JP2024014897A - 混合結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒト抗原上の新規エピトープを認識する治療用抗体を生成すること。【解決手段】ヒト生殖細胞系列可変領域と対合したトリ重鎖可変領域を含む、結合ドメイン又は多量体又はその変異体により、上記課題を解決する。【選択図】なし
Description
本発明は、結合ドメイン又は多量体又はその変異体、並びにかかる結合ドメイン又は多量体又はその変異体を作製するための方法に関する。結合ドメイン又は多量体又はその変異体は、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる可変領域を含み、かかる可変領域は、同族鎖のヒト可変領域と対合する。本発明はまた、ゲノム中に、結合ドメイン又は多量体又はその変異体をコードする核酸を含む、ペプチドディスプレイに好適なファージ又は他の生物；複数のかかる生物を含むディスプレイライブラリー、及びかかるディスプレイライブラリーを調製するための方法にも関する。更に、本発明は、かかる結合ドメイン又は多量体又はその変異体を産生する宿主細胞に関する。更に、本発明は、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を含む医薬組成物；治療によるヒト又は動物の処置におけるその使用；並びに結合ドメイン又は多量体又はその変異体を使用して、医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法に関する。
Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによるハイブリドーマ技術の開発によって、ヒト疾患の予防及び処置のための抗体の使用への扉が開かれ、そして抗体の生成のために頻繁にマウスが選択された。
当初、ヒトの治療のためにマウス抗体を直接使用する試みがなされていた。ヒトへのマウス抗体の投与に対して免疫原性応答を引き起こし、病気及び場合により死に至るヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を起こした後に、免疫系を有し、またヒト可変領域及び／又は定常領域をコードする核酸を保有するトランスジェニックマウスが開発された。このマウスは抗体を生成することができ、次にこの抗体をヒト治療法の開発のために分析することができる。同様に、ファージディスプレイライブラリーが、核酸をコードするヒト免疫グロブリンを用いて生成される。かかるヒト化マウス及びファージディスプレイライブラリーは、今日の市場で成功を収めている一連の治療用抗体に寄与しており、更に多くの臨床開発が行われている。
ヒトトランスジェニック動物についても以前より記載されてきた。ヒトトランスジェニック動物は、再構成された軽可変鎖又は重可変鎖を含むヒト共通免疫グロブリン鎖をコードし、及びかかる動物の生殖細胞系列における同族鎖の再構成されていない可変領域をコードする、核酸を保有する。かかるトランスジェニック動物は、免疫グロブリンの２つの同族鎖、例えば、再構成されていない重鎖又は軽鎖のうちの１つを介して生成される多様性を有する抗体を産生することができる。再構成されていない重鎖又は軽鎖は、Ｂ細胞の発達中に体細胞組換えを起こし、抗原曝露後に親和性成熟を起こす。ＭｅＭｏ（登録商標）マウス（例えば、国際公開第２００９／１５７７１号）などのこれらのトランスジェニック動物は、一連の抗原に対する抗体の多様なレパートリーを産生することができ、次に例えば、異なる抗原又は同じ抗原のエピトープに対して、かかるレパートリーの重鎖可変領域をコードする又はそれに基づく核酸を、二重特異性抗体であるＢｉｃｌｏｎｉｃｓ（登録商標）の大きなパネルをコードする宿主細胞に組み合わせることができる。これらの細胞は、分化した新規の生態を有する二重特異性抗体の効率的な産生について容易にスクリーニングすることができる（例えば、国際公開第２０１７／０６９６２８号）。
ヒト化トランスジェニックマウスは医学的進歩をもたらし、更なる進歩の兆しを提供するが、マウスとヒトとの間の進化的類似性を考慮すると、ヒトに対して免疫学的に不明である抗原（例えば、自己抗原）にエピトープが存在する可能性があり、これはトランスジェニックマウス又はヒトと進化的に類似した他の動物に対して免疫学的に不明であることが類似し得る。ヒトとマウスは、所与の抗原について多くの保存されたドメインを共有している。このことが理由で、トランスジェニック動物を改変したり、潜在的に手間のかかる免疫化プロトコルに従事したりする余計な労力を加えずに、かかるトランスジェニック動物の免疫化により、低レベルの抗体が生じる、又は抗体が全く生じない場合につながる可能性がある。
同様に、トランスジェニック生物の免疫化により抗体が生成される場合があるが、かかる抗体がヒト及びトランスジェニック動物に対して交差反応性ではなく、かかる抗体のアッセイ及び試験をあまり効率的にしない場合がある。更に、よりまれな例が存在し、げっ歯類やマウスなどの野生型動物の免疫化、及び同じ標的を有するヒト化免疫系によるトランスジェニック動物の免疫化により、種間で類似のエピトープに結合する抗体から構成される抗体レパートリーがもたらされ得る場合がある。（余白）
したがって、ヒト抗原上の新規エピトープを認識する治療用抗体の生成が必要とされている。
いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明者らは、ヒトと免疫化された動物との間の進化的類似性により、かかる動物がヒトに対して進化的に近い場合、かかる動物における免疫応答がもたらされることがあり、それがヒトレパートリーによって産生された抗体と同じ又は類似のエピトープを標的とする抗体を発現させ、かかるトランスジェニック動物によって同定されていない新規又はネオエピトープにつながると考える。すなわち、概して進化的類似性は、種間で異なるエピトープを認識する抗体レパートリーをもたらし、典型的には、種間で類似又は同一であるエピトープを認識する抗体をもたらすのではない。
したがって、可変領域及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、キメラ又はヒト化結合ドメイン又は抗体などの、結合ドメイン又は抗体を得ること、並びに、ヒトに対して進化的に離れた種の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られた、該可変領域をコードする核酸を得ることが有益であり得る。これにより、新規抗体を生成することが可能になり得、これには、ヒト及びより進化的に近い種（例えば、げっ歯類及び他の哺乳動物種）からの可変領域を有するヒト、ヒト化又はキメラ抗体によって容易に同定されないエピトープに結合できるものが含まれる。可変領域を保有する結合ドメイン又は抗体の産生のための進化的に離れた種を用いること、及びかかる種の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、該可変領域をコードする核酸を用いることにより、ヒト、ネズミ、カニクイザル交差反応性である抗体を生成することができる利点がもたらされる。
かかる可変領域の潜在的な発生源の１つは、例えば、ニワトリ、アヒル、ダチョウなどの家畜化されたトリであり、制御された環境で容易に繁殖され、免疫化することができる。トリは３億年超の間、ヒトと共通の祖先を共有しておらず、主竜類の動物群において生き残った数少ない生物として知られている。ヒトに対して進化的に遠位にあるこの群の可変領域及び免疫系は、保存されている治療標的に結合することができる抗体の力価の生成に好適な免疫応答を与え、そして哺乳動物（例えば、ヒト、げっ歯類、及びカニクイザル）の間で免疫学的に不明又は損なわれ得る。更に、トリ、例えばニワトリ、アヒル、ダチョウの免疫化によって生成された抗体レパートリーは、マウス又は進化的にヒトに近い他の種（例えば、げっ歯類及びカニクイザル）の免疫化によって生成された抗体と比較した場合、固有のエピトープを同定することができる。
理論に束縛されるものではないが、これは、ヒトとニワトリなどのトリとの間の進化的距離に起因し得る。例えば、ニワトリＨＣＤＲ３配列におけるチロシンの異常に低い出現とシステインの異常に高い出現によって例示されるように、ニワトリ相補性決定領域（ＣＤＲ）での異なるアミノ酸を用いることや、同じ抗原に対するヒト（及び進化的に関連性の高い種）に関して生じる抗原に対するレパートリーの異なる免疫原性応答により、ヒト免疫応答又は他の動物の中でもマウス、ラット、ウサギなどの採用される古典的なトランスジェニック動物の免疫応答と比較して、固有の抗体を生成することができる。
以前より、ヒトとは非常に無関係な動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる可変領域及び／又はＣＤＲを保有する抗体、例えばニワトリ抗体の使用による免疫原性のリスクは、かかる抗体を使用することへの障害であり、マウスなどのより進化的に近い種を用いることよりも大きいものと理解されている。トリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる配列を有する抗体のポリペプチドのヒト化により、かかる抗体の可変領域又は相補性決定領域をヒト抗体フォーマットに移植され得ることは、かかる抗体又はかかる可変領域を含む抗体をヒトの臨床開発又は治療環境で使用することへ障害と理解されている。
更に、トリ（例えば、ニワトリ）抗体可変領域又は抗体ドメインをヒト抗体フォーマットと組み合わせてキメラニワトリ／ヒト抗体を生成する能力は、かかるレパートリーからのかかる抗体の不安定化及び／又は親和性及び有効性の喪失の可能性を伴い、かかる抗体及び宿主を用いて抗体を生成することの利点の有用性をここでもまた制限する、困難で不確実な行為と見なされてきた。
したがって、少なくとも上記の理由により、同族鎖のヒト可変領域と対合するヒトに対して進化的に離れた動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる可変領域を含む、結合ドメイン又は多量体、例えば抗体及びその変異体；かかる結合ドメイン又は多量体、例えば抗体を作製する方法；それらをコードする核酸；かかる結合ドメインの可変領域を提示するディスプレイライブラリーの産生；かかる結合ドメイン又は多量体、例えば抗体のスクリーニング；それらを産生する宿主細胞の作製；並びにそれらを含む医薬品は、非常に望ましく、当該技術分野の進歩であり、かかる発明が本明細書に記載されている。
多くのタンパク質を多様化させたトリとヒトとの間の進化的距離にもかかわらず、そしてトリの種の限られた数の機能的ＶＨ遺伝子セグメントがヒトＶＨ遺伝子セグメントと一次アミノ酸配列で顕著な相同性を共有しないという事実にもかかわらず、本発明者らは、再構成可変領域を分析する場合、ニワトリ、アヒル、及びダチョウのＶＨ遺伝子セグメントがヒトＶＨ遺伝子セグメントと顕著な三次構造類似性を共有することを確認した。
例えば、本発明者らは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、Ｈｅｒ３に結合する配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含むＭＦ３１７８（ＰＤＢエントリー５Ｏ４Ｏ）を有するヒトＦａｂの結晶構造に基づいて生成されたヒト／ニワトリハイブリッドＦａｂの３Ｄ相同性モデルを生成した。ＭＦ３１７８は、親ＶＨ１－０２可変遺伝子セグメントに由来し、ヒト共通軽鎖を含む。モデルでは、ヒトＶＨ領域は、ニワトリＦａｂの構造から取得したニワトリＶＨ領域のアミノ酸配列に基づいてモデル化されたＶＨ領域によって置き換えられている。モデルの分析では、ニワトリＶＨ領域とヒト共通軽鎖界面との間に２４の非結合静電相互作用が存在するのに対し、ＭＦ３１７８と軽鎖の完全なヒト界面では２０の非結合静電相互作用が確認された。これは、ニワトリＶＨとヒトＶＬとの間の界面が相補的であり、ヒト／ニワトリハイブリッドＦａｂがこれらの相互作用によって安定化され、完全なヒトＦａｂよりも安定であり得ることを示す。機能的ニワトリＶ遺伝子セグメントと、本明細書に例示されるＭＦ３１７８が由来するヒトＶＨ１－０２遺伝子セグメントとの間の低レベルの一次アミノ酸配列相同性が、わずか４３％の配列同一性しかないことを考えると、これは特に驚くべきことである。
したがって、本発明者らは、本明細書において、ヒトＶＬ領域と直接対合して新しいタイプのハイブリッド又はキメラ結合ドメインを形成する、トリによって生成された再構成ＶＨ領域を含む結合ドメインを記載する。かかるＶＨ及びＶＬ領域を含むＦａｂを生成することができ、そのＣＨ１及びＣＬ領域は、両方ともヒトであってもよく、又は両方ともヒトから進化的に離れた動物（ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウを含むトリなど）であってもよい。ＣＨ１領域は、進化的に離れた動物のものであり、ＣＬ領域はヒトである場合もある。ＣＨ１領域がヒトであり、ＣＬ領域が進化的に離れた動物のものである場合もある。
例えば、ニワトリ重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変領域と三次構造レベルで相同性を共有して、免疫化ニワトリから単離されたニワトリ再構成ＶＨ領域が、ヒト可変軽（ＶＬ）領域、好ましくは、ＶＬ領域と直接対合し得るようにする。このＶＬ領域は、結合ドメイン、多量体、抗体、又は変異体のパネルを生成するための、共通鎖として機能することができ、かかるドメインの多様性及び対象となる抗原に結合する性質は、主にニワトリ重鎖可変領域によるものである。かかる混合結合ドメインは、Ｂ細胞成熟中にトリ可変領域及びヒト可変領域が共進化する必要なしに安定して形成することができるが、例えば、野生型の再構成トリ重鎖可変領域を用いて、それをヒト軽鎖、好ましくはヒト共通軽鎖と対合することによって、混合結合ドメインに容易に組み合わせることができる。この技術によりディスプレイライブラリーの産生が可能となり、このディスプレイライブラリーは、既知の抗原の新規結合の潜在的な同定のためのかかる混合結合ドメイン、及び乳動物種間で交差反応性である可能性のある混合結合ドメインの大規模スクリーニングを可能にする。
このようにして、ヒト重鎖又は軽鎖可変領域、好ましくはヒト共通重鎖又は共通軽鎖可変領域などのヒト可変領域を、ニワトリ、アヒル、及びダチョウなどのトリの再構成可変重鎖又は軽鎖可変領域と対合することから、キメラ結合ドメイン、多量体、及び抗体を直接生成することが可能である。同族のトリ軽鎖可変領域ではなく、ヒト軽鎖可変領域、好ましくはヒト共通軽鎖可変領域の使用が好ましい。まず、ヒト共通軽鎖可変領域を使用することにより、結合ドメインの半分が、直ちにヒト化される。次に、ヒト共通軽鎖可変領域を使用することにより、ヒト共通軽鎖可変領域と対合する野生型トリ重鎖可変領域が同定され、その後、抗体、特に二重特異性抗体、又は多価多量体の効率的な生成に使用することができる。
Ｆａｂは、共に展開しないドメイン構造を形成する必要がある重鎖及び軽鎖の部分で構成されており、進化的に離れた種からの重鎖及び軽鎖が組み合わされたときに、安定した結合ドメインを形成するように機能することは予想外である。ディスプレイ技術を使用することにより、別の抗体／動物／種に由来する（共通）軽鎖との関連で、（該動物を免疫化するために使用される）抗原に結合することができる、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物からの重鎖可変領域鎖の同定が可能になる。
驚くべきことに、本明細書に記載されるように、対象となる抗原に結合する、ヒトに対して遠位にある動物からの抗体レパートリーに由来する重鎖可変領域をコードする核酸は、ヒト軽鎖と対合することができる。これにより、安定したＶＨ／ＶＬ界面が得られ、これはネイティブＶＨ／ＶＬ対合を含む抗体が結合する抗原に結合することができる。
これらの結合ドメイン（一方のヒト可変領域と、対合するもう一方のトリ可変領域で構成される）をコードする核酸は、宿主細胞に容易に組み込むことができる。次に、かかる宿主細胞は、共通ヒト軽鎖とともに１つ以上の重鎖可変ドメインを発現し得る。これにより、多重特異性抗体を含む多量体の大きなパネルの産生が可能になり、多量体は、多様な一連の抗原に結合することができる。多量体には、ヒト可変遺伝子セグメントに基づく又はそれに由来する抗体、又は、ヒトに近い種、例えばげっ歯類、及び他の哺乳動物に基づく又はそれに由来する可変遺伝子セグメントに基づく又はそれに由来する抗体のパネルによって容易に同定されない可能性があるエピトープを標的とするものが含まれる。更に、ヒト可変領域と対合するヒトに対して遠位にある動物からの、対合する可変領域から構成されるかかる結合ドメインは、広範囲の哺乳動物（ネズミ、ヒト及びカニクイザルを含む）に存在する抗原に対して、完全にヒト可変領域よりも、又はヒトに系統発生的により近い免疫化動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる可変領域を有する抗体よりも容易に交差反応する。
出願人らは、２つ以上の多様な免疫グロブリン可変鎖（重可変鎖又は軽可変鎖）及び共通可変鎖（重共通可変鎖又は軽共通可変鎖）をコードする核酸を含有する宿主細胞から二重特異性及び多重特異性抗体を発現する能力について、並びに、重鎖ヘテロ二量体の形成を促進するＣＨ３操作などのＦｃ領域の操作を使用することにより、かかる可変鎖を対合して、ホモ二量体抗体よりもかかる二重特異性及び多重特異性抗体を優先的に産生できる方法（国際公開第２０１３／１５７９５４号）について以前述べている。ＣＨ３操作電荷差又はノブインホールを含む、異なる重鎖のヘテロ二量体化を産生する他の手段も、当該技術分野において既知である。
したがって、本明細書に開示される発明は、共通可変領域又は共通鎖、典型的にはヒト共通可変領域又は共通鎖、並びにヒトに対して系統発生的に遠位にある生物、例えばトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られるに核酸によってコードされる同族可変領域又は同族鎖を含む、結合ドメイン及び多量体、例えば抗体に関する。例えば、共通鎖は、ヒト共通軽鎖などの共通軽鎖（ｃＬＣ）であり得、同族可変領域は、ニワトリ、アヒル、ダチョウなどのトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる重鎖可変領域（ＶＨ）であり得る。
ヒト軽鎖可変領域、好ましくはヒト共通軽鎖可変領域を、トリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるＶＨ領域と対合すること（又はその逆）により、従来の抗体生成プラットフォームを介してアクセスできない又は結合しないエピトープにアクセスし得る結合ドメイン、多量体、及び抗体の産生が容易になる。これには、ヒト合成ファージディスプレイライブラリー及びヒト化免疫系を保有するトランスジェニック生物を用いることが含まれる。
更に、ヒトから系統発生的に遠位にある動物、好ましくはニワトリなどのトリから、ヒト鎖、好ましくはヒト共通鎖と対合する可変領域を含む結合ドメイン、多量体、及び抗体の生成は、二重特異性及び多重特異性多量体、例えば抗体、及び変異体の生成に有用である。ヒト鎖、好ましくはヒト共通鎖を使用することにより、結合ドメインの半分を即座にヒト化することができる。ヒトから系統発生的に遠位にある動物は、本明細書では「本発明での使用に好適な動物」と呼ばれ得る。
全ての高等脊椎動物と同様に、トリ（ニワトリなど）のＶＨ／ＶＬ領域の一次多様性は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと、それに続く親和性成熟によって生み出される。
Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに利用できる複数の機能的Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントを有するヒト及びマウスなどの哺乳動物とは対照的に、ニワトリ、アヒル、ダチョウなどの様々なトリは、一連の機能的Ｄ遺伝子セグメントに加えて、それぞれＶＨ、ＪＨ、ＶＬ、及びＪＬに、限られた数の機能的遺伝子セグメントのみを含有する。実際に、ニワトリ及びダチョウは、１つの機能的Ｖ遺伝子セグメントしか有していない。例えば、アヒルは、１つ又は２つのみの機能的重鎖Ｖ遺伝子セグメントを有する場合がある。
組換えＶＨ及びＶＬ領域が、対応するＶ（Ｄ）配列（の一部）を含む一連の偽遺伝子との相同組換えを介して多様化される遺伝子変換プロセスにより、ニワトリにおいて免疫レパートリーの更なる多様化が生まれる。これらの非機能的偽遺伝子は、組換えシグナル配列、プロモーター、シグナルペプチド、及びＫｏｚａｋ翻訳開始部位を欠いている。生成されたＶＨ及びＶＬ領域の体細胞超変異と組み合わされて、このプロセスは、非常に多様なＣＤＲを有するニワトリ抗体レパートリーにつながるが、フレームワーク（ＦＷ）配列は、元の機能的遺伝子と非常に類似したままであり；ニワトリはＪＨ／ＪＬ偽遺伝子を有さないため、ＦＷ４には変異が導入されていないか、限られている。ニワトリでは、主な抗体アイソタイプはＩｇＹであり、これは哺乳動物のＩｇＧと構造的及び機能的に類似しているため、ＩｇＧとして誤ってラベル付けされることがよくある（Ｒｅｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４０，２８３－２９１，１９８５；Ｒｅｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ４８，３７９－３８８，１９８７；Ｒｅｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５９，１７１－１８３，１９８９；ａｎｄ Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８８，３２２－３３３，２０１２）。
本発明者らは、Ｈｅｒ３に結合するヒトＦａｂ ＭＦ３１７８（ＰＤＢエントリー５Ｏ４Ｏ）の結晶構造に基づいて生成されたヒト／ニワトリハイブリッドＦａｂ（以下の例を参照）の３Ｄ相同性モデルを産生し、本明細書に開示しており、アミノ酸配列に基づくＶＨ領域は、配列番号１に記載の配列を有する。ＭＦ３１７８は、親ＶＨ１－０２可変遺伝子セグメントに由来し、ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１共通軽鎖と対合される。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＨＧＳＲＨＦＷＳＹＷＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）
モデルでは、ヒトＶＨ領域は、ニワトリＦａｂの構造から得られたニワトリＶＨ領域のアミノ酸配列（配列番号２）に基づいてモデル化されたＶＨ領域によって置き換えられている（ＰＤＢ ４ＧＬＲ；Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７，４４４２５－４４４３４，２０１２）。驚くべきことに、モデルの分析では、ニワトリＶＨ領域とＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１の共通軽鎖界面との間に存在する２４の非結合静電相互作用を示したが、２０の非結合静電相互作用はＭＦ３１７８の完全なヒト界面（図４Ａ参照）及び軽鎖で同定される。したがって、本明細書に記載されているのは、安定した界面を形成することができる多数の接触残基及び静電相互作用を有する、ヒト同族可変領域に直接対合する野生型ニワトリ可変領域から得られる混合結合ドメインである。
キメラニワトリＶＨ領域／ヒトｃＬＣ界面では、１０の静電相互作用は、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂのヒトＶＨ及びＶＬ界面の界面と比較して同一であり、ニワトリＶＨ領域とヒト共通軽鎖との間の相互作用の２つは、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂのニワトリＶＨ領域及びヒトＶＨ領域における同等の位置に見られる相同残基間で形成される。更に、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂのヒトＶＨ／ＶＬ相互作用と比較して、ニワトリＶＨ領域／ヒト共通軽鎖界面には、より多くの水素結合（６ではなく１２）が存在し、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂの完全ヒト結合ドメインよりも、ニワトリＶＨ領域とヒトＶＬ界面との間の安定性の潜在能力が高いことを示している。
同様に、本発明者らは、限定された機能的Ｖ遺伝子セグメントを有するアヒルに関して、再構成重鎖可変領域がヒトｃＬＣとの相互作用を生み出し、様々な接触点と静電相互作用を生成することを実証した。ヒトＶＨは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ａ４６５２９（配列番号３）のアミノ酸１～１３３の構造から得られたアヒルＶＨのアミノ酸配列に基づいてモデル化されたＶＨによって置き換えられている。
驚くべきことに、モデルの分析では、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂの完全なヒト界面で特定された２０の非結合静電相互作用と比較して、アヒルＶＨ領域とヒトＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１共通軽鎖可変領域界面との間に存在する２８の非結合静電相互作用が示され（図１０ａを参照）、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂの同じ位置に見られるヒト重鎖／ヒト軽鎖に対するアヒル重鎖／ヒト軽鎖を比較するときに、これらの相互作用のうち１２は同一であり、１つは同等である。
限定された機能的Ｖ遺伝子セグメントを有するダチョウについては、ダチョウの再構成重鎖可変領域がヒトｃＬＣとの相互作用を生み出し、様々な接触点と静電相互作用を生成することが更に実証されている。ヒトＶＨは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＮ０２３８８．１（配列番号４）の構造から取得したダチョウＶＨ領域のアミノ酸配列に基づいてモデル化されたＶＨ領域によって置き換えられ、１４の非結合静電相互作用が、ダチョウＶＨ領域と共通軽鎖界面との間に存在する。
キメラダチョウＶＨ領域／ヒトｃＬＣ界面では、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂのヒトＶＨ及びＶＬと比較して、静電相互作用の７つが同一であり、ダチョウＶＨ領域とヒトＶＬとの間の相互作用の１つは、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂの同じ位置において、ヒト重鎖／ヒト軽鎖に見られる相同残基間で形成される。
したがって、本発明者らは、トリの組換え及び親和性成熟重鎖可変領域、例えばニワトリ重鎖可変領域が、ヒト軽鎖可変領域、好ましくは共通軽鎖可変領域又は共通軽鎖、より好ましくは生殖細胞系列軽鎖可変領域又は軽鎖、例えばＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１と直接対合して、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）ｎ又はｓｃＦｖドメインなどの機能的結合ドメインを得ることができ、これらには二価抗体及び多価抗体並びに他の多量体の生成が含まれ、例えばトランスジェニック生物又は広範な抗体操作で起こるＢ細胞発達及び親和性成熟を介したニワトリＶＨ及びヒトＶＬの共進化を必要としないと判断した。
原則として、本明細書に記載される技術及び教示に従い、任意の進化的に離れた動物、例えばニワトリなどのトリの抗体を取得し、同族のニワトリ軽鎖又は軽鎖可変領域を、ヒト軽鎖又は軽鎖可変領域、特にヒト共通軽鎖又はヒト共通軽鎖可変領域に置き換えることができる。
したがって、トリの組換え及び親和性成熟重鎖可変領域と、軽鎖ヒト可変領域、特に共通軽鎖との間の構造的相同性により、キメラライブラリーを生成することができ、そこから、トリ重鎖可変領域が親和性及び特異性に優勢である抗体を選択することができる。ヒト共通鎖で構成され、野生型トリ再構成鎖と対合するライブラリーの生成により、野生型同族鎖と対合していない場合、対象となる抗原に特異的に結合できる野生型トリ再構成鎖の同定を可能にする。したがって、このライブラリーは、二重特異性抗体又は多価多量体の効率的な生成のために、それらをコードする該重鎖及び核酸の同定を可能にする。
すなわち、本明細書に開示される発明は、例えば、多量体又は抗体の形態をとることができる新しい混合結合ドメインを含み、これは、ヒトＶＬ領域と対合する、ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるＶＨ領域を含む。典型的には、かかる動物は、Ｖ遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つの重鎖Ｖ遺伝子セグメントのみを有する動物である。それはまた、例えば、ヒトＶ領域と構造的に類似しているＶ領域を有する動物であり得る。
好ましくは、かかる結合ドメインは、ヒト軽鎖、例えばヒト共通軽鎖、より好ましくは生殖細胞系列軽鎖可変領域又は軽鎖、例えばＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１を含む。かかる結合ドメイン、又はかかる結合ドメインを組み込んだ抗体、多量体、若しくは変異体は、治療としての使用に直接好適であり得る、又はＣＤＲ移植及び他の修飾を含む更なるヒト化の対象となり得る。
