KR20230148857A - 개과 항체 라이브러리 - Google Patents

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KR20230148857A
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토마스 틸러
마커스 발드후버
랄프 스트로너
카트린 라데츠키-배스
조셉 프라슬러
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모르포시스 아게
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Abstract

본 발명은, 합성 개과 항체 라이브러리뿐만 아니라, 이들 라이브러리와 함께 사용되는 폴리펩티드, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 라이브러리로부터 단리된 항체를 제공한다.

Description

개과 항체 라이브러리{Canine Antibody Libraries}
본 발명은, 완전한 개과 항체의 선택에 적합한 합성 항체 라이브러리와 같은 개과(canine) 라이브러리에 관한 것이며, 또한 이를 제공한다. 본 발명은 또한, 개별 또는 조합의 개과 항체를 인코딩하는 합성 핵산 서열, 즉 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이다. 그러한 라이브러리를 생성 및 사용하는 방법들이 제공된다. 구체적으로, 본 발명은 특정 생물리 특성을 가진 완전한 개과 항체의 라이브러리를 생성하기 위해 합성 생식계열 서열의 사용에 의한, 완전한 개과 항체의 라이브러리 제조에 관한 것이다.
항체와 같은 면역글로불린은, 약학 산업에 있어 지속적이고도 증가하는 관심대상이다. 2000년 이래로, 모노클로날 항체 치료 시장이 폭발적으로 성장하였고, 2007년에, 미국에서 가장 잘 판매되는 20개의 생명공학 약물 중 8개는 치료용 모노클로날 항체로, 각각은 전세계상의 연간 판매가 50억 US달러를 초과한다. 치료용 항체는, 많은 질환의 치료를 개선하며 가장 심각하고 어려운 질환을 갖는 환자조차의 삶의 질을 점차 더 개선시킨다.
개와 같은 반려 동물은, 유사하거나 심지어 동일하기도 한 생물 기작 및 장애를 바탕으로 인간과 유사한 질환을 나타낸다. 예를 들어, 림프종은 개과 혈액림프계의 가장 흔한 신생물(neoplasm)이다. 이는 모든 개과 신생물의 약 4.5% 및 모든 악성 신생물의 15%를 나타낸다. 개과 림프종(CL)은 보통 급속히 치명적으로, 진단 1 내지 3개월 이내에 죽음을 초래한다(Squire et al, 1973; Steven E. Crow, 2008). 나아가, 미국 내 성견 5마리 중 1마리는 관절염을 가지는 것으로 추정되며, 개들은, 예를 들어 골관절염, 전십자인대 파열 및 반월 손상과 같은 인간 관절 질환의 모델로 사용되어 왔다.
따라서, 치료용 모노클로날 항체는, 인간 치료뿐만 아니라 개의 치료를 위한 매우 전도 유망한 약물 부류를 제공한다.
개의 치료를 위해 항체를 사용하고자 하는 시도들이 이미 이루어졌다. 인간 암의 치료를 위한 첫번째 모노클로날 항체의 미국 식품의약국(Food and Drug Administration; FDA)의 승인 이전에도, 1992년에는 미국 농무부(United States Department of Agriculture; USDA)에 의해, 림프종을 가진 개에서의 모노클로날 항체 MAb 231의 사용이 승인된 바 있다. MAb 231은 쥣과-유래된 모노클로날 항체로, 1975년 Kohler 및 Milstein에 의해 개발된 하이브리도마 기술을 사용하여 생성되었고, 개과 림프종 세포주 17-71에 특이적으로 결합한다(예를 들어, US 5169775A 참조). MAb 231은, 종양 세포에는 결합하나 정상 세포에는 결합하지 않는 것으로 나타났고, 세포 독성을 매개하는 치료상 바람직한 쥣과 이소타입 IgG2a이었다.
한편, 항체를 "개과화(caninise)"하고 따라서 개과 항체를 모방하는 방법이 사용되고 있다. 예를 들어, 문헌[Gearing et al., BMC Veterinary Research 2013, 9:226]은, 기존의 래트 항-NGF 모노클로날 항체를 재조합 개과화 항-NGF mAb로 전환하기 위해 발현된 개과 면역글로불린 서열 기반의 알고리즘의 사용에 의한, "완전 개과화된" 항-NGF 모노클로날 항체의 생성을 개시한다.
본 발명자들의 지식에 따르면, 완전 합성 개과 항체 라이브러리나 이미 정의되고 다양한 VH/VL 조성을 가지는 임의의 기타 다른 신뢰할만한 개과 항체 라이브러리 어느 것도 이전에 개시된 바가 없다. 본 발명에서는, 천연 발생의 개과 항체 서열의 합리적인 분석과 라이브러리의 정교한 설계가, 생의학 연구에 폭넓게 유용한 최초의 완전 합성 개과 항체 라이브러리에 이르도록 하였다. 높은 단량체 함량 및 높은 열 안정성과 같은 유리한 특성에 대해 라이브러리의 구성원을 또한 선택하였다.
합성 개과 항체 라이브러리의 스크리닝 방법에 대하여, 파지, 대장균(E. coli), 효모 등에서의 디스플레이를 사용할 수 있다. 바람직한 파지 디스플레이에서, 예를 들어, 항체는 박테리오파지 표면 단백질 상의 융합 폴리펩티드로 제시된다. 항체-디스플레이된 파지 입자를 관심 대상의 표적 분자(예를 들어, 고상(예: 마이크로타이터 플레이트, 자성 비드, 등) 위에 고정화되거나 용액 중에 존재)와 접촉시켜, 그에 따라 친화도 선택을 실시한다. 통상 "(바이오)-패닝'이라고 불리는 선택 과정 중, 표적 분자에 대한 친화도를 가지는 항체 발현 파지를 선택하고, 표적 분자에 결합하지 않는 항체를 갖는 파지는 씻어 버린다. 파지 디스플레이에서, 선택된 파지 상에 제시된 항체는 이를 코딩하는 유전자에 일-대-일로 상응하고, 그에 따라 관심 항체를 쉽게 동정할 수 있다. 나아가, 항체를 인코딩하는 유전자를 쉽게 증폭시킬 수 있으며, 그에 따라 파지 디스플레이는, 거대 라이브러리로부터 항체를 스크리닝 및 단리하는 방법으로 널리 사용된다.
개과 생식계열 서열에 의해 인코딩되는 면역글로불린 서열은, 개에서는 항원성이 아닌 것으로 예상되므로, 본 발명자들은 가장 풍부한 개과 항체의 부류를 나타내는 생식계열 면역글로불린 서열을 찾아보았다.
문헌[Bao et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 137 (2010) 64-75]에 따르면, 개과 항체 VH 유전자 레파토리는 80개의 VH 절편(그 중 41개는 작용성이고 39개는 위유전자(pseudogene)임), 6개의 DH 및 3개의 JH 절편을 포함한다. VH 유전자는, 상기 VH 유전자 레파토리로부터, 상이한 V, D 및 J 유전자 절편들의 조합에 의해 형성되고, VD 및 VJ 조인트에서 짧은 코딩 서열의 첨가 또는 결실에 의해 연결되어 항체의 다양성을 증가시킨다. 배중심 진입 이전에 발생하는 VDJ 재조합은 완전 랜덤한 것이 아니라, 특정 VH 유전자들이 나머지 것들보다 보다 빈번하게 사용된다.
개과에 있어서, 1-VH62(Vs624) 및 1-VH44(Vs635)가 비장 B 세포 중에서 가장 빈번하게 사용되는 VH 절편인 것으로 동정되었으며, 발생률은 1-VH62가 27%, 1-VH44가 23.4%이다(Bao et al. 2010). 나머지 모든 VH는 빈도 11% 미만으로 사용되었다. 개과에서는, 3개의 VH 패밀리(VH1, VH2 및 VH3)가 존재하며, 이들 중 다수가 VH1 패밀리에 속하는 한편, 2-VH51, 2-VH64 및 2-VH66는 VH2 패밀리에 속하고 3-VH80은 VH3 패밀리 구성원만을 나타낸다.
개과의 항체 경쇄는 또한 V 및 J 유전자 절편들에 의해 인코딩되는 가변 영역 및 카파 및 람다 유전자들에 의해 인코딩되는 불변 영역에 기반한다. 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris) 면역글로불린 람다 서열은, 4개의 VL 람다 사슬 패밀리[V-I(GenBank 수탁 번호 XM845300), V-II(GenBank 수탁 번호 XM543519), V-III(GenBank 수탁 번호 XM844188) 및 V-IV(GenBank 수탁 번호 XM844237)]로 그룹화되고, 씨. 파밀리아리스(C. familiaris) 면역글로불린 카파 서열은 또한 4개의 VL 카파 사슬 패밀리 V-I(Gen Bank 수탁 번호 XM849621), V-II(Gen Bank 수탁 번호 XM844874), V-III(Gen Bank 수탁 번호 XM849629) 및 V-IV(Gen Bank 수탁 번호 XM849668) 서열들로 그룹화 될 수 있다(Braganza et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 139 (2011) 27-40). 개는, 90% 람다 및 단지 10%의 카파 경쇄를 발현하는 것으로 알려졌다(Braganza et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 139 (2011) 27-40). 그러나, 개에서 발생하는 VH/VL 조합뿐만 아니라 개과 동물의 특정 경쇄의 분포 및 배열은 아직 거의 특정되지 않았다.
문헌에 기재된 바와 같은 VH 유전자의 분포 및 서열 유사도 분석에 기반하여, 특정 VH 유전자들을 합성 개과 항체 라이브러리를 위해 선택하였다. VL 유전자들에 대해서는, 합성 개과 항체 라이브러리를 위해 특정 경쇄 생식계열 서열을 선택하기 위해, Braganza외 다수(2011)에 제공된 정보 및 http://vgenerepertoire.org에서 얻을 수 있는 86개의 람다 경쇄 생식계열 서열 및 29개의 카파 경쇄 생식계열 서열에 기반한 공통 서열을 사용하였다.
본 발명자들은, 대표적인 개과 VH 생식계열 서열들 및 6개의 대표적인 개과 VL 생식계열 서열들(4개의 람다 VL, 2개의 카파 VL)을 테스트하였다. 본 발명자들은, 가능한 30개의 VH/VL 조합 중, 하기의 유리한 특성을 나타내는 6개의 조합을 동정하였다: (i) Fab-포맷에서, 섬유상 파지의 말단에서 높은 디스플레이율(rate)을 나타냄, (ii) Fab 포맷에서, 높은 단량체 함량을 가지는 가용 형태로 발현함, 및 (iii) IgG 포맷에서, 높은 단량체 함량으로 발현함.
프레임워크(framework)의 선택은, 우수한 생물리 특성을 가지며 생체내(in-vivo) 성숙을 겪지 않은 합성 라이브러리로부터 유래된 항체의 단점이 없는 항체의 수득 기회를 최적화하도록 선택되었다. 그러한 우수하고도 바람직한 생물리 특성은, 예를 들어 본원에 예시된 바와 같은 더 높은 안정성 및 응집에의 더 낮은 경향성을 포함한다.
가장 우수한 6개의 VH/VL 조합에서, L-CDR3 및 H-CDR3 영역은, 매우 다양화된 L-CDR3 및 H-CDR3 라이브러리 카세트로 각각 대체되었고, 이에 따라 5Х109개 구성원을 초과하는 전체 라이브러리 크기를 달성하였다. L-CDR3 및 H-CDR3 라이브러리 카세트 삽입을 가능하게 하기 위해, 각각의 제한 부위를 실행하였다.
추가로, 바람직하지 않은 번역후 개질(post-translational modification; PTM) 부위를 특정 생식계열 서열들로부터 제거하여 각각의 VH 또는 VL 유전자와 상응하는 단백질의 발현 및 생물리 특성을 추가로 최적화하였다.
치료용 적용을 위한 항체 제형 중에서 발생하는 번역후 개질을 인지하는 것이 중요하다. PTM은 초기의 시험관내(in vitro) 특성화를 위해 제조된 항체 샘플에서 반드시 발생하는 것은 아니지만, 고농도 및 장기간의 보관 조건하의 항체 샘플에서 발생할 수 있고, 또한 생체내에서도 발생한다. 따라서, PTM은 항체 안정성 및/또는 균질성을 방해할 수 있고, 항체 작용성의 손실을 야기할 수 있다. PTM의 예는 산화(Met, Trp, His), 탈아미드화(Asn, Gln), 이성질체화(Asp) 또는 N-결합 글리코실화(Asn)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은, 합성 개과 항체 라이브러리, 바람직하게는 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 하나의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하는 라이브러리를 제공한다.
일 양태에서, 본원에 제공된 상기 라이브러리는, 적어도 2개의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 2개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함한다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 하나의 구성원을 포함한다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 2개의 구성원을 포함한다. 또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 적어도 2개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323(람다)(서열 번호 16) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13) 중 적어도 하나를 포함한다. 본원 개시 내용의 일 구현예에서, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323(람다)(서열 번호 16) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 생식계열 VL 영역으로부터 선택된다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 2개와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323(람다)(서열 번호 16) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13) 중 적어도 2개를 포함한다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2)와, 생식계열 VL 영역링 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323(람다)(서열 번호 16) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 하나와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323(람다)(서열 번호 16) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13) 중 적어도 하나로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 2개와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323(람다)(서열 번호 16) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13) 중 적어도 2개로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2)와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323(람다)(서열 번호 16) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13)로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 번역후 개질(PTM) 부위는 생식계열 VH 영역 또는 생식계열 VL 영역 중 하나 이상으로부터 제거된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624-PTM-로우(low)(서열 번호 6) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7)과, VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18) 및 Vs365(람다)(서열 번호 13)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합을 포함한다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 2개의 구성원을 포함한다. 또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 적어도 2개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 추가로 포함한다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 하기 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15) 중 적어도 하나를 포함한다.
