CN117587524A - 犬抗体文库 - Google Patents
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Abstract
本发明提供合成犬抗体文库以及结合这些文库使用的多肽、核酸、载体、宿主细胞和方法。本发明还提供从这些文库分离的抗体。
Description
本申请是2019年12月23日提交到中华人民共和国国家知识产权局的发明名称为“犬抗体文库”、申请号为“201880042013.1”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及并提供犬文库，例如适合于选择完全犬抗体的合成抗体文库。本发明还涉及编码犬抗体个体或集合的合成核酸序列，即编码犬抗体文库的核酸序列。提供了用于产生和使用这类文库的方法。特别地，本发明涉及通过使用合成种系序列以产生具有特定生物物理特性的完全犬抗体的文库来制备完全犬抗体文库。
背景技术
免疫球蛋白，例如抗体，在制药工业中具有持续和日益增加的兴趣。自2000年以来，单克隆抗体的治疗市场呈指数增长，在2007年，美国20种销量最好的生物技术药物中有8种是治疗性单克隆抗体，每一种在全世界的年销售额都超过50亿美元。治疗性抗体改善了许多疾病的治疗，并日益改善了患者的生活质量，即使是最严重、最具有挑战性的疾病的患者。
伴侣动物例如狗发展出与人类相比类似的疾病，其基于类似的或甚至相同的生物学机制和病症。例如，淋巴瘤是犬的血液淋巴系统最常见的肿瘤。它代表所有犬肿瘤的约4.5％和所有恶性肿瘤的15％。犬淋巴瘤(CL)通常是迅速致命的，在诊断的1-3个月内造成死亡(Squire等人,1973；Steven E.Crow,2008)。而且，据估计，美国五分之一的成年狗患有关节炎，并且狗已经被用作人关节疾病的模型，例如用于骨关节炎、前交叉韧带破坏和半月板损伤。
因此，治疗性单克隆抗体不仅提供了用于治疗人、而且还用于治疗狗的非常有前景的药物种类。
已经尝试使用抗体用于狗的治疗。甚至在美国食品和药物管理局(the U.S.Foodand Drug Administration，FDA)批准第一种用于人癌症治疗的单克隆抗体，1992年，美国农业部(the United States Department of Agriculture，USDA)已经批准了用于患淋巴瘤的狗的单克隆抗体MAb231。MAb231是一种源自鼠科动物的单克隆抗体，其使用Kohler和Milstein于1975年开发的杂交瘤技术产生，并特异性结合犬淋巴瘤细胞系17-71(参见例如：US5169775A)。MAb231被证明结合肿瘤细胞而不结合正常细胞，并具有治疗上需要的介导细胞毒性的鼠科动物同种型IgG2a。
同时，在使用对抗体进行“犬源化(caninise)”并因此模拟犬抗体的方法。例如，Gearing等人(BMC Veterinary Research 2013,9:226)公开了通过使用基于表达的犬免疫球蛋白序列的算法将现有的大鼠抗-NGF单克隆抗体转化成重组犬源化抗-NGF mAb，从而产生“完全犬源化”抗-NGF单克隆抗体。
据发明人所知，以前既没有公开完全合成犬抗体文库，也没有公开具有预定的、多样的VH/VL组成的任何其它可靠的犬抗体文库。在本发明中，对天然存在的犬抗体序列的合理分析和文库的复杂设计，产生了首个完全合成犬抗体文库，其可广泛用于生物医学研究。另外，对于有益的特性例如高单体含量和高度热稳定性，对文库的成员(member)进行了选择。
至于筛选合成犬抗体文库的方法，可以使用在噬菌体、大肠杆菌(E.coli)、酵母等上展示。在优选的噬菌体展示中，例如，抗体作为融合多肽呈递在噬菌体的表面蛋白质上。使抗体-展示噬菌体颗粒与感兴趣的靶分子(例如固定在固相(例如微量滴定板、磁珠等)上或在溶液中)接触，从而进行亲和力选择。选择表达对靶分子具有亲和力的抗体的噬菌体，在选择循环(selection round)中洗去具有不结合靶分子的抗体的噬菌体，其通常称作“(生物)淘选(bio-panning)”。在噬菌体展示中，呈递在所选择的噬菌体上的抗体与编码该抗体的基因一一对应，因此，可以容易地识别出感兴趣的抗体。而且，编码抗体的基因可以容易地扩增，因此，噬菌体展示被广泛用作从大文库中筛选和分离抗体的方法。
发明内容
由于犬种系序列编码的免疫球蛋白序列预计在犬中不具有免疫原性，因此我们寻找代表最丰富的犬抗体种类的种系免疫球蛋白序列。
根据Bao等人(Veterinary Immunology and Immunopathology 137(2010)64-75)，犬抗体VH基因库(gene repertoire)包括80种VH区段(其中41种是功能性的，39种是假基因)、6种DH和3个JH区段。VH基因通过所述VH基因库中不同的V、D和J基因区段的组合形成，并通过在VD和VJ接合处添加或缺失短编码序列而连接，以增加抗体的多样性。在生发中心进入之前发生的VDJ重组不是完全随机的，而是特异性VH基因比其它VH基因更频繁地使用。
在犬中，识别出1-VH62(Vs624)和1-VH44(Vs635)是在脾B细胞中最频繁使用的VH区段，1-VH62出现率为27％，1-VH44为23.4％(Bao等人,2010)。所有其余的VH以小于11％的频率使用。在犬中，存在三个VH家族(VH1、VH2和VH3)，其中大部分属于VH1家族，而2-VH51、2-VH64和2-VH66属于VH2家族，3-VH80代表仅有的VH3家族成员。
犬中的抗体轻链也基于由V和J基因区段编码的可变区和由κ和λ基因编码的恒定区。犬家族免疫球蛋白λ序列可以分成四个VLλ链家族[V-I(GenBanK登记号XM845300)、V-II(GenBank登记号XM543519)、V-III(GenBank登记号XM844188)和V-IV(GenBank登记号XM844237)]。C.家族免疫球蛋白κ序列也可以分成四个VLκ链家族：V-I(Gen Bank登记号XM849621)、V-II(Gen Bank登记号XM844874)、V-III(Gen Bank登记号XM849629)和V-IV(Gen Bank登记号XM849668)序列(Braganza等人,Veterinary Immunology andImmunopathology 139(2011)27-40)。发现狗表达90％的λ轻链，且仅表达10％的κ轻链(Braganza等人,Veterinary Immunology and Immunopathology 139(2011)27-40)。然而，迄今为止，犬的特定轻链的分布和排列以及犬中存在的VH/VL组合几乎没有表征。
基于文献中描述的VH基因的分布和序列相似性分析，选择特定的VH基因用于合成犬抗体文库。对于VL基因，使用Braganza等人,2011中提供的信息和可在http:// vgenerepertoire.org上获得的基于86种λ轻链种系序列和29种κ轻链种系序列的共有序列，以选择用于合成犬抗体文库的特定轻链种系序列。
我们测试了五种代表性的犬VH种系序列和六种代表性的犬VL种系序列(4λVL，2κVL)。在30种可能的VH/VL组合中，我们识别出6种表现出以下有益特性的组合：(i)它们在丝状噬菌体的尖端以Fab形式表现出高展示率；(ii)它们以Fab形式以高单体含量的可溶形式表达；和(iii)以IgG形式以高单体含量表达。
框架的选择要选择成优化获得以下抗体的机会：该抗体具备有利生物物理特性，并且没有源自未经历过体内突变的合成文库的抗体的缺点。如本文所示例，这种有利的、期望的生物物理特性例如包括较高的稳定性和低的聚集倾向。
对于六种最有利的VH/VL组合，L-CDR3和H-CDR3区分别被高度多样化的L-CDR3和H-CDR3文库盒(library cassette)替代，从而获得大于5×109个成员的总体文库大小。实施各自的限制性位点，以便能够进行L-CDR3和H-CDR3-文库盒插入。
此外，从特定种系序列中去除不利的翻译后修饰(PTM)位点，以进一步优化各个VH或VL基因以及相应的蛋白质的表达和生物物理特性。
重要的是，意识到用于治疗应用的抗体制剂中发生的翻译后修饰。PTM不一定发生在产生用于最初的体外表征的抗体样品中，而是PTM可能发生在高浓度和长期储存条件下的抗体样品中，而且也在体内发生。因此，PTM可以干扰抗体稳定性和/或同质性，并可能导致抗体功能性的丧失。PTM的实例包括但不限于氧化(Met、Trp、His)、脱酰胺(Asn、Gln)、异构化(Asp)或N-连接糖基化(Asn)。
本公开提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系VH1区和至少一个种系VL区的成员的文库。
一方面，本文提供的所述文库包括至少两个种系VH1区和至少两个种系VL区的成员。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VH1区中的至少一个的成员：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ IDNo.:1)和Vs635(SEQ ID No.:2)。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VH1区中的至少两个的成员：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ IDNo.:1)和Vs635(SEQ ID No.:2)。另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库还包括至少两个种系VL区的成员。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VL区中的至少一个：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)。在本公开的一个实施方式中，所述种系VL区选自以下种系VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VH区中的至少两个：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)和Vs635(SEQ ID No.:2)，并包括以下种系VL区中的至少两个：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括种系VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)和Vs635(SEQ IDNo.:2)，并包括以下种系VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系VH区Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)和Vs635(SEQ ID No.:2)中的至少一个，和以下种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)中的至少一个。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系VH区Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)和Vs635(SEQ ID No.:2)中的至少两个，和以下种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)中的至少两个。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系VH区：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)和Vs635(SEQ ID No.:2)，和以下种系VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中从种系VH区或种系VL区中的一个或多个中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)，并包括VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括：VH1区Vs618(SEQ IDNo.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VH1区中的至少两个的成员：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ IDNo.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)。另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库还包括至少两个种系VL区的成员。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VL区中的至少一个：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
在本公开的一个实施方式中，所述种系VL区选自以下种系VL区：Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VH区中的至少两个：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ IDNo.:2)，并包括以下种系VL区中的至少两个：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括种系VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ IDNo.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，和以下种系VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：以下种系VH区中的至少一个：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，和以下种系VL区中的至少一个：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ IDNo.:13)和Vs843(λ)(SEQID No.:15)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：以下种系VH区中的至少两个：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，和以下种系VL区中的至少两个：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ IDNo.:13)和Vs843(λ)(SEQID No.:15)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库由以下组成：种系VH区：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，和以下种系VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中从种系VH区或种系VL区中的一个或多个中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)，和VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下VH/VL组合中的一个或多个：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括本文公开的VH/VL组合中的一个或多个。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下VH/VL组合中的一个或多个：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQID No.:13)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下VH/VL组合中的一个或多个组成：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQID No.:13)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由本文公开的VH/VL组合中的一个或多个组成。