したがって、本発明によれば、結合ドメイン、多量体、抗体、又はその変異体が提供され、これは、ヒトから系統発生的に遠位にある動物（「本発明で使用するのに好適な動物」）の、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、その可変領域はヒト可変領域と対合する。かかる結合ドメインにおいて、本発明での使用に好適な動物のＶＨ領域とヒトＶＬとの間の接触点の数は、ヒトＶＨ領域及びヒトＶＬ結合ドメイン、例えば本明細書に例示されるような、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂの間に存在するものと実質的に類似及び／又は好ましくは少なくとも同数であり得る。
かかる結合ドメイン、多量体、抗体、又は変異体のレパートリーは、例えば、ライブラリーの形で作製され得る。かかる結合ドメイン、多量体、抗体、又は変異体のレパートリーはまた、例えば、本発明での使用に好適な動物の抗体の同族軽鎖又は軽鎖可変領域を、ヒト軽鎖又は軽鎖可変領域、特にヒト共通軽鎖又はヒト共通軽鎖可変領域で置き換えることによって作製され得る。結合ドメイン、多量体、抗体、又は変異体は、所望の特異性を有するように選択され得る。
したがって、本発明によれば、結合ドメイン、多量体、抗体、又はその変異体が提供され、これは、ヒトから系統発生的に遠位にある動物の、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、その可変領域はヒト可変領域と対合する。本発明はまた、かかる結合ドメイン、多量体、抗体、又は変異体のレパートリーも含む。
したがって、本明細書に開示される発明によれば、結合ドメイン、多量体、抗体、又はその変異体であって、ヒト可変領域と対合する、ヒトから系統発生的に遠位にある動物の、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、かかる結合ドメインは、４、好ましくは５、好ましくは８、より好ましくは１０以上の静電相互作用を含み、静電相互作用は、ヒト重鎖／ヒト軽鎖可変領域界面の結合ドメイン、例えば本明細書に例示されるような、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂに存在する電気的相互作用と同一又は同等である、結合ドメイン、多量体、抗体、又はその変異体が提供される。
ヒトから系統発生的に遠位にある該動物は、上記のようなトリ、好ましくはニワトリ、アヒル及びダチョウであり得る。
本発明はまた、混合結合ドメインを調製するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリを抗原に曝露することと；
かかる動物からの重鎖又は軽鎖可変領域をコードする核酸を単離することと；
単離された核酸によってコードされる重鎖又は軽鎖可変領域を、ヒト重鎖又は軽鎖可変領域と対合させることと、を含み、それにより、混合結合ドメインを形成する、方法を提供する。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリを抗原に曝露することと；
かかる動物からの重鎖又は軽鎖可変領域をコードする核酸を単離することと；
単離された核酸によってコードされる重鎖又は軽鎖可変領域を、ヒト重鎖又は軽鎖可変領域と対合させることと、を含み、それにより、混合結合ドメインを形成する、方法を提供する。
混合結合ドメインは、抗体又はその変異体、特に、二重特異性又は三重特異性抗体などの多重特異性抗体の調製に使用することができる。
本発明はまた、抗体又はその変異体を調製するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリを抗原に曝露することと；
重鎖又は軽鎖可変領域をコードする核酸配列を、抗原に結合することができるかかる動物から単離することと；
重鎖又は軽鎖可変領域が、トリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる単離された遺伝物質によってコードされる、ディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、該重鎖又は軽鎖可変領域が、混合結合ドメインを形成するヒト同族鎖可変領域と対合する、方法を提供する。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリを抗原に曝露することと；
重鎖又は軽鎖可変領域をコードする核酸配列を、抗原に結合することができるかかる動物から単離することと；
重鎖又は軽鎖可変領域が、トリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる単離された遺伝物質によってコードされる、ディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、該重鎖又は軽鎖可変領域が、混合結合ドメインを形成するヒト同族鎖可変領域と対合する、方法を提供する。
該ライブラリーは、ファージ、酵母、リボソーム、又は当技術分野で知られているペプチドディスプレイ用の他のべセルから構成され得る。
本発明のライブラリー、例えばファージディスプレイライブラリーを使用して、同族鎖可変領域と結合することができるトリからの重鎖又は軽鎖可変領域を同定又は選択することができる。ヒト（共通）軽鎖又は重鎖と組み合わされたときに、ライブラリー内のトリからの重鎖又は軽鎖のどちらが、最終的にトリを免疫化するために使用される抗原に結合できるかを判定するために、選択が行われる。
本発明はまた、
本発明のファージであって、そのゲノム中に、トリの、少なくとも一部、重鎖領域に基づく、重鎖領域に由来する、又は重鎖領域から得られる重鎖可変領域をコードする核酸配列と、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列と、を含む、ファージ；
本発明の複数のファージを含むファージディスプレイライブラリー；
ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することと、
抗原に結合することが可能な、かかる動物からの重鎖可変領域をコードする複数の核酸配列を単離することと、
核酸配列を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法；
ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することであって、かかる動物は、ＶＨ／ＶＬ界面においてヒトＶＬ可変領域との５、好ましくは８、より好ましくは１０の静電相互作用を含む機能的ＶＨ遺伝子セグメントを含む、免疫化することと、
抗原に結合することが可能な、かかる動物からの重鎖可変領域をコードする複数の核酸配列を単離することと、
核酸配列を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法；
本発明のファージディスプレイライブラリーを使用することによる、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定するための方法；
トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、２つ以上の重鎖可変領域をコードする核酸を含む宿主細胞であって、該重鎖可変領域は、ヒト軽鎖と対合するエピトープに結合することができ、好ましくは、コードされた各重鎖可変領域は、同じ又は異なる標的又は標的上のエピトープに結合することができる、宿主細胞；
トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、２つ以上の重鎖可変領域をコードする核酸であって、該重鎖可変領域は、ヒト軽鎖と対合するエピトープに結合することができ、発現及び多量体化して、可変結合ドメイン、好ましくは多量体、抗体、又はその変異体、より好ましくは多重特異性多量体、抗体、又はその変異体を形成することができる、核酸；
本発明のいずれか１つによる抗体と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物；
治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための本発明の抗体；並びに、
医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、ヒト又は動物に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法、を提供する。
本発明のファージであって、そのゲノム中に、トリの、少なくとも一部、重鎖領域に基づく、重鎖領域に由来する、又は重鎖領域から得られる重鎖可変領域をコードする核酸配列と、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列と、を含む、ファージ；
本発明の複数のファージを含むファージディスプレイライブラリー；
ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することと、
抗原に結合することが可能な、かかる動物からの重鎖可変領域をコードする複数の核酸配列を単離することと、
核酸配列を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法；
ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することであって、かかる動物は、ＶＨ／ＶＬ界面においてヒトＶＬ可変領域との５、好ましくは８、より好ましくは１０の静電相互作用を含む機能的ＶＨ遺伝子セグメントを含む、免疫化することと、
抗原に結合することが可能な、かかる動物からの重鎖可変領域をコードする複数の核酸配列を単離することと、
核酸配列を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法；
本発明のファージディスプレイライブラリーを使用することによる、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定するための方法；
トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、２つ以上の重鎖可変領域をコードする核酸を含む宿主細胞であって、該重鎖可変領域は、ヒト軽鎖と対合するエピトープに結合することができ、好ましくは、コードされた各重鎖可変領域は、同じ又は異なる標的又は標的上のエピトープに結合することができる、宿主細胞；
トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、２つ以上の重鎖可変領域をコードする核酸であって、該重鎖可変領域は、ヒト軽鎖と対合するエピトープに結合することができ、発現及び多量体化して、可変結合ドメイン、好ましくは多量体、抗体、又はその変異体、より好ましくは多重特異性多量体、抗体、又はその変異体を形成することができる、核酸；
本発明のいずれか１つによる抗体と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物；
治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための本発明の抗体；並びに、
医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、ヒト又は動物に治療有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法、を提供する。
「抗体」は、抗原上のエピトープに結合する１つ以上のドメインを含有するタンパク質の免疫グロブリンクラスに属するタンパク質分子を意味し、かかるドメインは、抗体の可変領域に由来するか又は配列相同性を共有する。
抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを判定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。
抗体結合は、特異性及び親和性を含む異なる性質を有する。特異性は、どの抗原又はそのエピトープが結合ドメインによって特異的に結合されているかを判定する。親和性は、特定の抗原又はエピトープへの結合の強度についての尺度である。本明細書では、抗体の「特異性」は、特定の抗原に対するその選択性を指し、「親和性」は、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープとの間の相互作用の強度を指すことに注意しておくとよい。
したがって、本明細書で使用する場合、「結合特異性」は、抗原決定基と反応する個々の抗体結合部位の能力を指す。典型的には、本発明の抗体の結合部位は、Ｆａｂ部分に位置し、重鎖及び軽鎖の超可変領域から構築される。
「親和性」は、単一抗原結合部位とその抗原との間の相互作用の強度である。抗原に対する本発明の抗体の単一抗原結合部位は、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。典型的には、治療用途のための抗体は、Ｋｄが１×１０－１０Ｍまで低下した親和性、又は更にはより高い親和性（すなわち、更に低いＫｄ）を有し得る。
「抗原」は、宿主生物において（抗体を産生するために）免疫応答を誘導することができる、及び／又は抗体によって標的化されることができる分子である。分子レベルにおいて、抗原は、抗体の抗原結合部位によって結合される能力を特徴とする。また、抗原の混合物は「抗原」とみなすことができ、すなわち、当業者であれば、時には腫瘍細胞の溶解物、又はウイルス粒子が「抗原」として示されてもよく、その一方で、かかる腫瘍細胞溶解物又はウイルス粒子の調製は、多くの抗原決定基が存在することを認識するであろう。抗原は、少なくとも１つ、多くの場合、より多くのエピトープを含む。
「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位である。エピトープは、タンパク質の３次フォールディング（それぞれ、いわゆる直鎖及び立体構造エピトープ）によって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸から形成することができる。連続的な直鎖アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されて保持される一方で、３次フォールディングにより形成されるエピトープは、構造が、典型的には、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的コンフォメーションにおいて３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸を含んでもよい。
用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、任意の生物の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含み、特に明記されない限り、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。重鎖可変ドメインという用語は、特に明記されない限り、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。重鎖の断片としては、ＣＤＲ及びＦＲ、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端へ）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片は、抗原を特異的に認識することができ、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。
用語「軽鎖」は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、又はＶＬ（又はその機能的断片）、及び免疫グロブリン定常ドメイン、又は任意の生物からのＣＬ（又はその機能的断片）配列を含む。特に明記されない限り、用語「軽鎖」は、ヒトのカッパ、ラムダ、及びこれらの組み合わせから選択される軽鎖を含み得る。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインは、典型的には、特に明記されない限り、３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域を含む。概して、全長軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメイン、及び軽鎖定常ドメインを含む。本発明で使用することができる軽鎖としては、例えば、重鎖によって選択的に結合したエピトープに選択的に結合しないものが挙げられる。
本発明の抗体で使用するのに好適な軽鎖には、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリー又はｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で、最も一般的に使用される軽鎖をスクリーニングすることにより同定できるものなどの共通軽鎖が含まれ、該軽鎖は、重鎖のエピトープ結合ドメインの親和性及び／又は選択性を実質的に阻害しないが、一連の重鎖と対合するのにも適している。例えば、好適な軽鎖は、そのゲノムに組み込まれた共通軽鎖を有するＭｅＭｏ（登録商標）などのトランスジェニック動物由来のものを含み、これは、重鎖に多様性を有し、該抗原への曝露時に抗原に特異的に結合することができる共通軽鎖抗体の大きなパネルを生成するために使用することができる。
本発明による用語「共通軽鎖」は、同一であり得る、又はいくつかのアミノ酸配列の違いを有し得る軽鎖を指し、本発明の抗体の結合特異性は影響を受けない、すなわち、その違いは機能的結合領域の形成に実質的に影響を与えない。
例えば、本明細書において使用される共通鎖の定義の範囲内で、同一ではないが機能的に同等である可変鎖を調製又は発見することが可能である（例えば、保存的アミノ酸変化、同族鎖と対合する場合に結合特異性に寄与しないか、又は部分的にのみ寄与する領域におけるアミノ酸の変化などを導入及び試験することにより）。したがって、かかる変異体は、異なる同族鎖を結合し、機能的抗原結合ドメインを形成することも可能である。したがって、本明細書において使用する場合、用語「共通軽鎖」は、重鎖との対合後に得られる抗体の結合特異性を保持しながら、同一であり得る又はいくつかのアミノ酸配列の差異を有し得る軽鎖を指す。特定の共通軽鎖とかかる機能的に同等である変異体との組み合わせは、用語「共通軽鎖」に包含される。国際公開第２００４／００９６１８号及び同第２００９／１５７７７１号を参照して、共通軽鎖の使用について詳細に説明する。
「Ｆａｂ」は、可変領域を含む結合ドメイン、典型的には、対合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む結合ドメインを意味する。Ｆａｂは、定常軽ドメイン（ＣＬ）及びＶＬドメインと対合するＣＨ１及びＶＨドメインを含む、定常領域ドメインを含み得る。かかる対合は、例えば、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおいてジスルフィド架橋を介した共有結合として行ってもよい。
「単鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）は、リンカー、例えばペプチドリンカー、例えば長さが約１０～約２５のアミノ酸を介して接続されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む結合ドメインを意味する。
本明細書において、「接続された」という用語は、一次アミノ酸配列によって互いに接合されるドメインを指す。例えば、ベース抗体部分は、リンカーを介して追加の結合ドメイン（又は追加の結合ドメインから追加の結合ドメイン）に接続されてもよい。同様に、ＣＨ１ドメインは可変重領域に接続されてもよく、ＣＬドメインは可変軽領域に接続されてもよい。
次に、「対合」は、本発明のポリペプチド間における、これらが多量体化することができるような相互作用を指す。混合結合ドメインなどの抗体鎖又はポリペプチドのドメインは、共有結合又は非共有相互作用を介して、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、水媒介在水素結合、塩橋若しくは他の静電力、芳香族側鎖間の引力相互作用、ジスルフィド結合の形成、又は当業者に知られている他の力を介して、相互作用及び対合して界面を形成し得る。
本明細書における核酸又はアミノ酸配列について言及する場合、「パーセント（％）同一性」は、最適な比較目的のために配列をアラインメントした後、選択された配列中の残基と同一である候補配列中の残基の割合として定義される。核酸配列を比較するパーセント配列同一性は、デフォルト設定を使用してＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １０．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して求められる。この設定には、変更されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３～４６８０）、ｓｗｇａｐｄｎａｒｎｔスコアマトリックス、１５のギャップオープンペナルティ、及び６．６６のギャップエクステンションペナルティを用いる。アミノ酸配列は、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションとアラインメントされる。この設定には、変更されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４）、ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２スコアマトリックス、１０のギャップオープニングペナルティ、及び０．１のギャップエクステンションペナルティを用いた。
「複数」とは、２つ以上を意味する。
本明細書に記載の抗体の「変異体」は、抗体の機能的部分、誘導体及び／又は類似体を含み得る。これには、抗体模倣体、モノボディ、アプタマーが含まれる。
変異体は、典型的には、抗体の結合特異性、例えば二重特異性抗体の特異性を維持する。変異体は、本明細書に記載されるような結合ドメイン、多量体又は抗体の機能的部分又は誘導体であり得る。
本明細書に記載の結合ドメイン、多量体又は抗体の機能的部分は、かかる結合ドメイン、多量体又は抗体と同じ標的に結合する可変ドメインを含む部分である。
本明細書に記載の抗体の機能的誘導体は、連結領域によって連結された、１つの標的に結合する可変ドメインと、もう１つの標的に結合する可変ドメインとを含むタンパク質である。可変ドメインは、かかる可変ドメイン、又はＦａｂ断片若しくはリンカーを介して一緒に連結されたＶＨ及びＶＬを含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片などの可変ドメイン様分子であってもよい。可変ドメイン様分子の他の例は、いわゆる単一ドメイン抗体断片である。単一ドメイン抗体断片（single-domain antibody fragment、ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体領域を有する抗体断片である。抗体全体と同様に、これは特定の抗原に選択的に結合することができる。わずか１２～１５ｋＤａの分子量しか有さない場合、単一ドメイン抗体断片は、２つの重鎖タンパク質及び２つの軽鎖で構成される共通抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さく、更にはＦａｂ断片（約５０ｋＤａ、１つの軽鎖と半分の重鎖）及び単鎖可変断片（約２５ｋＤａ、２つの可変領域、１つは軽鎖から、１つは重鎖から）よりも小さい。単一ドメイン抗体自体は、正常な抗体よりもはるかに小さいことはない（典型的には、９０～１００ｋＤａである）。単一ドメイン抗体断片は、大部分が、ラクダに見られる重鎖抗体から遺伝子操作され、これらはＶＨＨ断片（ナノボディ（登録商標））と呼ばれる。一部の魚類もまた、ＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体断片を得ることができる重鎖のみの抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新抗原受容体」）も有する。代替のアプローチは、ヒト又はマウスからの共通免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）からの二量体可変ドメインを単量体に分割することである。単一ドメイン抗体へのほとんどの研究は、現在、重鎖可変ドメインに基づくが、軽鎖に由来するナノボディも、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。可変ドメイン様分子の他の非限定的な例は、ＶＨＨ、ヒトドメイン抗体（Domain Antibody、ｄＡｂ）及びユニボディである。好ましい機能的部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む可変ドメインを含む部分である。このような可変ドメインの非限定的な例は、Ｆ（ａｂ）－断片及び単鎖Ｆｖ断片である。可変ドメイン（様）結合の二重特異性フォーマットは、例えば、２つの異なるｓｃＦｖに結合されたヒト血清アルブミン（Human Serum Albumin、ＨＳＡ）；二量体化モチーフを介して一緒に結合された２つの異なるｓｃＦｖ、又はｓｃＦｖ断片の二量体化をもたらすために、螺旋束又はコイルドコイルなどの自己会合二次構造を含む二重特異性ミニ抗体（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５：１２３３－３４）である。ｓｃＦｖをリンカーに結合するための好適なＨＳＡリンカー及び方法の例は、国際公開第第２００９／１２６９２０号に記載されている。
機能的誘導体は、抗体模倣体、ポリペプチド、アプタマー、又はこれらの組み合わせであり得る。これらのタンパク質又はアプタマーは、典型的には、１つの標的に結合する。本発明のタンパク質は、２つ以上の標的に結合する。これらの抗体、抗体模倣体、ポリペプチド及びアプタマーの任意の組み合わせは、当該技術分野において既知の方法によって一緒に連結され得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の結合分子は、コンジュゲート又は融合タンパク質である。
抗体模倣体は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合することができるが、抗体に構造的に関連しないポリペプチドである。抗体模倣体は、通常、約３～２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチド又はタンパク質である。抗体に対する共通の利点は、より良好な溶解性、組織浸透、熱及び酵素に対する安定性、並びに比較的低い生産コストである。抗体模倣体の非限定的な例は、アフィボディ分子（典型的には、プロテインＡのＺドメインに基づく）、アフィリン（典型的には、ガンマ－Ｂ結晶質又はユビキチンに基づく）、アフィマー（典型的には、シスタチンに基づく）、アフィチン（典型的には、スルホロブス・アシドカルダリス（Sulfolobus acidocaldarius）からのＳａｃ７ｄに基づく）、アルファボディ（典型的には、三重螺旋コイルドコイルに基づく）、アンチカリン（典型的には、リポカリンに基づく）、アビマー（典型的には、様々な膜受容体のＡドメインに基づく）、ＤＡＲＰｉｎ（典型的にはアンキリン反復モチーフに基づく）、フィノマー（典型的にはＦｙｎ７のＳＨ３ドメインに基づく）、ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（典型的には、様々なプロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメインに基づく）、及びモノボディ（典型的にはフィブロネクチンのＩＩＩ型ドメインに基づく）である。
モノボディは、分子スカフォールドとしてフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（fibronectin type III domain、ＦＮ３）を使用して構築される合成結合タンパク質である。モノボディは、標的結合タンパク質を作製するための抗体の単純かつロバストな代替物である。「モノボディ」という用語は、ヒトフィブロネクチンの第１０のＦｎ３ドメインを使用して、モノボディ概念を実証する最初の論文を公開したＫｏｉｄｅのグループによって、１９９８年に作り出された。
モノボディ及び他の抗体模倣体は、典型的には、スキャフォールドの部分が、分子ディスプレイ及びファージディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、及び酵母表面ディスプレイなどの指向進化技術を使用して多様化されるコンビナトリアルライブラリーから生成される。多数の抗体模倣体は、それらのそれぞれの標的に対して高い親和性及び高い特異性を有する。
アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きなランダム配列プールから選択することによって作製されるが、天然アプタマーもリボスイッチ中に存在する。アプタマーは、巨大分子として基本研究及び臨床目的の両方に使用することができる。
「非結合」相互作用は、共有結合によって結合されていない原子間で作用する。したがって、これらは電子の共有を伴わない結合であるが、分子間又は分子内の電磁相互作用のより分散した変化を伴う。非結合相互作用としては、水素結合、イオン相互作用、ハロゲン結合などの静電相互作用が挙げられる。ファンデルワールス力は、永久双極子又は誘導双極子（又は多重極子）が関与する静電相互作用のサブセットである。これらには、永久双極子－双極子相互作用、双極子－誘導双極子相互作用、及び誘導双極子－誘導双極子相互作用が含まれる。塩橋は、水素結合及びイオン結合の２つの非共有相互作用の組み合わせである。疎水性相互作用は、より強い水－水相互作用により、強制的に結合される非極性（非イオン化性）炭化水素分子の相互作用である。
本明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」、「含む（include）」、及び「有する（having）」という単語、並びに「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、及び「含む（including）」などの変形は、包括的に解釈されるべきである。すなわち、これらの単語は、文脈によって許される場合、具体的に列挙されていない他の要素又は整数の可能な包含を伝えることを意図している。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、２つ以上の（すなわち、１つ又は少なくとも１つ）文法的対象の物品を指すために使用される。一例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味し得る。
可変領域、結合ドメイン、多量体、及び抗体
本発明は、結合ドメイン、及び結合ドメインを含む多量体、例えば抗体、又はそのいずれかの変異体に関する。典型的には、本発明の結合ドメインは、ヒトに対して系統発生的に遠位にある生物、例えばトリ、好ましくはニワトリ、アヒル、又はダチョウの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含む。その可変領域は典型的には、ヒト可変領域と対合する。したがって、本明細書に開示される本発明の結合ドメインは、キメラ、又はヒト化又は混合結合ドメインであり得る。
本発明は、結合ドメイン、及び結合ドメインを含む多量体、例えば抗体、又はそのいずれかの変異体に関する。典型的には、本発明の結合ドメインは、ヒトに対して系統発生的に遠位にある生物、例えばトリ、好ましくはニワトリ、アヒル、又はダチョウの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含む。その可変領域は典型的には、ヒト可変領域と対合する。したがって、本明細書に開示される本発明の結合ドメインは、キメラ、又はヒト化又は混合結合ドメインであり得る。
典型的には、可変領域は、トリ、好ましくはニワトリ、アヒル又はダチョウの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされ、コードされる可変領域は重鎖可変領域であり、軽鎖可変領域であるヒト可変領域と安定して対合することができる。あるいは、トリ、好ましくはニワトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域は、軽鎖可変領域であり得、重鎖可変領域であり得るヒト可変領域と対合することができる。
核酸への言及における、「基づく」とは、核酸配列が、それが基づく核酸と同じアミノ酸をコードすることを意味し、その基づく核酸配列又は発生源に一致する特定のコドンに関係なく、遺伝子コードにおける冗長性を考慮し、同じ残基をコードする代替コドンを提供する。「由来する」とは、対象となる生物の核酸から核酸が、クローニングされ得るか、又は合成的に産生され得その発生源の配列情報と一致すことを意味する。
結合ドメインは、可変領域、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、修飾Ｆａｂドメイン若しくはｓｃＦｖ、又はそれらのいずれかの機能的断片を含んでもよい。
トリ
本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、キジ目、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス（grouse）、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン（ptarmigan）、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル、又はダチョウを含むトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる、免疫グロブリン可変領域又はその一部分を含む。
本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、キジ目、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス（grouse）、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン（ptarmigan）、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル、又はダチョウを含むトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる、免疫グロブリン可変領域又はその一部分を含む。
本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域、好ましくは重鎖可変領域を含み、かかる可変領域は、ヒトＶＨ及びＶＬ界面間に存在するもの、例えば、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂのもの（図４ａを参照）、と実質的に同じ数の非結合静電相互作用、及び好ましくはより多くのかかる相互作用を含む。
本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、好ましくは、可変領域、好ましくは重鎖可変領域を含む混合結合ドメインであり、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされ、ヒト鎖、好ましくはヒトＶＬと対合しており、ＶＨ／ＶＬ界面は、ＶＨ／ＶＬ界面で少なくとも５、好ましくは１０以上の相互作用を有し、これは、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂの同じ位置に見出されるヒトＶＨ及び共通ＶＬと比較して、相同であり、好ましくは同一である。
本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、ヒト可変領域をコードする。
本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、トリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるＶＨ領域を含むことができ、これはヒト軽鎖領域との界面を形成し、該結合ドメインのＶＨ／ＶＬ界面は、ＶＨ領域とヒトＶＬ領域との間の少なくとも４、好ましくは５、好ましくは８、より好ましくは１０の静電接触点を含み、これはヒトＶＨ領域／ヒトＶＬ領域結合ドメイン界面の静電接触点と同一又は同等であり、好ましくは、該ヒトＶＬは、ＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１共通軽鎖（配列番号７）；ＩｇＶＫ１－３９／ＩＧＪＫ５共通軽鎖（配列番号１０）；ＩｇＶＫ３－１５／ＩＧＪＫ１共通軽鎖（配列番号８７）；ＩｇＶＫ３－２０／ＩＧＪＫ１共通軽鎖（配列番号８８）；又はＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３共通軽鎖（配列番号８９）のものであり、最も好ましくは、ヒトＶＬは、ＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１共通軽鎖（配列番号７）のものであり、好ましくは、コンパレーターヒト結合ドメインは、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂである。
あるいは、本明細書に記載の本発明の結合ドメインは、トリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるＶＨ領域を含み、これはヒト軽鎖領域との界面を形成し、該結合ドメインのＶＨ／ＶＬ界面は、ＶＨ領域とヒトＶＬ領域との間の少なくとも１４、より好ましくは２４の静電接触点、より好ましくは２８の静電接触点を含み、好ましくは、該ヒトＶＬは、ＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１共通軽鎖（配列番号７）；ＩｇＶＫ１－３９／ＩＧＪＫ５共通軽鎖（配列番号１０）；ＩｇＶＫ３－１５／ＩＧＪＫ１共通軽鎖（配列番号８７）；ＩｇＶＫ３－２０／ＩＧＪＫ１共通軽鎖（配列番号８８）；又はＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３共通軽鎖（配列番号８９）のものであり、最も好ましくは、ヒトＶＬは、ＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１共通軽鎖（配列番号７）のものである。
本明細書に開示される発明によれば、結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体が存在し、これは、ヒトから系統発生的に遠位にある動物の、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、ヒト可変領域と対合する場合、かかる可変領域は、ヒトＶＨ及びヒトＶＬ界面に存在するもの、好ましくは、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂにおいて見られるようなもの、と実質的に同じ可変領域界面における静電接触点を含み、ＶＨ、ＶＬ界面でのヒトＶＬ可変領域との４、好ましくは５、好ましくは８、より好ましくは１０の静電相互作用、好ましくはＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１軽鎖、ＩｇＶＫ１－３９／ＩＧＪＫ５軽鎖、ＩｇＶＫ３－１５／ＩＧＪＫ１軽鎖、ＩｇＶＫ３－２０／ＩＧＪＫ１軽鎖、又はＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３共通軽鎖、最も好ましくは、ＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１又はＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０５軽鎖を含み、かかる動物は、ニワトリ、ダチョウ、又はアヒルである。
本発明の結合ドメイン、多量体、又は抗体の定常領域は、典型的にはヒト定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＬ）であるが、げっ歯類若しくは他のキメラ定常領域、又はヒトから系統発生的に遠位にある動物の、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域と同じ生物若しくは発生源からの定常領域を含み得る。
結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又は本発明の変異体は、可変領域が、トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるものであり得、この核酸は、Ｂ細胞の発達を介して及び／又はかかる動物の抗原曝露への応答を含むＶ（Ｄ）Ｊ組換えをされている。該結合ドメインは、該可変領域が、ヒト軽鎖可変領域、好ましくは共通軽鎖と対合する重鎖可変領域であり、より好ましくはＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１軽鎖（配列番号１）ＮＯ：５）、ＩｇＶＫ１－３９／ＩＧＪＫ５軽鎖（配列番号９３）、ＩｇＶＫ３－１５／ＩＧＪＫ１軽鎖（配列番号９４）、ＩｇＶＫ３－２０／ＩＧＪＫ１軽鎖（配列番号９５）、又はＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３共通軽鎖（配列番号９６）、最も好ましくはＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１共通軽鎖（配列番号５）を含むものであり得る。
本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体は、可変領域が、トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるものであり得、この核酸は、かかる動物の抗原曝露への応答を含むＶ（Ｄ）Ｊ組換えをされている。該結合ドメインは、該可変領域が、ヒト重鎖可変領域、好ましくは共通重鎖と対合する軽鎖可変領域であるものであり得る。
本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体は、可変領域がヒト化され、その結果、ＣＤＲがトリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるものであり得、この核酸は、Ｂ細胞の発達を介して及び／又はかかる動物の抗原曝露への応答を含むＶ（Ｄ）Ｊ組換えをされている。
本発明による多量体は、本明細書に記載されるような少なくとも１つの結合ドメインを含む。本発明による多量体は、一価、二価、又は多価の多量体又は抗体であり得る。
本明細書に開示される本発明の二価又は多価の抗体又は多量体は、１つ、２つ、又は好ましくは３つ以上の標的に結合することができ、標的は抗原又は所与の抗原のエピトープであり得る。
動物の免疫化
本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体は、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、例えば対象となる抗原又はエピトープで免疫化されたトリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含む。したがって、可変領域は、該抗原又はエピトープに対して特異性を有する。
本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体は、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、例えば対象となる抗原又はエピトープで免疫化されたトリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域を含む。したがって、可変領域は、該抗原又はエピトープに対して特異性を有する。
トリ、例えば、ニワトリ、アヒル、又はダチョウなどの多様な一連の動物を免疫化する方法は、当業者によく知られている。好適な免疫化プロトコルは、典型的には、Ｂ細胞の選択的増殖を引き起こすプロトコルである。つまり、一次免疫化及びブースター免疫化は、対象となる抗原又はエピトープに結合する抗体を産生するＢ細胞の選択的増殖を引き起こすように設計されている。免疫化プロトコルは、例えば、一次免疫化及びその後の各ブースター免疫化中に、異なる形態の抗原又は断片を使用し得る。例えば、抗原は、細胞の膜、組換えタンパク質、別のタンパク質に融合された組換えタンパク質、タンパク質のドメイン、又はタンパク質のペプチド上に発現され得る。免疫化プロトコルは、一次免疫化及び／又はブースター免疫化中にアジュバントの使用を含み得る。
アジュバントは、バイスタンダーＢ細胞の非特異的増殖の程度を制限するためにのみ一次免疫化中に使用することができる。バイスタンダーＢ細胞は、Ｂ細胞の表面に発現している抗体受容体に抗原が結合するステップなしで活性化される細胞である。例えば、Ｆｃ融合タンパク質による免疫化により、多くの場合、強力な抗Ｆｃ応答がもたらされ、ここで全てのＢ細胞の最大約７０％が、対象となる抗原ではなく、融合タンパク質のＦｃ部分に反応することが当技術分野で知られている。免疫化に使用される抗原によって活性化されたＢ細胞を優先的に増殖させるために、免疫化プロトコルは、アジュバントなしで使用され得る。
本発明の結合ドメインでの使用に好適な可変領域をコードする核酸は、任意の好適な組織から、例えば、卵から、リンパ組織から、又は骨髄から（すなわち、Ｂ細胞を産生する組織から）回収することができる。
したがって、本発明の結合ドメイン又は多量体又はその変異体を産生するための方法は、例えば、Ｂ細胞の集団からの抗体、又はトリから得られた卵若しくは血清からの抗体の可変領域をコードする核酸を単離するステップを少なくとも含み得、該トリは抗原で免疫化されており、その結果、対象となる抗原又はエピトープと反応するＢ細胞の選択的クローン増殖が優先的に誘導される。トリなどの好適な動物は、タンパク質の形態の抗原で、又は核酸配列の形態の抗原で免疫化され得、これはトリが該核酸配列で免疫化されたときに抗原を発現することができる。
トリは、例えば、筋肉内ワクチン接種によって、又は遺伝子銃（Gene-Gun）プラスミド免疫化によって、又は当技術分野で知られている他の任意の手段によって免疫化され得る。Ｂ細胞の選択的クローン増殖を誘導する好ましい方法は、ＤＮＡタトゥーワクチン接種である。「ＤＮＡタトゥーワクチン接種」という用語は、プラスミドＤＮＡをロードした固体振動針により、皮膚を繰り返し穿刺し、表皮と真皮上部の両方を傷つけ、皮膚の炎症を引き起こし、その後治癒する侵襲的処置を指す（Ｂｉｎｓ ｅｔ ａＩ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：８９９－９０４，２００５；Ｐｏｋｏｒｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｔｈｅｒ．６：４，２００８）。該ＤＮＡは、トリにおける発現のために最適化されたコドンであってもよく、遺伝子サイレンシングを防止するように設計された配列を含んでもよい。
ニワトリの免疫化プロトコルは当技術分野で知られている。例えば、Ｓｃｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，ＡＴＬＡ Ａｌｔｅｒｎ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．２４（１９９６）９２５－９３４を参照されたい。また、ｈｔｔｐ：／／ｇａｌｌｕｓｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｉｇｙ－ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ、及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｎｌ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ｃｕｓｔｏｍ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／ｃｕｓｔｏｍ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／ｃｕｓｔｏｍ－ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／ｃｕｓｔｏｍ－ｃｈｉｃｋｅｎ－ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍｌも参照されたい。ニワトリの免疫化を行う商業的に利用可能な会社としては、例えば、Ａｖｅｓ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．，Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏ，Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｌａｍｐｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｉｅｓ，Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ａｌｄｅｖｒｏｎ，Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ ａｎｄ Ｃａｐｒａｌｏｇｉｃｓが挙げられる。
アヒル及びダチョウも同様に免疫化することができる。簡単に言うと、アヒルとダチョウは、抗原とフロイント完全アジュバントとを含む混合物の皮下注射又は筋肉内注射を受けることができる。次に、抗原とフロイント不完全アジュバントとの混合物を用いてブースターショットを投与することができる。
最初のアヒルの免疫化から１週間後、アヒルの卵を回収し始め、４℃での保管することができる。ブースターショットは４週間ごとに繰り返すことができ、各ブースター注射の７日後に血清を分析することができる。その後の手順には、卵黄からのＩｇＹの水抽出と、それに続く脱脂、塩析、脱塩、濃縮の短いプロトコルが含まれる。抗体溶液のタンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度によって決定できる。
最初のダチョウ免疫化の１週間後、頸静脈から採取した血液サンプルから血清抗体レベルを測定できる。ブースターは１週間おきに投与され得る。４週間で、卵黄抗体レベルはアガロースゲルでの沈殿反応によって測定できる。アヒルの免疫化及び抗体単離は、例えば、米国特許第６６８０３７６（Ｂ２）号及びオーストラリア特許第７８４９００号、並びにＣｈｉｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．２００８，４６：５３９－５４４に記載されおり、ダチョウの免疫化及び抗体単離は、例えば、Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ Ｍｅｄ．２０１１，２：４１－４５及び国際公開第２００７０２６６８９号に記載されている。
代表的な免疫化プロトコルは、免疫化前の少なくとも１つの卵又は血清の収集のステップを含み得る。これらの卵から回収されたＩｇＹは、対照として使用できる。０日目に、例えば、０．０２～０．５ｍｇの抗原（例えば、フロイント完全アジュバント、Ｓｐｅｃｏｌ、リポペプチド（Ｐａｍ３－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－［Ｌｙｓ］４、例えば、２５０μｇの量で）を、皮下及び／又は筋肉内で、複数の部位でニワトリの胸部組織に注入する。抗原／アジュバントの総量は約１ｍｌであり得、アジュバントはその容量の半分から３分の２であり得る。ウサギを免疫化するために使用されるのと同程度の量の抗原が使用される。抗原の免疫原性に応じて、１回又は２回又は３回又は４回以上のブースト免疫化後にのみ、高い抗体価（最大１：１００，０００～１：１，０００，０００）が達成され得る。したがって、ブースター免疫化は、不完全フロイントアジュバントと約半分の量の抗原（初期の免疫化と比較して）を使用して、１０、２０、及び３０日目に実行され得る。３０日目までに卵又は血清中の特異抗体を検出する必要がある。長期間の抗体産生にわたって、例えば、ニワトリは追加のブースター免疫化を受けることがある。ニワトリなどのトリの場合、雌のトリは通常約７２週間連続して産卵し、その後、産卵量が低下する。卵又は血清は必要に応じて回収することができ、次いで、抗体は卵から、典型的には卵黄から回収することができる。
様々なＩｇＹ抽出方法が、例えば、Ｄｅ Ｍｅｕｌｅｎａｅｒ ＆ Ｈｕｙｇｈｅｂａｅｒｔ（Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１３：２７５－２８８；レビューについては、Ｓｃｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．Ａｌｔｅｒｎ．Ｌａｂ Ａｎｉｍ．２００５；３３：１２９－１５４も参照されたい）により詳細に検討される。概して、これらの方法は３つの主要な群に分けることができる。
１．沈殿法：硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カプリル酸、及びカラギーナンを伴う。
２．クロマトグラフィー法：親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、チオフィリック（thiophylic）相互作用クロマトグラフィー、及びゲル濾過クロマトグラフィー。
３．限外濾過。
ＩｇＹ調製物の純度は、方法の組み合わせによって高めることができる。例えば、ＰＥＧ沈殿を親和性クロマトグラフィーと組み合わせたり、硫酸アンモニウム沈殿をイオン交換クロマトグラフィーと組み合わせたりすることができる。場合によっては、最終的な用途に応じて、ＩｇＹの水抽出物で十分な場合がある。好適な方法の任意の組み合わせを使用して、ＩｇＹ調製物を回収することができる。
１．沈殿法：硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、カプリル酸、及びカラギーナンを伴う。
２．クロマトグラフィー法：親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、チオフィリック（thiophylic）相互作用クロマトグラフィー、及びゲル濾過クロマトグラフィー。
３．限外濾過。
ＩｇＹ調製物の純度は、方法の組み合わせによって高めることができる。例えば、ＰＥＧ沈殿を親和性クロマトグラフィーと組み合わせたり、硫酸アンモニウム沈殿をイオン交換クロマトグラフィーと組み合わせたりすることができる。場合によっては、最終的な用途に応じて、ＩｇＹの水抽出物で十分な場合がある。好適な方法の任意の組み合わせを使用して、ＩｇＹ調製物を回収することができる。
トランスジェニック動物
本発明の利点は、本発明に好適な免疫化動物の可変領域及び核酸をヒト可変領域と直接対合して、混合結合ドメインを直接形成することができるので、ヒトに対して系統発生的に遠位にあるトランスジェニック動物を生成しないで済むようにしてくれることである。したがって、混合結合ドメインのファージディスプレイライブラリーは、ヒトＩｇ遺伝子座又はＤＮＡを含むかかる動物のトランスジェニック品種を生成する必要なしに、本発明での使用に好適な動物の野生型抗体レパートリーから直接生成され得る。ファージは、免疫化された動物からの可変領域及び同族のヒト可変領域を含む混合結合ドメインを表示する。
本発明の利点は、本発明に好適な免疫化動物の可変領域及び核酸をヒト可変領域と直接対合して、混合結合ドメインを直接形成することができるので、ヒトに対して系統発生的に遠位にあるトランスジェニック動物を生成しないで済むようにしてくれることである。したがって、混合結合ドメインのファージディスプレイライブラリーは、ヒトＩｇ遺伝子座又はＤＮＡを含むかかる動物のトランスジェニック品種を生成する必要なしに、本発明での使用に好適な動物の野生型抗体レパートリーから直接生成され得る。ファージは、免疫化された動物からの可変領域及び同族のヒト可変領域を含む混合結合ドメインを表示する。
任意選択で、本発明の結合ドメイン又は多量体又はその変異体が生成され得るように免疫化されるヒトに対して系統発生的に遠位にある動物は、例えば本明細書に記載のトランスジェニックトリの生成によるトランスジェニック動物であり得る。かかるトランスジェニック動物は、少なくともそのＢ細胞系統において、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖をコードする核酸を含み得る。
トランスジェニックトリは、重鎖又は軽鎖をコードする配列が、それがＤＮＡ再構成及び／又は体細胞超変異に対して抵抗性をもたらす手段を備えているものであり得る。
核酸は、好ましくは、ヒト、ヒト様、又はヒト化免疫グロブリン鎖をコードする。好ましくは、トランスジェニック動物は、核酸配列が、ヒトＶＫ配列又はヒトＶラムダ配列である配列をコードする軽鎖をコードするものであり得る。好ましくは、軽鎖は、例えば本明細書に記載されるように、ヒト共通軽鎖である。
例えば、ニワトリは重鎖遺伝子座及びラムダ軽鎖遺伝子座を有するが、カッパ軽鎖遺伝子座を有さない。例えば、ヒト共通軽鎖は、ニワトリの重鎖遺伝子座又はラムダ軽鎖遺伝子座に組み込まれ得る。
トリなどの非ヒト動物を調製するための方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５７７１号に既に記載されている。トランスジェニックニワトリを生成するための方法は、Ｃｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＭＡＢＳ ２０１８，１０（１），７１－８０に見出すことができる。
本発明の結合ドメイン、多量体、例えば抗体、又はその変異体を作製するための方法
本発明は、本発明の結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製するための方法に関する。該方法は、
本発明での使用に好適な動物を抗原で免疫化することと；