본원 개시 내용의 일 구현예에서, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 생식계열 VL 영역으로부터 선택된다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 2개와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15) 중 적어도 2개를 포함한다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 하나와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15) 중 적어도 하나로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 2개와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15) 중 적어도 2개로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 생식계열 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)와, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 번역후 개질(PTM) 부위는 생식계열 VH 영역 또는 생식계열 VL 영역 중 하나 이상으로부터 제거된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624-PTM-로우(서열 번호 6), Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), 및 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 상기 라이브러리는, 하기의 VH/VL 조합들 중 하나 이상을 포함한다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 본원에 개시된 VH/VL 조합 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 하나 이상을 포함한다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 하나 이상으로 구성된다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 본원에 개시된 VH/VL 조합 중 하나 이상으로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개를 포함한다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개로 구성된다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 본원에 개시된 VH/VL 조합 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개로 구성된다.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 하나 이상으로 구성된다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 하나 이상을 포함한다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 14개, 적어도 16개로 구성된다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 14개, 적어도 16개로 구성된다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 80%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 하나 이상을 포함한다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 50%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 하나 이상으로 구성된다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
또 다른 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 항체 또는 작용성 단편의 적어도 80%는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합을 포함하며, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합의 프레임워크 영역은, 하기의 VH/VL 조합 중 하나 이상으로 구성된다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 바람직하게 그 라이브러리는, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및/또는 적어도 2개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하고, 본질적으로, 상기 라이브러리의 모든 VH/VL 조합은 Fab 포맷으로 효율적으로 디스플레이된다.
일 양태에서 상기 라이브러리의 상기 VH/VL 조합은, 파지당 적어도 0.5 Fab의 디스플레이율을 가지며, Fab 포맷으로 디스플레이된다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 바람직하게 그 라이브러리는, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및/또는 적어도 2개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하고, 본질적으로, 모든 VH/VL 조합은 Fab 포맷으로 대장균 내에서 발현된다. 일 구현예에서, Fab 포맷으로 대장균 내에서 발현되는 상기 VH/VL 조합은, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 단량체 함량을 가진다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 바람직하게 그 라이브러리는, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및/또는 적어도 2개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하고, 본질적으로, 모든 VH/VL 조합은 IgG 포맷으로 포유류 시스템 내에서 발현된다. 일 구현예에서, IgG 포맷으로 포유동물 내에서 효율적으로 발현되는 상기 VH/VL 조합은, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 단량체 함량을 가진다.
일 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리가 본원에서 제공되며, 바람직하게 그 라이브러리는, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및/또는 적어도 2개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하고, 본질적으로, 모든 VH/VL 조합은 열적으로 안정적이다.
본 개시 내용은 또한 상기 합성 개과 항체 라이브러리의 항체를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다.
본 개시 내용은 또한 상기 핵산 분자를 인코딩하는 벡터를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 상기 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 항원에 특이적인 항체를 단리하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
(a) 본 개시 내용의 합성 개과 항체 라이브러리를 항원과 접촉시키는 단계;
(b) 항원에 결합하지 않는 (또는 특이적이지 않은) 라이브러리의 구성원을 제거하는 단계; 및
(c) 항원에 결합한(또는 특이적인) 라이브러리의 구성원을 회수하는 단계
를 포함한다.
본 개시 내용은 또한 상기 언급한 라이브러리 또는 상기 언급한 방법으로부터 단리된 항체를 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는, 본 발명이 속하는 당업계의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다.
숫자 값 및 범위 내용상의 "약" 또는 "대략"의 용어는, 의도된 바와 같이 본 발명이 실시될 수 있도록 하는 대략의 언급된 값 또는 범위 또는 그에 근사하는 값 또는 범위를 말하며, 예로써, 본원에 포함된 교시로부터 당업자에게 명백한 바와 같이, 서열 상동성의 바람직한 수 또는 퍼센트를 가지는 것이다. 이는, 적어도 부분적으로, 다양한 배양 조건 및 생물 시스템의 변이도 때문이다. 따라서, 상기 용어들은, 시스템상 오류에 기인한 값들을 넘어선 값들을 포함한다. 이들 용어는, 은연적인 것을 명확하게 한다.
본 발명의 요약 및 설명에 제시된 모든 범위는, 범위의 수치 근처 또는 사이의 모든 수치 또는 값들을 포함한다. 본 발명의 범위는, 범위 내의 모든 정수, 소수, 및 분수 값들을 명백하게 명명 및 제시한다. 용어 "약"은 범위를 기재하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 단쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는, 상호 이황화 결합으로 연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함한 당단백질이다. 각각의 중쇄는, 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약기함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG, IgA 또는 IgD 항체의 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인으로 구성되는 반면, IgM 및 IgE 항체의 중쇄는 CH1, CH2, CH3, CH4의 4개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는, 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약기함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL, 1개의 도메인으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 보다 보존된 영역들이 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 하위분류될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로, 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은, 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변 영역은, 면역계의 각종 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전적 상보계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 정확히 정의된 바 있다(문헌[Kabat, 1991, J. Immunol., 147, 915-920.]; [Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]; [Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883]; [Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273: 927-948] 참조). 항체의 프레임워크 영역, 즉 구성 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은, 항원에의 결합의 대부분을 담당하는 CDR을 위치시키고 정렬하는 역할을 한다.
항체의 "항원 결합 부분" 또는 "단편"이라는 용어는, 본 출원에서 동등하게 사용된다. 이들 용어는, 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 완전한 항체의 하나 이상의 단편을 일컫는다. 항체의 항원 결합 기능은, 완전한 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 이황화 가교로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH로 구성된 단일 도메인 항체(dAb) 단편(Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 바람직한 항체의 항원 결합 부분 또는 단편은 Fab 단편이다.
나아가, Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩됨에도 불구하고, 이들은, 재조합 방법을 사용하여, 1가 분자를 형성하기 위해 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루는 단일 단백질 사슬로서 상기 도메인의 제조를 가능하게 하는 인공 펩티드 링커(단일 사슬 Fv(scFv); 예를 들어, 문헌[Bird et al., 1988 Science 242:423-426]; 및 [Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)에 의해 결합될 수 있다. 그러한 단일 사슬 항체는, 항체의 하나 이상의 "항원 결합 부분"을 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상의 기법을 사용하여 수득되며, 온전한 항체와 동일한 방식으로, 유용성에 관하여 단편을 스크리닝한다. 항원 결합 부분은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv에 혼입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은, 피브로넥틴 타입 III(Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드 내로 그래프팅될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재하는 미국 특허 6,703,199 참조). 항원 결합 부분은, 상보적인 경쇄 폴리펩티드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는, 탠덤 Fv 절편(VH-CH1-VH-CH1)의 쌍을 포함하는 단일 사슬 분자로 혼입될 수 있다(Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; 및 미국 특허 5,641,870).
본원에서 사용된 용어 "개과 항체"는, 프레임워크 및 CDR 영역 모두가 개과 기원 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 말한다. 예를 들어, 프레임워크 및 CDR 영역 모두는 개과 기원의 서열로부터 유래될 수 있다. 나아가, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역 또한 그러한 개과 서열, 예를 들어 개과 생식계열 서열, 또는 개과 생식계열 서열의 돌연변이 형태로부터 유래된다. 본 발명의 개과 항체는, 개과 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이).
용어 "나이브(naive) 개과 면역 레파토리"는, 개의 면역계의 항원 무경험 B 세포로부터 단리된 핵산의 레파토리를 의미하며, 이 때 항체 또는 이의 작용성 단편을 인코딩하는 핵산은 체세포 과돌연변이를 경험하지 않아, 그에 따라 V(D)J 유전자 절편의 재배열 발생과 함께 생식계열 유전자의 핵산을 포함하는 것으로 여겨진다. 레파토리는 개인 또는 집단의 것일 수 있다. 바람직하게, 면역 레파토리는, 샘플 편향을 회피하기 위해 다수의 개인으로부터 수득된다.
용어 "개과 면역 레파토리"는, 개의 면역계의 B 세포로부터 단리된 핵산의 레파토리를 의미한다. 레파토리는 개인 또는 집단의 것일 수 있고, 나이브 B 세포 및/또는 항원 경험 B 세포로부터 기인할 수 있다. 바람직하게, 면역 레파토리는, 샘플 편향을 회피하기 위해 다수의 개인으로부터 수득된다.
용어 "단리된 항체"는, 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 기타 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 말한다. 그러나 항원에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 기타 다른 항원에 대한 교차-반응성을 가질 수 있다. 나아가, 단리된 항체는, 기타 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다.
용어 "이소타입"은, 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류(예를 들어, IgM, IgE, IgA, IgG1 또는 IgG4와 같은 IgG)를 말한다. 개과에는 4개의 IgG 하위부류, 즉 IgG-A, IgG-B, IgG-C 및 IgG-D가 존재한다(L.M. Bergeron et al., Veterinary Immunology and Immunopathology 157 (2014) 31- 41). 이소타입은 또한, 이들 부류의 개질 형태를 포함하며, 이 때 개질은 Fc 기능을 변경시켜, 예를 들어 효과기 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 향상 또는 감소시키도록 이루어졌다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은, 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조물을 말한다. 모노클로날 항체 조성물은, 단일 결합 특이성 및 특정 에피토프에 대한 친화성을 나타낸다.
용어 "라이브러리"는, 103개 초과, 104개 초과, 105개 초과, 106개 초과, 107개 초과, 108개 초과, 109개 초과, 또는 나아가 1010개 초과의 구성원을 통상 포함한 별개 분자들의 집합을 말한다. 본 발명 문맥에서 라이브러리는, 이종 (heterogeneous)의 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물이다. 라이브러리는, 각각 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 가지는 구성원들로 구성된다. 라이브러리 구성원간의 서열 차이가, 라이브러리 내 존재하는 다양성을 담당한다. 라이브러리는, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단순 혼합물의 형태를 가질 수 있거나, 또는 핵산 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 파지, 동물 또는 식물 세포의 형태일 수 있다. 바람직하게, 각각의 개개 유기체 또는 세포는, 하나 또는 제한된 개수의 라이브러리 구성원을 포함한다. 유리하게는, 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 허용하도록, 핵산이 발현 벡터 내로 혼입된다. 특정 양태에서는, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단 형태를 가질 수 있고, 이 때 각각의 유기체는, 상응하는 폴리펩티드 구성원을 생성하도록 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리 단일 구성원을 포함한 발현 벡터의 하나 이상의 복제물을 포함한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 유전적으로 다양한 폴리펩티드 변이체의 다수의 레파토리를 인코딩하는 잠재력을 가진다. 용어 "집합"은, 본질적으로, 용어 "라이브러리"와 상호교환적으로 사용된다.
항체 라이브러리는, 면역화된 동물 또는 천연 면역화되거나 감염된 인간에 존재하는 특정 특이성에 대해 편향된(biased) 면역글로불린 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 항체 라이브러리는, 나이브 면역글로불린 또는 이의 단편, 즉 면역계에서 발견되는 특이성에 편향되지 않은 면역글로불린으로부터 유래될 수 있다. 그러한 라이브러리는 "미편향(unbiased)" 라이브러리로 언급된다. 바람직한 구현예에서, 본 개시 내용은 미편향 항체 라이브러리, 즉 관심 대상의 항원에 사전-노출되지 않은 라이브러리를 제공한다. 어떤 편향도 존재하지 않으므로, 그러한 라이브러리는, 관심 대상의 임의의 잠재 표적 항원에 결합하는 항체를 포함한다.
통상, 면역 항체 라이브러리는, PCR-기반(또는 관련) 클로닝 기법에 의해 공급원 B 세포로부터 클로닝된 VH 및 VL 유전자 풀(pool)로 구축된다. 또한, 동일한 방식으로, 미편향, 나이브 항체 라이브러리를 생성할 수 있다. 그러나 미편향, 나이브 항체 라이브러리는 또한, 전체 라이브러리를 전적으로 시험관내로 구축하는 합성 방식으로 생성될 수 있다. 천연 항체 레파토리의 천연 편향 및 중복을 모방하기 위해 재조합 DNA 기술을 채용하고 사용할 수 있다. 그러한 항체 라이브러리를, "합성" 항체 라이브러리로 언급한다. 용어 "완전 합성" 라이브러리는, 완벽하게, 즉, 완전히, 예를 들어 전체 유전자 합성, PCR-기반 방법, 또는 관련 DNA 기술에 의한 DNA 합성에 의해 드노보(de novo)로 구축된 항체 라이브러리를 말한다. 그러한 라이브러리에서, 라이브러리의 항체 CDR을 감싸는 부분을 인코딩하는 부분(예를 들어, 프레임워크 영역)뿐만 아니라, 전체 DNA, 즉, CDR을 인코딩하는 부분이 드노보로 구축된다. 용어 "합성" 및 "완전 합성"은, 따라서 DNA의 드노보 기원을 말한다. 반면, "반(semi)-합성" 항체 라이브러리에서는, 라이브러리 항체의 단지 일부분만 드노보로 구축되는 한편, 기타 다른 부분, 예를 들어 특정 CDR 영역은 천연 공급원으로부터 유래된다(이 주제에 관한 다수의 검토가 존재하며, 예를 들어 문헌 [Sidhu et al.; Nat Chem Biol (2006), 2, 682-8]을 참조). 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 개시 내용은 완전 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
용어 "완전 생식계열"은, 생식 세포를 통해 부모로부터 자식으로 전달되는 항체 유전자 및 유전자 절편의 뉴클레오티드 서열을 말한다. 생식계열 서열은, B 세포 성숙 과정 동안의 재조합 및 과돌연변이에 의해 변경된 성숙 B 세포내의 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 구별된다. 용어 "생식계열"은, 완전 생식계열 서열, 및 추가적으로 예컨대 원치 않는 번역후 개질(PTM) 부위의 제거, 원치 않는 시스테인의 제거, 항체의 최적화(예를 들어, 친화도, 반감기) 또는 원하는 제한 부위의 도입, 또는 합성, 증폭 또는 클로닝 중의 오류에서 기인한 개질의 목적으로, 아미노산 서열 중 약한 돌연변이로 개질 또는 조작된 생식계열 서열을 말한다.
