JP7290581B2 - イヌ抗体ライブラリ - Google Patents
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Description
(a)本開示の合成イヌ抗体ライブラリを抗原と接触させるステップと、
(b)抗原に結合しない(又は抗原に特異的ではない)ライブラリのメンバーを除去するステップと、
(c)抗原に結合している(又は抗原に特異的な)ライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含む方法を提供する。
a)生殖細胞系列遺伝子によりコードされた抗体若しくはその機能的断片の可変領域の核酸配列若しくはアミノ酸配列、
b)生殖細胞系列遺伝子によりコードされた抗体若しくはその機能的断片の可変領域の核酸配列若しくはアミノ酸配列であって、核酸配列が、例えばコドン最適化、所望の制限部位の付加、GC含有量の最適化、望ましくない翻訳後修飾(PTM)部位の除去、望ましくないmRNAスプライス部位の除去、若しくはmRNA不安定化モチーフの除去により修飾されている核酸配列若しくはアミノ酸配列、又は
c)生殖細胞系列遺伝子によりコードされた抗体若しくはその機能的断片の可変領域の核酸配列若しくはアミノ酸配列であるが、望ましくない翻訳後修飾(PTM)部位の除去、望ましくないシステインの除去、若しくは所望の制限部位の導入、若しくは合成、増幅若しくはクローニングのエラーから生じる修飾の目的などでアミノ酸配列にわずかな変異が加えられた核酸配列若しくはアミノ酸配列を意味する。
特定の態様では、本開示は、少なくとも1種の生殖細胞系列VH1領域のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、上記ライブラリは、少なくとも2種又は少なくとも3種又は少なくとも4種の生殖細胞系列VH1領域のメンバーを含む。
(a)本明細書で開示される実施形態の何れか1つに記載のライブラリを抗原と接触させるステップと、
(b)抗原に結合しないライブラリのメンバーを除去するステップと、
(c)抗原に結合しているライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含む方法を提供する。
(a)上述のライブラリを抗原と接触させるステップと、
(b)抗原に結合しないライブラリのメンバーを除去するステップと、
(c)抗原に結合しているライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含む方法を提供する。
本開示は、イヌ免疫レパートリ中に存在するイヌVH及びVL遺伝子対を含む抗体候補のコレクション又はライブラリにおいて、望ましくない翻訳後修飾(PTM)部位を除去して、抗体発現及び生物物理学的特性を更に最適化するために、各メンバーが生殖細胞系列遺伝子配列又は修飾された生殖細胞系列配列(PTM-低と称される)を含むコレクション又はライブラリを提供する。ライブラリに組み込むために選択されたVH及びVL対は、ライブラリから選択された抗体の各々が都合よく開発可能である可能性を高める有利な生物物理学的特性を含む。ライブラリの組成を決定するために、複数の基準を評価する必要があった。以下の実施例は、評価された基準、評価方法、及び結果について記載する。
第1ステップでは、イヌ免疫レパートリからの優勢VH及びVL生殖細胞系列遺伝子を、文献(Bao et al.Vet Immunol Immunopathol.2010 Sep 15;137 (1-2):64-75;Steiniger et al.Mol Immunol.2014 May;59(1):71-8)から、及びBao et al.(Vet Immunol Immunopathol.2010 Sep;137(1-2):64-75)、Braganza et al.(Vet Immunol Immunopathol.2011 Jan;139(1):27-40)、Vgenerepertoire.org and AbYsis (http://www.bioinf.org.uk/abysis2.7/index.html)から入手可能な再配列されたイヌ抗体配列の分析により同定した。全体で、300超の再配列されたイヌVH、100Vκより大きい、及び150より大きいVλ配列を分析した。効率的な抗原-抗体相互作用のために、広いコンフォメーション-空間が有益である可能性があることが認識されているため、最終選択に構造的に異なる配列を含めるように注意した。したがって、第2ステップでは、イヌ生殖細胞系列レパートリからの構造的に多様なVH及びVL(Vκ及びVλ)遺伝子を、距離分析により同定した。結果を図1、図2、及び図3に示す。
抗体と抗原の最も近い接触部位は、抗体の相補性決定領域(CDR)である。H-CDR3及びL-CDR3は、抗原結合に主要な役割を果たしているため、これら2つのCDRに主に変動性が導入された。全ての他のCDRについて、生殖細胞系列配列又はPTMモチーフが除去された修飾生殖細胞系列配列を使用した。