該動物から、抗原に結合する可変領域をコードする核酸を単離することと；
該核酸によってコードされる可変領域を得て、該可変領域を同族のヒト可変領域と対合することと；を含み、
それにより、混合結合ドメイン、多量体、抗体、又はその変異体を調製する。
本発明は、本発明の結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製するための方法に関する。該方法は、
本発明での使用に好適な動物を抗原で免疫化することと；
該動物から、抗原に結合する可変領域をコードする核酸を単離することと；
該核酸によってコードされる可変領域を得て、該可変領域を同族のヒト可変領域と対合することと；を含み、
それにより、混合結合ドメイン、多量体、抗体、又はその変異体を調製する。
動物からの可変領域コードする核酸、又は、動物の核酸に基づく、核酸に由来する、若しくは核酸から得られる核酸、及び同族のヒト可変領域をコードする核酸を発現することによって、かかる対合を行うことができ、その結果、コードされた可変領域が対合することによって、結合ドメインを生成することができる。
これは、結合ドメインの２つの可変領域をコードする２つの核酸を、該結合ドメインを発現する好適な細胞で発現させることによって実施することができる。
本発明は、本発明の様々な混合結合ドメインを表示するディスプレイライブラリーを調製するための方法に関する。該方法は、核酸を、ファージ若しくは酵母などの生物、又はペプチドディスプレイ用の他のべセルに組み込むことと、本発明の混合結合ドメインをコードすることと、を含み、該生物は、該生物又はべセルの表面上に該結合ドメインを発現及び表示する。複数の結合ドメイン、典型的には複数の異なる結合ドメインは、ファージディスプレイライブラリーを使用することにより、ファージ（各ファージが１つの結合ドメインを表示する）などの複数の生物の表面に表示され得る。
したがって、ディスプレイライブラリーにおいて、免疫化された動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる複数の可変領域は、複数のヒト可変領域と対合するか、又はヒト共通鎖可変領域と対合する。ディスプレイライブラリーは、例えば、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーであり得る。
ファージディスプレイライブラリー内のファージは、免疫化された動物からの可変領域及び同族のヒト可変領域を含む混合結合ドメインを表示する。
ファージディスプレイは、ヒトからの同族可変領域と対合し得る免疫化された動物からの可変領域の選択を可能にする。したがって、結合ドメインは、このプロセスで半分ヒト化される。免疫化された動物からの可変領域が抗原への結合を引き起こす結合ドメインは、例えば、抗原を使用して選択され得る。
細胞及びファージディスプレイライブラリーにおける結合ドメインの発現は、以下により詳細に記載される。
本発明はまた、抗体又はその断片の混合結合ドメインを産生するための方法を提供する。該方法は、ヒト軽鎖可変領域、特にヒト共通軽鎖可変領域を、ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリに基づく、トリに由来する、又はトリから得られる核酸によってコードされる重鎖可変領域と組み合わせることを含む。あるいは、該方法は、ヒト重鎖可変領域、特にヒト共通重鎖可変領域を、ヒトから系統発生的に遠位にある動物、例えばトリに基づく、トリに由来する、又はトリから得られる核酸によってコードされる軽鎖可変領域と組み合わせることを含み得る。
本発明はまた、トランスジェニック動物を使用することにより、キメラ免疫グロブリン結合ドメインをコードする核酸を産生する方法を提供する。該方法は、
（ａ）動物のゲノムがその生殖細胞系列において、再構成されていない免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントと、ヒト再構成共通軽鎖とを含み、抗原に応答して動物が、再構成免疫グロブリン重鎖可変領域によってコードされる重鎖可変領域を含む抗体を産生する、動物を準備することと；
（ｂ）動物を抗原に曝露することにより、動物の免疫応答を刺激することと；
（ｃ）抗体の重鎖可変領域をコードする核酸を単離することと；
（ｄ）抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、細胞内のヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結することと；
（ｅ）該ヒト再構成共通軽鎖をコードするＤＮＡを該細胞に組み込むことと；
（ｆ）細胞が、重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域、並びに対合することができるヒト共通軽鎖を含む結合ドメインを発現するような条件下で、細胞を増殖させることと；
（ｇ）結合ドメインを回収することと；を含む。
（ａ）動物のゲノムがその生殖細胞系列において、再構成されていない免疫グロブリン重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントと、ヒト再構成共通軽鎖とを含み、抗原に応答して動物が、再構成免疫グロブリン重鎖可変領域によってコードされる重鎖可変領域を含む抗体を産生する、動物を準備することと；
（ｂ）動物を抗原に曝露することにより、動物の免疫応答を刺激することと；
（ｃ）抗体の重鎖可変領域をコードする核酸を単離することと；
（ｄ）抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、細胞内のヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結することと；
（ｅ）該ヒト再構成共通軽鎖をコードするＤＮＡを該細胞に組み込むことと；
（ｆ）細胞が、重鎖可変領域及びヒト重鎖定常領域、並びに対合することができるヒト共通軽鎖を含む結合ドメインを発現するような条件下で、細胞を増殖させることと；
（ｇ）結合ドメインを回収することと；を含む。
かかる方法は、再構成可変領域を使用して、本発明の結合ドメインを生成するために好適な動物の同定を含み得、該動物の核酸によってコードされる再構成可変領域とヒトＶＬ領域界面との間の接触点の数を決定するステップを含む。好ましくは、可変領域をコードする核酸が選択され、これは、ヒト／動物可変領域界面における、ヒトＶＨ及びヒトＶＬ界面に存在するもの、好ましくは、配列番号１を有する重鎖可変領域及び配列番号７を有する軽鎖可変領域を含むヒトＦａｂの界面におけるもの、と実質的に同じ静電接触点を含み、４、好ましくは５、好ましくは８、より好ましくは１０の、該界面でのヒトＶＬ領域との静電相互作用を含む。
ディスプレイライブラリー技術
ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイなどの様々な形態のディスプレイ技術が、当技術分野で知られており、本明細書に記載の結合ドメインを使用するために、本明細書に記載の本発明に包含される。
ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイなどの様々な形態のディスプレイ技術が、当技術分野で知られており、本明細書に記載の結合ドメインを使用するために、本明細書に記載の本発明に包含される。
以下の考察はファージディスプレイに焦点を合わせているが、かかる説明は限定的ではなく、本明細書で提供される説明に基づいて、他の形態のディスプレイ技術に容易に適用することができる。
ファージディスプレイは、細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージを使用するタンパク質－タンパク質相互作用、タンパク質－ペプチド相互作用、及びタンパク質－ＤＮＡ相互作用の研究などに使用される屈指の技術である。本明細書に記載のプロトコルの多くは、ファージディスプレイライブラリーの構築及び対象となる抗原に結合するためのファージのパニングのための標準プロトコルであり、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（編集者：Ｐｈｉｌｉｐｐａ Ｍ．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｒｏｂｅｒｔ Ａｉｔｋｅｎ）に記載されている。ライブラリーは、当技術分野で知られている手順、例えば、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３ （Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１１）：ｅ５９）によって記載されているように、ヘルパーファージ株としてＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用するものに従って、増殖及び採取することができる。ファージは、当技術分野で知られている手順、例えば、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３ （Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．２００３．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１１）：Ｅ５９）によって記載されているように、ヘルパーファージ株としてＶＣＳＭ１３を使用するものに従って、増殖及び処理することができる。
例示的な技術において、対象となるタンパク質をコードする核酸、例えば、可変領域をコードする核酸は、ファージコートタンパク質遺伝子に組み込まれ、ファージによりタンパク質をその外側に「表示」させ、一方で、その内部にタンパク質をコードする核酸を含む。このようにして、遺伝子型と表現型との間の関係が確立される。
抗体の発見に関して、ファージディスプレイでは、ＶＨ及び／又はＶＬ領域の大きな集合（ライブラリー）が、繊維状バクテリオファージ粒子の表面に発現し、その結果、それらが対合して結合ドメインを形成する場合がある。これらのライブラリーから、抗原及び表示された結合ドメインとの結合相互作用を介して、ファージを選択することができる。
したがって、表示されるファージは、他のタンパク質、ペプチド若しくはＤＮＡ配列、又は他の形態の標的部分に対してスクリーニングされて、表示されるＶＨ、ＶＬ、又は結合ドメインとそれらの他の部分との間の相互作用を検出することができる。このようにして、ＶＨ、ＶＬ、又は結合ドメインの大きなライブラリーを、自然選択に類似したｉｎ ｖｉｔｒｏ選択と呼ばれるプロセスでスクリーニング及び増幅することができる。
したがって、本発明の結合ドメインは、ファージ上に表示され得る。典型的には、かかる結合ドメインの可変領域の１つは、本明細書に記載の免疫化された動物の、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸から得られる、又は核酸に由来し、また、ヒト可変領域、好ましくは共通鎖、より好ましくは共通軽鎖を含む。したがって、結合ドメインを表示するファージは、動物を免疫化するために使用された抗原を使用して選択され得る。
したがって、本発明は、ファージであって、そのゲノム中に、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、好ましくはトリ、より好ましくはニワトリ、アヒル又はダチョウの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる第１の可変領域をコードする核酸配列と、第２のヒト可変領域をコードする核酸配列と、を含むファージを提供する。好ましくは、第２の可変領域は、該第１の可変領域と対合することができる。
本発明はまた、ファージを調製するための方法であって、そのゲノム中に、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、好ましくはトリ、より好ましくはニワトリ、アヒル又はダチョウの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる第１の可変領域と、該第１の可変領域と対合することができる第２のヒト可変領域をコードする核酸配列と、を含む、方法も提供する。かかる方法は、
トリを抗原で免疫化することと；
該動物から、第１の可変領域をコードする核酸を単離することと；
ファージのゲノムに、該核酸と、第１の可変領域と対合することができる第２のヒト可変領域をコードする核酸とを組み込むことと；を含み、
それによって、ファージを調製する。
トリを抗原で免疫化することと；
該動物から、第１の可変領域をコードする核酸を単離することと；
ファージのゲノムに、該核酸と、第１の可変領域と対合することができる第２のヒト可変領域をコードする核酸とを組み込むことと；を含み、
それによって、ファージを調製する。
より全般的には、本発明によれば、ファージディスプレイを使用して結合ドメインを生成するための方法が提供される。かかる方法は、
（ａ）本明細書に記載されているトリなどの抗原で好適な動物を免疫化することと、
（ｂ）可変領域をコードする１つ以上の核酸を動物から得ることと、
（ｃ）各ファージが、対合することができる２つの可変領域を表示するように、１つ以上の核酸を、同族ヒト可変領域をコードする核酸と共に１つ以上のファージに組み込むことと、
（ｄ）（ａ）で使用された抗原に結合することができる結合ドメインを表示するファージを選択することと、を含み得る。
（ａ）本明細書に記載されているトリなどの抗原で好適な動物を免疫化することと、
（ｂ）可変領域をコードする１つ以上の核酸を動物から得ることと、
（ｃ）各ファージが、対合することができる２つの可変領域を表示するように、１つ以上の核酸を、同族ヒト可変領域をコードする核酸と共に１つ以上のファージに組み込むことと、
（ｄ）（ａ）で使用された抗原に結合することができる結合ドメインを表示するファージを選択することと、を含み得る。
以下は、ステップをより詳細に説明するものであり、ファージディスプレイスクリーニングにおいて用いて、ポリペプチド、この場合、対合した可変ドメインを含む結合ドメインを同定することができ、これは所望の標的タンパク質又はＤＮＡ配列に高い親和性で結合する。このプロセスは免疫選択を再現することができ、このアプローチを使用して多くの異なる結合特異性を有する抗体が単離される（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，１１０５）。
１．標的タンパク質（すなわち、動物を免疫化するために使用される抗原）は、典型的には、例えば、マイクロタイタープレートのウェルに固定化される。
このステップでは、標的タンパク質は、動物を免疫化するために使用される任意の抗原であり得、これに対して、抗体を生成することが望まれる。本発明で使用することができる動物の種類、及びそれらを免疫化するための方法を本明細書に記載する。
２．可変配列をコードする１つ以上の核酸が、標的タンパク質で免疫化された動物から単離される。
しかしながら、典型的には、対象となる抗原に結合することができる異なる可変領域をコードする多数の核酸配列が、動物から単離される。典型的には、単離される核酸は、ＶＨ配列をコードする核酸である。
動物からの核酸の単離は、典型的には、動物からの適切な組織、例えば、脾臓、骨髄、又はリンパ節組織、すなわち、Ｂ細胞を含む組織の回収から始まる。細胞懸濁液は、かかる組織から調製することができ、その後、可変配列をコードする核酸を細胞懸濁液から単離することができる。例えばＴｒｉｓｏｌを使用して好適な細胞懸濁液を調製するための方法は、当技術分野で周知である。所望であれば、脾臓Ｂ細胞画分は、脾臓Ｂ細胞を、例えば、ＣＤ１９選択に基づく陽性選択によって精製することができる。次に、当技術分野で周知の方法に従って、細胞からＲＮＡを調製し、該ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することができる。
次に、ｃＤＮＡからの可変領域コード配列を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットが使用される（典型的には、ＶＨコード配列が増幅される）。このアプローチは、Ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｊｕｎ ２５；２７４（２６）：１８２１８－３０）に記載されており、ニワトリ用の特定のプライマーセットが、実施例に記載されている。典型的には、プライマーは、ＶＨをコードする増幅された核酸の５’’及び３’末端に固有の制限酵素部位を導入して、ファージミドなどの適した（stuaible）ファージディスプレイベクターへの核酸のクローニングを容易にするように設計されている。
３．動物から得られたＶＨ領域などの可変領域をコードする核酸を使用して、ファージディスプレイライブラリーを生成することができる。
ファージミドベクターを使用して、本発明の結合ドメインの発現を、細菌細胞中に又はファージの表面に誘導することができる。ファージミドは、ｆ１ファージからのｆ１複製起点を含むプラスミドである。これは、繊維状ファージＭ１３と組み合わせてクローニングベクターの一種として使用できる。ファージミドはプラスミドとして複製することができ、ウイルス粒子に単鎖ＤＮＡとしてパッケージすることもできる。ファージミドには、二本鎖複製の複製起点（ｏｒｉ）と、単鎖複製及びファージ粒子へのパッケージングを可能にするｆ１ ｏｒｉが含まれている。
したがって、ファージミドを使用してＤＮＡ断片をクローニングし、形質転換及びエレクトロポレーションなどの様々な技術によって細菌宿主に導入することができる。「ヘルパー」ファージによるファージミドを含む細菌宿主の感染は、単鎖ＤＮＡ複製及びファージミドＤＮＡのファージ粒子へのパッケージングを可能にするために必要なウイルス成分を提供する。「ヘルパー」ファージは、最初に宿主細胞の線毛に付着し、次いで、付着後、ファージゲノムを宿主細胞の細胞質に輸送することによって、細菌宿主に感染する。細胞内では、ファージゲノムが細胞質で単鎖ファージミドＤＮＡの産生を引き起こす。次に、このファージミドＤＮＡは、ファージ粒子にパッケージされる。ｓｓＤＮＡを含有するファージ粒子は、細菌の宿主細胞から細胞外環境に放出される。
したがって、本発明に好適な免疫化動物から単離された可変領域をコードする（又はかかる動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる）核酸は、同族可変領域をコードする核酸と共にファージミドベクターにクローニングされ得る。すなわち、各ファージミドは、動物から単離された可変領域をコードする核酸と、その同族可変領域、例えば、ｃＬＣの可変領域をコードする核酸とを含む。ファージミドがファージにパッケージされたときにＦａｂ断片が表示され得るようにするために、定常領域も存在することが好ましい場合がある。
ライブラリーを生成するために、多数のファージミドを好適な細菌細胞に形質転換又はトランスフェクトすることができる。ライブラリーからファージをレスキューするために、ヘルパーファージ、例えば、ＶＣＳＭ１３が細菌細胞に添加され、その後、当業者に周知の技術を使用してファージが回収される。
４．次に、得られたファージディスプレイライブラリーを、対象となる標的、すなわち抗原を含有するマイクロタイタープレートに加え、ファージが該標的に結合する時間を確保した後、皿を洗浄することができる。
５．標的分子と相互作用するファージディスプレイタンパク質は、皿に付着したままであり、他の全ては洗い流される。
６．付着したファージを溶出及び使用して、好適な細菌宿主の感染によって、より多くのファージを作製することができる。新しいファージは、初期混合物中に存在するものよりも、かなり少ない無関係なファージ（すなわち、非結合）を含有する、濃縮された混合物を構成する。
７．ステップ４～６は、任意選択で１回以上繰り返すことができ、結合タンパク質においてファージライブラリーを更に濃縮することができる。
８．相互作用するファージ内の核酸（本発明に好適な動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる可変領域をコードする）を配列決定して、相互作用するタンパク質又はタンパク質断片を同定することができる。
したがって、特に、ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法は、
トリの動物を抗原で免疫化することと；
複数の可変領域をコードする複数の核酸を、該動物から単離することと；
該核酸によってコードされる可変領域の少なくとも一部分がヒト可変領域と対合する、該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーを調製する。
トリの動物を抗原で免疫化することと；
複数の可変領域をコードする複数の核酸を、該動物から単離することと；
該核酸によってコードされる可変領域の少なくとも一部分がヒト可変領域と対合する、該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーを調製する。
したがって、本発明の一態様は、結合ドメインの集団を産生するための方法を提供する。該方法は、少なくとも、
ａ）Ｂ細胞の集団を準備するステップと、
ｂ）核酸を該Ｂ細胞から単離するステップと、
ｃ）該サンプル中の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸配列を増幅するステップと、
ｄ）本質的に全ての増幅産物を少なくとも部分的に配列決定するステップと、
ｅ）ステップｄ）からの全ての配列の頻度分析を実行するステップと、
ｆ）所望のＶＨ配列を選択するステップと、
ｇ）宿主細胞に、該所望のＶＨ配列の少なくとも１つと、ヒト軽鎖可変領域をコードする少なくとも１つの核酸とを含む少なくとも１つのベクターを提供するステップと、
ｈ）該宿主細胞を培養し、ＶＨ及びＶＬポリペプチドの発現を可能にするステップと、
ｉ）該結合分子を得るステップと、を含む。
ａ）Ｂ細胞の集団を準備するステップと、
ｂ）核酸を該Ｂ細胞から単離するステップと、
ｃ）該サンプル中の免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする核酸配列を増幅するステップと、
ｄ）本質的に全ての増幅産物を少なくとも部分的に配列決定するステップと、
ｅ）ステップｄ）からの全ての配列の頻度分析を実行するステップと、
ｆ）所望のＶＨ配列を選択するステップと、
ｇ）宿主細胞に、該所望のＶＨ配列の少なくとも１つと、ヒト軽鎖可変領域をコードする少なくとも１つの核酸とを含む少なくとも１つのベクターを提供するステップと、
ｈ）該宿主細胞を培養し、ＶＨ及びＶＬポリペプチドの発現を可能にするステップと、
ｉ）該結合分子を得るステップと、を含む。
あるいは、ステップｃ）及びｄ）は、代替ステップｃ’及びｄ’、すなわちｃ’）ＶＨ領域配列に特異的な核酸プローブでプローブすることによりＶＨ領域特異的ＤＮＡ配列についてスクリーニングされるｃＤＮＡライブラリーを構築するステップ、及びｄ’）ＶＨインサートを含むクローンの少なくとも部分的な配列決定するステップによって置き換えることができる。
本発明は更に、ファージディスプレイライブラリーを開発し、対象となる標的に結合する可変領域を同定するためにスクリーニングする際の抗体の産生を含む。本方法は、
ａ）上記の抗原に結合することができる結合ドメインを表示するファージの重鎖可変領域をコードする核酸を単離することと；
ｂ）可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結することと；
ｃ）該可変領域ＤＮＡ及びヒト共通軽鎖をコードするＤＮＡを、宿主細胞に組み込むことと；
ｄ）細胞が、対合することができる、ヒト共通軽鎖と対合するヒト重鎖定常領域に操作可能に連結された可変領域を含む抗体を発現するような条件下で、細胞を増殖させることと；
ｅ）抗体を回収することと；を含む。
ａ）上記の抗原に結合することができる結合ドメインを表示するファージの重鎖可変領域をコードする核酸を単離することと；
ｂ）可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結することと；
ｃ）該可変領域ＤＮＡ及びヒト共通軽鎖をコードするＤＮＡを、宿主細胞に組み込むことと；
ｄ）細胞が、対合することができる、ヒト共通軽鎖と対合するヒト重鎖定常領域に操作可能に連結された可変領域を含む抗体を発現するような条件下で、細胞を増殖させることと；
ｅ）抗体を回収することと；を含む。
多くの場合、ファージディスプレイライブラリーから得られた抗体は、高親和性抗体を得るためにｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟に供される（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３，１１０５）。
本発明のファージ、例えば上記の手順によって同定されたファージは、典型的には、トリの、少なくとも一部、核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる可変領域、及びヒト可変領域を表示することが可能であり、該可変領域は、互いに対合する。
本発明によるファージディスプレイライブラリーは、複数のファージミド又はファージを含む。本発明のファージディスプレイライブラリーは、それぞれがトリからの異なる可変領域をコードする最大１０１０個の核酸、例えば、それぞれがトリからの異なる可変領域をコードする最大１０９個又は最大１０８個の核酸を含み得る。本発明のファージディスプレイライブラリーにおいて、実質的に全てのファージは、例えば、Ｆａｂの形態で、本発明の結合ドメインを表示する。
例えば、ＦＡＣＳ分析の使用によって、当業者に周知の方法に従って、免疫化に使用される抗原に結合することができる結合ドメインを同定するために、ファージライブラリーをスクリーニングすることができる。したがって、動物を免疫化するために使用される抗原に対して親和性及び特異性を有する結合領域は、該抗原を使用してスクリーニングすることによって同定され得る。ライブラリーに表示される結合領域の画分は、免疫化するのに使用される抗原に実際に結合し得る。免疫化された動物に由来するいくつかの可変領域は、抗原に結合しない（すなわち、異なる特異性を有する）可能性があり、他の場合、結合領域が代替のＶＨ－ＶＬ ＣＤＲ対合のために、親和性又は特異性を失ったＶＨ／ＶＬ対が形成される可能性がある。
共通鎖
本発明の結合ドメイン又はその多量体、例えば抗体が、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、好ましくはトリ、より好ましくはニワトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる一連の重鎖可変領域と結合して、機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる共通軽鎖（可変領域）を有することは、本発明の好ましい態様である。（国際公開第２００４／００９６１８号、同第２００９／１５７７７１号）。
本発明の結合ドメイン又はその多量体、例えば抗体が、ヒトに対して系統発生的に遠位にある動物、好ましくはトリ、より好ましくはニワトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされる一連の重鎖可変領域と結合して、機能的抗原結合ドメインを有する抗体を形成することができる共通軽鎖（可変領域）を有することは、本発明の好ましい態様である。（国際公開第２００４／００９６１８号、同第２００９／１５７７７１号）。
本発明の多価抗体において使用するための共通軽鎖（可変領域）は、好ましくはヒト軽鎖（可変領域）である。共通軽鎖（可変領域）は、好ましくは生殖細胞系列配列を有する。好ましい生殖細胞系列配列は、ヒトレパートリーで頻繁に使用され、良好な熱力学的安定性、収率、及び溶解度を有する軽鎖可変領域である。好ましい生殖細胞系列軽鎖は、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１（図１７Ａ；配列番号５）である。共通軽鎖可変領域は、好ましくは、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１の可変領域である（図１７Ｂ；配列番号６及び７）。共通軽鎖は、好ましくは、０～５個のアミノ酸挿入、欠失、置換、付加、又はこれらの組み合わせを有する、図１７Ｂ、又は１７Ｄに示されるような（それぞれ配列番号７又は１０）軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい共通軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／ＩＧＪκ５（図１９Ｇ；配列番号２５）である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／ＩＧＪκ５の可変領域を含む。
更に好ましい共通軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ３－１５／ＩＧＪκ１（図１９Ｈ；配列番号９４）である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ３－１５／ＩＧＪκ１の可変領域を含む。
更に好ましい共通軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ３－２０／ＩＧＪκ１（図１９Ｉ；配列番号９５）である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ３－２０／ＩＧＪκ１の可変領域を含む。
