JP2016216461A - ヒト化抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト化又は完全ヒト抗体プラットフォームに関して認められる短所の一部又は全てを避け、かつヒト宿主における免疫原性を最小限に抑える一方で、治療上重要な広範な標的抗原に対する特異性及び親和性が高い抗体の産生を可能にする、「ヒト化」モノクローナル抗体（抗原結合ポリペプチド）プラットフォームの提供。
【解決手段】ラクダ科ファミリーの種の通常型抗体レパートリーに由来するヒト化抗体。特に、ラクダ科動物VHドメイン、及びラムダ軽鎖クラス又はカッパ軽鎖クラスのいずれかのラクダ科動物VLを含み、ヒト化する少なくとも1つのアミノ酸置換が、該VHドメイン及び／又はVLドメインに存在することを特徴とする、抗体。
【選択図】図１

Description

（発明の分野）
本発明は、ラクダ科ファミリー（family Camelidae）の種の通常型（conventional）抗
体レパートリーに由来する新規ヒト化抗体に関する。

（発明の背景）
モノクローナル抗体は、研究ツールとしての、及び次第に治療剤又は診断剤としての多
くの用途を有する。現在20種を超える様々なモノクローナル抗体が、癌、炎症、自己免疫
障害、感染性疾患、喘息、心血管疾患、及び移植拒絶反応を含む、種々の異なる疾患を治
療するために規制当局の認可を受けており、また、開発ライン上にあるモノクローナル抗
体医薬の数が、対前年比で増加している。

ヒト治療における齧歯類（特に、マウス）モノクローナル抗体の有用性は、その非ヒト
起源と関連する問題点、特に、ヒト宿主におけるその免疫原性のために限定されている。
治療用抗体医薬に対するヒト免疫応答を最小限に抑えるために、モノクローナル抗体技術
は、完全マウス抗体から、キメラ抗体（マウス可変ドメインをヒトIgG骨格に移植したも
の）、ヒト化抗体（マウスCDRをヒトIgG骨格に移植したもの）、合成及び非免疫ライブラ
リー、又はヒトIgGレパートリーの一部を発現する免疫トランスジェニックマウスに由来
する「完全ヒト」抗体へと進化している。

治療上関心のある標的抗原に対する完全ヒト又は「ヒト化」モノクローナル抗体の産生
を可能にするいくつかの技術プラットフォームが開発されている。これらのプラットフォ
ームの各々は、それ自体の独特な特徴及び潜在的短所を有する。

マウスモノクローナル抗体のヒト化は、マウス可変ドメインをヒト定常ドメインと組み
合わせて、約70％のヒト成分（content）を有する、いわゆる、キメラ抗体を作製するこ
とによって初めに達成された。その後、さらなる程度のヒト化は、マウスモノクローナル
抗体の相補性決定領域（CDR）を、ヒト抗体の可変抗体ドメインのヒトフレームワーク領
域に移植することによって達成された。さらに、これらのフレームワーク領域に存在する
数個のアミノ酸残基は、CDR又は抗原と相互作用することが確認され、結合を改善するよ
うにヒト化抗体において復帰突然変異させられた。（Almagroらの文献、Frontiers in Bi
oscience. 13：1619-1633（2008））。このアプローチを用いて人為操作されたモノクロ
ーナル抗体は、ヒト化した後に、ヒトVH及びVLドメイン配列との比較的高度な一次配列相
同性を有するが、欠点は、マウスにコードされたCDRの全てが、ヒト抗体に見られないカ
ノニカルフォールド（canonical fold）、及びカノニカルフォールド組合せを用いるわけ
ではないために、ヒト様構造を持たない超可変ループで終わる可能性があることである（
Almagroらの文献、Mol. Immunol. 34：1199-1214（1997）；Almagroらの文献、Immunogen
, 47：355-63（1998））。さらなる欠点は、そのような抗体をヒト化するために通常必要
とされる多数の突然変異（そのための手順は複雑で時間のかかるものである）、それに伴
う、ヒト化に必要な多くの変化の結果として親和性及び効力を失うという当然のリスク、
並びにマウスのレパートリーではVカッパドメインが主に用いられるのに対し、全ヒト抗
体のうちの約半分はVラムダドメインを有するという事実である。別のヒト化手順は、リ
サーフェシング（resurfacing）又はベニアリング（veneering）を含み、その場合、ヒト
から逸脱する溶媒曝露フレームワーク残基のみが置換されるが、埋没又は一部埋没した残
基、及びドメイン間接触に関与する残基は維持される（Padlan E.（1991） Mol Immunol.
）。よりストリンジェントな方法は、SDR移植であり、その場合、ヒトFRへのCDR移植が適
用されるが、この最上部では、抗原と接触している特異性決定残基（SDR）だけを保持し
て、CDR内の残基をヒト対応物へと突然変異させる（Kashmiri S.V.S.らの文献（2005） M
ethods）。

ヒト化マウスモノクローナル抗体に対する可能性のある改善として、「完全ヒト」モノ
クローナル抗体を2つの非常に異なるアプローチによって産生することができる。第一の
アプローチは、完全な合成ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、HuCAL（登
録商標）、MorphoSys社）から、又は非免疫抗体ライブラリー（Vaughan T.J.らの文献（1
996） Nat Biotechnol., Cambridge Antibody Technology；de Haard H.J.らの文献（199
9） J Biol Chem., DYAX）からの選択である。このアプローチの潜在的な欠点は、そのよ
うなライブラリーが、ヒト生殖系列に天然に存在する機能的多様性に近似するものでしか
なく、したがって、その多様性が多少限定されているということである。また、このアプ
ローチを用いて作製された抗体は、これらが能動免疫を介して得られる抗体中に生じるよ
うな、インビボ選択されたCDRを含まず、また、標的抗原に対する親和性を向上させるた
めに、通常、親和性成熟がなされなければならない。親和性成熟は、長期にわたるプロセ
スであり、これによって、抗体発見プロセスにかなりの時間がかがる場合がある。また、
親和性成熟のプロセスでは、得られる抗体の結合特異性又は安定性及び産生に負の影響を
及ぼし得る特定のアミノ酸残基が変化する場合がある（Wuらの文献、J. Mol. Biol. 368
：652-65（2007））。

別の「完全ヒト」プラットフォームは、マウス免疫グロブリンコード領域をヒト生殖系
列由来の抗体コード配列と交換するように人為操作されたトランスジェニックマウスに基
づくものである（例えば、HuMab、Medarex社）。これらのシステムは、抗体が標的抗原を
用いて能動免疫によって産生される、すなわち、抗体が、抗原に対する高い出発親和性を
有するという利点、及びもとの抗体をよりヒト様にするためのその抗体操作が、全く又は
ごくわずかしか必要ないという利点を有する。しかしながら、このトランスジェニックマ
ウス系統は、定義上は高度に近交系であり、このことは、抗体応答の強度及び多様性に悪
影響を及ぼす。このプラットフォームに関する別の欠点は、一部のトランスジェニックマ
ウスシステムでのヒトFc／マウスFc受容体相互作用によるB細胞成熟障害であり得る。

さらなるプラットフォームは、非ヒト霊長類、特にカニクイザルの免疫に基づくもので
ある。サルとヒトの免疫グロブリンの間には高度なアミノ酸配列同一性があるため、サル
で作製された抗体は、ヒト治療薬として有用なものとするために、可変ドメインでのさら
なる「ヒト化」をほとんど又は全く必要としないと仮定される（WO93／02108号を参照さ
れたい）。しかしながら、VHにおけるCDR1及びCDR2の非ヒトカノニカルフォールド組合せ
が、これらの霊長類化抗体に見られることが非常に多い。

（発明の概要）
本発明は、従来技術のヒト化又は完全ヒト抗体プラットフォームに関して認められる短
所の一部又は全てを避け、かつヒト宿主における免疫原性を最小限に抑える一方で、治療
上重要な広範な標的抗原に対する特異性及び親和性が高い抗体の産生を可能にする、「ヒ
ト化」モノクローナル抗体（抗原結合ポリペプチド）プラットフォームを提供する。

ラクダ科ファミリー由来の通常型抗体のVHドメインとVLドメインの両方が、フレームワ
ーク領域にわたって、ヒト抗体のVHドメイン及びVLドメインとの高度なアミノ酸配列同一
性を示すことが認められている。実際に、ラクダ科動物の通常型VHドメインとヒトVHドメ
インの間、及びラクダ科動物の通常型VLドメインとヒトVLドメインの間の配列同一性の程
度は、ヒトと他の霊長類種、例えば、カニクイザルとの間で認められる同一性の程度に近
づくことがあり、かつヒトとラクダ科動物の系統学的な距離を考慮した上で予想され得る
ものよりもはるかに高い。この知見は、重鎖ラクダ科動物抗体の可変ドメイン（VHH）が
、ヒト可変ドメインとのこうした高度な配列相同性を示さないことを考えると、驚くべき
ことである。

さらに、ラクダ科動物VH及びVLドメインの超可変ループ（H1、H2、L1、L2、及びL3）は
、ヒトVH及びVLドメインの超可変ループとの高度な構造相同性を示すことが多いことが認
められており、このことも、ヒトとラクダ科動物の間の進化的距離を考えると予想外であ
る。重鎖ラクダ科動物抗体の超可変ループは、ヒト及びマウスVH中の対応するループと、
立体構造及び長さが大幅に異なることが報告されているので、ラクダ科動物の通常型抗体
（又はむしろそのような抗体の超可変ループ）とヒト抗体の間の高度な構造相同性も、驚
くべきことである（De Genstらの総説、Develop Comp. Immunol. 30：187-98（2006）を
参照されたい）。

この超可変ループを含む抗原結合部位とヒト抗体の結合部位との高度な構造相同性と組
み合わされた、ヒト抗体のフレームワーク領域との高度な一次アミノ酸配列相同性に加え
、ラクダ科通常型抗体をヒトから系統学的に極めて遠い非近交系動物集団の能動免疫によ
って作製することができるという事実により、ラクダ科ファミリー由来の通常型抗体が、
ヒト治療薬としての潜在的有用性を有するモノクローナル抗体を人為操作するための魅力
的な出発点であることが確認された。

さらに、多数の新規の通常型ラクダ科動物抗体が配列決定され、ラクダ科動物VH及びVL
ドメインのアミノ酸配列がヒトVH及びVL配列と比較して解析された。これらの解析から、
アミノ酸残基がラクダ科動物のVH及びVLとヒトのVH及びVLとで顕著に異なるいくつかの重
要なアミノ酸位置が、該ラクダ科動物VH又はVL配列中に同定された。こうした知見により
、ラクダ科動物VH及び／又はVLドメイン中の1つ又は複数の特定の位置をヒトVH又はVL配
列中の対応する位置由来のアミノ酸と置換する新規のヒト化戦略が促進された。

したがって、第一の態様では、本発明は、ラクダ科動物VHドメイン、及びラムダ軽鎖ク
ラス（Vλ）又はカッパ軽鎖クラス（Vκ）のいずれかのラクダ科動物VLドメインを含み、
少なくとも1つのアミノ酸置換が、該VHドメイン及び／又は該VLドメイン中に存在し、該
アミノ酸置換（複数可）が、以下からなる群から選択されることを特徴とする、抗体を提
供する：
（a）該ラクダ科動物VHドメイン中のアミノ酸置換（複数可）、ここで、Kabatによる、
該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40
、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H8
9、H93、H94、及びH108からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメ
イン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される；並びに
（b）該ラクダ科動物VLドメイン中のアミノ酸置換、ここで、該ラムダ軽鎖クラス（Vλ
）のラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置
L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L
44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L
80、L84、及びL103からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVλドメイ
ン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換され；かつ該カッパ軽鎖クラス（Vκ
）のラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置
K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、
K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、及びK106からなる群から
選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVκドメイン配列中の対応する位置に見られる
アミノ酸と交換される。

第二の態様では、本発明は、ラクダ科動物VHドメイン（ここで、Kabatによって付番さ
れた、該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H3
7、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H
86、H89、H93、H94、もしくはH108のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメイン配
列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される）を含み、かつ／又はラムダ軽鎖ク
ラス（Vλ）に属するラクダ科動物VLドメイン（ここで、Kabatによって付番された、該ラ
クダ科動物Vλドメインの位置L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19
、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70
、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、もしくはL103のうちの1つ又は複数のアミノ酸は
、ヒトVλドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される）を含み、か
つ／又はカッパ軽鎖クラス（Vκ）に属するラクダ科動物VLドメイン（ここで、Kabatによ
って付番された、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13
、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80
、K83、K100、K103、K104、もしくはK106のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVκド
メイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される）を含む、抗体を提供する
。

別の実施態様では、最も良く一致するヒト生殖系列ファミリーメンバーに生じる対応す
る残基、又はあまり好ましくないが、対応するコンセンサスヒト生殖系列ファミリーに生
じる残基から逸脱する、ラクダ科動物生殖系列ドメイン中に存在する（すなわち、解析さ
れた体細胞突然変異ドメインの全てもしくはほとんどに見られる）フレームワーク残基中
の1つ又は複数の位置のアミノ酸が、ヒト生殖系列及び／又はコンセンサス配列中の対応
する位置（複数可）に見られるアミノ酸と交換される。整列させたときに、ラクダ科動物
生殖系列ドメイン中のこれらの残基が、最も良く一致するヒト生殖系列中に存在する残基
と同一である場合、ヒト生殖系列ドメインから逸脱する、体細胞突然変異によって導入さ
れる（すなわち、体細胞突然変異したラクダ科動物ドメインに低頻度で生じる）残基の突
然変異はあまり好ましくない。

様々な実施態様では、ラクダ科動物生殖系列にコードされた残基を、最も良く一致する
ヒト生殖系列ファミリーメンバー中に存在する残基、又はコンセンサスヒト生殖系列ファ
ミリーの残基に変換するVHドメイン中の突然変異は、したがって、以下の通りである。

一実施態様では、H1のアミノ酸が交換される。非限定的な実施態様では、H1のアミノ酸
がQ又はEと交換される。
一実施態様では、H7のアミノ酸が交換される。非限定的な実施態様では、H7のアミノ酸
がSと交換される。
一実施態様では、H11のアミノ酸が交換される。非限定的な実施態様では、H11のアミノ
酸がVと交換される。
一実施態様では、H12のアミノ酸がKと交換される。
一実施態様では、H13のアミノ酸がK、又はあまり好ましくないが、RもしくはQと交換さ
れる。
一実施態様では、H14のアミノ酸がPと交換される。
一実施態様では、H29のアミノ酸がV、又はあまり好ましくないが、Fと交換される。

一実施態様では、H30のアミノ酸がSと交換される。
一実施態様では、H37のアミノ酸がVもしくはI、又はあまり好ましくないが、Fと交換さ
れる。
一実施態様では、H40のアミノ酸がAと交換される。
一実施態様では、H48のアミノ酸がIと交換される。
一実施態様では、H67のアミノ酸がVと交換される。
一実施態様では、H68のアミノ酸がTと交換される。
一実施態様では、H69のアミノ酸がM、又はあまり好ましくないが、IもしくはSと交換さ
れる。
一実施態様では、H71のアミノ酸がRもしくはV、又はあまり好ましくないが、A、E、も
しくはTと交換される。
一実施態様では、H74のアミノ酸が交換される。非限定的な実施態様では、H74のアミノ
酸がS、又はあまり好ましくないが、Aと交換されてもよい。

一実施態様では、H77のアミノ酸がS、又はあまり好ましくないが、Tと交換される。
一実施態様では、H78のアミノ酸がVもしくはL、又はあまり好ましくないが、Aに交換さ
れる。
一実施態様では、H80のアミノ酸がMと交換される。
一実施態様では、H81のアミノ酸がKと交換される。
一実施態様では、H83のアミノ酸がR、又はあまり好ましくないが、Kと交換される。
一実施態様では、H84のアミノ酸がA、又はあまり好ましくないが、Tと交換される。
一実施態様では、H85のアミノ酸がAと交換される。
一実施態様では、H86のアミノ酸がDと交換される。
一実施態様では、H94のアミノ酸がR、又はあまり好ましくないが、KもしくはTと交換さ
れる。
一実施態様では、H108のアミノ酸がM、又はあまり好ましくないが、LもしくはTと交換
される。

ヒト生殖系列ドメインから逸脱する体細胞突然変異残基を変換するが、ラクダ科動物生
殖系列ドメイン中のこれらの残基は、最も良く一致するヒト生殖系列中に存在する残基と
同一である、VHドメイン中の他の突然変異を以下に記載する。
一実施態様では、H5のアミノ酸がL、又はあまり好ましくないが、Vと交換される。
一実施態様では、H82bのアミノ酸がSと交換される。
一実施態様では、H89のアミノ酸がV、又はあまり好ましくないが、Lと交換される。
一実施態様では、H93のアミノ酸がA、又はあまり好ましくないが、Tと交換される。

ラクダ科動物生殖系列にコードされた残基を最も良く一致するヒト生殖系列ファミリー
メンバー、又はあまり好ましくないが、コンセンサスヒト生殖系列ファミリーに変換する
Vλクラスの軽鎖中の最も好ましい突然変異は、以下のものである。
一実施態様では、L1のアミノ酸がSと交換される。
一実施態様では、L2のアミノ酸がYと交換される。
一実施態様では、L3のアミノ酸がEと交換される。
一実施態様では、L7のアミノ酸がD、又はあまり好ましくないが、PもしくはLと交換さ
れる。
一実施態様では、L8のアミノ酸がRもしくはP、又はあまり好ましくないが、A、S、L、
もしくはHと交換される。
一実施態様では、L9のアミノ酸がP、又はあまり好ましくないが、Aと交換される。
一実施態様では、L11のアミノ酸がA、V、S、もしくはF、又はあまり好ましくないが、L
もしくはHと交換される。

一実施態様では、L14のアミノ酸がT、S、又はAと交換される。
一実施態様では、L15のアミノ酸がP、又はあまり好ましくないが、LもしくはTと交換さ
れる。
一実施態様では、L17のアミノ酸がQもしくはE、又はあまり好ましくないが、Aと交換さ
れる。
一実施態様では、L18のアミノ酸がRもしくはS、又はあまり好ましくないが、Kと交換さ
れる。
一実施態様では、L19のアミノ酸がV又はP又はAと交換される。
一実施態様では、L20のアミノ酸がR、又はあまり好ましくないが、Sと交換される。
一実施態様では、L39のアミノ酸がH、又はあまり好ましくないが、Pと交換される。
一実施態様では、L40のアミノ酸がPと交換される。
一実施態様では、L42のアミノ酸がK、又はあまり好ましくないが、Tと交換される。
一実施態様では、L47のアミノ酸がMと交換される。

一実施態様では、L58のアミノ酸がVと交換される。
一実施態様では、L59のアミノ酸がP、又はあまり好ましくないが、Sと交換される。
一実施態様では、L60のアミノ酸がD、又はあまり好ましくないが、Eと交換される。
一実施態様では、L66のアミノ酸がS、又はあまり好ましくないが、N、Tと交換される。
一実施態様では、L67のアミノ酸がSもしくはL、又はあまり好ましくないが、Pと交換さ
れる。
一実施態様では、L69のアミノ酸がT又はNと交換される。
一実施態様では、L70のアミノ酸がT、又はあまり好ましくないが、M、I、もしくはAと
交換される。
一実施態様では、L71のアミノ酸がV、又はあまり好ましくないが、AもしくはTと交換さ
れる。
一実施態様では、L72のアミノ酸がSもしくはI、又はあまり好ましくないが、Tもしくは
Lと交換される。
一実施態様では、L74のアミノ酸がA、又はあまり好ましくないが、Gと交換される。
一実施態様では、L76のアミノ酸がS又はTと交換される。
一実施態様では、L78のアミノ酸がV、又はあまり好ましくないが、A、T、もしくはIと
交換される。
一実施態様では、L80のアミノ酸がSもしくはA、又はあまり好ましくないが、Tもしくは
Pと交換される。
一実施態様では、L84のアミノ酸がA又はSと交換される。
一実施態様では、L103のアミノ酸がKと交換される。