L-CDR3はJセグメントによって生殖細胞系列に依存せずに部分的にコードされるため、L-CDR3の分析は、VL生殖細胞系列ファミリーに関係なく、全ての再配列された配列に対して行われた。イヌの再配列されたVκ配列の分析に基づき、Kabat L-CDR3の長さが9のアミノ酸が、全てのVκ配列の約85%中に発生する。したがって、ライブラリ中のVκ領域についてのKabat L-CDR3の長さは、長さ9のアミノ酸に設定した(表16参照)。Vλ配列について、最も頻繁なKabat L-CDR3の長さは、11aa(60%)、続いて10aa(30%)である。したがって、ライブラリ中のVλ領域についてのKabat L-CDR3の長さは、長さ10及び11のアミノ酸に設定した(表17及び表18参照)。例えば、システインの完全な回避、及びグリコシル化部位(NxS、NxT)の回避によって、観察されたアミノ酸分布をわずかに修飾し、ライブラリ中のL-CDR3の設計を完成させた。
本実験で生成されたイヌ抗体ライブラリは、多様化したL-CDR3及びH-CDR3領域を含む。システイン及び停止コドンの導入を防ぐCDR3-カセットへの望ましいコドンのみの制御された組み込みを可能にするSlonomics技術によって、CDR3ライブラリカセットを生成した(Van den Brulle et al.Biotechniques.2008 Sep;45(3):340-3)。ライブラリ生成後の非選択クローンのシーケンシングにより、L-CDR3及びH-CDR3カセットの望ましくないDNA変異、欠失、挿入、及びフレームシフトの全体的な発生率が低いことが示された。
pMORPH18(Rauchenberger et al.J Biol Chem.2003 Oct 3;278 (40):38194-205)及びpMORPHx30(Prassler et al.J Mol Biol.2011 Oct 14;413(1):261-78)ベクターを、それぞれ、新しいFabディスプレイpCaDis18及びFab発現ベクターpCaBxを生成するためのテンプレートとして、以下の修飾を加えて使用した。両ベクターについて、Ig軽鎖コード配列の上流のompAリーダー配列を、C末端で修飾し、それぞれ制限部位NdeIを導入して、VL及びVHタンパク質配列の本物のN末端を確保し、pCaMx IgGベクターへのFab断片の好都合なサブクローニングを可能にした。加えて、哺乳類IgG発現ベクターセットを構築した。GeneArt(H.サピエンスコドン最適化)により、イヌIgG CH1及びCλ及びCκ配列を合成した。CHコンストラクトを、Kan stuffer (pCaMx_Stuffer)を含有するpM4_ベクター中にクローニングした。2つのコドン最適化Cλ及びCκ配列を、一般的なGeneartベクター中にクローニングした(pMA-T_CaMin κ pMA-T_CaMin λ)。最先端の分子生物学の方法を使用して、IgG変換を実施した。
以下の実施例は、イヌVH/VL対の生物物理学的特性評価の方法及び結果を記載する。
実施例1.1で合成された抗体組合せを、機能性試験用にFabディスプレイベクターpCaDis中にクローニングした。ベクターには5種のVH及び6種のVLマスター遺伝子の組合せが含まれ、30種の可能な組合せを得た。2xYT/Cam/1%グルコース培地でウェルの各々を満たし、それらを30種の生成された抗体コンストラクトからのシングルクローンとともに接種することによりマスタープレートを生成した。プレートを振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。翌日、マスタープレートを最終濃度15%グリセロールで保存し、-80℃で凍結した。ファージ調製物について、2xYT/Cam/1%グルコースに、マスタープレート由来のグリセロストック(glycerostocks)を接種し、OD600nmが0.5に達するまで、400rpmにて振盪しながらインキュベートした。次いで、細胞にVCSM 13ヘルパーファージを感染させ、振盪することなく37℃で30分間、次いで、400rpmにて振盪しながら更に30分間インキュベートした。細菌を遠心分離にかけ、34μg/mlのクロラムフェニコール、50μg/mlのカナマイシン及び0.25mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを含む2xYT培地(2xYT/Cam/Kan/IPTG)中に再懸濁させ、ファージ生成のために更に22℃で18~20時間インキュベートした。Fab提示ファージを含有する上清を新しいチューブに移し、上清量の1/5のPEG/NaCl(20%のPEG6000、ddH2O中2.5MのNaCl)を使用してファージを沈殿させた。遠心分離及び上清の除去後、ファージペレットを滅菌PBS中に再懸濁させた。OD268nmでの吸光度測定(Nanodrop,peqlab)により、ファージ力価を決定し、LB/Cam/Glucプレート上の感染大腸菌(E.Coli)TG1F+細胞の限界希釈プレーティングによって確認した。