更に好ましい共通軽鎖は、ヒトラムダ軽鎖ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３（図１９Ｊ；配列番号９６）である。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３の可変領域を含む。
共通軽鎖は、好ましくは、軽鎖定常領域、好ましくはカッパ軽鎖定常領域を更に含む。共通軽鎖をコードする核酸は、共通軽鎖タンパク質を発現するために使用される細胞系に対してコドン最適化され得る。コード核酸は、生殖細胞系列核酸配列から逸脱し得る。
本発明の結合ドメイン又はその多量体、例えば多価抗体で使用するための共通軽鎖（可変領域）は、ヒトラムダ軽鎖ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３（図１９Ｊ）などのラムダ軽鎖であり得る。したがって、これは本発明の文脈でも提供される。本発明の共通軽鎖は、カッパ又はラムダ軽鎖の定常領域を含み得る。これは、好ましくは、カッパ軽鎖の定常領域であり、好ましくは、該共通軽鎖は生殖細胞系列軽鎖であり、好ましくは、ＩｇＶＫ１－３９遺伝子セグメントを含む再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖、例えば、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶＫ１－３９＊０１／ＩＧＪＫ１＊０１（図１７Ａ）；ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９／ＩＧＪκ５（図１９Ｇ）；ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ３－１５／ＩＧＪκ１（図１９Ｈ）；又はヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ３－２０／ＩＧＪκ１（図１９Ｉ）である。当業者は、「共通」が、アミノ酸配列が同一ではない軽鎖の機能的等価物を指すことも認識するであろう。該軽鎖の多くの変異体が存在し、機能的結合領域の形成に実質的に影響を与えない変異（欠失、置換、付加）が存在する。
ＩｇＶκ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１－３９、ＩＧＫＶ１－３９、ＩＧＫＶ１－３９としても知られる。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５７４０、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＩｇＶκ１－３９の好ましいアミノ酸配列を図１７に示す。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１７は、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶκ１－３９についての２つの好ましい配列を記載している。接合された配列は、ＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ１及びＩＧＫＶ１－３９／ｊｋ５として示され、代替名は、ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１又はＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。これらの名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントの対立遺伝子変異体を包含する。
ＩｇＶκ３－１５は、免疫グロブリン可変カッパ３－１５遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－１５、ＩＧＫＶ３１５、ＩＧＫＶ３－１５としても知られている。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５８１６、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４４４３７である。ＩｇＶκ３－１５の好ましいアミノ酸配列を図１９Ｄ（配列番号９０）に示す。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１９Ａは、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶκ３－１５についての好ましい配列を記載している。接合された配列は、ＩＧＫＶ３－１５／ｊｋ１として示され、代替名は、ＩｇＶκ３－１５＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。この名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントの対立遺伝子変異体を包含する。
ＩｇＶκ３－２０は、免疫グロブリン可変カッパ３－２０遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－２０、ＩＧＫＶ３２０、ＩＧＫＶ３－２０としても知られている。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５８１７、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１２、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２３９９５１である。ＩｇＶκ３－２０の好ましいアミノ酸配列を図１９Ｅ（配列番号９１）に示す。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１９Ｂは、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶκ３－２０についての好ましい配列を記載している。接合された配列は、ＩＧＫＶ３－２０／ｊｋ１として示され、代替名は、ＩｇＶκ３－２０＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。この名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントの対立遺伝子変異体を包含する。
ＩｇＶλ３－２１は、免疫グロブリン可変ラムダ３－２１遺伝子についての短縮形である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンラムダ可変３－２１、ＩＧＬＶ３２０、ＩＧＬＶ３－２１としても知られている。この遺伝因子についての外部Ｉｄｓは、ＨＧＮＣ：５９０５、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８７９６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１６６２．２である。ＩｇＶλ３－２１の好ましいアミノ酸配列を図１９Ｋ（配列番号９７）に示す。これはＶ領域の配列を列挙している。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと組み合わせることができる。図１９Ｊは、Ｊ領域と組み合わせたＩｇＶλ３－２１についての好ましい配列を記載している。接合された配列は、ＩＧλＶ３－２１／ｊｋ３として示され、代替名は、ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪκ３である（ｉｍｇｔ．ｏｒｇでのＩＭＧＴデータベースの世界的なウェブによる命名法）。この名称は例示的なものであり、遺伝子セグメントの対立遺伝子変異体を包含する。
共通軽鎖を産生する細胞は、例えば、再構成生殖細胞系列ヒトカッパ軽鎖ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１及びラムダ定常領域に融合された前述の軽鎖の可変領域を含む軽鎖を産生することができる。本明細書では生殖系列配列を参照する場合、可変領域は生殖系列配列であることが好ましい。
本発明の結合ドメイン又はその多量体、例えば抗体において使用するための好ましい共通軽鎖は、配列番号５に記載された配列を含むものである。
本発明の結合ドメイン又はその多量体、例えば抗体において使用するための共通鎖は、重鎖であってもよく、これもまた本発明の文脈において提供される。共通重鎖は、二重特異性抗体を作製するために当該技術分野において使用されており、本明細書では３つ以上の結合ドメインを含む多価抗体を作製する際に使用することができ、該結合ドメインのうちの２つ以上は、当該技術分野において既知の共通重鎖を含む。例えば、重鎖可変ドメインが全てのライブラリーメンバーについて同じであり、したがって多様性が軽鎖可変ドメインに基づく抗体ライブラリーの使用は、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５６１９号、及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５７７８０号に記載されており、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。共通重鎖を有する結合ドメインを生成するためのこれらの及び他の技術は、当業者によって作られ得、本発明で使用することができる。
本発明の多量体の産生
本発明の多量体、例えば抗体は、上記ものなどの多量体を形成する２つ以上、例えば３つのタンパク質を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物による個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。例えば、本発明に好適な免疫化動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、又は上記の方法によるディスプレイライブラリーからの１つ以上の重鎖可変領域と、抗体を産生するための共通軽鎖可変領域と、をコードする核酸配列で、宿主細胞は共トランスフェクトされ得る。あるいは、本発明の抗体は、１つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物を用いた個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。多重特異性多量体、例えば二重特異性抗体が望まれる場合に、複数の重鎖可変領域又は複数の軽鎖領域を細胞から発現させることができる。
本発明の多量体、例えば抗体は、上記ものなどの多量体を形成する２つ以上、例えば３つのタンパク質を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物による個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。例えば、本発明に好適な免疫化動物の核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる、又は上記の方法によるディスプレイライブラリーからの１つ以上の重鎖可変領域と、抗体を産生するための共通軽鎖可変領域と、をコードする核酸配列で、宿主細胞は共トランスフェクトされ得る。あるいは、本発明の抗体は、１つ以上の軽鎖可変領域及び共通重鎖を一緒にコードする１つ以上の遺伝子構築物を用いた個々の細胞の共トランスフェクションによって産生され得る。多重特異性多量体、例えば二重特異性抗体が望まれる場合に、複数の重鎖可変領域又は複数の軽鎖領域を細胞から発現させることができる。
二重特異性抗体などの多重特異性抗体が望まれる場合、ヘテロ二量体である抗体の産生に有利に働くいくつかの方法が公開されている。本発明において、細胞は、それぞれのホモ二量体の産生よりもヘテロ二量体の産生を優先することが好ましい。このことは、典型的には、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化（つまり、１つの重鎖を第２の重鎖と組み合わせる二量体化）を優先するように、重鎖の定常領域を修飾することによって達成される。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する２つの異なる免疫グロブリン重鎖を含む。
この適合性ヘテロ二量体化ドメインは、好ましくは、適合性免疫グロブリン重鎖ＣＨ３ヘテロ二量体化ドメインである。野生型ＣＨ３ドメインが使用される場合、２つの異なる重鎖（Ａ及びＢ）と共通軽鎖との共発現は、３つの異なる抗体種、ＡＡ、ＡＢ及びＢＢをもたらすであろう。ＡＡ及びＢＢは、２つのホモ二量体抗体の表記であり、ＡＢはヘテロ二量体抗体の表記である。所望のヘテロ二量体産物（ＡＢ）の割合を増加させるために、ＣＨ３操作を使用することができ、又は言い換えれば、以下に定義されるように、適合性ヘテロ二量体化ドメインを有する重鎖を使用することができる。当該技術分野では、重鎖のこのようなヘテロ二量体化が達成され得る様々な方法が記載されている。
本明細書で使用するとき、用語「適合性ヘテロ二量体化ドメイン」は、操作ドメインＡ’が操作ドメインＢ’を有するヘテロ二量体を優先的に形成し、逆もまた同様であり、Ａ’－Ａ’とＢ’－Ｂ’との間のホモ二量体化が減少するように操作を受けたタンパク質ドメインを指す。
米国特許出願公開第１３／８６６，７４７号（現在、米国特許第９，２４８，１８１号として発行）、米国特許出願公開第１４／０８１，８４８号（現在、米国特許第９，３５８，２８６号として発行）、国際公開第２０１３／１５７９５３号、及び国際公開第２０１３／１５７９５４号において、適合性ヘテロ二量体化ドメインを使用して多価抗体を産生するための方法及び手段が開示されている。本発明では、これらの手段及び方法を好適に採用することができる。具体的には、本発明の抗体は、好ましくは、本質的に二重特異性全長ＩｇＧ分子のみを産生するための変異を含む。好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン又はそれに対応する位置におけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵナンバリング）（「ＫＫ－変異体」重鎖）、並びに第２のドメイン又はそれに対応する位置におけるアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ－変異体」重鎖）である（又はその逆）。ＤＥ－変異体及びＫＫ－変異体が優先的に対をなして、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成することが、本発明者らの米国特許第９，２４８，１８１号及び同第９，３５８，２８６号の特許、並びに国際公開第２０１３／１５７９５４号で以前に実証されている。ＤＥ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）又はＫＫ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＫＫＫＫホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３－ＣＨ３界面における荷電残基間の反発力のために、ほとんど発生しない。
国際公開第２０１９／１９０３２７号には、多価抗体、例えば、三重特異性又は多重特異性抗体の産生方法が記載されている。３つ以上の結合ドメインを含む多価抗体のモジュラーフォーマットが記載されている。これらのフォーマットでは、少なくとも１つの結合ドメインがベース抗体部分に接続され、該ベース抗体部分は２つの結合ドメインを含む。追加の結合ドメインは、可変領域、Ｆｖドメイン、Ｆａｂドメイン、又は修飾Ｆａｂドメイン、又はそれらのいずれかの機能的断片を含んでもよい。ベース抗体部分は、例えば、全長抗体又はその断片であってもよいが、いずれの場合にも、２つの結合ドメインを含む。１つ以上の追加の結合ドメインは、リンカー（複数可）を介してベース抗体部分に接続され、ベース抗体部分のものに加えて１つ以上の結合部分を提供する。リンカーは、１つ以上の追加の結合ドメインをベース抗体部分に接続するために使用される。リンカーは、ペプチド領域、例えば、１つ以上のヒンジ領域及び／又はヒンジ領域に由来する１つ以上の領域を含む。本発明の結合ドメイン又は多量体は、かかる多価抗体に組み込まれ得る。
核酸配列、ポリペプチド、ベクター、及び細胞
本発明は更に、本発明の抗体などの多量体の組み立てにおいて使用され得るポリペプチドをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含むベクター、本発明の抗体などの多量体を産生できる細胞、及びかかる細胞を使用して抗体を含むかかる多量体を調製するための方法を提供する。
本発明は更に、本発明の抗体などの多量体の組み立てにおいて使用され得るポリペプチドをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含むベクター、本発明の抗体などの多量体を産生できる細胞、及びかかる細胞を使用して抗体を含むかかる多量体を調製するための方法を提供する。
本発明による抗体などの多量体は、典型的には、本発明の抗体などの多量体を形成するように一緒に組み立てるポリペプチドをコードする核酸配列を発現する細胞によって産生される。
本発明の抗体などの多量体のポリペプチドを作製するために採用される核酸配列は、任意の好適な発現ベクター内に配置されてもよく、適切な状況では、単一の宿主細胞内の２つ以上のベクター内に配置されてもよい。
概して、可変ドメインをコードする核酸配列は、適切なリンカー及び／又は定常領域でクローニングされ、配列は、発現に好適な細胞株において好適な発現構築物内のプロモーターと作動可能に連結して配置される。
したがって、本発明は、抗体などの多量体を調製するための方法も提供する。該方法は、
本発明の抗体などの多量体に組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
該細胞を、ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを抗体などの多量体に提供する条件下で、培養することと、を含む。
本発明の抗体などの多量体に組み立てることができるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む細胞を準備することと、
該細胞を、ポリペプチドの発現及びそれらの組み立てを抗体などの多量体に提供する条件下で、培養することと、を含む。
特に、細胞は、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる１つ以上の核酸配列を備えており、この核酸配列は免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変領域をコードする。細胞が免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする１つ以上の核酸配列を備えている場合、細胞はまた、免疫グロブリン軽鎖可変領域、好ましくは本明細書に記載されるものなどの共通軽鎖可変領域をコードする核酸を含む。細胞が免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする１つ以上の核酸配列を備えている場合、細胞はまた、免疫グロブリン重鎖可変領域、好ましくは共通重鎖可変領域をコードする核酸を含む。細胞は、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする１つ以上の核酸を更に含む。
本発明の宿主細胞は、全発現免疫グロブリンに基づいて、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の純度で、本発明の抗体などの多量体を産生することができる。
本発明の宿主細胞は、本発明の抗体などの多量体を産生することができ、産生される多価抗体の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％は、全ての結合部位に対して同族の共通鎖と対合した可変再構成領域を含む。
本発明の宿主細胞は、抗体を産生することができ、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の発現した共通鎖は多価抗体と対合しており、遊離した会合していないタンパク質ではない。
結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体の発現
組換え宿主細胞における結合ドメイン、多量体、例えば抗体、又はその変異体の発現については、当該技術分野において記載されている。本発明の抗体の結合ドメイン及び軽鎖及び重鎖の場合の可変領域をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び／又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましいが、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くことが知られている遺伝子座を標的とし得る。
組換え宿主細胞における結合ドメイン、多量体、例えば抗体、又はその変異体の発現については、当該技術分野において記載されている。本発明の抗体の結合ドメイン及び軽鎖及び重鎖の場合の可変領域をコードする核酸分子は、染色体外コピーとして存在してもよく、及び／又は宿主細胞の染色体に安定的に組み込まれてもよい。後者が好ましいが、その場合には遺伝子サイレンシングを欠くことが知られている遺伝子座を標的とし得る。
本発明の抗体などの多量体として組み立てるポリペプチドをコードしている核酸配列の発現を得るために、かかる発現を駆動することができる配列は、ポリペプチドをコードしている核酸配列に機能的に連結され得ることが、当業者には周知である。機能的な連結は、ポリペプチド又はその前駆体をコードする核酸配列が、これらの配列がポリペプチド又はその前駆体の発現を駆動できるように、発現を駆動することができる配列に連結されていることを説明することを意味する。有用な発現ベクターは、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡベクターシリーズなど、当該技術分野において利用可能である。対象となるポリペプチドをコードする配列が、コードされたポリペプチドの転写及び翻訳を調節する配列を参照して適切に挿入される場合、得られる発現カセットは、発現と呼ばれる対象となるポリペプチドを産生するのに有用である。発現を駆動する配列としては、プロモーター、エンハンサーなど、及びこれらの組み合わせが挙げられ得る。これらは、宿主細胞において機能することができ、それにより、それらに機能的に連結された核酸配列の発現を駆動することができる必要がある。プロモーターは、構成的であるか又は調節されていてもよく、ウイルス、原核生物、若しくは真核生物源、又は人工的に設計された物を含む様々な供給源から得ることができる。
本発明の核酸配列の発現は、天然プロモーター若しくはその誘導体由来、又は完全に異種プロモーター由来であってもよい。真核細胞において発現するためのいくつかの周知の多用されるプロモーターは、ウイルス由来のプロモーター、例えば、アデノウイルス、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）由来のプロモーターを含む。好適なプロモーターはまた、例えばメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子Ｉａ（ＥＦ－Ｉａ）プロモーター、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターなどの、真核細胞に由来し得る。宿主細胞における本発明の核酸配列の発現を駆動することができる任意のプロモーター又はエンハンサー／プロモーターは、本発明において好適である。一実施形態では、発現を駆動することが可能な配列は、ＣＭＶプロモーターの領域、好ましくはＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターのヌクレオチド－７３５～＋９５を含む領域を含む。当業者であれば、本発明において使用される発現配列が、インスレーター、マトリックス付着領域、ＳＴＡＲエレメントなどの発現を安定化又は増強することができるエレメントと好適に組み合わせられ得ることを認識するであろう。これは、発現の安定性及び／又はレベルを向上させることができる。
組換え核酸配列を発現させるのに好適な任意の細胞を使用して、本発明の抗体などの多量体を生成することができる。好ましくは、該細胞は懸濁増殖に適合される。
本発明の抗体などの多量体は、典型的には、本発明の好適な細胞を培養し、該培養物から該抗体などの該多量体を採取することによって、宿主細胞において発現させることができる。好ましくは、該細胞は、無血清培地中で培養される。本発明の抗体などの多量体は、細胞から回収され得るか、又は好ましくは、当業者に全般的に知られている方法によって細胞培養培地から回収され得る。
更に、本発明による抗体などのアルティマーを製造するための方法によって得ることができる抗体などの多量体が提供される。抗体などのマルトマーは、好ましくは、培養培地から精製される。
回収後、当該技術分野において既知の方法を使用して、培養物から抗体などの多量体を精製することができる。かかる方法としては、沈殿、遠心分離、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオン及び／又は陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどを挙げることができる。本発明の抗体などの多量体を分離する手段としてリンカー配列をベースとする親和性クロマトグラフィーを使用することができる。
医薬組成物及び使用方法
また、本発明によって提供されるのは、本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物である。
また、本発明によって提供されるのは、本発明の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物である。
したがって、本発明は、治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための、本発明の結合ドメイン又は抗体などの多量体、又は本明細書に記載のその変異体を提供する。
本発明によって更に提供されるのは、医学的状態に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であり、該方法は、本明細書に記載されるように、治療有効量の結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体をヒト又は動物に投与することを含む。
患者に投与されるべき本発明による結合ドメイン又は多量体、例えば抗体、又はその変異体の量は、典型的には、治療用ウィンドウ内にあり、これは、治療効果を得るために十分な量が使用されるが、その量は、許容不可能な程度の副作用をもたらす閾値を超えないことを意味する。
先行技術として与えられる特許文献又は他の事項への本明細書での言及は、その文献若しくは事項が既知であったこと、又はそれを含む情報が、特許請求の範囲のいずれかの優先日における共通の一般知識の一部であったことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本明細書に記載される各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の態様
１．ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、該可変領域がヒト可変領域と対合する、結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
１．ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域を含み、該可変領域がヒト可変領域と対合する、結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
２．ヒトから系統発生的に遠位にある動物がトリである、態様１に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
３．多量体が抗体である、態様１又は２に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
４．抗体の定常領域がヒト定常領域である、態様３に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
５．ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域が、該動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる再構成ＶＤＪ領域であり、ヒト可変領域は、軽鎖可変領域である、態様１～４のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
６．ヒト共通軽鎖などの共通軽鎖を含む、態様５に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
