TW202214705A - 抗tigit抗體及雙抗體和它們的應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，抗TIGIT/抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，包含抗TIGIT抗體或其抗原結合片段或者抗TIGIT/抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體具有顯著的抗腫瘤活性，可在製備抗腫瘤的藥物中應用。

Description

抗TIGIT抗體及雙抗體和它們的應用
本發明涉及抗體藥物技術領域，尤其涉及一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，抗TIGIT/抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，包含抗TIGIT抗體或其抗原結合片段或者抗TIGIT/抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的藥物組合物以及它們的應用。
TIGIT是脊髓灰質炎病毒受體結合蛋白家族成員之一，屬免疫球蛋白超家族亞型，由胞外的免疫球蛋白結構域(IgV)、一個跨膜結構、胞內的基於酪胺酸抑制基序免疫受體(ITIM)和免疫球蛋白酪胺酸尾巴基序(ITT)組成。TIGIT僅表達於淋巴細胞，高表達於效應CD4+ T細胞與調節T細胞、CD4+囊泡輔助T細胞、效應CD8+T細胞以及NK細胞。免疫系統中TIGIT與CD226、CD96競爭結合PVR(CD155)，與CD226、CD112R競爭結合CD122。藉由網絡訊號傳導協調免疫系統，調節免疫活化和免疫抑制。研究表明TIGIT在腫瘤免疫抑制調節中起到重要的作用。TIGIT與其配體PVR、PVR2及PVR3(潛在配體)結合後藉由三種不同的作用方式抑制免疫反應。第一種作用方式是藉由TIGIT的訊號傳導，觸發PVR快速磷酸化向抗原遞呈細胞或者腫瘤細胞傳遞訊號，TIGIT自身是藉由胞內ITIM/ITT結構域將其訊號傳遞給淋巴細胞；第二種影響免疫反應的作用方式是藉由抗原遞呈細胞接收TIGIT訊號後表達分泌IL10、TGF-β等炎症因子抑制T細胞活性；第三種作用方式是藉由與CD226競爭結合PVR干擾CD226的平衡來抑制T細胞的活化。抗TIGIT抗體可阻斷其訊號通路，解除腫瘤免疫抑制，提高效應T細胞、NK細胞細胞毒性，並能建立長期的抗腫瘤免疫記憶，達到治療腫瘤的效果。
考慮到TIGIT在免疫檢查點調節中的重要作用，本領域仍需要開發對TIGIT具有特異性的拮抗性抗體以單獨或與其它試劑組合用於免疫療法和癌症治療。
PD-L1是一種大小爲40 KD的I型跨膜蛋白，在抑制免疫系統中起重要作用。PD-L1藉由與PD-1和B7-1形成免疫複合物，負調控T細胞受體訊號通路，進而引起T細胞活化受阻，抑制T細胞的抗腫瘤活性，其中PD-1作爲PD-L1的受體，主要參與活化T細胞、B細胞、單核細胞和髓系細胞，CD80(B7-1)是一種T細胞共刺激分子。PD-L1的這種免疫調節作用主要發生在一些慢性疾病中，諸如異體移植、自身免疫性疾病和癌症等。PD-L1在許多腫瘤細胞和腫瘤浸潤免疫細胞表面高表達，包括大多數實體瘤和血液淋巴瘤，例如骨髓瘤、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、胃癌、黑色素瘤等。因此，PD-L1可以作爲一個重要的腫瘤治療靶標。目前，藉由阻斷PD-L1發揮抗腫瘤作用的單克隆抗體已經廣泛應用於臨床，並在多種腫瘤中展示出强大的抗腫瘤活性。
同一種疾病在體內往往是受不同的訊號通路、不同的細胞因子以及不同的受體調節機制等控制。多個免疫檢查點通路的聯合阻斷，可能是巧妙且必要的抗腫瘤免疫治療策略。抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體可以藉由阻斷PD-1/PD-L1通路和TIGIT/CD155通路活化免疫應答，並將腫瘤細胞招募至淋巴細胞周圍，進一步提高抗腫瘤活性。因此，開發抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體顯得尤爲必要。
本發明一方面提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區，其中所述重鏈可變區包含重鏈可變區的互補决定區1(H1CDR1)、重鏈可變區的互補决定區2(H1CDR2)和/或重鏈可變區的互補决定區3(H1CDR3)，所述輕鏈可變區包含輕鏈可變區的互補决定區1(L1CDR1)、輕鏈可變區的互補决定區2(L1CDR2)和/或輕鏈可變區的互補决定區3(L1CDR3)。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
(1)所述重鏈可變區包含選自如下組的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3：
(a1)如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列；
(a2)如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列；和
(a3)與(a1)或(a2)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述輕鏈可變區包含選自如下組的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3：
(a4)如SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列；
(a5)如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列；和
(a6)與(a4)或(a5)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其具有所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:25、26和27或與SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO:31、32和33或與SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其具有所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是單克隆抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段是鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段或人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中
(1)所述重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b1) 如SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92所示的胺基酸序列；
(b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b3) 與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b4) 如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97所示的胺基酸序列；
(b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b6) 與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:75功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:75具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:76經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:76功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:76具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:78經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:78功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:78具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:75功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:75具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:76經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:76功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:76具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:78經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:78功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:78具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT抗體爲鼠源抗體，其還含有鼠源的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其變體的重鏈恆定區，和鼠源的κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT鼠源抗體還含有鼠源的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或其變體的重鏈恆定區，和鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段，其中：
(1)所述重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c1) 如SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99所示的胺基酸序列；
(c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c3) 與(c1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c4) 如SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列；
(c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c6) 與(c4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:98經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:98功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:98具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:100功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:100具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:98經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:98功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:98具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:100功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:100具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 31、32和33所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段，其中所述重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列。
在本發明一個較佳的實施方案中，所述的鼠源抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或進一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，所述的抗TIGIT嵌合抗體或其抗原結合片段的抗體輕鏈進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。所述的抗TIGIT嵌合抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其突變序列的重G鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後顯著降低ADCC(抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG4恆定區。
在一些具體的實施方案中，本發明的抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其變體的重鏈恆定區，和人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。在一些較佳的實施方案中，本發明的抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，本發明提供抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗原結合片段爲Fab、Fv、sFv或F(ab)2。
本發明的另一方面提供一種分離的核酸，其編碼根據本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101的核苷酸序列。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼重鏈可變區SEQ ID NO:75的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:77的核苷酸序列。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼重鏈可變區SEQ ID NO:76的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:78的核苷酸序列。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼重鏈可變區SEQ ID NO:98的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:100的核苷酸序列。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼重鏈可變區SEQ ID NO:99的核苷酸序列；和編碼輕鏈可變區SEQ ID NO:101的核苷酸序列。
本發明的另一方面提供一種表達載體，其表達本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。根據本發明的表達載體其包含本發明的分離的核酸分子。
本發明的另一方面提供一種如上所述的表達載體轉化的宿主細胞。
在一些實施方案中，根據本發明的宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。在一些實施方案中，所述的宿主細胞爲細菌，較佳爲大腸杆菌。在另一個較佳的實施方案中，所述的宿主細胞爲哺乳動物細胞。
本發明的另一方面提供製備本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的方法，包括在所述宿主細胞中表達抗體以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
本發明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發明的抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段和藥學可接受的載體。在一些實施方案中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明的抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段，還包含其他活性組分，如其他抗體、靶向藥物等。在一些實施方案中，所述藥學可接受的載體選自抗氧化劑、多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、糖醇、離子和表面活性劑。在一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體爲緩衝水溶液。在另一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體爲脂質體的形式。
可以將本發明的抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脉內、腦內、眼內、氣管內、皮下、鼻內途徑。所述製劑可以藉由任何途徑施用，例如藉由輸注或推注，藉由經上皮或皮膚粘膜(例如口腔粘膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。所述製劑可藉由本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的另一方面提供抑制TIGIT活性的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物。
本發明的另一方面提供用於檢測或測定人TIGIT的方法，所述方法包括使用本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的步驟。
本發明的另一方面提供用於檢測或測定人TIGIT的試劑，所述試劑包本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。
本發明的另一方面提供一種治療與TIGIT相關的疾病的方法，所述方法包括向受試者施用藥物有效量的本發明的TIGIT抗體或其抗原結合片段，或包含上述藥物組合物，或上述分離的核酸分子。本發明的另一方面提供本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段或本發明的藥物組合物在製備與TIGIT相關的疾病的藥物中的應用。在一些實施方案中，所述與TIGIT相關的疾病的藥物用於治療T細胞功能障礙性病症，例如腫瘤、免疫性疾病或感染性病症。在一些實施方案中，所述腫瘤爲非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑素瘤、頭和頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈樣肉芽腫、梅克爾細胞癌、腎上腺皮質癌、肝臟肝細胞癌、胰管腺癌、嗜鉻細胞瘤、神經節細胞瘤、子宮內膜癌和卵巢漿液性囊腺癌等。在一些實施方案中，所述免疫性疾病爲關節炎、炎性腸病、銀屑病。在一些實施方案中，所述感染性疾病爲慢性病毒感染。
本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和/或第一輕鏈可變區，其中所述第一重鏈可變區包含第一重鏈可變區的互補决定區1(H1CDR1)、第一重鏈可變區的互補决定區2(H1CDR2)和/或第一重鏈可變區的互補决定區3(H1CDR3)，所述第一輕鏈可變區包含第一輕鏈可變區的互補决定區1(L1CDR1)、第一輕鏈可變區的互補决定區2(L1CDR2)和/或第一輕鏈可變區的互補决定區3(L1CDR3)；和所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段爲特異性結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)所述第一重鏈可變區包含選自如下組的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3：
(a1)如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列；
(a2)如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列；和
(a3)與(a1)或(a2)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第一輕鏈可變區包含選自如下組的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3：
(a4)如SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列；
(a5)如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列；和
(a6)與(a4)或(a5)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段具有：
所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:25、26和27或與SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO:31、32和33或與SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；或
所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區。
在一些實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)所述第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b1) 如SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92所示的胺基酸序列；
(b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b3) 與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b4) 如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97所示的胺基酸序列；
(b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b6) 與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:75功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:75具有至少85%序列同一性的胺基酸序列且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性的胺基酸序列且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列；或
所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:76經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:76功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:76具有至少85%序列同一性的胺基酸序列且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:78經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:78功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:78具有至少85%序列同一性的胺基酸序列且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段爲人源化抗體或其抗原結合片段，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)所述第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c1) 如SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99所示的胺基酸序列；
(c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c3) 與(c1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c4) 如SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列；
(c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(c4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c6) 與(c4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段爲人源化抗體或其抗原結合片段，其包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中
所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:98經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:98功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:98具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:100功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:100具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或
所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些較佳的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段如以上實施方案中所限定；和所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和/或第二輕鏈可變區，其中所述第二重鏈可變區包含第二重鏈可變區的互補决定區1(H2CDR1)、第二重鏈可變區的互補决定區2(H2CDR2)和/或第二重鏈可變區的互補决定區3(H2CDR3)，所述第二輕鏈可變區包含第二輕鏈可變區的互補决定區1(L2CDR1)、第二輕鏈可變區的互補决定區2(L2CDR2)和/或第二輕鏈可變區的互補决定區3(L2CDR3)。
進一步較佳地，在一些實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段如以上實施方案中所限定，和所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)所述第二重鏈可變區包含選自如下組的H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3：