ヒト生殖系列ドメインから逸脱する体細胞突然変異残基を変換するが、ラクダ科動物生
殖系列ドメイン中のこれらの残基は、最も良く一致するヒト生殖系列中に存在する残基と
同一である、Vλクラスの軽鎖中の他の突然変異を以下に記載する。
一実施態様では、L38のアミノ酸がQと交換される。
一実施態様では、L44のアミノ酸がPと交換される。
一実施態様では、L46のアミノ酸がLと交換される。
一実施態様では、L49のアミノ酸がYと交換される。

ラクダ科動物生殖系列にコードされた残基を最も良く一致するヒト生殖系列ファミリー
メンバー、又はあまり好ましくないが、コンセンサスヒト生殖系列ファミリーに変換する
Vκクラスの軽鎖中の最も好ましい突然変異は、以下のものである。
一実施態様では、K1のアミノ酸がA、又はあまり好ましくないが、DもしくはNと交換さ
れる。
一実施態様では、K4のアミノ酸がL、又はあまり好ましくないが、Mと交換される。
一実施態様では、K7のアミノ酸がS、又はあまり好ましくないが、Tと交換される。
一実施態様では、K9のアミノ酸がL又はDと交換される。
一実施態様では、K11のアミノ酸がV又はLと交換される。
一実施態様では、K12のアミノ酸がK、P、もしくはA、又はあまり好ましくないが、Sと
交換される。

一実施態様では、K13のアミノ酸がK又はVと交換される。
一実施態様では、K14のアミノ酸がTと交換される。
一実施態様では、K15のアミノ酸がVもしくはL、又はあまり好ましくないが、Tと交換さ
れる。
一実施態様では、K18のアミノ酸がPもしくはR、又はあまり好ましくないが、Qと交換さ
れる。
一実施態様では、K19のアミノ酸がAと交換される。
一実施態様では、K36のアミノ酸がY、又はあまり好ましくないが、FもしくはLと交換さ
れる。
一実施態様では、K39のアミノ酸がKと交換される。
一実施態様では、K42のアミノ酸がKと交換される。
一実施態様では、K43のアミノ酸がAもしくはP、又はあまり好ましくないが、Vと交換さ
れる。
一実施態様では、K45のアミノ酸がKと交換される。

一実施態様では、K46のアミノ酸がL、又はあまり好ましくないが、Rと交換される。
一実施態様では、K58のアミノ酸がVと交換される。
一実施態様では、K63のアミノ酸がSと交換される。
一実施態様では、K68のアミノ酸がGと交換される。
一実施態様では、K70のアミノ酸がD、又はあまり好ましくないが、Eと交換される。
一実施態様では、K77のアミノ酸がS、又はあまり好ましくないが、Cと交換される。
一実施態様では、K78のアミノ酸がLと交換される。
一実施態様では、K79のアミノ酸がQ又はEと交換される。
一実施態様では、K80のアミノ酸がPもしくはA、又はあまり好ましくないが、Sと交換さ
れる。
一実施態様では、K83のアミノ酸がFもしくはV、又はあまり好ましくないが、Iと交換さ
れる。

一実施態様では、K100のアミノ酸がQと交換される。
一実施態様では、K103のアミノ酸がKと交換される。
一実施態様では、K104のアミノ酸がVと交換される。
一実施態様では、K106のアミノ酸がIと交換される。
ヒト生殖系列ドメインから逸脱する体細胞突然変異残基を変換するが、ラクダ科動物生
殖系列ドメイン中のこれらの残基は、最も良く一致するヒト生殖系列中に存在する残基と
同一である、Vκクラスの軽鎖中のあまり好ましくない突然変異を以下に記載する。
一実施態様では、K3のアミノ酸がQ、又はあまり好ましくないが、Rと交換される。

第二の態様では、本発明は、本発明の第一の態様による抗体をコードするポリヌクレオ
チド分子を提供する。
さらなる態様では、本発明は、宿主細胞での抗体の発現、又は無細胞発現系での転写及
び翻訳を可能にする調節配列に機能的に連結されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベク
ター、並びにさらには、該発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現系を提供する。
またさらなる態様では、本発明は、抗体の発現を可能にする条件下で宿主細胞又は無細
胞発現系を培養し、かつ発現された抗体を回収することを含む、組換え抗体の産生方法を
提供する。

（図面の簡単な説明）
IL1-βで免疫したリャマ由来の血清を、免疫後0日目及び28日目に、IL1-βに対する抗体の存在について試験したELISAの結果を示す。 （配列番号：1〜23）1E2及び1F2と符号化された、IL-1βと免疫反応性がある2つのFabの「ヒト化」変異体のアミノ酸配列を示す。最も近いヒト生殖系列に対するアラインメントに基づいて、1E2及び1F2のVH及びVλフレームワーク領域における突然変異が提案された。完全ヒト化（hum）V領域及び野生型（wt）V領域の他に、3つの野生型残基しか残存していない「安全変異体」（safe）も提案された。 組換えにより発現されたFabを、biot-IL-1βに結合するその能力について試験したELISAの結果を示す。このために、該Fabを、抗mycコーティングしたMaxisorpプレート上に捕捉した。ビオチン化ヒトIL-1βを添加し、結合したサイトカインを、HRP-コンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出した。 Fab 1E2及び1F2のヒト化変異体を提示するファージをIL-1βへの結合について試験したファージELISAの結果を示す。 キメラ1E2をIL-1βへの結合について試験したELISAの結果を示す。 VHフレームワーク領域1（FR1）の成熟ラマ・グラマ（Llama glama）コンセンサス配列と、VH FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列（VH1-VH7；配列番号：25〜31）との比較を示す。（A）VH1-46ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：24）。（B）VH3-11ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：32）。（C）VH3-21ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：33）。（D）VH3-23ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：34）。（E）VH3-48ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：35）。（F）〜（G）VH3-66ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：36）。（H）VH3ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：37）。（I）〜（J）VH4-30-4ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：38）。 VHフレームワーク領域2（FR2）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VH FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列（VH1-VH7；配列番号：40〜46）との比較を示す。（A）VH1-46ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：39）。（B）VH3-11ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：47）。（C）VH3-21ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：48）。（D）VH3-23ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：49）。（E）VH3-48ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：50）。（F）〜（G）VH3-66ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：51）。（H）VH3ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：52）。（I）〜（J）VH4-30-4ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：53）。 VHフレームワーク領域3（FR3）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VH FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列（VH1-VH7；配列番号：55〜61）との比較を示す。（A）VH1-46ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：54）。（B）〜（C）VH3-11ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：62）。（D）〜（E）VH3-21ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：63）。（F）〜（G）VH3-23ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：64）。（H）VH3-48ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：65）。（I）〜（J）VH3-66ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：66）。（K）〜（L）VH3ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：67）。（M）〜（N）VH4-30-4ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：68）。 VHフレームワーク領域1（FR1）の成熟ラマ・パコス（Llama pacos）コンセンサス配列と、VH FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列（VH1-VH7；配列番号：25〜31）との比較を示す。（A）VH1-46ラマ・パコスFR1コンセンサス配列（配列番号：69）。（B）VH3-66ラマ・パコスFR1コンセンサス配列（配列番号：70）。（C）VH3-48ラマ・パコスFR1コンセンサス配列（配列番号：71）。（D）VH3ラマ・パコスFR1コンセンサス配列（配列番号：72）。（E）〜（F）VH4-30-4ラマ・パコスFR1コンセンサス配列（配列番号：73）。 VHフレームワーク領域2（FR2）の成熟ラマ・パコスコンセンサス配列と、VH FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列（VH1-VH7；配列番号：40〜46）との比較を示す。（A）VH1-46ラマ・パコスFR2コンセンサス配列（配列番号：74）。（B）〜（C）VH3-66ラマ・パコスFR2コンセンサス配列（配列番号：75）。（D）VH3-48ラマ・パコスFR2コンセンサス配列（配列番号：76）。（E）〜（F）VH3ラマ・パコスFR2コンセンサス配列（配列番号：77）。（G）〜（H）VH4-30-4ラマ・パコスFR2コンセンサス配列（配列番号：78）。 VHフレームワーク領域3（FR3）の成熟ラマ・パコスコンセンサス配列と、VH FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列（VH1-VH7；配列番号：55〜61）との比較を示す。（A）VH1-46ラマ・パコスFR3コンセンサス配列（配列番号：79）。（B）VH3-66ラマ・パコスFR3コンセンサス配列（配列番号：80）。（C）〜（D）VH3-48ラマ・パコスFR3コンセンサス配列（配列番号：81）。（E）VH3ラマ・パコスFR3コンセンサス配列（配列番号：82）。（F）〜（G）VH4-30-4ラマ・パコスFR3コンセンサス配列（配列番号：83）。 成熟ラマ・グラマコンセンサス配列VL1-44（配列番号：84）のフレームワーク領域1（FR1）配列と、VL（ラムダ）FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒトVL1-VL6 FR1配列（配列番号：85〜90）とのアラインメント。（B）ヒトVL7-VL10 FR1配列（配列番号：91〜94）とのアラインメント。 成熟ラマ・グラマコンセンサス配列VL1-44（配列番号：95）のフレームワーク領域2（FR2）配列と、VL（ラムダ）FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒトVL1-VL6 FR2配列（配列番号：96〜101）とのアラインメント。（B）ヒトVL7-VL10 FR2配列（配列番号：102〜105）とのアラインメント。 成熟ラマ・グラマコンセンサス配列VL1-44（配列番号：106）のフレームワーク領域3（FR3）配列と、VL（ラムダ）FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒトVL1-VL8 FR3配列（配列番号：107〜114）とのアラインメント。（B）ヒトVL9-VL10 FR3配列（配列番号：115〜116）とのアラインメント。 VL2フレームワーク領域1（FR1）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列（VK1-VK10；配列番号：118〜125）との比較を示す。（A）VL2-11ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：117）アラインメント。（B）〜（C）VL2-18ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：126）アラインメント。 VL2フレームワーク領域2（FR2）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列（VK1-VK10）との比較を示す。（A）VL2-11ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：127）アラインメント。（B）〜（C）VL2-18ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：128）アラインメント。 VL2フレームワーク領域3（FR3）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列（VK1-VK10；配列番号：130〜139）との比較を示す。（A）VL2-11ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：129）アラインメント。（B）〜（C）VL2-18ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：140）アラインメント。 VL3フレームワーク領域1（FR1）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列（VL1-VL10；配列番号：85〜94）との比較を示す。（A）VL3-19ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：141）アラインメント。（B）〜（C）VL3-25ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：142）アラインメント。 VL3フレームワーク領域2（FR2）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列（VL1-VL10；配列番号：96〜105）との比較を示す。（A）VL3-19ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：143）アラインメント。（B）〜（C）VL3-25ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：144）アラインメント。 VL3フレームワーク領域3（FR3）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL（ラムダ）FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列（VL1-VL10；配列番号：130〜139）との比較を示す。（A）VL3-19ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：145）アラインメント。（B）〜（C）VL3-25ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：146）アラインメント。 VL5（配列番号：147）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列フレームワーク領域1（FR1）配列と、VL FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒト生殖系列VL1-VL6（配列番号：85〜90）のFR1配列とのアラインメント。（B）ヒト生殖系列VL7-VL10（配列番号：91〜94）のFR1配列とのアラインメント。 VL5（配列番号：148）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列フレームワーク領域2（FR2）配列と、VL FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒト生殖系列VL1-VL6（配列番号：96〜101）のFR2配列とのアラインメント。（B）ヒト生殖系列VL7-VL10（配列番号：102〜105）のFR2配列とのアラインメント。 VL5（配列番号：149）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列フレームワーク領域3（FR3）配列と、VL FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒト生殖系列VL1-VL6（配列番号：150〜155）のFR3配列とのアラインメント。（B）ヒト生殖系列VL7-VL10（配列番号：156〜159）のFR3配列とのアラインメント。 VL8-61（配列番号：160）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列フレームワーク領域1（FR1）配列と、VL FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒト生殖系列VL1-VL6（配列番号：85〜90）のFR1配列とのアラインメント。（B）ヒト生殖系列VL7-VL10（配列番号：91〜94）のFR1配列とのアラインメント。 VL8-61（配列番号：161）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列フレームワーク領域2（FR2）配列と、VL FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒト生殖系列VL1-VL6（配列番号：96〜101）のFR2配列とのアラインメント。（B）ヒト生殖系列VL7-VL10（配列番号：102〜105）のFR2配列とのアラインメント。 VL8-61（配列番号：162）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列フレームワーク領域3（FR3）配列と、VL FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列との比較を示す。（A）ヒト生殖系列VL1-VL6（配列番号：107〜112）のFR3配列とのアラインメント。（B）ヒト生殖系列VL7-VL10（配列番号：113〜116）のFR3配列とのアラインメント。 Vカッパフレームワーク領域1（FR1）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL（カッパ）FR1のヒト生殖系列コンセンサス配列（VK1-VK5；（配列番号：164〜168））との比較を示す。（A）VK1ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：163）アラインメント。（B）VK2ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：169）アラインメント。（C）VK4ラマ・グラマFR1コンセンサス配列（配列番号：170）アラインメント。 Vカッパフレームワーク領域2（FR2）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL（カッパ）FR2のヒト生殖系列コンセンサス配列（VK1-VK5；（配列番号：172〜176））との比較を示す。（A）VK1ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：171）アラインメント。（B）VK2ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：177）アラインメント。（C）VK4ラマ・グラマFR2コンセンサス配列（配列番号：178）アラインメント。 Vカッパフレームワーク領域3（FR3）の成熟ラマ・グラマコンセンサス配列と、VL（カッパ）FR3のヒト生殖系列コンセンサス配列（VK1-VK5；（配列番号：180〜184））との比較を示す。（A）VK1ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：179）アラインメント。（B）VK2ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：185）アラインメント。（C）VK4ラマ・グラマFR3コンセンサス配列（配列番号：186）アラインメント。 ヒトVカッパ配列（VK1-13、VK2-28、VK4-1）内の特定の位置、及び各々のヒトVカッパ配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。（A）FR1及びCDR1（破線部分）中の特定のKabat位置におけるアミノ酸利用％。（B）FR2、CDR2、FR3及びCDR3中の特定のKabat位置におけるアミノ酸利用％。 ヒトVL1配列（VL1-44）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。 特定のヒトVL2配列（VL2-11及びVL2-18）内の特定の位置、並びに各々のヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。（A）CDR1、FR1、CDR2、及びFR2中の選択された位置。（B）FR2及びCDR3中の選択された位置。 特定のヒトVL3配列（VL3-19及びVL3-25）内の特定の位置、並びに各々のヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。（A）CDR1、FR1、及びCDR2中の選択された位置。（B）FR2、CDR3、及びFR3中の選択された位置。 ヒトVL5配列（VL5-37）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。 ヒトVL8配列（VL8-61）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。 ヒトVH1配列（VH1-46）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。 選択されたヒトVH3配列（VH3-21、VH3-48、VH3-23、VH3-66、VH3-11）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。（A）FR1、CDR1、及びFR2内の選択された位置。（B）CDR2内の選択された位置。（C）FR3内の選択された位置。 ヒトVH4配列（VH4-30-4）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。 ヒト生殖系列配列（HJ3）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.グラマ）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。 ヒトVH1配列（VH1-46）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.パコス）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。 ヒトVH3配列（VH3-48及びVH3-66）内の特定の位置、並びに該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.パコス）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。（A）FR1、CDR1、FR2、及びCDR2内の選択された位置。（B）CDR2及びFR3内の選択された位置。 ヒトVH4配列（VH4-30-4）内の特定の位置、及び該ヒト配列との最も近い相同性を有するラクダ科動物（L.パコス）配列中の対応する位置における様々なアミノ酸残基の利用％を示す。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ラクダ科ファミリーの種の通常型抗体レパートリーに由来する、所望の標的
抗原に対する特異性を有する、ヒト化抗体に関する。

したがって、第一の態様では、本発明は、ラクダ科動物VHドメイン、及びラムダ軽鎖ク
ラス（Vλ）又はカッパ軽鎖クラス（Vκ）のいずれかのラクダ科動物VLドメインを含み、
少なくとも1つのアミノ酸置換が、該VHドメイン及び／又は該VLドメイン中に存在し、該
アミノ酸置換（複数可）が、以下のものから選択されることを特徴とする、抗体、及びよ
り具体的には、ラクダ科動物由来抗体のヒト化変異体を提供する：
（a）該ラクダ科動物VHドメイン中のアミノ酸置換（複数可）、ここで、Kabatによる、
該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40
、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H8
9、H93、H94、及びH108からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメ
イン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される；並びに
（b）該ラクダ科動物VLドメイン中のアミノ酸置換、ここで、該ラムダ軽鎖クラス（Vλ
）のラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置
L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L
44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L
80、L84、及びL103からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVλドメイ
ン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換され；かつ該カッパ軽鎖クラス（Vκ
）のラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置
K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、
K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、及びK106からなる群から
選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVκドメイン配列中の対応する位置に見られる
アミノ酸と交換される。

以下の節において、本発明の様々な態様がより詳細に定義されている。矛盾することが
明確に示されない限り、そのように定義された各態様を、任意の他の1つの態様又は複数
の態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であることが示された任意
の特徴を、好ましい又は有利であることが示された任意の他の1つの特徴又は複数の特徴
と組み合わせることができる。

（定義）
「抗体」という用語は、標的抗原を特異的に認識する、モノクローナル抗体（完全長モ
ノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性
抗体）、抗体断片、イムノアドヘシン、及び抗体-イムノアドヘシンキメラを含むように
最も広い意味で用いられる。抗体断片の非限定的な例としては、単一の可変ドメイン（VH
、VL、もしくはVκ）（Skerra A.及びPluckthun, A.の文献（1988） Science 240：1038-
41）、単鎖抗体（例えば、scFv）（Bird, R.E.らの文献（1988） Science 242：423-26；
Huston, J.S.らの文献（1988） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-83）、Fab、（Fa
b'）2、又は当業者に周知の他の断片が挙げられる。

本発明の抗体中のVLドメインは、Vラムダ型又はVカッパ型であることができる。特に明
記しない限り、「VLドメイン」という用語は、本明細書では一般的な意味で用いられ、か
つカッパ型の免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン（Vκ）とラムダ型の免疫グロブリン軽
鎖の可変ドメイン（Vλ）の両方を意味する。「ラクダ科動物VLドメイン」及び「ラクダ
科動物由来VLドメイン」という用語は、ラクダ科動物種から単離されたVLドメイン（又は
特に明記しない限り、Vκ型もしくはVλ型のどちらか）、及びネイティブなラクダ科動物
VLドメインと比べて1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む人為操作された
その変異体を意味する。

「ラクダ科動物VHドメイン」という用語は、γ、ε、δ、α、又はμアイソタイプを含
む、ラクダ科動物の任意の既知の重鎖アイソタイプのVHドメイン、及びネイティブなラク
ダ科動物VHドメインと比べて1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む人為操
作されたその変異体を意味する。「ラクダ科動物VHドメイン」という用語は、ラクダ科動
物の通常型抗体のVHドメインだけを意味し、ラクダ科動物VHHドメインを包含しない。

「ラクダ科動物VHドメイン」又は「ラクダ科動物VLドメイン」という用語は、それぞれ
、通常型のラクダ科免疫グロブリン可変領域遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配
列を含むVH又はVLドメインを意味する。ラクダ科動物VH及び／又はVLドメイン（ラムダ又
はカッパ軽鎖）をコードする通常型のラクダ科免疫グロブリン遺伝子配列は、天然の免疫
グロブリン遺伝子（限定するものではないが、ラクダ科動物、例えば、所望の抗原で免疫
したラクダ科動物から得られる生殖系列免疫グロブリン遺伝子、再編成された免疫グロブ
リン遺伝子、もしくは体細胞突然変異した免疫グロブリン遺伝子を含む）から、又は天然
の通常型のラクダ科免疫グロブリン遺伝子配列（限定するものではないが、「異種CDRも
しくはフレームワーク領域配列」を含むように改変されている天然のラクダ科免疫グロブ
リン遺伝子、もしくはコンセンサス配列を含む非経験的に（ab initio）生成された免疫
グロブリン遺伝子、もしくは天然の通常型のラクダ科免疫グロブリン遺伝子配列のキメラ
を含む）に由来する合成遺伝子から得ることができる。「ラクダ科動物VHドメイン」とい
う用語は、ラクダ科VHHドメインを包含しない。