용어 "번역후 개질" 또는 "PTM"은, 일반적으로 단백질 생합성 동안 또는 그 이후의 단백질의 효소적 개질을 말한다. 번역후 개질은, 아미노산 측쇄 상에서 또는 단백질의 C- 또는 N-말단에서 발생할 수 있다. 이는, 포스페이트, 아세테이트, 아미드 기, 또는 메틸 기와 같은 새로운 작용기의 도입에 의해 20개의 표준 아미노산의 화학 레파토리를 확장할 수 있다. 다수의 진핵 단백질은, 또한 단백질 접힘을 촉진하고 안정도를 개선할 뿐 아니라, 조절 기능을 수행할 수 있는 글리코실화로 불리는 과정 동안, 탄수화물 분자가 단백질에 부착되도록 한다. 개질은, 특히 N-결합 글리코실화 부위(NxS 또는 NxT) 또는 Asp 절단(종종 DP에서), Asp 이성질화(DS, DG), 탈아미드화(NS, NG)와 같은 화학적 개질을 포함하는 소위 번역후 개질 부위(즉, 밝혀진 아미노산 모티브)에서 발생한다. 메티오닌은, 용매에 노출시 산화될 수 있다. 개질은 생체내(혈청 중) 또는 제형 완충액 중 보관시에 발생할 수 있으며, 이는 항체 결합의 손실을 초래한다.
용어 "생식계열 가변 영역"은:
a) 생식계열 유전자에 의해 인코딩되는 항체 또는 이의 작용성 단편의 가변 영역의 핵산 서열 또는 아미노산 서열;
b) 생식계열 유전자에 의해 인코딩되는 항체 또는 그 작용성 단편 가변 영역의 핵산 서열 또는 아미노산 서열(이 때, 핵산 서열은, 예를 들어 코돈 최적화, 원하는 제한 부위의 첨가, GC 함량의 최적화, 원치 않는 번역후 개질(PTM) 부위의 제거, 원치 않는 mRNA 스플라이스 부위의 제거 또는 mRNA 불안정성 모티브의 제거에 의해 개질된 것임); 또는,
c) 예컨대, 원치 않는 번역후 개질(PTM) 부위의 제거, 원치 않는 시스테인의 제거, 또는 원하는 제한 부위의 도입, 또는 합성, 증폭 또는 클로닝 중의 오류에서 기인한 개질의 목적으로, 아미노산 서열 중 약한 돌연변이를 갖는, 생식계열 유전자에 의해 인코딩되는 항체 또는 이의 작용성 단편의 가변 영역의 핵산 서열 또는 아미노산 서열
을 의미한다.
본 개시 내용의 의미에서, "생식계열 가변 영역"은 "생식계열 VH 영역" 또는 "생식계열 VL 영역"이다. 개과 "생식계열 가변 영역"의 예가 표 1에 나타나 있다.
용어 "가변 중쇄 및 가변 경쇄 조합" 또는 "VH/VL 조합"은 1개의 가변 중쇄와 1개의 가변 경쇄의 조합(짝지음)을 의미한다. 항체 및 작용성 단편, 예를 들어 Fab는 가변 경쇄에 결합한 적어도 하나의 가변 중쇄를 포함하며, 이는 항원 결합 영역을 형성한다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호 교환적으로 사용되고, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 이의 중합체를 말한다. 상기 용어는, 공지의 뉴클레오티드 유사체, 또는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 합성, 천연 발생 또는 비천연 발생의 개질 골격 잔기 또는 결합을 가지는 핵산을 포함한다. 그러한 유사체의 예는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함한다.
달리 지시하지 않는 한, 특정 핵산 서열은 명시적으로 지시한 서열뿐만 아니라, 이의 보존적으로 개질된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환) 및 상보적 서열을 또한 암시적으로 포함한다. 특히, 하기에 상술한 바와 같이, 축퇴 코돈 치환은, 하나 이상의 선택된 (또는 모두의) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "최적화된"은, 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia) 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포 또는 인간 세포내 제조가 선호되는 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 인코딩하도록 뉴클레오티드 서열이 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은, 또한 "부모" 서열로 알려진 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 인코딩되는 아미노산을 완벽하게 또는 가능한 최대로 유지하도록 조작된다. 본원에서 최적화된 서열은, 포유류 세포에서 선호되는 코돈을 가지도록 조작된 것이다. 그러나, 기타 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 이들 서열의 최적화된 발현이 또한 본원에서 상정된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열 또한 최적화된 것으로 언급된다.
용어 "아미노산"은, 천연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 천연 발생 아미노산은, 유전자 코드에 의해 인코딩되는 것뿐만 아니라, 이후 개질된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합한 알파 탄소, 카르복시 기, 아미노 기, 및 R 기를 가지는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 말한다. 그러한 유사체는, 개질된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 개질된 펩티드 골격을 가지나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는, 아미노산의 일반적 화학 구조와는 상이한 구조를 가지나 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 말한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은, 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 이들 용어는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 달리 지시하지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한, 이의 보존적으로 개질된 변이체를 암시적으로 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서의 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 하기의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나, 수작업 정렬 및 시각적 검사에 의해 측정한 비교 윈도우 또는 지정 영역에 대한 최대 일치를 위한 비교 및 정렬시, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 퍼센트(즉, 특정 영역에 대하여, 또는 미특정시에는, 전체 서열에 대하여 60% 동일성, 선택적으로는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성)를 가지면, 그 2개의 서열은 "실질적으로 동일"하다. 선택적으로, 동일성은, 적어도 약 50개 뉴클레오티드(또는 10개의 아미노산) 길이인 영역, 또는 더 바람직하게는, 100 내지 500 또는 1000개 이상 뉴클레오티드(또는 20, 50, 200개 이상의 아미노산) 길이인 영역에 대해 존재한다.
서열 비교를 위하여, 통상적으로, 하나의 서열이, 시험 서열과 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘 사용시, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 하위서열 좌표를 지정하고, 그리고 필요시에는, 서열 알고리즘 프로그램 인자를 지정한다. 디폴트 프로그램 인자를 사용할 수 있거나, 대안적인 인자를 지정할 수 있다. 이후, 프로그램 인자에 기반하여, 참조 서열에 대한 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 서열 비교 알고리즘으로 계산한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 항체"는, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창조 또는 단리된 모든 항체, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식성 또는 염색체이식성인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 그로부터 제조된 하이브리도마, 설치류, 인간 또는 개과 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합, 조합성 개과 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 개과 면역글로불린 유전자, 서열의 전부 또는 일부의 기타 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 기타 다른 수단에 의해 제조, 발현, 창조 또는 단리된 항체를 포함한다. 그러한 재조합 개과 항체는, 프레임워크 및 CDR 영역이 개과 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진다. 그러나, 특정 구현예에서, 그러한 재조합 개과 항체는, 시험관내 돌연변이유발(또는, 개과 Ig 서열에 대해 유전자이식성인 동물 사용시에는, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 이에 따라 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 개과 생식계열 VH 및 VL 서열에서 유래되고 이와 관련되었음에도, 생체의 생식계열 개과 항체 레파토리 내에서 천연으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간략히 "숙주 세포")는, 재조합 발현 벡터가 그 안에 도입된 세포를 말한다. 그러한 용어는, 특정 대상 세포뿐만 아니라, 그러한 세포의 자손까지 말하고자 하는 것임을 이해하여야만 한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 특정 개질이 후속의 세대에서 발생할 수 있으므로, 그러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 "숙주 세포"의 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
용어 "벡터"는, 그에 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 전달할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 말한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는, 추가의 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 고리를 말한다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터로, 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 기타 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)를 숙주 세포 내로 도입하여, 숙주 세포의 게놈 내로 일체화할 수 있으며, 이에 따라 숙주 게놈과 함께 복제된다. 나아가, 특정 벡터는, 그들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간략히, "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드"와 "벡터"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은, 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 기타 다른 형태의 발현 벡터를 포함하고자 한다.
"디스플레이 벡터"는, 디스플레이 벡터로 형질전환된 박테리아 숙주 세포와 같은, 숙주 세포 내에서 염색체 외적으로 재조합 DNA 분자의 복제 및 유지를 지시하는 능력을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 그러한 DNA 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 디스플레이 벡터는, 예를 들어 파지 벡터 또는 fd, M13, 또는 fl 섬유상 박테리오파지 부류로부터 기원한 파지미드 벡터일 수 있다. 그러한 벡터는, 예를 들어 결합 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 단백질의, 섬유상 박테리오파지 표면상의 디스플레이를 촉진할 수 있다. (예를 들어, 바이러스 벡터 또는 키메라 단백질을 인코딩하는 벡터와 같이) 파지, 리보솜, DNA, 박테리아 세포 또는 진핵 세포, 예를 들어 효모 또는 포유류 세포 상의 디스플레이에 적합한 디스플레이 벡터 또한 당업계에 알려져 있다.
"고유(unique)"한 제한 부위는 주어진 핵산 분자상에 단지 1회 존재하거나 출현하는 제한 부위이다. 통상적으로, 그러한 핵산 분자는, 본 발명의 라이브러리 구성원을 인코딩하는 벡터이다.
용어 "위치-의존적 아미노산 사용"은, 폴리펩티드 내 주어진 위치에서 특정 아미노산 서열 발생의 가능성을 말한다. 본 발명에서, 위치-의존적 아미노산 사용은, 개개의 생식계열 유전자에 의해 분류된 재배열 아미노산 서열에 대해 결정된다. 이는, 그 천연 생식계열 내용 안에서의 개별적이며 정확한 CDR 설계를 가능하게 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "본질적으로 모든"은, 그것이 언급하는 성분이 거의 순수한 것을 의미한다. 성분의 유리한 특성을 제한하거나 그에 영향을 끼치지 않는 단지 소량 또는 기타 다른 상이한 성분이 존재한다. 성분의 본성에 따라, 본질적으로 모든은, 그 성분의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%를 말할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PTM-로우"는, 잠재적인 번역후 개질(PTM) 부위를 제거하기 위해 Kabat H-CDR1 및/또는 H-CDR2 내에서 개질된 항체 생식계열 VH 및/또는 VL 아미노산 서열을 말한다. 바람직하게, FR1, FR2, FR3 및 FR4 프레임워크 영역 내의 잠재적인 PTM 모티브는, 개질되지 않는다.
중쇄, 카파 경쇄, 및 람다 경쇄 FR4에 대한 J 영역 아미노산 서열은, 각각 표 2에 나타낸 바와 같이 WGQGTLVTVSS(서열 번호 37), FGAGTKVELK(서열 번호 38) 및 FGGGTQLTVL(서열 번호 39)이다.
발명의 구현예
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 생식계열 VH1 영역의 구성원을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은, Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)의 최적화된 변이체로부터 선택된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은, Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되는 생식계열 VH1 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일하다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은, Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되고, 이 때 번역후 개질(PTM) 부위는 제거된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은, Vs618-PTM-로우(서열 번호 9), Vs624-PTM-로우(서열 번호 6), Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7)로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본원에 개시된 합성 개과 항체 라이브러리는 미편향이다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 합성 개과 항체 라이브러리는 완전 합성 개과 항체 라이브러리이다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 천연 개과 VH 레파토리의 50% 초과를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 천연 개과 VH 레파토리의 60% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 하나의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(서열 번호 15)로부터 선택된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VL 영역은 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(서열 번호 15)의 최적화된 변이체로부터 선택된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(서열 번호 15)로부터 선택되는 생식계열 VL 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일하다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(서열 번호 15)로부터 선택되고, 이 때 번역후 개질(PTM) 부위는 제거된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18), Vs365(람다)(서열 번호 13), Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 천연 개과 VL 레파토리의 50% 초과를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 천연 개과 VL 레파토리의 60% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 하나의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역 및 생식계열 VL 영역의 하나 이상은 생식계열 VH1 영역 또는 생식계열 VL 영역의 최적화된 변이체이다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역은 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역은 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택되고, 이 때 번역후 개질(PTM) 부위는 제거된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은, Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되는 생식계열 VH1 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일하고, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택되는 생식계열 VL 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일하다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은 Vs618-PTM-로우(서열 번호 9), Vs624-PTM-로우(서열 번호 6), Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7)로부터, 및 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 하나의 생식계열 VL 영역의 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 생식계열 VL 영역의 VH/VL 조합을 포함한다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역은 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13), Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역은 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택되고, 이 때 번역후 개질(PTM) 부위는 제거된다.