(A1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列；
(A2)如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列；
(A3)如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列；和
(A4)如SEQ ID NO:10、11和12所示的胺基酸序列；
(A5)與(A1)、(A2)、(A3)或(A4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第二輕鏈可變區包含選自如下組的L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3：
(A6)如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列；
(A7)如SEQ ID NO:16、17和18所示的胺基酸序列；
(A8)如SEQ ID NO:19、20和21所示的胺基酸序列；
(A9)如SEQ ID NO:22、23和24所示的胺基酸序列；
(A10)與(A6)、(A7)、(A8)或(A9)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中：
所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)所述第一重鏈可變區包含選自如下組的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3：
(a1)如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列；
(a2)如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列；和
(a3)與(a1)或(a2)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第一輕鏈可變區包含選自如下組的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3：
(a4)如SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列；
(a5)如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列；和
(a6)與(a4)或(a5)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和
所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)所述第二重鏈可變區包含選自如下組的H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3：
(A1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列；
(A2)如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列；
(A3)如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列；和
(A4)如SEQ ID NO:10、11和12所示的胺基酸序列；
(A5)與(A1)、(A2)、(A3)或(A4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第二輕鏈可變區包含選自如下組的L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3：
(A6)如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列；
(A7)如SEQ ID NO:16、17和18所示的胺基酸序列；
(A8)如SEQ ID NO:19、20和21所示的胺基酸序列；
(A9)如SEQ ID NO:22、23和24所示的胺基酸序列；
(A10)與(A6)、(A7)、(A8)或(A9)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO: 28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別爲SEQ ID NO:1、2和3或與SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別爲SEQ ID NO:13、14和15或與SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO: 28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別爲SEQ ID NO:7、8和9或與SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別爲SEQ ID NO:19、20和21或與SEQ ID NO: 19、20和21所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO: 28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別爲SEQ ID NO: 4、5和6或與SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別爲SEQ ID NO: 16、17和18或與SEQ ID NO: 16、17和18所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一個具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO: 28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區；和所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別爲SEQ ID NO:10、11和12或與SEQ ID NO:10、11和12所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別爲SEQ ID NO:22、23和24或與SEQ ID NO:22、23和24所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段以及抗PD-L1抗體或其抗原結合片段各自獨立地爲鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或完全人抗體。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1) 所述第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b1) 如SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99所示的胺基酸序列；
(b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b3) 與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(b4) 如SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列；
(b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(b6) 與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)所述第二重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(B1) 如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列；
(B2) (B1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(B3) 與(B1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(B4) 如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:64所示的胺基酸序列；
(B5) (B4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(B6) 與(B4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:98經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:98功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:98具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:100功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:100具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:98經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:98功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:98具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO: 25、26和27所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:100功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:100具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 31、32和33所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述抗TIGIT抗體或抗PD-L1抗體可以爲鼠源抗體，其還含有鼠源的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其變體的重鏈恆定區，和鼠源的κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些較佳的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述抗TIGIT鼠源抗體還含有鼠源的IgG1或IgG2或其變體的重鏈恆定區，和鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中：
(1)所述第一重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c1) 如SEQ ID NO:99所示的胺基酸序列；
(c2) (c1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(c1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c3) 與(c1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(c4) 如SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列；
(c5) (c4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(c4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(c6) 與(c4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中：
(1)所述第二重鏈可變區的胺基酸序列選自：
(C1) 如SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列；
(C2) (C1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(C1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(C3) 與(C1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和
(2)所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列選自：
(C4) 如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:64所示的胺基酸序列；
(C5) (C4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(C4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和
(C6) 與(C4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列；和所述第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:50所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:50經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:50功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:50具有至少85%序列同一性且所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:54功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:54具有至少85%序列同一性且所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列；和所述第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:52所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:52經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:52功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:52具有至少85%序列同一性且所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:56經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:56功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:56具有至少85%序列同一性且所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列；和所述第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:61經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:61功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:61具有至少85%序列同一性且所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列，且所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:64經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:64功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:64具有至少85%序列同一性且所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:19、20和21所示的胺基酸序列。
在一些較佳的實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列；和所述第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:50所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:50經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:50功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:50具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:54功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:54具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列；和所述第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:52所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:52經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:52功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:52具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:56經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:56功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:56具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且所述第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列；和所述第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:61經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:61功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:61具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列，且所述第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:64經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:64功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:64具有至少85%，或至少90%，或至少95%，或至少98%序列同一性且所述L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:19、20和21所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，本發明提供一種抗TIGIT/抗PD-L1人源化抗體，其中所述重鏈包含人源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區，所述輕鏈包含人源的κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，所述的鼠源抗TIGIT/抗PD-L1抗體，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或進一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其變體的重鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的抗體輕鏈進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2、IgG4重鏈恆定區。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其變體的重鏈恆定區，和人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。在一些較佳的實施方案中，本發明的抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2、IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈進一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其突變序列的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG或其突變序列的重鏈恆定區；所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的抗體輕鏈進一步包含鼠源κ、λ鏈或其突變序列的輕鏈恆定區。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，所述抗PD-L1人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。在一些較佳的實施方案中，本發明的抗TIGIT人源化抗體或其抗原結合片段還包含人源IgG4或其變體的重鏈恆定區，和人源κ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，本發明提供抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段以及抗PD-L1抗體或其抗原結合片段分別爲Fab、Fv、sFv或F(ab)2。在一個具體的實施方案中，本發明提供的抗TIGIT/抗PD-L1抗體爲scF(ab)2。
較佳地，本發明以上實施方案中的抗TIGIT/抗PD-L1抗體是抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體。在一些實施方案中，所述雙特異性抗體是人抗體或人源化抗體。在一些實施方案中，所述結合特異性之一是針對TIGIT，而另一個結合特異性是針對任何其它抗原。在一些實施方案中，所述結合特異性之一是針對TIGIT，而另一個結合特異性是針對PD-L1。在一些實施方案中，所述雙特異性抗體可結合TIGIT的兩種不同表位。所述雙特異性抗體還可用於將細胞毒劑定位於表達TIGIT的細胞。這些抗體擁有TIGIT結合臂和細胞毒劑結合臂，所述細胞毒劑例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物鹼類、蓖麻毒蛋白A鏈、甲胺蝶呤或放射性同位素半抗原。可將本發明的雙特異性抗體製備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。
製備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統上，雙特異性抗體的重組製備基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩個重鏈具有不同的特異性(Millstein and Cuello, Nature 305: 537(1983))。由於免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(quadroma))可能産生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種分子具有正確的雙特異性結構。該正確分子的純化通常藉由親和層析步驟進行，相當麻煩且産物産量低。類似的方法在WO93/08829及Trauneckeretal., EMBOJ. 10: 3655(1991)中有公開。
根據一種不同的方法，具有期望結合特異性(抗體-抗原結合位點)的抗體可變區與免疫球蛋白恆定區序列融合。在一些實施方案中，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區的免疫球蛋白重鏈恆定區進行融合。在一些實施方案中，包含與輕鏈結合所必需位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於該融合的至少一部分中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合片段以及免疫球蛋白輕鏈(如果需要)的DNA插入不同的表達載體中並共轉染入合適的宿主生物體。在用於構建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳産量的實施方案中，這爲調整三種多肽片段的相互比例提供極大的靈活性。不過，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達産生高産量時或比例沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。
在該方法的一個實施方案中，所述雙特異性抗體由一個臂中具有第一結合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一個臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)組成。由於免疫球蛋白輕鏈僅在該雙特異性分子的一半中存在提供了便利的分離途徑，因此發現該不對稱性結構便於將期望的雙特異性物質與不想要的免疫球蛋白鏈組合物分開。該方法在WO 94/04690中公開。關於産生雙特異性抗體的進一步信息參見例如Sureshetal., Methods in Enzymology 121: 210(1986)。
根據另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面以使從重組細胞培養物回收的異二聚體的百分比最大化。該界面包含抗體恆定區CH3結構域的至少一部分。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替換。藉由將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替換，在第二抗體分子的界面上産生與大側鏈相同或相似大小的補償性“空腔”。這提供了提高異二聚體相比於其它不想要的終産物諸如同二聚體的產量的機制。
雙特異性抗體包括交聯或“異源綴合”抗體。例如，一種異源綴合抗體可以與親合素偶聯，另一種異源綴合抗體可以與生物素偶聯。可使用任何便利的交聯方法來製備異源綴合抗體。合適的交聯劑是本領域眾所周知的，連同許多交聯技術一起在美國專利No.4,676,980中公開。
本發明的雙特異性抗體可以由抗體片段生成。例如，可使用化學連接技術來製備雙特異性抗體。Brennanetal., Science 229: 81(1985)描述了藉由蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡合劑亞砷酸鈉的情况下(用以穩定鄰近的二硫醇和防止分子間二硫鍵的形成)分解。然後將產生的Fab'片段轉變爲硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然後將Fab'-TNB衍生物之一藉由巰基乙胺的還原重新恢復成Fab'-硫醇，並與等莫耳量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。