「異種CDR又はフレームワーク領域配列」という用語は、ラクダ科動物VH又はVL（Vλ／
Vκ）ドメインでなされた任意のCDR又はフレームワーク領域アミノ酸配列改変を包含する
。

「対応する位置」という用語は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている
、Kabatらの文献、「免疫学的関心対象のタンパク質の配列（Sequences of Proteins of
Immunological Interest）」（第5版.Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD., 1983）に示された付番体系による、ヒトVH又はVL（Vλもしくは
Vκ）ドメイン配列中の同じ付番位置のアミノ酸を意味する。

「ヒトVHドメイン配列」という用語は、ヒト生殖系列によってコードされた任意の抗体
重鎖可変領域配列、又はその部分に加え、その誘導体を広く包含する。ヒトVHドメイン配
列の好適で、非限定的な例としては、ヒト重鎖生殖系列V、D、及び／もしくはJ領域配列
、体細胞突然変異したVHドメインを含む成熟ヒトVHドメイン配列、並びにコンセンサスヒ
ト生殖系列もしくは成熟ヒトVHドメイン配列、又はそれらの部分が挙げられる。「ヒトVL
ドメイン配列」という用語も同様に定義される。コンセンサス配列の好適で、非限定的な
例、及びそれを作製する方法は、US648213号に記載されている。

「に由来する」という用語は、ある生物由来の成熟可変領域アミノ酸配列と同じ生物由
来の生殖系列にコードされたV、D、及び／又はJ領域アミノ酸配列との間の相同性の程度
を意味する。生殖系列にコードされた特定のV、D、及び／又はJ領域アミノ酸配列に対す
る高度な相同性を有する可変領域は、その生殖系列配列「に由来する」と考えられる。

「生殖系列配列」という用語は、生物のゲノムDNAに存在する、再編成されていない免
疫グロブリンV、D、及び／もしくはJ領域、又はそれらの部分によってコードされたアミ
ノ酸配列を意味する。

特定のファミリーに属するか、又は特定のファミリーメンバーと一致するラクダ科動物
VH又はVL（VλもしくはVκ）ドメインを本明細書で参照することができる。特に明記しな
い限り、ラクダ科動物VH及びVL（Vλ又はVκ）ドメインを、規定のファミリー又は特定の
ファミリーメンバーのヒトVH又はVL（VλもしくはVκ）ドメイン配列に対するアラインメ
ントに基づいて、特定のファミリー又はファミリーメンバーに「割り当てる」。したがっ
て、（VH1、VH2、又はVH4などではなく）ヒトVH3ファミリーのVHドメインと最も良く整列
するラクダ科動物VHドメインを、本明細書では「ラクダ科動物VH3ドメイン」と同定する
ことができる。ヒトVH1ファミリーのVHドメインと最も良く整列するラクダ科動物VHドメ
インを、本明細書では「ラクダ科動物VH1ドメイン」と呼ぶ。ヒトVH4ファミリーのVHドメ
インと最も良く整列するラクダ科動物VHドメインを、本明細書では「ラクダ科動物VH4ド
メイン」と呼ぶ。同様に、特に明記しない限り、ラクダ科動物VL（Vλ又はVκ）ドメイン
を、既知のファミリー又はファミリーメンバーのヒトVL（Vλ又はVκ）ドメインに対する
アラインメントに基づいて、特定のクラスに割り当てる。したがって、カッパクラスのヒ
トVLドメインと最も良く整列するラクダ科動物VLドメインを、本明細書では、「ラクダ科
動物Vκドメイン」（「Vκ」と略記する）と呼ぶことができ、一方、ラムダクラスのヒト
VLドメインと最も良く整列するラクダ科動物VLドメインを、本明細書では、「ラクダ科動
物Vラムダドメイン」（「Vλ」と略記する）と呼ぶことができる。

Vカッパドメインの分類において、ラクダ科動物Vκドメインを、最も近いヒトサブクラ
スに対するアラインメントを基にして、特定のサブクラスに割り当てることができる。し
たがって、ヒトVκ1、Vκ2、及びVκ4と最も良く整列するラクダ科動物Vκドメインを、
本明細書では、それぞれ、「ラクダ科動物Vκ1」、「ラクダ科動物Vκ2」、及び「ラクダ
科動物Vκ4」ドメインと呼ぶことができる。

ラクダ科動物VH及びVL（Vλ又はVκ）ドメインを、最も良く一致するヒト生殖系列配列
を基にして分類することもできる。したがって、例として、ヒトVH3-23生殖系列と最も良
く整列するラクダ科動物VHドメインを、本明細書では、ラクダ科動物VH3-23ドメインと呼
ぶことができる、などのようである。同様に、ヒトVκ1-46生殖系列と最も良く整列する
ラクダ科動物Vκドメインを、本明細書では、ラクダ科動物Vκ1-46ドメインと特定するこ
とができる。

さらに、重鎖又はカッパ／ラムダ軽鎖ドメインのJセグメントによってコードされたFR4
領域を、最も良く一致するヒト生殖系列を基にして分類することもできる。したがって、
例として、ヒトJH3生殖系列と最も良く整列するラクダ科動物重鎖可変ドメインのFR4を、
本明細書では、ラクダ科動物JH3領域と呼ぶことができ、該FR4をコードするC末端部分は
、ヒト化又は生殖系列化のために特に関心対象となる。

ラクダ科動物種は、古典的又は「通常型」抗体、さらには重鎖抗体という、2つの異な
るタイプの抗体を有することが知られている。

本明細書で使用する場合、「通常型抗体」という用語は、IgA、IgG、IgD、IgE、又はIg
Mを含む任意のアイソタイプの抗体を意味する。ネイティブな又は天然の「通常型」ラク
ダ科動物の抗体は、通常、2本の同一の軽（L）鎖及び2本の同一の重（H）鎖から構成され
る、ヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって
重鎖に連結されているが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプ
の重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的に配置された鎖内ジスルフィド架橋も有す
る。各重鎖は、一方の端（N-末端）に可変ドメイン（VH）を有し、それに続いていくつか
の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端（N-末端）にある可変ドメイン（VL）とも
う一方の端にある定常ドメイン（CL）を有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常
ドメインと並置され、かつ軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置されている。
特定のアミノ酸残基が、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの境界面を形成すると考え
られている。

「重鎖抗体」という用語は、軽鎖を天然に欠いている抗体のような、ラクダ科動物種に
天然に生じることが知られている第二のタイプの抗体を意味する（Hamers-Castermanらの
文献、Nature.1993；363；446-8）。重鎖抗体（HCAbと略される）は、共有ジスルフィド
結合によって連結された2本の重鎖から構成される。HCAb中の各重鎖は、一方の端に可変
ドメインを有する。HCAbの可変ドメインは、これを「通常型」ラクダ科動物抗体の重鎖の
可変ドメイン（VH）と区別するために「VHH」と呼ばれる。VHHドメインとVHドメインは全
く別物であり、ラクダ科動物ゲノムの異なる遺伝子セグメントによってコードされている
。

Vラムダ軽鎖ドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループを、本明細書では、L1（
λ）、L2（λ）、及びL3（λ）と呼び、かつVLドメイン中の残基24-34（L1（λ））、50-
56（L2（λ））、及び89-97（L3（λ））（残基の付番はKabatによる；CDRの定義はChoth
iaによる(http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef参照））を含むものとして定義するこ
とができる。Vカッパ軽鎖ドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループを、本明細書
では、L1（κ）、L2（κ）、及びL3（κ）と呼び、かつVカッパドメイン中の残基24-34（
L1（κ））、50-56（L2（κ））、及び89-97（L3（κ））（残基の付番はKabatによる；C
DRの定義はChothiaによる(http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef参照））を含むものと
して定義することができる。VHドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループを、本明
細書では、H1、H2、及びH3と呼び、かつVHドメイン中の残基26-32..34（H1）、52-56（H2
）、及び95-102（H3、長さにかなりのばらつきがある）（残基の付番はKabatによる；CDR
の定義はChothiaによる(http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef参照））を含むものとし
て定義することができる。

特に指示しない限り、L1、L2、及びL3という用語は、それぞれ、VLドメインの第一、第
二、及び第三の超可変ループを意味し、かつラクダ科由来のVカッパアイソタイプとVラム
ダアイソタイプの両方から得られる超可変ループを包含する。H1、H2、及びH3という用語
は、それぞれ、VHドメインの第一、第二、及び第三の超可変ループを意味し、かつγ、ε
、δ、α、又はμを含む、ラクダ科由来の既知の重鎖アイソタイプのいずれかから得られ
る超可変ループを包含する。

超可変ループL1、L2、L3、H1、H2、及びH3は、各々、「相補性決定領域」又は「CDR」
の一部を含むことができる。超可変ループ（HV）は、構造を基に定義される（http://www
.bioinf.org.uk/abs/#cdrdefのウェブページでChothia定義と呼ばれる）のに対し、相補
性決定領域（CDR）は、配列変動性を基に定義される（先に記載したウェブページ上でKab
at定義と呼ばれる；Kabatらの文献、「免疫学的関心のあるタンパク質の配列（Sequences
of Proteins of Immunological Interest）」、第5版、Public Health Service、米国国
立衛生研究所（NIH）、ベセスダ、MD., 1983）ので、「超可変ループ」及び「相補性決定
領域」という用語は厳密には同義語ではなく、HVとCDRの境界は、一部のVH及びVLドメイ
ンで異なる場合がある。Kabat（配列変動性）、Chothia（構造）、AbMによるか、又は接
触に基づくCDRの定義は、UCLのAndrew C.R. Martin's Bioinformatics Groupの先に述べ
たウェブサイト（http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef）上で見ることができる。

VラムダドメインのCDRは、通常、以下のアミノ酸を含むものとして定義することができ
る：
残基24-34（ヒトVラムダ生殖系列中の11、12、13、又は14アミノ酸残基からなる、L1（
λ））、50-56（ヒトVラムダ生殖系列中の7、11、又は12残基からなる、L2（λ））、及
び89-97（大部分の体細胞突然変異したヒト抗体中の9〜11残基からなる、L3（λ）（Knap
pikらの文献、J. Mol. Biol. 296：57-86（1999）））；付番はKabatによる。

VカッパドメインのCDRは、通常、以下のアミノ酸を含むものとして定義することができ
る：残基24-34（ヒトVカッパ生殖系列中の11、12、16、又は17残基からなる、L1（κ））
、50-56（ヒトVカッパ生殖系列中の7残基からなる、L2（κ））、及び89-97（大部分の体
細胞突然変異したヒト抗体中の10残基からなる、L3（κ）（Knappikらの文献、J. Mol. B
iol. 296：57-86（1999）））；付番はKabatによる。

VHドメインのCDRは、通常、以下のアミノ酸を含むものとして定義することができる：V
Hドメイン中の、残基31-35B（ヒト生殖系列VH中に存在する5、6、又は7残基からなる、H1
）、50-65（ヒト生殖系列VH中に存在する16、17、18、又は19残基からなる、H2）、及び9
5-102（長さにかなりのばらつきがある、H3）；付番はKabatによる。

したがって、これらのHVは、対応するCDR内に含まれることができ、特に指示しない限
り、本明細書におけるVH及びVLドメインの「超可変ループ」への言及は、対応するCDRも
包含するものと解釈すべきであり、その逆もまた同様である。体細胞突然変異したVH及び
生殖系列VH、並びに体細胞突然変異したVカッパ及びVラムダ配列（表1〜37）の解析では
、（変動性に基づく）KabatによるCDRの定義を適用した。

可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（FR）と呼ばれる。
ネイティブな重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々、3つの超可変ループによって接続さ
れた、主にβ-シート立体配置を取る4つのFR（それぞれ、FR1、FR2、FR3、及びFR4）を含
む。各鎖内の超可変ループは、これらのFRによって密に近接して保持され、かつ他の鎖由
来の超可変ループとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。抗体の構造解析から
、相補性決定領域によって形成された結合部位の配列と形状の関係が明らかになった（Ch
othiaらの文献、J. Mol. Biol., 227：799-817（1992））；Tramontanoらの文献、J. Mol
. Biol., 215：175-182（1990））。その高度な配列変動性にもかかわらず、これら6つの
ループのうちの5つは、「カノニカル構造」と呼ばれる、ごく少数のレパートリーの主鎖
立体構造を取る。これらの立体構造は、まず第一にループの長さによって、第二に、その
パッキング、水素結合、又は普通でない主鎖立体構造を取る能力によって立体構造を決定
するループ内及びフレームワーク領域内の特定の位置での重要残基の存在によって決定さ
れる。

定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接は関与しないが、抗体依存性細胞傷害性（
ADCC）、補体依存性細胞傷害性（CDC）、抗体依存性細胞食作用（ADCP）、又はFcRn結合
への抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示す。

本発明の全ての態様及び実施態様において、（本発明の抗原結合ポリペプチドの超可変
ループ又はCDRが得られる）ラクダ科（又はラクダ科動物）種は、フタコブラクダ、リャ
マ、ヒトコブラクダ、ビクーナ、グアナコ、又はアルパカ、及びそれらの任意の交配種で
あることができる。リャマ（ラマ・グラマ）、アルパカ（ラマ・パコス）、及びヒトコブ
ラクダ（カメルス・ドロメダリウス（Camelus dromedarius））は、本発明の全ての態様
について好ましいラクダ科種である。

「ラクダ科ファミリーの種のVHドメイン又はVLドメインから得られた超可変ループ又は
相補性決定領域」とは、超可変ループ（HV）又CDRが、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子に
よってコードされる超可変ループ又はCDRのアミノ酸配列と同一、又は実質的に同一であ
るアミノ酸配列を有することを意味する。この文脈において、「免疫グロブリン遺伝子」
は、生殖系列遺伝子、再編成を経た免疫グロブリン遺伝子、及びさらに体細胞突然変異し
た遺伝子を含む。したがって、ラクダ科種のVH又VLドメインから得られたHV又CDRのアミ
ノ酸配列は、成熟したラクダ科通常型抗体中に存在するHV又はCDRのアミノ酸配列と同一
であり得る。この文脈における「から得られた」という用語は、本発明のヒト化抗体のHV
又はCDRが、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子によってもともとコードされていたアミノ酸
配列（又はそのマイナー変異体）を具現化するという意味において、構造的関係性を暗示
するものである。しかしながら、これは、本発明の抗原結合ポリペプチドを調製するのに
用いられる生産プロセスに関して、必ずしも特定の関係を暗示するものではない。以下で
論じるように、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子によってもともとコードされていた配列と
同一（又は実質的に同一）のアミノ酸配列を有するHV又はCDRを含むヒト化抗体を調製す
るために使用し得るいくつかの方法が存在する。

誤解を避けるために、「ラクダ科動物の通常型抗体のVHドメイン」及び「ラクダ科の種
から得られたVHドメイン」という用語は同義的に用いられ、かつ合成の又は人為操作され
た組換え遺伝子（コドン最適化された合成遺伝子を含む）の産物であるVHドメインを包含
するものであり、このVHドメインは、ラクダ科免疫グロブリン遺伝子（生殖系列のもの、
再編成されたもの、又は体細胞突然変異したもの）によってコードされるVHドメインのア
ミノ酸配列と同一（又は実質的に同一）のアミノ酸配列を有する。同様に、「ラクダ科動
物の通常型抗体のVLドメイン」及び「ラクダ科の種から得られたVLドメイン」という用語
は同義的に用いられ、かつ合成の又は人為操作された組換え遺伝子（コドン最適化された
合成遺伝子を含む）の産物であるVLドメインを包含するものでり、このVLドメインは、ラ
クダ科免疫グロブリン遺伝子（生殖系列のもの、再編成されたもの、又は体細胞突然変異
したもの）によってコードされるVLドメインのアミノ酸配列と同一（又は実質的に同一）
のアミノ酸配列を有する。

本発明のヒト化抗体は、通常、組換えによって発現されたポリペプチドであり、かつキ
メラポリペプチドであってもよい。「キメラポリペプチド」という用語は、そうでなけれ
ば隣接して生じることのない2以上のペプチド断片の並置によって生成される人工の（非
天然の）ポリペプチドを意味する。この定義に含まれるのは、例えば、ラクダ科動物とヒ
トなどの、2以上の種によってコードされるペプチド断片の並置によって生成される「種
」キメラポリペプチドである。

少なくともラクダ科動物VHドメイン及び／又はラクダ科動物VLドメインが存在するため
に、本発明のヒト化抗体は、天然のヒト抗体、特にヒト自己抗体ではない。「天然のヒト
抗体」という用語は、ヒト対象内で天然に発現される抗体を意味する。天然のヒト抗体、
又はその断片のアミノ酸配列と100％同一であるアミノ酸配列を有する抗体であって、そ
の天然の抗体、又は断片がキメラでなく、かつアミノ酸配列にいかなる人為操作された変
化も施されていない（体細胞変異を除く）ものは、本発明の範囲から除外される。

（ラクダ科動物VH及びVLドメインのヒト化）
ラクダ科動物の通常型抗体レパートリーは、引用により本明細書中に組み込まれている
、US12／497,239号で論じられた、以下の要因のために、ヒト治療剤としての有用性を有
する抗体の調製に有利な出発点を提供することが認識されている：
1）ラクダ科動物VH及びVLドメインとそれらのヒト対応物の間の高い配列相同性％；
2）ラクダ科動物VH及びVLドメインのCDRとそれらのヒト対応物（すなわち、ヒト様カノ
ニカルフォールド構造及びヒト様カノニカルフォールド組合せ）の間の高度な構造相同性

ラクダ科動物VH及び／又はラクダ科動物VLドメインを含む抗体のヒト治療に対する有用
性を、例えば、それらがヒト宿主において免疫原性の低いものとなるように、天然のラク
ダ科動物VH及びVLドメインの「ヒト化」によって、またさらに改善することができる。ヒ
ト化の全般的な目的は、VH及びVLドメインが、ヒト対象に導入されたときに最小限の免疫
原性を示す一方で、もとのVH及びVLドメインによって形成される抗原結合部位の特異性及
び親和性を保持する分子を産生することである。

ヒト化の1つのアプローチである、いわゆる「生殖系列化」は、ラクダ科動物VH又はVL
ドメインのアミノ酸配列の変化を人為操作して、それをヒトVH又はVLドメインの配列によ
り近付けることを含む。

ラクダ科動物VH（又はVL）ドメインとヒトVH（又はVL）ドメインの間の相同性の決定は
、（所与のVH又はVLドメイン中の）変化させるべきラクダ科動物アミノ酸残基の選択と適
切な交換用アミノ酸残基（複数可）の選択の両方のために、ヒト化プロセスの極めて重要
な工程である。

ヒト化のアプローチは、多数の新規ラクダ科動物VH（及びVL）ドメイン配列、典型的に
は標的抗原に結合することが知られている体細胞突然変異したVH（又はVL）ドメインと、
ヒト生殖系列VH（又はVL）配列、ヒトVH（及びVL）コンセンサス配列、並びにラマ・パコ
スについて入手可能な生殖系列配列情報とのアラインメントに基づいて開発された。この
アプローチは、置換の候補残基としてのヒト生殖系列VH（又はVL）ドメインとのミスマッ
チを典型的に示すラクダ科動物VH（又はVL）ドメイン内の特定の残基の同定を可能にした
。ラマ・グラマで生成された体細胞突然変異抗体の多数のVドメインを、これらが最適に
整列するヒト生殖系列から逸脱する、生殖系列にコードされたフレームワーク残基（及び
相補性決定残基）と整列させ、同定し、ヒト化又は生殖系列化のための好ましい突然変異
を同定した。さらに、他のラクダ科動物ファミリーメンバーの大部分においてヒト生殖系
列と同一である、体細胞突然変異によって導入された逸脱を認識し、これらをあまり好ま
しくない突然変異に分類した。

以下の節では、（i）交換用の「ラクダ科動物」アミノ酸残基を選択し、かつ（ii）任
意の所与のラクダ科動物VH（又はVL）ドメインをヒト化するときに代入する交換用「ヒト
」アミノ酸残基を選択するために適用される原理を概説する。