７．ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域が、該動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる再構成ＶＪ領域であり、ヒト可変領域は、重鎖可変領域である、態様１～６のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
８．共通重鎖を含む、態様７に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
９．トリが、ＶＨ領域をコードする機能的ＶＨ遺伝子セグメントを含み、ＶＨ領域が、ＶＨ／ＶＬ界面においてヒトＶＬ領域との少なくとも５、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０の静電相互作用を含む、態様１～８のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
１０．トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル又はダチョウなどのキジ目である、態様２～９のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
１１．マウス及び／又はヒトＣＸＣＲ４に、好ましくはヒトＣＸＣＲ４に結合する、態様１～１０のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
１２．ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域が、アミノ酸配列を含む重鎖可変領域であり、アミノ酸配列が、配列番号１００、配列番号１０１若しくは配列番号１０２を含む、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、より好ましくは少なくとも９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する、態様１１に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
１３．ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる核酸によってコードされる可変領域が、ヒト化されている、態様１～１２のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
１４．二重特異性抗体である、態様３～１３のいずれか一態様に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
１５．多重特異性抗体、例えば、三重特異性抗体である、態様３～１４のいずれか１つに記載の結合ドメイン又はその変異体の多量体。
１６．結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする核酸配列を該動物から単離することと、
可変領域を該単離された核酸配列から得ることと、
該動物からの可変領域をヒト可変領域と対合することと、を含み、
それにより、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製する、方法。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする核酸配列を該動物から単離することと、
可変領域を該単離された核酸配列から得ることと、
該動物からの可変領域をヒト可変領域と対合することと、を含み、
それにより、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製する、方法。
１７．ヒトから系統発生的に遠位にある動物が、機能的ＶＨ遺伝子セグメントを含み、ＶＨ／ＶＬ界面においてヒトＶＬ可変領域との、５、好ましくは８、より好ましくは１０の静電相互作用を含む、態様１６に記載の方法。
１８．該動物からの可変領域をコードする核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、ヒト可変領域が、軽鎖可変領域である、請求項１６又は１７に記載の方法。
１９．ヒトから系統発生的に遠位にある動物から単離された核酸配列によってコードされる可変領域が、再構成ＶＤＪ領域であり、ヒト可変領域は、軽鎖可変領域である、態様１６～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．共通軽鎖を含む、態様１８又は１９に記載の方法。
２１．ヒトから系統発生的に遠位にある動物から単離された核酸配列によってコードされる可変領域が、再構成ＶＪ領域であり、ヒト可変領域が、重鎖可変領域である、態様１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２２．共通重鎖を含む、態様２１に記載の方法。
２３．ヒトから系統発生的に遠位にある動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル又はダチョウをはじめとするキジ目などのトリである、態様１６～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．多量体が抗体であり、二重特異性抗体である、態様１６～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．多量体が、多重特異性抗体、例えば三重特異性抗体である、態様１６～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．ヒトから系統発生的に遠位にある動物が、少なくともそのＢ細胞系統において、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖をコードする核酸を含むトランスジェニックニワトリである、態様１６～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．核酸をコードする重鎖又は軽鎖が、ＤＮＡ再構成及び／又は体細胞超変異に対して抵抗性をもたらす手段を備える、態様２６に記載の方法。
２８．核酸をコードする軽鎖の配列が、ヒトＶＫ配列である、態様２７に記載の方法。
２９．ファージであって、そのゲノム中に：
可変領域をコードする核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、核酸と；
ヒト可変領域をコードする核酸と、を含む、ファージ。
可変領域をコードする核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、核酸と；
ヒト可変領域をコードする核酸と、を含む、ファージ。
３０．該動物からの可変領域をコードする核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列であり、ヒト可変領域が、軽鎖可変領域である、態様２９に記載のファージ。
３１．ファージが、核酸によってコードされる可変領域を表示することができ、該可変領域が互いに対合する、態様２９又は３０に記載のファージ。
３２．可変領域が互いに対合して、結合ドメインを形成する、態様２９～３１のいずれか１つに記載のファージ。
３３．結合ドメインが、Ｆａｂの形態である、態様２９～３２のいずれか１つに記載のファージ。
３４．態様２９～３３のいずれか１つに記載ファージを含むファージディスプレイライブラリーであって、ライブラリーが、少なくとも約１０６個のファージを含む、ファージディスプレイライブラリー。
３５．ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を該動物から単離することと、
該可変領域をコードする該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を該動物から単離することと、
該可変領域をコードする該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、ファージディスプレイライブラリーを調製する、方法。
３６．該動物からの可変領域をコードする複数の核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列である、態様３５に記載の方法。
３７．ファージディスプレイライブラリー内のファージが、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、態様３５又は３６に記載の方法。
３８．該動物からの可変領域をコードする複数の核酸を使用して、それぞれ該核酸を含む複数のファージを調製する、態様３５～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．ファージディスプレイライブラリーが、少なくとも１つのファージを含み、該ファージが、そのゲノム中に：
可変領域をコードする核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、核酸と；
ヒト可変領域をコードする核酸と、を含む、態様３５～３８のいずれか１つに記載の方法。
可変領域をコードする核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、核酸と；
ヒト可変領域をコードする核酸と、を含む、態様３５～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．可変領域が互いに対合して、結合ドメインを形成する、態様３９に記載の方法。
４１．結合ドメインが、Ｆａｂの形態である、態様４０に記載の方法。
４２．抗原に結合することができる、態様１～１５のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定するための方法であって、
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を該動物から単離することと、
該可変領域をコードする該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、
抗原に結合することができるファージディスプレイライブラリー内のファージを同定することと、を含み、
それによって、抗原に結合することができる結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定する、方法。
ヒトから系統発生的に遠位にある動物を抗原で免疫化することと、
可変領域をコードする複数の核酸を該動物から単離することと、
該可変領域をコードする該核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、
抗原に結合することができるファージディスプレイライブラリー内のファージを同定することと、を含み、
それによって、抗原に結合することができる結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定する、方法。
４３．結合ドメイン又は多量体又はその変異体が、抗原に結合する、態様４２に記載の方法。
４４．該動物からの可変領域をコードする複数の核酸配列が、重鎖可変領域をコードする核酸配列である、態様４２又は４３に記載の方法。
４５．ファージディスプレイライブラリー内のファージが、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、態様４２～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．核酸又は複数の核酸であって、ヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる重鎖可変領域を含むポリペプチドと；ヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドとをコードする、核酸又は複数の核酸。
４７．ポリペプチドが対合して、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を形成することができる、態様４６に記載の核酸又は複数の核酸。
４８．核酸又は複数の核酸が、重鎖可変領域を含む少なくとも２つのポリペプチドであって、その少なくとも１つはヒトから系統発生的に遠位にある動物に基づく、動物に由来する、又は動物から得られる、ポリペプチドと；ヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドとをコードする、態様４６又は４７に記載の核酸又は複数の核酸。
４９．重鎖可変領域を含む少なくとも２つのポリペプチド、及びヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドが、多量体に組み立てることができる、態様４８に記載の核酸又は複数の核酸。
５０．多量体が、抗体、例えば二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、態様４９に記載の核酸又は複数の核酸。
５１．態様４６～５０のいずれか１つに記載の核酸又は複数の核酸を含む宿主細胞。
５２．ヒトから系統発生的に遠位にある動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル又はダチョウをはじめとするキジ目などのトリである、態様２９～３３のいずれか１つに記載のファージ、態様３４に記載のファージディスプレイライブラリー、態様３５～４１のいずれか１つに記載のファージディスプレイライブラリーを調製するための方法、態様４２～４５のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体若しくはその変異体を同定するための方法、又は態様４６～５０のいずれか１つに記載の核酸又は複数の核酸、又は態様５１に記載の宿主細胞。
５３．態様１～１５のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
５４．態様１～１５のいずれか１つに記載の抗体と、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と、を含む、医薬組成物。
５５．治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための、態様１～１５のいずれか１つに記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
５６．医学的適応症に罹患しているヒト又は動物を処置するための方法であって、態様１～１５のいずれか１つに記載の治療有効量の結合ドメイン又は多量体又はその変異体をヒト又は動物に投与することを含む、方法。
５７．ヒトから系統発生的に遠位にある動物であって、少なくともそのＢ細胞系統において、ヒト免疫グロブリン軽鎖又は重鎖をコードする核酸を含むトランスジェニック動物である、動物。
５８．ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、サカツラガン、アヒル又はダチョウである、態様５７に記載の動物。
以下の実施例は、本発明を例示するものであるが、いかなる方法でも本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１．キメラニワトリＶＨ－ヒトＶＬ抗体
ファージディスプレイライブラリーを産生するために、これは、免疫化されたトリ、好ましくはニワトリ、アヒル又はダチョウの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるＶＨ領域から構成される結合ドメインを表示し、かかるＶＨ領域は、ヒト軽鎖可変領域、好ましくはｃＬＣを有する多量体を形成し、ＶＨ領域はＶＬ領域と対合できる必要がある。
ファージディスプレイライブラリーを産生するために、これは、免疫化されたトリ、好ましくはニワトリ、アヒル又はダチョウの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られる核酸によってコードされるＶＨ領域から構成される結合ドメインを表示し、かかるＶＨ領域は、ヒト軽鎖可変領域、好ましくはｃＬＣを有する多量体を形成し、ＶＨ領域はＶＬ領域と対合できる必要がある。
本明細書において、免疫化されたトリ、好ましくはニワトリの核酸に基づく、核酸に由来する、又は核酸から得られるＶＨ領域のレパートリーは、ヒトＶＬと安定して対合できることが実証される。本明細書で例示されるヒトＶＬは、配列番号７；配列番号１０；配列番号８７；配列番号８８；又は配列番号８９に示されるアミノ酸配列を含む。
抗体のＦａｂは、重鎖及び軽鎖部分を含み、この部分は、対合したときに、展開しない結合ドメイン構造を形成する。本明細書において、可変領域が一次アミノ酸レベルで低い相同性を有するＶ遺伝子セグメントに由来する場合であっても、異なる種からの軽鎖及び重鎖可変領域が組み合わされたときであっても、かかる構造を組み立てることができることが実証される。
これらの例では、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＡｌｉｇｎＸコンポーネントを使用し、デフォルト設定を使用して、全ての配列同一性を決定した。２つの核酸配列間のパーセント配列同一性は、デフォルト設定を使用してＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して求められた。この設定には、変更されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．（１９９４）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４６７３～４６８０）、ｓｗｇａｐｄｎａｒｎｔスコアマトリックス、１５のギャップオープンペナルティ、及び６．６６のギャップエクステンションペナルティを用いる。アミノ酸配列は、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用してアラインメントされる。この設定には、変更されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ．Ｊ．，１９９４）、ｂｌｏｓｕｍ６２ｍｔ２スコアマトリックス、１０のギャップオープニングペナルティ、及び０．１のギャップエクステンションペナルティを用いる。
１．配列番号１４の単一の機能的ニワトリＶＨ１遺伝子セグメントは、図１に示されるタンパク質アラインメントに示されているように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントと相同である。機能的ニワトリＶＨ１遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントとの相同性が低いものでしかないことが分かる。ニワトリ遺伝子セグメント、及びヒトＦａｂ３１７８の配列番号１を有する重鎖可変領域が由来するヒトＶＨ１－０２遺伝子セグメントは、図２に示すタンパク質アラインメントに示されているように、わずか４３％のアミノ酸同一性が得られた（以下を参照）。全ての配列比較は、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸコンポーネントを使用して実施した。
２．機能的ニワトリＪＨ遺伝子セグメントのＦＷ４領域は、ヒトＪＨ遺伝子セグメントの対応する領域と相同であり、図３に示すタンパク質アラインメントに示されているように、全体で７３％のアミノ酸同一性を有する。
３．ヒト／ニワトリハイブリッドＦａｂの３Ｄ相同性モデルを（図４を参照）、配列番号１を有するＭＦ３１７８（ＰＤＢエントリー５Ｏ４Ｏ；ＶＨ１－０２由来遺伝子［Ｇｅｕｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８］を含む）と、配列番号７を有するＶＬとを含むヒトＦａｂの結晶構造に基づいて生成した。相同性モデリングに使用されたアルゴリズムは、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓａｌｉｌａｂ．ｏｒｇ／ｍｏｄｅｌｌｅｒ／）であった。全ての構造分析（モデリングを含む）は、デフォルト設定を使用し、Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｂｉｏｖｉａ－ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－ｓｔｕｄｉｏ／）を使用して実施した。
モデルでは、ヒトＶＨ領域は、ニワトリＦａｂ（ＰＤＢ ４ＧＬＲ；［Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７，４４４２５－４４４３４，２０１２］）の構造から得られたニワトリＶＨ領域のアミノ酸配列に基づいてモデル化されたＶＨ領域によって置き換えられている。ニワトリＦａｂ ＰＤＢ ４ＧＬＲの重鎖可変領域配列は、以下のとおりである。
ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＧＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＬＳＳＹＱＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＳＲＧＧＶＴＧＹＧＳＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＫＰＡＬＤＳＤＱＣＧＦＰＥＡＧＣＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＴＶＳＳ（配列番号２）
ＡＶＴＬＤＥＳＧＧＧＬＱＴＰＧＧＧＬＳＬＶＣＫＡＳＧＦＴＬＳＳＹＱＭＭＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＳＲＧＧＶＴＧＹＧＳＡＶＫＧＲＡＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＶＲＬＱＬＮＮＬＲＡＥＤＴＧＴＹＹＣＡＫＰＡＬＤＳＤＱＣＧＦＰＥＡＧＣＩＤＡＷＧＨＧＴＥＶＴＶＳＳ（配列番号２）
モデルの分析により、ニワトリＶＨとヒトＶＬの間に２４の非結合静電相互作用が存在するのに対し、完全ヒトテンプレートではわずか２０しか同定されないことが示された（図４ａを参照）。これらの相互作用のうち、１０は、２つの構造間で同一であり、２は、同じ位置で見出される同等又は相同の残基間で形成される。興味深いことに、ヒトＶＨ－ヒトＶＬ界面と比較して、ニワトリＶＨ－ヒトＶＬ界面ではより多くの水素結合（６ではなく１２）が見られ、ニワトリＶＨ－ｃＬＣ界面での安定した相互作用を示す。相互作用の詳細を図４ａに示す。
更に、ニワトリＶＨ配列にＩ３３８Ｔ変異体を導入した（配列番号２）。この変異体は、核酸レベルでのＢｓｔＥＩＩクローニング部位の導入を考慮するために追加された。これにより、以下で更に詳細に説明するように、野生型免疫化ニワトリ重鎖レパートリーの使用、及びそれらの重鎖可変領域をコードする核酸のファージディスプレイライブラリーへの直接導入が促進される。Ｉ１１０Ｔ変異体及び核酸のＢｓｔＥＩＩクローニング部位を導入することにより、Ｑ１２で形成された水素結合が維持される（図４ｂを参照）。注目すべきことに、相同性モデルでは、位置１２及び１１０は、それぞれＦＷ１及びＦＷ４にある。ヒト及びニワトリＦａｂ（ＰＤＢ ５Ｏ４Ｏ及び４ＧＬＲ）のＶＬ－ＶＨ領域のオーバーレイを図４ｃに示す。１．２７Åの原子位置の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する構造は、主にＣＤＲ及びループに位置する小さな差と同様である。全体として、相同性モデル及び構造解析は、ハイブリッドＦａｂのフォールディングがヒトＦａｂのフォールディングと類似していることを示しており、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとニワトリＶＨ遺伝子セグメントとの間の相同性が一次アミノ酸レベルで低いという事実にかかわらず、ニワトリＶＨドメインとヒトＶＬドメインとの間の安定した相互作用を証明している。
ＭＦ３１７８ ＰＤＢエントリー５Ｏ４Ｏを含むヒトＦａｂのエネルギー最小化及び側鎖最小化結晶構造に基づく別のモデルでは、配列番号９２を有するニワトリＦａｂ ＰＤＢ ４ＧＬＲ（Ｓｈｉｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７，４４４２５－４４４３４，２０１２）の重鎖領域を、配列番号９４；配列番号９５；配列番号９３；又は配列番号９６を有するヒト軽鎖領域に対してモデル化した。結果を図２０に示す。
モデルの分析は、３１の非結合静電相互作用がニワトリＶＨ－ヒトＣＨ１と配列番号９４のヒトＶＬ－ＣＬとの間に存在することを示し、５０の相互作用が完全なニワトリテンプレートで同定され、３５の相互作用が完全なヒトテンプレートで同定された。ニワトリＶＨ－ヒトＣＨ１は、配列番号９５のヒトＶＬ－ＣＬとの４７の非結合静電相互作用；配列番号９３のヒトＶＬ－ＣＬとの４５の非結合静電相互作用；及び配列番号９６のヒトＶＬ－ＣＬとの４４の非結合静電相互作用を更に有する。
このデータは、ニワトリＶＨ領域がいくつかの異なるヒトＶＬ領域と対合できることを示す。
実施例２．キメラアヒルＶＨ－ヒトＶＬ抗体
ニワトリ重鎖可変領域をヒト共通軽鎖と直接対合する性質、及びヒトＶＨ－ＶＬ界面と比較して、混合ＶＨ－ＶＬ界面で更に多数の安定した相互作用を生成するその性質を実証するとき、更にトリの種であるＡｎａｓ ｐｌａｔｙｒｙｎｃｈｏｓ（マガモ）を、上記のニワトリＶＨについて説明したようにモデル化した。
ニワトリ重鎖可変領域をヒト共通軽鎖と直接対合する性質、及びヒトＶＨ－ＶＬ界面と比較して、混合ＶＨ－ＶＬ界面で更に多数の安定した相互作用を生成するその性質を実証するとき、更にトリの種であるＡｎａｓ ｐｌａｔｙｒｙｎｃｈｏｓ（マガモ）を、上記のニワトリＶＨについて説明したようにモデル化した。
アヒルＶＨ遺伝子セグメントＸＰ＿０２１１３２８７７．１（配列番号１２）によってコードされるアミノ酸配列は、図８に示すタンパク質アラインメントに示されているように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列と相同である。アヒルの推定機能的ＶＨ遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列と最も高い相同性を有するアミノ酸配列をコードするヒトＶＨ遺伝子セグメントは、図９に示されるタンパク質アラインメントに示されているような、４１％のアミノ酸同一性を有するヒトＶＨ４－５９、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－３９及びＶＨ４－３１である。全ての配列比較は、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸコンポーネントを使用して実施した。
ヒト／アヒルハイブリッドＦａｂの３Ｄ相同性モデル（図１０を参照）を、実施例１に上述したように、配列番号１を有するＭＦ３１７８（ＰＤＢエントリー５Ｏ４Ｏ；ＶＨ１－０２由来遺伝子［Ｇｅｕｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８］を含む）を含むヒトＦａｂの結晶構造に基づいて生成した。
モデルでは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ａ４６５２９から取得したアヒルＶＨのアミノ酸配列に基づいてモデル化されたＶＨによって、ヒトＶＨを置き換えた。重鎖可変領域配列は以下のとおりである。
ＡＥＴＬＤＥＳＧＧＧＬＶＳＰＧＧＳＬＴＬＶＣＫＧＳＧＦＴＦＳＳＮＥＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＴＧＧＹＴＧＹＡＰＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＧＱＳＴＬＴＬＱＭＮＳＬＫＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＫＩＴＧＹＡＮＣＡＧＹＧＣＡＡＤＩＤＬＷＧＨＧＴＥＶＴＶＳＳ（配列番号３）
ＡＥＴＬＤＥＳＧＧＧＬＶＳＰＧＧＳＬＴＬＶＣＫＧＳＧＦＴＦＳＳＮＥＭＹＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＧＩＴＴＧＧＹＴＧＹＡＰＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＧＱＳＴＬＴＬＱＭＮＳＬＫＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＫＩＴＧＹＡＮＣＡＧＹＧＣＡＡＤＩＤＬＷＧＨＧＴＥＶＴＶＳＳ（配列番号３）
モデルの分析により、アヒルＶＨとヒトＶＬ界面の間に２８の非結合相互作用が存在するのに対し、完全ヒトテンプレートではわずか２０しか同定されないことが示された（図１０ａを参照）。これらの相互作用のうち、１２は２つの構造間で同一であり、１つは混合ＶＨ－ＶＬ界面とヒトＶＨ－ＶＬ界面との間の同じ位置で見出される同等又は相同の残基間で形成される。ヒトＶＨ－ヒトＶＬ界面と比較して、アヒルＶＨ－ヒトＶＬ界面ではより多くの水素結合（７ではなく１２）が見られ、アヒルＶＨ－ｃＬＣ界面での安定した相互作用を示す。相互作用の詳細を図１０ａに示す。
ヒト及びアヒルのＦａｂのＶＬ－ＶＨ領域のオーバーレイを図１０ｂに示す。１．２７Åの原子位置の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する構造は、主にＣＤＲ及びループに位置する小さな差と同様である。全体として、相同性モデル及び構造解析は、ハイブリッドＦａｂのフォールディングがヒトＭＦ３１７８テンプレートの重鎖に類似していることを示しており、アヒルＶＨドメインとヒトＶＬドメインとの間の安定した相互作用を証明している。