可以從大腸杆菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學偶聯以形成雙特異性抗體。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225(1992)描述了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。每個Fab'片段由大腸杆菌單獨分泌，並在體外進行定向化學偶聯以形成雙特異性抗體。
在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體片段可以直接從重組細胞培養物生成和分離。例如，可以使用亮胺酸拉煉生成雙特異性抗體(Kostelnyetal., J. Immunol. 148(5): 1547-1553(1992))。將來自Fos和Jun蛋白的亮胺酸拉煉肽藉由基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區分解以形成單體，然後重新氧化以形成抗體異二聚體。該方法也可用於生成抗體同二聚體。雙抗體技術提供了製備雙特異性抗體片段的其他機制。所述雙特異性抗體片段包含藉由接頭相連的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述接頭太短以使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結構域與另一個片段上的互補VL和VH結構域配對，由此形成兩個抗原結合位點。在另一實施方案中，可以藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體構建雙特異性抗體片段。
本發明涵蓋具有超過兩價的多價抗體，例如，可製備三特異性抗體。多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達該抗體結合的抗原的細胞的內在化(和/或異化)。本發明的抗體可以是可容易地藉由編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達而生成的、具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。在一些實施方案中，二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情况中，抗體會包含Fc區及Fc區胺基末端的三個或更多抗原結合位點。在一些實施方案中，多價抗體包含(或由其組成)三個至大約八個抗原結合位點。在一些實施方案中，多價抗體包含四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(例如兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或更多可變區。本發明的多價抗體可進一步包含至少兩條(例如四條)輕鏈可變區多肽。本發明的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變區多肽。本發明的輕鏈可變區多肽包含輕鏈可變區，且任選進一步包含CL結構域。
在包含TIGIT靶向部分和PD-L1靶向部分的雙特異性抗體中，TIGIT靶向部分和PD-L1靶向部分之一可以是全長抗體，並且另一個可以是包含重鏈CDR、輕鏈CDR或其組合的抗原結合片段(例如scFv)。靶向TIGIT和PD-L1蛋白之一的全長抗體和靶向另一蛋白的抗原結合片段可以直接或藉由連接肽以化學方式連接(例如共價連接)。抗原結合片段(例如scFv)可以直接或藉由連接肽與全長抗體的N-末端(例如全長抗體的輕鏈或重鏈的N-末端)、全長抗體的C-末端(例如全長抗體的重鏈(或Fc或CH3結構域)的C-末端)或兩者連接。
在一個實施方案中，雙特異性抗體可以包含全長抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體的抗原結合片段(例如scFab、scFv)以及它們之間的連接肽。在其他實施方案中，雙特異性抗體可以包含全長抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體的抗原結合片段(例如scFab、scFv)以及它們之間的連接肽。
在一個實施方案中，雙特異性抗體中包含的scFv可以按任何順序包含重鏈可變區和輕鏈可變區。例如，雙特異性抗體中包含的scFv可以在從N-末端到C-末端的方向上包含重鏈可變區和輕鏈可變區以及任選地在它們之間的連接肽，或者可替代地，雙特異性抗體中包含的scFv可以在從N-末端到C-末端的方向上包含輕鏈可變區和重鏈可變區以及任選地在它們之間的連接肽。
在一些實施方案中，所述連接肽可包括例如Gly、Asn和/或Ser殘基，並且還可以包括中性胺基酸，例如Thr和/或Ala。適用於連接肽的胺基酸序列可以是相關領域中已知的那些。同時，可以在使得融合蛋白功能不受影響的這樣的限度內不同地確定連接肽的長度。例如，連接肽可以藉由包括總共約1至約100、約2至約50、或約5至約25個選自由Gly、Asn、Ser、Thr、和Ala組成的組的一種或多種來形成。在一個實施方案中，連接肽可以表示爲(GmSl)n(m、l和n獨立地是約1至約10的整數，特別是約2至約5的整數)。
在另一個實施方案中，PD-L1靶向部分和TIGIT靶向部分可以均是全長抗體或包含重鏈CDR、輕鏈CDR或其組合的抗原結合片段。
在另一個實施方案中，雙特異性抗體可以是異二聚體形式，其包含第一臂和第二臂，該第一臂包括靶向TIGIT和PD-L1之一的一對第一重鏈和第一輕鏈，該第二臂包括靶向另一者的一對第二重鏈和第二輕鏈。
在一個實施方案中，全長抗體可以是全長免疫球蛋白形式(例如IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，例如人IgG、人IgM、人IgA、人IgE或人IgD)，並且抗原結合片段可以選自由Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、scFab、單鏈抗體、sdFv等組成的組。例如，全長抗體可以是全長人IgG (人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4)形式，並且抗原結合片段可以是scFv。
例如，本文描述的抗體可以包含柔性接頭序列，或者可以被修飾以添加功能部分(例如PEG、藥物、毒素或標記)。在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的結構爲(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的結構爲(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH。在另一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，所述抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的結構爲(VL-VH)-連接肽-IgG4FC，所述抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的結構爲(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH。在一些具體的實施方案中，所述連接肽爲(GGGGS)n形式，其中n爲1-12，較佳爲3-10，更佳爲6-8，例如6、7、8個GGGGS重複序列。在另一些具體的實施方案中，靶向TIGIT部分的(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH中的IgG4FC爲含有S228P、L235E突變的IgG4 CH段，靶向PD-L1部分的(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH中的IgG4FC爲含有S228P、L235E突變的IgG4 CH段。在另一些具體的實施方案中，靶向TIGIT部分的(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH中的IgG4FC爲含有S228P、S354C、T366W突變形成“Hole”結構的IgG4 CH段，靶向PD-L1部分的(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH中的IgG4FC爲含有S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V突變形成“Knob”結構的IgG4 CH段。在另一些具體的實施方案中，靶向TIGIT部分的(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH中的IgG4FC爲含有S228P、L235E、S354C、T366W突變形成“Hole”結構的IgG4 CH段，靶向PD-L1部分的(VL-CL)-連接肽-(VH)-IgG4CH中的IgG4FC爲含有S228P、L235E、Y349C、T366S、L368A、Y407V突變形成“Knob”結構的IgG4 CH段。在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中：
肽鏈1的結構爲：
Figure 02_image001
肽鏈2的結構爲：
Figure 02_image003
其中IgG4CH/Ks表示IgG4恆定區(S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V突變)，IgG4CH/Hs表示IgG4恆定區(S228P、S354C、T366W突變)。
在另一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中：
肽鏈1的結構爲：
Figure 02_image005
肽鏈2的結構爲：
Figure 02_image007
其中IgG4CH/PE表示IgG4恆定區(S228P、L235E突變)。
在一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中肽鏈1的胺基酸序列爲SEQ ID NO:102，肽鏈2的胺基酸序列爲SEQ ID NO:103。在另一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中肽鏈1的胺基酸序列爲SEQ ID NO:104，肽鏈2的胺基酸序列爲SEQ ID NO:105。在另一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中肽鏈1的胺基酸序列爲SEQ ID NO:102，肽鏈2的胺基酸序列爲SEQ ID NO:106。在另一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中肽鏈1的胺基酸序列爲SEQ ID NO:107，肽鏈2的胺基酸序列爲SEQ ID NO:108。在另一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中肽鏈1的胺基酸序列爲SEQ ID NO:102，肽鏈2的胺基酸序列爲SEQ ID NO:109。在另一些具體的實施方案中，根據本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，其由兩條肽鏈組成，其中肽鏈1的胺基酸序列爲SEQ ID NO:110，肽鏈2的胺基酸序列爲SEQ ID NO:111。本發明的另一方面提供分離的核酸。在一些實施方案中，根據本發明的分離的核酸編碼本發明的抗TIGIT/抗PD-L1抗體。在一些實施方案中，根據本發明的分離的核酸編碼本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。在另一些實施方案中，根據本發明的分離的核酸編碼本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼第一重鏈可變區如SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的核苷酸序列和編碼第一輕鏈可變區如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101的核苷酸序列。在另一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼第二重鏈可變區如SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:61的核苷酸序列和編碼第二輕鏈可變區如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:64的核苷酸序列。在再一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼第一重鏈可變區如SEQ ID NO:99的核苷酸序列和編碼第一輕鏈可變區如SEQ ID NO:101的核苷酸序列。在再一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸，其包含編碼第二重鏈可變區SEQ ID NO:50的核苷酸序列和編碼第二輕鏈可變區SEQ ID NO:54的核苷酸序列。在一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸組合，其包含編碼第一重鏈可變區如SEQ ID NO:99的核苷酸序列，編碼第一輕鏈可變區如SEQ ID NO:101的核苷酸序列，編碼第二重鏈可變區如SEQ ID NO:50的核苷酸序列，和編碼第二輕鏈可變區如SEQ ID NO:54的核苷酸序列。在另一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸組合，其包含編碼第一重鏈可變區如SEQ ID NO:99的核苷酸序列，編碼第一輕鏈可變區如SEQ ID NO:101的核苷酸序列，編碼第二重鏈可變區如SEQ ID NO:52的核苷酸序列，和編碼第二輕鏈可變區如SEQ ID NO:56的核苷酸序列。在另一個具體的實施方案中，根據本發明的分離的核酸組合，其包含編碼第一重鏈可變區如SEQ ID NO:99的核苷酸序列，編碼第一輕鏈可變區如SEQ ID NO:101的核苷酸序列，編碼第二重鏈可變區如SEQ ID NO:61的核苷酸序列，和編碼第二輕鏈可變區如SEQ ID NO:64的核苷酸序列。
本發明的另一方面提供表達載體。在一些實施方案中，本發明的表達載體表達本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體。在一些實施方案中，本發明的表達載體表達本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段。在另一些實施方案中，本發明的表達載體表達本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，根據本發明的表達載體，表達本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段的載體和表達本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的載體是同種表達載體。根據本發明的表達載體其包含本發明的分離的核酸分子。
本發明的另一方面提供一種如上所述的表達載體轉化的宿主細胞。
在一些實施方案中，根據本發明的宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。在一些實施方案中，所述的宿主細胞爲細菌，較佳爲大腸杆菌。在另一個較佳的實施方案中，所述的宿主細胞爲哺乳動物細胞。
本發明的另一方面提供製備本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體的方法，包括在所述宿主細胞中表達抗體以及從宿主細胞中分離所述抗體的步驟。
本發明的另一方面提供一種藥物組合物，其包含本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體和藥學可接受的載體。在一些實施方案中，本發明提供藥物組合物，其包含本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體，還包含其他活性組分，如其他抗體、靶向藥物等。在一些實施方案中，所述藥學可接受的載體選自抗氧化劑、多肽、蛋白質、親水性聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、糖醇、離子和表面活性劑。在一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體爲緩衝水溶液。在另一個具體的實施方案中，所述藥學可接受的載體爲脂質體的形式。
本發明的另一方面提供一種嵌合抗原受體(CAR)融合蛋白，其包含本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和/或抗PD-L1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，所述嵌合抗原受體融合蛋白包含本發明的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其爲針對TIGIT抗原的VH和VL的單鏈可變片段(scFv)。在另一些實施方案中，所述嵌合抗原受體融合蛋白包含本發明的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其爲針對PD-L1抗原的VH和VL的單鏈可變片段(scFv)。在另一些實施方案中，所述嵌合抗原受體融合蛋白包含針對TIGIT抗原的VH和VL的第一單鏈可變片段(scFv)和針對PD-L1抗原的VH和VL的第二單鏈可變片段(scFv)。所述針對TIGIT抗原的VH和VL的第一scFv具有以上實施方案中描述的第一重鏈可變區的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3和第一輕鏈可變區的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3。所述針對PD-L1抗原的VH和VL的第二scFv具有以上實施方案中描述的第二重鏈可變區的H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3和第二輕鏈可變區的L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3。
可以將本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑混合製備成藥物製劑，以適合於經口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限於經口、皮內、肌內、腹膜內、靜脉內、腦內、眼內、氣管內、皮下、鼻內途徑。所述製劑可以藉由任何途徑施用，例如藉由輸注或推注，藉由經上皮或皮膚粘膜(例如口腔粘膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。所述製劑可藉由本領域已知的方法製備，且包含藥物製劑領域常規使用的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的另一方面提供治療和/或預防與TIGIT、PD-L1或兩者相關的疾病的方法，所述方法包括向有此需要的個體施用本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體或本發明的藥物組合物。
本發明的另一方面提供本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體或本發明的藥物組合物在製備治療和/或預防與TIGIT、PD-L1或兩者相關的疾病的藥物中的應用。在一些實施方案中，所述與TIGIT、PD-L1或兩者相關的疾病包括血液腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤和/或黑素瘤。所述腫瘤可以是任何表達PD-L1蛋白的腫瘤，例如膀胱癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌等)、乳腺癌、尿道癌、頭頸癌、胃腸癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、腎癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌等。所述腫瘤可以是原發性或轉移性腫瘤。在一些實施方案中，本發明提供上述抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體或本發明的藥物組合物在製備抗腫瘤的藥物中的應用，例如所述腫瘤選自血液腫瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經膠質瘤、黑素瘤、骨髓瘤、前列腺癌。
本發明提供的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體具有顯著的抗腫瘤作用，可明顯抑制腫瘤生長，可在製備用於治療各類腫瘤疾病的藥物中應用，具有廣闊的市場前景。
定義
除非另有定義，本文中使用的科學和技術術語的含義是本領域技術人員所通常理解的含義。本文中所述的細胞和組織培養、分子生物學以及蛋白質和寡或多核苷酸化學及雜交中使用的命名和技術是本領域公知且普遍使用的。對於重組DNA、寡核苷酸合成和組織培養與轉化(如電穿孔、脂質轉染)，使用了標準技術。酶促反應和純化技術根據生產商的說明書或本領域普遍使用或本文所述的方法進行。前述技術和方法通常根據本領域公知且本說明書中引用和討論的多部綜合和較具體的文獻中描述的那樣使用。參見例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual) (第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，紐約冷泉港(1989))。本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥學化學中使用的命名以及實驗室方法和技術是本領域公知且普遍使用的。
在本發明中，術語“至少80%序列同一性”是指至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。在本發明中，術語“至少85%序列同一性”是指至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。在一些較佳的實施方案中，本發明所述的序列同一性可以至少爲90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。兩個序列之間的序列比較和同一性百分比測定可以藉由National Center For Biotechnology Instutute網站上的BLASTN/BLASTP算法來進行。
在抗體分子中，輕鏈的三個高變區和重鏈的三個高變區在三維空間中以相對彼此的位置排列以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原的三維表面互補，且每條重鏈和輕鏈的三個高變區均被稱作“互補决定區”或“CDR”。胺基酸向每個結構域的分配是根據Kabat《免疫學感興趣的蛋白質的序列》(國立衛生研究院，馬裏蘭州貝塞斯達(1987和1991))或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，Chothia等，Nature 342:878-883(1989)定義。
本發明的“抗體”是指特異性地識別並結合抗原的多肽或多肽複合物。抗體可以是完整抗體和其任何抗原結合片段或單鏈。本發明的“抗體”包括含有Ig分子的具有結合抗原的生物活性的至少一部分的任何蛋白質或肽。本發明“抗體”的實例包括但不限於重鏈或輕鏈的CDR或其配體結合部分、重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈恆定區、框架區或其任何部分。
本發明所述的“抗原結合片段”包括具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段及與人TIGIT或PD-L1結合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗體第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多連接肽，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱爲單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)。本發明的抗TIGIT或抗PD-L1抗體可以是單鏈可變區片段(scFv)，其源自抗體的單鏈多肽，保留了結合抗原的能力。scFv的實例包括藉由重組DNA技術形成的抗體多肽，其中免疫球蛋白重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)片段的Fv區經由間隔序列連接。製備scFv的各種方法是本領域技術人員所熟知的。
本發明所述的抗體指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即包含特異性結合抗原(與其免疫反應)的抗原結合位點的分子。“特異性結合”指抗體與抗原的一種或多種抗原决定簇反應而不與其他多肽反應或以很低的親和性(Kd＞10-6)結合其他多肽。抗體包括但不限於多克隆、單克隆、嵌合、dAb(結構域抗體)、單鏈、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、scFv及Fab表達文庫。單克隆抗體(mAb)是由單一的克隆細胞株得到的抗體，所述的細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的克隆細胞株。單克隆抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術及合成技術如CDR grafting或其它現有技術進行重組得到。
本發明所述的“鼠源抗體”爲根據本領域知識和技能製備的對人TIGIT的單克隆抗體。製備時用TIGIT抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。
本發明所述的“嵌合抗體”是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以减輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從小鼠雜交瘤細胞中克隆可變區基因，再根據需要克隆人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。
本發明所述的“人源化抗體”也稱爲CDR移植抗體，是將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架(FR)中產生的抗體。此類可變區框架序列可以從公共的DNA數據庫或公開的參考文獻獲得，例如從ImMunoGeneTics (IMGT)網站http://imgt.cines.fr得到或從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本發明所述的“雙特異性抗體”指對至少兩種不同抗原具有結合特異性的單克隆抗體。
本發明所述的“連接肽”可以是包括1至10，特別是2至50個任何胺基酸的那些，並且可以包括任何種類的胺基酸而沒有任何限制。
下面代表性的實施例是爲了更好地說明本發明，而非用於限制本發明的保護範圍。以下實施例中未註明條件的實驗方法通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手册、分子克隆手册等，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件進行。實施例中使用的材料、試劑如無特殊說明均爲商購獲得。
實施例1  抗人PD-L1抗體的獲得
1. 動物免疫
採用mFc標簽的PD-L1抗原蛋白(購於北京百普賽斯生物科技有限公司，中國)與佐劑共同免疫的方法免疫BALB/c、SJL品系的實驗小鼠和SD品系的實驗大鼠。
免疫佐劑首次是Freund’s Adjuvant, Complete (SIGMA, F5881-10ML)，後期用Freund’s Adjuvant, Incomplete (SIGMA, F5506-10ML)。將不同標簽的PD-L1抗原蛋白樣品逐滴加入到佐劑溶液中，邊滴加邊渦旋以充分混合，佐劑使用劑量參考說明書進行。混合均勻形成油包水的乳狀後免疫小鼠或大鼠。免疫方案如表1所示：