（ヒト化アプローチの概略）
工程1.ヒト化すべき成熟ラクダ科動物配列との最も高い相同性／同一性を示すヒト（生
殖系列）ファミリー及びこのファミリーのメンバーを選択する。任意の所与のラクダ科動
物VH（又はVL）ドメインに対して最も良く一致するヒト生殖系列を同定するための一般手
順を以下に概説する。

工程2.生殖系列化するために用いられる特定のヒト生殖系列ファミリーメンバーを選択
する。これは、最も高い相同性を有する生殖系列、又は同じファミリー由来の別の生殖系
列ファミリーメンバーであることが好ましい。

工程3.選択されたヒト生殖系列に最も近いラクダ科動物配列のアミノ酸利用の表を基に
して、生殖系列化が考慮される好ましい位置を同定する。

工程4.最も近いヒト生殖系列から逸脱するラクダ科動物配列中のアミノ酸を変化させて
みる；CDR残基よりもFR残基の生殖系列化が好ましい。
a.生殖系列化するために用いられる選択されたヒト生殖系列から逸脱している位置が好
ましく、そのため、ラクダ科動物配列に見られるアミノ酸は、選択された生殖系列と一致
せず、また、（VにコードされたFRアミノ酸とJにコードされたFRアミノ酸の両方について
）同じサブクラスの他の生殖系列に見られない。
b.選択されたヒト生殖系列ファミリーメンバーから逸脱しているが、同じファミリーの
他の生殖系列で用いられている位置についても生殖系列化プロセスで対処することができ
る。
c.（例えば、さらなる体細胞突然変異による）選択されたヒト生殖系列とのさらなるミ
スマッチについても対処することができる。

以下のアプローチを用いて、所与のラクダ科動物VH（又はVL）ドメインに対して最も良
く一致するヒト生殖系列を決定することができる：

ラクダ科のVH及びVLとヒト生殖系列のVH及びVLの間の配列同一性の割合を解析する前に
、そのカノニカルフォールドをまず決定することができ、これにより、H1及びH2又はL1及
びL2（及びL3）ついての同一のカノニカルフォールド組合せを有するヒト生殖系列セグメ
ントのファミリーの同定が可能になる。その後、関心対象のラクダ科可変領域と最高水準
の配列相同性を有するヒト生殖系列ファミリーのメンバーを、配列相同性のスコア化のた
めに選択することができる。超可変ループL1、L2、L3、H1、及びH2のChothiaカノニカル
クラスの決定は、ウェブページwww.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page.上で公に利用
可能なバイオインフォマティクスツールを用いて行なうことができる。このプログラムの
アウトプットは、データファイル中の重要残基の要件を示す。これらのデータファイルに
おいて、重要残基の位置は、各位置における許容されるアミノ酸とともに示される。抗体
の可変領域の配列は、インプットとして与えられ、かつKabat付番方式を割り当てるため
に、まずコンセンサス抗体配列と整列させられる。カノニカルフォールドの解析では、Ma
rtin及びThorntonによって開発された自動化された方法により得られる1セットの重要残
基テンプレートが用いられる（Martinらの文献、J. Mol. Biol. 263：800-815（1996））
。個々のフレームワーク領域の境界は、Chothiaの付番方式を改変したものであるIMGT付
番方式を用いて割り当てることができる（Lefrancらの文献、NAR 27：209-212（1999）；
http://imgt.cines.fr）。

H1及びH2又はL1及びL2（及びL3）についての同じカノニカルフォールド組合せを用いて
いる、既知の特定のヒト生殖系列Vセグメントを用いて、配列相同性に関して最も良く一
致するファミリーメンバーを決定することができる。ラクダ科VH及びVLドメインフレーム
ワークアミノ酸配列と、ヒト生殖系列によってコードされた対応する配列との間の配列同
一性の割合は、バイオインフォマティクスツールを用いて決定することができるが、これ
らの配列の手作業によるアラインメントを用いることもできる。ヒト免疫グロブリン配列
を、VBase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)又はPluckthun/Honeggerデータベース（ht
tp://www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines）などの、いくつかのタンパク
質データベースから同定することができる。ヒト配列をラクダ科VH又はVLドメインのV領
域と比較するために、例えば、www.expasy.ch/tools/#alignのようなウェブサイトを介し
て利用可能な配列アラインメントアルゴリズムを用いることができるが、限定された配列
セットに関しては、手作業によるアラインメントを行なうこともできる。同じカノニカル
フォールド組合せを有し、かつ各鎖のフレームワーク領域1、2、及び3との最高水準の相
同性を有するファミリーのヒト生殖系列軽鎖及び重鎖配列を選択し、関心対象のラクダ科
可変領域と比較することができる；同様に、FR4を、ヒト生殖系列JH及びJK又はJL領域に
照らしてチェックする。

全体的な配列相同性の割合の計算において、FR1、FR2、及びFR3の残基は、同一のカノ
ニカルフォールド組合せを有するヒト生殖系列ファミリー由来の最も良く一致する配列を
用いて評価されることに留意されたい。同じカノニカルフォールド組合せを有する最も良
く一致するもの又は同じファミリーの他のメンバーと異なる残基のみがスコア化される（
NB-プライマーにコードされたFR1中の違いは全て除外する）。しかしながら、ヒト化の目
的のためには、同じカノニカルフォールド組合せを持たない、他のヒト生殖系列ファミリ
ーのメンバーと同一のフレームワーク領域内の残基に対して、これらは上記のストリンジ
ェントな条件によれば「ネガティブ」とスコア化されるという事実にもかかわらず、ヒト
化を考慮することができる。この考えは、ヒト化のための「ミックス・アンド・マッチ（
mix and match）」アプローチに基づいており、このアプローチでは、Quと同僚（Quらの
文献、Clin. Cancer Res. 5：3095-3100（1999））及びOnoと同僚（Onoらの文献、Mol. I
mmunol. 36：387-395（1999））によって行われたように、FR1、FR2、FR3、及びFR4の各
々が、その最も良く一致するヒト生殖系列配列と個別に比較され、そのため、ヒト化分子
は、様々なFRの組合せを含む。

（ヒト化のためのアミノ酸位置のコアリスト）
成熟ラクダ科動物VH及びVLドメインとコンセンサスヒト生殖系列VH／VL配列との配列ア
ラインメント、及びさらに、最も良く整列するヒト生殖系列配列とのアラインメントに基
づいて、ラクダ科動物VHドメイン及びVLドメイン中の以下の残基が置換の候補として同定
された：
Kabatによって付番された、ラクダ科動物VHドメインのH1、H5、H7、H11、H12、H13、H1
4、H29、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H
83、H84、H85、H86、H89、H93、H94、又はH108；
Kabatによって付番された、ラクダ科動物VラムダドメインのL1、L2、L3、L7、L8、L9、
L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、
L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103。
Kabatによって付番された、ラクダ科動物VカッパドメインのK1、K3、K4、K7、K9、K11
、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78
、K79、K80、K83、K100、K103、K104、又はK106。

これらのリストは、ヒト化しようとするラクダ科動物VH又はVラムダもしくはVカッパド
メインに対して最も良く整列するヒト生殖系列となる特定のヒト生殖系列に対して生殖系
列化するときに変化を考慮することができる、ラクダ科動物VHフレームワークアミノ酸位
置のコアセット、並びにラクダ科動物Vラムダ及びVカッパフレームワークアミノ酸位置の
コアセットとみなされるべきである。各コアセット内のアミノ酸位置は全て、フレームワ
ーク領域FR1、FR2、FR3、又はFR4に生じる。

したがって、本発明は、Kabatによる、位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H3
0、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H
85、H86、H89、H93、H94、又はH108のうちの1つ又は複数の天然アミノ酸が、ラクダ科動
物VHドメイン中のその位置に天然に見られるアミノ酸以外のアミノ酸に交換されるラクダ
科動物VHドメインを含む抗体を提供する。特に、H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29
、H30、H37、H40、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H8
4、H85、H86、H89、H93、H94、又はH108のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメ
イン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸に交換されてもよい。

本発明はまた、Kabatによる、位置L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18
、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69
、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103のうちの1つ又は複数の天然のア
ミノ酸が、ラクダ科動物Vラムダドメイン中のその位置に天然に見られるアミノ酸以外の
アミノ酸に交換されるラクダ科動物Vラムダドメイン（Vλ）を含む抗体を提供する。特に
、L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42
、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78
、L80、L84、又はL103のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVラムダドメイン配列中の
対応する位置に見られるアミノ酸に交換されてもよい。

本発明はまた、Kabatによる、位置K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K1
8、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K
103、K104、又はK106のうちの1つ又は複数の天然のアミノ酸が、ラクダ科動物Vカッパド
メイン中のその位置に天然に見られるアミノ酸以外のアミノ酸に交換されるラクダ科動物
Vカッパドメイン（Vκ）を含む抗体を提供する。特に、K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、
K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、
K80、K83、K100、K103、K104、又はK106のうちの1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVカッパ
ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸に交換されてもよい。

本発明による抗体は、上に示したコアリスト中のVHアミノ酸位置のいずれか1つ又は複
数におけるアミノ酸置換を含むラクダ科動物VHドメインを、上に示したコアリスト中のV
ラムダ又はVカッパアミノ酸位置のいずれか1つ又は複数におけるアミノ酸置換を含むラク
ダ科動物Vラムダ又はVカッパドメインと組み合わせて含み得る。

該コアリスト中の位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H
67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、
H94、又はH108の各々において代入されるべきアミノ酸は、a）出発ラクダ科動物VHドメイ
ン中のその位置の天然のアミノ酸ではなく、かつb）1つ又は複数のヒトVHドメイン配列中
の対応する位置に見られる任意のアミノ酸であることができる。

同様に、該コアリスト中の位置L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L
19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L
70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103の各々において代入されるべきアミ
ノ酸は、a）出発ラクダ科動物Vラムダドメイン中のその位置の天然のアミノ酸ではなく、
かつb）1つ又は複数のヒトVラムダドメイン配列中の対応する位置に見られる任意のアミ
ノ酸であることができる。

同様に、該コアリスト中の位置K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、
K19、K36、K42、K43、K45、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103
、K104、又はK106の各々において代入されるべきアミノ酸は、a）出発ラクダ科動物Vカッ
パドメイン中のその位置の天然のアミノ酸ではなく、かつb）1つ又は複数のヒトVカッパ
ドメイン配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸であることができる。

（ラクダ科動物VH又はVLの特定のVH又はVLクラス又はサブクラスへの生殖系列化）
ラクダ科動物VH又はVLドメインを特定のヒト生殖系列クラス又はサブクラスへと生殖系
列化するのに特に適切なさらなるアミノ酸残基のセットが同定されている。したがって、
特定の実施態様では、本発明は、以下のものを提供する。

ヒトVH3ドメインとの相同性を有するラクダ科動物VHドメインを含み、Kabatによる、該
ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H13、H14、H29、H37、H40、H74、H77、H78、H83
、H84、H86、又はH94のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH3ドメイン配列中の対応
する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。

ヒトVH1ドメインとの相同性を有するラクダ科動物VHドメインを含み、Kabatによる、該
ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80、又はH86の
うちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミ
ノ酸と交換される、抗体。

ヒトVH4ドメインとの相同性を有するラクダ科動物VHドメインを含み、Kabatによる、該
ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H30、H48、H67、H68、H71、H81、H84、H85、又はH86
のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH4ドメイン配列中の対応する位置に見られるア
ミノ酸と交換される、抗体。

ヒトVλ1ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによ
る、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L11、L14、L18、L19、L69、L74、L76、又はL8
0のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVL1ドメイン配列中の対応する位置に見られる
アミノ酸と交換される、抗体。

ヒトVλ2ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによ
る、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L5
8、L59、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ2ドメイン配列中の対応する
位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。

ヒトVλ3ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによ
る、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15
、L19、L20、L60、L66、L69、L70、L71、L72、L76、L78、又はL84のうちの1つ又は複数の
アミノ酸が、ヒトVλ3ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、
抗体。

ヒトVλ5ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによ
る、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L2、L11、L17、L19、L40、L70、L72、又はL80
のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ5ドメイン配列中の対応する位置に見られる
アミノ酸と交換される、抗体。

ヒトVλ8ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vラムダドメインを含み、Kabatによ
る、該ラクダ科動物Vラムダドメインの位置L2、L11、L60、L67、L80、L81、又はL84のう
ちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ8ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミ
ノ酸と交換される、抗体。

ヒトVκ1ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vカッパドメインを含み、Kabatによ
る、ラクダ科動物VHドメインの位置K1、K4、K11、K12、K13、K15、K42、K43、K70、K77、
K79、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ1ドメイン配列中の対応す
る位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。

ヒトVκ2ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vカッパドメインを含み、Kabatによ
る、ラクダ科動物VHドメインの位置K7、K9、K12、K14、K18、K36、K46、K63、K77、K79、
又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ2ドメイン配列中の対応する位置に見
られるアミノ酸と交換される、抗体。

ヒトVκ4ドメインとの相同性を有するラクダ科動物Vカッパドメインを含み、Kabatによ
る、ラクダ科動物VHドメインの位置K9、K11、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45
、K58、K68、K78、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ4ドメイン配
列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、抗体。

（交換用アミノ酸の選択の論理的根拠）
交換用に選択されるアミノ酸位置でラクダ科動物VH（又はVλもしくはVκ）ドメインに
対して代入されるべき適切な交換用アミノ酸を選択するために、該ラクダ科動物VH（又は
VλもしくはVκ）ドメインアミノ酸配列と、ヒトVH（又はVλもしくはVκ）ドメインのア
ミノ酸配列、典型的にはヒト生殖系列VH（又はVλもしくはVκ）配列、及び生殖系列JH（
又はJλもしくはJκ）配列、或いは特定のVH（又はVλもしくはVκ）ファミリーもしくは
そのファミリーメンバーについてのコンセンサス配列とのアラインメントを再び参照する
ことができる。

いくつかの異なるアプローチを取って、「ヒト」残基を選択し、本明細書で同定された
1つ又は複数の位置にある天然のラクダ科動物アミノ酸残基を交換することができる。第
一に、最も良く一致／整列するヒト生殖系列VH又はVλもしくはVκドメイン、或いは出発
ラクダ科動物VH又はVλもしくはVκと極めて良く一致する少なくともヒト生殖系列（これ
は、最も良く一致するヒト生殖系列配列と同じファミリー又はそのファミリーメンバーの
メンバーであることが好ましい）中の対応する位置に見られる交換用ヒトアミノ酸残基を
選択することができる。任意の所与のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインに対し
て最も良く一致するヒト生殖系列配列を選択するためのアルゴリズムは、上に示されてい
る。

第二に、ラクダ科動物VH／Vλ／Vκドメインが割り当てられるVHもしくはVλもしくはV
κファミリー又はファミリーメンバーのために、最もよく用いられるヒト生殖系列由来の
交換用ヒト残基を選択することができる。例えば、ラクダ科動物VHドメインがVH3ファミ
リーに属することが確認されているならば、最もよく用いられるヒトVH3生殖系列ファミ
リーメンバーであるV3-23を交換用アミノ酸残基の源として用いることができる。配列ア
ラインメントを用いて、ラクダ科動物VH／Vλ／Vκドメイン配列中で交換されるべきアミ
ノ酸残基と等価なヒト残基を同定する。下記の表1〜3には、特定のファミリー又はファミ
リーメンバーに属するラクダ科動物VH／Vλ／Vκドメインのための交換用ヒトアミノ酸残
基の源としての好ましいヒトVH、Vラムダ、及びVカッパ生殖系列が記載されている。

最後に、第三のアプローチでは、別の生殖系列ファミリー由来のVH又はVλもしくはVκ
ドメインを含む、任意の他のヒト生殖系列VH又はVλもしくはVκドメイン配列由来の置換
ヒトアミノ酸残基を選択することができる。この場合、出発ラクダ科動物VHドメインと選
択されたヒトVH生殖系列の間の全体的な配列相同性はあまり考慮されなくてもよく；置換
残基が、ことによると類似した局所的配列状況にある、ヒト生殖系列に見られる残基であ
ることだけで十分な場合がある。

上記のアプローチの組合せを単一のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインにおい
て用いることができ；2以上の異なるヒト生殖系列から取得した交換用残基を混合して組
み合わせることができる。任意の所与のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインにつ
いて、本明細書で同定された位置、特に、コアリストに載っているアミノ酸位置（ラクダ
科動物VHドメインのH1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H48、H67、
H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H89、H93、H94
、又はH108；ラクダ科動物VラムダドメインのL1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、
L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、
L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L84、又はL103；ラクダ科動物Vκドメ
インのK1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45
、K46、K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、又はK106）のう
ちの1つ又は複数にあるネイティブなラクダ科動物残基を交換するかしないかの決定は、
ケースバイケースで判断してもよい。

第一段階として、所与のVH又はVλもしくはVκドメインをヒト化する場合、典型的には
、ラクダ科動物配列と基準ヒト配列（これは、特定の生殖系列配列又はコンセンサス配列
であってもよい）とのアラインメントによって変化させるべき候補残基を同定する。コア
リスト（適宜、VH又はVλもしくはVκについてのもの）に載っていることが確認された位
置にミスマッチがある（すなわち、ヒト配列と整列しない）ラクダ科動物残基を、上に示
した基準に従って選択された対応するヒト残基との交換用に選択することができる。

ある場合には、ミスマッチがある全てのラクダ科動物残基を対応するヒト残基と交換す
る決定を下してもよい。別の場合には、例えば、抗体の構造（例えば、抗原結合部位の立
体構造）にとってのその重要性のために、特定の位置にある1つ又は複数の残基を変化さ
せない決定を下してもよい。その他の残基を、それが他のヒト生殖系列において同じ配列
状況で見られ（VH／Vλ／Vκドメイン全体にわたって、必ずしも最も良く一致するもので
はない）、したがって、それをヒトのものと考えることができるという理由で除外しても
よい（すなわち、変化させなくてもよい）。さらに、「ミスマッチ」残基の位置を考慮に
入れてもよい。すなわち、FR1、FR2、及びFR3中のミスマッチ残基を変化させることが一
般に好ましいが、CDR中のミスマッチは大きく容認されてもよい。また、ミスマッチ残基
（複数可）が溶媒に曝されるかどうかを考慮してもよい。内部にあって、溶媒に曝されな
いミスマッチ残基は、溶媒に曝される残基よりも大きく容認されてもよい。

本明細書に記載の生殖系列化アプローチの他に、折り畳まれた分子の表面で溶媒に曝さ
れるミスマッチ残基のみに交換が考慮される「ベニアリング」によってヒト化を達成する
こともできる。

VL残基1、2^*、3、5、7、8、10、11、12、13^*、14、15、16、17、18、20、22、37^*、39
、40、41、42、43^*、45、46^*,49^*、57、59、60、63、65、66、67、68、69、70、72、74、
76、77、79、80、81、83、85^*、99^*、100、101^*、103、105、及び106は露出しているか、
大部分露出しているか、又は一部埋没しており、ヒト化における成熟を考慮することがで
きる（アステリスクは、2つの異なるVLについての不一致を示す）。VH残基1、3、5、7、8
、10、11、13、14、15、16、17、19、21、23、25、26、28、30、40、41、42、43、44、46
、66^*、68、70、72、73、74、75、76、77^*、79^*、81、82a^*、82b、83、84、85、87、88^*
、89、104^*、105、108、110、112、及び113は露出しているか、大部分露出しているか、
又は一部埋没しており、同様に、ヒト化において突然変異させることができる（Padlanの
文献、Mol Immunol. 31：169-217（1994））。これらのリストを用いて、溶媒に曝される
ラクダ科動物VL及びVH候補残基を突然変異誘発のためにコアリストから選択し、それによ
り、ベニアリングのプロセスへと進むことができる。

以下に説明するように、ヒト化プロセスを反復して実行することもできるし、又はライ
ブラリーアプローチを求めることもできる。例えば、様々な組合せのアミノ酸残基が置換
されている所与の出発ラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインの1セットの「ヒト化
」変異体を調製してもよい。その後、これらの変異体を、標的抗原に対する結合親和性、
及びヒト宿主における潜在的なまたは実際の免疫原性を含む、機能に関するその他のパラ
メータ／指標について試験してもよい。