実施例2.1のように調製したファージ上清を使用して、ウェスタンブロット技術を用いて、ファージ粒子上のファージディスプレイ比を決定した。
pCaBx中にクローニングされた30種のVH/VL組合せのクローンを、成長培地(2xYT/Cam/IPTG/0.1%グルコース)に接種し、培地がわずかに濁るまで400rpmで約3時間振盪しながら37℃でインキュベートした。続いて、培養物を22℃で振盪しながら一晩インキュベートした後、BELバッファー(24.7mg/mlのホウ酸、18.7mg/mlのNaCl、1.48mg/mlのEDTA、2.5 mg/mlのリゾチーム、10MのNaOHでpH8.0に調整されている)を使用して細胞を溶解し、PBS中の10%粉乳でブロックした。抗-イヌF(ab’)2断片特異的捕捉抗体(ウサギ抗-犬IgG Fab’2抗体 非コンジュゲート;LifeSpan BioSciences, LS-C69729)、及びAP-コンジュゲート抗-犬IgG F(ab’)2断片検出抗体(ヤギ抗-犬IgG(H+L)-アルカリホスファターゼ抗体、Sigma SAB3700097)を AttoPhos(Roche)とともに使用して、ELISAによりFab発現を決定した。相対的なFab発現レベルは、それぞれのFab VH/VL対のシグナルから参照ヒト/イヌキメラ抗体のシグナルを除算することにより計算された。85%超の試験されたFab VH/VL対は、対照の少なくとも0.5の相対発現を示した。λクローンは、平均して、最も高い相対的Fab発現レベルを有した。結果を図6に示す。
大腸菌(E.coli)TG-1 F細胞における細菌発現ベクターによってコードされたFab断片の発現を、0.1%グルコース及び34μg/mLのクロラムフェニコールを追加した500mlの2xYT培地を使用して振盪フラスコ培養で実施した。OD600が0.5の値に達するまで、培養物を振盪させた。IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を添加して、更に20時間培養することにより、Fab発現を誘導した。細胞を回収し、リゾチームを使用して破壊した。His6タグ付き(配列番号47)Fab断片をIMAC(Bio-Rad,Munich,Germany)により単離し、イミダゾールを使用して溶離した。「PD10」カラム(GE Healthcare)を使用して、1×ダルベッコPBS(pH7.2)とのバッファー交換を実施した。サンプルを無菌濾過した(0.2μm)。タンパク質濃度を、UV分光測定法により決定した。サンプルの純度を、変性、非還元15%SDS-PAGEで分析した。30種のイヌVH/VL対の各々を表す精製Fab断片の%モノマーを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により決定した。SECを、AeKTA精製システム(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)で実施した。分離には、Superdex75 HR 10/30カラム(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)を使用した。各サンプルについて、10μlのタンパク質をカラムにロードし、0.05mL/分の流量で分離を実施し、260及び280nmでのUV吸収を記録、分析した。ランニングバッファーは、Gibco D-PBS、pH7.4(Invitrogen,Paisley,USA)で構成された。結果を図7に示す。
真核生物HKB11細胞に、IgGの重鎖及び軽鎖の両方をコードするpCaMx哺乳類発現ベクターDNAをトランスフェクトした。トランスフェクション後3又は6日目に細胞培養上清を回収し、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(MabSelect SURE,GE Healthcare,Munich,Germany)に供した。1×ダルベッコPBS(pH7.2)でバッファー交換を実施し、サンプルを無菌濾過した(0.2μm孔径)。
主要コートタンパク質pVIIIを介したファージを捕捉するために、抗-M13抗体(Amersham)を使用して、及びディスプレイされたFabと結合する抗-Fd抗体(The Binding Site)を使用して、ELISAによりM13ファージ上のFabディスプレイを測定した。ファージ上清及び参照サンプルの適切な希釈物が、抗-M13ペルオキシダーゼコンジュゲート(Amersham)及びQuanta Blu(商標)(Pierce)を用いて検出された。抗-Fdの力価を抗-M13の力価で除算することにより、各サンプルについての相対ディスプレイ比の計算を実施した。参照ファージ調製物の検量線から力価を入手した。