表1 免疫方案
組別 品系 抗原 佐劑 劑量 免疫途徑*
1 BALB/c PBS 無    
2 BALB/c PD-L1-mFc Freund’s Adjuvant, Complete(首次) Freund’s Adjuvant, Inomplete 50 μg 25 μg i.m.
3 SJL PBS 無    
4 SJL PD-L1-mFc Freund’s Adjuvant, Complete(首次) Freund’s Adjuvant, Inomplete 50 μg 25 μg i.m.
5 SD PBS 無    
6 SD PD-L1-mFc Freund’s Adjuvant, Complete(首次) Freund’s Adjuvant, Inomplete 100 μg 50 μg i.m.
* i.m. 肌內注射
2. 細胞融合
無菌取小鼠脾臟並製成細胞懸液，按脾細胞：Sp2/0細胞(小鼠骨髓瘤細胞)=1：1的比例進行細胞融合。將融合後的細胞懸液轉入到含有20% FBS的15mL RPMI 1640完全培養基中，室溫放置20 min。用含1×HAT、1×BIOMYC3、20%FBS的RPMI 1640培養基重懸融合細胞。按100 μl/孔將細胞懸液加到若干塊96孔細胞培養板中，保證每孔細胞量約爲4×104個細胞/孔，置於37℃細胞培養箱中培養。5天后補加100 µL/孔RPMI 1640完全培養基(含20% FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。
3. 陽性克隆篩選
融合一周後，取細胞上清，藉由ELISA篩選出具有結合及阻斷能力的雜交瘤母克隆細胞並進行擴大培養，複測結合活性及阻斷活性，再次篩選獲得具有結合及阻斷能力的雜交瘤陽性細胞株。利用有限稀釋法將陽性細胞株進行亞克隆，培養一周後用ELISA檢測亞克隆上清與PD-L1分子的結合活性以及阻斷PD-L1/PD-1相互作用的活性，獲得PL-7、PL-15、PL-16、PL-18四株較佳雙陽性細胞株。
4. 抗PD-L1抗體可變區序列的獲得
將經亞克隆操作的陽性雜交瘤細胞進行擴大培養，取適量細胞按RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen，74134)試劑盒說明書提取總RNA，利用Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，6110A)反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。
根據小鼠抗體亞型可變區設計特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)，以cDNA爲模板進行抗體可變區基因的PCR擴增，從而分別獲得小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區的基因片段，命名爲SHS009PL-7、SHS009PL-15、SHS009PL-16、SHS009PL-18；設計引物(參考文獻：1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester etal. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35–55; 2. Simon KorenMiha KosmačAnja Colja Venturini etal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071–1078)，進行DNA測序獲得序列，測序結果見表2。
表2 抗PD-L1鼠源單克隆抗體序列
抗體 重鏈可變區胺基酸 序列 輕鏈可變區胺基酸 序列 H2CDR1、H2CDR2、H2CDR3 L2CDR1、L2CDR2、L2CDR3
SHS009PL-7 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:41 SEQ ID NOs: 1、2、3 SEQ ID NOs: 13、14、15
SHS009PL-15 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:42 SEQ ID NOs: 4、5、6 SEQ ID NOs: 16、17、18
SHS009PL-16 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:43 SEQ ID NOs: 7、8、9 SEQ ID NOs: 19、20、21
SHS009PL-18 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:44 SEQ ID NOs: 10、11、12 SEQ ID NOs: 22、23、24
5. 嵌合抗體的構建
將純化後的小鼠抗體輕鏈與重鏈可變區基因片段分別與線性化的含有人抗體輕鏈或重鏈恆定區基因片段的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，挑取測序正確的嵌合抗體分別標記爲PL-7CHI、PL-15CHI、PL-16CHI、PL-18CHI，嵌合抗體測序結果見表3。
PL-7CHI、PL-15CHI、PL-16CHI、PL-18CHI輕重鏈可變區胺基酸序列，分別同鼠源性抗體SHS009PL-7、SHS009PL-15、SHS009PL-16、SHS009PL-18輕重鏈可變區胺基酸序列相同。
提取嵌合抗體輕鏈質粒與重鏈質粒轉染HEK 293F細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
表3 抗PD-L1嵌合抗體序列
嵌合抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
PL-7CHI SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:41
PL-15CHI SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:42
PL-16CHI SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:43
PL-18CHI SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:44
6. 抗PD-L1抗體人源化改造
根據嵌合抗體的活性分析、親和力KD值等結果選擇PL-7CHI、PL-16CHI進行人源化抗體改造。
鼠源單克隆嵌合抗體PL-7CHI、PL-16CHI的人源化參照經典的CDR移植策略進行，以PL-7CHI、PL-16CHI抗體框架區序列FR1-FR3作爲模板，在人框架區庫中尋找3D結構相似但是免疫原性較低的全人框架替代PL-7CHI/PL-16CHI的FR1-FR3序列。經同源比對分析，PL-7CHI、PL-16CHI抗體重鏈可變區FR區分別與人抗體種系基因M99683|IGHV4-31*02 (SEQ ID NO:45)、X62109|IGHV1-3*01 (SEQ ID NO:46)最爲相似，PL-7CHI、PL-16CHI抗體輕鏈可變區FR區與人抗體種系基因Z00023|IGKV4-1*01(SEQ ID NO:47)最爲相似。人源化後的重鏈/輕鏈全長序列進行3D建模並和原抗體重鏈/輕鏈序列進行結構比對分析，綜合考慮抗原性和3D結構相似度，並將在結構模擬中顯示對抗體結構穩定起到關鍵作用的的胺基酸位點回突變爲鼠源性胺基酸殘基。最後得到PL-7CHI人源化重鏈5條(PL-7CHI人源化重鏈可變區序列：VH1-0 (SEQ ID NO:48)、VH1-1(SEQ ID NO:49)、VH1-2(SEQ ID NO:50)、VH1-3(SEQ ID NO:51)或VH1-4(SEQ ID NO:52))、人源化輕鏈4條(PL-7CHI人源化輕鏈可變區序列：VL1-0 (SEQ ID NO:53)、VL1-1(SEQ ID NO:54)、VL1-2(SEQ ID NO:55)或VL1-3(SEQ ID NO:56))；PL-16CHI人源化重鏈5條(PL-16CHI人源化重鏈可變區序列：VH1-0 (SEQ ID NO:57)、VH1-1(SEQ ID NO:58)、VH1-2(SEQ ID NO:59)、VH1-3(SEQ ID NO:60)或VH1-4(SEQ ID NO:61))、人源化輕鏈3條(PL-16CHI人源化輕鏈可變區序列：VL1-0 (SEQ ID NO:62)、VL1-1(SEQ ID NO:63)或VL1-2(SEQ ID NO:64))。在此基礎上，藉由不同的輕重鏈組合，我們得到了多個人源化抗體。經活性檢測後，確定其中評分最高的抗PD-L1人源化抗體序列分別爲HuPL7-21、HuPL16-42。
實施例2  人源化抗PD-L1抗體生產
將以上設計好的人源化抗體輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列合成相對應的核苷酸編碼序列，並生成相鄰片段之間含有互補序列的寡核苷酸片段，藉由Overlap PCR將寡核苷酸片段退火後連接起來，再利用特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)擴增出完整的輕鏈與重鏈可變區核苷酸片段；將純化後的輕鏈可變區核苷酸片段與線性化的含有IgG4輕鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，將純化後的重鏈可變區核苷酸片段與含S228P/L235E突變的IgG4重鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，分別將轉化質粒的感受態細胞均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恒溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序。
將測序正確的陽性克隆進行質粒提取，從而獲得人源化抗體輕鏈與重鏈表達質粒，使用核酸定量分析儀檢測質粒的濃度與純度。
將質粒轉染HEK293 F細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。序列見表4。
表4 抗PD-L1人源化抗體序列
人源化抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列 H2CDR1、H2CDR2、H2CDR3 L2CDR1、L2CDR2、L2CDR3
HuPL7-21 SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:54 SEQ ID NOs:1、2和3 SEQ ID NOs: 13、14、15
HuPL16-42 SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:64 SEQ ID NOs:7、8和9 SEQ ID NOs: 19、20、21
實施例3  TIGIT抗體相關抗原蛋白及陽性對照抗體的製備
1、抗原蛋白及陽性對照抗體的表達載體構建
1)     抗原蛋白的表達載體構建
人源TIGIT蛋白胞外區胺基酸序列與hIgG1-Fc或mIgG1-Fc標簽胺基酸序列，胺基酸序列設計分別如SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66所示。對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標簽的TIGIT蛋白胞外區基因片段TIGIT-hFc、TIGIT-mFc，並將其分別克隆至真核表達質粒pHR中，獲得其表達質粒pHR-TIGIT-hFc、pHR-TIGIT- mFc。
融合人源TIGIT蛋白胞外區胺基酸序列與his胺基酸序列，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:67所示。對該胺基酸序列進行密碼子優化後合成完整的表達質粒pcDNA3.1-TIGIT-his。
2)     配體蛋白的表達載體構建
人源CD155蛋白胞外區胺基酸序列與hIgG1-Fc或mIgG1-Fc標簽胺基酸序列，胺基酸序列設計分別如SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69所示。對上述胺基酸序列進行密碼子優化後合成帶有標簽的CD155蛋白胞外區基因片段CD155-hFc、CD155-mFc，並將其分別克隆至真核表達質粒pHR中，獲得其表達質粒pHR- CD155-hFc、pHR-CD155- mFc。
融合人源CD155蛋白胞外區胺基酸序列與his胺基酸序列，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:70所示。對該胺基酸序列進行密碼子優化後合成完整的表達質粒pcDNA3.1(+)- CD155- his。
3)     陽性對照抗體的表達載體構建
使用專利申請US 2016/0176963A1中公開的人源化抗體22G2(本文簡稱22G2)作爲陽性對照抗體。參照US 2016/0176963A1中公開的方法製備22G2。22G2的胺基酸序列如下所示：
22G2重鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO:71；
22G2輕鏈可變區胺基酸序列：SEQ ID NO:72；
對22G2抗體所對應的胺基酸序列進行密碼子人工優化，將其重鏈基因片段克隆到含有IgG4輕鏈恆定區的真核表達質粒pHR上，獲得22G2的重鏈真核表達質粒pHR-22G2-hG4，其輕鏈表達質粒爲pHR-22G2-hk。
2、抗原蛋白及陽性對照抗體的表達與純化
1)     抗原蛋白的穩轉細胞株的構建
合成編碼TIGIT蛋白全長的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:73所示，然後克隆到真核表達質粒pTargeT上，獲得其表達質粒pTargeT-TIGIT。
將真核表達質粒pTargeT-TIGIT在160V電壓，15msec的方形脉衝下以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所)，置37℃，5% CO 2的培養箱中培養。24h後採用含500μg/ml G418的培養基加壓培養。16天后採用FACS檢測pool陽性率，將電轉質粒後的細胞鋪板(1x10 6個/ml的細胞密度，100ul/孔)，採用PE mouse anti-human TIGIT抗體(BD，556046)與細胞孵育，以流式細胞儀(BD，FACSJazz)讀取585nm波長下mean值，使用GraphPad生成進行數據分析。將陽性細胞株進行亞克隆，挑選出克隆化的CHO-K1細胞株，該細胞株高水平表達TIGIT分子，命名爲hTIGIT-CHO-K1。
2)     配體蛋白的穩轉細胞株的構建
合成編碼CD155蛋白全長的基因片段，胺基酸序列設計如SEQ ID NO:74所示，然後克隆到真核表達質粒pTargeT上，獲得其表達質粒pTargeT-CD155。
將真核表達質粒pTargeT- CD155在160V電壓，15msec的方形脉衝下以電轉的方式轉染到CHO-K1細胞(中國科學院上海細胞生物學研究所)，置37℃，5% CO 2的培養箱中培養。24h後採用含500μg/ml G418的培養基加壓培養。16天后採用FACS檢測pool陽性率，將電轉質粒後的細胞鋪板(1x10 6個/ml的細胞密度，100ul/孔)，採用PE mouse anti-human CD155抗體(BD，556046)與細胞孵育，以流式細胞儀(BD，FACSJazz)讀取585nm波長下mean值，使用GraphPad生成進行數據分析。將陽性細胞株進行亞克隆，挑選出克隆化的CHO-K1細胞株，該細胞株高水平表達CD155分子，命名爲hCD155-CHO-K1。
3)     標簽蛋白及陽性對照抗體的表達
在1L細胞培養瓶中接種密度爲0.5 x 10 6個細胞/ml的293F細胞，加入新鮮的預熱的FreeStyle 293表達培養基，使接種後總體積達到250mL，置37℃，8% CO 2，加濕的CO 2培養箱中培養過夜。取8.5 mL FreeStyle 293表達培養基，加入1mg/ml的PEI溶液500 ul，混合均勻，取250μg待轉染質粒加入8.5 ml FreeStyle 293表達培養基中，混合均勻，其中標簽抗原蛋白質粒pHR-TIGIT-hFc、pHR- TIGIT -his、pcDNA3.1(+)-TPA- TIGIT -mIgG1-Fc分別轉染；標簽配體蛋白質粒pHR-CD155-hFc、pHR- CD155-his、pcDNA3.1(+)-TPA- CD155 -mIgG1-Fc分別轉染；陽性對照抗體22G2重鏈質粒pHR-22G2-hG4和輕鏈質粒pHR-22G2-hk共同轉染。將PEI與FreeStyle 293表達培養基的混合溶液加入到質粒中，混合均勻，然後加入細胞培養物中，置37℃，8% CO 2，加濕的CO 2培養箱中培養。在細胞轉染後第1天和第3天對細胞進行補料，每瓶加入2.5ml的穀胺醯胺(母液濃度爲200mM)和5ml的葡萄糖(母液濃度爲180g/L)。當細胞細胞活力降至65%~75%時，收集細胞上清。將細胞培養物1500rpm離心5min，收集上清，再8000rpm離心20min，收集上清。
4)     親和層析柱純化
利用AKTA(GE，AKTA pure-150)根據蛋白性質採用不同的親和層析柱進行純化(不同蛋白適配的親和層析柱見表5)，具體純化步驟如下：
表5 不同蛋白適配的親和層析柱
蛋白屬性 適配柱子 品牌 型號
鼠單抗(雜交瘤)/TIGIT-mFc/CD155-mFc Protein G 預裝柱 博格隆 Ezfast Protein G/4FF
TIGIT-his/ CD155-His NI柱預裝柱 GE His Trap, HP/5ml
TIGIT-hFc/ CD155-hFc/嵌合抗體、人源化抗體 Protein A 預裝柱 GE Hi Trap, Mabselect SuRe/5ml
Protein A 自裝柱 GE Mabselect LX/18ml
清洗：超純水清洗設備及管路2min，流速10mL/min，後用0.1M NaOH清洗層析系統；
接柱：將層析柱接入層析設備，並用超純水沖洗5min；後0.1M NaOH沖洗30min，保留時間5min；
平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV(柱體積)；
上樣：將細胞表達上清上樣，保留時間5min；
後平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV；
洗脫：50mM醋酸，pH =3.4洗脫，保留時間5min。UV280至50 mAu左右時開始收集，降至50 mAu左右時停止收集。用1M Tris-HCl，pH 9.0將樣品pH調節至7.0；
再平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡3個CV，保留時間5min；
在線清洗：0.1M NaOH清洗30min，保留時間5min；
