 43
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH4-28 (DP-68)
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
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Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 44
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH4-34 (DP-63)
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 45
<211> 101
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH6-01 (DP-74)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 46
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-15 (DP-38)
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr
100
<210> 47
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-49
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile
65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg
100
<210> 48
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-72 (DP-29)
<400> 48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20 25 30
Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg
100
<210> 49
<211> 100
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-73
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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85 90 95
Tyr Cys Thr Arg
100
<210> 50
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-16
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Asp Met Asn Trp Ala Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Lys Asn Arg Arg Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg
<210> 51
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-35 (DP-59)
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Asp Met Asn Trp Val His Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Val Ser Trp Asn Gly Ser Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Thr Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg
<210> 52
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-09 (DP-31)
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp
<210> 53
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-20 (DP-32)
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 54
<211> 99
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-43 (DP-33)
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Val Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp
<210> 55
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-07 (DP-54)
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 56
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-30 (DP-49)
<400> 56
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 57
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-33 (DP-50)
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 58
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-74 (DP-53)
<400> 58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val
35 40 45
Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 59
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-13 (DP-48)
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 60
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-11 (DP-35)
<400> 60
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 61
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-21 (DP-77)
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 62
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-48 (DP-51)
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 63
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-23 (DP-47)
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys
<210> 64
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-64
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 65
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-38
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Glu Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Arg Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Gly Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
85 90 95
<210> 66
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-53 (DP-42)
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 67
<211> 97
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human VH3-66
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Cys Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chicken JH gene segment
<400> 68
Thr Ala Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human JH gene segment
<400> 69
Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human JH gene segment
<400> 70
Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Ser
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human JH gene segment
<400> 71
Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human JH gene segment
<400> 72
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human JH gene segment
<400> 73
Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human JH gene segment
<400> 74
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
1 5 10 15
Thr Val Ser Ser
20
<210> 75
<211> 710
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 75
acgcgctaac gaagccggag ccctccttat gcaaattagc ccctccagag ggccataaaa 60
gcgccggctc tccgacggag gagcaccagt cggctccgca accatgagcc cactcgtctc 120
ctccctcctg ctcctggccg ccctgccagg tgagggcgct gtggggctct atggggctct 180
atggggtctc agcggggctc tgcgggctca atgggggcca aagggggggt ctgcgggctc 240
tatggggggg tcaacggggg gtctcacggg gggccggctc cgcgaggccg tgtggcggcg 300
gctccgtcag cgctctctgt ccttccccac agggctgatg gcggccgtga cgttggacga 360
gtccgggggc ggcctccaga cgcccggaag agcgctcagc ctcgtctgca aggcctccgg 420
gttcaccttc agcagttaca acatgggttg ggtgcgacag gcgcccggca aggggctgga 480
gttcgtcgct ggtattgaca acactggtag atacacaggc tacgggtcgg cggtgaaggg 540
ccgtgccacc atctcgaggg acaacgggca gagcacagtg aggctgcagc tgaacaacct 600
cagggctgag gacaccggca cctactactg cgccaaagct gctggtcacg gtgacaccga 660
tccccagcac gggtggcaca aaacccaccg ttgcaaccca aggcggtgaa 710
<210> 76
<211> 120
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 76
Met Ser Pro Leu Val Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Pro Gly
1 5 10 15
Leu Met Ala Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr