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下VH/VL组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下VH/VL组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个组成：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由本文公开的VH/VL组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个组成。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下VH/VL组合中的一个或多个组成：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ IDNo.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下VH/VL组合中的一个或多个：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ IDNo.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下VH/VL组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个组成：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ IDNo.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下VH/VL组合中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个组成：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ IDNo.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ IDNo.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ IDNo.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少80％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区包括以下VH/VL组合中的一个或多个：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ IDNo.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少50％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下VH/VL组合中的一个或多个组成：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ IDNo.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
另一方面，本文提供合成犬抗体文库，其中至少80％的抗体或功能性片段包括可变重链和可变轻链组合，其中所述可变重链和可变轻链组合的框架区由以下VH/VL组合中的一个或多个组成：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ IDNo.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系VH1区和/或至少两个种系VL区的成员这样的文库，其中基本上所述文库的全部VH/VL组合以Fab形式高效地展示。
一方面，所述文库的所述VH/VL组合以Fab形式展示，展示率为至少0.5Fab/噬菌体。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系VH1区和/或至少两个种系VL区的成员这样的文库，其中基本上全部VH/VL组合以Fab形式在大肠杆菌中表达。在一实施方式中，以Fab形式在大肠杆菌中表达的所述VH/VL组合具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的单体含量。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系VH1区和/或至少两个种系VL区的成员这样的文库，其中基本上全部VH/VL组合以IgG形式在哺乳动物系统中表达。在一实施方式中，以IgG形式在哺乳动物系统中表达的所述VH/VL组合具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的单体含量。
一方面，本文提供合成犬抗体文库，优选包括至少一个种系VH1区和/或至少两个种系VL区的成员这样的文库，其中基本上全部VH/VL组合是热稳定的。
本公开还提供核酸分子的集合，该核酸分子编码所述合成犬抗体文库的抗体。
本公开还提供编码所述核酸分子的载体。
本公开还提供包括所述核酸分子或载体的重组宿主细胞。
本公开还提供分离对抗原具有特异性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使本公开的合成犬抗体文库与抗原接触；
(b)除去文库的不与抗原结合(或者对抗原不具有特异性)的成员；和
(c)回收文库的与抗原结合(或者对其具有特异性)的成员。
本公开还提供从前述文库或者根据前述方法分离的抗体。
附图说明
图1
41个犬VH基因的同一性表格分析显示比对中包括的序列的所有可能的序列对的距离值。示出序列对之间的距离分数(即，100减去同一性分数)。序列对之间的同一性分数是序列对之间的所有无缺口(ungapped)位置当中相同残基的百分比。
图2
29个犬Vκ基因的同一性表格分析显示比对中包括的序列的所有可能的序列对的距离值。示出序列对之间的距离分数(即，100减去同一性分数)。序列对之间的同一性分数是序列对之间的所有无缺口位置当中相同残基的百分比。
图3
86个犬Vλ基因的同一性表格分析显示比对中包括的序列的所有可能的序列对的距离值。示出序列对之间的距离分数(即，100减去同一性分数)。序列对之间的同一性分数是序列对之间的所有无缺口位置当中相同残基的百分比。
图4
VH/VL构建体子集(subset)的蛋白质印迹分析，以评价Fab-展示率。
图5
图4中所示印迹的密度测定法(Densiometric)分析，示出用于有效噬菌体展示的适当展示率(典型地，0.5-2Fab/噬菌体)。
图6
通过ELISA分析30种VH/VL组合在细菌细胞裂解物中的相对Fab表达，其中每个VH/VL对的表达水平相对于参考Fab对照的表达而测定。基本上所有测定的Fab VH/VL对均显示出对照的至少0.5的相对表达。λ克隆具有平均上最高的相对Fab表达水平。样品数编于表3中。
图7
30种VH/VL组合的Fab表达产量(示为柱状图；左轴)和单体含量(示为点状图；右轴)。样品数编于表3中。
图8
30种VH/VL组合的研究级IgG表达产量(示为柱状图；左轴)和单体含量(示为点状图；右轴)。样品数编于表3中。
图9
显示出包括相关的独特限制性位点的噬菌体展示载体pCaDis的基础部分。
图10
显示出包括相关的独特限制性位点的细菌Fab表达载体pCaBx的基础部分。
图11
高质量和正确性的犬抗体文库，如通过每文库组成预计的VH主基因分布所示。
图12
对于示例性轻链CDR，设计的氨基酸分布(左柱)与文库中对应位置处得到的氨基酸(右柱)相比较，证实了合成文库的精确的、正确的组成。
图13
～790万序列的MiSeq NGS质量控制之后，设计的CDR-H3长度分布(白色柱)与得到的CDR-H3长度分布(深色柱)相比较。
图14
Fab筛选结果的斑点印迹可视化。特异性结合eGFP的背景值之上的信号描绘于x-轴(直接ELISA)，Fab表达的结果显示于y-轴(Fab-捕获ELISA中背景值之上的信号)。点的形状示出各自的淘选子码(panning subcode)。
图15
对提纯的Fab形式的抗体进行滴定，并通过ELlSA在包被在Maxisorp板上的eGFP上用缀合有碱性磷酸酶(AP)(Sigma，SAB37000097)的兔抗-狗IgG F(ab)2-特异性检测抗体进行测试，包括了之前从HuCAL文库分离的抗-GFP抗体(MOR06391)作为参考。
图16
在标准固相ELISA中确认了针对eGFP的IgG反应性，其中用缀合有碱性磷酸酶(AP)(Sigma，SAB37000097)的兔抗-狗IgG F(ab)2-特异性检测抗体进行IgG与包被在Maxisorp板上的eGFP结合的检测，包括了之前从HuCAL文库分离的抗-GFP抗体(MOR06391)作为参考。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
在数值和范围的上下文中，术语“约”或“大约”是指近似或接近于所述的数值或范围，使得本发明可以如预期的那样进行，例如，具有所需的序列同源性的数目或百分比，这对于本领域技术人员从本文包含的教导是显而易见的。这至少部分是由于培养条件的变化和生物系统的可变性。因此，这些术语包括超出由系统误差产生者的值。这些术语明确了隐含的内容。
在本发明的概述和说明中在此列出的所有范围，均包括在其附近的或者在该范围的数字之间的的所有数字和数值。本发明的范围明确地命名和阐述了该范围中的所有整数、小数和分数值。术语“约”可以用于描述范围。
如本文所用，术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或其单链。天然存在的“抗体”是包括通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。每个重链包括重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。IgG、IgA或IgD抗体的重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE抗体的重链包括四个结构域CH1、CH2、CH3、CH4组成。每个轻链均包括轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成称作互补决定区(CDR)的高变区，其中散布有称作框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。构架区和CDR的范围已得以精确确定(参见Kabat,1991,J.Immunol.,147,915-920；Chothia&Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,1989,Nature 342:877-883；Al-Lazikani等人,1997,J.Mol.Biol.273:927-948)。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于定位和排列CDR，其主要负责与抗原的结合。
术语抗体的“抗原结合部分”或“片段”在本申请中等同使用。这些术语是指完整抗体的一个或多个片段，其保留了特异性结合给定抗原的能力。抗体的抗原结合功能可以通过完整抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包括在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)。优选的抗体的抗原结合部分或片段是Fab片段。
而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是可以使用重组方法通过人工的肽接头将它们连接起来，使其能够被制备成单一的蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(ScFv)；参见，例如，Bird等人,1988Science 242:423-426；和Huston等人,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这样的单链抗体包括抗体的一个或多个“抗原结合部分”。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选所述片段，以与完整抗体相同的方式使用所述片段。抗原结合部分也可以掺入单结构域抗体、巨型抗体(maxibody)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体(intrabodies)、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)、v-NAR和bis-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,2005,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136)。抗体的抗原结合部分可以被移植到基于多肽例如纤连蛋白III型(Fn3)的支架中(参见美国专利第6,703,199号，其描述了纤连蛋白多肽单抗体)。抗原结合部分可以掺入包括一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995Protein Eng.8(10):1057-1062；和美国专利第5,641,870号)。
如本文所用，术语“犬抗体”指具有其中框架区和CDR区二者都源自犬来源序列的可变区的抗体。例如，框架区和CDR区二者都可以源自犬来源序列。而且，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自这样的犬源序列，例如犬种系序列或者犬种系序列的突变形式。本发明的犬抗体可以包括并非由犬序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外的随机或定点诱变或者通过体内的体细胞突变引入的突变)。
术语“原初犬免疫组库(repertoire)”是指从来自犬免疫系统的未经历抗原的B细胞所分离的核酸的组库，其中编码抗体或其功能性片段的核酸没有经历过体细胞超变，因此认为其包含种系基因的核酸，并伴随V(D)J基因区段重排的发生。组库(repertoire)可以是个体或群体的组库。优选地，免疫组库从多个个体获得，以避免样品偏差。
术语“犬免疫组库”是指从来自犬免疫系统的B细胞所分离的核酸的组库。组库可以是个体或群体的，并且可以来自原初B细胞和/或经历过抗原的B细胞。优选地，免疫组库从多个个体获得，以避免样品偏差。
术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原结合特异性的其它抗体的抗体。然而，分离的特异性结合抗原的抗体可以具有与其他抗原的交叉反应性。而且，分离的抗体可以基本上不含其它的细胞材料和/或化学品。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如，IgM、IgE、IgA、IgG，如IgG1或IgG4)。在犬种，有四个IgG小类：IgG-A、IgG-B、IgG-C和IgG-D(L.M.Bergeron等人,Veterinary Immunology and Immunopathology 157(2014)31-41)。同种型还包括这些类别之一的修饰形式，其中修饰进行为改变Fc功能，例如，提高或降低效应子功能或与Fc受体的结合。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物对特定的表位表现出单一的结合特异性和亲和力。
术语“文库(library)”是指典型地包括大于103、大于104、大于105、大于106、大于107、大于108、大于109或甚至大于1010个成员的不同分子的集合。本发明上下文中的文库是异源性多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个成员具有单一的多肽或核酸序列。文库成员之间的序列差异是造成文库中存在多样性的原因。文库可以采取多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可以是用核酸文库转化的有机体或细胞的形式，例如细菌、病毒、噬菌体、动物或植物细胞。优选地，每个个体有机体或细胞仅含有一个或有限数量的文库成员。有利地，将核酸引入表达载体中，以便允许由核酸编码的多肽的表达。在某些方面，文库可以采取宿主有机体种群的形式，每个有机体含有一个或多个拷贝的表达载体，该表达载体含有核酸形式的文库的单个成员，其可以表达成产生其相应的多肽成员。因此，宿主有机体种群具有编码遗传多样性多肽变体的大型组库(large repertoire)的潜力。术语“集合”基本上与术语“文库”可互换使用。