清洗保存：純化水清洗10min，後20%乙醇2個CV。
實施例4  抗TIGIT單克隆抗體的製備
1、雜交瘤單克隆的製備
(1)動物免疫
採用購買的不同標簽的TIGIT抗原蛋白(TIGIT-His(Sino Biological，10917-H08H)、TIGIT-hFc(R & D, 7898-TG)、TIGIT-mFc (Acro Biosystems ,Cat.No.TIT-H5253))與佐劑共同免疫的方法免疫C57、SJL品系的實驗小鼠，首次免疫使用50μg抗原，後期使用25μg抗原免疫；採用不同標簽的TIGIT抗原蛋白與佐劑共同免疫的方法免疫SD品系的實驗大鼠，首次抗原使用100μg抗原，後期使用50μg抗原免疫。
免疫佐劑可以是Quick Antibody-Mouse5W(北京博奧龍免疫技術有限公司，北京)或Titer Max(Sigma)與CpG(金斯瑞生物科技有限合成)/Alum(thermo)佐劑間隔。將不同標簽的TIGIT抗原蛋白樣品逐滴加入到佐劑溶液中，邊滴加邊渦旋以充分混合，佐劑使用劑量參考說明書進行。混合均勻形成油包水的乳狀後免疫小鼠及大鼠。
高水平表達TIGIT分析的細胞系如hTIGIT-CHO-K1也用來免疫大鼠，使之產生抗體。用胰蛋白酶消化處理正在培養的實施例1中獲得的hTIGIT-CHO-K1陽性單細胞，1000rpm離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞沉澱，取樣用細胞計數儀計數，剩餘樣品1000rpm離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞沉澱，計入適量的PBS以獲得1×10 8個細胞/ml的細胞懸液。實驗組小鼠每隻免疫1×10 7個細胞。
免疫方案如表6、表7所示：
表6 小鼠免疫方案
組別 抗原 佐劑 免疫途徑* 品系
1 PBS 無 i.p. C57/SJL
2 TIGIT-His 弗氏佐劑 i.p. / s.c. C57
3 TIGIT-His Titermax/cpg+Alum s.c./i.m. C57
4 TIGIT-His Titermax/cpg+Alum s.c./i.m. SJL
5 TIGIT-mFc Titermax/cpg+Alum s.c./i.m. SJL
6 TIGIT-hFc 弗氏佐劑 i.p./s.c. C57
表7 大鼠免疫方案
組別 抗原 佐劑 免疫途徑* 品系
1 PBS 無 i.p. SD
2 TIGIT-His Quick 5W i.m. SD
3 TIGIT-mFc Quick 5W i.m. SD
4 hTIGIT-CHO-K1 無 i.p. SD
* i.m. 肌內注射；s.c. 皮下注射；i.p. 腹腔注射。
(2)雜交瘤融合
脾細胞的獲取和製備：將加强免疫後的小/大鼠處死後浸泡75%的酒精中。解剖取出脾臟，用研磨棒研磨後，經細胞篩網過濾後製備成單細胞懸液。將脾細胞懸液2000rpm離心5min，棄上清。加入2mL紅細胞裂解液，室溫裂解紅細胞2 min，加入PBS至20mL，1500 rpm離心7min，棄上清，重懸後進行活細胞計數。收集培養瓶中的Sp2/0細胞，1000rpm離心5min後棄上清，重懸後進行活細胞計數。按脾細胞：Sp2/0細胞=1:1的比例混合細胞，1500rpm離心7min後棄上清。用20mL電轉緩衝液重懸細胞，1500rpm 離心7 min。棄上清，重複一次。分別用適量電轉緩衝液重懸細胞，保證細胞濃度2×107個細胞/mL左右。把細胞懸液加入9mL電轉融合槽中融合。融合後將細胞懸液轉入到含有20% FBS的15mL RPMI 1640完全培養基中，室溫放置20 min。用含1×HAT、1×BIOMYC-3、20％FBS的RPMI 1640培養基重懸融合細胞。按100μl/孔將細胞懸液加到若干塊96孔細胞培養板中，保證每孔細胞量約爲4×10 4個細胞/孔，置於37℃細胞培養箱中培養。5天后補加100µL/孔RPMI 1640完全培養基(含20% FBS，1×HAT，1×BIOMYC-3)。
(3)雜交瘤及亞克隆上清的篩選
初篩：融合一周後，取細胞上清，藉由ELISA篩選出能結合TIGIT-his蛋白或細胞表面TIGIT的雜交瘤上清，利用TIGIT-his篩選針對TIGIT而非hFc、mFc的抗體。然後利用ELISA分析雜交瘤上清阻斷TIGIT-CD155相互作用的能力。包被CD155-hFc於酶標板上，加入重組人源蛋白TIGIT-mFc與雜交瘤上清的混合物孵育2h，加入HRP標記的anti mouse IgG Fc特異性抗體(Jackson Immuno Research)孵育1h，利用酶標儀檢測450nm處的吸光值。
複測：將篩選獲得的具有結合能力及阻斷能力的雜交瘤母克隆擴大培養，進行ELISA結合活性的複測；藉由FACS篩選出能結合hTIGIT-CHO-K1細胞表面TIGIT的雜交瘤上清；再藉由ELISA篩選出能結合cyno-TIGIT-his蛋白的雜交瘤上清；藉由三次實驗陽性交叉的雜交瘤上清作爲候選陽性克隆。
利用有限稀釋法將陽性細胞株進行亞克隆，培養一周後利用ELISA檢測亞克隆上清與TIGIT分子的結合活性以及阻斷TIGIT-CD155相互作用的活性，獲得5種雙陽性細胞株，分別標記爲SHS006-17、SHS006-23。
2、單克隆抗體的製備
根據亞克隆上清活性分析結果確定單克隆抗體母克隆株SHS006-17、SHS006-23，將其擴大培養。培養條件是含有10%胎牛血清、1×NAEE、1×丙酮酸鈉、1%青鏈黴素雙抗的1640培養基，待細胞匯合度大於＞80%時，進將細胞傳代擴培，待培養至約50 ml時收集上清，純化抗體。獲得抗體經SDS-PAGE凝膠電泳確定純度良好。
3、單克隆抗體測序
將經亞克隆操作的陽性雜交瘤細胞進行擴大培養，取適量細胞按RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen，74134)試劑盒說明書提取總RNA，利用Prime Script 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara，6110A)反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。
根據大鼠抗體亞型可變區設計特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)，以cDNA爲模板進行抗體可變區基因的PCR擴增，從而分別獲得大鼠抗體輕鏈與重鏈可變區的基因片段；設計引物(參考文獻：1. Anke Krebber, Susanne Bornhauser, Jorg Burmester etal. Reliable cloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleen cell repertoires employing a reengineered phage display system. Journal of Immunological Methods, 1997, 201: 35–55;2. Simon KorenMiha KosmačAnja Colja Venturini etal. Antibody variable-region sequencing as a method for hybridoma cell-line authentication, 2008, 78: 1071–1078)，進行DNA測序獲得序列，測序結果見表8。
表8 抗TIGIT鼠源單克隆抗體序列
抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列 H1CDR1、H1CDR2、H1CDR3 L1CDR1、L1CDR2、L1CDR3
SHS006-17 SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:77 SEQ ID NOs: 25、26、27 SEQ ID NO:31、32、33
SHS006-23 SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:78 SEQ ID NO:28、29、30 SEQ ID NO:34、35、36
實施例5  抗TIGIT嵌合抗體的構建
將純化後(純化步驟參見實施例3)的鼠抗輕鏈與重鏈可變區基因片段分別與線性化的含有人抗體輕鏈或重鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，將混合液均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恒溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序；將測序正確的嵌合抗體分別標記爲SHS006-17CHI、SHS006-23CHI。
將測序正確的陽性克隆接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37℃振蕩培養12小時以上，然後收集菌體進行質粒提取，從而獲得嵌合抗體輕鏈與重鏈表達質粒，使用核酸定量分析儀檢測質粒的濃度與純度。
將嵌合抗體轉染HEK293E細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
嵌合抗體測序結果見表9。
表9 抗TIGIT嵌合抗體序列
嵌合抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
SHS006-17 CHI SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:77
SHS006-23 CHI SEQ ID NO:76 SEQ ID NO:78
實施例6  抗TIGIT人源化抗體的構建及生產
根據嵌合抗體的活性分析、親和力KD值等結果選擇SHS006-17CHI、SHS006-23CHI進行人源化抗體改造。
抗體的人源化改造，首先是藉由與免疫基因數據庫(IMGT)中的小鼠抗體序列進行比對，確認SHS006-17CHI、SHS006-23CHI抗體可變區的鼠源種系，經過同源比對，SHS006-17CHI、SHS006-23CHI抗體的重鏈可變區序列的FR區分別與小鼠抗體種系基因IGHV2-26*01以及IGHV3-7*01最爲相似；抗體輕鏈可變區的FR序列則分別與小鼠抗體IGKV2-28*01以及IGKV1-39*01最爲相似。以SHS006-17CHI/SHS006-23CHI抗體框架區序列FR1-FR3作爲模板，在人框架區庫中尋找3D結構相似但是免疫原性較低的全人框架替代SHS006-17CHI/SHS006-23CHI的FR1-FR3序列，重鏈/輕鏈全長序列進行3D建模並和原抗體重鏈/輕鏈序列進行結構比對分析，綜合考慮抗原性和3D結構相似度，並將在結構模擬中顯示對抗體結構穩定起到關鍵作用的的胺基酸位點回突變爲鼠源性胺基酸殘基。最終選擇SHS006-17CHI的5條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:79、80、81、82、83)和4條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO: 84、85、86、87)及SHS006-23CHI的5條人源化重鏈可變區(參見SEQ ID NO:88、89、90、91、92)和5條人源化輕鏈可變區(參見SEQ ID NO:93、94、95、96、97)進行下一步優化。SHS006-17CHI/SHS006-23CHI人源化抗體非CDR區序列均達到95%以上人源化。
將以上設計好的人源化抗體輕鏈與重鏈可變區胺基酸序列反轉錄成相對應的核苷酸序列，並生成相鄰片段之間含有互補序列的寡核苷酸片段，藉由Overlap PCR將寡核苷酸片段退火後連接起來，再利用特異性引物(5’端含有用於與真核表達載體發生同源重組的同源臂序列)擴增出完整的輕鏈與重鏈可變區核苷酸片段；將純化後的輕鏈可變區核苷酸片段與線性化的含有IgG4輕鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，將純化後的重鏈可變區核苷酸片段與含S228P/L235E突變的IgG4重鏈恆定區的真核表達質粒共轉化大腸杆菌DH5α感受態細胞，分別將轉化質粒的感受態細胞均勻塗布於含有相應抗生素的瓊脂平板表面，於37℃恒溫培養箱過夜培養後分別挑取若干單菌落進行DNA測序。
將測序正確的陽性克隆接種於含有相應抗生素的2×YT液體培養基中，於37℃振蕩培養12小時以上，然後收集菌體進行質粒提取，從而獲得人源化抗體輕鏈與重鏈表達質粒，使用核酸定量分析儀檢測質粒的濃度與純度。
將質粒轉染HEK293E細胞，表達純化獲得大量抗體，進行純度檢測、活性分析及親和力的檢測。
挑選純度、活性和親和力均較好的人源化抗體，標記爲SHS006-T-Hu17-31、SHS006-T-Hu23-53，序列見表10。
表10 抗TIGIT人源化抗體序列
人源化抗體 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列 H1CDR1、H1CDR2、H1CDR3 L1CDR1、L1CDR2、L1CDR3
HS006-T-Hu17-31 SEQ ID NO: 98 SEQ ID NO: 100 SEQ ID NOs: 25、26、27 SEQ ID NO:31、32、33
SHS006-T-Hu23-53 SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 101 SEQ ID NO:28、29、30 SEQ ID NO:34、35、36
實施例7  抗TIGIT抗體細胞功能測定
採用螢光素酶報告基因系統(購於BPS Bioscience公司，美國)對本發明的抗TIGIT抗體進行細胞功能測定，使用抗體22G2作爲對照。
實驗步驟如下：
①靶細胞準備：將CD155/TCR Activator-CHO細胞以2.5x 10 4cells/ml的密度鋪板(檢測孔及NTC)，100ul/孔，細胞培養板放入於37℃、5%CO 2培養箱中培養過夜；
②效應細胞準備：取TIGIT/NFAT-reporter-Jurkat細胞，用分析培養基洗一遍，調整密度至4 x 10 5cells/ml；
③抗體與效應細胞孵育：將按梯度稀釋好的本發明抗TIGIT抗體與效應細胞(V:V=1:1，各60μl)於37℃孵育30min；
④與靶細胞孵育：去除靶細胞培養板中的培養基，加入TIGIT/NFAT-reporter-Jurkat細胞和抗體複合物，100μl/孔，BG孔加入100ul分析培養基，將細胞培養板放入培養箱孵育5-6個小時；
⑤檢測：水浴融化試劑A及試劑B，在避光的條件下，用試劑A將試劑B稀釋，體積比100:1，混勻，在每孔中加入100ul一步法螢光素酶試劑，室溫輕微晃動15-30min，使用螢光酶標儀檢測。
根據每個樣品的吸光度與抗體濃度關係繪圖，以展示抗體在不同濃度下誘導螢光素酶的表達相對空白對照組的倍數，並對數據計算其Top值及EC50值。Top值及EC50值的結果如表11所示。
表11 抗TIGIT抗體誘導的螢光素酶表達
               抗體名稱 參數 22G2 SHS006-23
Top(倍數) 1.589 1.621
EC50(nM) 0.104 0.019
實驗結果顯示本發明的抗TIGIT抗體誘導螢光素酶表達的EC50值顯著低於對照抗體22G2。這表明本發明的抗TIGIT抗體能夠更有效地藉由阻斷TIGIT-CD155的結合來活化T細胞，在活化T細胞進而殺傷腫瘤方面表現出顯著優於22G2的功能。
實施例8  抗TIGIT抗體與人TIGIT結合活性測定(ELISA)
採用ELISA分析抗體的結合活性。將人TIGIT-His蛋白(1 μg/孔，Sino Biological，10917-H08H)包被到96孔酶標板，37℃孵育2h。用1×PBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4℃封閉過夜。用1×PBST清洗3次後，本發明提供的抗TIGIT抗體作爲一抗從2μg/mL開始，5倍梯度稀釋加入酶標板，共8個濃度，濃度分別爲2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL、0ng/mL，37℃孵育1.5h；用1×PBST清洗5次後，二抗使用Anti-Human IgG HRP (Jackson，109-035-003，1:10000)，37℃孵育40min。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成EC50，結果如表12所示。
表12 抗TIGIT抗體與人TIGIT結合活性
              抗體名稱   參數 SHS006-23CHI SHS006-HuT23-53 SHS006-17CHI SHS006-T-Hu17-31
EC50 (nM) 1.686 2.428 1.578 1.589
實驗結果顯示本發明的抗TIGIT抗體SHS006-17CHI、SHS006-T-Hu17-31、SHS006-23CHI、SHS006-T-Hu23-53均具有較好的與人TIGIT結合能力。
實施例9  抗TIGIT抗體與細胞表面TIGIT結合活性測定(FACS)
採用FACS分析抗體的結合活性。hTIGIT-CHO-K1細胞以每孔1x105個細胞的方式鋪細胞板，置於37℃，5% CO 2的條件下過夜培養；第二天用Cell stanining buffer洗滌2遍；本發明提供的抗TIGIT抗體作爲一抗從2μg/mL開始，梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別爲2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、4ng/mL、0.8ng/mL、0.16ng/mL，陽性對照抗體爲22G2，37℃孵育1h；Cell stanining buffer洗滌2遍；二抗使用PE anti-human IgG Fc (Biolegend，409304，1.2ul/孔)，4℃避光孵育30min；Cell stanining buffer洗滌2遍後利用流式細胞儀(ACEABIO，Novocyte)測定585nm波長下mean值。使用GraphPad生成EC50，結果如表13所示。
表13抗TIGIT抗體與細胞表面TIGIT結合活性
        抗體名稱   參數 22G2 SHS006-23CHI SHS006-T-Hu23-53 SHS006-17CHI SHS006-T-Hu17-31
EC50 (nM) 0.4114 0.2349 0.1989 0.4076 0.3033
實驗結果顯示，本發明的人源化抗TIGIT抗體SHS006-T-Hu23-53、SHS006-T-Hu17-31均可與細胞表面TIGIT結合，且結合能力優於抗體22G2。
實施例10  抗TIGIT抗體與人TIGIT蛋白的親和力測定
利用Fortebio Octet對實施例1、2中制得的人源化抗TIGIT抗體結合抗原TIGIT-his的親和力進行測定。將所述人源化抗TIGIT抗體用SD緩衝液(PBST+0.02%Tween20+0.1%BSA)稀釋到濃度5μg/ml，抗原TIGIT-His用SD緩衝液4倍濃度梯度稀釋，使其濃度爲1μg/ml、0.25μg/ml、0.0625μg/ml、0μg/ml，選用SA傳感器固化該抗原，按Fortebio Octet RED96的操作規程進行親和力測定，具體參數及實驗結果如表14所示。