［出発ラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメイン中で］変化させることが選択された
位置の各々における可能な交換用残基のプールからの特定の交換用ヒト残基の選択は、局
所的な配列状況によって、又はラクダ科動物VHドメイン配列内のヒトT細胞エピトープの
存在を最小化する必要性によって影響を受ける場合がある。

したがって、所与のラクダ科動物VH又はVλもしくはVκドメインのヒト化のための適切
な残基を選択する場合、まず、最も良く一致するヒト生殖系列、すなわち、CDR中の適当
なカノニカルフォールド構造との最も高い配列相同性を調べることができるが、一致しな
いカノニカルフォールド（例えば、長さの異なるCDR）との高い配列相同性を示す生殖系
列も、必ずしも最も良く一致するものではない同じファミリー内の他のヒト生殖系列ファ
ミリーメンバーも調べ、また、異なるファミリーのヒト生殖系列すらも調べることができ
る。

（好ましい置換 - VH）
上に示した基準を考慮して、表4に記載のアミノ酸置換は、ラクダ科動物VHドメインの
ヒト化に好適であることが確認されている。したがって、本発明の対象には、表4に記載
のアミノ酸置換の1つもしくは複数、又は任意の組合せを含むラクダ科動物VHドメインを
含む抗体が含まれるが、これらに限定されない。各々の場合において、左側の列に特定さ
れている位置にあるラクダ科動物VH配列によってコードされるアミノ酸は、右側の列に記
載されている、その位置についての好ましいヒト残基のうちの1つに交換することができ
る。表4は、特定のヒトVHファミリー又はファミリーメンバーにとって、どの変化が最も
重要と考えられるかを示すものでもあるが、これは、限定と解釈されるべきではない。ラ
クダ科動物生殖系列において、（逸脱する残基が高い頻度で出現することから結論される
）ヒト生殖系列から逸脱する残基が表4に記載されており、好ましい変化は、ラクダ科動
物残基を、CDR1及びCDR2についての同一のカノニカルフォールド組合せを有する最良のヒ
ト生殖系列中に存在する残基に変換する変化である。これらの結論は、図36、37、及び38
から得られた。これらの図は、最も良く一致するヒト生殖系列ファミリーメンバーから逸
脱する体細胞突然変異したラマ・グラマVH中の残基、及び全ヒト生殖系列ファミリーに存
在する残基を示している。また、言及した図は、ヒト生殖系列残基が体細胞突然変異した
VH領域にかなり多く見られるものの、頻度が低いことを示しており、そのため、ヒト生殖
系列中に存在する残基への復帰突然変異が実現可能であるはずであるという確信が得られ
る。さらに、図40、41、及び42は、タイプは同じであるが、ラマ・パコスの生殖系列VHに
ついての解析を示している。

特定の実施態様では、本発明は、表4に記載のアミノ酸変化のうちの少なくとも1つを含
むラクダ科動物VHドメインを含むヒト化抗体を包含し、ここで、該ラクダ科動物VHドメイ
ンは、リャマ（ラマ・グラマ）又はアルパカ（ラマ・パコス）に由来する。

本発明によるヒト化抗体は、表4に記載の特定のアミノ酸置換のうちの2つ以上の任意の
組合せを含むラクダ科動物VHドメインも含み得る。この場合も、該ラクダ科動物VHドメイ
ンは、リャマ（ラマ・グラマ）又はアルパカ（ラマ・パコス）に由来し得る。

（特定のヒトVH配列への生殖系列化）
成熟した（機能的抗原結合性）ラクダ科動物VH（及びVL又はVκ）ドメイン配列と、そ
の最も良く整列するヒト生殖系列とのアラインメントに基づいて、所与のラクダ科動物VH
（及びVL又はVκ）ドメインを特定のヒト生殖系列配列へと生殖系列化するときに特に有
用なアミノ酸置換のセットが得られた。このヒト配列は、ヒト化のために選択された特定
のラクダ科動物配列に対して最も良く一致するヒト生殖系列であり得る（しかし、必ずし
もそうではない）。

特定のヒト生殖系列VHサブクラスへとヒト化するための好ましい置換のセットは、次の
通りである（各々の場合において、記載された位置（複数可）にあるラクダ科動物にコー
ドされた天然の残基を、以下に示す特定のアミノ酸と交換することができる）：

Hu VH3-21：H1 E、H13 K、H77 S、H83 R、H84 A
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH3-21配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
またはラマ・パコスに由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH3-48：H1 E、H77 S、H83 R、H84 A
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH3-48配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
またはラマ・パコスに由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH3-23：H1 E、H74 S、H83 R、H84 A
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH3-23配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
またはラマ・パコスに由来する）ヒト化ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH3-66：H1 E、H29 V、H37 V、H40 A、H74 S、H83 R、H84 A、H94 R
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH3-66配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
またはラマ・パコスに由来する）ヒト化ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH3-11：H1 Q、H13 K、H14 P、H37 I、H77 S、H78 L、H83 R、H84 A、H94 R
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH3-11配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
またはラマ・パコスに由来する）ヒト化ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH3-66：H1 E、H29 V、H37 V、H40 A、H74 S、H78 L、H83 R、H84 A、H86 D、H94 R
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH3-66配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
またはラマ・パコスに由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH3-48：H1 E、H77 S、H83 R、H84 A、H86 D
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH3-48配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
またはラマ・パコスに由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH1-46：H1 Q、H11 V、H12 K、H13 K、H69 M、H71 R、H78 V、H80 M
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH1-46配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
に由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH1-46：H1 Q、H7 S、H11 V、H12 K、H69 M、H71 R、H78 V、H80 M、H86 D
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH1-46配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・パコス
に由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH4-30-4：H1Q、H30 S、H48 I、H67 V、H68 T、H71 V、H81 K、H84 A、H85 A
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH4-30-4配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

Hu VH4-30-4：H1 Q、H30 S、H48 I、H67 V、H68 T、H71 V、H81 K、H84 A、H85 A、H86 D
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVH4-30-4配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・パコ
スに由来する）ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供する。

上記の実施態様の各々は、位置108にアミノ酸Lをさらに含んでいてもよい。

（好ましい置換 - Vカッパ（Vκ）及びVラムダ（Vλ））
表5に記載のアミノ酸置換は、ラクダ科動物VLドメインのヒト化に好適であることが確
認されている。したがって、本発明の対象には、表5に記載のアミノ酸置換の1つもしくは
複数、又は任意の組合せを含むラクダ科動物VLドメインを含む抗体が含まれるが、これら
に限定されない。各々の場合において、左側の列に特定されている位置にあるラクダ科動
物VL配列によってコードされるアミノ酸は、表5の右側の列に記載されている、その位置
についての好ましいヒト残基のうちの1つに交換することができる。ラクダ科動物生殖系
列において、（逸脱する残基が高い頻度で出現することから結論される）ヒト生殖系列か
ら逸脱する残基が表5に記載されており、好ましい変化は、ラクダ科動物残基を、CDR1及
びCDR2についての同一のカノニカルフォールド組合せを有する最良のヒト生殖系列中に存
在する残基に変換する変化である。これらの結論は、Vカッパについては図30から、及びV
ラムダについては図31〜35から得られた。これらの図は、最も良く一致するヒト生殖系列
ファミリーメンバーから逸脱する体細胞突然変異したリャマVκ／Vλ中の残基、及び全ヒ
ト生殖系列ファミリーに存在する残基を示している。また、言及した表は、ヒト生殖系列
残基が体細胞突然変異したVカッパ／Vラムダ領域にかなり多く見られるものの、頻度が低
いことを示しており、そのため、ヒト生殖系列中に存在する残基への復帰突然変異が許容
されることを示している。

特定の実施態様では、本発明は、表5に記載のアミノ酸変化のうちの少なくとも1つを含
むラクダ科動物Vκ又はVλドメインを含むヒト化抗体を包含し、ここで、該ラクダ科動物
Vκ又はVλドメインは、リャマ（ラマ・グラマ）又はアルパカ（ラマ・パコス）に由来す
る。

本発明によるヒト化抗体はまた、表5に記載の特定のアミノ酸置換のうちの2つ以上の任
意の組合せを含むラクダ科動物Vκ又はVλドメインを含んでいてもよく、ここでも、該ラ
クダ科動物Vκ又はVλドメインは、リャマ（ラマ・グラマ）又はアルパカ（ラマ・パコス
）に由来する。

（特定のヒトVκ又はVλ配列への生殖系列化）
成熟した（機能的抗原結合性）ラクダ科動物Vκ又はVλドメイン配列と、その最も良く
整列するヒト生殖系列とのアラインメントに基づいて、所与のラクダ科動物VLドメインを
特定のヒト生殖系列配列へと生殖系列化するときに特に有用なアミノ酸置換のセットが得
られた。このヒト配列は、ヒト化のために選択された特定のラクダ科動物配列に対して最
も良く一致するヒト生殖系列であり得る（しかし、必ずしもそうではない）。

特定のヒト生殖系列Vラムダファミリーメンバーへとヒト化するための好ましい置換の
セットは、次の通りである（各々の場合において、記載された位置（複数可）にあるラク
ダ科動物にコードされた天然の残基を、以下に示す特定のアミノ酸と交換することができ
る）：

Vλ1-44：L11 A、L14 T、L18 R、L19 V、L38 Q、L69 T、L74 A、L76 S、L80 S
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ1-44配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。

Vλ2-11：L8 R、L17 Q、L18 S、L39 H、L42 K、L47 M、L58 V、L59 P、L80 A
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ2-11配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。

Vλ2-18：L3 A、L14 S、L15 P、L17 Q、L18 S、L39 H、L47 M、L58 V、L80 A
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ2-18配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。

Vλ3-19：L1 S、L3 E、L7 D、L8 P、L11 V、L14 A、L19 V、L20 R、L60 D、L69 N、L70 T
、L72 S、L76 T、L84 A
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ3-19配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。

Vλ3-25：L1 S、L2 Y、L3 E、 L5 M、L8 P、L9 S、L15 P、L66 S、L69T、L71 V、L78 V
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ3-25配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。

Vλ5-37：L2 P、L11 S、L17 E、L19 A、L 40 P、L70 T、L72 I、L80 S
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ5-37配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。

Vλ8-61：L2 T、L11 F、L60 D、L67 L、L80 A、L81 D、L84 S
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVλ8-61配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vラムダドメインを含む抗体を提供する。

特定のヒト生殖系列Vカッパファミリーメンバーへとヒト化するための好ましい置換の
セットは、次の通りである（各々の場合、記載された位置（複数可）にあるラクダ科動物
にコードされた天然の残基を、以下に示す特定のアミノ酸と交換することができる）：

Vκ1-13：K11 V、K12 K、K13 K、K15 V、K42 K、K43 A、K70 D、K77 S、K79 Q、K80 P、K
83 F
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVκ1-13配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vカッパドメインを含む抗体を提供する。

Vκ2-28：K7 S、K9 L、K12 P、K14 T、K18 P、K36 Y、K46 L、K63 S、K77 R、K79 E、K83
V
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVκ2-28配列に対して整列し、かつ記述された位
置（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラ
マに由来する）ラクダ科動物Vカッパドメインを含む抗体を提供する。

Vκ4-1：K9 D、K11 L、K12 A、K13 V、K15 L、K18 R、K19 A、K39 K、K43 P、K45 K、K58
V、K68 G、K78 L、K80 A、K83 V
特定の実施態様では、本発明は、ヒトVκ4-1配列に対して整列し、かつ記述された位置
（複数可）に上記のアミノ酸の1つ又は複数又は全てを含む、（好ましくはラマ・グラマ
に由来する）ラクダ科動物Vカッパドメインを含む抗体を提供する。

上記の実施態様の各々は、FR4の残基103にアミノ酸置換を含むこともでき、VカッパとV
ラムダの両方について、この位置にKを有することが好ましい。さらに、Vカッパにおける
アミノ酸置換を、FR4の残基100に導入して、この位置にQを有することが好ましいか、又
はFR4の残基104に導入して、Vを有することが好ましい。

本発明の抗体中のラクダ科動物VH及び／又はVλ及び／又はVκドメインは、本明細書で
提供された「コア」VH、Vλ、及びVκリスト上で特定される1つ又は複数のアミノ酸位置
におけるアミノ酸置換の他に、天然のラクダ科動物VH、VL、又はVκドメイン（例えば、
標的抗原によるラクダ科の能動免疫によって得られる通常型ラクダ科動物抗体のVH、Vλ
、又はVκドメイン）と比較して、さらなるアミノ酸配列変化を含むように人為操作する
ことができる。特定の実施態様では、該抗体のVH、Vλ、及びVκドメインは、VHドメイン
とVλ／Vκドメインのどちらか一方又は両方のフレームワーク領域FR1、FR2、FR3、及びF
R4にわたって、最大10個、また場合により、さらに多くのアミノ酸置換を導入するように
（独立に）人為操作されていてもよい。

ヒト化目的で、ラクダ科動物生殖系列JセグメントによってコードされたFR4残基中で行
なわれ得るアミノ酸置換のリストを以下に提供する：

（JセグメントによってコードされたFR4残基中のアミノ酸置換）
さらなる実施態様では、本発明は、ラクダ科動物VHドメインを含む抗体を提供し、ここ
で、Kabatによる、該ラクダ科動物VHドメインの位置H108の、FR4にコードされたアミノ酸
は、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される。

H108の交換用残基は、上で論じたラクダ科動物VHドメインのヒト化の一般原則に従って
選択することができる。特に、交換用「ヒト」残基は、最も近いヒト生殖系列配列との、
もしくはヒトコンセンサス配列とのアラインメントを基にして、又は最も良く整列するヒ
ト生殖系列と同じクラスもしくはサブクラスのヒト生殖系列配列から、もしくは異なるク
ラスもしくはサブクラスのヒト生殖系列からさえも選択することができる。

一実施態様では、H108のアミノ酸は、好ましくはL、又はあまり好ましくないが、Mと交
換される。

Jカッパ又はJラムダのアミノ酸変化を同様の原則に従って選択することができる。

したがって、本発明は、ラクダ科動物Vλ又はVκドメインを含む抗体を提供し、ここで
、Kabatによる、該ラクダ科動物Vλ又はVκドメインのうちの1つ又は複数の位置のアミノ
酸は、ヒトVλ又はVκドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される。

一実施態様では、Vラムダドメインは、ヒトVラムダドメインとの相同性を有し、L103の
アミノ酸は、好ましくはK、又はあまり好ましくないが、E又はQと交換される。

一実施態様では、Vカッパドメインは、ヒトVカッパドメインとの相同性を有し、K103の
アミノ酸は、好ましくはK、又はあまり好ましくないが、Rと交換される。

一実施態様では、Vカッパドメインは、ヒトVカッパドメインとの相同性を有し、K104の
アミノ酸は、好ましくはVと交換される。

一実施態様では、Vカッパドメインは、ヒトVカッパドメインとの相同性を有し、K104の
アミノ酸は、好ましくはLと交換される。

（CDR中のアミノ酸変化）
「ヒト化」をもたらすアミノ酸置換に加えて、出発ラクダ科VH、Vλ、又はVκドメイン
中のミスマッチのあるアミノ酸残基を、ヒトVH、Vλ、又はVκドメインに見られる等価な
残基と交換することにより、ヒト化目的のためにも、該ラクダ科動物由来のVH、Vλ、及
びVκドメインの超可変ループ（CDR）に、特にCDR1及び／又はCDR2に、さらにCDR3にも、
アミノ酸置換を独立に行なうことも可能である。FRとの境界に位置する残基が関心対象と
なるが、それは、これらが、FR及びCDRにコードされた残基からなるT細胞エピトープを決
定し得るからである。

以下の表は、ラクダ科動物由来CDRのヒト化のための可能なアミノ酸置換をまとめたも
のである。

したがって、本発明の範囲は、CDR1及び／又はCDR2及び／又はCDR3中のうちの1つ又は
複数のアミノ酸が、ヒトVHドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換され
るラクダ科動物VHドメインを含む抗体にまで及ぶ。許容されるアミノ酸置換は、表6にま
とめたものを含み、このうちの1つ又は複数が、任意の組合せで存在し得る。

本発明は、CDR1及び／又はCDR2及び／又はCDR3中のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、
ヒトVλ又はVκドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換されるラクダ科
動物Vλ又はVκドメインを含む抗体も包含する。許容されるアミノ酸置換は、表6にまと
めたものを含み、このうちの1つ又は複数が、任意の組合せで存在し得る。

任意の所与の「ヒト化」ラクダ科動物VH、Vλ、又はVκドメインについて、CDR中のア
ミノ酸置換を、フレームワーク領域中のアミノ酸置換とともに、又はフレームワーク領域
中のアミノ酸置換なしで含めることができる。フレームワークアミノ酸置換も存在する場
合、好ましい変化には、表4（VH）並びに表5（Vλ及びVκ）にまとめたもの全てが含まれ
る。

ラクダ科動物VH、Vλ、及びVκドメインのCDR内でヒト化するとき、フレームワーク領
域について上で概説した生殖系列化アプローチの一般原則に従うことができる。したがっ
て、同じファミリーもしくはファミリーメンバーの特定のヒト生殖系列配列（これは、出
発ラクダ科動物VH／Vλ／Vκドメインに対して最も良く整列するヒト生殖系列であっても
よいし、そうでなくてもよい）へと生殖系列化することを選ぶことができるし、又は異な
るファミリーもしくはファミリーメンバーのヒト生殖系列配列へと生殖系列化することを
選ぶことができる。

（ファミリーを越えた生殖系列化）
成熟ラクダ科動物VH（及びVλ／Vκ）配列（並びにそれに由来するコンセンサス配列）
と、該ラクダ科動物VH（Vλ／Vκ）ドメインが最も良く整列するヒトVH（又はVλ／Vκ）
ドメイン配列と同じファミリー（又はファミリーメンバー）ではないヒトVH（及びVλ／V
κ）ドメインのコンセンサス配列とのアラインメントにより、ラクダ科動物VH（又はVλ
／Vκ）ドメインの、異なる生殖系列ファミリー又はファミリーメンバーのヒトVH（又はV
λ／Vκ）ドメイン配列へのヒト化を可能にし得るアミノ酸置換のセットを得ることが可
能になった。これらのアミノ酸置換のセットは、添付の図に記載されている。

図6〜11は、ファミリーVH1、3、及び4のヒト生殖系列配列と最も良く整列するラクダ科
動物VH配列を、ファミリー1、3、4、5、6、及び7のヒト生殖系列又は成熟VH配列へと生殖
系列化する全順列を示す。図12〜26は、Vλファミリー1、3、5、及び8のヒト生殖系列配
列と最も良く整列するラクダ科動物Vλ配列（VLと表記する）を、ヒトVλファミリー1、3
、4、5、6、7、8、9、及び10のヒト生殖系列又は成熟Vλ配列へと生殖系列化する全順列
を示し、図27〜29は、Vκファミリー1、及び4のヒト生殖系列配列と最も良く整列するラ
クダ科動物Vκ配列を、ヒトVκファミリー1、3、4、及び5のヒト生殖系列又は成熟Vκ配
列へと生殖系列化する全順列を示す。

ヒト化を可能にするために交換が考慮され得るアミノ酸位置は、ラクダ科動物VH、Vλ
、又はVκファミリーの出発コンセンサス配列を複数の異なるヒト生殖系列ファミリーの
コンセンサス配列と比較しているそれぞれの表で強調されている。したがって、これらの
表を用いて、どのヒト生殖系列ファミリー又はサブファミリーを生殖系列化するかをまず
選択し、次に、ヒト化プロセスで考慮される適切なアミノ酸置換を選択することができる
。本明細書中の別所で概説されているように、ヒト化を、反復プロセスとして、又は複数
の交換、もしくは交換の組合せを同時に試験することを可能にするライブラリーアプロー
チを用いて実施することができる。

以下の表7には、ヒトVH1ファミリーと最も良く整列するラクダ科動物配列をヒトVH3の
ファミリーメンバーへと生殖系列化することが考慮され得る、図6〜11に示すアラインメ
ントから得られたアミノ酸置換が記載されている。好ましいヒトアミノ酸は、生殖系列化
に使用され得るファミリーに最も良く見られるアミノ酸である。しかしながら、特定の位
置では、特定のファミリーメンバーに存在するアミノ酸が、それぞれのヒト生殖系列ファ
ミリーのコンセンサス配列に見られるアミノ酸から逸脱している場合がある。