抗体文库可以来源于免疫球蛋白或其片段，其偏向于免疫的动物或天然免疫的或受感染的人中存在的某些特异性。另外可选地，抗体文库可以来源于原初免疫球蛋白或其片段，即，不偏向于免疫系统中发现的特异性的免疫球蛋白。这样的文库被称为“无偏性(unbiased)”文库。在优选的实施方案中，本公开提供了无偏性抗体文库，即，不预先暴露于所关注抗原的文库。由于不存在任何偏向，这样的文库包括结合任何潜在的所关注靶抗原的抗体。
典型地，免疫抗体文库用通过基于PCR(或相关)的克隆技术从来源B细胞克隆的VH和VL基因库构建。以相同的方式，还可以产生无偏性原初抗体文库。但是，无偏性原初抗体文库还可以合成的方式产生，其中整个文库完全在体外构建。使用重组DNA技术，其可以用于模拟天然抗体库的天然偏向和丰度。这样的抗体文库被称作“合成”抗体文库。术语“全合成”文库是指完全即通过DNA合成(例如通过全基因合成、基于PCR的方法或相关的DNA技术)完全从头(de novo)构建的文库。在这样的文库中，从头构建整个DNA，即，编码CDR的部分以及编码围绕文库抗体的CDR的部分的部分(例如，框架区)。术语“合成”和“全合成”因此是指DNA的从头来源。相反，在“半合成”抗体文库中，文库抗体仅有部分是从头构建的，而其他部分例如某些CDR区源自于天然来源(对此存在有大量综述，参见，例如，Sidhu等人；Nat ChemBiol(2006),2,682-8)。在某些方面，本公开提供合成的犬抗体文库。在优选的方面，本公开提供全合成犬抗体文库。
术语“完全种系”是指抗体基因和基因片段通过生殖细胞从亲本传递至后代时它们的核苷酸序列。种系序列与编码成熟B细胞中的抗体(其在B细胞成熟过程中已通过重组和超变事件而改变)的核苷酸序列不同。术语“种系”是指完全种系序列，并额外地指已经用氨基酸序列中的微小突变修饰或改造的种系序列，例如，出于以下目的：去除不期望的翻译后修饰(PTM)位点、去除不期望的半胱氨酸、优化抗体(例如亲和力、半衰期)或引入期望的限制性位点，或由合成、扩增或克隆中的错误导致的修饰。
术语“翻译后修饰”或“PTM”是指在蛋白质生物合成期间或之后通常为酶促的蛋白质修饰。翻译后修饰可以发生在氨基酸侧链上，或者蛋白质的C-或N-端处。它们可以通过引入新的官能团如磷酸酯、乙酸酯、酰胺基或甲基来扩展20种标准氨基酸的化学组库。许多真核蛋白质还具有在称作糖基化的过程中与其连接的碳水化合物分子，其可以促进蛋白质的折叠，提高稳定性，以及起到调节功能。修饰发生在所谓的翻译后修饰位点(即，限定的氨基酸基序)处，其具体地包括N-连接的糖基化位点(NxS或NxT)或化学修饰，例如Asp切割(通常在DP处)、Asp异构化(DS、DG)、脱酰胺(NS、NG)。甲硫氨酸在暴露于溶剂时可以被氧化。修饰可以在体内(在血清中)或者在制剂缓冲液中储存时发生，并导致抗体结合的丧失。
术语“种系可变区”是指：
a)由种系基因编码的抗体或其功能片段的可变区的核酸序列或氨基酸序列；
b)由种系基因编码的抗体或其功能片段的可变区的核酸序列或氨基酸序列，其中核酸序列通过例如密码子优化、加入期望的限制位点、优化的GC含量、去除不期望的翻译后修饰(PTM)位点、去除不期望的mRNA剪接位点或去除mRNA不稳定基序加以修饰，或
c)由种系基因编码的抗体或其功能片段的可变区的核酸序列或氨基酸序列，但在氨基酸序列中具有微小突变例如，出于以下目的：去除不期望的翻译后修饰(PTM)位点、去除不期望的半胱氨酸或者引入期望的限制位点，或由合成、扩增或克隆中的错误导致的修饰。
在本公开的意义中，“种系可变区”是“种系VH区”或“种系VL区”。犬“种系可变区”的实例示于表1中。
术语“可变重链和可变轻链的组合”或“VH/VL组合”是指一个可变重链和一个可变轻链的组合(配对)。抗体及功能片段例如Fab包括至少一个与可变轻链结合的可变重链，其形成抗原结合区。
术语“核酸”在本文与术语“多核苷酸”可互换使用，是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。术语包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接键(其是合成的、天然的和非天然的)的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并以与参考核酸类似的方式被代谢。这些类似物的实例包括，不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另外指出，具体的核酸序列还隐含包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确示出的序列。具体地，如下文详述，通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第3位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，可以实现简并密码子置换(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。
如本文所用，术语“优化”是指核苷酸序列已经改变成使用生产细胞或有机体(通常是真核细胞，例如，毕赤酵母细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人细胞)中优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列改造成完全或尽可能地保留起始核苷酸序列(也称作“亲代”序列)原始编码的氨基酸序列。在此优化的序列已经改造成具有哺乳动物细胞中优选的密码子。但是，在此也预计其他真核细胞或原核细胞中这些序列的优化表达。优化的核苷酸序列表达的氨基酸序列也称作是优化的。
术语“氨基酸”是指天然的和合成的氨基酸，以及以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通常化学结构不同的结构、但以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的化合物。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。除非另外指出，具体的多肽序列还隐含包括其保守修饰的变体。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或百分比“同一性”是指两个或更多个相同的序列或子序列。如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量，在比较窗口或指定区域上比较和比对最大对应性时，如果两个序列具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上，或者当未指定时，在整个序列上，60％的同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或者更优选地存在于长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定另外可选的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
本文所用的术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如从人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从转化成表达啮齿类、人或犬抗体的宿主细胞例如从转染瘤分离的抗体，从重组、组合犬抗体文库分离的抗体，和通过涉及将犬免疫球蛋白基因的全部或一部分、序列剪接至其它DNA序列的任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组犬抗体具有可变区，其中框架和CDR区源自犬种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这些重组犬抗体可进行体外诱变(或者，当使用犬Ig序列转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下序列：其尽管源自犬种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可以并非天然存在于犬种系抗体组库中。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指其中已经引入重组表达载体的细胞。应当理解到，这些术语不仅指特定的受试细胞，还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在随后的世代中可能发生某些修饰，这样的后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
术语“载体”是指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够自主复制到它们所引入的宿主细胞中(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括这些其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其提供等同的功能。
“展示载体”包括具有指导重组DNA分子在用其转化的宿主细胞(例如细菌宿主细胞)中在染色体外复制和维持的能力的DNA序列。这些DNA序列是本领域公知的。展示载体可以是例如来源于fd、M13或fl丝状噬菌体类的噬菌体载体或噬菌粒载体。这些载体能够促进蛋白质包括例如结合蛋白或其片段在丝状噬菌体表面上的展示。适合于在噬菌体、核糖体、DNA、细菌细胞或真核细胞例如酵母或哺乳动物细胞上展示的展示载体也是本领域已知的，例如，病毒载体或编码嵌合蛋白质的载体。
“独特的”限制性位点是在指定的核酸分子上仅存在或出现一次的限制性位点。通常，这样的核酸分子是编码本发明文库成员的载体。
术语“依赖于位置的氨基酸使用”是指在多肽的指定位置处出现特定氨基酸序列的可能性。在本发明中，对于通过单独的种系基因分类的重排氨基酸序列，确定依赖于位置的氨基酸使用。这使得能够在其天然种系背景内单独、精确地设计CDR。
如本文所用，术语“基本上全部”是指其所指的组分或多或少是纯的。仅有少量或其它不同组分存在，其不限制或影响组分的有利特性。取决于组分的性质，基本上所有可以指该组分的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
如本文所用，术语“PTM-少”(“PTM-low”)是指已经在Kabat H-CDR1和/或H-CDR2内进行修饰以去除潜在的翻译后修饰(PTM)位点的抗体种系VH和/或VL氨基酸序列。优选地，框架区FR1、FR2、FR3和FR4中潜在的PTM基序不加以修饰。
重链、κ轻链和λ轻链的FR4的J区氨基酸序列分别为WGQGTLVTVSS(SEQ ID No.:37)、FGAGTKVELK(SEQ ID No.:38)和FGGGTQLTVL(SEQ ID No.:39)，如表2所示。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一个种系VH1区的成员。在其他方面，所述文库包括至少2个或至少3个或至少4个种系VH1区的成员。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)的优化变体。
在某些方面，所述种系VH1区以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQID No.:5)和Vs635(SEQ IDNo.:2)的种系VH1区相同。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，其中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618-PTM-少(SEQ ID No.:9)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)。
在某些方面，合成犬抗体文库是无偏性的。在某些方面，本文公开的合成犬抗体文库是全合成犬抗体文库。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括多于50％的天然犬VH组库。在其他方面，所述文库包括多于60％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％或多于95％的天然犬VH组库。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一个种系VL区的成员。
在其他方面，所述文库包括至少2个或至少3个或至少4个或至少5个种系VL区的成员。
在某些方面，所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(SEQ ID No.:15)。
在某些方面，所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(SEQ ID No.:15)的优化变体。
在某些方面，所述种系VL区以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(SEQ ID No.:15)的种系VL区相同。
在某些方面，所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(SEQ ID No.:15)，其中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
在某些方面，所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)、Vs843(λ)(SEQID No.:15)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括多于50％的天然犬VL组库。在其他方面，所述文库包括多于60％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％或多于95％的天然犬VL组库。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一个种系VH1区和至少一个种系VL区的成员。
在其他方面，所述文库包括至少2个或至少3个或至少4个种系VH1区和至少2个或至少3个或至少4个或至少5个种系VL区的成员。
在某些方面，所述种系VH1区和种系VL区中的一个或多个是种系VH1区或种系VL区的优化变体。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)，其中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
在某些方面，所述种系VH1区以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQID No.:5)和Vs635(SEQ IDNo.:2)的种系VH1区相同，并且所述种系VL区以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的种系VL区相同。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618-PTM-少(SEQ ID No.:9)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)，以及选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一个种系VH1区和至少一个种系VL区的VH/VL组合。
在其他方面，所述文库包括至少2个或至少3个或至少4个种系VH1区和至少2个或至少3个或至少4个或至少5个种系VL区的VH/VL组合。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，并且所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ ID No.:2)，并且所述种系VL区选自Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)，其中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