20 25 30
Pro Gly Arg Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Asn Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Phe Val Ala Gly Ile Asp Asn Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser
85 90 95
Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Ala Ala Gly
115 120
<210> 77
<211> 215
<212> DNA
<213> Gallus gallus
<400> 77
gttggatggc caaaaaacgg ttgttttttt ttttttttaa ccaaaatggg cggttttcgc 60
ccgaaaagag tgggtggagt ttttgggtga aaaaaggcgg attttggggc attgtggtac 120
tgctggtagc atcgacgcat ggggccacgg gaccgaagtc atcgtctcct ccggtgagtc 180
ttcaaccccc cccaaaattg ccgcggcgat tttgg 215
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 78
Thr Ala Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 79
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer chVH-FW annotation
<400> 79
Val Leu Ala Thr Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Val Thr Leu Asp
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 80
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> past of vector MV1511
<400> 80
ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg 60
tgg 63
<210> 81
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> part of the functional chicken VH
<400> 81
cagcgctctc tgtccttccc cacagggctg atggcggccg tgacgttgga cgagtccggg 60
ggc 63
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse complement of chVH-RV reverse primer
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(24)
<400> 82
ggg acc gag gtc acc gtc tcc tcc 24
Gly Thr Glu Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 83
Gly Thr Glu Val Thr Val Ser Ser
1 5
<210> 84
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> part of vector MV1511
<400> 84
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg tcaccgtctc gagcgcctcc accaagggcc 60
cat 63
<210> 85
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> part of chicken JH gene segment
<400> 85
gcatcgacgc atggggccac gggaccgaag tcatcgtctc ctccggtgag tcttcaaccc 60
ccc 63
<210> 86
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nonsense sequence
<400> 86
aaaaaaaaaa aaaaa 15
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain variable region IgVk3-15/IGJk1
<400> 87
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain variable region IgVk3-20/IGJk1
<400> 88
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> common light chain variable region IgVl3-21/IGJl3
<400> 89
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 90
<211> 95
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable gene region sequence IgVk3-15
<400> 90
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro
85 90 95
<210> 91
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable gene region sequence IgVk3-20
<400> 91
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
<210> 92
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> heavy chain variable region of the chicken Fab region PDB 4GLR
and a human constant region CH1
<400> 92
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gln Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Thr Ser Arg Gly Gly Val Thr Gly Tyr Gly Ser Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro Ala Leu Asp Ser Asp Gln Cys Gly Phe Pro Glu Ala Gly
100 105 110
Cys Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr Glu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
210 215 220
Val
225
<210> 93
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human kappa light chain IgVk1-39/IGJk5/Ckappa
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 94
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human kappa light chain IgVk3-15/IGJk1/Ckappa
<400> 94
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 95
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human kappa light chain IgVk3-20/IGJk1/Ckappa
<400> 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> human lambda light chain IgVl3-21/IGJl3/Clambda
<400> 96
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 97
<211> 96
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Variable gene region sequence IgVl3-21
<400> 97
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Gly Ser Ser Asp His
85 90 95
<210> 98
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human control MF1025 VH sequence
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Trp Trp Ala Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 99
<211> 359
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 99
Met Glu Pro Ile Ser Val Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Ser Glu
1 5 10 15
Glu Val Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Asn Lys Glu Pro Cys Phe Arg
20 25 30
Asp Glu Asn Val His Phe Asn Arg Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Phe
35 40 45
Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val
50 55 60
Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu
65 70 75 80
His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp
85 90 95
Ala Val Asp Ala Met Ala Asp Trp Tyr Phe Gly Lys Phe Leu Cys Lys
100 105 110
Ala Val His Ile Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile
115 120 125
Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr
130 135 140
Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Ala Val Tyr Val
145 150 155 160
Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe
165 170 175
Ala Asp Val Ser Gln Gly Asp Ile Ser Gln Gly Asp Asp Arg Tyr Ile
180 185 190
Cys Asp Arg Leu Tyr Pro Asp Ser Leu Trp Met Val Val Phe Gln Phe
195 200 205
Gln His Ile Met Val Gly Leu Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser
210 215 220
Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln
225 230 235 240
Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe
245 250 255
Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr Val Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile
260 265 270
Leu Leu Gly Val Ile Lys Gln Gly Cys Asp Phe Glu Ser Ile Val His
275 280 285
Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu
290 295 300
Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Ser Ser Ala