특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은, Vs618(서열 번호 4), Vs628(서열 번호 5), Vs624(서열 번호 1) 및 Vs635(서열 번호 2)로부터 선택되는 생식계열 VH1 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일하고, 상기 생식계열 VL 영역은, Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택되는 생식계열 VL 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일하다. 특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역은 Vs618-PTM-로우(서열 번호 9), Vs624-PTM-로우(서열 번호 6), Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7)로부터, 및 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs323(람다)(서열 번호 16)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합 및 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
본 개시 내용의 특정 양태에서, 상기 VH/VL 조합은, 서열 번호 4, 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 12, 서열 번호 16, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 13에 따른 생식계열 VH1 영역 및/또는 생식계열 VL 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일한 생식계열 VH1 또는 생식계열 VL 영역을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs323(람다)(서열 번호 16)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합 및 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 적어도 9개의 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs323(람다)(서열 번호 16)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합으로부터 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 적어도 9개의 VH/VL 조합으로 구성되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs323(람다)(서열 번호 16)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 1) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 2) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합으로 구성되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 구현예에서, 본 개시 내용은 개과 H-CDR3 레파토리의 천연 발생 H-CDR3 길이의 50% 초과를 포함하는 H-CDR3를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 개과 H-CDR3 레파토리의 천연 발생 H-CDR3 길이의 60% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 라이브러리의 본질적으로 모든 구성원의 H-CDR3 영역이 고유 제한 부위에 측접되어 있는, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 5 내지 16개 아미노산 Kabat 길이의 H-CDR3를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 5개 아미노산 및/또는 6개 아미노산 및/또는 7개 아미노산 및/또는 8개 아미노산 및/또는 9개 아미노산 및/또는 10개 아미노산 및/또는 11개 아미노산 및/또는 12개 아미노산 및/또는 13개 아민노산 및/또는 14개 아미노산 및/또는 15개 아미노산 및/또는 16개 아미노산 Kabat 길이의 H-CDR3를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 표 4 내지 15에 나타낸 바와 같은 H-CDR3 설계를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, H-CDR3 영역이 적어도 1.0*109의 다양성을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 구현에서, 본 개시 내용은, H-CDR3 영역이 적어도 1.0*1010, 적어도 1.0*1011, 적어도 1.0*1012 또는 적어도 1.0*1013의 다양성을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 라이브러리의 본질적으로 모든 구성원의 L-CDR3 영역이 고유 제한 부위에 측접되어 있는, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 개과 L-CDR3 레파토리의 천연 발생 L-CDR3 길이의 80% 초과를 포함하는 L-CDR3를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 상기 라이브러리는, 개과 L-CDR3 레파토리의 천연 발생 L-CDR3 길이의 85% 초과, 90% 초과 또는 95% 초과를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, V카파에 있어서 9개 아미노산 길이의 Kabat L-CDR3를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은, 라이브러리의 본질적으로 모든 V카파 구성원의 L-CDR3이 라이브러리 9개 아미노산 Kabat 길이인 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, V람다에 있어서 10개 및/또는 11개 아미노산 Kabat 길이의 L-CDR3를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 특정 양태에서, 본 발명은, 라이브러리의 본질적으로 모든 V람다 구성원의 L-CDR3이 10개 및/또는 11개 아미노산 길이인 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 표 16에 나타낸 바와 같은 V카파 L-CDR3 설계를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 표 17 및 18에 나타낸 바와 같은 V람다 L-CDR3 설계를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, L-CDR3 영역이 적어도 1.0*104의 다양성을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은, L-CDR3 영역이 적어도 1.0*105, 적어도 1.0*106, 적어도 1.0*107 또는 적어도 1.0*108의 다양성을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 표 4 내지 15에 나타낸 바와 같은 H-CDR3 설계 및 표 16과 표 17 및 18에 나타낸 바와 같은 L-CDR3 설계를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 파지 입자 상에 효율적으로 디스플레이되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VH 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VL 영역을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리에 포함된 각각의 VH/VL 조합은 효율적으로 디스플레이된다. 디스플레이 효율은, 본원에서 실시예 2.6에 기재된 바와 같이 샌드위치 파지 ELISA에 의해 측정될 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VH 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VL 영역을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리에 포함된 각각의 VH/VL 조합은 파지 당 적어도 0.5 Fab의 디스플레이율을 가지며 효율적으로 디스플레이된다. 추가의 구현에에서, 디스플레이율은 파지 당 적어도 0.6, 적어도 0.7, 적어도 0.8, 적어도 0.9, 적어도 1, 적어도 1.1, 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2, 적어도 2.1, 적어도 2.2, 적어도 2.3, 적어도 2.4, 적어도 2.5, 적어도 2.6, 적어도 2.7, 적어도 2.8, 적어도 2.9, 적어도 3.0, 적어도 3.1, 적어도 3.2, 적어도 3.3, 적어도 3.4, 적어도 3.5, 적어도 3.6, 적어도 3.7, 적어도 3.8, 적어도 3.9 또는 적어도 4 Fab이다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VH 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VL 영역을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 Fab 포맷으로 대장균 내에서 발현된 본질적으로 모든 VH/VL 조합은, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 단량체 함량을 가진다. 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VH 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VL 영역을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 Fab 포맷으로 대장균 내에서 발현된 상기 라이브러리의 각각의 VH/VL 조합은, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 단량체 함량을 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 Fab 포맷으로 대장균 내에서 발현된 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VH 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VL 영역을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리에 포함된 각각의 VH/VL 조합은, 대장균 내에서 Fab 포맷으로 잘 발현된다. 대장균 내 Fab 포맷의 발현은 정량화될 수 있다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 박테리아 배양액중 1 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 박테리아 배양액중 5 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 대부분의 VH/VL 조합이 박테리아 배양액중 10 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 VH/VL 조합이 박테리아 배양액중 1 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 잘 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VH 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VL 영역을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리에 포함된 각각의 VH/VL 조합은, 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 잘 발현된다. 포유류 시스템 내 IgG 포맷의 발현은 정량화될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 포유류 시스템은 포유류 현탁 배양액이다. 다른 양태에서, 상기 포유류 시스템은 포유류 부착성 세포 배양액이다. 특정 양태에서, 상기 IgG 포맷은 개과 IgG-B 포맷이다. 다른 양태에서, 상기 IgG 포맷은 개과 IgG-A, IgG-C 또는 IgG-D 포맷이다. 특정 양태에서, 상기 포유류 시스템은 HKB11 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 포유류 시스템은 PERC.6 세포를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 포유류 시스템은 CHO 세포를 포함한다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 5 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 10 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 대부분의 VH/VL 조합이 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 15 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개의 VH/VL 조합이 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 20 mg/L 초과의 수준으로 발현되는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 상기 라이브러리의 모든 또는 실질적으로 모든 구성원이 30%(v/v) 농도의 이소프로판올 중 안정적인 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 이는, 안정적인 프레임워크의 모든 CDR 유도체가 시험한 VH/VL 쌍과 같이 거동할 것이라는 가정이다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 모든 또는 실질적으로 모든 VH/VL 조합이 열적으로 안정적인 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 열적 안정성은 본 출원에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 62℃ 초과의 Tm을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 64℃ 초과의 Tm을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 본질적으로 모든 VH/VL 조합이 66℃ 초과의 Tm을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 대부분의 VH/VL 조합이 68℃ 초과의 Tm을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 다수의 VH/VL 조합이 70℃ 초과의 Tm을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 모든 또는 실질적으로 모든 VH1-조합이 70℃ 초과의 Tm을 가지는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본원에 개시된 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 하나의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 라이브러리가 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다. 다른 양태에서, 본 개시 내용은, 상기 라이브러리가 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공하며, 여기서 상기 생식계열 VH1 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs618(서열 번호 22), Vs624(서열 번호 19), Vs628(서열 번호 23) 및 Vs635(서열 번호 20)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs321(람다)(서열 번호 32), Vs323(람다)(서열 번호 34), Vs365(람다)(서열 번호 31) 및 Vs834(람다)(서열 번호 33)로부터 선택된다. 특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs618(서열 번호 22), Vs624(서열 번호 19), Vs628(서열 번호 23) 및 Vs635(서열 번호 20)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs321(람다)(서열 번호 32), Vs323(람다)(서열 번호 34), Vs365(람다)(서열 번호 31), 및 Vs834(람다)(서열 번호 33)로부터 선택되며, 여기서 번역후 개질(PTM) 부위는 제거된 것이다. 특정 양태에서, 상기 핵산 분자는 Vs618-PTM-로우(서열 번호 22), Vs624-PTM-로우(서열 번호 24), Vs628-PTM-로우(서열 번호 28) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 25)로부터, 그리고 Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs321(람다)(서열 번호 32), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 36), VS843(람다)(서열 번호 33) 및 Vs365(람다)(서열 번호 31)로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 적어도 하나의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 하나의 생식계열 VL 영역의 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다. 다른 양태에서 본 개시 내용은, 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개의 생식계열 VH1 영역 및 적어도 2개 또는 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 생식계열 VL 영역의 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs618(서열 번호 22), Vs624(서열 번호 19) 및 Vs635(서열 번호 20)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs323(람다)(서열 번호 34) 및 Vs365(람다)(서열 번호 31)로부터 선택된다. 특정 양태에서, 상기 생식계열 VH1 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs618(서열 번호 22), Vs624(서열 번호 19), Vs628(서열 번호 23) 및 Vs635(서열 번호 20)로부터 선택되고, 상기 생식계열 VL 영역을 인코딩하는 상기 핵산 분자는 Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs321(람다)(서열 번호 32), Vs323(람다)(서열 번호 34), Vs365(람다)(서열 번호 31) 및 Vs843(람다)(서열 번호 33)으로부터 선택되며, 여기서 번역후 개질(PTM) 부위는 제거된 것이다. 특정 양태에서, 상기 핵산 분자는 Vs618-PTM-로우(서열 번호 22), Vs624-PTM-로우(서열 번호 24) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 25)로부터, 그리고 Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs321(람다)(서열 번호 32), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 36), Vs365(람다)(서열 번호 31) 및 Vs843(람다)(서열 번호 33)으로부터 선택된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, Vs618(서열 번호 22), Vs624(서열 번호 19), Vs628(서열 번호 23 및 Vs635(서열 번호 20)로부터 선택되는 생식계열 VH1 영역을 인코딩하는 핵산 분자 및 Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs321(람다)(서열 번호 32), Vs323(람다)(서열 번호 34), Vs365(람다)(서열 번호 31) 및 Vs843(람다)(서열 번호 33)으로부터 선택되는 생식계열 VL 영역을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 VH/VL 조합으로부터 선택되는 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다. 본원 개시 내용의 특정 양태에서, 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 상기 핵산 분자는, Vs618(서열 번호 22), Vs624(서열 번호 19), Vs628(서열 번호 23 또는 Vs635(서열 번호 20), Vs236(카파)(서열 번호 30), Vs321(람다)(서열 번호 32), Vs323(람다)(서열 번호 34), Vs365(람다)(서열 번호 31) 및/또는 Vs843(람다)(서열 번호 33)으로부터 선택되는 핵산 분자와 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%의 동일성으로 동일하다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 19) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 20) 및 생식계열 VL 영역 Vs323(람다)(서열 번호 34)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 19) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 분자 및 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 20) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 적어도 9개의 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 핵산은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22), 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30), 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 19), 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30), 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 20), 생식계열 VL 영역 Vs323(람다)(서열 번호 34), 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22), 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31), 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 19), 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31), 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 20) 및/또는 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 중 하나 이상의 최적화된 변이체이다. 특정 양태에서, 상기 핵산은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22), 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30), 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 19), 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30), 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 20), 생식계열 VL 영역 Vs323(람다)(서열 번호 34), 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22), 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31), 생식계열 VH1 영역 Vs624(서열 번호 19), 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31), 생식계열 VH1 영역 Vs635(서열 번호 20) 및/또는 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 핵산 중 하나 이상의 PTM-로우 변이체이다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역 Vs618-PTM-로우(서열 번호 27) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 24) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 30)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 25) 및 생식계열 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 36)를 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs618-PTM-로우(서열 번호 27) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 24) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 분자, 및 생식계열 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 25) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 31)를 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22) 및 생식계열 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 33)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 24) 및 생식계열 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 33)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 25) 및 생식계열 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 33)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22) 및 생식계열 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 36)를 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 24) 및 생식계열 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 36)를 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 22) 및 생식계열 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 32)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 24) 및 생식계열 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 32)을 인코딩하는 핵산 분자, 생식계열 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 25) 및 생식계열 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 32)을 인코딩하는 핵산 분자에 의해 인코딩되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 또는 적어도 9개의 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본 개시 내용의 구현예에 개시된 핵산 분자를 인코딩하는 벡터를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본 개시 내용의 구현예에 개시된 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
일 양태에서, 본 개시 내용은, 항원에 특이적인 항체를 단리하는 방법을 제공하며, 그 방법은
(a) 본원에 개시된 구현예 중 어느 하나에 따른 라이브러리를 항원과 접촉시키는 단계;
(b) 항원에 결합하지 않은 라이브러리의 구성원을 제거하는 단계; 및
(c) 항원에 결합한 라이브러리의 구성원을 회수하는 단계
를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 우수한 생물리 특성을 가진 개과 항체를 제공한다. 그러한 항체는, 생체내 성숙을 거치지 않은 합성 라이브러리로부터 유래된 항체의 단점을 갖지 않는다. 그러한 우수하고도 바람직한 생물리 특성은, 보다 더 높은 안정성, 보다 더 높은 발현 수준, 및 낮은 응집 경향을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 본 개시 내용에 의해 고려된 개과 라이브러리로부터 단리된 항체를 제공한다. 특정 양태에서, 상기 항체는, 본 개시 내용에 의해 고려된 개과 라이브러리로부터 단리된 항체의 개질 또는 변이체 항체일 수 있다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 하나의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323(람다)(서열 번호 16), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs834(람다)(서열 번호 15) 중 적어도 하나를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 번역후 개질(PTM) 부위는 생식계열 VH 영역 또는 생식계열 VL 영역 중 하나 이상으로부터 제거된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624-PTM-로우(서열 번호 6), Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), 및 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs834(람다)(서열 번호 15)를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 하기 VH/VL 조합 중 하나 이상을 포함한다: VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 및 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리의 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 파지 당 적어도 0.5 Fab의 디스플레이율로 효율적으로 디스플레이된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 대장균 중 Fab 포맷으로 발현시 적어도 85%의 단량체 함량을 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 발현시 적어도 90%의 단량체 함량을 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 모든 VH/VL 조합이 열적으로 안정적이다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 상기 언급한 라이브러리의 구성원을 인코딩하는 핵산 분자의 집합을 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 상기 언급한 핵산 분자를 인코딩하는 벡터를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 상기 언급한 핵산 분자 또는 상기 언급한 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다.