上記の交換は全て、ラクダ科動物VH1からヒトVH3への生殖系列化を可能にするのに有用
であり得るが、それは、いずれか1つの特定の成熟ラクダ科動物VH1ドメインをヒトVH3へ
と生殖系列化するときに、これらの交換の全てが行なわれなければならないか、又はこれ
らの交換の全てが実際に行なわれることを必ずしも意味するものではない。それどころか
、熟練した読者であれば、本明細書中の別所で概説されている、生殖系列化アプローチの
一般原則に従って、この表から適切な交換を選択することができるであろう。

以下の実施例には、ヒトVκ1ファミリーと最も良く整列するラクダ科動物配列をヒトV
κ3のファミリーメンバーへと生殖系列化することが考慮され得る、図27〜29から得られ
たアミノ酸置換が記載されている。好ましいヒトアミノ酸は、生殖系列化に使用され得る
ファミリーに最もよく見られるアミノ酸である。しかしながら、特定の位置では、特定の
ファミリーメンバーに存在するアミノ酸が、それぞれのヒト生殖系列ファミリーのコンセ
ンサス配列に見られるアミノ酸から逸脱している場合がある。

以下の実施例には、ヒトVλ8ファミリーと最も良く整列するラクダ科動物配列をヒトV
λ2のファミリーメンバーへと生殖系列化することが考慮され得る、図24〜26から得られ
たアミノ酸置換が記載されている。好ましいヒトアミノ酸は、生殖系列化に使用され得る
ファミリーに最もよく見られるアミノ酸である。しかしながら、特定の位置では、特定の
ファミリーメンバーに存在するアミノ酸が、それぞれのヒト生殖系列ファミリーのコンセ
ンサス配列に見られるアミノ酸から逸脱している場合がある。

VH1をVH3へと、Vκ1をVκ3へと、及びVλ8をVλ2へと生殖系列化するための上記の例は
、ある特定のファミリーの成熟ラクダ科動物VH（又はVL）ドメインの、異なるファミリー
又はサブファミリーのヒト生殖系列への生殖系列化を可能にするために、図6〜29に提示
された配列アラインメント情報をいかに利用することができるかということを示すために
記載されている。この文脈において、「異なるファミリー又はサブファミリー」という用
語は、（ヒト化することを望む成熟ラクダ科動物VH又はVLに対して）最も良く整列するヒ
ト生殖系列が属するファミリー又はサブファミリーではない任意のファミリー又はサブフ
ァミリーを意味する。

本発明はまた、免疫原性のリスクを回避するために、ヒト免疫系で最も支配的に用いら
れている、VH及びVλ／Vκを含む抗体となるよう、ファミリーを越えて生殖系列化する能
力を提供する。VH3ファミリーとファミリーメンバーDP-47（又は3-23）、Vκ3ファミリー
とファミリーメンバーDPK22（又はA27）、及びVλ2ファミリーとファミリーメンバーDPL1
1（もしくは2a2）（又はVλ1ファミリーとファミリーメンバーDPL5、又はVλ3ファミリー
とファミリーメンバーDPL23）が好ましい。US2003190317号においてGenentechにより開示
されている技術、及びMorphosys（Knappikらの文献、J Mol. Biol. 296：57-86（2000）
）を利用することができる。

熟練した読者であれば、図6〜29に提示された配列アラインメント情報によって、ラク
ダ科動物VH、Vラムダ、及びVカッパドメインのファミリー又はサブファミリーを越えた多
数の生殖系列化の可能性が可能になることを理解するであろう。任意の所与の成熟ラクダ
科動物VH又はVLドメインについて、FR1、FR2、FR3、及びFR4の各々を、同じ又は異なるヒ
ト生殖系列へと生殖系列化することができる「ミックス・アンド・マッチ」アプローチが
使用可能であると考えられる場合、可能性の数はまたさらに増大する。図6〜29に提示さ
れた配列アラインメント情報によって可能になる生殖系列化の可能性の全てが本発明の対
象の一部を形成することが意図される。したがって、本発明の範囲は、図6〜29にまとめ
たアミノ酸置換の1つ又は複数を含むラクダ科動物VHドメイン及び／又はラクダ科動物VL
ドメインを含む任意のヒト化ラクダ科動物抗体にまで及ぶ。

（本発明の範囲）
表4に記載のVH置換と類似したアミノ酸置換を含むヒト化VHHドメインは、本発明の範囲
内に包含されないことが好ましい。

一実施態様では、本発明の抗体の全VHドメイン及び／又は全Vλ／Vκドメインは、ラク
ダ科ファミリーの種から得ることができる。その後、ラクダ科VHドメイン及び／又はラク
ダ科Vλ／Vκドメインを、本明細書で特定されている1つ又は複数の特定の位置で、アミ
ノ酸置換をラクダ科配列に導入するタンパク質操作に供する。

特定の実施態様では、ラクダ科超可変ループ（又はCDR）は、所望の標的抗原によるラ
クダ科ファミリーの種の能動免疫によって得ることができる。本明細書で詳細に考察及び
例証されているように、標的抗原によるラクダ科（ネイティブな動物又はラクダ科動物種
の免疫グロブリンレパートリーを発現するように人為操作されたトランスジェニック動物
のいずれか）の免疫後、所望の抗原に対する特異性を有するB細胞産生（通常型ラクダ科
）抗体を同定することができ、そのような抗体のVH及びVλ／Vκドメインをコードするポ
リヌクレオチドを公知の技術を用いて単離することができる。

能動免疫により得られた単離されたラクダ科VH及びVλ／Vκドメインは、本発明による
ヒト化抗体を人為操作するための基礎として用いることができる。無傷のラクダ科VH及び
Vλ／Vκドメインから出発して、本明細書で特定された特定のアミノ酸位置での置換を含
む、出発ラクダ科配列から逸脱するVHドメイン及び／又はVλ／Vκドメインのフレームワ
ーク領域中の1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は欠失を人為操作することが可能で
ある。一次アミノ酸配列におけるそのような変化の目的は、おそらく好ましくない特性（
例えば、ヒト宿主における免疫原性）、生成物の潜在的な不均一性及び／もしくは不安定
性の部位（グリコシル化、脱アミド化、異性体化など）を減少させるか、又は分子のいく
つかの他の好ましい特性（例えば、溶解度、安定性、バイオアベイラビリティなど）を増
強することであり得る。他の実施態様では、一次アミノ酸配列の変化を、能動免疫により
得られたラクダ科VH及び／又はVλ／Vκドメインの1つ又は複数の超可変ループ（又はCDR
）中で人為操作することができる。そのような変化は、抗原結合親和性及び／もしくは特
異性を増強するために、又はおそらく好ましくない特性、例えば、ヒト宿主における免疫
原性（いわゆるヒト化）、生成物の潜在的な不均一性及び／もしくは不安定性の部位、グ
リコシル化、脱アミド化、異性体化などを減少させるために、又は分子のいくつかの他の
好ましい特性、例えば、溶解度、安定性、バイオアベイラビリティなどを増強するために
導入することができる。

標的抗原（又は標的抗原もしくはそれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物）に
よる「能動免疫」の代わりとして、所望の抗原結合特性を有するヒト化抗体の成分として
用いることができるVH及び／又はVλ／Vκドメインの供給源として、罹患したラクダ科動
物における免疫応答又はラクダ科種内で自然に起こる免疫応答を利用することも可能であ
る。そのようなVH／Vλ／Vκドメインは、能動免疫により得られるVH／Vλ／Vκドメイン
と類似した方法でヒト化抗体を人為操作するための出発点として用いることもできる。本
発明はまたさらに、非免疫ライブラリー、及びそれから得られる／それに由来するヒト化
抗体の使用を包含している。

他の実施態様では、本発明は、ラクダ科由来のヒト化VH及びVλ／Vκドメインと、非ラ
クダ科動物抗体由来の1つ又は複数の定常ドメイン、例えば、ヒトにコードされた定常ド
メイン（又は人為操作されたその変異体）とを含む「キメラ」抗体分子を包含する。本発
明は、VH又はVλ／Vκドメインのうちの一方がラクダ科動物にコードされているが、本発
明によってヒト化されたものであり、もう一方の可変ドメインが非ラクダ科動物（例えば
、ヒト、齧歯類、ウサギ目動物、非ヒト霊長類、又は軟骨魚類）由来のものであるキメラ
抗原結合ポリペプチド（例えば、抗体分子）にも及ぶ。そのような実施態様では、VHドメ
インとVλ／Vκドメインは両方とも、ラクダ科動物の同じ種から得られることが好ましく
、例えば、VHとVλ／Vκは両方とも、ラマ・グラマ由来であってもよいし、又はVHとVλ
／Vκは両方とも、ラマ・パコス由来であってもよい（人為操作されたアミノ酸配列変異
の導入前）。そのような実施態様では、VHドメインとVλ／Vκドメインは両方とも、単一
の動物、特に、能動免疫された単一の動物に由来するものであってもよい。

（ヒト化抗体の構造）
非限定的な実施態様では、本発明によるヒト化抗体は、そのアミノ酸配列が完全に又は
実質的にヒトのものであるCH1ドメイン及び／又はCLドメインを含むことができる。本発
明の抗体が、ヒト治療用途を対象とした抗体である場合、該抗体の定常領域全体、又は少
なくともその一部が完全に又は実質的にヒトアミノ酸配列を有することが典型的である。
したがって、本発明の抗体のCH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及
びCLドメイン（並びに存在するならばCH4ドメイン）の1つ又は複数又は任意の組合せは、
そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトのものであることができる。

有利なことに、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、及びCLドメイ
ン（並びに存在するならばCH4ドメイン）は全て、完全に又は実質的にヒトのアミノ酸配
列を有することができる。ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、又は抗体断片の定常領域の文
脈において、「実質的にヒト」という用語は、ヒト定常領域との少なくとも90％、又は少
なくとも95％、又は少なくとも97％、又は少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を意味す
る。この文脈における「ヒトアミノ酸配列」という用語は、生殖系列遺伝子、再編成され
た遺伝子、及び体細胞突然変異した遺伝子を含む、ヒト免疫グロブリン遺伝子によってコ
ードされたアミノ酸配列を意味する。本発明は、ヒト配列に関して1つ又は複数のアミノ
酸付加、欠失、又は置換によって改変されている「ヒト」配列の定常ドメインを含む抗体
も企図している。

本明細書中の別所で論じられているように、1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、又は
欠失が、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域内、特にFc領域内で行なわれることが企図されて
いる。アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸の、異なる天然アミノ酸との、又は非天然も
しくは修飾されたアミノ酸との交換を生じさせることができる。例えば、グリコシル化パ
ターンの変化（例えば、N-又はO-結合型グリコシル化部位の付加又は欠失によるもの）な
どの、他の構造的修飾も許容される。抗体の意図された用途に応じて、Fc受容体へのその
結合特性に関して、本発明の抗体を修飾すること、例えば、エフェクター機能を調節する
ことが望ましい場合がある。例えば、システイン残基（複数可）をFc領域に導入し、それ
により、この領域内での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。こうして
生成されたホモ二量体型抗体は、改善された内在化能、並びに／又は増大した補体媒介性
細胞傷害性及び抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を有する。Caronらの文献、J. Exp. Med.
176：1191-1195（1992）及びShopesの文献、B. J. Immunol. 148：2918-2922（1992）を
参照されたい。或いは、抗体を、2つのFc領域を有し、その結果、増強された補体溶解能
及びADCC能を有し得るように人為操作することができる。Stevensonらの文献、Anti-Canc
er Drug Design, 3：219-230（1989）を参照されたい。本発明は、化学療法剤、毒素（例
えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性のある毒素、もしくはその断片）
、又は放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの、細胞毒性物質に結合し
た、本明細書に記載されたような抗体を含む免疫抱合体も企図している。Fc領域は、半減
期を延長するように人為操作することもできる。

本発明は、ある実施態様では、ラクダ科／ヒトキメラ抗体、及び特にVH及びVλ／Vκド
メインが完全にラクダ科動物配列（例えば、リャマ又はアルパカ）のものであり、かつそ
の抗体の残りの部分が完全にヒト配列のものであるキメラ抗体を包含する。好ましい実施
態様では、本発明は、「ヒト化された」又は「生殖系列化された」ラクダ科抗体、並びに
VH及びVλ／Vκドメインが、能動免疫により得られたラクダ科VH及びVλ／Vκドメインと
比べて、フレームワーク領域内に1つ又は複数のアミノ酸置換を含む、ラクダ科／ヒトキ
メラ抗体も包含する。そのような「ヒト化」は、出発ラクダ科VH又はVλ／Vκドメイン中
のミスマッチのあるアミノ酸残基を、ヒト生殖系列にコードされたVH又はVλ／Vκドメイ
ン中に見られる等価な残基と交換することによって、ヒト生殖系列VH又はVλ／Vκドメイ
ンとの配列同一性％を増大させる。

本発明はまたさらに、ラクダ科動物以外の種（例えば、齧歯類、霊長類、ウサギ目動物
、もしくは軟骨魚類）、又は異なるラクダ科動物種から得ることができる、異種抗体に由
来するCDR（又は超可変ループ）が、ヒト化されたラクダ科動物VH及びVλ／Vκフレーム
ワーク上に移植されており、該抗体の残りの部分も完全にヒト起源のものである、CDR移
植抗体を包含する。

本発明は、VH又はVλ／Vκドメインのどちらか一方が、本明細書で特定される特定の位
置の1つ又は複数におけるアミノ酸置換を含む、ヒト化されたラクダ科動物VH又はVλ／V
κドメインであり、かつ「もう一方の」可変ドメインが、非ラクダ科動物、例えば、ヒト
のアミノ酸配列を有する、抗原結合ポリペプチドも包含する。したがって、ヒト化された
ラクダ科動物VHドメインをヒトVλ／Vκドメインと対合させるか、又はヒトVHドメインを
ヒト化されたラクダ科動物Vλ／Vκドメインと対合させることが企図されている。そのよ
うな対合は、そこから所望の抗原結合特性を有する高親和性のバインダーを選択する、利
用可能な抗原結合レパートリーを増大させることができる。

本発明はまたさらに、VHドメイン及び／又はVλ／Vκドメインの超可変ループ（複数可
）又はCDR（複数可）が、ラクダ科から得られるが、該（ラクダ科動物由来の）超可変ル
ープ又はCDRの少なくとも1つは、ラクダ科動物にコードされた配列と比べて1つ又は複数
のアミノ酸置換、付加、又は欠失を含むように人為操作されている、抗原結合ポリペプチ
ドに及ぶ。そのような変化は、超可変ループ／CDRの「ヒト化」を含む。このように人為
操作されているラクダ科動物由来のHV／CDRは、ラクダ科動物にコードされたHV／CDRのア
ミノ酸配列と「実質的に同一」であるアミノ酸配列を依然として示すことができる。この
文脈において、「実質的同一性」は、ラクダ科動物にコードされたHV／CDRとの、1個以下
、又は2個以下のアミノ酸配列ミスマッチを許容することができる。

本発明による抗体は、任意のアイソタイプであることができる。ヒト治療用途を対象と
する抗体は、典型的には、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM型、多くの場合、IgG型であり、その
場合、抗体は、4つのサブクラスIgG1、IgG2a及びIgG2b、IgG3、又はIgG4のいずれかに属
することができる。これらのサブクラスの各々において、例えば、Fc依存的機能性を増強
もしくは軽減するために、Fc部分内に1つ又は複数のアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失
を生じさせるか、又は他の構造的修飾を生じさせることが許容される。

本発明によるヒト化抗体は、研究と、疾患の診断及び／又は治療の両方における、広範
な用途で有用であり得るが、特にモノクローナル抗体の形態での、ヒト治療剤としての特
定の有用性を見出すであろう。

本発明は、広範な抗原に対するヒト化抗体、及び具体的にはモノクローナル抗体の産生
のためのプラットフォームを提供し、かつその最も広い態様において、本発明は、標的抗
原の厳密な中身に関しても、実際に標的抗原に対する結合の特異性又は親和性に関しても
、限定されることを意図するものではない。しかしながら、特定の非限定的な実施態様で
は、標的抗原は、非ラクダ科動物抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、又はヒト抗原であるこ
とができる。好ましい実施態様では、標的抗原は、治療上特に重要な抗原であることがで
きる。「治療上重要な標的」という用語は、ヒトもしくは動物の疾患の、又はそれぞれの
疾患に関連した作用の、形成、発症、進行、媒介に関与する標的を意味する。この定義に
含まれるのは、標的の発現レベル及び／又は活性が、抗体結合によって調節される標的（
例えば、その活性がアゴニスト又はアンタゴニスト抗体の結合によって調節され得る受容
体）、並びに標的の活性及び／又は発現が、疾患に対する直接的又は間接的な影響を有す
る標的である。

例として、「ヒト抗原」は、受容体、受容体リガンド、細胞シグナル伝達分子、ホルモ
ン、サイトカイン又はサイトカイン受容体、神経伝達物質などとして機能する天然のヒト
ポリペプチド（タンパク質）を含むことができる。「天然の」とは、ポリペプチドがその
発達のいずれかの段階においてヒト体内で発現されることを意味し、疾患の経過中にヒト
の体によって発現されるポリペプチドを含む。

（ポリヌクレオチド、ベクター、及び組換え発現）
本発明はまた、本発明のヒト化抗体をコードするポリヌクレオチド分子、宿主細胞又は
無細胞発現系で該抗体の発現を可能にする調節配列に機能的に連結された本発明のヒト化
抗体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及びこの発現ベクターを含む宿
主細胞又は無細胞発現系を提供する。

本発明のヒト化抗体をコードするポリヌクレオチド分子は、例えば、組換えDNA分子を
含む。

「核酸」、「ポリヌクレオチド」、又は「ポリヌクレオチド分子」という用語は、本明
細書では互換的に用いられ、かつ一本鎖又は二本鎖のいずれかの任意のDNA又はRNA分子、
及び一本鎖の場合、その相補配列の分子を意味する。核酸分子を論じる際、特定の核酸分
子の配列又は構造は、該配列を5'から3'の方向で提供する通常の慣習に従って、本明細書
に記載することができる。本発明のいくつかの実施態様では、核酸又はポリヌクレオチド
は、「単離され」ている。この用語は、核酸分子に適用される場合、それが起源とする生
物の天然のゲノム内でそれがすぐに接している配列から分離されている核酸分子を意味す
る。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドベクターもしくはウイルスベクターなど
のベクターに挿入されたDNA分子、又は原核細胞もしくは真核細胞もしくは非ヒト宿主生
物のゲノムDNAに組み込まれたDNA分子を含むことができる。RNAに適用される場合、「単
離されたポリヌクレオチド」という用語は、上で定義した単離されたDNA分子によってコ
ードされるRNA分子を主に意味する。或いは、この用語は、その自然の状態で（すなわち
、細胞又は組織内で）それが関連している他の核酸から精製／分離されているRNA分子を
意味することができる。単離されたポリヌクレオチド（DNA又はRNAのいずれか）はさらに
、生物学的手段又は合成手段によって直接的に産生され、かつその産生時に存在する他の
成分から分離された分子を表すことができる。

本発明によるヒト化抗体の組換え産生のために、それをコードする組換えポリヌクレオ
チドを（標準的な分子生物学的技術を用いて）調製し、かつ選ばれた宿主細胞、又は無細
胞発現系で発現させるための複製可能なベクターに挿入することができる。好適な宿主細
胞は、原核細胞、酵母細胞、又は高等真核細胞、具体的には哺乳動物細胞であることがで
きる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（C
OS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胎児腎臓株（293細胞又は懸濁培養での増殖のためにサブク
ローニングされた293細胞、Grahamらの文献、J. Gen. Virol. 36：59（1977））；ベビー
ハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（C
HO、Urlaubらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216（1980））；マウスセルト
リ細胞（TM4、Matherの文献、Biol. Reprod. 23：243-251（1980））；マウス骨髄腫細胞
SP2／0-AG14（ATCC CRL 1581；ATCC CRL 8287）、又はNSO（HPAカルチャーコレクション
番号85110503）；サル腎臓細胞（CV1、ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VE
RO-76、ATCC CRL-1587）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK
、ATCC CCL 34）；バッファロー系ラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細
胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2、HB 8065）；マウス乳癌（MMT 060562
、ATCC CCL51）；TRI細胞（Matherらの文献、Annals N. Y. Acad. Sci. 383：44-68（198
2））；MRC 5細胞；FS4細胞；及びヒト肝細胞癌株（Hep G2）、並びにDSMのPERC-6細胞株
である。これらの宿主細胞の各々における使用に好適な発現ベクターもまた、当技術分野
では一般に公知である。