表14 與人TIGIT蛋白的親和力測定
抗體 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
SHS006-T-Hu17-31 3.27E-10 7.31E+05 2.39E-04
SHS006-T-Hu23-53 1.14E-09 1.33E+06 1.51E-03
實驗結果顯示，本發明的人源化抗TIGIT抗體SHS006-T-Hu17-31、SHS006-T-Hu23-53與人TIGIT蛋白具有較高的親和力。
實施例11  ELISA檢測阻斷TIGIT與CD155的結合活性
採用ELISA分析抗體的阻斷活性。將人CD155-hFc蛋白(1 μg/孔)包被到96孔酶標板，37℃孵育2h。用1×PBST清洗3次後用5%的脫脂牛奶4℃封閉過夜。用1×PBST清洗3次後，本發明提供的抗TIGIT抗體與TIGIT-mFc混合作爲一抗，其中抗TIGIT抗體從5μg/mL開始，梯度稀釋加入酶標板，共8個濃度，濃度分別爲5000ng/mL、1667ng/mL、556ng/mL、278ng/mL、139ng/mL、46ng/mL、15ng/mL、0ng/mL，陽性對照抗體爲22G2，TIGIT-mFc濃度恆定爲1μg/ml，37℃孵育2h；用1×PBST清洗5次後，二抗使用Goat anti mouse IgG-HRP antibody (abcam，Ab6789，1:10000)，37℃孵育40min。用1xPBST清洗5次後，加入顯色液TMB，終止後利用酶標儀(thermo，Multiskan FC)讀取OD450值。使用GraphPad生成IC50，結果如表15所示。
表15 抗TIGIT抗體阻斷TIGIT與CD155的結合活性
          抗體名稱 參數 22G2 SHS006-23CHI SHS006-T-Hu23-53 SHS006-17CHI SHS006-T-Hu17-31
IC50(nM) 1.336 1.042 1.015 1.031 0.9537
實驗結果顯示本發明的人源化抗TIGIT抗體SHS006-T-Hu23-53、SHS006-T-Hu17-31均具有阻斷人TIGIT與CD155結合的能力，且阻斷能力優於抗體22G2。
實施例12  FACS檢測阻斷TIGIT與CD155的結合活性
採用FACS檢測本發明提供的抗TIGIT抗體阻斷TIGIT結合到細胞表面CD155的能力。hCD155-CHO-K1陽性細胞株作爲CD155提供者，在梯度稀釋的抗TIGIT抗體存在的情况下，觀察TIGIT-mFc與CD155-CHO-K1的結合能力。二抗使用PE Goat anti mouse IgG (Biolegend，405307，1.2ul/孔)來監測TIGIT-mFc的變化。22G2作爲阻斷TIGIT結合到細胞表面CD155的陽性對照。流式細胞儀(ACEABIO，Novocyte)讀取585nm波長下mean值，使用GraphPad生成IC50，結果如表16所示。
表16 抗TIGIT抗體阻斷TIGIT與CD155的結合活性
             抗體名稱 參數 22G2 SHS006-23CHI SHS006-T-Hu23-53 SHS006-17CHI SHS006-T-Hu17-31
IC50 1.667 1.493 1.396 1.041 0.9820
實驗結果顯示本發明的人源化抗TIGIT抗體SHS006-T-Hu17-31、SHS006-T-Hu23-53均具有阻斷人TIGIT與CD155結合的能力，且阻斷能力優於抗體22G2。
實施例13  抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體表達載體的構建及蛋白表達純化
1.     抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體的表達載體構建
本發明所用抗PD-L1抗體是藉由用人PD-L1-his蛋白免疫小鼠後篩選得到的小鼠單克隆抗體PL-7(重鏈可變區序列爲SEQ ID NO:37，輕鏈可變區序列爲SEQ ID NO:41)、PL-16(重鏈可變區序列爲SEQ ID NO:39，輕鏈可變區序列爲SEQ ID NO:43)，將其人源化後篩選獲得人源化單克隆抗體HuPL7-21(重鏈可變區序列SEQ ID NO:50，輕鏈可變區序列SEQ ID NO:54)、HuPL7-43(重鏈可變區序列SEQ ID NO:52，輕鏈可變區序列SEQ ID NO:56)、HuPL16-42(重鏈可變區序列SEQ ID NO:61，輕鏈可變區序列SEQ ID NO:64)。
本發明所用抗TIGIT抗體是藉由用人TIGIT-his蛋白免疫小鼠後篩選得到的小鼠單克隆抗體T-23(重鏈可變區序列爲SEQ ID NO:76，輕鏈可變區序列爲SEQ ID NO:78)，將其人源化後篩選獲得人源化單克隆抗體HuT23-53(重鏈可變區序列爲SEQ ID NO:99，輕鏈可變區序列爲SEQ ID NO:101)。
本發明利用上述抗PD-L1和抗TIGIT的人源化抗體的可變區序列，構建了涉及兩種結構的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體。這兩種結構分別是以ScFab爲元件構成的非對稱結構(如本實施例中雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFab)及以ScFv爲元件構成的對稱結構(如本實施例中雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFv)。其中ScFab結構的雙特異性抗體如圖1所示，具體爲該雙特異性抗體是由兩條分別抗PD-L1和抗TIGIT的抗體單鏈藉由異源二聚化而形成；區別於天然IgG抗體，該雙特異性抗體中抗PD-L1或抗TIGIT抗體的輕鏈都藉由額外添加的柔性連接肽連接至抗體重鏈N端，該連接肽包含甘胺酸(G)和絲胺酸(S)殘基，包含GGGGS重複序列，較佳包含8個GGGGS的重複序列；此外，爲促進異源二聚體的形成，在上述S228P或S228P/L235E突變的基礎上，在抗TIGIT抗體單鏈的CH3 domain 再增加S354C/T366W突變，在抗PD-L1抗體單鏈的CH3 domain 再增加Y349C/T366S/L368A/Y407V突變。ScFv結構的雙特異性抗體如圖2所示，具體爲將TIGIT抗體的ScFv重鏈藉由一段柔性連接肽連接至完整的抗PD-L1抗體重鏈C端，該連接肽包含甘胺酸(G)和絲胺酸(S)殘基，包含GGGGS重複序列，較佳包含8個GGGGS的重複序列。此外，在上述的兩種結構雙特異性抗體中，均可在重鏈可變區VH44位和輕鏈可變區VL100位同時引入半胱胺酸突變，使得其形成VH44-VL100的二硫鍵，以增加抗體結構的穩定性。
本發明的非對稱結構雙特異性抗體序列示意圖:
肽鏈1：
Figure 02_image009
肽鏈2：
Figure 02_image011
本發明的對稱結構雙特異性抗體序列示意圖:
肽鏈1：
Figure 02_image013
肽鏈2：
Figure 02_image007
其中IgG4CH/Ks表示IgG4恆定區(S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V突變)，IgG4CH/Hs表示IgG4恆定區(S228P、S354C、T366W突變)，IgG4CH/PE表示IgG4恆定區(S228P、L235E突變)。
根據上述非對稱結構形式，利用抗PD-L1抗體HuPL7-21和抗TIGIT抗體HuT23-53的可變區序列，構建雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFab的表達載體ScFab-T2353-Knob-PHR(序列爲SEQ ID NO:102所示)和HuPL721-scfab-hole-PHR(序列爲SEQ ID NO:103所示)；
根據上述對稱結構形式，利用抗PD-L1抗體HuPL7-21和抗TIGIT抗體HuT23-53的可變區序列，構建雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFv的表達載體PL721-T2353-scFv-HC-PHR(序列爲SEQ ID NO:104所示)和HuPL721-VL1-PHR(序列爲SEQ ID NO:105所示)；
根據上述非對稱結構形式，利用抗PD-L1抗體HuPL7-43和抗TIGIT抗體HuT23-53的可變區序列，構建雙特異性抗體HuPL743-T2353-ScFab的表達載體ScFab-T2353-Knob-PHR(序列爲SEQ ID NO:102所示)和HuPL743-scfab-hole-PHR(序列爲SEQ ID NO:106所示)；
根據上述對稱結構形式，利用抗PD-L1抗體HuPL7-43和抗TIGIT抗體HuT23-53的可變區序列，構建雙特異性抗體HuPL743-T2353-ScFv的表達載體PL743-T2353-scFv-HC-PHR(序列爲SEQ ID NO:107所示)和HuPL743-VL3-PHR(序列爲SEQ ID NO:108所示)；
根據上述非對稱結構形式，利用抗PD-L1抗體HuPL16-42和抗TIGIT抗體HuT23-53的可變區序列，構建雙特異性抗體HuPL1642-T2353-ScFab的表達載體ScFab-T2353-Knob-PHR(序列爲SEQ ID NO:102所示)和HuPL1642-scfab-hole-PHR(序列爲SEQ ID NO:109所示)；
根據上述對稱結構形式，利用抗PD-L1抗體HuPL16-42和抗TIGIT抗體HuT23-53的可變區序列，構建雙特異性抗體HuPL1642-T2353-ScFv的表達載體PL1642-T2353-scFv-HC-PHR(序列爲SEQ ID NO:110所示)和HuPL1642-VL2-PHR(序列爲SEQ ID NO:111所示)；
2.     抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體的表達和純化
1)     抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體的表達
在1L細胞培養瓶中接種密度爲1.0×10 6個/ml的HEK293E細胞，加入新鮮的預熱的FreeStyle 293表達培養基，使接種後總體積達到250mL，置37℃，8% CO 2，加濕的CO 2培養箱中培養過夜。取8 mL FreeStyle 293表達培養基，加入1mg/ml的PEI溶液500 ul，混合均勻，取250μg待轉染的表達載體加入8.0 ml FreeStyle 293表達培養基中，混合均勻，其中雙特異性抗體按照兩載體比爲1:1共同轉染。將PEI與FreeStyle 293表達培養基的混合溶液加入到質粒中，混合均勻，然後加入細胞培養物中，置37℃，8% CO 2，加濕的CO 2培養箱中培養。在細胞轉染後第1天和第3天對細胞進行補料，每瓶加入2.5ml的穀胺醯胺(母液濃度爲200mM)、每250mL 加入12.5mL 的OPM-CHO PFF05和5ml的葡萄糖(母液濃度爲180g/L)。當細胞細胞活力降至65%~75%時，收集細胞上清。將細胞培養物1500rpm離心5min，收集上清，再8000rpm離心20min，收集上清。
2)     親和層析柱純化
利用AKTA(GE，AKTA pure-150)根據蛋白性質採用不同的親和層析柱進行純化(抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體適配的親和層析柱見表17)，具體純化步驟如下：
表17 抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體適配的親和層析柱
蛋白屬性 適配柱子 品牌 型號
抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體 Protein A 預裝柱 GE Hi Trap, Mabselect SuRe  5ml
清洗：超純水清洗設備及管路2min，流速10mL/min，後用0.1M NaOH清洗層析系統；
接柱：將層析柱接入層析設備，並用超純水沖洗5min；後0.1M NaOH沖洗30min，保留時間5min；
平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV(柱體積)；
上樣：將細胞表達上清上樣，保留時間5min；
後平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡5個CV；
洗脫：50mM醋酸，pH =3.4洗脫，保留時間5min。UV280至50 mAu左右時開始收集，降至50 mAu左右時停止收集。用1M Tris-HCl，pH 9.0將樣品pH調節至7.0；
再平衡：20mM PB+ 0.15M NaCl，pH 7.2 平衡3個CV，保留時間5min；
在線清洗：0.1M NaOH清洗30min，保留時間5min；
清洗保存：純化水清洗10min，然後加入20%乙醇2個CV。
純化獲得的抗體HuPL721-T2353-ScFab/ ScFv、HuPL743-T2353-ScFab/ ScFv、HuPL1642-T2353-ScFab/ ScFv經SDS-PAGE和SEC-HPLC鑒定純度。如若純度低於95%，則進行進一步精純，從而獲得SEC純度＞95%的雙特異性抗體分子用於後續實驗。
實施例14  抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體與人PD-L1蛋白結合活性的測定
採用FACS法分析抗體的結合活性。hPD-L1-CHO-K1細胞以每孔1.5×105個細胞的方式鋪細胞板；本發明提供的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體作爲一抗從10μg/mL開始，梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別爲10000ng/mL、2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL、0.64ng/mL、0.128ng/mL，4℃孵育1.5h；稀釋液(PBS+2%FBS)洗滌2遍；二抗使用PE anti-human IgG Fc (Abcam，ab98596，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀釋液洗滌2遍後利用流式細胞儀(ACEABIO，Novocyte)測定585nm波長下mean值。數據處理時將質量濃度換算爲莫耳濃度後使用GraphPad生成EC50，結果如表18所示。
表18 抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體與人PD-L1蛋白結合活性
                  抗體名稱 參數     HuPL1642-T2353-ScFv HuPL721-T2353-ScFv HuPL743-T2353-ScFv HuPL721-T2353-ScFab
EC50(nM) 0.9553 0.7147 0.8204 1.766
實驗結果顯示本發明提供的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFab、HuPL1642-T2353-ScFv、HuPL721-T2353-ScFv和HuPL743-T2353-ScFv均具有較好的與PD-L1結合能力。
實施例15  抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體與人TIGIT結合活性的測定
採用FACS法分析抗體的結合活性。hTIGIT-CHO-K1細胞以每孔1.5×105個細胞的方式鋪細胞板；本發明提供的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體作爲一抗從2μg/mL開始，梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別爲2000ng/mL、400ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、4ng/mL、0.8ng/mL、0.16ng/mL，4℃孵育1.5h；稀釋液(PBS+2%FBS)洗滌2遍；二抗使用PE anti-human IgG Fc (Abcam，ab98596，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀釋液洗滌2遍後利用流式細胞儀(ACEABIO，Novocyte)測定585nm波長下mean值。數據處理時將質量濃度換算爲莫耳濃度後使用GraphPad生成EC50，結果如表19所示。
表19 抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體與人TIGIT結合活性
                        抗體名稱 參數 HuPL721-T2353-ScFab HuPL721-T2353-ScFv
EC50 (nM) 1.303 0.6118
實驗結果顯示本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFab、HuPL721-T2353-ScFv均具有較好的與PD-L1結合的能力。
實施例16  抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體阻斷PD-L1與PD-1結合的活性檢測
採用FACS法分析抗體的結合活性。hPD-L1-CHO-K1細胞以每孔2.5×105個細胞的方式鋪細胞板；本發明提供的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體梯度稀釋後與終濃度爲2μg/ml的PD-1-mFc混合均勻後作爲一抗，其中抗體的梯度稀釋方法爲：從20μg/mL開始，3倍梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別爲20000ng/mL、6666.66ng/mL、2222.22ng/mL、740.74ng/mL、246.9ng/mL、82.3ng/mL、27.4ng/mL、9.14ng/mL，4℃孵育1.5h；稀釋液(PBS+2%FBS)洗滌2遍；二抗使用PE anti-Mouse IgG Fc(Biolegend，405307，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀釋液洗滌2遍後利用流式細胞儀(ACEABIO，Novocyte)測定585nm波長下mean值。數據處理時將質量濃度換算爲莫耳濃度後使用GraphPad生成IC50，結果如表20所示。
表20 抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體阻斷PD-L1與PD-1結合的活性