細菌溶解物の適切な希釈物を、異なる温度(0℃、60℃、70℃、及び80℃)に45分間さらした。抗-6×His(配列番号47)捕捉抗体(R&D Systems)及びAP標識抗-イヌIg検出抗体をAttoPhos(Roche)とともに使用して、ELISAによりインタクトFab分子を検出した。
IgGの熱安定性を、示差走査型蛍光定量法(DSF)によって測定する。DSFは、対象とするタンパク質の熱的なアンフォールディング(融点)を観察する蛍光色素系技法である。アンフォールディングタンパク質の疎水性アミノ酸側鎖と相互作用する疎水性色素の蛍光の温度勾配に伴う変化が観察される。以下の材料を使用する:Syproオレンジ蛍光色素(Sigma,#S5692);iCycler iQ PCRプレート、96ウェル(Biorad,#2239441);Microseal B接着シーラー(Biorad #MSB-1001);96ウェル光学パッド(Biorad,#ADR3296);及びiCycler iQ5サーマルサイクラー(Biorad)。希釈したSyproオレンジを96ウェルiCycler iQ PCRプレートの各ウェルに添加し、少なくとも0.1mg/mlの終濃度でサンプルを試験する。温度を60℃/時の加熱速度で20℃から95℃まで走査し、蛍光遷移の中点を分析することによりアンフォールディングの温度を計算する。
各IgGの等電点を計算する。タンパク質のpIの決定方法は、当業者に公知である。例えば、以下のツールを使用することができる:http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html;Vector NTI(Invitrogen, Carlsbad, California)。
ライブラリ設計の有効性を確認するために、ライブラリは様々な抗原に対して試験される。次いで選択された抗体は、開発可能特性、例えば:a)Fabディスプレイ比;b)Fab発現収率、c)Fab熱安定性;d)Fab血清安定性;e)Fab SEC%モノマー;f)IgG発現収率;g)IgG熱安定性;h)IgG血清安定性;i)IgG SEC%モノマー;j)IgG等電点(pI);k)示差走査蛍光分析を使用した酸への暴露前後のFab若しくはIgGフォーマットでの熱安定性;l)酸への暴露前後のFab若しくはIgGフォーマットでの吸収;m)動的光散乱によって測定された場合の、酸への暴露前後の分子半径及び%多分散度;並びに/又はn)Fab若しくはIgGフォーマットでの粒子染色などについて、Fab及びIgGフォーマットの両方で試験される。加えて、Fabフォーマットでの抗原に対する親和性を決定した。
FabフォーマットでのそれぞれのVH/VL対をディスプレイするファージを、以下のとおり調製した。各ライブラリファージ調製物につき80mlの2xYT/Cam/Glc培地に、対応するライブラリグリセロールストック由来の細菌を、OD600nmが0.2~0.3となるように接種した。培養物を、OD600nmが0.45~0.55に達するまで、120rpm及び37℃にて、30~90分間振盪した。次いでヘルパーファージを感染多重度10で細菌培養物に添加し、続いて振盪することなく37℃にて45分間、次いで120rpmで振盪しながら37℃にて45分間インキュベートした。細菌をスピンダウンし、ヘルパーファージ含有上清を廃棄した。ファージ感染細菌を400mLの2xYT/CAM/KAN/IPTG培地中に再懸濁させ、120rpmで振盪しながら22℃にて一晩インキュベートした。翌日、一晩培養物からの細菌をペレット状にし、Fab提示ファージを含有する上清を回収した。ファージ含有上清に、合計量の1/5の予冷されたPEG/NaClを添加することにより、ファージ沈殿を実施した。沈殿するファージの濁りが見えるようになるまで、サンプルを氷上で少なくとも30分間インキュベートした。沈殿したファージをスピンダウンし、20mLのPBS中に再懸濁させた。サンプルをゆっくり回転させて均質な懸濁液を得て、残留細菌デブリをペレット状にして廃棄した。PEG/NaClを使用して、ファージ含有上清から再びファージを沈殿させた。最後に、ファージペレットをPBS中に再懸濁させ、滅菌チューブに移し、ゆっくりと振盪して均質な懸濁液を得た。スポットタイトレーション及びELISAにより、ファージ力価を決定した。ディスプレイベクターpCaDis(図9に示される)により発現させ、ファージ上に提示させたFab断片のファージ力価及びディスプレイレベルを、各個々のファージ調製物ごとにELISA及び/又はウェスタンブロット(実施例2.6参照)により評価した。ELISAに関して、捕捉には2つの異なる抗体を使用した:(1)抗-M13抗体(Amersham #27-9420-01)を使用した。これは主要コートタンパク質g8pによりファージ粒子を捕捉する;したがって、ファージ力価を決定することができる。(2)抗-イヌ-Fab’2(LS Bio,#LS-C69729)を使用した。これはディスプレイされたFabに結合する;したがって、ファージディスプレイFabのみが捕捉された。(1)及び(2)に対し、別個の基準曲線が用いられた。HRPとコンジュゲートしたモノクローナル抗-M13(M13ファージの主要コートタンパク質g8pに対する)を、検出抗体として使用した。ELISAデータの評価は、以下のとおり完了した:検量線を作成し、ファージ上清及び対照の力価を計算した。各サンプルについて、抗-Fdに関する力価を抗-M13(抗-pVIII)に関する力価で除算し、得られた割合が相対ディスプレイ比である。