「宿主細胞」という用語は通常、培養された細胞株を意味することに留意すべきである
。本発明による抗原結合ポリペプチドをコードする発現ベクターが導入されているヒト全
体は、本発明の範囲から明確に除外される。

重要な態様では、本発明はまた、組換え抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド（例えば、発現ベクター）を含む宿主細胞（又は無細胞発現系）を、該抗原結合ポ
リペプチドの発現を可能にする条件下で培養し、かつ発現された抗体を回収することを含
む、組換えヒト化抗体を産生する方法を提供する。この組換え発現プロセスは、ヒト治療
用途を対象とするモノクローナル抗体を含む、本発明による抗体の大規模生産に用いるこ
とができる。インビボ治療用途に好適な組換え抗体の大規模製造のための好適なベクター
、細胞株、生産プロセスは、通常、当技術分野で利用可能であり、かつ当業者に周知であ
る。

本発明のさらなる態様は、本発明による抗体を含む、診断キットなどを含む、試験キッ
ト、及びさらに本発明による抗体を含む医薬製剤に関する。

ヒト化抗体が診断用途を意図したものである場合、例えば、該抗体が病状又は疾患感受
性のバイオマーカーとなる抗原に特異的である場合、抗原結合ポリペプチドを試験キット
の構成要素として供給することが好都合であることがある。診断試験は、通常、例えば、
ELISA、ラジオイムノアッセイ、Elispotなどの、標準的なイムノアッセイの形を取る。そ
のような試験キットの構成要素は、本発明の抗原結合ポリペプチドを用いて実施すること
が意図される試験又はアッセイの性質に応じて様々に異なり得るが、通常、本発明の抗原
結合ポリペプチドを用いてイムノアッセイを実施するために必要とされるさらなる試薬を
含む。診断試薬として用いられる、抗体、又はその抗原結合断片は、例えば、蛍光部分、
酵素標識、又は放射性標識などの顕在化標識（revealing label）を有することができる
。

インビボ治療用途を対象とするヒト化抗体は、通常、1つ又は複数の医薬として許容し
得る希釈剤、担体、又は賦形剤と一緒に、医薬剤形へと製剤化される（「レミントン薬科
学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第16版、Osol, A.編、1980）。本発明
による抗体は、通常、それを必要とする哺乳動物対象、通常ヒト患者に、静脈内投与され
るか、又は筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、腫瘍内、経口、腫瘍周辺、皮下、滑液嚢内、髄腔
内、局所、舌下もしくは吸入経路で投与されるべき、滅菌水溶液として製剤化される。疾
患の予防又は治療のために、抗体の適切な投薬量は、治療されるべき疾患の種類、該疾患
の重症度及び臨床経過に加え、患者の年齢、体重、及び既往歴によって決まり、かつ担当
医の判断によって決定される。

（ヒト化抗体の産生のためのプロセス）
本発明によるヒト化抗体の産生のためのプロセスは、まず、所望の抗原結合特性を有す
る通常型ラクダ科動物抗体を単離し、次に、本明細書に記載したように、VHドメイン又は
VLドメインのいずれかにおいて1つ又は複数のアミノ酸置換を人為操作することによって
、該抗体をヒト化に供することを含むことができる。

該プロセスの第一の工程は、標的抗原に対する免疫応答を誘発するためのラクダ科ファ
ミリーの種の能動免疫、それにより、該標的抗原と免疫反応性のあるラクダ科動物の通常
型抗体を生成させること含むことができる。ラクダ科動物の免疫のためのプロトコルは、
付随する実施例に記載されている。免疫に用いられる抗原調製物は、精製された形の標的
抗原、例えば、組換えにより発現されたポリペプチド、又はその免疫原性断片であること
ができる。しかしながら、例えば、該標的抗原を発現もしくはコードする単離された細胞
もしくは組織調製物、細胞ライセート、細胞上清もしくは細胞膜などの画分などのような
抗原の粗調製物で免疫するか、又は該標的抗原をコードするポリヌクレオチドで免疫する
（DNA免疫）ことも可能である。

このプロセスは、通常、ラクダ科種の動物（リャマ及びアルパカを含むが、これらに限
定されない）の免疫を含み、かつ有利なことに、これらの動物は非近交系集団に属する。
しかしながら、ラクダ科動物の通常型Ig遺伝子座、又は少なくともその一部を含むトラン
スジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）を用いることも企図される。

関心が高まっている話題は、インビボ及びインビトロで生成された抗体の相補性決定領
域（CDR）間の差異であるように思われる。インビボ選択が、得られる抗体の免疫原性、
機能性、安定性、及びその結果として改善された製造可能性に対して望ましい影響を有す
る一方、インビトロで生成されかつ選択された合成CDRは、この観点から言えば、不利で
あり得ると推測される。所与の治療抗体は、患者からのいわゆる抗イディオタイプ抗体応
答によって中和されるリスクがあるので、このことは重要である（Lonbergの文献、Natur
e Biotechnology, 23：1117-1125（2005））。

ラクダ科動物の能動免疫に基づくプロセスの重要な利点は、個々の動物が異なる遺伝的
背景を有する巨大な非近交系集団にラクダ科の全ての種を保つことができるという事実に
端を発する。したがって、能動免疫を用いて、潜在的な抗原結合分子の多様なプールを得
ることができる関心対象の抗原に対する強力かつ多様な免疫応答を誘発することが可能で
ある。付随する実施例で例証されているように、ラクダ科動物の能動免疫によって、高度
の免疫多様性を有する標的抗原に結合するFab断片を生成させることができることが認め
られている。理論によって束縛されることを望むものではないが、ヒトとラクダ科動物の
間の系統学的距離は、所与の標的抗原に対する多様な免疫応答の生成に重要であり得ると
推測される。対照的に、非ヒト霊長類は、系統学的にヒトに近く、したがって、非ヒト霊
長類とヒトの間で高い相同性を有する標的は、非ヒト霊長類において強度及び多様性の点
で限定された免疫応答しか誘発することができない。

ヒトから系統学的に離れている非近交系集団で能動免疫を用いることができることは、
仮に、そのように産生された抗体が、治療的潜在能力を有する候補抗体を作製するために
大幅な「タンパク質操作」を必要とするようなヒト抗体との低い配列相同性及び構造相同
性を示すのであれば、特に有利なことではないであろう。したがって、ラクダ科生殖系列
（及び体細胞突然変異配列）が、ヒトVH及びVLドメインとの非常に高度の配列相同性及び
構造相同性を有するVHドメインとVLドメインの両方をコードすることが示されたことは極
めて重要である。巨大な非近交系集団の利用可能性と組み合わせた、この高度の相同性に
より、ヒト治療薬として使用されるモノクローナル抗体の開発のための非常に強力なプラ
ットフォームが得られる。

標的抗原による能動免疫後、末梢血リンパ球、又はリンパ節もしくは脾臓生検標本など
の生検標本を、免疫動物から単離し、該標的抗原に対する通常型ラクダ科動物抗体の産生
についてスクリーニングすることができる。本実施例で例示するように、パニング又はFA
CS選別を用いた濃縮などの技術をこの段階で用いて、スクリーニングされるべきB細胞レ
パートリーの複雑度を低下させることができる。次に、抗原特異的B細胞を選択して、ト
ータルRNA抽出及びその後のcDNA合成に用いる。（標的抗原に特異的な）ネイティブなラ
クダ科動物VH及びVLドメインをコードする核酸をPCRで単離することができる。

関心対象の標的と免疫反応性があるラクダ科動物の通常型抗体を同定するために能動免
疫を用いることは必須ではない。ラクダ科動物自身の免疫応答、この動物か、又は例えば
、罹患した動物もしくは例えば、通常の感染経路で特定の病原体に自然に曝されている動
物かのいずれかに天然に存在する免疫多様性を利用することも可能である場合がある。こ
れに関して、非免疫ラクダ科動物ライブラリーを利用することができる。ラクダ科動物に
おける「自然」免疫応答が関心対象の標的抗原に結合する抗体を既に生じていれば、その
ような抗体を産生するB細胞を培養及び単離するために、又はそのような抗体のモノクロ
ーナル培養物を産生するために、並びに／又はそのような抗体のVH及び／もしくはVLドメ
インをコードするラクダ科動物遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を決定するために、
本明細書に記載の遺伝子操作技術、及び当技術分野で公知の他の標準的技術を利用するこ
とが可能である。この配列情報を持っていれば、ラクダ科動物由来のVH及び／もしくはVL
、又はそれらの超可変ループ（もしくはCDR）を具現化する抗体をコードする組換えDNAコ
ンストラクトを人為操作することが可能である。

（能動免疫によって得られたものであれ、他の手段によって得られたものであれ）ラク
ダ科動物VH及びVLドメインをコードする核酸は、本発明による抗原結合ポリペプチドを産
生するための発現ベクターに直接クローニングすることができる。特に、これらの配列は
、キメラ抗体を産生するために、ヒト抗体定常領域、又はその一部もコードする発現ベク
ターにクローニングすることができる。しかしながら、ヒト定常領域配列のクローニング
及び発現の前に、単離されたラクダ科動物VH及びVL配列に対してさらなる操作を行なうこ
とが典型的である。

第一の工程として、候補ラクダ科動物VH及びVL配列（能動免疫後に単離された配列を含
む）を用いて、ラクダ科動物ライブラリー（例えば、付随する実施例に記載されているよ
うな、Fabライブラリー）を調製することができる。次に、このライブラリーを（例えば
、ファージディスプレイを用いて）標的抗原への結合についてスクリーニングすることが
できる。有望なリード候補は、例えば、Biacore又は好適なバイオアッセイを用いて、標
的抗原結合についてさらに試験することができる。最後に、最も有望なリードのVH及びVL
ドメインをコードする配列を、ヒト抗体定常領域をコードする配列とのインフレーム融合
体としてクローニングすることができる。

VH／VLドメイン中のラクダ科動物由来配列、又はそのヒト化変異体をコードするために
用いられるポリヌクレオチド配列の変化をコドン最適化の目的で導入し、かつコードされ
るアミノ酸配列を改変しない、クローニング及び／又は発現に関連するポリヌクレオチド
配列の他の変化をもたらすことが可能である。

特定のプロセスでは、関心対象の抗原に結合することが知られている特定の可変ドメイ
ンを、反対のタイプの可変ドメインのセットの各々と対合させる（すなわち、VHをVLライ
ブラリーと対合させる、またはその逆を行なう）「鎖シャッフリング」を行なって、ライ
ブラリーを作製し、得られる「雑多な」VH／VLの組合せを抗原結合の親和性及び／又は特
異性について試験することができる。或いは、VHドメインのライブラリーを、無作為か又
は階層的な様式かのいずれかで、VLドメインのライブラリーと対合させ、得られた組合せ
を試験することができる（Clacksonらの文献、Nature, Vol. 352. pp624-638, 1991を参
照されたい）。このプロセスでは、これらのライブラリーは、関心対象の抗原に対する免
疫を提示するラクダ科動物（能動免疫動物を含む）由来の再編成されたVH及びVL（Vκ又
はVλ）のライブラリーであることができる。この鎖シャッフリングプロセスは、免疫多
様性を増大させ、かつ顕著に増強された親和性を有する対合物を生じさせることができる
。

有用な抗原結合特性を有するラクダ科動物VH／VLドメイン対合物は、関心対象の抗原に
結合する非ラクダ科動物（好ましくはヒト）にコードされたVH／VLドメイン組合せから始
める、逆「鎖シャッフリング」プロセスを用いて単離することもできる。これは、例えば
、バリデーション済みの疾患標的に対する完全ヒト治療抗体であることができる。このVH
／VL組合せから出発して、VHドメインをラクダ科動物にコードされたVLドメインのライブ
ラリーと「シャッフル」し（またはその逆を行ない）、対合物を抗原結合について試験す
る第一ラウンドの選択を実施することが可能である。次に、選択された非ラクダ科動物（
例えば、ヒト）VH／ラクダ科動物VL対合物は、ラクダ科動物にコードされたVLをラクダ科
動物にコードされたVHのライブラリーに対してシャッフルし、得られた対合物を抗原結合
について試験する第二ラウンドの選択に供される。結果として、出発VH／VL組合せのエピ
トープ跡（epitope imprint）を有するラクダ科動物VH／ラクダ科動物VLの組合せを生じ
させることが可能となり得る。このラクダ科動物VH／VL組合せを、本明細書に記載のプロ
セスのいずれかを用いて、さらに人為操作／修飾し、必要に応じて、ヒトにコードされた
定常ドメインと組み合わせることができる。

その後、ラクダ科動物由来VHドメイン及び／又はラクダ科動物VLドメインをコードする
クローニングされたポリヌクレオチド配列を人為操作して、本明細書に開示された特定の
アミノ酸位置の1つ又は複数にアミノ酸置換を導入する。好ましい置換としては、本明細
書に開示されたJセグメント置換のいずれか及び／又は本明細書に開示されたCDR置換のい
ずれかと任意に組み合わせた、VHについて表4に記載された置換、及びVLについて表5に記
載された置換が挙げられるが、これらに限定されない。

ヒト化の全般的目的は、ヒト対象に導入したときに、VH及びVLドメインが最小限の免疫
原性を示す一方で、ラクダ科によってコードされたもとのVH及びVLドメイン（例えば、能
動免疫によって得られたラクダ科動物VH／VL）により形成された抗原結合部位の特異性及
び親和性を保持する分子を産生することである。ヒト化プロトコルは、ラクダ科動物から
ヒトへのアミノ酸変化を順次導入し、親和性の顕著な低下（例えば、5〜10倍）が認めら
れるまで各段階で試験する反復プロセスとして実施することができる。複数のアミノ酸変
化を同時に試験するために、「ライブラリー」アプローチを用いることも可能である。

（ライブラリー構築方法）
ラクダ科動物の通常型抗体のVH及び／又はVLドメインをコードする発現ベクターのライ
ブラリーを作製する方法は、以下の工程を含むことができる：
a）ラクダ科動物の通常型抗体のVH及び／又はVLドメインをコードする核酸分子の領域
を増幅して、各遺伝子セグメントがラクダ科動物の通常型抗体のVHドメインをコードする
ヌクレオチド配列又はVLドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、増幅された遺伝
子セグメントを得る工程、並びに
b）各発現ベクターが、VHドメインをコードする遺伝子セグメント及び／又はVLドメイ
ンをコードする遺伝子セグメントを少なくとも含むように、工程a）で得られた遺伝子セ
グメントを発現ベクターにクローニングし、それにより、発現ベクターのライブラリーを
得る工程。

工程a）で増幅された核酸は、ラクダ科動物のリンパ系組織から調製されたcDNA又はゲ
ノムDNAを含むことができ、該リンパ系組織は、1つ又は複数のB細胞、リンパ節、脾臓細
胞、骨髄細胞、又はそれらの組合せを含む。循環B細胞が特に好ましい。驚くべきことに
、末梢血リンパ球（PBL）を、通常型ラクダ科動物抗体のVH及びVLドメインをコードする
核酸の供給源として用いることができる、すなわち、直接増幅を可能にするほど十分な量
の（抗体を発現する）形質細胞がPBL試料中に存在することが分かった。これは、動物（
ラクダ科動物）から採取された全血試料からPBLを調製することができるので有利である
。これは、侵襲的手順を用いて（例えば、脾臓又はリンパ節から）組織生検標本を得る必
要を避け、試料採取手順を必要なだけ何度も繰り返し、動物に対する影響を最小限に抑え
ることを意味する。例えば、ラクダ科動物を能動免疫し、該動物から第一の血液試料を採
取して、PBLを調製し、次に、同じ動物に「追加免疫」用量の同じ抗原か、又は異なる抗
原かいずれかを用いて2回目の免疫を行ない、その後、第二の血液試料を採取し、PBLを調
製することが可能である。

リンパ系組織（例えば、循環B細胞）は、能動免疫したラクダ科動物から得ることがで
きる。非免疫ライブラリー及び罹患したラクダ科動物のリンパ系組織に由来するライブラ
リーを調製することも企図される。

好都合なことに、トータルRNA（又はmRNA）をリンパ系組織試料（例えば、末梢血細胞
又は組織生検標本）から調製し、標準的な技術によってcDNAに変換することができる。出
発材料としてゲノムDNAを用いることも可能である。

多様なライブラリーアプローチか、又は該ライブラリーの構築のためのB細胞選択アプ
ローチかのいずれかを用いることができる。多様なライブラリーアプローチでは、VH及び
VLをコードする遺伝子セグメントのレパートリーを、いかなる事前のB細胞選択もなくリ
ンパ系組織から調製された核酸から増幅することができる。B細胞選択アプローチでは、
所望の抗原結合特性を有する抗体を提示しているB細胞を選択した後、核酸を抽出し、か
つVH及びVLをコードする遺伝子セグメントを増幅することができる。

様々な従来法を用いて、所望の抗原結合特性を有する抗体を発現するラクダ科動物のB
細胞を選択することができる。例えば、B細胞を、通常型IgGの細胞表面提示について、蛍
光標識したモノクローナル抗体（リャマ又は他のラクダ科動物由来の通常型抗体を特異的
に認識する、mAb）と、別の蛍光色素で標識した標的抗原とで染色することができる。次
に、個々の二重陽性B細胞をFACSで単離し、トータルRNA（又はゲノムDNA）を個々の細胞
から抽出することができる。或いは、細胞をインビトロ増殖に供することができ、分泌さ
れたIgGを含む培養上清をスクリーニングして、トータルRNA（又はゲノムDNA）を陽性細
胞から抽出することができる。またさらなるアプローチでは、個々のB細胞を特定の遺伝
子で形質転換させるか、又は腫瘍細胞株と融合させて、「自由自在に」増殖することがで
きる細胞株を作製し、その後、これらの細胞からトータルRNA（又はゲノムDNA）を調製す
ることができる。

FACSによる選別の代わりに、通常型IgGを発現する標的特異的B細胞を（ラクダ科動物の
通常型抗体に対する）固定化したモノクローナル抗体上で、その後、固定化した標的抗原
上で「パニングする」ことができる。RNA（又はゲノムDNA）を抗原特異的B細胞のプール
から抽出することができるか、又はこれらのプールを形質転換し、個々の細胞を限定希釈
又はFACSによって徹底的にクローニングすることができる。

B細胞選択法は、陽性選択又は陰性選択を含むことができる。

いかなるB細胞選択も伴わない多様なライブラリーアプローチを用いるのであれ、B細胞
選択アプローチを用いるのであれ、リンパ系組織から調製された核酸（cDNA又はゲノムDN
A）は、個々のVHドメイン又はVLドメインをコードする遺伝子セグメントを増幅するため
に増幅工程に供される。

リンパ系組織（例えば、末梢B細胞又は組織生検標本）から抽出されたトータルRNAを、
ランダムプライムcDNAに変換することができるか、又はオリゴdTプライマーをcDNA合成に
用いることができるか、或いはIg特異的オリゴヌクレオチドプライマーをcDNA合成に適用
することができるか、又はmRNA（すなわち、ポリA RNA）を、オリゴdTセルロースを用い
てトータルRNAから精製した後にcDNAを合成することができる。B細胞から単離されたゲノ
ムDNAは、PCRに用いることができる。