                     抗體名稱 參數 HuPL721-T2353-ScFab HuPL721-T2353-ScFv
IC50 (nM) 3.191 3.338
實驗結果顯示本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFab、HuPL721-T2353-ScFv均具有阻斷PD-L1與PD-1結合的能力。
實施例17  抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體阻斷TIGIT與CD155結合的活性檢測
採用FACS法分析抗體的阻斷活性。hTIGIT-CHO-K1細胞以每孔2.5×105個細胞的方式鋪細胞板；本發明提供的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體梯度稀釋後與終濃度爲0.4μg/ml的TIGIT-mFc混合均勻後作爲一抗，其中抗體的梯度稀釋方法爲：從20μg/mL開始，梯度稀釋加入細胞板，共8個濃度，濃度分別爲20000ng/mL、4000ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、33.33ng/mL、11.11ng/mL，4℃孵育1.5h；稀釋液(PBS+2%FBS)洗滌2遍；二抗使用PE anti-Mouse IgG Fc(Biolegend，405307，0.8ul/孔)，4℃避光孵育60min；稀釋液洗滌2遍後利用流式細胞儀(ACEABIO，Novocyte)測定585nm波長下mean值。數據處理時將質量濃度換算爲莫耳濃度後使用GraphPad生成IC50，結果如表21所示。
表21 抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體阻斷TIGIT與CD155結合的活性
                抗體名稱 參數 HuPL1642-T2353-ScFab HuPL1642-T2353-ScFv HuPL721-T2353-ScFv HuPL721-T2353-ScFab
IC50 (nM) 1.506 1.678 2.134 4.082
實驗結果顯示本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFab、HuPL721-T2353-ScFv、HuPL1642-T2353-ScFab和HuPL1642-T2353-ScFv均具有較好的阻斷TIGTI與CD155結合的能力。
實施例18  抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體的親和力檢測
利用Fortebio Octet對實施例15中制得的人源化抗TIGIT/抗PD-L1抗體結合抗原PD-L1-his和TIGIT-his的親和力分別進行測定。先將抗體HuPL721-T2353-ScFab/ScFv、HuPL743-T2353-ScFab/ScFv、HuPL1642-T2353-ScFab/ScFv稀釋到67nM，選用AHC傳感器固化上述抗體，將PD-L1-his用SD緩衝液(0.02%Tween20+0.1%BSA溶液)梯度稀釋到2μg/ml、0.4μg/ml、0.08μg/ml，TIGIT-his用SD緩衝液梯度稀釋到0.5μg/ml、0.1μg/ml、0.02μg/ml，按Fortebio Octet RED96的操作規程進行親和力測定，具體參數及實驗結果如表22、表23所示。
表22 抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體與人PD-L1蛋白的親和力測定
抗體 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
HuPL7-21 1.49E-09 1.85E+05 2.76E-04
HuPL16-42 1.90E-09 1.19E+05 2.25E-04
HuPL1642-T2353-ScFab 1.15E-09 1.84E+05 2.12E-04
HuPL1642-T2353-ScFv 2.08E-09 1.57E+05 3.26E-04
HuPL721-T2353-ScFab 1.32E-09 2.07E+05 2.73E-04
HuPL721-T2353-ScFv 2.67E-09 1.77E+05 4.72E-04
表23 抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體與人TIGIT蛋白的親和力測定
抗體 KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s)
T-Hu23-53 2.43E-09 7.92E+05 1.92E-03
HuPL1642-T2353-ScFab 1.39E-08 3.50E+05 4.87E-03
HuPL1642-T2353-ScFv 2.74E-09 8.72E+05 2.39E-03
HuPL721-T2353-ScFab 3.06E-09 1.09E+06 3.33E-03
HuPL721-T2353-ScFv 2.49E-09 9.96E+05 2.48E-03
實驗結果顯示，本發明的抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體HuPL1642-T2353-ScFab、HuPL1642-T2353-ScFv、HuPL721-T2353-ScFab和HuPL721-T2353-ScFv具有較好的與人PD-L1蛋白的親和力以及與人TIGIT蛋白的親和力。
實施例19  抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體的體外藥效檢測
採用SEB(金黃色葡萄球菌腸毒素B)兩次刺激PBMC(外周血單核細胞)的方法來檢測本發明的雙特異性抗體的體外藥效。
按所需細胞量復蘇PBMC，加到8-9 ml的IMDM完全培養基中，1200 rpm離心10 min，棄上清；用適量培養基重懸，用血球計數板計數，加入到6孔板中，同時加入終濃度爲100 ng/ml的SEB溶液，孵育48h；48h後，1200 rpm離心10 min，棄上清，使用IMDM完全培養基洗滌1-2次，用適量培養基重懸，用血球計數板計數，並重懸爲1 M/mL，100 μL/孔加入96孔板中；按4倍濃度(即80 μg/mL)，50 μL/孔，用IMDM完全培養基配製對照IgG4 (Isotype)，做好標記，渦旋；將抗體溶液加入對應孔中，對照組加入50μL/孔的培養基，96孔板置於37℃孵箱中，細胞和抗體孵育1h；1h後，按4倍濃度(400 ng/ml)，50 μL/孔用量，用IMDM完全培養基配製SEB溶液，加入對應孔中；96孔板置於37℃，5%CO 2孵箱中孵育48h後，離心去除上清收集無細胞上清150 μL，按一定比例稀釋後，按照hIFN-γ(R&D system  Cat：DY285B)ELISA檢測試劑盒說明書檢測上清中IFN-γ的濃度。結果如表24所示。
表24 本發明抗體對IFN-γ釋放的影響
組別 IFN-γ(pg/ml)
無SEB 211.09
SEB (100 ng/mL) 526.09
IgG4 (Isotype) (20μg/mL) 644.73
HuPL16-42 (20μg/mL) 1662.55
HuPL7-21 (20μg/mL) 999.00
HuT23-53 (20μg/mL) 742.09
HuPL16-42 (20μg/mL) + HuT23-53 (20μg/mL) 1992.27
HuPL7-21 (20μg/mL) + HuT23-53 (20μg/mL) 1264.91
HuPL1642-T2353-scFab (20μg/mL) 1765.64
HuPL721-T2353-scFab (20μg/mL) 2146.91
HuPL721-T2353-scFab (40μg/mL) 2862.82
HuPL721-T2353-scFv (13.4μg/mL) 1542.27
HuPL721-T2353-scFv (26.8μg/mL) 2842.36
實驗結果顯示，本發明的抗體具有較好的促IFN-γ釋放能力。抗體HuPL16-42和HuPL7-21與抗體HuT23-53聯用效果優於抗體單用。雙特異性抗體HuPL721-2353促IFN-γ釋放具有劑量依賴性。HuPL721-T2353-ScFv在一半莫耳數的情况下依然優於聯用組[對於單抗聯用組20 μg/ml+20 μg/ml、scFab雙抗組40μg/ml和scFv雙抗組26.8μg/ml，這三組濃度是針對TIGIT和PD-L1兩種抗原結合臂的數量均相等的濃度(稱“等臂”濃度)；相對於單抗聯用組20 μg/ml+20 μg/ml，scFab雙抗組20μg/ml和scFv雙抗組13.4μg/ml的濃度相當於是結合臂數量减半的濃度；從莫耳數的角度來說，單抗聯用組20 μg/ml+20 μg/ml中兩種分子的總莫耳數與scFab雙抗組40μg/ml的莫耳數相等，scFv雙抗組26.8ul/ml莫耳數僅爲聯用組20 μg/ml+20 μg/ml和scFab雙抗組40μg/ml的一半]。
實施例20  抗PD-L1/抗TIGIT雙特異性抗體對小鼠體內移植瘤生長抑制的檢測(Raji-PBMC-NSG模型)
本發明利用NSG小鼠(購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司，中國)、Raji-PD-L1腫瘤細胞(購自宜明昂科生物醫藥技術有限公司，中國)建立腫瘤移植模型——Raji-PBMC-NSG模型，研究本發明的抗體在Raji-hPD-L1淋巴瘤皮下移植模型中的抗腫瘤作用。抗PD-L1陽性對照抗體爲Atezolizumab(Sino Biological，Cat:68049-H001)。表25爲測試藥物在Raji-PBMC-NSG腫瘤模型中的抗腫瘤作用實驗設計方案。
表25 Raji-PBMC-NSG模型測試藥物實驗設計方案
組別 N* 抗體 小鼠品系 劑量(mg/kg) 給藥途徑 給藥頻次
1 6 PBS NSG+PBMC / i.p. BIW×3
2 6 Atezolizumab NSG+PBMC 10 i.p. BIW×3
3 6  HuPL7-21 NSG+PBMC 10 i.p. BIW×3
4 6 HuPL721-T2353-ScFab NSG+PBMC 20 i.p. BIW×3
5 6 HuPL721-T2353-ScFab NSG+PBMC 40 i.p. BIW×3
*：N是指每組小鼠的數量；i.p.：腹腔注射；BIW指每周給藥2次。
各組的腫瘤抑制率(TGITV)%如表26所示。
表26各抗體對Raji-PBMC-NSG模型小鼠腫瘤體積的影響
組別 劑量(mg/kg) TGI TV(%)
PBS - 0.00
Atezolizumab 10 37.40
HuPL7-21 10 48.75
HuPL721-T2353-ScFab 20 53.83
HuPL721-T2353-ScFab 40 57.14
本發明的抗體HuPL7-21、HuPL721-T2353-ScFab體內抑瘤效果顯著優於Atezolizumab。
實施例21  抗PD-L1/抗TIGIT雙特異性抗體對小鼠體內移植瘤生長抑制的檢測(MC38-hPD-L1結腸癌模型)
採用B-hPD-L1/hTIGIT雙人源化小鼠(購於北京百奧賽圖基因生物技術有限公司，中國)MC38-hPD-L1結腸癌(細胞購於舜冉上海生物科技有限公司，中國)的動物模型進行藥效實驗。將PBS重懸的MC38-hPD-L1結腸癌細胞以5×10 5個/0.1 mL濃度，0.1 mL/隻體積接種於B-hPD-L1/hTIGIT人源化小鼠的右側皮下。當平均腫瘤體積達到98 mm3時，根據小鼠腫瘤體積和體重選擇合適的小鼠入組，平均分配到6個實驗組中，每組8隻，分組當天開始給藥，具體給藥方案見表27。
表27 B-hPD-L1/hTIGIT雙人源化小鼠MC38-hPD-L1結腸癌動物模型實驗給藥方案
組別 受試品 劑量 (mg/kg) a 給藥途徑 給藥頻率 b 給藥次數
G1 PBS - i.p. BIW 6
G2 Atezolizumab 3 i.p. BIW 6
G3 HuPL721-T2353-ScFab 3.14 i.p. BIW 6
G4 HuPL721-T2353-ScFab 6.27 i.p. BIW 6
注：PBS：生理鹽水對照組； a：給藥體積依實驗動物體重按10 μL/g計算； b：BIW指每周給藥2次。
記錄結果並計算腫瘤抑制率(TGITV)。
在實驗終點(即分組給藥第24天)，Atezolizumab在3 mg/kg劑量下的抑瘤率爲35.3%；HuPL721-T2353-ScFab在3.14 mg/kg和6.27 mg/kg劑量下的抑瘤率分別爲30.6%和50.7%。實驗結果表明抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體HuPL721-T2353-ScFab對MC38-hPD-L1腫瘤皮下移植瘤生長有明顯的抑制作用，且具有劑量依賴性。
以上實施例證明本發明提供的抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體、抗TIGIT/抗PD-L1雙特異性抗體可明顯抑制腫瘤增長，具有顯著的抗腫瘤作用，提示這些抗體可在製備抗腫瘤藥物中應用，具有好的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的權利範圍並不限於上文所作的詳細描述，而應歸屬於申請專利範圍。
無
圖1是ScFab結構的雙特異性抗TIGIT/抗PD-L1抗體結構示意圖。 圖2是ScFv結構的雙特異性抗TIGIT/抗PD-L1抗體結構示意圖。

Claims (20)

  1. 一種抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中： （1）      該重鏈可變區包含選自如下組的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3： (a1)如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列； (a2)如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列；和 (a3)與(a1)或(a2)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）      該輕鏈可變區包含選自如下組的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3： (a4)如SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列； (a5)如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列；和 (a6)與(a4)或(a5)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其具有： 該H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:25、26和27或與SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的該重鏈可變區，和該L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO:31、32和33或與SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的該輕鏈可變區；或 該H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的該重鏈可變區，和該L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的該輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中： (1)      該重鏈可變區的胺基酸序列選自： (b1) 如SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99所示的胺基酸序列； (b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b3) 與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）      該輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (b4) 如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列； (b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b6) 與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