특정 양태에서 본 개시 내용은, 항원에 특이적인 항체를 단리하는 방법을 제공하며, 그 방법은
(a) 상기 언급한 라이브러리를 항원과 접촉시키는 단계;
(b) 항원에 결합하지 않은 라이브러리의 구성원을 제거하는 단계; 및
(c) 항원에 결합한 라이브러리의 구성원을 회수하는 단계
를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 상기 언급한 라이브러리로부터 단리 또는 상기 언급한 방법으로 단리된 항체를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, VH1으로부터 선택되는 생식계열 VH 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624-PTM-로우(서열 번호 6), Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 중 적어도 하나의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 카파 V-III, 람다 V-I, 및 람다 V-III으로부터 선택되는 생식계열 VL 영역의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15) 중 적어도 하나를 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, VH 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624-PTM-로우(서열 번호 6), Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7), 및 VL 영역인 Vs236(카파)(서열 번호 12), Vs321(람다)(서열 번호 14), Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18), Vs365(람다)(서열 번호 13) 및 Vs843(람다)(서열 번호 15)을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다. 특정 양태에서, 본 개시 내용은, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 생식계열 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, 생식계열 VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 생식계열 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs323-PTM-로우(람다)(서열 번호 18)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs618(서열 번호 4) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs624-PTM-로우(서열 번호 6) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs321(람다)(서열 번호 14)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs635-PTM-로우(서열 번호 7) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs236(카파)(서열 번호 12)의 VH/VL 조합, VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs365(람다)(서열 번호 13)의 VH/VL 조합, 및 VH1 영역 Vs628-PTM-로우(서열 번호 10) 및 VL 영역 Vs843(람다)(서열 번호 15)의 VH/VL 조합으로부터 선택되는 VH/VL 조합을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리를 제공한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 개과 H-CDR3 레파토리의 천연 발생 H-CDR3 길이의 50% 초과를 포함하는 H-CDR3을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 5 내지 16개 아미노산 Kabat 길이의 H-CDR3를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 표 4 내지 표 15에 나타낸 H-CDR3 설계를 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 H-CDR3 영역에서 적어도 5E+09의 다양성을 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 라이브러리의 L-CDR3은, 8개 아미노산(카파) Kabat 길이 및 10개 및 11개 아미노산(람다) Kabat 길이이다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 표 16 및 표 17 및 18에 나타낸 L-CDR3 설계를 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 L-CDR3 영역에서 적어도 1E+04 의 다양성을 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리의 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 효율적으로 디스플레이된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리의 본질적으로 모든 VH/VL 조합은, 파지당 적어도 0.5 Fab의 디스플레이율을 가지고 효율적으로 디스플레이된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 대장균 중 Fab 포맷으로 발현된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 대장균 중 Fab 포맷으로 발현된 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 적어도 85%의 단량체 함량을 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 발현된다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 포유류 시스템 내에서 IgG 포맷으로 발현된 본질적으로 모든 VH/VL 조합은 적어도 90%의 단량체 함량을 가진다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 모든 VH/VL 조합은 열적으로 안정적이다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 라이브러리의 본질적으로 모든 구성원의 H-CDR3 영역은 고유 제한 부위에 측접되어 있다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 라이브러리의 본질적으로 모든 구성원의 L-CDR3 영역은 고유 제한 부위에 측접되어 있다.
특정 양태에서, 본 개시 내용은, 합성 개과 항체 라이브러리를 제공하며, 여기서 상기 라이브러리는 미편향 라이브러리이다.
도 1
41개 개과 VH 유전자의 동일성 표 분석은, 정렬에 포함된 서열들의 모든 가능한 서열쌍에 대한 거리값을 나타낸다. 서열쌍 간의 거리 점수(즉, 100 마이너스(-) 동일성 점수)를 나타낸다. 서열쌍 간의 동일성 점수는, 그 쌍간의 모든 무갭 (ungapped) 위치들 중 동일 잔기의 퍼센트이다.
도 2
29개 개과 V카파 유전자의 동일성 표 분석은, 정렬에 포함된 서열들의 모든 가능한 서열쌍에 대한 거리값을 나타낸다. 서열쌍 간의 거리 점수(즉, 100 마이너스 동일성 점수)를 나타낸다. 서열쌍 간의 동일성 점수는, 그 쌍간의 모든 무갭 위치들 중 동일 잔기의 퍼센트이다.
도 3
86개 개과 V람다 유전자의 동일성 표 분석은, 배열에 포함된 서열들의 모든 가능한 서열쌍에 대한 거리값을 나타낸다. 서열쌍 간의 거리 점수(즉, 100 마이너스 동일성 점수)를 나타낸다. 서열쌍 간의 동일성 점수는, 그 쌍간의 모든 무갭 위치들 중 동일 잔기의 퍼센트이다.
도 4
Fab-디스플레이율을 평가하기 위한 VH/VL 구축물 하위군의 웨스턴 블롯 분석.
도 5
효율적인 파지 디스플레이를 위한 적합한 디스플레이율(통상 0.5 내지 2 Fab/파지)을 나타내는, 도 4에 나타낸 블롯의 밀도계 분석.
도 6
ELISA에 의해, 30개의 VH/VL 조합을 박테리아 세포 용해물 중 상대적 Fab 발현에 대해 분석하였으며, 이 때 각각의 VH/VL 쌍의 발현 수준은 참조 Fab 대조군의 발현과 비교하여 측정하였다. 본질적으로 모든 시험된 Fab VH/VL 쌍이 대조군의 적어도 0.5의 상대적 발현을 나타내었다. 람다 클론은 평균하여, 가장 높은 상대적 Fab 발현 수준을 가졌다. 샘플 번호는 표 3에 코드화되어 있다.
도 7
30개 VH/VL 조합의 Fab 발현 수율(막대로 표시됨; 왼쪽 축) 및 단량체 함량(도트로 표시됨: 오른쪽 축). 샘플 번호는 표 3에 코드화되어 있다.
도 8
30개의 VH/VL 조합의 연구-스케일 IgG 발현 수율(막대로 표시됨; 왼쪽 축) 및 단량체 함량(도트로 표시됨: 오른쪽 축). 샘플 번호는 표 3에 코드화되어 있다.
도 9
관련 고유 제한 부위를 포함한 파지 디스플레이 벡터 pCaDis의 필수 부위를 나타낸다.
도 10
관련 고유 제한 부위를 포함한 박테리아 Fab 발현 벡터 pCaBx의 필수 부위를 나타낸다.
도 11
라이브러리 조성에 따라 기대되는 바와 같은, VH 마스터유전자 분포로 나타낸 개과 항체 라이브러리의 높은 품질 및 올바름(correctness).
도 12
예시적인 경쇄 CDR에 대한 라이브러리 중 상응하는 위치(오른쪽 막대)에서 수득된 아미노산과 비교한 설계된 아미노산의 분포(왼쪽 막대)는, 합성 라이브러리의 정확하고 올바른 조성을 확인시켜준다.
도 13
약 7,900,000개 서열의 MiSeq NGS 품질 제어 이후 수득된 CDR-H3 길이 분포(진한 막대)와 비교한 CDR-H3 길이 분포(흰 막대)의 설계.
도 14
Fab 스크리닝 결과의 도트 블롯(dot blot) 시각화. eGFP에 대한 특이 결합의 배경값에 대한 신호를 x축에 나타내고(직접적인 ELISA), Fab 발현의 결과는 y축에 나타낸다(Fab-포획 ELISA에서의 배경에 대한 신호). 도트의 형상은, 각각의 패닝 하위코드(panning subcode)를 나타낸다.
실시예
실시예 1: 합성 개과 항체 라이브러리의 생성
본 개시 내용은, 개과 면역 레파토리에 존재하는 개과 VH 및 VL 유전자 쌍을 포함하는 항체 후보의 집합 또는 라이브러리를 제공하며, 여기서 각각의 구성원은, 생식계열 유전자 서열 또는 항체 발현 및 생물리 특성을 추가로 최적화하기 위해 바람직하지 않은 번역후 개질(PTM) 부위를 제거하기 위해 개질된 생식계열 서열 (PTM-로우로 언급됨)을 포함한다. 라이브러리 내로의 혼입을 위해 선택된 VH 및 VL 쌍은, 라이브러리로부터 선택되는 각각의 항체가 간편하게 발달되도록하는 가능성을 증가시키는 유리한 생물리 특성을 포함한다. 라이브러리의 조성을 결정하기 위해, 다중의 기준을 평가하여야만 한다. 하기의 실시예들은 평가된 기준, 평가 방법 및 결과를 기재한다.
실시예 1.1: 후보 VL- 및 VH-생식계열 서열의 선택
제1 단계에서, 개과 면역 레파토리로부터의 우세한 VH 및 VL 생식계열 유전자를 문헌(Bao et al. Vet Immunol Immunopathol. 2010 Sep 15;137 (1-2):64-75; Steiniger et al. Mol Immunol. 2014 May;59(1):71-8) 및 Bao외 다수(Vet Immunol Immunopathol. 2010 Sep;137(1-2):64-75), Braganza외 다수(Vet Immunol Immunopathol. 2011 Jan;139(1):27-40), Vgene repertorie.org 및 AbYsis (http://www.bioinf.org.uk/abysis2.7/index.html)로부터 얻을 수 있는 재배열된 개과 항체 서열 분석에 의해 동정하였다. 총 300개 초과의 재배열된 개과 VH, 100개 초과의 V카파 및 150개 초과의 V람다 서열을 분석하였다. 효율적인 항원-항체 상호작용을 위해서 폭넓은 구조-공간이 유리할 것으로 인식되므로, 최종 선택 중 구조적으로 상이한 서열들을 포함하도록 주의하였다. 따라서, 제2 단계에서는, 개과 생식계열 레파토리로부터의 구조적으로 다양한 VH 및 VL (V카파 및 V람다) 유전자를 거리 분석에 의해 동정하였다. 결과를 도 1, 2, 및 3에 나타낸다.
제한 효소를 위한 측접 부위를 가진 V 영역을, hu4D5-8 항체의 CDR-H3(WGGDGFYAMDY)(서열 번호 43) 및 카파 CDR-L3(QQHYTTPPT)(서열 번호 44) 및 람다-유사 CDR-L3(QSYDSSLSGVV)(서열 번호 45) 서열, 및 개과 JH, J카파 및 J람다 생식계열 단백질 서열(표 2 참조) 각각을 이용하여 GeneArt에 의해 합성하였다. 대장균 발현에 관련한 코돈 사용 최적화(드문 인간 코돈을 피하기 위함), 매우 높거나(80% 초과) 또는 매우 낮은(30% 미만) GC 함량의 영역 회피, 및 RNA 불안정 모티브 및 암호성 스플라이스 공여체 및 수용체 부위와 같은 잠재적인 시스-작용 서열 모티브의 제거를 GeneArt에 의해 실시하였다. 합성된 Ig V 영역 중쇄 유전자는, MfeI에 대한 고유한 5' 제한 부위를 포함하는 제1 아미노산(EVQL)(서열 번호 46)으로부터 V에서 C 영역 경계에 위치하는 XhoI에 대한 고유한 3' 제한 부위까지의 전체 서열을 포함하였다. CDR-H3의 상류에, 후속의 CDR-H3 라이브러리 삽입을 가능하게 하도록 BssHII에 대한 제한 부위를 혼입하였다. Ig V카파 및 V람다 영역 경쇄 유전자 서열은, 개질된 ompA 리더 서열 내에 위치하는 NdeI에 대한 제1의 고유한 5' 제한 부위부터 프레임워크 영역(FR4) 내의 Acc65I/KpnI에 대한 3' 제한 부위까지 걸치는 것이었다. CDR-L3의 상류에, 후속의 CDR-L3 라이브러리 삽입을 가능하게 하도록 BbsI에 대한 제한 부위를 혼입하였다. 이후, 5개의 선택된 VH, 4개의 V람다, 및 2개의 V카파 유전자로부터 VH/VL 유전자 쌍을 조합하여 30개의 VH/VL 조합을 창조하였다. 5개의 VH 영역 구축물(구축물 A 내지 E)을, 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 2개의 V카파 영역 구축물(#1 및 #2) 또는 4개의 V람다 영역 구축물(#3 내지 #6)과 함께 파지 디스플레이 벡터 pCaDis18(gIII - Fab 유전자 융합)(도 9 참조) 및 박테리아 Fab 발현 벡터 pCaBx_FH(도 10 참조) 내로 클로닝하였다. 유지된 모든 조합들을 서열 검증하였다. 마지막으로, 이들 30개의 VH/VL 쌍을 실험적으로 비교하여, 바람직한 생물리 특성을 갖는 VH/VL 유전자의 하위세트를 동정하였다. 적어도 다음의 특성들을 평가하였다: 1) 인실리코 분석: a) CDR1+CDR2 길이; b) 번역후 개질 모티브(PTM); c) CDR 중 메티오닌의 존재; d) 시스테인의 존재; 2) Fab 디스플레이율; 3) Fab 및 IgG 발현율 및 수율; 4) Fab 및 IgG 단량체 함량.
실시예 1.2: 개과 H-CDR3의 설계
항체 및 항원간의 가장 가까운 접촉 부위가 항체의 상보성 결정 영역(CDR)이다. H-CDR3 및 L-CDR3은 항원 결합에 있어 주요 역할을 담당하며, 따라서 이들 2개의 CDR에 변이성을 주로 도입하였다. 기타 다른 모든 CDR에 대해서는, 생식계열 서열 또는 제거된 PTM 모티브를 가지는 개질된 생식계열 서열을 사용하였다.
시스테인 잔기는 CDR3의 설계에서 일반적로 회피되었는데, 이는, 결합체(binder)와 패닝 표적을 공유 연결하는 이황화 결합의 형성 또는 항체 동종이량체의 정보와 시스테인 잔기가 관련되기 때문이다. 그러한 결합체는 표적-선택성이 될 가능성이 있을 것 같지 않다.
재배열된 항체-서열을 취합하여, 개과 CDR3의 설계를 위해 H-CDR3 및 L-CDR3을 분석하였다. H-CDR3의 분석은, VH 생식계열 패밀리와 무관하게 모든 재배열된 서열에 대해 실시되었는데, 이는, H-CDR3이 D- 및 J-절편에 의해 VH-독립적으로 인코딩되기 때문이다.
본 발명자들의 아미노산 분포 분석에 따르면, 기재한 바와 같이, 개과 VH CDR3 중 가장 높은 빈도의 아미노산 모티브는 IMGT 위치 104 내지 106(Chothia 위치 92 내지 94)의 CAR/CAK이고, 위치 IMGT 115 내지 117(Chothia 위치 100x-94)의 FDY 모티브(Steiniger Molecular Immunology 59 (2014) 71-78)인 것으로 확인되었다.