在某些方面，所述种系VH1区以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与选自Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs628(SEQ ID No.:5)、Vs624(SEQID No.:1)和Vs635(SEQ IDNo.:2)的种系VH1区相同，并且所述种系VL区以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的种系VL区相同。在某些方面，所述种系VH1区选自Vs618-PTM-少(SEQ ID No.:9)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)，以及选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQID No.:15)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括一个或多个选自以下的VH/VL组合：种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:1)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:2)和种系VL区Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)的VH/VL组合、种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:1)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、和种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:2)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ IDNo.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区VS236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、和VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
在本公开的某些方面，所述VH/VL组合包括以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与根据SEQ ID No.:4、SEQ ID No.:1、SEQ ID No.:2、SEQ ID No.:12、SEQ ID No.:16、SEQ ID No.:14、SEQ ID No.:15和SEQ ID No.:13的种系VH1区和/或种系VL区相同的种系VH1或种系VL区。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个选自以下的VH/VL组合：种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:1)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:2)和种系VL区Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)的VH/VL组合、种系VH1区Vs618(SEQID No.:4)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQ IDNo.:1)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、和种系VH1区Vs635(SEQ IDNo.:2)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其由至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个选自以下的VH/VL组合：种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQID No.:1)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs635(SEQ IDNo.:2)和种系VL区Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)的VH/VL组合、种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:1)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、和种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:2)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其由以下组成：种系VH1区Vs618(SEQID No.:4)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQ IDNo.:1)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:2)和种系VL区Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)的VH/VL组合、种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:1)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、和种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:2)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合。
在某些实施方式中，本公开提供合成犬抗体文库，其包括覆盖犬H-CDR3组库的多于50％的天然H-CDR3长度的H-CDR3。在其他方面，所述文库包括犬H-CDR3组库的多于60％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％或多于95％的天然H-CDR3长度。
在某些实施方式中，本公开提供合成犬抗体文库，其中文库的基本上全部成员的H-CDR3区的侧翼为独特的限制性位点。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其包括Kabat长度为5-16个氨基酸的H-CDR3。在其他方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括Kabat长度为5个氨基酸和/或6个氨基酸和/或7个氨基酸和/或8个氨基酸和/或9个氨基酸和/或10个氨基酸和/或11个氨基酸和/或12个氨基酸和/或13个氨基酸和/或14个氨基酸和/或15个氨基酸和/或16个氨基酸的H-CDR3。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其包括表4-15中所示的H-CDR3设计。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中H-CDR3区具有至少1.0*109的多样性。在其他方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中H-CDR3区具有至少1.0*1010、至少1.0*1011、至少1.0*1012或至少1.0*1013的多样性。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中文库的基本上全部成员的L-CDR3区的侧翼为独特的限制性位点。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括覆盖犬L-CDR3组库的多于80％的天然L-CDR3长度的L-CDR3。在其他方面，所述文库包括犬L-CDR3组库的多于85％、多于90％或多于95％的天然L-CDR3长度。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括长度为9个氨基酸的Vκ的KabatL-CDR3。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中文库的基本上全部Vκ成员的L-CDR3的Kabat长度为9个氨基酸。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括Kabat长度为10和/或11个氨基酸的Vλ的L-CDR3。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中文库的基本上全部Vλ成员的L-CDR3的长度为10和/或11个氨基酸。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括表16中所示的VκL-CDR3设计。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括表17-18中所示的VλL-CDR3设计。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中L-CDR3区具有至少1.0*104的多样性。在其他方面，本发明提供合成犬抗体文库，其中L-CDR3区具有至少1.0*105、至少1.0*106、至少1.0*107或至少1.0*108的多样性。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括表4-15中所示的H-CDR3设计和表16及表17-18中所示的L-CDR3设计。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合有效地在噬菌体颗粒上展示。
在再其他的方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少2个或至少3个种系VH区和至少2个或至少3个种系VL区，其中所述文库中包括的每个VH/VL组合均有效地展示。展示的效率可以通过如本文实施例2.6中所述的夹心式(sandwich)噬菌体ELISA测量。在其他方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少2个或至少3个种系VH区和至少2个或至少3个种系VL区，其中所述文库中包括的每个VH/VL组合均有效地展示，展示率为每噬菌体至少0.5Fab。在其他实施方式中，展示率为每噬菌体至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2、至少2.1、至少2.2、至少2.3、至少2.4、至少2.5、至少2.6、至少2.7、至少2.8、至少2.9、至少3.0、至少3.1、至少3.2、至少3.3、至少3.4、至少3.5、至少3.6、至少3.7、至少3.8、至少3.9或至少4Fab。
在再其他的方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少2个或至少3个种系VH区和至少2个或至少3个种系VL区，其中以Fab形式在大肠杆菌(E.coli)中表达的基本上全部VH/VL组合都具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的单体含量。在再其他的方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少2个或至少3个种系VH区和至少2个或至少3个种系VL区，其中所述文库中包括的每个VH/VL组合在大肠杆菌中以Fab形式表达，具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的单体含量。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在大肠杆菌中以Fab形式表达。在再其他的方面，其包括至少2个或至少3个种系VH区和至少2个或至少3个种系VL区，其中所述文库中包括的每个VH/VL组合在大肠杆菌中以Fab形式良好地表达。大肠杆菌中Fab形式的表达可以加以定量。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在细菌培养物中以多于1mg/L的水平表达。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在细菌培养物中以多于5mg/L的水平表达。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中大多数VH/VL组合在细菌培养物中以多于10mg/L的水平表达。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中至少2个、至少3个、至少4个或至少5个VH/VL组合在细菌培养物中以多于1mg/L的水平表达。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在哺乳动物系统中以IgG形式良好地表达。在再其他的方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少2个或至少3个种系VH区和至少2个或至少3个种系VL区，其中所述文库中包括的每个VH/VL组合在哺乳动物系统中以IgG形式良好地表达。哺乳动物系统中IgG形式的表达可以加以定量。在某些方面，所述哺乳动物系统是哺乳动物悬浮培养。在某些方面，所述哺乳动物系统是哺乳动物贴壁细胞培养。在某些方面，所述IgG形式是犬IgG-B形式。在其他方面，所述IgG形式是犬IgG-A、IgG-C或IgG-D形式。在某些方面，所述哺乳动物系统包括HKB11细胞。在其他方面，所述哺乳动物系统包括PERC.6细胞。在再其他方面，所述哺乳动物系统包括CHO细胞。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在哺乳动物系统中以IgG形式以多于5mg/L的水平表达。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在哺乳动物系统中以IgG形式以多于10mg/L的水平表达。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中大多数VH/VL组合在哺乳动物系统中以IgG形式以多于15mg/L的水平表达。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个VH/VL组合在哺乳动物系统中以IgG形式以多于20mg/L的水平表达。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库的全部或基本上全部成员在30％(v/v)浓度下异丙醇中是稳定的。假设稳定框架的全部CDR衍生物将会与所测试的VH/VL对行为类似。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中全部或基本上全部VH/VL组合是热稳定的。热稳定性可以如本申请中所述加以测量。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合具有大于62℃的Tm。在其他方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合具有大于64℃的Tm。在再其他方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合具有大于66℃的Tm。在再其他方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中大多数VH/VL组合具有大于68℃的Tm。在再其他方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中许多VH/VL组合具有大于70℃的Tm。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中全部或基本上全部VH1组合具有大于70℃的Tm。