以下に記載されるように又は当業者に公知の別の方法により、ファージディスプレイ選択を行ってもよい。例えば、並行パニング方法(例えば、溶液パニング、Fc捕捉パニング、直接固相パニング)を実施して、所望の生物物理学的特性を有する多様な結合抗体を同定する可能性を最大化する。様々な可溶性タンパク質を、ライブラリ検証用のモデル抗原として選択することができる(例えば、リゾチーム)。以下に記載されるカルボン酸基へのアミド結合形成による磁気Dynabeads(Dynal/Invitrogen 製品番号143.06)と共有結合した抗原を用いたビーズ系溶液パニングにおいて、モデル抗原に対するコレクションスクリーニングを実施する。以下に記載のFc捕捉パニング方法を用いて、モデル抗原に対する選択もまた実施することができる。
モデル抗原及び対照BSAでコーティングしたカルボキシルビーズ(Dynal)を、室温(RT)にて2時間、PBS中5%粉乳+0.1%Tween20でブロックした後、予め吸収させたファージと共に室温にて2時間インキュベートする。数回の洗浄ステップの後、結合したファージを溶離し、次の選択ラウンドのため、TG1F+細胞を感染させることにより増幅する。3ラウンドの選択の後、pCaDis(図9に示される)ファージミドDNAを単離し、Fabコード断片をXbaI及びEcoRIによる制限消化により切り出し、発現ベクターpCaBx(図10に示される)に結合して、大腸菌(E.coli)TG1F-に形質転換する。次いで、感染培養物を大型LB/Cam/Glucプレート上にプレーティングし、34℃で成長させた。シングルクローンを単離し、Fab発現収率及び抗原結合性についてELISAにより試験する。ウサギ抗-犬IgG F(ab)’2抗体(LifeSpan BioSciences,LS-C69729)でコーティングしたELISAプレートでFab含有細胞抽出物をインキュベートし、続いて、ヤギ抗-犬IgG(H+L)アルカリホスファターゼ抗体(Sigma,SAB37000097)を用いて検出することにより、Fab発現を検出する。例えば、ビーズ系アッセイ(Applied Biosystems 8200細胞検出システム/PE Biosystems)用の蛍光定量的なマイクロボリュームアッセイ技術(FMAT(登録商標))によってモデル抗原結合カルボキシルビーズ及びBSA結合カルボキシルビーズ(Dynal)でFab含有細胞抽出物をスクリーニングすることにより、抗原特異性を試験する。一次ヒットは、200の値に設定されたバックグラウンドを少なくとも5倍上回るFMAT平均蛍光シグナルをもたらすFabとして定義する。モデル抗原に対する特異性を、同種抗原としてモデル抗原及び陰性対照抗原として無関連抗原を用いた二次ELISAで確認する。各試験されたサブライブラリ、サブライブラリミックス、又は全ライブラリについての約50~100個のクローンを、重鎖及び軽鎖CDR3領域のシーケンシング用に選択し、モデル抗原結合抗体の配列多様性を推定する。シーケンシング結果は、構築されたライブラリがモデル抗原バインダの多様なレパートリを含むことを示す。ELISAによる結合特性評価は、単離された抗体が、対象とする同種のモデル抗原に非常に特異的であり、無関連対照抗原と交差反応しないため、生物医学研究及び高度に特異的な治療抗体の生成のためのライブラリの有用性を証明することを示す。
MaxiSorpプレート(Nunc)上のヤギ抗ヒト-IgG Fc特異的(Jackson;カタログ109-005-098)又はマウス抗-ヒト-IgG Fc特異的(Jackson;カタログ209-005-098)を用いて捕捉することにより固定化した組換えヒトFcタグ付きモデルタンパク質を用いて、3ラウンドの固相Fc捕捉パニングを実施する。各選択ラウンドの前に、ファージを0.1mg/mlのPBS/5%ミルク、/5%BSA/0.1%Tween中ヒト、ヤギ及びマウス免疫グロブリンで、室温にて2時間ブロックする。数回の洗浄ステップの後、結合したファージを溶離し、次の選択ラウンドのため、TG1F+細胞を感染させることにより増幅する。選択を3ラウンド行った後、pCaDis(図9に示される)ファージミドDNAを単離し、Fabコード断片をXbaI及びEcoRIによる制限消化により切り出し、発現ベクターpCaBx(図10に示される)に結合して、TG1F-に形質転換する。次いで、感染培養物を大型LB/Cam/Glucプレート上にプレーティングし、34℃で成長させた。シングルクローンを単離し、Fab発現収率及び抗原結合性についてELISAにより試験する。Fab発現は、上記のように検出する。MaxiSorpプレートにコーティングしたヤギ抗ヒトIgG抗体(Jackson;カタログ109-005-098)により捕捉されたモデルタンパク質_Fc抗原でのFab含有細胞抽出物によるELISAスクリーニングによって、抗原特異性を試験する。一次ヒットは、バックグラウンドを少なくとも5倍上回るELISAシグナルをもたらすFabとして定義する。モデルタンパク質_Fcに対する特異性を、同種抗原としてモデル抗原_Fc及び陰性対照抗原として無関連タンパク質_Fcを用いた二次Fc捕捉ELISAで確認する。