예를 들어, 시스테인의 완전 회피, 감소된 트립토판 사용, 및 글리코실화 부위(NxS, NxT)의 회피에 의해, 관측된 아미노산 분포를 다소 변경하여, 라이브러리 중 5 내지 16개 아미노산 길이의 H-CDR3 설계를 최종 결정하였다(표 4 내지 15 참조).
실시예 1.3.: L-CDR3의 설계
VL 생식계열 패밀리와 무관하게, 모든 재배열된 서열에 대해 L-CDR3 분석을 실시하였는데, 이는, L-CDR3이 부분적으로는 J-절편에 의해 생식계열-독립적으로 인코딩되기 때문이다. 개과 재배열된 V카파-서열 분석에 기반하여, 9개 아미노산의 Kabat L-CDR3-길이가 모든 V카파 서열의 약 85%에서 발생하는 것이 밝혀졌다. 따라서, 라이브러리 중 V카파 영역에 대한 Kabat L-CDR3의 길이를 9개 아미노산 길이로 설정하였다(표 16 참조). V람다-서열에 대해서는, 가장 높은 빈도의 Kabat L-CDR3 길이가 11개의 aa(60%)이었고 그 다음으로 10개의 aa(30%)이었다. 따라서, 라이브러리 중 V람다 영역에 대한 Kabat L-CDR3의 길이를 10개 및 11개 아미노산 길이로 설정하였다(표 17 및 표 18 참조). 예를 들어, 시스테인의 완전 회피 및 글리코실화 부위(NxS, NxT)의 회피에 의해, 관측된 아미노산 분포를 다소 변경하여, 라이브러리 중 L-CDR3 설계를 최종 결정하였다.
실시예 1.4: 개과 라이브러리의 다양화
본 연구에서 생성한 개과 항체 라이브러리는, 다양화된 L-CDR3 및 H-CDR3 영역을 포함한다. CDR3 라이브러리 카세트를, 시스테인-코돈 및 정지-코돈의 도입을 방지하는, CDR3-카세트 내로 원하는 코돈만을 조절하에 혼입하도록 허용하는 Slonomics 기술에 의해 생성하였다(Van den Brulle et al. Biotechniques. 2008 Sep;45(3):340-3). 라이브러리 생성 이후 미선택된 클론의 서열분석에 따르면, L-CDR3 및 H-CDR3 카세트의 바람직하지 않은 DNA 돌연변이, 결실, 삽입 및 프레임시프트의 전반적 발생이 낮은 것으로 나타났다.
본 발명자들은, VH 및 VL-도메인의 생화학 및 생물리 특성이 이들 도메인의 H-CDR3 및 L-CDR3 서열 각각에 또한 의존하는 것으로 판단하고, 이에 따라, 본 발명자들은 VH/VL 비교 목적을 위해, 선택된 개과 VH, V카파 및 V람다 유전자 각각에 하나의 특정 H-CDR3, 카파 L-CDR3 및 람다 L-CDR3 서열을 도입하기로 결정하였다. H-CDR3(WGGDGFYAMDY)(서열 번호 43) 및 카파 L-CDR3 서열(QQHYTTPPT)(서열 번호 44)은 항체 hu4D5-8(Carter et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:4285-9;)로부터 유래된 것이고, 람다-유사 L-CDR-3(QSYDSSLSGVV)(서열 번호 45)을 사용하였으며, 이들은 모두 인간 마스터-유전자의 평가를 위해 이전에 적용되었던 것들이었다 (Knappik et al., 2000, J Mol Biol 296, 57-86; Ewert et al., J Mol Biol 2003; 325:531-53).
실시예 1.5 디스플레이 및 발현 벡터
pMORPH18(Rauchenberger et al. J Biol Chem. 2003 Oct 3;278 (40):38194-205) 및 pMORPHx30(Prassler et al. J Mol Biol. 2011 Oct 14;413(1):261-78) 벡터를, 하기의 개질과 함께, 새로운 Fab 디스플레이 pCaDis18 및 Fab 발현 벡터 pCaBx 각각의 생성을 위한 주형으로 사용하였다. 2가지 벡터 모두에 대해, Ig 경쇄 인코딩 서열 상류의 ompA 리더 서열을 그 C-말단에서 개질하여 제한 부위 NdeI를 각각 도입하여, VL 및 VH 단백질 서열의 진정한 N-말단이 되도록 하며 그리고 pCaMx IgG 벡터 내로의 Fab 단편의 간편한 서브-클로닝이 되도록 하였다. 추가로, 포유류 IgG 발현 벡터 세트를 구축하였다. 개과 IgG CH1 및 C람다와 C카파 서열을 GeneArt에 의해 합성하였다(에이치. 사피엔스(H. sapiens) 코돈 최적화). CH 구축물을 Kan 스터퍼(pCaMx_Stuffer)를 포함하는 pM4_벡터 내로 클로닝하였다. 2개의 코돈 최적화된 C람다와 C카파 서열을 일반품(generic) GeneArt 벡터 내로 클로닝하였다(pMA-T_CaMin 카파 pMA-T_CaMin 람다). IgG 전환은, 최첨단의 분자생물학 방법을 사용하여 실시하였다.
실시예 2. 개과 VH/VL 쌍의 생물리적 특성화
하기의 실시예들은, 개과 VH/VL 쌍의 생물리적 특성화의 방법 및 결과를 기재한다.
실시예 2.1 파지 제조
실시예 1.1에서 합성한 항체 조합을, 작용성 시험을 위해 Fab 디스플레이 벡터 pCaDis 내로 클로닝하였다. 벡터는, 5개의 VH 및 6개의 VL 마스터 유전자의 조합을 포함하여, 30개의 가능한 조합을 산출한다. 각각의 웰을 2xYT/Cam/1% 글루코스 매질로 충전하고, 상기 조합을 30개의 생성된 항체 구축물로부터의 단일클론으로 접종하여 마스터플레이트를 생성하였다. 플레이트를 진탕하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 마스터플레이트를, 15% 글리세롤의 최종 농도로 저장하고 -80℃에서 냉동하였다. 파지 제조를 위해, 2xYT/Cam/1% 글루코스에 마스터플레이트에서 유래된 글리세롤 스톡(stock)을 접종하고, 400 rpm 진탕하에, OD600 nm가 0.5에 이를때까지 인큐베이션하였다. 이후 세포를 VCSM 13 헬퍼 파지로 감염시키고, 진탕 없이 37℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이후, 400 rpm 진탕하에, 추가로 30분간 인큐베이션하였다. 박테리아를 원심 분리하고, 34 μg/ml 클로람페니콜, 50 μg/ml 카나마이신 및 0.25 mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(2Υ YT/Cam/Kan/IPTG)를 갖는 2xYT 매질 내에 재현탁한후, 파지 제조를 위해 22℃에서 18 내지 20시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. Fab-제시 파지 함유 상청액을 새로운 튜브에 옮기고, 파지를 1/5 상청액 부피의 PEG/NaCl(ddH2O 중 20% PEG 6000, 2.5 M NaCl)을 사용하여 침전시켰다. 원심 분리 및 상청액 제거 이후, 파지 펠릿을 멸균 PBS 중에 재현탁하였다. 파지 역가를, OD268 nm(Nanodrop, peqlab)에서의 흡광도 측정에 의해 결정하고, 감염된 LB/Cam/Gluc 플레이트 상에서의 대장균 TG1F+ 세포의 제한 희석 플레이팅에 의해 확인하였다.
실시예 2.2 웨스턴 블롯에 의한 Fab 파지 디스플레이율
실시예 2.1에서 제조한 파지 상청액을, 웨스턴 블롯 기법을 사용하여 파지 입자상의 Fab 디스플레이율의 결정에 사용하였다.
총 부피 10 μl의 약 1E+09개의 파지를 4x LDS 로딩 염료와 혼합하고, 80℃에서 10분간 가열하였다. 젤(NUPAGE 4 내지 12% Bis-Tris-Gel, 1.0 mm Х 12 웰, Novex, Cat. NP0322Box)을 전개 챔버에 넣고, 챔버를 1x MES 전개 완충액(NUPAGE 제조, MES SDS 전개 완충액으로 제조, 20x, Invitrogen)으로 채웠다. 샘플과 마커를 젤상에 로딩하고, 200 V에서 35분간 전기영동을 실시하였다. 젤을 제거하고, ddH20로 세척하고, 웨스턴 블롯 막으로의 단백질 전달을 iBlot 천공(aperture)으로 실시하였다. 이어서, 막을 TBS-T 중 10% 분유로, RT에서 1.5시간 동안 차단하였다. 막을 신속하게 TBS-T로 세척하고 항-pIII 항체(마우스 항-pIII, MoBiTec, Cat.: PSKAN3; TBS-T 중 1:1000, 3% MP)와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3Х 5분간의 세척 단계 이후, 막을 항-마우스 IgG-HRP(항-마우스 IgG-HRP (P9), Jackson Immuno Research, Code 115-036-062; TBS-T 중 1:10´000, 3% MP)와 함께 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 TBS-T로 3Х 5분 세척하고, 화학발광을 HRP-기질(Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore, Cat. WBKLS0500) 첨가 이후 Biorad Imager(프로그램: 단백질 마커를 나타내기 위해서는 "블롯 비색법(blot colorimetric)" 이고, HRP 검출을 나타내기 위해서는 "블롯 화학(blot chem")로 기록하였다. 항-pIII 웨스턴 블롯 상에서, pIII(fl) 및 pIII(ct)-Fd의 상대적인 양을 측정하였다. 결과는 도 4에 나타낸다.
파지 입자 상의 라이브러리 구성원의 효율적인 디스플레이는, 성공적인 파지 디스플레이 선택의 선행조건이다. 본 발명자들은, Fab-포맷의 개과 VH/VL 조합의 디스플레이 효율 결정을 위해 웨스턴 블롯을 사용하였다. 본 발명자들의 데이터는, 본질적으로 모든 시험된 개과 VH/VL 조합이 파지 상에서 디스플레이되었음을 나타낸다. 결과는 도 5에 나타낸다.
실시예 2.3 상대적 Fab 발현 ELISA
pCaBx 내로 클로닝된 30개 VH/VL 조합의 클론을 성장 매질(2x YT/Cam/IPTG/0.1% 글루코스) 내에 접종하고, 배양액이 다소 혼탁해질 때까지 약 3시간 동안 400 rpm에서 진탕하며 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 배양액을 22℃ 진탕 하에 밤새 인큐베이션하고, 이후, 세포를 BEL 완충액(24.7 mg/ml 붕산, 18.7 mg/ml NaCl, 1.48 mg/ml EDTA, 2.5 mg/ml 리소자임, 10 M NaOH로 pH 8.0로 조정됨)을 사용하여 용해한 후, PBS 중 10% 분유로 차단하였다. 항-개과 F(ab')2 단편 특이적 포획 항체(토끼 항-개 IgG Fab'2 항체 컨쥬게이션되지 않음; LifeSpan BioSciences, LS-C69729) 및 AP-컨쥬게이션된 항-개 IgG F(ab')2 단편 검출 항체(염소 항-개 IgG (H+L)-알칼린 포스파타제 항체, Sigma SAB3700097) 및 AttoPhos(Roche)를 사용하여 ELISA에 의해 Fab 발현을 측정하였다. 상대적 Fab 발현 수준을, 각각의 Fab VH/VL 쌍의 신호를 참조 인간/개과 키메라 항체의 신호로 나누어 계산하였다. 시험한 Fab VH/VL 쌍의 85% 초과가, 대조군의 적어도 0.5의 상대적 발현을 나타내었다. 람다 클론이, 평균하여, 최고의 상대적 Fab 발현 수준을 나타내었다. 결과는 도 6에 나타낸다.
실시예 2.4 His-태깅된 Fab 단편의 탐사적 규모의 제조
박테리아 발현 벡터에 의해 인코딩된 Fab 단편의 대장균 TG1 F- 세포 중의 발현은, 0.1% 글루코스 및 34 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 500 mL의 2xYT를 사용하여 진탕 플라스크 배양물 내에서 실시하였다. 배양물을 OD600가 0.5의 값에 이를 때까지 진탕하였다. Fab 발현을, IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드) 첨가 및 20시간 동안의 추가의 배양에 의해 유도하였다. 세포를 수확하고, 리소자임을 사용하여 붕괴시켰다. His6-태깅된(서열 번호 47) Fab 단편을 IMAC(Bio-Rad)를 통해 단리하고, 이미다졸을 사용하여 용출하였다. 'PD10' 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여, 1x Dulbecco's PBS(pH 7.2)로의 완충액 교환을 실시하였다. 샘플을 멸균 여과하였다(0.2 μm). 단백질 농도를 UV-분광법으로 측정하였다. 샘플의 순도를, 변성, 비환원 15% SDS-PAGE로 분석하였다. 각각 30개의 개과 VH/VL 쌍을 나타내는 정제된 Fab 단편의 단량체 %를, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정하였다. SEC는, AKTA Purifier System(GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany) 상에서 실시하였다. 분리를 위해, Superdex75 HR 10/30 컬럼을 사용하였다(GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Germany). 각각의 샘플에 대해 10 μl의 단백질을 컬럼 상에 로딩하고, 0.05 ml/분의 유량으로 분리를 실시하고 260 및 280 nm에서의 UV 흡광을 분석하여 기록하였다. 전개 완충액은, Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, USA)로 구성되었다. 결과는 도 7에 나타낸다.
도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 시험한 모든 개과 VH/VL 조합이 대장균에서 발현되고, 정제된 Fab의 발현율은 0.2 mg/L 내지 8 mg/L 박테리아 배양물(좌측 y축 막대기들)이다. 또한, 단리된 물질의 특성화에 따르면, 정제된 개과 Fab VH/VL의 대부분은 85% 초과의 단량체 형태인 것으로 밝혀졌다. 이는, 라이브러리를 사용한 개과 항체 개발에의 유용성을 나타내는 것이다.