在某些方面，本公开提供编码本文所公开文库的核酸分子的集合。
在某些方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，该文库包括至少一个种系VH1区和至少一个种系VL区的成员。在其他方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，其中所述文库包括至少2个或至少3个种系VH1区和至少2个或至少3个种系VL区的成员。在其他方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，其中所述文库包括至少2个或至少3个或至少4个种系VH1区和至少2个或至少3个或至少4个种系VL区的成员，并且其中编码所述种系VH1区的所述核酸分子选自Vs618(SEQ ID No.:22)、Vs624(SEQ ID No.:19)、Vs628(SEQ ID No.:23)和Vs635(SEQ IDNo.:20)，并且其中编码所述种系VL区的所述核酸分子选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)、Vs323(λ)(SEQ IDNo.:34)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)和Vs834(λ)(SEQ ID No.:33)。在某些方面，编码所述种系VH1区的所述核酸分子选自Vs618(SEQ IDNo.:22)、Vs624(SEQ IDNo.:19)、Vs628(SEQ ID No.:23)和Vs635(SEQ ID No.:20)，编码所述种系VL区的所述核酸分子选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:34)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)和Vs834(λ)(SEQ ID No.:33)，其中去除了翻译后修饰(PTM)位点。在某些方面，所述核酸分子选自Vs618-PTM-少(SEQ ID No.:22)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:24)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:28)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:25)，并且选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ IDNo.:36)、VS843(λ)(SEQ ID No.:33)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)。
在某些方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，该文库包括至少一个种系VH1区和至少一个种系VL区的VH/VL组合。在其他方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，该文库包括至少2个或至少3个或至少4个种系VH1区和至少2个或至少3个或至少4个或至少5个种系VL区的VH/VL组合。在某些方面，编码所述种系VH1区的所述核酸分子选自Vs618(SEQ ID No.:22)、Vs624(SEQ ID No.:19)和Vs635(SEQ IDNo.:20)，并且编码所述种系VL区的所述核酸分子选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:34)和Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)。在某些方面，编码所述种系VH1区的所述核酸分子选自Vs618(SEQ ID No.:22)、Vs624(SEQ ID No.:19)、Vs628(SEQ ID No.:23)和Vs635(SEQ ID No.:20)，并且编码所述种系VL区的所述核酸分子选自Vs236(κ)(SEQ IDNo.:30)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)、Vs323(λ)(SEQ IDNo.:34)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:33)，其中去除了翻译后修饰(PTM)位点。在某些方面，所述核酸分子选自Vs618-PTM-少(SEQ ID No.:22)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:24)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:25)，并且选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:36)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:33)。
在某些方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，该文库包括选自以下VH/VL组合的VH/VL组合，所述VH/VL组合由编码选自Vs618(SEQ ID No.:22)、Vs624(SEQ ID No.:19)、Vs628(SEQ ID No.:23)和Vs635(SEQ ID No.:20)的种系VH1区的核酸分子和编码选自Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)、Vs323(λ)(SEQ IDNo.:34)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:33)的种系VL区的核酸分子编码。在本公开的某些方面，编码合成犬抗体文库的所述核酸分子以至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同一性与选自Vs618(SEQ ID No.:22)、Vs624(SEQ ID No.:19)、Vs628(SEQ ID No.:23)或Vs635(SEQ ID No.:20)、Vs236(κ)(SEQ IDNo.:30)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:34)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)和/或Vs843(λ)(SEQ ID No.:33)的核酸分子相同。
在某些方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，该文库包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个由以下核酸分子编码的VH/VL组合：编码种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)的核酸分子、编码种系VH1区Vs624(SEQ IDNo.:19)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)的核酸分子、编码种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:20)和种系VL区Vs323(λ)(SEQ ID No.:34)的核酸分子、编码种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)的核酸分子、编码种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:19)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.31)的核酸分子、和编码种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:20)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)的核酸分子。在某些方面，核酸是编码以下的一个或多个核酸的优化变体：种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)、种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:19)、种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、种系VH1区Vs635(SEQ IDNo.:20)、种系VL区Vs323(λ)(SEQ ID No.:34)、种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)、种系VL区Vs365(λ)(SEQ IDNo.:31)、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:19)、种系VL区Vs365(λ)(SEQID No.:31)、种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:20)和/或种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)。在某些方面，核酸是编码以下的一个或多个核酸的“PTM-少”变体：种系VH1区Vs618(SEQ IDNo.:22)、种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:19)、种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)、种系VH1区Vs635(SEQ ID No.:20)、种系VL区Vs323(λ)(SEQID No.:34)、种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)、种系VL区Vs365(λ)(SEQ IDNo.:31)、种系VH1区Vs624(SEQ ID No.:19)、种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)、种系VH1区Vs635(SEQID No.:20)和/或种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)。
在某些方面，本公开提供编码合成犬抗体文库的核酸分子的集合，该文库包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个由以下的核酸分子编码的VH/VL组合：编码种系VH1区Vs618-PTM-少(SEQ ID No.:27)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)的核酸分子、编码种系VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:24)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:30)的核酸分子、编码种系VH1区Vs635-PTM-少(SEQ IDNo.:25)和种系VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:36)的核酸分子、编码种系VH1区Vs618-PTM-少(SEQ ID No.:27)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)的核酸分子、编码种系VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:24)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)的核酸分子、和编码VH1种系区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:25)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:31)的核酸分子、编码种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)和种系VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:33)的核酸分子、编码种系VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:24)和种系VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:33)的核酸分子、编码种系VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:25)和种系VL区Vs843(λ)(SEQID No.:33)的核酸分子、编码种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)和种系VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:36)的核酸分子、编码种系VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:24)和种系VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:36)的核酸分子、编码种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:22)和种系VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)的核酸分子、编码种系VH1区Vs624-PTM-少(SEQ IDNo.:24)和种系VL区Vs321(λ)(SEQ IDNo.:32)的核酸分子、编码种系VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:25)和种系VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:32)的核酸分子。
在某些方面，本公开提供编码本公开的实施方式中公开的核酸分子的载体。
在某些方面，本公开提供包含本公开的实施方式中公开的核酸分子的重组宿主细胞。
在一方面，本公开提供分离对抗原具有特异性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使根据本文公开的实施方式中任一项的文库与抗原接触；
(b)除去文库的不与抗原结合的那些成员；和
(c)回收文库的与抗原结合的那些成员。
在某些方面，本公开提供具备有利的生物物理特性的犬抗体。
这些抗体没有来源于未经历体内成熟的合成文库的抗体的缺点。这些有利的和期望的生物物理特性包括更高的稳定性、更高的表达水平和低聚集倾向。
在某些方面，本公开提供从本公开预期的犬文库分离的抗体。在某些方面，所述抗体可以是从本公开预期的犬文库分离的抗体的修饰或变异抗体。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一个以下种系VH1区的成员：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ IDNo.:2)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一个以下种系VL区的成员：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs834(λ)(SEQ ID No.15)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中从一个或多个种系VH区或种系VL区中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)；和VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs834(λ)(SEQ ID No.:15)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下VH/VL组合中的一个或多个：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ IDNo.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库的基本上全部VH/VL组合以至少0.5Fab/噬菌体的展示率有效地展示。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中当以Fab形式在大肠杆菌中表达时，基本上全部VH/VL组合具有至少85％的单体含量。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中当以IgG形式在哺乳动物系统中表达时，基本上全部VH/VL组合具有至少90％的单体含量。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中全部VH/VL组合是热稳定的。在某些方面，本公开提供编码前述文库的成员的核酸分子的集合。