開発可能特性、例えば、Fabフォーマットでの熱安定性、Fabフォーマットでの親和性、IgGフォーマットでのpI、IgGフォーマットでの発現収率、IgGフォーマットでの熱安定性、及びSECにより測定する場合のIgGフォーマットでの%モノマーについて、本明細書で開示される方法により又は当業者に公知の他の方法により、抗原に特異的な抗体又は断片をFab及びIgG1の両フォーマットで試験する。Fab及びIgGフォーマットでの熱安定性試験は、実施例2.7及び2.8に記載されるとおり完了する。IgGフォーマットでのpIの決定は、実施例2.9に記載されるとおり完了する。IgGフォーマットでの発現収率は、実施例2.5に記載されるとおり完了する。SECにより決定する場合のIgGフォーマットでの%モノマーは、実施例2.5に記載されるとおり完了する。
モノマーFab画分の結合(分析的SECにより分析;Superdex75,Amersham Pharmacia)の抗原の捕捉を、以下のとおり分析する:CM5チップ(Biacore/GE Healthcare)上で、適切な抗-抗原タグ捕捉抗体を、EDC/NHSケミストリーを用いて共有結合的に固定化する。抗原を捕捉し、続いて6つの異なるFab濃度(2n段階希釈)を注入することにより、動態計測を行う。各サイクル終了後に、センサーチップを再生する。二重参照のため、ランニングバッファーのブランク注入を用いる。全てのセンサグラムを、BIA評価ソフトウェア3.2(Biacore/GE Healthcare)を用いてフィッティングして、kon及びkoff速度定数を決定し、これを用いてKDを計算する。
製造元が提供するマニュアルに従って、MiSeq機器(Illumina 1つのVL/VHサンプルあたり約100万配列)を使用した高い処理量のアンプリコンシーケンシングによって、ライブラリの品質を評価した。
簡潔には、個々のサンプルのVL又はVHアンプリコン(例えば:クローンライブラリ由来のプラスミドDNA)を、PCR(1分間98℃、15秒間98℃の15サイクル、15秒間60℃及び15秒間72℃、5分間72℃、15ngのテンプレートDNA、0.4μMの各プライマー、200μMのdNTP、及び1UのPhusionポリメラーゼ(NEB))により生成した。
ユニバーサルNexteraアダプタを含有するアンプリコンを上記のようにPCR増幅し(第1ステップ-アダプタPCR)、アガロースゲルを精製して定量した。第2PCRステップ(インデックスPCR)では、固有のインデックスの組み合わせ(i5/i7インデックス)を、各サンプルの5’末端及び3’末端に並行して添加した(1分間98℃、15秒間98℃の10サイクル、15秒間60℃及び60秒間72℃、5分間72℃、1ngのテンプレート、0.4μMのプライマー、200μMのdNTP、及び0.5UのPhusionポリメラーゼ)。
大規模なシーケンシングデータセットの処理及び分析用に社内で開発されたソフトウェアを使用して、品質フィルタリングされた配列を更に分析した。配列を多重分離化し、ライブラリ固有の配列機能、例えば、V遺伝子型、HCDR3の長さ及びアミノ酸分布を評価した。簡潔には、VH及びVL分布は、それぞれ、予想どおりであり、設計と所望の位置で得られたアミノ酸との間に非常に良好な相関関係がある(図11、図12、及び図13)。
eGFP(高感度緑色蛍光タンパク質)を、ライブラリ検証用のモデル抗原として選択した。固相パニング、続いて直接コーティングELISAにおけるスクリーニングを実施して、ライブラリからeGFP特異的バインダを単離した。マイクロタイタープレート上に直接固定化されたeGFPを使用して、固相パニングを実施した。各選択ラウンドの前に、ファージをPBS中10%スキムミルク粉末でブロックした。ファージのインキュベーションに続いて、PBSTで数回の洗浄ステップを実施して、非常に弱い/非特異的なバインダを除去した。結合したファージを低-pH溶離バッファーで溶離し、次の選択ラウンドのため、TG1F+細胞を感染させることにより増幅した。最終選択ラウンド後に、pCaDisファージミドDNAを単離し、Fabコード断片をXbaI及びEcoRIによる制限消化により切り出し、発現ベクターpCaBx(図10)に結合させ、TG1F-大腸菌(E.coli)に形質転換した。