  4. 如請求項1-3之任一項所述的抗TIGIT抗體或其抗原結合片段，其中 該重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:75經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:75功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:75具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:77經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:77功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:77具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 該重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:76，SEQ ID NO:76經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:76功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:76具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:78經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:78功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:78具有至少85%序列同一性的胺基酸序列； 該重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:98經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:98功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:98具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:100經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:100功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:100具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；或者 該重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，且該輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  5. 一種抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其包括抗TIGIT抗體或其抗原結合片段和抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，其中： 該抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中： （1）      該第一重鏈可變區包含選自如下組的H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3： (a1)如SEQ ID NO:25、26和27所示的胺基酸序列； (a2)如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列；和 (a3)與(a1)或(a2)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）      該第一輕鏈可變區包含選自如下組的L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3： (a4)如SEQ ID NO:31、32和33所示的胺基酸序列； (a5)如SEQ ID NO:34、35和36所示的胺基酸序列；和 (a6)與(a4)或(a5)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中： （1）      該第二重鏈可變區包含選自如下組的H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3： (A1)如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列； (A2)如SEQ ID NO:4、5和6所示的胺基酸序列； (A3)如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列；和 (A4)如SEQ ID NO:10、11和12所示的胺基酸序列； (A5)與(A1)、(A2)、(A3)或(A4)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）      該第二輕鏈可變區包含選自如下組的L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3： (A6)如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列； (A7)如SEQ ID NO:16、17和18所示的胺基酸序列； (A8)如SEQ ID NO:19、20和21所示的胺基酸序列； (A9)如SEQ ID NO:22、23和24所示的胺基酸序列； (A10)與(A6)、(A7)、(A8)或(A9)所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列。
  6. 如請求項5所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中 該抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含該H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3分別爲SEQ ID NO:28、29和30或與SEQ ID NO: 28、29和30所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一重鏈可變區，和該L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3分別爲SEQ ID NO: 34、35和36或與SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第一輕鏈可變區。
  7. 如請求項5或6所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含該H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別爲SEQ ID NO:1、2和3或與SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和該L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別爲SEQ ID NO:13、14和15或與SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區；或者 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含所述H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別爲SEQ ID NO: 4、5和6或與SEQ ID NO: 4、5和6所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和該L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別爲SEQ ID NO: 16、17和18或與SEQ ID NO: 16、17和18所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區；或者 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含該H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3分別爲SEQ ID NO:7、8和9或與SEQ ID NO: 7、8和9所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二重鏈可變區，和該L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3分別爲SEQ ID NO:19、20和21或與SEQ ID NO: 19、20和21所示的胺基酸序列具有至少85%序列同一性的胺基酸序列的第二輕鏈可變區。
  8. 如請求項5-7之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中： 該抗TIGIT抗體或其抗原結合片段包含第一重鏈可變區和第一輕鏈可變區，其中： (1)      該第一重鏈可變區的胺基酸序列選自： (b1) 如SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99所示的胺基酸序列； (b2) (b1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b3) 與(b1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）      該第一輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (b4) 如SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101所示的胺基酸序列； (b5) (b4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與(b4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (b6) 與(b4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含第二重鏈可變區和第二輕鏈可變區，其中： (1)      該第二重鏈可變區的胺基酸序列選自： (B1) 如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列； (B2) (B1)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B1)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (B3) 與(B1)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列；和 （2）      該第二輕鏈可變區的胺基酸序列選自： (B4) 如SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:64所示的胺基酸序列； (B5) (B4)所示的胺基酸序列經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的、且與(B4)所示的胺基酸序列功能相同或相似的胺基酸序列；和 (B6) 與(B4)所示的胺基酸序列具有至少80%序列同一性的胺基酸序列。
  9. 如請求項5-8之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中： 該第一重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:99經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:99功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:99具有至少85%序列同一性且該H1CDR1、H1CDR2和H1CDR3如SEQ ID NO:28、29和30所示的胺基酸序列，且該第一輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:101，SEQ ID NO:101經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:101功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:101具有至少85%序列同一性且該L1CDR1、L1CDR2和L1CDR3如SEQ ID NO: 34、35和36所示的胺基酸序列。
  10. 如請求項5-9之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中： 該第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:50所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:50經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:50功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:50具有至少85%序列同一性且該H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:54經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:54功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:54具有至少85%序列同一性且該L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列； 該第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:52所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:52經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:52功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:52具有至少85%序列同一性且該H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:1、2和3所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:56經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:56功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:56具有至少85%序列同一性且該L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:13、14和15所示的胺基酸序列；或者 該第二重鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:61所示的胺基酸序列，SEQ ID NO:61經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:61功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:61具有至少85%序列同一性且該H2CDR1、H2CDR2和H2CDR3如SEQ ID NO:7、8和9所示的胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區的胺基酸序列爲SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:64經取代、缺失或添加一個或多個胺基酸獲得的且與SEQ ID NO:64功能相同的胺基酸序列或與SEQ ID NO:64具有至少85%序列同一性且該L2CDR1、L2CDR2和L2CDR3如SEQ ID NO:19、20和21所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項5-10之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中該抗體是雙特異性抗體。
  12. 如請求項1-4之任一項所述的抗TIGIT抗體或如請求項5-11之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體，其中該抗體是人源化抗體或完全人抗體。
  13. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-4之任一項所述的抗TIGIT抗體或如請求項5-11之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體。
  14. 如請求項13所述的核酸，其包含： (1)      編碼第一重鏈可變區如SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:98或SEQ ID NO:99的核苷酸序列； (2)      編碼第一輕鏈可變區如SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101的核苷酸序列；和/或 (3)      編碼第二重鏈可變區如SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52或SEQ ID NO:61的核苷酸序列； (4)      編碼第二輕鏈可變區如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:64的核苷酸序列。
  15. 一種表達載體，其包含如請求項13或14所述的核酸。
  16. 一種宿主細胞，其轉化如請求項15所述的表達載體，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，優先爲哺乳動物細胞。
  17. 一種製備請求項1-4之任一項所述的抗TIGIT抗體或請求項5-11之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體的方法，包括在如請求項16所述的宿主細胞中表達抗體，以及從宿主細胞中分離該抗體的步驟。
  18. 一種藥物組合物，其包含請求項1-4之任一項所述的抗TIGIT抗體或請求項5-11之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體和藥學可接受的載體。
  19. 一種如請求項1-4之任一項所述的抗TIGIT抗體或請求項5-11之任一項所述的抗TIGIT/抗PD-L1抗體或如請求項18的藥物組合物在製備用於抑制TIGIT和/或PD-L1活性的藥物中的應用。
  20. 如請求項19所述的應用，該抑制TIGIT和/或PD-L1活性的藥物用於治療腫瘤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
MA40662B1 (fr) 2014-12-23 2020-12-31 Bristol Myers Squibb Co Anticorps contre tigit
US20200399376A1 (en) * 2018-02-26 2020-12-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
JP2021532058A (ja) * 2018-07-25 2021-11-25 イノベント バイオロジックス （スウツォウ） カンパニー，リミテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体及びその使用
EP3877418A4 (en) * 2018-11-05 2022-08-17 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-TIGIT ANTIBODY DOSAGE REGIMEN FOR THE TREATMENT OF CANCER
CN111196852A (zh) * 2018-11-16 2020-05-26 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗tigit抗体及其用途

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