在某些方面，本公开提供编码前述核酸分子的载体。
在某些方面，本公开提供包含前述核酸分子或前述载体的重组宿主细胞。
在某些方面，本公开提供分离对抗原具有特异性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使前述文库与抗原接触；
(b)除去文库的不与抗原结合的那些成员；和
(c)回收文库的与抗原结合的那些成员。
在某些方面，本公开提供从前述文库中分离或者通过前述方法分离的抗体。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括选自VH1的种系VH区的成员。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一种以下VH1区的成员：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括选自κV-III、λV-I和λV-III的种系VL区的成员。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括至少一个以下VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)；和VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其包括选自以下的VH/VL组合：种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和种系VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、种系VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、和VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和种系VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ IDNo.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合以及VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括覆盖犬H-CDR3组库的多于50％的天然H-CDR3长度的H-CDR3。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库包括Kabat长度为5-16个氨基酸的H-CDR3。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库具有表4-15中所示的H-CDR3设计。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库在H-CDR3区中具有至少5E+09的多样性。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中文库的L-CDR3的Kabat长度为8个氨基酸(κ)，并且Kabat长度为10和11个氨基酸(λ)。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库具有表16和表17-18中所示的L-CDR3设计。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库在L-CDR3区中具有至少1E+04的多样性。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库的基本上全部VH/VL组合有效地展示。
在某些方面中，本公开提供合成犬抗体文库，其中所述文库的基本上全部VH/VL组合有效地展示，展示率为至少0.5Fab/噬菌体。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在大肠杆菌中以Fab形式表达。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中以Fab形式在大肠杆菌中表达的基本上全部VH/VL组合都具有至少85％的单体含量。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中基本上全部VH/VL组合在哺乳动物系统中以IgG形式表达。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中以IgG形式在哺乳动物系统中表达的基本上全部VH/VL组合都具有至少90％的单体含量。
在某些方面，本公开提供合成犬抗体文库，其中全部VH/VL组合是热稳定的。
在某些方面，本公开提供合成全抗体文库，其中文库的基本上全部成员的H-CDR3区的侧翼为独特的限制性位点。
在某些方面，本公开提供合成全抗体文库，其中文库的基本上全部成员的L-CDR3区的侧翼为独特的限制性位点。
在某些方面，本公开提供合成全抗体文库，其中所述文库是无偏性文库。
表1：
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表2
表3
实施例
实施例1：生成合成犬抗体文库
本公开提供包括犬免疫组库中存在的犬VH和VL基因对的抗体候选物的集合或文库，其中每个成员包括种系基因序列，或修饰的种系序列(称作“PTM-少”)以去除不利的翻译后修饰(PTM)位点，从而进一步优化抗体的表达和生物物理特性。选择用于引入文库的VH和VL对包括有利的生物物理特性，其增加了选自文库的每个抗体都将方便地开发的可能性。为了确定文库的组成，必须对多个标准进行评估。以下实施例描述了所评估的标准、评估方法和结果。
实施例1.1：候选VL-和VH-种系序列的选择
第一步，从文献中鉴定来自犬免疫组库的主要VH和VL种系基因(Bao等人.VetImmunol Immunopathol.2010Sep 15；137(1-2):64-75；Steiniger等人.MolImmunol.2014May；59(1):71-8)，并分析可获自以下文献的重排犬抗体序列：Bao等人(VetImmunol Immunopathol.2010Sep；137(1-2):64-75)；Braganza等人(Vet ImmunolImmunopathol.2011Jan；139(1):27-40)；Vgenerepertoire.org和AbYsis(http://www.bioinf.org.uk/abysis2.7/index.html)。总共分析了多于300个重排的犬VH、＞100Vκ和＞150Vλ序列。由于已经认识到，对于有效的抗原-抗体相互作用，宽泛的构象空间可能是有益的，因此在最终选择中注意包括结构不同的序列。因此，在第二步中，通过距离分析鉴定来自犬种系组库的结构上多样的VH和VL(Vκ和Vλ)基因。结果示于图1、图2和3中。
分别使用CDR-H3(WGGDGFYAMDY)(SEQ ID No.:43)和hu4D5-8抗体的κCDR-L3(QQHYTTPPT)(SEQ ID No.:44)和λ-样CDR-L3(QSYDSSLSGVV)(SEQ ID No.:45)序列和犬JH、Jκ和Jλ种系蛋白质序列(参见表2)，通过GeneArt合成具有侧翼限制性酶位点的V区。通过GeneArt，进行相对于大肠杆菌表达的密码子使用优化(避免罕见的人密码子)、避免GC含量非常高(>80％)或非常低(<30％)的区、去除潜在的cis-作用序列基序例如RNA不稳定性基序和隐蔽性剪接供体和受体位点。合成的Ig V区重链基因覆盖了从含有Mfel的独特5'限制性位点的第一氨基酸(EVQL)(SEQ ID No.:46)到位于V-C区边界处的Xhol的独特3'限制性位点的完整序列。在CDR-H3的上游，引入BssHII的限制性位点，以便能够进行随后的CDR-H3文库插入。Ig Vκ和Vλ区轻链基因序列的范围是从位于修饰的ompA前导序列中的NdeI的第一独特5'限制性位点到框架区(FR4)中的Acc65l/Kpnl的3'限制性位点。在CDR-L3的上游，引入BbsI的限制性位点，以便能够进行随后的CDR-L3文库插入。然后从5个所选择的VH、4个Vλ和2个Vκ基因，组合VH/VL基因对，产生30个VH/VL组合。使用标准分子生物学方法，将5个VH区构建体(构建体A-E)与2个Vκ区构建体(#1-#2)或4个Vλ区构建体(#3-#6)一起克隆到噬菌体展示载体pCaDis18(gIII-Fab遗传融合)(参见图9)和细菌Fab表达载体pCaBx_FH(参见图10)。所有保留的组合都进行了序列验证。最后，实验比较这30个VH/VL对，以识别具有有利生物物理性质的VH/VL基因对的亚组。至少评价以下特性：1)计算机(in silico)分析：a)CDR1+CDR2长度；b)翻译后修饰基序(PTM)；c)CDR中甲硫氨酸的存在；d)半胱氨酸的存在；2)Fab展示率；3)Fab和IgG表达率和产量；4)Fab和IgG单体含量。
实施例1.2：犬H-CDR3的设计
抗体和抗原之间最紧密接触的位点是抗体的互补决定区(CDR)。H-CDR3和L-CDR3在抗原结合中起主要作用，因此主要将变化性引入这两个CDR中。对于所有其它CDR，均使用种系序列或去除了PTM基序的修饰种系序列。
在CDR3的设计中通常要避免半胱氨酸残基，因为半胱氨酸残基可参与形成将结合物与淘选靶标共价连接的二硫键，或者参与形成抗体同二聚体。这样的结合物不太会是靶标选择性的。
对重排的抗体序列进行汇编，并分析H-CDR3和L-CDR3用于设计犬CDR3。对所有重排序列均进行H-CDR3的分析，而不考虑VH种系家族，因为H-CDR3通过D-和J-区段不依赖于VH而编码。
我们的氨基酸分布分析证实，如所述，犬VH CDR3中最常见的氨基酸基序是IMGT位置104-106(Chothia位置92-94)处的CAR/CAK，对于位置IMGT 115-117(Chothia位置100x-94)是FDY基序(Steiniger Molecular Immunology 59(2014)71-78)。
观察到的氨基酸分布是略有修饰的，以完成文库中长度为5-16个氨基酸的H-CDR3的设计(参见表4-15)，例如，通过完全避免半胱氨酸、减少色氨酸的使用和避免糖基化位点(NxS，NxT)。
表4
表5
表6
表7
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表8
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表9
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表10
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表11
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表12
表13
表14
表15
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实施例1.3：L-CDR3的设计
对所有重排序列均进行L-CDR3的分析，而不考虑VL种系家族，因为L-CDR3部分地通过J-区段不依赖于种系而编码。
基于对犬重排Vκ序列的分析，发现9个氨基酸的Kabat L-CDR3长度出现在所有Vκ序列的约85％中。因此，文库中Vκ区的Kabat L-CDR3的长度设定为9个氨基酸的长度(参见表16)。对于Vλ序列，最常见的Kabat L-CDR3长度是11aa(60％)，然后是10aa(30％)。因此，文库中Vλ区的Kabat L-CDR3的长度设定为10和11个氨基酸的长度(参见表17和表18)。观察到的氨基酸分布是略有修饰的，以完成文库中L-CDR3的设计，例如，通过完全避免半胱氨酸和避免糖基化位点(NxS，NxT)。
表16
| L＝9aa | mix K9 | mix K2 | mix K3 | mix K4 | mix K5 | mix K6 | mix K7 | mix K8 | |
| pos | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 |
| D | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| E | 0 | 0 | 0 | 5 | 0 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| K | 0 | 0 | 0 | 5 | 5 | 0 | 0 | 4 | 0 |
| R | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 | 5 | 0 | 10 | 0 |
| H | 2.5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 2.5 | 0 | 4 | 0 |
| T | 0 | 0 | 5 | 25 | 5 | 10 | 2 | 0 | 100 |
| S | 0 | 0 | 12.5 | 5 | 15 | 10 | 2 | 4 | 0 |
| N | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Q | 70 | 95 | 0 | 0 | 30 | 0 | 0 | 4 | 0 |
| G | 27.5 | 0 | 25 | 5 | 5 | 5 | 0 | 4 | 0 |
| A | 0 | 0 | 12.5 | 5 | 5 | 5 | 0 | 0 | 0 |
| C | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| P | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 5 | 94 | 20 | 0 |
| V | 0 | 0 | 5 | 5 | 0 | 5 | 0 | 5 | 0 |
| I | 0 | 0 | 5 | 10 | 5 | 5 | 0 | 5 | 0 |
| L | 0 | 0 | 5 | 10 | 5 | 5 | 2 | 5 | 0 |
| M | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| F | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 | 20 | 0 | 10 | 0 |
| Y | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 | 10 | 0 | 15 | 0 |
| W | 0 | 0 | 5 | 5 | 5 | 2.5 | 0 | 10 | 0 |
| 合计 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| #aa | 3 | 2 | 13 | 14 | 14 | 15 | 4 | 13 | 1 |
表17
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表18
实施例1.4：犬文库的多样化