実施例３．キメラダチョウＶＨ－ヒトＶＬ抗体
ニワトリ及びアヒルは、生物学的種類の家禽（系統群、Ｇａｌｌｏａｎｓｅｒａｅ）、すなわちキジ目及びガンカモ目を代表している。したがって、ヒト軽鎖可変領域（多価多量体フォーマットで共通軽鎖として使用され得る）と直接対合する、（アヒル及びニワトリに対してより遠位に関連する）非家禽のトリ種、すなわちダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ）の重鎖可変領域の能力を、上記の実施例１のニワトリＶＨについて記載したようにモデル化した。
ニワトリ及びアヒルは、生物学的種類の家禽（系統群、Ｇａｌｌｏａｎｓｅｒａｅ）、すなわちキジ目及びガンカモ目を代表している。したがって、ヒト軽鎖可変領域（多価多量体フォーマットで共通軽鎖として使用され得る）と直接対合する、（アヒル及びニワトリに対してより遠位に関連する）非家禽のトリ種、すなわちダチョウ（Ｓｔｒｕｔｈｉｏ ｃａｍｅｌｕｓ）の重鎖可変領域の能力を、上記の実施例１のニワトリＶＨについて記載したようにモデル化した。
ダチョウＶＨ遺伝子セグメントＸＰ＿００９６６９３２２．１（配列番号１３）によってコードされるアミノ酸配列は、図５に示すタンパク質アラインメントに示されているように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸配列と相同である。ダチョウＶＨ遺伝子セグメントのコードされたアミノ酸と最も高い相同性を有するアミノ酸をコードするヒトＶＨ遺伝子セグメントは、図６に示すタンパク質アラインメントに示されるように、７６．５％のアミノ酸同一性を有するヒトＶＨ３－７３及びＶＨ３－２３である。全ての配列比較は、デフォルト設定を使用して、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ １１．５．２ソフトウェアのＡｌｉｇｎＸコンポーネントを使用して実施した。
ヒト／ダチョウハイブリッドＦａｂの３Ｄ相同性モデル（図７を参照）を、上記の実施例１に記載のように、配列番号１を有するＭＦ３１７８（ＰＤＢエントリー５Ｏ４Ｏ；ＶＨ１－０２由来遺伝子［Ｇｅｕｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８］を含む）を含むヒトＦａｂの結晶構造に基づいて生成した。
モデルでは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦＮ０２３８８から取得したダチョウＶＨのアミノ酸配列に基づいてモデル化されたＶＨによって、ヒトＶＨを置き換えた。重鎖可変領域配列は以下のとおりである。
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＱＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＧＴＧＦＴＬＳＳＦＧＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＰＶＡＧＩＳＳＳＧＳＤＴＹＹＡＤＡＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＬＹＬＱＭＮＧＬＫＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＫＣＡＴＤＷＧＳＣＧＰＷＮＬＤＡＷＧＲＧＡＳＶＴＶＳＳ（配列番号４）
ＡＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＱＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＫＧＴＧＦＴＬＳＳＦＧＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＰＶＡＧＩＳＳＳＧＳＤＴＹＹＡＤＡＶＱＧＲＦＴＩＳＲＤＮＧＱＳＴＬＹＬＱＭＮＧＬＫＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＫＣＡＴＤＷＧＳＣＧＰＷＮＬＤＡＷＧＲＧＡＳＶＴＶＳＳ（配列番号４）
モデルの分析により、ダチョウＶＨとヒトＶＬ界面との間に１４の非結合相互作用が存在することが示された（図７ａを参照）。これらの相互作用のうち、７つは２つの構造間で同一であり、１つはヒトＶＨ及びＶＬ界面の同じ位置にある同等又は相同の残基間で形成される。ヒトＶＨ－ヒトＶＬ界面と比較して、ダチョウＶＨ－ヒトＶＬ界面では、ほぼ同じ数の水素結合（７ではなく６）が見られ、ダチョウＶＨ－ｃＬＣ界面での安定した相互作用を示す。相互作用の詳細を図７ａに示す。
ヒト及びダチョウのＦａｂのＶＬ－ＶＨ領域のオーバーレイを図７ｂに示す。１．２７Åの原子位置の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）を有する構造は、主にＣＤＲ及びループに位置する小さな差と同様である。全体として、相同性モデル及び構造解析は、ハイブリッドＦａｂのフォールディングがヒトＦａｂのフォールディングと類似していることを示しており、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとダチョウＶＨ遺伝子セグメントとの間の相同性が一次アミノ酸レベルで低いという事実にかかわらず、ダチョウＶＨドメインとヒトＶＬドメインとの間の安定した相互作用を証明している。
全体として、実施例１～３は、三次構造レベルでかなりの量の相同性が、ニワトリとヒト可変領域との間、アヒルとヒト可変領域との間、並びにダチョウとヒト可変領域との間に存在することを示し、これは、ニワトリ、アヒル及びダチョウからのＶ遺伝子セグメントが、一次アミノ酸レベルでのヒトＶ遺伝子セグメントとの比較的低い相同性を共有している場合であってもである。確かに、アヒルは一次アミノ酸レベルでニワトリよりもヒトＶ遺伝子セグメントとの相同性が低いが、（ニワトリと比較して）ヒトｃＬＣとの接触点が更にモデル化されており、三次構造の相同性がより高いことを示す。一方、ダチョウは、一次アミノ酸レベルでニワトリよりもヒトＶ遺伝子セグメントとの相同性が高いが、ヒトｃＬＣとのモデル化された接触点は少ない（ニワトリと比較して）。したがって、安定した結合ドメインは、再構成可変領域の間に形成され得る。
実施例４：ファージディスプレイライブラリーの生成に使用するためのニワトリＶＨ領域のベクターへの導入、又は宿主細胞への導入のためのプライマーの生成
市販のブロイラー（ＣＢ）近交系のゲノムニワトリ重鎖遺伝子座配列が公開されており（Ｒｅｙｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５９，１７１－１８３，１９８９）、アクセッション番号Ｍ３０３１９（図１１を参照）でＮＣＢＩデータベースに保存されている単一の機能的ＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ１）を含有する断片と、単一の機能的ＪＨ遺伝子セグメント（アクセッション番号Ｍ３０３２０；図１２を参照）を含有する断片と、が含まれている。
市販のブロイラー（ＣＢ）近交系のゲノムニワトリ重鎖遺伝子座配列が公開されており（Ｒｅｙｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５９，１７１－１８３，１９８９）、アクセッション番号Ｍ３０３１９（図１１を参照）でＮＣＢＩデータベースに保存されている単一の機能的ＶＨ遺伝子セグメント（ＶＨ１）を含有する断片と、単一の機能的ＪＨ遺伝子セグメント（アクセッション番号Ｍ３０３２０；図１２を参照）を含有する断片と、が含まれている。
ニワトリは１つの機能的ＶＨ遺伝子セグメント及び１つの機能的ＪＨ遺伝子セグメントのみを含むため、免疫化されたニワトリからのＶＨ領域配列を増幅するには、単一のフォワードプライマー及び単一のリバースプライマーで十分である。
ｃｈＶＨ－ＦＷという名称のフォワードプライマーは、以下のように設計された。
●プライマーｃｈＶＨ－ＦＷの最初の３３塩基（ＧＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ）は、ヒト、マウス、又はラットのＶＨ配列を増幅することが知られているフォワードプライマーの最初の３３塩基と同一である（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４，１８２１８－１８２３０，１９９９）。この領域はリーダーペプチドの一部をコードし、ファージディスプレイに使用されるベクターに存在するＳｆｉＩクローニング部位を含有する。
●プライマーｃｈＶＨ－ＦＷの最後の２１塩基（ＧＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣ）は、単一の機能的ニワトリＶＨ遺伝子セグメントの最初の２１塩基と同一である。ニワトリから単離されたｍＲＮＡ由来のＶＨ配列には、通常、この領域には変異が全くないか、又はほとんど含まれない（Ｒｅｙｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａ）。このことは、この領域において、ＶＨ偽遺伝子（ＶＨ多様化においてドナー配列として機能する）は、アクセプターとして機能する機能的ＶＨ遺伝子セグメントと完全に又はほぼ同一であるという事実による。全く同じ２１塩基が、他者（Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４２，１５９－１８１，２０００）によって記述された同様のニワトリＶＨ増幅フォワードプライマーに使用されている。
●ＳｆｉＩ部位に下線が引かれたプライマーｃｈＶＨ－ＦＷの合計５４塩基配列は、以下のとおりである。
●プライマーｃｈＶＨ－ＦＷの注釈付き配列を図１３に示す。
●図１４のＤＮＡアラインメントは、プライマーｃｈＶＨ－ＦＷである機能的ニワトリＶＨの一部と、特定のファージディスプレイベクターＭＶ１５１１の一部との間の相同性を示す。
●ベクターＭＶ１５１１のリーダーをニワトリＶＨ配列と組み合わせて、処理を補正することをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで確認するために、ＳｉｇｎａｌＰツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）を使用して、ＭＶ１５１１リーダー及びニワトリＶＨ１を含むタンパク質配列を分析した。結果は、予想される位置での予測される切断を示した。
●プライマーｃｈＶＨ－ＦＷの最初の３３塩基（ＧＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ）は、ヒト、マウス、又はラットのＶＨ配列を増幅することが知られているフォワードプライマーの最初の３３塩基と同一である（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７４，１８２１８－１８２３０，１９９９）。この領域はリーダーペプチドの一部をコードし、ファージディスプレイに使用されるベクターに存在するＳｆｉＩクローニング部位を含有する。
●プライマーｃｈＶＨ－ＦＷの最後の２１塩基（ＧＣＣＧＴＧＡＣＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＣ）は、単一の機能的ニワトリＶＨ遺伝子セグメントの最初の２１塩基と同一である。ニワトリから単離されたｍＲＮＡ由来のＶＨ配列には、通常、この領域には変異が全くないか、又はほとんど含まれない（Ｒｅｙｎａｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａ）。このことは、この領域において、ＶＨ偽遺伝子（ＶＨ多様化においてドナー配列として機能する）は、アクセプターとして機能する機能的ＶＨ遺伝子セグメントと完全に又はほぼ同一であるという事実による。全く同じ２１塩基が、他者（Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４２，１５９－１８１，２０００）によって記述された同様のニワトリＶＨ増幅フォワードプライマーに使用されている。
●ＳｆｉＩ部位に下線が引かれたプライマーｃｈＶＨ－ＦＷの合計５４塩基配列は、以下のとおりである。
●図１４のＤＮＡアラインメントは、プライマーｃｈＶＨ－ＦＷである機能的ニワトリＶＨの一部と、特定のファージディスプレイベクターＭＶ１５１１の一部との間の相同性を示す。
●ベクターＭＶ１５１１のリーダーをニワトリＶＨ配列と組み合わせて、処理を補正することをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで確認するために、ＳｉｇｎａｌＰツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ）を使用して、ＭＶ１５１１リーダー及びニワトリＶＨ１を含むタンパク質配列を分析した。結果は、予想される位置での予測される切断を示した。
ｃｈＶＨ－ＲＶという名称のリバースプライマーを、以下のように設計した。
●ファージディスプレイベクターＭＶ１５１１（図１８を参照）には、ヒト、マウス、ラットのＪＨの対応する配列と高度に相同なＪＨの末端をコードする配列の一部として、ＢｓｔＥＩＩ及びＸｈｏＩクローニング部位が含まれている。機能的ニワトリＶＨには内部ＸｈｏＩサイトが含まれているため（ＦＷ３－図１１を参照）、ＸｈｏＩを使用してニワトリＶＨのクローニングすることはできない。ＢｓｔＥＩＩ部位はニワトリＶＨには存在しないため、この部位は、ＪＨ配列の末端をコードするリバースプライマーに組み込まれている。これは、サイレント変異だけでは不可能である。ＢｓｔＥＩＩ部位を組み込むことで、単一のイソロイシンからスレオニンへの変異がもたらされ、これによりＪＨ配列をＶＩＶＳＳからＶＴＶＳＳに変更する。ＶＨ結晶構造の分析（上記を参照）に基づいて、この変異体は抗体の構造及び結合特性に大きな影響を与えないと予測される。これは、クローニング目的、並びにヒト化目的のためのニワトリＶＨ配列の変異体の例であるが、当業者は、ニワトリＶＨ／ヒトＶＬドメインの結合の構造に大きな影響を及ぼさない追加の又は異なる変異体も組み込むことができることを理解している。
●ニワトリＪＨ遺伝子セグメントから離れた変異に下線が引かれ、ＢｓｔＥＩＩ部位は太字のイタリック体である、２４塩基プライマーｃｈＶＨ－ＲＶの配列は、以下のとおりである。
●プライマーｃｈＶＨ－ＲＶの逆相補体の注釈付き配列を図１５に示す。
●図１６のＤＮＡアラインメントは、ｃｈＶＨ－ＲＶの逆相補体であるニワトリＪＨの一部と、ベクターＭＶ１５１１の一部との間の相同性を示す。プライマー全体は、対応するニワトリＪＨ配列と９２％同一（２４塩基中２２塩基）であり、最初の１０塩基（５’側）及び最後の８塩基（３’側）は１００％同一である。
●ファージディスプレイベクターＭＶ１５１１（図１８を参照）には、ヒト、マウス、ラットのＪＨの対応する配列と高度に相同なＪＨの末端をコードする配列の一部として、ＢｓｔＥＩＩ及びＸｈｏＩクローニング部位が含まれている。機能的ニワトリＶＨには内部ＸｈｏＩサイトが含まれているため（ＦＷ３－図１１を参照）、ＸｈｏＩを使用してニワトリＶＨのクローニングすることはできない。ＢｓｔＥＩＩ部位はニワトリＶＨには存在しないため、この部位は、ＪＨ配列の末端をコードするリバースプライマーに組み込まれている。これは、サイレント変異だけでは不可能である。ＢｓｔＥＩＩ部位を組み込むことで、単一のイソロイシンからスレオニンへの変異がもたらされ、これによりＪＨ配列をＶＩＶＳＳからＶＴＶＳＳに変更する。ＶＨ結晶構造の分析（上記を参照）に基づいて、この変異体は抗体の構造及び結合特性に大きな影響を与えないと予測される。これは、クローニング目的、並びにヒト化目的のためのニワトリＶＨ配列の変異体の例であるが、当業者は、ニワトリＶＨ／ヒトＶＬドメインの結合の構造に大きな影響を及ぼさない追加の又は異なる変異体も組み込むことができることを理解している。
●ニワトリＪＨ遺伝子セグメントから離れた変異に下線が引かれ、ＢｓｔＥＩＩ部位は太字のイタリック体である、２４塩基プライマーｃｈＶＨ－ＲＶの配列は、以下のとおりである。
●図１６のＤＮＡアラインメントは、ｃｈＶＨ－ＲＶの逆相補体であるニワトリＪＨの一部と、ベクターＭＶ１５１１の一部との間の相同性を示す。プライマー全体は、対応するニワトリＪＨ配列と９２％同一（２４塩基中２２塩基）であり、最初の１０塩基（５’側）及び最後の８塩基（３’側）は１００％同一である。
実施例６に詳細に記載されるように、プライマーｃｈＶＨ－ＦＷ及びｃｈＶＨ－ＲＶを使用して、ｈｕＰＤ－１で免疫化されたニワトリからのＶＨ領域を増幅し、続いて、増幅されたＶＨ領域を、ヒトＣＨ１遺伝子及びヒトｃＬＣを含有するベクターＭＶ１５１１にクローニングすることにより、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーを調製する。これらのライブラリーを使用して、実施例６に示すように、抗ｈｕＰＤ－１Ｆａｂパネルを生成する。
実施例５：ヒトＰＤ－１による野生型ニワトリの免疫化
ニワトリのＤＮＡ免疫化を実施し得るようにするために、ヒトＰＤ－１（ｈｕＰＤ－１）の少なくとも一部分をコードする核酸を組み込んだ好適な発現ベクターを生成することができる。
ニワトリのＤＮＡ免疫化を実施し得るようにするために、ヒトＰＤ－１（ｈｕＰＤ－１）の少なくとも一部分をコードする核酸を組み込んだ好適な発現ベクターを生成することができる。
ｈｕＰＤ－１をコードする核酸は、以下の配列番号１７に示されている。しかし、この配列はニワトリでの発現のためにコドン最適化されている可能性があり、ｈｕＰＤ－１の細胞外ドメインのみが発現されるように、配列の一部のみが使用され得る。細胞外ドメインの発現に向いている、好適なコドン最適化された核酸配列は、配列番号１８に示されている。
発現ベクターは、免疫化後のニワトリにおけるｈｕＰＤ－１ポリペプチドの発現を駆動するのに好適なプロモーターなどの適切な制御要素を含み得る。
配列番号１７
ＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＧＴＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＣＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡ
配列番号１７
ＡＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＴＣＧＴＣＴＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＧＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＧＴＧＣＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＧＣＧＴＧＡＣＴＴＣＣＡＣＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＧＡＧＣＣＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＧＴＡＴＧＣＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴＡＧＣＧＧＡＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＡＧＧＧＧＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡ
ｈｕＰＤ－１発現ベクターは、例えば好適なアジュバントに付着させることにより、免疫化のために調製することができる。次に、ニワトリ、典型的には白色レグホンニワトリをｈｕＰＤ－１ＤＮＡで免疫化する。免疫化は、連続４週間にわたって週１回の頻度（０、７、１４、２１日目）で遺伝子銃を使用し、筋肉内である場合もあれば、皮内（アジュバントなし）である場合もある。好適な量のＤＮＡ、例えば１２０μｇのＤＮＡを各免疫ポイントに適用できる。したがって、一次免疫化は、２回、３回、４回、又はそれ以上のブースター免疫化で実施することができる。遺伝子銃によるニワトリの免疫化については、例えば、Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；３４１：１４６－１５３に記載されている。
０日目に、免疫化されたニワトリ１羽あたり１つの卵又は血清が免疫前サンプルとして収集される。３回目又は４回目のブースター免疫化に続いて、例えば、ニワトリ１羽あたり１日１個の卵又は血清を数日間収集することができる。必要に応じて／所望の場合、８回の免疫化後又は更には１２回の免疫化後に、卵／血清を収集することができる。
ＩｇＹ抗体は、当業者に周知の方法を使用して、収集された卵の卵黄又は血清から単離され得る。
例えば、ＦＡＣＳ分析により、ＩｇＹが明確なｈｕＰＤ－１反応性を示すニワトリについては、脾臓細胞及び骨髄細胞を単離することができる。すなわち、脾臓及び骨髄を、標的タンパク質に対して著しい体液性応答が観察されるニワトリから除去する。次に、脾臓細胞と骨髄細胞の両方から細胞懸濁液を生成し、続いてこれらの細胞をＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃ＃１０２９６０２８）で溶解し、使用するまで－８０℃で保存し、存在するタンパク質を変性させる一方で、ニワトリＶＨ又はＶＬ領域のレパートリーをコードする核酸の抽出を可能にする。
ｈｕＰＤ－１とのＩｇＹ反応性は、ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡを使用して分析することができる。ＦＡＣＳは、標的細胞としてｈｕＰＤ－１をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされた好適な細胞、陰性対照細胞としての非トランスフェクト細胞、陽性対照抗体としての抗ＰＤ－１抗体、及び陰性対照としての抗破傷風毒素（ＴＴ）抗体を含み得る。ヒトＩｇＧを検出するための二次抗体として、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｈ１０１０４）を使用することができる。ニワトリＩｇＹを検出するための二次抗体として、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ニワトリＩｇＹ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０３－１１７－００８）を使用することができる。
実施例６：脾臓及び骨髄（ＢＭ）からのライブラリー生成
ニワトリＶＨ領域とヒトＶＬ領域とのファージディスプレイライブラリーを生成するために、例えば実施例５に記載のプロトコルに従って産生されたｈｕＰＤ－１免疫化ニワトリの脾臓細胞及び骨髄細胞からのＴＲＩｚｏｌサンプルを使用して、個々のライブラリーを生成した。サンプルを使用してＲＮＡを単離し、次いでオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。複数の反応を実行して、後続のＰＣＲ反応に十分な材料を生成することができる。
ニワトリＶＨ領域とヒトＶＬ領域とのファージディスプレイライブラリーを生成するために、例えば実施例５に記載のプロトコルに従って産生されたｈｕＰＤ－１免疫化ニワトリの脾臓細胞及び骨髄細胞からのＴＲＩｚｏｌサンプルを使用して、個々のライブラリーを生成した。サンプルを使用してＲＮＡを単離し、次いでオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してｃＤＮＡを合成した。複数の反応を実行して、後続のＰＣＲ反応に十分な材料を生成することができる。
次に、生成されたｃＤＮＡサンプルをテンプレートとして使用して、２つのニワトリ特異的プライマーｃｈＶＨ－ＦＷ及びｃｈＶＨ－ＲＶ（図１３～図１６及び配列番号を参照）を使用して、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（３），５８１－９７，１９９９）に基本的に記載されているように、ＶＨ遺伝子を増幅し、続いて消化した。
各ｃＤＮＡサンプルについて、後続のステップに十分なＰＣＲ産物を生成するために、複数のＰＣＲを並行して（全てｃｈＶＨ－ＦＷ及びｃｈＶＨ－ＲＶを使用して）行うことができる。１０を超えるＰＣＲ又は更には２０を超えるＰＣＲが必要になる場合がある。
この手順は、３ｎｇ／μＬの最小濃度で、各ｃＤＮＡサンプルに対して少なくとも２０ｎｇの精製された消化ＶＨインサートを得ることを目的としている
ファージディスプレイライブラリーは、プレートベースのプロトコルに従って作製された。要約すれば、 ファージ上にＦａｂ断片を表示するために、ファージミドベクターでＰＣＲ産物のクローニングを、基本的にｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ｊｕｎ ２５；２７４（２６）：１８２１８－３０）に記載されているように行ったが、例外として、Ｆａｂごとに使用された配列番号５の軽鎖をベクターによってコードした。
ＶＨ領域をコードする核酸をＳｆｉＩ／ＢｓｔＥＩＩ消化ベクターにライゲーションし、得られたライゲーションベクターをＴＧ１細胞に形質転換した。これにより、ライブラリーあたり＞１Ｅ６ｃｆｕ（コロニー形成単位）を得た。
各ライブラリーのクローンのサブセットに対してコロニーＰＣＲを実施して、ＶＨインサート頻度を決定することができる。ライブラリーごとにクローンのサブセットに対してＤＮＡ配列決定を行い、ＶＨ配列の多様性を判断することもできる。
実施例７：Ｆａｂ検証
生成される全てのライブラリーについて、多数のランダムなクローンを採取及び使用して、基本的にＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２２（３），５８１－９７，１９９１ ａｎｄ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２６），１８２１８－３０，１９９９に従って、可溶性Ｆａｂを調製した。完全にヒトのクローンが参照として含まれる。この手順により、可溶性Ｆａｂを含有する未精製のペリプラズム抽出物が得られる。
生成される全てのライブラリーについて、多数のランダムなクローンを採取及び使用して、基本的にＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２２（３），５８１－９７，１９９１ ａｎｄ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２６），１８２１８－３０，１９９９に従って、可溶性Ｆａｂを調製した。完全にヒトのクローンが参照として含まれる。この手順により、可溶性Ｆａｂを含有する未精製のペリプラズム抽出物が得られる。
Ｆａｂが適切に産生され、プロテインＬに結合できることを確認するために、機器に取り付けられた別個のコンピュータ上のＯｃｔｅｔソフトウェアによって制御されるＯｃｔｅｔ機器を含むＦｏｒｔｅＢＩＯ Ｏｃｔｅｔ－ＱＫｅシステムを使用することができる。このシステムは、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）に基づいており、生体分子相互作用のリアルタイムの定量化と速度論的特性評価を可能にし、実質的に製造元の説明書（詳細についてはｗｗｗ．ｆｏｒｔｅｂｉｏ．ｃｏｍを参照）に従って使用される。プロテインＬバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢＩＯ、部品番号１８－５０８５）を使用して、Ｆａｂの定量化を行う。
ＮＡｂ（商標）プロテインＬスピンキットを使用して、上清からＦａｂを精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで直接Ｆａｂを分析できるようにした。上清及びプロテインＬ精製サンプルの濃度を測定した。
未精製のＦａｂの濃度は通常の範囲で、約５０μｇ／ｍｌであった。これは、ニワトリＶＨ及びヒトＶＬを含むＦａｂが正常な発現レベルをもたらすことを示す。
タンパク質の完全性を確認するために、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルを使用して、ＦａｂをＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットに供した。検出抗体には、ヒトＩｇＧのＣＨ１ドメインを認識するＨＲＰ標識マウス抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カタログ番号５５５７８８）を使用している。非還元条件では、無傷のＦａｂに対して約５０ｋＤの単一バンドが予想され、ニワトリ重鎖とヒト共通軽鎖の正しい対合が示されるが、Ｆａｂの重鎖断片の還元条件では約２５ｋＤのバンドが予想される。
図２１は、精製されたキメラＦａｂ及び配列番号９８のヒト対照Ｆａｂが同様の結果を与えることを示し、キメラＦａｂの正しい重鎖－軽鎖の対合を示す。これらのＦａｂの非還元サンプルには、無傷のＦａｂの５０ｋＤのバンドに加えて、２５ｋＤのバンドが含まれている。２５ｋＤのサイズは、プロテインＬ精製の結果として対合していない軽鎖と一致している。プロテインＬの精製により、無傷のＦａｂと対合していない軽鎖との比率が変わる可能性がある。したがって、これらの結果を、検出にＰｒｏｔＬ－ＨＲＰ（Ａｂ１０８）及びα－ｍｙｃ（Ａｂ２１７）を用いてウエスタンブロットによって更に確認した。結果を図２３に示す。キメラＦａｂは、配列番号９８のヒト対照と同様の結果を与え、それにより、キメラＦａｂの重鎖及び軽鎖の正しい対合を確認する。無傷のＦａｂを示す５０ｋＤの予想されるバンドは、全てのＦａｂに存在する。