305 310 315 320
Gln His Ala Leu Asn Ser Met Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu
325 330 335
Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu
340 345 350
Ser Ser Ser Phe His Ser Ser
355
<210> 100
<211> 134
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH region of CXCR4-1
<400> 100
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Arg Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Gly Ile Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ala Tyr Gly Ala Ala
50 55 60
Val Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asp Gly Gln Ser Thr Val
65 70 75 80
Arg Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asp Ala Gly Ser Cys Trp Tyr Gly Arg Arg Ser Gly Phe
100 105 110
Asn Cys Asp Pro Tyr Gly Gly Asn Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr
115 120 125
Glu Val Ile Val Ser Ser
130
<210> 101
<211> 134
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH region of CXCR4-2
<400> 101
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Tyr Ser Ile Gly Arg Asp Ala Gly Tyr Gly Ala Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Ser Gly Ser Ala Cys Arg Tyr Ala Ala Arg His Gly Tyr
100 105 110
Ile Cys Ala Gly Tyr Leu Gly Ser Ile Asp Ala Trp Gly His Gly Thr
115 120 125
Glu Val Ile Val Ser Ser
130
<210> 102
<211> 137
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VH region of CXCR4-3
<400> 102
Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gln Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ser Thr Ile Gly Gly Val Thr Trp Tyr Gly Ala Ala Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Ile Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Ser Asp Ser Pro Ser Cys Arg Tyr Gly Ser Arg Ser Gly
100 105 110
Trp Ser Cys Pro Gly Trp Asn Tyr Gly Gly Arg Ile Asp Ala Trp Gly
115 120 125
His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser
130 135
Claims (29)
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역을 포함하고, 가변 영역은 인간 가변 영역과 페어링(pairing)되는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제1항에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 상기 동물은 조류인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다량체는 항체인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제3항에 있어서, 상기 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역은 상기 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 재배열된 VDJ 영역이고, 상기 인간 가변 영역은 경쇄 가변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제5항에 있어서, 공통 경쇄, 예컨대 인간 공통 경쇄를 포함하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 가변 영역은 상기 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 재배열된 VJ 영역이고, 상기 인간 가변 영역은 중쇄 가변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제7항에 있어서, 공통 중쇄를 포함하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조류는 VH/VL 계면에서 인간 VL 영역과 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 8개 및 더욱 바람직하게는 적어도 10개의 정전기적 상호작용부를 포함하는 VH 영역을 인코딩하는 기능적 VH 유전자 세그먼트를 포함하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조류는 닭, 칠면조, 뇌조(grouse), 신대륙 메추라기, 구대륙 메추라기, 들꿩(ptarmigan), 자고새(partridge), 꿩, 멧닭(junglefowl), 봉관조과의 새, 거위, 백조, 오리 또는 타조와 같은 닭목(Galliform)인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체는 마우스 및/또는 인간 CXCR4, 바람직하게는 인간 CXCR4에 결합하는, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제11항에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 상기 가변 영역은 서열 번호 100; 서열 번호 101 또는 서열 번호 102를 포함하는 아미노산 서열을 포함하거나, 이에 대해 적어도 80%, 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 핵산에 의해 인코딩되는 상기 가변 영역은 인간화된 것인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이성 항체인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이성 항체, 예를 들어, 삼중특이성 항체인, 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체.
- 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체의 제조 방법으로서,
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 상기 동물로부터 단리하는 단계;
- 상기 단리된 핵산 서열로부터 가변 영역을 수득하는 단계; 및
- 상기 동물로부터의 상기 가변 영역을 인간 가변 영역과 페어링하는 단계를 포함하여,
결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 제조하는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열이고 상기 인간 가변 영역은 경쇄 가변 영역인, 방법.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 상기 동물은 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 뇌조, 신대륙 메추라기, 구대륙 메추라기, 들꿩, 자고새, 꿩, 멧닭, 봉관조과의 새, 거위, 백조, 오리 또는 타조와 같은 닭목인, 방법.
- 파지로서, 그의 게놈 내에:
인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득되는 가변 영역을 인코딩하는 핵산; 및
인간 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 파지. - 제19항에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열이고 상기 인간 가변 영역은 경쇄 가변 영역인, 파지.
- 제19항 또는 제20항에 따른 파지를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리로서, 적어도 약 106개의 파지를 포함하는, 파지 디스플레이 라이브러리.
- 파지 디스플레이 라이브러리의 제조 방법으로서,
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산을 상기 동물로부터 단리하는 단계; 및
- 상기 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하여,
파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는, 방법. - 제22항에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열인, 방법.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 파지 디스플레이 라이브러리 내의 상기 파지는 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
- 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 식별하는 방법으로서,
- 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물을 항원으로 면역화하는 단계;
- 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산을 상기 동물로부터 단리하는 단계;
- 상기 가변 영역을 인코딩하는 상기 핵산을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리를 제조하는 단계; 및
- 상기 항원에 결합하는 상기 파지 디스플레이 라이브러리 내의 파지를 식별하는 단계를 포함하여,
상기 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체를 식별하는, 방법. - 제25항에 있어서, 상기 결합 도메인 또는 다량체 또는 그의 변이체는 상기 항원에 결합하는, 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 동물로부터의 가변 영역을 인코딩하는 복수의 핵산 서열은 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열인, 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파지 디스플레이 라이브러리 내의 상기 파지는 인간 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
- 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 - 이의 핵산 또는 핵산들은 인간으로부터 계통 발생적으로 원위에 있는 동물에 기초하거나, 그로부터 유래되거나 수득됨 -; 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 또는 핵산들.
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