실시예 2.5 IgG 의 탐사 규모의 제조 및 단량체 함량의 측정
진핵 HKB11 세포를 IgG 중쇄 및 경쇄 모두를 인코딩하는 pCaMx 포유류 발현 벡터 DNA로 형질감염시켰다. 세포 배양액 상청액을 형질감염 이후 3일째 또는 6일째 수확하여, 표준 단백질 A 친화 크로마토그래피에 적용하였다(MabSelect SURE, GE Healthcare). 1x Dulbecco's PBS(pH 7.2)로의 완충액 교환을 실시하고, 샘플을 멸균 여과하였다(0.2 μm 공극 크기).
단백질 농도를 UV-분광법으로 측정하고, IgG 의 순도를 변성, 환원 및 비환원 조건하에서 CE-SDS(LabChip GXII, Perkin Elmer)를 사용하여 분석하였다. 각각 30개의 개과 VH/VL 쌍을 나타내는 정제된 IgG1의 단량체 %를, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정하였다. HP-SEC는, Wyatt miniDAWN Treos 및 Wyatt Optilab rEX(Wyatt Technology Europe, Dernbach, Germany)와 조합된 Dionex UltiMate 3000 Titanium HPLC 시스템 (Dionex Corporation, Germering, Germany) 상에서 실시하였다. 분리를 위해, Tosoh TSK-Gel G3000SWxl 컬럼을 사용하였다(Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany). 각각의 샘플에 대해 15 μg의 단백질을 컬럼에 로딩하고, 0.5 ml/분의 유량으로 분리를 실시하고 280 nm에서의 UV 흡광을 분석하여 기록하였다. 전개 완충액은, Gibco D-PBS, pH 7.4(Invitrogen, Paisley, USA)로 구성되었다. 결과는 도 8에 나타낸다(우측 y축 도트들). 충분한 발현율을 가지는 구축물은 95% 초과의 우수한 단량체 함량을 나타내었다. 라이브러리 클로닝 및 CDR3 다양화를 위한 스캐폴드로서 사용된 VH/VL 조합의 선택에 있어, Fab 및 IgG 제조 데이터를 모두 고려하였다.
실시예 2.6 상대적 Fab 파지 디스플레이율 ELISA
M13 파지 상의 Fab 디스플레이를, 주요 코트 단백질 단백질 pVIII을 통한 파지 포획을 위한 항-M13 항체(Amersham)를 사용하고 디스플레이된 Fab에 결합하는 항-Fd 항체(The Binding Site)를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 파지 상청액 및 참조 샘플의 적절한 희석물을, 항-M13 퍼옥시다제 컨쥬게이트(Amersham) 및 QuantaBluTM(Pierce)로 검출하였다. 각각의 샘플에 대한 상대적 디스플레이율의 계산은 항-Fd 역가를 항-M13 역가로 나누어 실시하였다. 참조 파지 제조물의 보정 곡선으로부터 역가를 수득하였다.
실시예 2.7 Fab 온도 안정성 ELISA
박테리아 용해물의 적절한 희석물을, 상이한 온도(0℃, 60℃, 70℃ 및 80℃에 45분간 노출시킨다. 온전한 Fab 분자를 AttoPhos(Roche)와 함께 항-6ХHis(서열 번호 47) 포획 항체(R&D Systems) 및 AP-표지화 항-개과 Ig 검출 항체를 사용하여 ELISA로 검출한다.
실시예 2.8. 정제된 IgG 열적 안정성 측정
IgG 열적 안정성을 시차 주사 열량계법(DSF)으로 측정한다. DSF는, 관심 대상 단백질의 열적 풀림(unfolding: 융점)을 모니터링하는 형광 염료 기반 기법이다. 풀리는 단백질의 소수성 아미노산 측쇄와 상호작용하는 소수성 염료의 형광 변화를, 온도 구배에 따라 모니터링한다. 다음의 물질들을 사용한다: Sypro Orange 형광 염료(Sigma, #S5692); iCycler iQ PCR Plates, 96-웰(Biorad, #2239441); Microseal B Adhesive Sealer(Biorad #MSB-1001); 96-웰 Optical Pad(Biorad, #ADR3296); 및 iCycler iQ5 Thermal cycler(Biorad). 희석된 Sypro Orange를 96 웰 iCycler iQ PCR Plate의 각각의 웰에 첨가하고, 샘플을 적어도 0.1 mg/ml의 최종 농도에서 시험한다. 가열 속도 60℃/시간에서 온도를 20℃에서 95℃까지 스캔하고, 풀림의 온도를 형광 전이의 중간점 분석에 의해 계산한다.
실시예 2.9. 등전점(pI) 계산
각각의 IgG의 등전점을 계산한다. 단백질 pI를 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 하기의 도구들을 사용할 수 있다: http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html; Vector NTI(Invitrogen, Carlsbad, California).
실시예 3. 항체 선택 및 특성화
라이브러리 설계의 효율성을 확인하기 위해 각종 항원에 대하여 라이브러리를 시험하였다. 선택한 항체를 이후 하기와 같은 발달가능성 특징에 관하여 Fab 및 IgG 포맷 모두에 대해 시험하였다: a) Fab 디스플레이율; b) Fab 발현 수율, c) Fab 열적 안정성; d) Fab 혈청 안정성; e) Fab SEC 단량체 %; f) IgG 발현 수율; g) IgG 열적 안정성; h) IgG 혈청 안정성; i) IgG SEC 단량체 %; j) IgG 등전점 (pI); k) 시차 주사 형광측정을 사용한 산 노출 전후의 Fab 또는 IgG 포맷에서의 열적 안정성; l) 산 노출 전후의 Fab 또는 IgG 포맷에서의 흡수율; m) 동적 광산란으로 측정할 때의 산 노출 전후의 분자 반경 및 다중분산성 %; 및/또는 n) Fab 또는 IgG 포맷에서의 입자 염색. 추가로, Fab 포맷에서의 항원에 대한 친화도를 측정한다.
실시예 3.1 파지 제조
Fab 포맷으로 각각의 VH/VL 쌍을 디스플레이하는 파지를 하기와 같이 제조하였다. 각각의 라이브러리 파지 제조를 위해 80 ml 2x YT/Cam/Glc 매질을, 상응하는 라이브러리 글리세롤 스톡으로부터의 박테리아로 접종하여 0.2 내지 0.3의 OD600 nm를 초래하였다. 0.45 내지 0.55의 OD600 nm에 이를 때까지 120 rpm 및 37℃에서 30 내지 90 분간 배양물을 진탕하였다. 이후, 박테리아 배양물에 10의 감염 다중도 (multiplicity of infection)로 헬퍼 파지를 첨가하고, 이후 진탕 없이 37℃에서 45분간 인큐베이션하고 이후 120 rpm에서 진탕하며 37℃에서 45분간 인큐베이션하였다. 박테리아를 회전으로 가라앉히고, 헬퍼 파지-함유 상청액을 폐기하였다. 파지-감염된 박테리아를 400 ml 2x YT/Cam/Kan/IPTG 매질 내에 재현탁하고, 120rpm에서 진탕하며 22℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 밤새 배양물로부터의 박테리아를 펠릿화하고, Fab-제시 파지를 함유하는 상청액을 수집하였다. 예비-냉각된 PEG/NaCl의 총 부피의 1/5을, 파지-함유 상청액에 첨가함으로써 파지 침전을 실시하였다. 침전하는 파지가 가시화될 때까지 샘플을 적어도 30분간 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 침전된 파지를 회전으로 가라앉히고, 20 ml PBS 중에 재현탁하였다. 샘플을 서서히 회전시켜 균질한 현탁액을 수득하고 잔류 박테리아 찌꺼기를 펠릿화하여 페기하였다. 파지-함유 상청액으로부터, PEG/NaCl을 사용하여 파지를 재차 침전시켰다. 마지막으로, 파지 펠릿을 PBS 중에 재현탁하고, 멸균 튜브에 옮기고, 서서히 진탕하여 균일한 현탁액을 수득하였다. 파지 역가를 스팟 적정 및 ELISA에 의해 측정하였다. 디스플레이 벡터 pCaDis(도 9에 나타냄)에 의해 발현되고 파지 상에 제시된 Fab 단편의 디스플레이 수준 및 파지 역가를 ELISA 및/또는 웨스턴 블롯 (실시예 2.6 참조)에 의해 각각의 별도의 파지 제조물에 대해 평가하였다. ELISA를 위해, 2개의 상이한 항체를 포획을 위해 사용하였다: (1) 항-M13 항체(Amersham #27-9420-01)는, 주요 코트 단백질 g8p를 통해 파지 입자를 포획하므로 사용되었고; 그에 따라, 파지 역가를 측정할 수 있음. (2) 항-개과-Fab'2(LS Bio, #LS-C69729)를 사용하였고, 이는 디스플레이된 Fab에 결합하고; 그에 따라 Fab를 디스플레이하는 파지만이 포획됨. (1)과 (2)에 대해서는 별개의 참조 곡선을 사용하였다. HRP에 컨쥬게이션된 모노클로날 항-M13(M13 파지의 주요 코트 단백질인 g8p에 대한 것)을 검출 항체로 사용하였다. ELISA 데이터의 평가를, 하기와 같이 완성하였다: 보정 곡선을 작성하고, 파지 상청액 및 대조군의 역가를 계산하였다. 각각의 샘플에 대해, 항-Fd 상의 역가를 항-M13(항-pVIII) 상의 역가로 나누고, 결과의 비율이 상대적 디스플레이율이다.
실시예 3.2. 항체 선택
파지 디스플레이 선택은 하기에 기재한 바와 같이, 또는 당업자에게 알려진 또 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 병행 패닝 전략(예를 들어, 용액 패닝, Fc 포획 패닝, 직접적인 고상 패닝)을, 바람직한 생물리 특징을 가지는 다양한 결합 항체의 동정 기회를 최대화하기 위해 실시한다. 각종 용해성 단백질을, 라이브러리 확인용 모델 항원(예를 들어, 리소자임)으로서 선택할 수 있다. 모델 항원에 대한 집합 스크리닝을, 하기 기재한 바와 같이, 카르복시산 기에 대한 아미드 결합 형성을 통한 자기 Dynabeads(Dynal/Invitrogen Prod. no. 143.06)에 공유 커플링된 항원과 함께 비드-기반 용액 패닝으로 실시한다. 모델 항원에 대한 선택은 또한, 하기 기재한 Fc-포획 패닝 전략에 의해 실시될 수 있다.
실시예 3.2.1. 비드-기반 용액 패닝
모델 항원 및 대조군으로의 BSA 코팅된 카르복시-비드(Dynal)를 5% 분유 + PBS 중 0.1% Tween20으로, 실온(RT)에서 2시간 동안 예비-흡착된 파지와의 인큐베이션 이전에 RT에서 2시간동안 차단한다. 수회의 세척 단계 이후, 결합된 파지를 용출하고, 다음 라운드의 선택을 위한 TG1F+ 세포의 감염에 의해 증폭한다. 제3 라운드의 선택 이후, pCaDis(도 9에 나타냄) 파지미드 DNA를 단리하고, Fab 인코딩 단편을 XbaI 및 EcoRI를 이용하여 제한 소화에 의해 절단하고 발현 벡터 pCaBx(도 10에 나타냄) 내로 결찰하고, 대장균 TG1 F- 내로 형질전환한다. 감염시킨 배양물을 이후 큰 LB/Cam/Gluc 플레이트에 도말하고, 34℃에서 성장하도록 한다. 단일 클론들을 단리하여, Fab 발현 수율 및 항원 결합에 대해 ELISA에 의해 시험한다. Fab 발현을, Fab-함유 세포 수출물들을 토끼 항-개 IgG F(ab)'2 항체(LifeSpan BioSciences, LS-C69729)로 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 인큐베이션한 후, 염소 항-개 IgG (H+L) 알칼리 포스파타제 항체(Sigma, SAB37000097)로의 검출에 의해 검출한다. 항원 특이성을, 예를 들어 비드 기반 분석(Applied Bio Systems 8200 Cellular Detection System / PE BioSystems)에 대한 형광측정 마이크로부피 분석 기술(FMAT®)로, 모델 항원-커플링된-카르복시비드 및 BSA 커플링된-카르복시비드 (Dynal) 상의 Fab-함유 세포 추출물들을 스크리닝함으로써 시험한다. 주요 히트 (primary hits)는, 200의 값에 세팅된 배경에 대해 적어도 5배 초과의 FMAT 평균 형광 신호를 초래하는 Fab로 정의된다. 모델 항원에 대한 특이성은, 동족 항원으로서의 모델 항원과 음성 대조군 항원으로서의 무관한 항원을 이용하여 2차 ELISA에 의해 확인된다. 시험한 하위-라이브러리, 하위-라이브러리-믹스 또는 총 라이브러리 각각에 대해 약 50 내지 100개의 클론을 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역의 서열분석을 위해 선별하여, 모델 항원 결합 항체의 서열 다양성을 평가한다. 서열분석 결과는, 구축한 라이브러리가 모델 항원 결합체의 다양한 레파토리를 포함함을 나타낸다. ELISA에 의한 결합 특성화는, 단리된 항체가, 무관한 대조군 항원에 대한 교차-반응성 없이, 관심 대상의 동족 모델 항원에 대해 매우 특이적임을 나타내며, 이는, 생의학 연구 및 매우 특이적인 치료용 항체의 생성을 위한 라이브러리의 유용성을 입증한다.