次いで、感染培養物をLB/Cam/Glucプレート上にプレーティングし、一晩成長させた。シングルクローンを単離し、Fab発現収率及び抗原結合性についてELISAにより試験した。ウサギ-抗-犬-IgG F(ab)2 (LSBio,カタログLS-C69729)でコーティングしたELISAプレートでFab含有細胞抽出物をインキュベートし、続いて、アルカリホスファターゼ(AP)(Sigma,SAB37000097)とコンジュゲートしたウサギ抗-犬IgG IgG F(ab)2特異的抗体を用いて検出することにより、Fab発現を検出した。MaxiSorpプレート上にコーティングされたeGFP上のFab含有細胞抽出物を用いたELISAスクリーニングにより、抗原特異性を試験した。一次ヒットは、バックグラウンドを少なくとも5倍上回るELISAシグナルをもたらすFabとして定義した。eGFPに対する特異性を、陰性対照抗原(乳タンパク質のみでコーティングされたプレート)上の二次ELISAで確認した。
パニング選択後に得られた個々のクローンの結合を比較するために、アルカリホスファターゼ(AP)(Sigma,SAB37000097)とコンジュゲートしたウサギ抗-犬IgG F(ab)2-特異的検出抗体を用いて、Maxisorpプレート上にコーティングされたeGFPでFabフォーマットの精製抗体を滴定して、試験した。予めHuCALライブラリから単離された抗-GFP抗体(MOR06391)を、参照として含んだ。図15に示すように、ライブラリから直接単離された抗体は、6/9の候補が参照抗体と同様又はより良好な結合特性を示す多様な結合強度を示す。
実施例5に記載されているように、モデル抗原としてのeGFPに対するパニングを実施した。抗体選択後に得られた特異的Fabヒットは、最先端の分子生物学的方法を使用してIgGフォーマットに変換され、IgGタンパク質は実施例2.5に記載のように産生された。標準固相ELISAによりeGFPに対するIgG反応性を確認した(図16)。アルカリホスファターゼ(AP)(Sigma,SAB37000097)とコンジュゲートしたウサギ抗-犬IgG F(ab)2-特異的検出抗体を用いて、Maxisorpプレート上にコーティングされたeGFPに結合するIgGの検出を実施した。予めHuCALライブラリから単離された抗-GFP抗体(MOR06391)を、参照として含んだ。
Claims (13)
- 合成イヌ抗体ライブラリにおいて、前記ライブラリが、
以下の生殖細胞系列VH1領域:Vs618(配列番号4)、Vs624(配列番号1)、Vs628(配列番号5)、及びVs635(配列番号2)のうちの少なくとも1種のメンバーを含み、かつ
以下の生殖細胞系列VL領域:Vs236(κ)(配列番号12)、Vs321(λ)(配列番号14)、Vs323(λ)(配列番号16)、Vs365(λ)(配列番号13)、及びVs843(λ)(配列番号15)のうちの少なくとも1種を含むことを特徴とするライブラリ。 - 請求項1に記載のライブラリにおいて、翻訳後修飾(PTM)部位が、前記生殖細胞系列VH1領域又は前記生殖細胞系列VL領域のうちの1種以上から除去されることを特徴とするライブラリ。
- 請求項1又は2に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリが前記VH1領域:Vs618(配列番号4)、Vs624-PTM-低(配列番号6)、及びVs635-PTM-低(配列番号7)、並びにVL領域:Vs236(κ)(配列番号12)、Vs323-PTM-低(λ)(配列番号18)、及びVs365(λ)(配列番号13)を含むことを特徴とするライブラリ。
- 請求項1乃至3の何れか1項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリが前記VH1領域:Vs618(配列番号4)、Vs624-PTM-低(配列番号6)、Vs628-PTM-低(配列番号10)、及びVs635-PTM-低(配列番号7)、並びにVL領域:Vs236(κ)(配列番号12)、Vs321(λ)(配列番号14)、Vs323-PTM-低(λ)(配列番号18)、Vs365(λ)(配列番号13)、及びVs843(λ)(配列番号15)を含むことを特徴とするライブラリ。