本研究中产生的犬抗体文库包括多样化的L-CDR3和H-CDR3区。CDR3文库盒通过Slonomics技术产生，该技术允许仅将所需的密码子控制并入CDR3盒中，防止半胱氨酸密码子和终止密码子的引入(Van den Brulle等人.Biotechniques.2008Sep；45(3):340-3)。文库生成后对未经选择的克隆的测序表明，L-CDR3和H-CDR3盒的不期望的DNA突变、缺失、插入和移码的总发生率低。
我们推论VH和VL-结构域的生物化学和生物物理特性也分别取决于它们的H-CDR3和L-CDR3序列，因此我们决定将一个特定的H-CDR3、κL-CDR3和λL-CDR3序列分别引入所选的犬VH、Vκ和Vλ基因中，以便进行VH/VL比较。H-CDR3(WGGDGFYAMDY)(SEQ ID No.:43)和κL-CDR3序列(QQHYTTPPT)(SEQ ID No.:44)来源于抗体hu4D5-8(Carter等人,Proc Natl AcadSci USA1992；89:4285-9)；并且使用λ-样L-CDR-3(QSYDSSLSGVV)(SEQ ID No.:45)，其以前均已应用于人主基因的评价(Knappik等人,2000,J Mol Biol 296,57-86；Ewert等人,JMol Biol 2003；325:531-53)。
实施例1.5展示和表达载体
加以以下改良，使用pMORPH18(Rauchenberger等人.J Biol Chem.2003Oct 3,278(40):38194-205)和pMORPHx30(Prassler等人.J Mol Biol.2011Oct 14；413(1):261-78)载体作为模版，分别用于生成新的Fab展示pCaDis18和Fab表达载体pCaBx。对于两种载体，将Ig轻链编码序列上游的ompA前导序列在其C-端进行修饰，以分别引入限制性位点Ndel，以确保VL和VH蛋白质序列的真实N-端，并允许将Fab片段方便地亚克隆到pCaMx IgG载体中。另外，构建了哺乳动物IgG表达载体组。通过GeneArt(智人(H.sapiens)密码子优化)合成犬IgG CH1和Cλ&Cκ序列。将CH构建体克隆到含有Kan填充片段(pCaMx_Stuffer)的pM4_Vector中。将两个密码子优化的Cλ和Cκ序列克隆到通用的Geneart载体中。(pMA-T_CaMinκpMA-T_CaMinλ)。使用本领域分子生物学方法进行IgG转化。
实施例2.犬VH/VL对的生物物理表征
以下实施例描述了犬VH/VL对的生物物理表征的方法和结果。
实施例2.1噬菌体制备
将实施例1.1中合成的抗体组合克隆到Fab展示载体pCaDis中用于功能测试。载体含有5个VH和6个VL主基因的组合，其产生30种可能的组合。通过用2xYT/Cam/1％葡萄糖培养基填充每个孔并用将其用30种产生的抗体构建体的单个克隆接种，产生母板(masterplate)。将板在摇动的同时在37℃下培养过夜。次日，将母板储存在终浓度15％甘油中，并冷冻于-80℃下。对于噬菌体制备，将2xYT/Cam/1％葡萄糖用来自母板的甘油储液接种，并在以400rpm摇动的同时孵育，直至达到0.5的OD600 nm。然后将细胞用VCSM 13辅助噬菌体感染，并在没有摇动的情况下在37°x下孵育30min，然后在以400rpm摇动的同时再孵育30min。将细菌离心，并再悬浮在含有34μg/ml氯霉素、50μg/ml卡那霉素和0.25mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的2xYT培养基(2xYT/Cam/Kan/IPTG)中，并在22℃下再孵育18-20h，用于产生噬菌体。将含有Fab-呈递噬菌体的上清液转移到新的试管中，并将噬菌体用1/5倍上清液体积的PEG/NaCl(20％ PEG 6000，ddH2O中2.5MNaCl)沉淀。离心并除去上清液后，将噬菌体沉淀再悬浮在无菌PBS中。通过OD268 nm处的吸光度测量(Nanodrop，peqlab)，确定噬菌体滴度，并通过将感染的大肠杆菌TG1F+细胞在LB/Cam/Gluc板上的有限稀释铺板加以证实。
实施例2.2通过蛋白质印迹的Fab噬菌体展示率
使用蛋白质印迹技术，将如实施例2.1中制备的噬菌体上清液用于测定噬菌体颗粒上的Fab展示率。
将总体积为10μl的约1E+09噬菌体与4x LDS负载染料混合，并在80℃下加热10分钟。将凝胶(NUPAGE 4-12％ Bis-Tris-Gel，1.0mm×12孔，Novex，Cat.NP0322Box)置于电泳槽中，并将电泳槽用1x MES电泳缓冲液(由NUPAGE MESSDS电泳缓冲液，20x，Invitrogen制备)填充。将样品和标志物负载在凝胶上，在200V下进行35分钟电泳。取出凝胶，用ddH2O洗涤，并用iBIot孔将蛋白质转移到蛋白质印迹膜上。随后，在室温下将膜用TBS-T中的10％乳粉封闭1.5h。将膜用TBS-T快速洗涤，并与抗-pIII抗体(小鼠抗-pIII，MoBiTec，Cat.:PSKAN3；TBS-T中1:1000，3％ MP)一起在室温下孵育1h。在3×5分钟的洗涤步骤后，将膜与抗小鼠IgG-HRP(抗小鼠IgG-HRP(P9)，Jackson Immuno Research，Code 115-036-062；TBS-T中1:10'000，3％MP)一起在室温下孵育1h。加入HRP-底物(Immobilon WesternChemiluminescent HRP Substrate，Millipore，Cat.WBKLS0500)后，将膜用TBS-T洗涤3x5min，并用Biorad Imager记录化学发光(程序：“印迹比色法”，以显示蛋白质标志物；“印迹化学”，以显示HRP检测)。在抗-pIII蛋白质印迹法中，测定pIII(fl)和pIII(ct)-Fd的相对量。结果如图4所示。
库成员在噬菌体颗粒上的有效展示是成功的噬菌体展示选择的前提。我们使用蛋白质印迹法确定Fab形式的犬VH/VL组合的展示效率。我们的数据表明，基本上全部所测试的犬VH/VL组合均展示在噬菌体上。结果如图5所示。
实施例2.3相对Fab表达ELISA
将克隆到pCaBx中的30个VH/VL组合的克隆接种在生长培养基(2x YT/Cam/IPTG/0.1％葡萄糖)中，并在37℃下以400rpm摇动孵育～3h，直至培养物变得略混浊。随后，将培养物在22℃下摇动孵育过夜，然后使用BEL缓冲液(24.7mg/ml硼酸，18.7mg/ml NaCl，1.48mg/ml EDTA，2.5mg/ml溶菌酶，pH用10M NaOH调节至8.0)将细胞裂解，并用PBS中10％乳粉封闭。使用抗-犬F(ab')2片段特异性捕获抗体(未缀合的兔抗-狗IgG Fab'2抗体；Lifespan Biosciences，LS-C69729)和AP-缀合的抗-狗IgG F(ab')2片段检测抗体(山羊抗-狗IgG(H+L)-碱性磷酸酶抗体，Sigma SAB3700097)，用AttoPhos(Roche)通过ELISA测定Fab表达。通过将各个Fab VH/VL对的信号除以参考人/犬嵌合抗体的信号，计算相对Fab表达水平。所测试的Fab VH/VL对中多于85％显示出对照的至少0.5的相对表达。λ克隆平均起来具有最高的相对Fab相对表达水平。结果如图6所示。
实施例2.4His-标签的Fab片段的探索性规模制造
由细菌表达载体编码的Fab片段在大肠杆菌TG1 F-细胞中的表达在摇瓶培养物中使用500mL补充有0.1％葡萄糖和34μg/mL氯霉素的2xYT培养基进行。摇动培养物，直至OD600达到0.5的数值。通过加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导Fab表达，并进一步培养20h。收获细胞，并将其用溶菌酶破坏。将His6-标签(SEQ ID No.:47)的Fab片段经由IMAC(Bio-Rad)分离，并用咪唑洗脱。使用“PD10”柱(GE Healthcare)将缓冲液交换成1xDulbecco's PBS(pH 7.2)。将样品无菌过滤(0.2μm)。蛋白质浓度通过UV-分光光度法测定。样品的纯度在变性、非还原性15％SDS-PAGE中分析。代表30个犬VH/VL对中每一个的提纯Fab片段的％单体通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定。SEC在Purifier系统(GEHealthcare Europe GmbH，Freiburg，德国)上进行。为进行分离，使用Superdex75 HR 10/30柱(GE Healthcare Europe GmbH，Freiburg，德国)。对于每个样品，将各个10μl蛋白质样品装载到柱上，在0.05ml/min的流速下进行分离，并记录分析在260nm和280nm处的UV吸收。电泳缓冲液由pH 7.4的Gibco D-PBS(Invitrogen，Paisley，美国)组成。结果如图7所示。
如图6和图7所示，所有测试的犬VH/VL组合均在大肠杆菌中得以表达，提纯Fab的表达率范围为0.2mg/L至8mg/L细菌培养物(条状图，左y轴)。而且，对分离材料的表征反映出，大多数提纯的犬Fab VH/VL的单体形式高于85％。这表明使用该文库开发犬抗体是有用的。
实施例2.5IgG的探索性规模制造和单体含量的测定
将真核HKB11细胞用编码IgG的重链和轻链的pCaMx哺乳动物表达载体DNA转染。转染后第3天或第6天，收获细胞培养上清液，并进行标准蛋白质A亲和力色谱(MabSelectSURE，GE Healthcare)。将缓冲液交换成1x Dulbcecco's PBS(pH 7.2)，并无菌过滤样品(孔径为0.2μm)。
蛋白质浓度通过UV-分光光度法测定，IgG的纯度在变性还原性和非还原性条件下使用CE-SDS(LabChip GXII,Perkin Elmer)分析。代表30个犬VH/VL对中每一个的提纯IgG1片段的％单体通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定。HP-SEC在结合Wyatt miniDAWN Treos和Wyatt Optilab rEX(Wyatt Technology Europe，Dernbach，德国)的Dionex UltiMate3000Titanium HPLC系统(Dionex Corporation，Germering，德国)上进行。分离使用TosohTSK-Gel G3000SWxl柱(Tosoh Bioscience，Stuttgart，德国)。对于每个样品，将15μg蛋白质装柱，以0.5ml/min的流速进行分离，记录分析280nm处的UV吸收。运行缓冲液由pH 7.4的Gibco D-PBS(Invitrogen，Paisley，USA)组成。结果示于图8中(点状图，右Y-轴)。具有充分表达率的构建体表现出优异的单体含量>95％。对于用作用于文库克隆和CDR3多样化基础的VH/VL组合的选择，Fab以及IgG二者的产生数据均考虑在内。
实施例2.6相对Fab噬菌体展示率ELISA
使用经由主要衣壳蛋白pVIII捕获噬菌体的抗-M13抗体(Amersham)和结合所展示的Fab的抗-Fd抗体(The Binding Site)，通过ELISA测定M13噬菌体上的Fab展示。用抗-M13过氧化物酶缀合物(Amersham)和QuantaBluTM(Pierce)对噬菌体上清液和参考样品的适当稀释物进行检测。通过将抗Fd滴度除以抗M13的滴度，计算每个样品的相对展示率。滴度获自参考噬菌体制剂的校正曲线。
实施例2.7Fab温度稳定性ELISA
将细菌裂解物的适当稀释物暴露于不同的温度(0℃、60℃、70℃和80℃)45min。使用抗-6xHis(SEQ ID No.:47)捕获抗体(R&DSystems)和AP-标记的抗-犬Ig检测抗体，用AttoPhos(Roche)通过ELISA检测完整的Fab分子。
实施例2.8提纯IgG热稳定性测定
IgG热稳定性通过差示扫描荧光法(DSF)测定。DSF是监测所关注蛋白质的热诱导解折叠(熔点)的基于荧光染料的技术。随着温度的变化监测与解折叠蛋白质的疏水性氨基酸侧链相互作用的疏水性染料的荧光变化。使用以下材料：Sypro橙色荧光染料(Sigma，#S5692)；iCycler iQ PCR板，96-孔(Biorad，#2239441)；Microseal B粘附性密封剂(Biorad#MSB-1001)；96-孔光学垫(Biorad，#ADR3296)；和iCycler iQ5热循环仪(Biorad)。将稀释的Sypro橙加入到96孔iCycler iQ PCR板的每孔中，样品在至少0.1mg/ml的终浓度下测试。以60℃/h的加热速率将温度从20℃扫描至95℃，通过分析荧光转变的中点计算解折叠温度。
实施例2.9.等电点(pI)的计算
计算每个IgG的等电点。蛋白质的pI测定方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用以下工具：http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html；Vector NTI(Invitrogen，Carlsbad，California)。
实施例3.抗体的选择和表征
为了确认文库设计的有效性，针对各种抗原对文库进行测试。然后，以Fab和IgG两种形式测试所选抗体开发性特性，例如：a)Fab展示率；b)Fab表达量；c)Fab热稳定性；d)Fab血清稳定性；e)Fab SEC％单体；f)IgG表达量；g)IgG热稳定性；h)IgG血清稳定性；i)IgGSEC％单体；j)IgG等电点(pI)；k)暴露于酸之前和之后使用差示扫描荧光法测定Fab或IgG形式的热稳定性；I)暴露于酸之前和之后Fab或IgG形式的吸收；m)暴露于酸之前和之后通过动态光散射测量分子半径和％多分散性；和/或n)Fab或IgG形式的颗粒染色。此外，测定了Fab形式的抗原亲和力。
实施例3.1噬菌体制备
展示各个Fab形式的VH/VL对的噬菌体如下制备。对于每个文库噬菌体制剂，将80ml 2x YT/Cam/Glc培养基用来自相应的文库甘油储液的细菌接种，导致OD600nm为0.2-0.3。培养物在37℃下以120rpm摇动30-90min，直至OD600nm达到0.45-0.55。然后以10的感染复数将辅助噬菌体加入细菌培养物中，接着在37℃下在不摇动的情况下孵育45min，然后在37℃下在120rpm下摇动孵育45min。将细菌离心下来，弃去含有辅助噬菌体的上清液。将噬菌体感染的细菌再悬浮在400ml 2x YT/Cam/Kan/IPTG培养基中，并在22℃下在120rpm下摇动培养过夜。次日，使来自过夜培养物的细菌沉淀，收集含有Fab-呈递噬菌体的上清液。通过将1/5总体积经预冷却的PEG/NaCl加入到含有噬菌体的上清液中，进行噬菌体沉淀。将样品在冰上孵育至少30分钟，直至沉淀噬菌体的云状物(clouds)变得可见。将沉淀的噬菌体离心下来，并再悬浮在20ml PBS中。缓慢旋转样品，以获得均匀的悬浮液，使残余的细菌碎片沉淀，并将其弃去。使用PEG/NaCl再次从含有噬菌体的上清液中沉淀出噬菌体。最后，将噬菌体沉淀再悬浮在PBS中，将其转移至无菌管中，并缓慢摇动，以获得均匀的悬浮液。通过斑点滴定和ELISA确定噬菌体滴度。对于每个单独的噬菌体制剂，通过ELISA和/或蛋白质印迹，评价噬菌体滴度和通过展示载体pCaDis(示于图9)表达、并呈递在噬菌体上的Fab片段的展示水平(参见实施例2.6)。对于ELISA，使用了两种不同的抗体用于捕获：(1)使用抗-M13抗体(Amersham#27-9420-01)，因为它经由主要衣壳蛋白g8p捕获噬菌体颗粒；因此，噬菌体滴度得以测定。(2)使用抗-犬-Fab'2(LS Bio，#LS-C69729)，它与展示的Fab结合；因此，仅捕获展示Fab的噬菌体。对于(1)和(2)，使用单独的参考曲线。使用与HRP缀合的单克隆抗-M13(针对M13噬菌体的主要衣壳蛋白g8p)作为检测抗体。ELISA数据的评价如下完成：生成校正曲线，并计算噬菌体上清液和对照的滴度。对于每个样品，将抗-Fd的滴度除以抗-M13(抗-pVIII)的滴度，所得的比值即为相对展示率。
实施例3.2.抗体选择
噬菌体展示选择可以如下所述进行，或者通过本领域技术人员已知的其他方法进行。例如，进行并行淘选策略(例如，溶液淘选、Fc捕获淘选、直接固相淘选)，以便使得识别具有所需生物物理特征的多样性结合抗体的机会得以最大化。可以选择许多种可溶性蛋白质作为用于文库验证的模型抗原(例如，溶菌酶)。在基于珠的溶液淘选中使用经由与羧酸基形成酰胺键而与磁性Dynabeads共价偶联的抗原，进行针对模型抗原的收集筛选(Dynal/lnvitrogen Prod.no.143.06)，如下文所述。针对模型抗原的选择也可用下文所述的Fc捕获淘选策略进行。
实施例3.2.1.基于珠的溶液淘选