실시예 3.2.2. Fc-포획 패닝
Maxisorp 플레이트(Nunc) 상의 염소 항 인간-IgG Fc 특이적(Jackson; Cat. 109-005-098) 또는 마우스 항-인간-IgG Fc 특이적(Jackson; Cat. 209-005-098)을 이용한 포획에 의해 고정화된 재조합 인간 Fc-태깅된 모델 단백질을 사용하여 고상 Fc-포획 패닝의 3개 라운드를 실시한다. 각각의 선택 라운드 이전에, 파지를, PBS/5% 우유, /5% BSA/ 0.1% Tween 중의 0.1 mg/ml 인간, 염소 및 마우스 면역글로불린으로 RT에서 2시간 동안 차단한다. 수회의 세척 단계 이후, 결합된 파지를 용출하고, 다음 라운드의 선택을 위한 TG1F+ 세포의 감염에 의해 증폭한다. 제3 라운드의 선택 이후, pCaDis(도 9에 나타냄) 파지미드 DNA를 단리하고, Fab 인코딩 단편을 XbaI 및 EcoRI을 이용하여 제한 소화에 의해 절단하고 발현 벡터 pCaBx(도 10에 나타냄) 내로 결찰하고, TG1F- 내로 형질전환한다. 감염시킨 배양물을 이후 큰 LB/Cam/Gluc 플레이트에 도말하고, 34℃에서 성장하도록 한다. 단일 클론들을 단리하여, Fab 발현 수율 및 항원 결합에 대해 ELISA에 의해 시험한다. Fab 발현은 상기한 바와 같이 검출한다. 항원 특이성을, MaxiSorp 플레이트 상에 코팅된 염소 항-인간 IgG 항체(Jackson; Cat. 109-005-098)를 통해 포획된 모델 단백질_Fc 항원 상의 Fab-함유 세포 추출물들을 이용한 ELISA 스크리닝에 의해 시험한다. 주요 히트는, 배경에 대해 적어도 5배 초과의 ELISA 신호를 초래하는 Fab로 정의된다. 모델 단백질_Fc에 대한 특이성은, 동족 항원으로서의 모델 항원_Fc와 음성 대조군 항원으로서의 무관한 단백질_Fc로, 2차 Fc-포획 ELISA에 의해 확인된다.
약 50 내지 100개의 클론을 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역의 서열분석을 위해 선별하여, 모델 항원_Fc 결합 항체의 서열 다양성을 평가한다. 서열분석 결과는, 구축한 라이브러리가 결합체의 다양한 레파토리를 포함함을 나타낸다. ELISA에 의한 결합 특성화는, 단리된 항체가, 무관한 대조군 항원에 대한 교차-반응성 없이, 관심 대상의 동족 모델 항원에 대해 매우 특이적임을 나타내며, 이는, 생의학 연구 및 매우 특이적인 치료용 항체의 생성을 위한 라이브러리의 유용성을 입증한다.
실시예 3.3. 발달가능성 시험
항원에 특이성인 항체 또는 단편을 Fab 포맷에서의 열적 안정성, Fab 포맷에서의 친화도, IgG 포맷에서의 등전점, IgG 포맷에서의 발현 수율, IgG 포맷에서의 열적 안정성, 및 SEC에 의해 측정된 IgG 포맷에서의 단량체%와 같은 Fab 포맷 및 IgG 포맷 모두에서의 발달가능성 특징에 관하여, 본원에 개시된 방법 또는 당업자에게 알려진 기타 다른 방법으로 시험하였다. Fab 및 IgG 포맷의 열적 안정성 시험은, 실시예 2.7 및 2.8에 기재된 바대로 완료하였다. pI 측정은 실시예 2.9에 기재된 바대로 완료하였다. IgG 포맷에서의 발현 수율은 실시예 2.5에 기재된 바대로 완료하였다. SEC에 의해 측정될 때 IgG 포맷에서의 단량체 %는 실시예 2.5에 기재된 바대로 완료하였다.
실시예 3.4. Fab 포맷의 항원 포획 설정을 통한 비아코어(biacore) KD(친화도) 측정
포획된 항원에 대한 단량체 Fab 분획의 결합(분석 SEC에 의해 분석됨; Superdex75, Amersham Pharmacia)을 하기와 같이 분석한다: CM5 칩(Biacore/ GE Healthcare) 상에, 적절한 항-항원 태그 포획 항체를 EDC/NHS 화학을 사용하여 공유적으로 고정화시킨다. 동력학(kinetic) 측정은, 항원을 포획하고 연이은 6개의 상이한 Fab 농도(2n 단계 희석)의 주입에 의해 실시한다. 각각의 사이클 이후, 센서칩을 재생한다. 전개 완충액의 블랭크 주입은 이중 참조를 위해 사용된다. 모든 센서그램은 BIA 평가 소프트웨어 3.2(Biacore/ GE Healthcare)를 사용하여 피팅하고, 이에 따라 KD 계산을 위해 사용되는 kon 및 koff 속도 상수를 결정한다.
문헌[Haenel et al., (2005) Analytical Biochemistry 339(1): 182-184]에 기재된 바와 같이, 용액 평형 적정에 의해 친화도를 또한 결정할 수 있다.
단리된 항체는 나노몰 미만 내지 한자리 나노몰 KD 범위의 친화도 값을 나타내며, 이는, 관심 대상 모델 항원에 대한 강한 결합 항체가 라이브러리로부터 용이하게 단리될 수 있음을 확인시켜준다.
실시예 4. 라이브러리 중복 분석 및 NGS에 의한 QC
라이브러리 품질을, 제조자가 제공한 매뉴얼에 따라 MiSeq 기기(Illumina, VL / VH 샘플 당 약 1백만개 서열)를 사용하여 고-처리량의 앰플리콘(amplicon) 서열분석에 의해 평가하였다.
실시예 4.1. 앰플리콘 생성
간략하게, 각각의 샘플의 VL 또는 VH 앰플리콘(예를 들어, 클로닝된 라이브러리로부터 유래된 플라스미드 DNA)을, 특수 앰플리콘 융합 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조하였다(1분 98℃, 15초간 98℃의 15 사이클, 15초간 60℃ 그리고 15초간 72℃, 5분간 72℃, 15 ng 주형 DNA, 0.4 μM의 각각의 프라이머, 200 μM dNTP 및 1 U Phusion 폴리머라제(NEB)).
실시예 4.2. 변형된 TruSeq / Nextera XT 프로토콜을 사용한 NGS
범용 Nextera 어댑터를 포함한 앰플리콘을, 상기 기재한 바와 같이 PCR 증폭하였고(제1 단계 - 어댑터 PCR), 아가로스 젤로 정제 및 정량화하였다. 제2 PCR 단계(지수 PCR)에서, 고유한 지수 조합(i5 / i7 지수들)을 동시에 각각의 샘플의 5'- 및 3'- 말단에 첨가하였다(1분 98℃, 15초간 98℃의 10 사이클, 15초간 60℃ 그리고 60초간 72℃, 5분간 72℃, 1 ng 주형 DNA, 0.4 μM의 프라이머, 200 μM dNTP 및 0.5 U Phusion 폴리머라제).
PCR 산물을 AMPure XP 비드(Beckman Coulter)를 사용하여 정제하여 작은 단편들을 제거하고, SequalPrep Normalization Plate Kit(Invitrogen)를 사용하여 표준화하고 등몰량을 수합하였다(pooled). 수합한 DNA를 0.2 N NaOH에 의해 변성시키고, 8 내지 10 pM의 농도로 최종 희석하였다. 대조군 라이브러리(PhiX)를 동일한 샘플 수합물(5 내지 10%)에 추가로 가하고(spike), 수합물을 서열분석용 유동 세포에 로딩하였다. 쌍을 이룬 말단 서열분석 조작을 MiSeq System 사용자 안내서 및 MiSeq Reagent Kit v3에 대한 서열분석 매뉴얼에 따라 실시하였다(600 사이클).
서열분석 결과를, 직접 가공처리하고, 역다중화하고, 스티칭하고, 제공된 MiSeq 소프트웨어 패키지(SAV1.8, MiSeq Reporter)를 사용하여 fastq 파일을 생성하였다.
실시예 4.3. 서열 분석
품질 여과된 서열들을 대규모 서열분석 데이터세트의 가공처리 및 분석을 위해 자체적으로 맞춤화되어 개발된 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석하였다. 서열들을 역다중화하였고, 라이브러리 특이적 서열 양상, 예를 들어 V-유전자 유형, HCDR3 길이 및 아미노산 분포를 평가하였다. 간략히, VH 및 VL 분포 각각은 예측한 대로이며, 설계와, 원하는 위치에서의 수득한 아미노산 간에 매우 양호한 상관관계가 존재한다(도 11, 12 및 13).
실시예 5. 파지 디스플레이 항체 선택
eGFP(증강된 녹색 형광 단백질)를, 라이브러리 확인을 위한 모델 항원으로서 선택하였다. 고상 패닝 및 이어서 직접 코팅 ELISA 스크리닝을 실시하여 라이브러리로부터 eGFP-특이적 결합체를 단리하였다. 고상 패닝은, 마이크로타이터 플레이트상에 직접 고정화된 eGFP를 사용하여 실시하였다. 각각의 선택 라운드 이전에, PBS 중 10% 탈지분유로 파지를 차단하였다. 파지 인큐베이션 이후, PBST를 이용한 수회의 세척 단계를 실시하여 매우 약한/비특이적인 결합체를 제거하였다. 결합된 파지를, 저-pH 용출 완충액으로 용출하고, 다음 라운드 선택을 위하여 TG1F+ 세포를 감염시킴으로서 증폭하였다. 최종 선택 라운드 이후, pCaDis 파지미드 DNA를 단리하고, Fab 인코딩 단편을 XbaI 및 EcoRI을 이용하여 제한 소화에 의해 절단하고, 발현 벡터 pCaBx(도 10) 내로 결찰하고, TG1F- 대장균 내로 형질전환하였다. 감염시킨 배양물을 이후 LB/Cam/Gluc 플레이트 상에 도말하고, 밤새 성장하도록 하였다. 단일 클론을 단리하여, ELISA에 의해 Fab 발현 수율 및 항원 결합에 대해 시험하였다. Fab 발현은, Fab-함유 세포 추출물들을 토끼 항-개 IgG F(ab)2(LSBio, Cat.: LS-C69729) 코팅된 ELISA 플레이트 상에서 인큐베이션 후, 알칼리 포스파타제(AP)(Sigma, SAB37000097)로 컨쥬게이션된 토끼 항-개 IgG IgG F(ab)2 특이적 항체를 이용한 검출에 의해 검출하였다. 항원 특이성을, MaxiSorp 플레이트 상에 코팅된 eGFP 상의 Fab-함유 세포 추출물들을 이용하는 ELISA에 의해 시험하였다. 주요 히트는, 배경에 대해 적어도 5배 초과의 ELISA 신호를 초래하는 Fab로 정의된다. eGFP에 대한 특이성은, 음성 대조군 항원(우유 단백질만으로 코팅된 플레이트) 상의 2차 ELISA에 의해 확인되었다.
2A/2D, 3A/3D 및 3B/6B 하위-라이브러리 각각에 대한 29개, 8개 및 58개 클론의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역을, eGFP 결합 항체의 서열 다양성 평가를 위해 서열분석하였다. 스크리닝 및 서열분석 데이터는 표 19에 요약되어 있다. 도 13은, 스크리닝 결과의 도트 블롯 시각화를 나타낸다.
실시예 6. Fab ELISA
패닝 선택 이후 수득된 각각의 클론의 결합을 비교하기 위해, Fab 포맷의 정제된 항체를 적정하고, 알칼리 포스파타제(AP)(Sigma, SAB37000097)로 컨쥬게이션된 토끼 항-개 IgG F(ab)2 특이적 검출 항체를 이용하여 MaxiSorp 플레이트 상에 코팅된 eGFP 상에서 시험하였다. HuCAL 라이브러리로부터 앞서 단리된 항-GFP 항체 (MOR06391)를 참조로서 포함시켰다. 도 15에 예시된 바와 같이, 라이브러리로부터 직접 단리된 항체는 다양한 결합 강도를 나타내었고, 6/9 후보들은 참조 항체에 대해 유사 또는 더 나은 결합 특징을 나타내었다.
실시예 7. IgG ELISA
모델 항원으로서의 eGFP에 대한 패닝을 실시예 5에 기재한 바와 같이 실시하였다. 항체 선택 이후 수득된 특이적 Fab 히트들을 최첨단의 분자 생물학 방법을 사용하여 IgG 포맷으로 전환하고, IgG 단백질을 실시예 2.5에 기재된 바와 같이 제조하였다. eGFP에 대한 IgG 반응성을 표준 고상 ELISA에서 확인하였다(도 16). Maxisorp 플레이트 상에 코팅된 eGFP에 대한 IgG 결합의 검출은, 알칼리 포스파타제(AP)(Sigma, SAB37000097)로 컨쥬게이션된 토끼 항-개 IgG F(ab)2-특이적 검출 항체를 이용하여 실시하였다. HuCAL 라이브러리로부터 앞서 단리된 항-GFP 항체 (MOR06391)를 참조로서 포함시켰다.
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180 gcacagaaat ttcagggtcg tgttaccctg accgcagata ccagcaccag caccgcatat 240 atggaactga gcagcctgcg tgccggtgat attgcagtgt attattgc 288 <210> 24 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 24 gaagtgcaat tggtggaaag cggtggcgat ctggtgaaac cagccggcag cctgcgcctg 60 agctgcgtgg ccagcggctt tacctttagc agctatagca tgagctgggt tcgccaggcc 120 ccggaaaaag gcctgcagct ggtggccggc attagcagcg gcggcagcag cacctattat 180 accgatgccg tgaaaggccg ctttaccatt agccgcgata acgccaaaaa caccgtgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaagat accgccatgt attattgc 288 <210> 25 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 25 gaagtgcaat tggttgaaag cggtggtgat ctggttaaac cgggtggcac cctgcgtctg 60 agctgtgttg caagcggttt tacctttagc agctatgata tgagctgggt gcgccagagt 120 ccgggtaaag gtctgcagtg ggttgcagtt atttggaatg aaggtagcag cacctattat 180 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Claims (1)

  1. 생식계열 VH1 영역인 Vs618(서열 번호 4), Vs624(서열 번호 1), Vs628(서열 번호 5) 및 Vs635(서열 번호 2) 중 적어도 하나의 구성원을 포함하는 합성 개과 항체 라이브러리.
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