- 請求項1乃至4の何れか1項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリが以下のVH/VL組合せ:VH1領域Vs618(配列番号4)及びVL領域Vs236(κ)(配列番号12)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs624-PTM-低(配列番号6)及びVL領域Vs236(κ)(配列番号12)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs635-PTM-低(配列番号7)及びVL領域Vs323-PTM-低(λ)(配列番号18)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs618(配列番号4)及びVL領域Vs365(λ)(配列番号13)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs624-PTM-低(配列番号6)及びVL領域Vs365(λ)(配列番号13)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs635-PTM-低(配列番号7)及びVL領域Vs365(λ)(配列番号13)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs618(配列番号4)及びVL領域Vs843(λ)(配列番号15)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs624-PTM-低(配列番号6)及びVL領域Vs843(λ)(配列番号15)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs635-PTM-低(配列番号7)及びVL領域Vs843(λ)(配列番号15)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs618(配列番号4)及びVL領域Vs323-PTM-低(λ)(配列番号18)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs624-PTM-低(配列番号6)及びVL領域Vs323-PTM-低(λ)(配列番号18)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs618(配列番号4)及びVL領域Vs321(λ)(配列番号14)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs624-PTM-低(配列番号6)及びVL領域Vs321(λ)(配列番号14)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs635-PTM-低(配列番号7)及びVL領域Vs321(λ)(配列番号14)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs635-PTM-低(配列番号7)及びVL領域Vs236(κ)(配列番号12)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs628-PTM-低(配列番号10)及びVL領域VS236(κ)(配列番号12)のVH/VL組合せ、VH1領域Vs628-PTM-低(配列番号10)及びVL領域Vs365(λ)(配列番号13)のVH/VL組合せ、並びにVH1領域Vs628-PTM-低(配列番号10)及びVL領域Vs843(λ)(配列番号15)のVH/VL組合せのうちの1種以上を含むことを特徴とするライブラリ。
- 請求項1乃至5の何れか1項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリの本質的に全てのVH/VL組合せが、1ファージ当たり少なくとも0.5Fabのディスプレイ比で、効率的にディスプレイされることを特徴とするライブラリ。
- 請求項1乃至6の何れか1項に記載のライブラリにおいて、本質的に全てのVH/VL組合せが、Fabフォーマットの大腸菌(E.coli)で発現される場合に、少なくとも85%のモノマー含有量を有することを特徴とするライブラリ。
- 請求項1乃至7の何れか1項に記載のライブラリにおいて、本質的に全てのVH/VL組合せが、IgGフォーマットの哺乳類系で発現される場合に、少なくとも90%のモノマー含有量を有することを特徴とするライブラリ。
- 請求項1乃至8の何れか1項に記載のライブラリにおいて、全てのVH/VL組合せが熱的に安定であることを特徴とするライブラリ。
- 請求項1乃至9の何れか1項に記載のライブラリメンバーをコードすることを特徴とする核酸分子のコレクション。
- 請求項10に記載の核酸分子をコードすることを特徴とするベクター。
- 請求項10に記載の核酸分子又は請求項11に記載のベクターを含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
- 抗原に特異的な抗体を単離するための方法において、上記方法が:
(a)請求項1乃至9の何れか1項に記載のライブラリを抗原と接触させるステップと;
(b)前記抗原に結合しない前記ライブラリのメンバーを除去するステップと、
(c)前記抗原に結合している前記ライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
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