実施例８：免疫化ニワトリライブラリーからのＰＤ－１Ｆａｂの選択
ファージディスプレイライブラリーのレスキュー
上記の実施例６で生成された全てのライブラリーは、この実施例におけるファージディスプレイの選択中に別々に使用される。
ファージディスプレイライブラリーのレスキュー
上記の実施例６で生成された全てのライブラリーは、この実施例におけるファージディスプレイの選択中に別々に使用される。
この実施例で使用される全てのライブラリーは、一晩増殖させた後に細菌を採取することによってレスキューすることができ、その後、確立されたプロトコルに従ってファージを調製することができる（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（２６），１８２１８－３０，１９９９）。
ファージディスプレイの選択
例えばこの実施例に記載されるように、いくつかの異なる選択ストラテジー（各々、ｈｕＰＤ－１及びｍｏＰＤ－１に対する組換えタンパク質及び細胞選択）を実施して、ファージを選択することができる。
例えばこの実施例に記載されるように、いくつかの異なる選択ストラテジー（各々、ｈｕＰＤ－１及びｍｏＰＤ－１に対する組換えタンパク質及び細胞選択）を実施して、ファージを選択することができる。
全ての選択ストラテジーについて、１回目の選択を実行できる。濃縮が観察されない場合、又はスクリーニング中のヒット率が２０％未満の場合は、２回目の選択を行うことができる。かかる２回目の選択は、１回目と同じ選択ストラテジーを使用して、又は異なるフォーマットを使用して実行することができる。例えば、ｈｕＰＤ－１組換えタンパク質での１回目の後、２回目は、ｈｕＰＤ－１組換えタンパク質、又はｍｏＰＤ－１組換えタンパク質、又は更には細胞発現されたｈｕＰＤ－１若しくはｍｏＰＤ－１で再度行うことができる。
組換えタンパク質パニングの選択
いくつかの種のＰＤ－１に融合したｈｕＦｃからなる組換えタンパク質、並びにビオチン化ＰＤ－１融合タンパク質を、選択に使用するために表１に示す。パニングの選択は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘを使用して実行される。
いくつかの種のＰＤ－１に融合したｈｕＦｃからなる組換えタンパク質、並びにビオチン化ＰＤ－１融合タンパク質を、選択に使用するために表１に示す。パニングの選択は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘを使用して実行される。
ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘ磁性粒子プロセッサは、マイクロプレート形式の磁性粒子の自動転送及び処理用に設計されている。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘシステムの技術は、使い捨ての特別に設計されたチップコームとプレートで覆われた磁気ロッドの使用に基づく（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ Ｓ．（２０１０）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ｐ２７０を参照されたい）。
ファージディスプレイの選択は、基本的に製造元の説明書に従って、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ Ｆｌｅｘを使用して半自動化された形式で実行される。ここでは、２つの異なる選択フォーマットについて説明する。１）「溶液中」の選択、すなわち可溶性組換えタンパク質の選択。及び２）ビオチン化細胞の選択。抗原は、典型的には、ビオチン化され、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ又は抗ビオチン抗体でコーティングされた磁気ビーズに捕捉される。
組換えビオチン化ｈｕＰＤ－１及びｍｏＰＤ－１、例えば市販のｈｕＰＤ－１－ｈｕＦｃ－ビオチン及びｍｏＰＤ－１－ｍｏＦｃ－ビオチン（表１を参照）を、５、０．５、及び０μｇ／ｍｌ（陰性対照として後者）で使用することができる。
組換えタンパク質のｈｕＦｃドメインに特異的なバインダーの選択を避けるために、ライブラリーのインキュベーション中に１００μｇ／ｍｌのｈｕｌｇＧ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号４５０６）を溶液に添加する。
結合したファージを、１ｍｇ／ｍｌトリプシンを使用して溶出する。
その後、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒからの溶出サンプルを、５μＬの４ｍｇ／ｍｌのＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ８４５６）を含有する丸底９６ウェルプレートの列に移して、トリプシンを不活性化する。
スポット法によるファージ滴定を使用して、選択の濃縮／出力力価を決定することができる。簡潔に述べると、細菌は溶出したファージの希釈系列に感染し、適切な抗生物質を含有する寒天プレート上にこれらの液滴をスポットし、一晩インキュベートした後、出力力価を表すコロニーの数を計数する。
細胞の選択
細胞の選択は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒを使用して、基本的に製造元の説明書に従い、以下の備考／変更を伴って実行される。
●選択は、ｈｕＰＤ－１又はｍｏＰＤ－１をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞を使用して行うことができる。
●市販の抗体を使用してＰＤ－１の発現を確認するための対照ＦＡＣＳ（表２を参照）を実行した後、以下に説明するビオチン化を開始することができる。
○ｈｕＰＤ－１を検出するために、ｈｕＰＤ－１を認識するマウス抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５２５８７）を一次抗体として、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ｍｏＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ３０００４－４）を二次抗体として使用できる。
○ｍｏＰＤ－１を検出するために、ＰＥコンジュゲートラット抗ｍｏＰＤ－１抗体（ＩＴＫ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１０９１０３；Ｍｅｒｕｓ Ａｂ０２８５）を使用できる。
●細胞は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２１２１７）を使用してビオチン化できる。これには、ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ、カタログ番号ＳＡ１００４－４）を検出試薬として用いて、ＦＡＣＳを使用したビオチン化効率を確認することが含まれる。同時に、上記のＦＡＣＳを再度実行して、細胞上のＰＤ－１が、ビオチン化後に依然として認識され得ることを確認することができる。
●結合したファージを、１ｍｇ／ｍｌトリプシンを使用して溶出する。
●その後、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒからの溶出サンプルを、５μＬの４ｍｇ／ｍｌのＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ８４５６）を含有する丸底９６ウェルプレートの列に移して、トリプシンを不活性化する。
●上記のスポット法によるファージ滴定を使用して、選択の濃縮／出力力価を決定することができる。
細胞の選択は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒを使用して、基本的に製造元の説明書に従い、以下の備考／変更を伴って実行される。
●選択は、ｈｕＰＤ－１又はｍｏＰＤ－１をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞を使用して行うことができる。
●市販の抗体を使用してＰＤ－１の発現を確認するための対照ＦＡＣＳ（表２を参照）を実行した後、以下に説明するビオチン化を開始することができる。
○ｈｕＰＤ－１を検出するために、ｈｕＰＤ－１を認識するマウス抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５２５８７）を一次抗体として、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ｍｏＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ３０００４－４）を二次抗体として使用できる。
○ｍｏＰＤ－１を検出するために、ＰＥコンジュゲートラット抗ｍｏＰＤ－１抗体（ＩＴＫ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１０９１０３；Ｍｅｒｕｓ Ａｂ０２８５）を使用できる。
●細胞は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号２１２１７）を使用してビオチン化できる。これには、ストレプトアビジン－ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ、カタログ番号ＳＡ１００４－４）を検出試薬として用いて、ＦＡＣＳを使用したビオチン化効率を確認することが含まれる。同時に、上記のＦＡＣＳを再度実行して、細胞上のＰＤ－１が、ビオチン化後に依然として認識され得ることを確認することができる。
●結合したファージを、１ｍｇ／ｍｌトリプシンを使用して溶出する。
●その後、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒからの溶出サンプルを、５μＬの４ｍｇ／ｍｌのＡＥＢＳＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ８４５６）を含有する丸底９６ウェルプレートの列に移して、トリプシンを不活性化する。
●上記のスポット法によるファージ滴定を使用して、選択の濃縮／出力力価を決定することができる。
スクリーニング
クローンをランダムに採取し、ファージとしてスクリーニングする。スクリーニングは、細胞発現ｈｕＰＤ－１又はｍｏＰＤ－１でＦＡＣＳによって行われる。理由としては、これらが最も関連性の高い抗原フォーマットであるためである（組換えＰＤ－１タンパク質でのＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、細胞発現ＰＤ－１に結合しないクローンをもたらし得る）。
クローンをランダムに採取し、ファージとしてスクリーニングする。スクリーニングは、細胞発現ｈｕＰＤ－１又はｍｏＰＤ－１でＦＡＣＳによって行われる。理由としては、これらが最も関連性の高い抗原フォーマットであるためである（組換えＰＤ－１タンパク質でのＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、細胞発現ＰＤ－１に結合しないクローンをもたらし得る）。
マスタープレート採取及びファージ産生
●各選択ストラテジーから、２４又は４８クローン（選択中に観察された濃縮に応じて）が、９６ウェルマスタープレート（ＭＰ）に採取される。
○陰性対照として、ＭＦ１０２５（抗サイログロブリンＦａｂドメインを含有するファージ）を各プレートの１つのウェルに接種することができる。
○各ＭＰの１つのウェルはブランク（細菌なし）のままにする。これは、以下に説明するように、ＦＡＣＳスクリーニング中に陽性対照抗体を添加するために使用される。
●各選択ストラテジーから、２４又は４８クローン（選択中に観察された濃縮に応じて）が、９６ウェルマスタープレート（ＭＰ）に採取される。
○陰性対照として、ＭＦ１０２５（抗サイログロブリンＦａｂドメインを含有するファージ）を各プレートの１つのウェルに接種することができる。
○各ＭＰの１つのウェルはブランク（細菌なし）のままにする。これは、以下に説明するように、ＦＡＣＳスクリーニング中に陽性対照抗体を添加するために使用される。
ＦＡＣＳを用いたファージスクリーニング
ファージＦＡＣＳは、ｈｕＰＤ－１又はｍｏＰＤ－１をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞を使用して実行される。１つのウェルを市販の陽性対照抗体（表２）に使用して、ＰＤ－１発現を確認する。ｈｕＰＤ－１を検出するには、ｈｕＰＤ－１を認識するマウス抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５２５８７）を一次抗体として使用でき、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ｍｏＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ３０００４－４）を二次抗体として使用できる。また、ｍｏＰＤ－１を検出するには、ＰＥコンジュゲートラット抗ｍｏＰＤ－１抗体（ＩＴＫ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１０９１０３）を使用できる。
ファージＦＡＣＳは、ｈｕＰＤ－１又はｍｏＰＤ－１をコードする発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３－Ｆ細胞を使用して実行される。１つのウェルを市販の陽性対照抗体（表２）に使用して、ＰＤ－１発現を確認する。ｈｕＰＤ－１を検出するには、ｈｕＰＤ－１を認識するマウス抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ５２５８７）を一次抗体として使用でき、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ｍｏＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ３０００４－４）を二次抗体として使用できる。また、ｍｏＰＤ－１を検出するには、ＰＥコンジュゲートラット抗ｍｏＰＤ－１抗体（ＩＴＫ－Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１０９１０３）を使用できる。
配列決定
ＦＡＣＳにおいてｈｕＰＤ－１及び／又はｍｏＰＤ－１に特異的に結合する全てのクローンのＶＨ遺伝子を配列決定する。それらのＣＤＲ３配列に従って、配列を分析及びグループ化する。
ＦＡＣＳにおいてｈｕＰＤ－１及び／又はｍｏＰＤ－１に特異的に結合する全てのクローンのＶＨ遺伝子を配列決定する。それらのＣＤＲ３配列に従って、配列を分析及びグループ化する。
実施例９：二重特異性キメラニワトリＶＨ／ヒトＶＬ抗体を発現する宿主細胞の生成
少なくとも１つのキメラニワトリＶＨ－ヒトＶＬによる二重特異性抗体は、軽鎖をコードする１つ又は複数のプラスミドと、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成を確実にするようにＣＨ３遺伝子操作された２つの異なる重鎖との（一過性）トランスフェクションによって生成することができる。単一細胞におけるこれらの鎖の産生は、単一特異性抗体の形成よりも優先する、二重特異性抗体の形成をもたらす。
少なくとも１つのキメラニワトリＶＨ－ヒトＶＬによる二重特異性抗体は、軽鎖をコードする１つ又は複数のプラスミドと、二重特異性抗体の効率的なヘテロ二量体化及び形成を確実にするようにＣＨ３遺伝子操作された２つの異なる重鎖との（一過性）トランスフェクションによって生成することができる。単一細胞におけるこれらの鎖の産生は、単一特異性抗体の形成よりも優先する、二重特異性抗体の形成をもたらす。
したがって、２つの異なるＶＨをコードする核酸は、二重特異性抗体が単一の細胞で発現され得るように、再構成ｈｕＶＫ１－３９軽鎖と共に好適な発現ベクターにクローニングされ得る。ＶＨ領域の核酸の一方又は両方は、残りがヒト、例えば、１つの腕のニワトリＶＨ－ヒトＶＬ及び残りがヒト、若しくは２つの腕のニワトリＶＨ－ヒトＶＬ、又は任意の他の順列を有する、ニワトリ起源のものであり得る。
参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第１３／８６６，７４７号（現在、米国特許第９，２４８，１８１号として発行）、米国特許出願公開第１４／０８１，８４８号（現在、米国特許第９，３５８，２８６号として発行）、及び国際出願ＰＣＴ／ＮＬ２０１３／０５０２９４号（国際公開第２０１３／１５７９５４号として公開）において、適合性ヘテロ二量体化ドメインを使用して二重特異性抗体を産生するための方法及び手段が開示されている。本発明では、これらの手段及び方法を好適に採用することができる。具体的には、本発明の二重特異性抗体は、本質的に二重特異性全長ＩｇＧ分子のみを産生するための変異を含むことが好ましい。好ましい変異は、第１のＣＨ３ドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋ及びＴ３６６Ｋ（ＥＵ番号付け）（「ＫＫ－変異体」重鎖）、及び第２のドメイン中のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ及びＬ３６８Ｅ（「ＤＥ－変異体」重鎖）、又はその逆である。ＤＥ－変異体及びＫＫ－変異体が優先的に対合して、ヘテロ二量体（いわゆる「ＤＥＫＫ」二重特異性分子）を形成することが、本発明者らの米国特許第９，２４８，１８１号及び同第９，３５８，２８６号の特許、並びに国際公開第２０１３／１５７９５４号で以前に実証されている。ＤＥ－変異体重鎖のホモ二量体化（ＤＥＤＥホモ二量体）は、同一の重鎖間のＣＨ３－ＣＨ３界面における荷電残基間の反発力のために、ほとんど発生しない。
かかるアプローチは、本明細書に記載されるように、本発明での使用に好適な任意の動物に適用され得る。
実施例１０：マウスＣＸＣＲ４による野生型ニワトリの免疫化
ＣＸＣＲ４は、ＧＰＣＲクラスＡ、サブファミリーＡ１のケモカイン受容体である。それは、細胞外Ｎ末端及び細胞内Ｃ末端を有する７つの膜貫通螺旋を有する。このトポロジーにより、４つの細胞外ドメインをもたらす。マウス相同体は、ヒトＣＸＣＲ４と９１％の全体的な相同性を共有し、細胞外ドメインと６７％の相同性を共有する。ニワトリ相同体は、ヒトＣＸＣＲ４と８２％の全体的な相同性を共有し、細胞外ドメインと４８％を共有する。
ＣＸＣＲ４は、ＧＰＣＲクラスＡ、サブファミリーＡ１のケモカイン受容体である。それは、細胞外Ｎ末端及び細胞内Ｃ末端を有する７つの膜貫通螺旋を有する。このトポロジーにより、４つの細胞外ドメインをもたらす。マウス相同体は、ヒトＣＸＣＲ４と９１％の全体的な相同性を共有し、細胞外ドメインと６７％の相同性を共有する。ニワトリ相同体は、ヒトＣＸＣＲ４と８２％の全体的な相同性を共有し、細胞外ドメインと４８％を共有する。
ＤＮＡ及びリポ粒子免疫化の組み合わせを用いて、５羽のニワトリをマウスＣＸＣＲ４で免疫化した。野生型全長配列マウスＣＸＣＲ４（配列番号９９）を、Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒによって合成及びクローニングした。プラスミドの検証は、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３及びＱＴ６細胞のフローサイトメトリーによって実行され、Ｍａｂ２１６５１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）が検出に使用された。
血液、骨髄、脾臓からのＢ細胞を、抗体応答が最も高いニワトリから単離した。ＲＮＡを白血球から抽出し、ＤＮＡに合成し、重鎖及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅した。増幅されたＶＨ及びＶＬ産物をＭＶ１５１１ベクターにクローニングし（図１８）、Ｆａｂファージミドを産生した。ＤＮＡを細菌に形質転換して、ファージライブラリーを生成し、ファージが配列番号５のヒト軽鎖を発現する。
Ｆａｂファージライブラリーを、マウスＣＸＣＲ４リポ粒子上でパニングした。クローンをリポ粒子ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。バインダーを配列決定し、ＣＤＲ３相同性に基づいてファミリーにグループ化した。３つのＶＨＣＤＲ３ファミリーからのＦａｂを、ネイティブに折り畳まれたマウスＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞を使用して、フローサイトメトリーにより検証した。続いて、これらのファミリーを、フローサイトメトリーによってヒトＣＸＣＲ４への結合について試験した。陽性クローンを、標準的な方法に従ってＩｇＧフォーマットに再クローニングした。ヒト及びマウスのＣＸＣＲ４と交差反応する３つのＶＨＣＤＲ３ファミリーを同定した。結果を図２５に示す。マウス及びヒトＣＸＣＲ４結合抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３１、３２及び３３に示されている。
ニワトリＶＨ及びヒトＶＬを含む抗原特異的キメラ抗体を、機能的に対合した重鎖及び軽鎖を用いて生成した。
Claims (31)
- ヒト生殖細胞系列可変領域と対合したトリ重鎖可変領域を含む、結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 結合ドメインがＦａｂである、請求項１に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- Ｆａｂが、定常軽鎖（ＣＬ）領域及びＶＬ領域と対合したＣＨ１及びＶＨ領域を含む、、請求項２に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ＣＨ１及びＣＬ領域がヒトである、請求項３に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ＣＨ１がトリのものであり、ＣＬ領域がヒトである、請求項３に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 前記トリが、ＶＨ領域をコードする機能的ＶＨ遺伝子セグメントを含み、前記ＶＨ領域が、前記ＶＨ／ＶＬ界面においてヒトＶＬ領域との少なくとも５、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０の静電相互作用を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 前記トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル又はダチョウなどのキジ目である、請求項１～６のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- マウス及び／又はヒトＣＸＣＲ４に、好ましくはヒトＣＸＣＲ４に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 前記トリ重鎖可変領域が、配列番号１００、配列番号１０１若しくは配列番号１０２を含むアミノ酸配列を含み、ヒト生殖細胞系列可変領域が、ＩｇＶＫ１－３９／ＩＧＪＫ１、ＩｇＶＫ１－３９／ＩＧＪＫ５、ＩｇＶＫ３－１５／ＩＧＪＫ１、ＩｇＶＫ３－２０／ＩＧＪＫ１、及びＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３から選択されるヒト生殖細胞系列軽鎖可変領域である、請求項８に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- ヒト重鎖可変領域が、ヒト化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 抗体、特に二重特異性抗体である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体。
- 多重特異性抗体、例えば、三重特異性抗体である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の結合ドメイン又はその変異体の多量体。
- 結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することと、
重鎖可変領域をコードする核酸配列を前記トリから単離することと、
重鎖可変領域を前記単離された核酸配列から得ることと、
前記トリからの前記重鎖可変領域をヒト軽鎖可変領域と対合することと、を含み、
それにより、結合ドメイン又は多量体又はその変異体を調製する、方法。 - 前記トリが、ニワトリ、シチメンチョウ、グラウス、ナンベイウズラ、ウズラ、ターミガン、ヤマウズラ、キジ、ヤケイ、ホウカンチョウ科のトリ、サカツラガン、アヒル又はダチョウをはじめとするキジ目などのトリである、請求項１３に記載の方法。
- ファージであって、そのゲノム中に：
トリ重鎖可変領域をコードする核酸と；
ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸と、を含む、ファージ。 - ヒト軽鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列軽鎖可変領域である、請求項１５に記載のファージ。
- 請求項１５又は１６に記載のファージを含む、ファージディスプレイライブラリーであって、前記ライブラリーが少なくとも約１０６個のファージを含む、ファージディスプレイライブラリー。
- ファージディスプレイライブラリーを調製するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することと、
重鎖可変領域をコードする複数の核酸を前記トリから単離することと、
前記重鎖可変領域をコードする前記核酸と、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、を含み、
それにより、トリ重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を含む結合ドメインを提示するファージディスプレイライブラリーを調製する、方法。 - ヒト軽鎖可変領域が、ヒト生殖細胞系列軽鎖可変領域である、、請求項１８に記載の方法。
- 抗原に対する結合特異性を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定するための方法であって、
トリを抗原で免疫化することと、
重鎖可変領域をコードする複数の核酸を前記トリから単離することと、
前記重鎖可変領域をコードする前記核酸を使用してファージディスプレイライブラリーを調製することと、
前記抗原に結合するファージディスプレイライブラリー内のファージを同定することと、を含み、
それにより、前記抗原に対する結合特異性を有する結合ドメイン又は多量体又はその変異体を同定する、方法。 - 前記結合ドメイン又は多量体又はその変異体が、前記抗原に結合する、請求項２０に記載の方法。
- 前記ファージディスプレイライブラリー内の前記ファージが、ヒト軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
- 前記ファージディスプレイライブラリー内の前記ファージが、ヒト生殖細胞系列軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 抗原に対する結合特異性を有する、混合結合ドメインを同定するための方法であって、
請求項１８又は１９に記載のファージディスプレイライブラリーを調製することと、
抗原に結合する、前記ファージディスプレイライブラリー内のファージを同定することと、
それにより、トリ重鎖可変領域及びヒト軽鎖可変領域を含む結合ドメインを同定する、方法。 - 核酸又は複数の核酸であって、トリ重鎖可変領域を含むポリペプチドと；ヒト軽鎖可変領域を含むポリペプチドとをコードする、核酸又は複数の核酸。
- 請求項１～１２のいずれか一項に記載の結合ドメイン又は多量体又はその変異体、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。
- 治療によるヒト又は動物の身体の処置に使用するための、請求項25に記載の医薬組成物。
- ａ）請求項１５又は１６に記載のファージから、又は請求項17に記載の記ファージディスプレイライブラリーから、トリ重鎖可変領域をコードする核酸を単離することと、
ｂ）トリ重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結することと、
ｃ）トリ重鎖可変領域ＤＮＡ及びヒト共通軽鎖をコードするＤＮＡを、宿主細胞に組み込むことと、
ｄ）細胞が、対合することができる、ヒト共通軽鎖と対合したヒト重鎖定常領域に操作可能に連結されたトリ可変領域を含む抗体を発現するような条件下で、細胞を増殖させることと、
ｅ）抗体を回収することと、
を含む、抗体を調製するための方法。 - 抗体が、多重特異性抗体、特にに二重特異性抗体又は三重特異性抗体である、請求項２８に記載の方法。
- 抗体がヒト化されている、請求項２９に記載の方法。
- 請求項２５に記載の核酸又は複数の核酸を含む、宿主細胞。
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