将模型抗原和对照BSA包被的羧基-珠(Dynal)用PBS中5％乳粉+0,1％ Tween20在室温(RT)下封闭2h，之后在RT下与预吸附的噬菌体一起孵育2h。若干洗涤步骤之后，将结合的噬菌体洗脱，并通过感染TG1F+细胞扩增，用于下一轮选择。3轮选择后，将pCaDis(示于图9)噬菌粒DNA分离，并将Fab编码片段通过用XbaI和EcoRI限制性消化进行剪切，连接到表达载体pCaBx(示于图10)中，并转化到大肠杆菌TG1 F-中。然后将感染的培养物在大的LB/Cam/Gluc板上铺板，并使其在34℃下生长。分离单个克隆，并通过ELISA测试Fab表达量和抗原结合。通过将含有Fab的细胞提取物在兔抗-狗IgG F(ab)'2抗体(Life Biosciences，LS-C69729)包被的ELISA板上孵育，然后用羊抗-狗IgG(H+L)碱性磷酸酶抗体(Sigma，SAB37000097)检测，从而对Fab表达进行检测。例如，通过用基于珠的检验(AppliedBiosystems 8200细胞检测系统/PE Biosystems)的荧光微量检验技术在模型抗原偶联的羧基珠和BSA偶联的羧基珠(Dynal)上筛选含有Fab的细胞提取物，从而对抗原特异性进行测试。初级命中物(primary hits)定义成产生高于背景(其值设定成200)至少5倍的FMAT平均荧光信号的Fab。以模型抗原作为同源抗原，以无关抗原为阴性对照抗原，在二次ELISA中确认了对模型抗原的特异性。对于每个测试的子文库、子文库-混合或总文库，挑选约50-100个克隆用于重链和轻链CDR3区的测序，以估计模型抗原结合抗体的序列多样性。测序结果显示，构建的文库含有模型抗原结合体的多样性组库。ELISA结合表征显示，分离的抗体对所关注的同源模型抗原是高度特异性的，与无关对照抗原没有交叉反应性，证明了文库用于生物医学研究和产生高度特异性治疗性抗体的可用性。
实施例3.2.2.Fc-捕获淘选
使用通过以羊抗人-IgG Fc特异性(Jackson；Cat.109-005-098)或小鼠抗-人-IgGFc特异性(Jackson；Cat.209-005-098)在Maxisorp板(Nunc)上固定化的重组人Fc-标签模型蛋白质，进行3轮固相Fc-捕获淘选。在每轮选择之前，将噬菌体用PBS中0.1mg/ml人、山羊和小鼠免疫球蛋白/5％乳、/5％ BSA/0.1％Tween在RT下封闭2h。若干洗涤步骤之后，将结合的噬菌体洗脱，并通过感染TG1F+细胞扩增，用于下一轮选择。3轮选择后，将pCaDis(示于图9)噬菌粒DNA分离，并将Fab编码片段通过用XbaI和EcoRI限制性消化剪切，连接到表达载体pCaBx(示于图10)中，并转化到TG1F-中。然后将感染的培养物在大的LB/Cam/Gluc板上铺板，并使其在34℃下生长。分离单个克隆，并通过ELISA测试Fab表达量和抗原结合。Fab表达如上所述进行检测。使用含有Fab的细胞提取物在经由包被在MaxiSorp板上的山羊抗-人IgG抗体(Jackson；Cat.109-005-098)捕获的模型蛋白质_Fc上进行ELISA筛选，从而对抗原特异性进行测试。初级命中物定义成产生高于背景至少5倍的ELISA信号的Fab。以模型抗原_Fc作为同源抗原，以无关蛋白质_Fc作为阴性对照抗原，在二次Fc捕获ELISA中确认了对模型蛋白质_Fc的特异性。
挑选约50-100个克隆用于重链和轻链CDR3区的测序，以估计模型抗原_Fc结合抗体的序列多样性。测序结果证实，构建的文库含有结合体的多样性组库。ELISA结合表征显示，分离的抗体对所关注的同源模型抗原是高度特异性的，与无关对照抗原没有交叉反应性，证明了文库用于生物医学研究和产生高度特异性治疗性抗体的可用性。
实施例3.3.开发性测试
测试Fab和IgG两种形式的抗体或抗原特异性片段的开发性(developability)特性，例如，Fab形式的热稳定性、Fab形式的亲和力、IgG形式的pI、IgG形式的表达量、IgG形式的热稳定性和IgG形式的％单体，如通过本文公开的方法通过SEC或通过本领域技术人员已知的其它方法测定。如实施例2.7和2.8中所述完成Fab和IgG形式的热稳定性测试。pI测定如实施例2.9中所述完成。如实施例2.5中所述完成IgG形式的表达量。如实施例2.5中所述，通过SEC测定完成IgG形式的单体％测定。
实施例3.4.Fab形式的经由抗原捕获设定的Biacore KD(亲和力)测定
单体Fab部分(通过分析型SEC分析；Superdex75，Amersham Pharmacia)与捕获的抗原的结合分析如下：在CM5芯片(Biacore/GE Healthcare)上，使用EDC/NHS化学将合适的抗-抗原标签捕获抗体共价固定化。通过捕获抗原和随后注射6种不同Fab浓度(2n系列稀释)进行动力学测量。每次循环之后，将传感器芯片再生。使用运行缓冲液的空白注射用于双重参照。所有的传感图均使用BIA评价软件3.2(Biacore/GE Healthcare)拟合，以确定kon和koff速率常数，其用于计算KD。
亲和力也可以通过溶液平衡滴定测定，如以下文献中所述：Haenel等人,(2005)Analytical Biochemistry 339(1):182-184。
分离的抗体显示出范围从亚纳摩尔到个位数纳摩尔KD的亲和力-值，证实了可以容易地从文库分离针对所关注模型抗原的强结合抗体。
实施例4.文库冗余分析和通过NGS的QC
根据制造商提供的手册，使用MiSeq仪器通过高通量扩增子测序(每个VL/VH样品Illumina～一百万序列)，对文库质量进行评估。
实施例4.1.扩增子的产生
简言之，使用特异性扩增子融合引物，通过PCR(1min 98℃，15个98℃15秒、60℃15秒和72℃15秒的循环，72℃5min，15ng模板DNA，0.4μΜ各引物，200μΜdNTP和1U Phusion聚合酶(NEB))产生各个样品(如来源于克隆文库的质粒DNA)的VL或VH扩增子。
实施例4.2.使用改良TruSeq/Nextera XT方案的NGS
如上所述对含有通用Nextera接头的扩增子进行PCR扩增(第一步-接头PCR)、琼脂糖凝胶提纯和定量。在第二PCR步骤(索引标签PCR(index PCR))中，将独特的索引标签组合(i5/i7索引标签)平行地添加至每个样品的5'-和3'-端(1min 98℃，10个98℃15秒、60℃15秒和72℃60秒的循环，72℃5min，1ng模板，0.4μΜ引物，200μΜdNTP和0.5U Phusion聚合酶)。
PCR产物使用AMPure XP珠(Beckman Coulter)提纯，以除去小的片段，使用SequalPrep标准化板试剂盒(Invitrogen)进行标准化，并进行等摩尔合并。将合并的DNA用0.2N NaOH变性，最后稀释至浓度8-10pM。将对照文库(PhiX)额外地加入样品库中(5-10％)，并将该库负载在流动池上用于测序。根据MiSeq System用户指南和MiSeq试剂盒v3的测序手册(600个循环)进行配对端测序运行。
将测序结果直接处理，解多路化，结合，并使用提供的MiSeq软件包(SAV1.8,MiSeqReporter)生成fastq文件。
实施例4.3.序列分析
使用定制用于处理和分析大测序数据集的内部开发软件对质量过滤的序列进行进一步的分析。对序列进行多路分解，并评价文库的特异性序列特征，例如V-基因型、HCDR3长度和氨基酸分布。简言之，VH和VL分布分别如所预期那样，具有非常好的设计间相关性，并且在所需位置获得氨基酸(图11、12和13)。
实施例5.噬菌体展示抗体选择
选择eGFP(增强型绿色荧光蛋白)作为用于文库验证的模型抗原。进行固相淘选，然后在直接包被ELISA中进行筛选，以从文库中分离出eGFP-特异性结合体。使用直接固定化在微量滴定板上的eGFP进行固相淘选。在每一轮选择之前，将噬菌体用PBS中的10％脱脂乳粉封闭。噬菌体孵育后，用PBST进行若干洗涤步骤，以去除非常弱/非特异性的结合体。将结合的噬菌体用低-pH洗脱缓冲液洗脱，并通过感染TG1F+细胞进行扩增，用于下一轮选择。在最后一轮选择后，分离pCaDis噬菌粒DNA，将Fab编码片段通过用XbaI和EcoRI限制性消化剪切，连接到表达载体pCaBx(图10)中，并转化到TG1F-大肠杆菌中。然后将感染的培养物铺在LB/Cam/Gluc板上，并使其生长过夜。分离单个克隆，并通过ELISA测试Fab表达量和抗原结合。通过将含有Fab的细胞提取物在含兔-抗-狗-IgG F(ab)2(LSBio，Cat.:LS-C69729)包被的ELISA平板上孵育，然后用缀合有碱性磷酸酶(AP)(Sigma，SAB37000097)的兔抗-狗IgGIgG F(ab)2特异性抗体检测，从而对Fab表达进行检测。通过在包被在MaxiSorp板上的eGFP用含有Fab的细胞提取物进行ELISA筛选，对抗原特异性进行测试。初级命中物定义成产生高于背景至少5倍的ELISA信号的Fab。在阴性对照抗原(仅包被牛乳的板)上，在二次ELISA中确认了对eGFP的特异性。
分别对2A/2D、3A/3D和3B/6B子文库的29、8和58个克隆的重链和轻链CDR3区进行测序，以评估eGFP结合抗体的序列多样性。筛选和测序数据总结于表19中。图13显示筛选结果的斑点印迹可视化图。
表19
| 子代码 | 筛选 | S/B>3-10 | S/B>10 | 命中率[％] | 测序 | 独特 |
| 2A/2D | 364 | 139 | 149 | 79 | 29 | 1 |
| 3A/3D | 364 | 20 | 2 | 6 | 8 | 3 |
| 3B/6B | 364 | 54 | 120 | 48 | 58 | 5 |
2A/2D含有来自子文库VL/VH(Vs236/Vs624)和VL/VH(Vs236/Vs618)的噬菌体
3A/3D含有来自子文库VL/VH(Vs365/Vs624)和VL/VH(Vs365/Vs635)的噬菌体
3B/6B含有来自子文库VL/VH(Vs365/Vs618)和VL/VH(Vs323/Vs635)的噬菌体
实施例6.Fab ELISA
为了比较淘选选择后得到的单个克隆的结合，对提纯的Fab形式的抗体进行滴定，并在包被在Maxisorp板上的eGFP上用缀合有碱性磷酸酶(AP)(Sigma，SAB37000097)的兔抗-狗IgG F(ab)2-特异性检测抗体进行测试。包括了之前从HuCAL文库分离的抗-GFP抗体(MOR06391)作为参考。如图15所示，从文库中直接分离的抗体表现出多样性结合强度，6/9的候选物显示与参考抗体类似或更好的结合特征。
实施例7.IgGELISA
如实施例5中所述进行针对作为模型抗原的eGFP的淘选。使用现有技术的分子生物学方法将抗体选择后得到的特异性Fab命中物转化成IgG形式，产生IgG蛋白质，如实施例2.5中所述。在标准固相ELISA中确认了针对eGFP的IgG反应性(图16)。用缀合有碱性磷酸酶(AP)(Sigma，SAB37000097)的兔抗-狗IgG F(ab)2-特异性检测抗体进行IgG与包被在Maxisorp板上的eGFP结合的检测。包括了之前从HuCAL文库分离的抗-GFP抗体(MOR06391)作为参考。
Claims (15)
1.一种合成犬抗体文库，其中所述文库包括以下种系VH1区中的至少一个的成员：Vs618(SEQ ID No.:4)、Vs624(SEQ ID No.:1)、Vs628(SEQ ID No.:5)和Vs635(SEQ IDNo.:2)。
2.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中所述文库包括以下种系VL区中的至少一个：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323(λ)(SEQ ID No.:16)、Vs365(λ)(SEQ IDNo.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中从所述种系VH区或所述种系VL区中的一个或多个中去除了翻译后修饰(PTM)位点。
4.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中所述文库包括VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)，并包括VL区：Vs236(κ)(SEQ IDNo.:12)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)和Vs365(λ)(SEQ IDNo.:13)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中所述文库包括VH区：Vs618(SEQ IDNo.:4)、Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)、Vs628-PTM-少(SEQ IDΝο.:10)和Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)，并包括VL区：Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)、Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)、Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)、Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)和Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中所述文库包括以下VH/VL组合中的一个或多个：VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs323-PTM-少(λ)(SEQ ID No.:18)的VH/VL组合、VH1区Vs618(SEQ ID No.:4)和VL区Vs321(λ)(SEQ IDNo.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs624-PTM-少(SEQ ID No.:6)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs321(λ)(SEQ ID No.:14)的VH/VL组合、VH1区Vs635-PTM-少(SEQ ID No.:7)和VL区Vs236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区VS236(κ)(SEQ ID No.:12)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs365(λ)(SEQ ID No.:13)的VH/VL组合、VH1区Vs628-PTM-少(SEQ ID No.:10)和VL区Vs843(λ)(SEQ ID No.:15)的VH/VL组合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中所述文库的基本上全部VH/VL组合以至少0.5Fab/噬菌体的展示率有效地展示。
8.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中当以Fab形式在大肠杆菌(E.coli)中表达时，基本上全部VH/VL组合具有至少85％的单体含量。
9.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中当以IgG形式在哺乳动物系统中表达时，基本上全部VH/VL组合具有至少90％的单体含量。
10.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中全部VH/VL组合是热稳定的。
11.一种核酸分子的集合，所述核酸分子编码前述权利要求中任一项所述的文库的成员。
12.一种载体，其编码权利要求11所述的核酸分子。
13.一种重组宿主细胞，其包括权利要求11所述的核酸分子或权利要求12所述的载体。
14.一种分离对抗原具有特异性的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使权利要求1-10中任一项所述的文库与抗原接触；
(b)除去所述文库的不与所述抗原结合的成员；和
(c)回收所述文库的与所述抗原结合的成员。
15.一种抗体，其从权利要求1-10中任一项所述的文库中分离，或者通过权利要求14所述的方法分离。
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