少なくともVH又はVLをコードする重鎖並びに軽鎖（カッパ及びラムダ）遺伝子セグメン
トのPCR増幅は、CH1又はCカッパ／Cラムダ領域の3'末端にアニールするプライマーと組み
合わせて、可変領域の5'末端にアニールするFR1プライマーを用いて実施することができ
、これらの定常領域プライマーに関して、各々のタイプに1つのプライマーしか必要ない
という利点がある。このアプローチによって、ラクダ科動物Fabをクローニングすること
が可能になる。或いは、可変領域の3'末端にアニールするFR4プライマーのセットを（ベ
クターにコードされた定常領域に融合された）Fabとして、又はscFv（重鎖可変領域と軽
鎖可変領域が柔軟なリンカー配列を介して連結されている、単鎖Fv）として、クローニン
グするために再度用いることができるか；或いは、可変領域を、哺乳動物細胞表面に提示
される完全長IgG分子の産生を可能にする発現ベクターにクローニングすることができる
。

一般に、増幅は、2工程で行なわれる；第一の工程では、（多様性を維持するために）
大量のcDNAを用いてタグなしプライマーで、及び第二の工程では、アンプリコンをタグ付
きプライマーで数サイクルだけ再増幅する。このタグ付きプライマーは、クローニングの
ために制限部位が5'に導入されている延長されたプライマーである。余分なプライマーを
除去するために、第一の増幅工程（タグなしプライマー）で産生されたアンプリコンを、
第二の増幅工程の前に、ゲル精製することができる。或いは、プロモーター配列を導入す
ることができ、これにより、リボソーム提示されるRNAへの転写が可能になる。制限部位
の代わりに、適当なベクターへの部位特異的挿入を可能にする、Cre-Lox部位又はTOPO部
位のような、組換え部位を導入することができる。

その後、ラクダ科動物の通常型VH及びVLドメインをコードする増幅された遺伝子セグメ
ントを、機能的抗原結合ポリペプチドとしてVH／VL組合せの発現に好適なベクターにクロ
ーニングすることができる。例として、B細胞（又はいかなるB細胞選択にも供されていな
い他のリンパ系組織）のプール由来の増幅されたVHCH1／VκCκ／VλCλ遺伝子セグメン
トをまず、個々のライブラリー（一次ライブラリー）として個別にクローニングすること
ができ、次に、第二の工程では、軽鎖断片を切り出し、これらを重鎖断片をコードするベ
クターに連結することによって、Fab又はscFVライブラリーを構築することができる。（
制限酵素による消化が最適でないために）PCR産物のクローニングは比較的非効率的であ
るので、この2工程手順は、大きいライブラリーの作製を後押しする。scFvをコードするD
NA断片は、アンプリコン内の配列のわずかな重複に基づくスプライシング・バイ・オーバ
ーラップ・エクステンション（splicing-by-overlap extension）PCR（SOE）によって生
成させることができ；PCRにおいて、VH及びVLコードするアンプリコンを、リンカーをコ
ードする小さいDNA断片と混合することにより、重複する配列が原因となって単一のDNA断
片が形成される。

VH及びVLをコードする遺伝子セグメントを含むアンプリコンをファージベクター又はフ
ァージミドベクターにクローニングし、ファージディスプレイをベースにした選択方法を
用いることによって、標的特異的抗体断片の選択を可能にすることができる。或いは、ア
ンプリコンを、酵母細胞（Fab、scFv、もしくは完全長IgGとして）又は哺乳動物細胞（Ig
Gとして）上での提示を可能にする発現ベクターにクローニングすることができる。

他の実施態様では、T7（又は他の）プロモーター配列及びリボソーム結合部位が増幅用
プライマーに含められているリボソームディスプレイ用のアンプリコンを用いることによ
り、クローニングを回避することができる。標的抗原への結合についての選択後に、プー
ルをクローニングし、個々のクローンを解析する。理論上、このアプローチを用いると、
ファージディスプレイライブラリーアプローチとは対照的に、より大きい免疫レパートリ
ーを試料採取することができるが、それは、ファージを用いるライブラリーのクローニン
グ及び選択が、10¹⁰〜10¹²クローンに制限されるからである。

B細胞選別を適用する場合、個々の標的特異的B細胞のVH又はVLをコードする遺伝子セグ
メントを含むアンプリコンを、抗体断片（scFVもしくはFab）、又はさらには完全長IgGの
産生のための細菌又は哺乳動物発現ベクターに直接クローニングすることができる。

（標的抗原と免疫反応性のあるクローンのスクリーニング及び選択）
スクリーニング／選択は、通常、ライブラリー中のクローンによってコードされる発現
産物（すなわち、抗原結合ポリペプチドの形態のVH／VL対合物、例えば、Fab、scFV、又
は抗体）を標的抗原と接触させ、かつ所望の抗原結合特性を示すVH／VL対合物をコードす
る1つ又は複数のクローンを選択することを含む。

ファージディスプレイライブラリーを、固定化した標的抗原に基づいて、又は可溶性の
（多くの場合、ビオチン化されている）標的抗原に基づいて選択することができる。Fab
フォーマットは、その単量体の外観及びファージ上でのその一価ディスプレイのために親
和性による選択を可能にするが、これは、scFv（凝集及びファージ上での多価ディスプレ
イの結果として）並びにIgG（二価フォーマット）については不可能である。標的特異的
バインダーの十分な濃縮を得るためには、2〜3ラウンドの選択が通常必要とされる。

その後の選択ラウンドで標的抗原の量を減少させることによって親和性による選択を行
なうことができるのに対し、ビオチン化されていない標的による長時間の洗浄によって、
極めて良好な親和性を有するバインダーの同定が可能になる。

この選択手順が、使用者に特定のエピトープに的を絞らせるのに対し；固定化した標的
からファージクローンを溶出する古典的な方法は、抗体断片及び／又は標的を変性させる
pHショックに基づくものであり、標的抗原又は可溶性受容体又はサイトカインに対する参
照mAbとの競合によって、該標的の関連エピトープに結合する抗体断片を提示するファー
ジの溶出がもたらされる（当然ながら、これは、B細胞選択法を含む、他のディスプレイ
系にも同様に適用可能である）。

選択のアウトプットから得られた個々のクローンを、細胞、又は細胞から断片が「漏出
する」培養上清から調製されたペリプラズム画分を用いて、抗原結合ポリペプチド（例え
ば、抗体断片）の小規模生産に用いることができる。発現は、誘導性プロモーター（例え
ば、lacプロモーター）によって促進することができ、誘導物質（IPTG）の添加によって
該断片の産生が開始されることを意味する。リーダー配列は、該断片のペリプラズムへの
輸送を確実なものにする。ペリプラズムでは、該断片が適切にフォールディングされ、分
子内ジスルフィド架橋が形成される。

得られた粗タンパク質画分を、ELISAなどの標的結合アッセイで用いることができる。
結合試験のために、個々のクローンから調製されたファージを用いて、概して非常に低い
結合シグナルを生む、Fabの低い発現収量を避けることができる。これらのタンパク質画
分は、拮抗抗体を同定するためのインビトロ受容体-リガンド結合アッセイを用いてスク
リーニングすることもでき；ELISAベースの受容体-リガンド結合アッセイを用いることが
でき、また、Alphascreenのようなハイスループットアッセイも可能である。スクリーニ
ングは、受容体を過剰発現する細胞株の膜画分が固定化されている、放射性標識リガンド
結合アッセイで実施することができ；後者のアッセイは、ピコモル量の放射性サイトカイ
ンしか必要ないので極めて感度が良く、これは、粗タンパク質画分中に存在する微量の拮
抗性Fabによって、正の読み出しが得られることを意味する。或いは、蛍光標識したサイ
トカインの、細胞表面に発現したその受容体への結合を阻害する抗体についてスクリーニ
ングするためにFACSを適用することができる一方、FMATは、このハイスループット型の変
形である。

ペリプラズム画分中に存在するFab、又はそのヘキサヒスチジンタグでIMACによっても
しくは（FabのCH1ドメインに結合することが知られている）プロテインGによって部分的
に精製されたFabを、細菌夾雑物に対して感度が高くない、細胞を用いるバイオアッセイ
で直接用いることができ；或いは、個々の大腸菌（E. coli）細胞由来のFabを、Fab又はI
gGの発現用の哺乳動物系で再クローニングし、その後、バイオアッセイでスクリーニング
することができる。

陽性発現ベクタークローン、すなわち、所望の標的抗原に結合する機能性VH／VL組合せ
をコードするクローンの同定後、可変領域のヌクレオチド配列を決定し、それによって、
コードされたVH及びVLドメインのアミノ酸配列を推定することは日常的な手順である。

望ましい場合、Fab（又はscFV）コード領域を、別の発現プラットフォーム、例えば、
細菌発現ベクター（ファージミドベクターと同一であるが、ファージ上でのディスプレイ
に必要なgene3を含まない）に再クローニングすることができ、これにより、より大量の
コード断片を産生及び精製することが可能になる。

標的結合の親和性を、表面プラズモン共鳴（例えば、Biacore）によるか、又は他の方
法を介して、精製Fab（又はscFV）について決定することができ、その中和効力を、イン
ビトロ受容体-リガンド結合アッセイ及び細胞ベースのアッセイを用いて試験することが
できる。

抗原結合性で、かつ特に拮抗性のFab（又はscFV）のファミリーは、（主にVH、特に、V
HドメインのCDR3の長さ及びアミノ酸配列の）配列解析を基にして同定することができる
。

（効力最適化）
望ましい場合、所望の標的抗原に対する親和性を有するVH／VL組合せをコードことがス
クリーニング／選択によって同定されたクローンを、親和性及び／又は中和効力を最適化
する下流の工程に供することができる。

各VHファミリーの優良（best performing）メンバーの効力最適化を、軽鎖シャッフリ
ング、重鎖シャッフリング、又はそれらの組合せによって達成し、それにより、動物に天
然に生じる親和性変異体を選択することができる。これは、もとのラクダ科動物VH／VLド
メインが、能動免疫したラクダ科動物から選択された実施態様では特に有利であるが、そ
れは、同じ免疫動物から調製されたもとのライブラリーを用いて、鎖シャッフリングを行
ない、それにより同じ免疫動物で生じる親和性変異体をスクリーニングすることが可能で
あるからである。

軽鎖シャッフリングのために、望ましい抗原結合特性を有するVH／VL対合物（例えば、
拮抗性Fab）のVH領域（又はVHCH1）をコードする遺伝子セグメントを用いて、ライブラリ
ーを構築することができる。このライブラリーでは、この単一のVHをコードする遺伝子セ
グメントは、クローンがそもそも選択されたライブラリーの軽鎖レパートリーと組み合わ
されている。例えば、VHをコードするセグメントが、標的抗原に対する免疫応答を誘発す
るために能動免疫されたラクダ科動物から調製されたライブラリー（例えば、Fabライブ
ラリー）から選択されたものであるならば、このVHをコードするセグメントを同じ免疫ラ
クダ科動物の軽鎖（VL）レパートリーと組み合わせることによって、「鎖シャッフリング
」ライブラリーを構築することができる。その後、得られたライブラリーを標的抗原の選
択に供することができるが、最良の親和性変異体の単離を確実なものとするために、スト
リンジェントな条件（低い標的濃度、ビオチン化されていない標的による溶液中での徹底
的な洗浄）下で行なわれる。ペリプラズム画分のオフレート（off-rate）スクリーニング
も、改善されたクローンの同定を助けることができる。配列解析及び細菌性産生ベクター
への再クローニング後、精製され、選択されたFabを、親和性（例えば、表面プラズモン
共鳴による）及び効力（例えば、バイオアッセイによる）について試験することができる
。

重鎖シャッフリングは、軽鎖シャッフリング後に選択されたクローンの軽鎖（VL）をコ
ードする遺伝子セグメントを（VH／VLをコードするもとのクローンが選択された）同じ動
物由来のもとの重鎖ライブラリーにクローニングし直すことによって行なうことができる
。或いは、CDR3特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、拮抗性Fabの軽鎖と組み合わせ
たレパートリーとしてクローニングし得るVH領域のファミリーの増幅に用いることができ
る。その後、親和性による選択及びオフレートスクリーニングによって、そのファミリー
内の優良VHの同定が可能になる。

実際には、軽鎖シャッフリング工程と重鎖シャッフリング工程を、どちらかの順番で行
なうことができる、すなわち、まず軽鎖シャッフリングを行なって、次に重鎖シャッフリ
ングを行なうことができるか、又はまず重鎖シャッフリングを行なって、次に軽鎖シャッ
フリングを行なうことができることが理解されるであろう。両方の可能性が本発明の範囲
内に包含される。

改善された親和性及び効力を有するVH／VL対合物（例えば、Fab）の軽鎖又は重鎖から
、特に、CDRの配列を用いて、個々のFabの突然変異が組み合わされている人為操作された
変異体を作製することができる。突然変異は、多くの場合、相加的なものであり得ること
が知られており、これは、これらの突然変異を組み合わせることによって、さらにより増
大した親和性がもたらされることを意味する。

（ヒト治療用途のための生殖系列化及びフォーマット化）
望ましい抗原結合特性を示すVH／VL対合物をコードする選択された発現クローン（例え
ば、scFV又はFabをコードするファージクローン）のVH及びVLをコードする遺伝子セグメ
ントを下流のプロセッシング工程に供し、ヒト治療用途に好適な抗原結合ポリペプチドフ
ォーマット（例えば、完全ヒト定常ドメインを有する完全長抗体）をコードするベクター
などの、別の発現プラットフォームに再クローニングすることができる。

有望な「リード」の選択されたクローンは、VHドメイン及び／又はVLドメインをコード
するヌクレオチド配列中に、1つ又は複数の変化を導入するように人為操作することがで
き、この変化は、VHドメイン及び／又はVLドメインのコードされたアミノ酸配列を改変し
てもよいし、改変しなくてもよい。VH又はVLドメインの配列のそのような変化は、本明細
書で同定された特定のVH及びVLアミノ酸残基の置換を含む。特に、ラクダ科動物VHドメイ
ンを人為操作して、表4に記載の特定のアミノ酸置換の1つ又は複数を導入することができ
る一方、ラクダ科動物VLドメインを操作して、表5に記載の特定のアミノ酸置換の1つ又は
複数を導入することができる。

ヒトVH3ファミリーのメンバーと相同なアミノ酸配列を有するVHドメインの生殖系列化
は、公知のラマ・グラマ、ラマ・パコス、又はカメルス・ドロメダリウス由来の生殖系列
配列中で既に逸脱している、いくつかの残基の交換／置換を伴うことが多い。ラマ・グラ
マ、ラマ・パコス、又はカメルス・ドロメダリウス、特に、ラマ・グラマのVH3ドメイン
の生殖系列化／ヒト化のための許容されるアミノ酸置換は、フレームワーク領域内の位置
74、83、及び84（kabat付番を使用）のいずれか1つ又はいずれかの組合せにおけるアミノ
酸交換を含むが、これらに限定されない。そのような交換（複数可）は、これらの位置に
あるラクダ科動物にコードされた残基（複数可）と異なるアミノ酸との置換を伴い、この
異なるアミノ酸は、天然又は非天然のアミノ酸であることができ、かつヒトにコードされ
たVH3ドメイン中の対応する位置に生じることが知られているアミノ酸であることが好ま
しい。例えば、位置74のアラニンがセリンと交換されてもよく、又はアラニンがこの位置
で保持されてもよく、位置83のリジンがアルギニンと交換され、また、位置84のプロリン
がアラニンと交換されてもよい。したがって、本発明の抗原結合ポリペプチドの特定の非
限定的な実施態様は、ヒトVH3ドメインとの配列相同性を示すラクダ科動物（及びより具
体的には、リャマ、アルパカ、又はヒトコブラクダ）のVHドメインを含む変異体を含み、
このVHドメインは、位置74、83、及び84（kabat付番を使用）のうちの1つ又は複数又は全
てにおける（ラクダ科動物にコードされた配列に対する）アミノ酸置換を含む。特に、以
下の置換の1つ又は複数又は任意の組合せを有する変異体が許容される：位置74でSに変化
したA、位置83でRに変化したK、又は位置84でAに変化したP。

ひとたび（必要に応じて、効力最適化の後に）リードVH及びVLドメインのアミノ酸配列
が分かれば、ヒト生殖系列から逸脱している残基が、好ましいヒト残基（最も良く一致す
るヒト生殖系列由来のもの、又は他のヒト生殖系列に生じる残基、もしくはさらにはラク
ダ科動物野生型残基を有するもの）と交換されているVH及びVLの合成遺伝子を設計するこ
とができる。この段階で、可変ドメインをコードする遺伝子セグメントを、遺伝子合成時
に、又は好適なディスプレイベクターへのクローニングによって、発現ベクターに再クロ
ーニングすることができる。この発現ベクターの中で、該遺伝子セグメントはFabのヒト
定常領域に融合される。

得られたVH及びVL合成遺伝子を組み換えてFabライブラリーにすることができるか、又
は生殖系列化されたVHを野生型VLと組み換えることができる（逆もまた同様であり、「ハ
イブリッド」ライブラリーと呼ばれる）。親和性による選択によって、優良な生殖系列化
バージョンの単離が可能になり、「ハイブリッド」ライブラリーの場合、生殖系列化され
た優良なVHを生殖系列化された優良なVLと組み換えることができる。

生殖系列化されたFabに関するアミノ酸及びヌクレオチド配列情報を用いて、好ましい
アイソタイプの完全長ヒトIgG（ADCC及びCDCについてはIgG1、限定されたエフェクター機
能についてはIgG2、IgG2と同様であるが、一価の結合が必要とされる場合にはIgG4）の産
生のためのコドン最適化された合成遺伝子を生成させることができる。非慢性的適用及び
急性適応のために、細菌又は哺乳動物細胞で産生されるヒトFabも産生することができる
。

本発明は、以下の非限定的な実験的実施例を参照して、さらに理解されるであろう。

実施例1〜9は、リャマの免疫から始めて、「サイトカインx」と表された抗原例に対す
る抗体を作製するプロセスを例示している。同じ一般プロトコルを、任意のラクダ科動物
種の任意の標的抗原に適応することができ、したがって、「サイトカインx」の厳密な中
身は重要ではない。本プロセスは、IL-1βに結合するFabの調製についても例証されてい
る。

様々な刊行物が、前述の記載において及び以下の実施例の全体を通じて引用されており
、その各々は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。

（一般プロトコル）
（実施例1）
リャマの免疫
リャマ（ラマ・グラマ）の免疫及び末梢血リンパ球の採取、並びにその後のRNA抽出及
び抗体遺伝子断片の増幅を、De Haardと同僚によって記載されているように実施した（De
Haardらの文献、J. Bact. 187：4531-4541（2005））。1頭のリャマを、フロイント完全
アジュバント又は動物に優しい適切なアジュバントStimune（商標）（Cedi Diagnostics
BV社、オランダ）用いて、組換えヒトサイトカインxで筋肉内に免疫した。サイトカインx
（人為操作したヒト細胞株で組換えにより発現されたもの）は購入した。免疫の前に、凍
結乾燥されたサイトカインxを、PBS（Dulbecco社）中、250μg／mlの濃度で再構成した。
リャマは、隔週で6回の注射を受け、最初の2回の注射は、注射1回当たりサイトカイン100
μg、最後の4回の注射は、各追加免疫1回につき50μgとした。最後の免疫から4日後、150
mlの血液試料（PBL1）を該動物から回収し、血清を調製した。最後の免疫から10日後、15
0mlの第二の血液試料（PBL2）を回収し、血清を調製した。この血液試料から、Ficoll-Pa
que（商標）勾配（Amersham Biosciences社）を用いて、リャマ免疫グロブリンの遺伝子
供給源としての末梢血リンパ球（PBL）を単離し、1〜5×10⁸個のPBLを得た。抗体の最大
多様性は、試料採取されたBリンパ球の数と等しいと予想され、その数は、PBLの数（1〜5
×10⁷）の約10％（9.2〜23.2％（De Genstらの文献、Dev. Comp. Immunol. 30：187-98（
2006））である。リャマ血清中の通常型抗体の画分は、全免疫グロブリンの量の最大80％
であり、これを、通常型抗体を産生するBリンパ球の同様の画分に対して外挿することが
できる。したがって、150mlの血液試料中の通常型抗体の最大多様性は、0.8〜4×10⁷個の
異なる分子と計算される。トータルRNAは、Chomczynskiらの方法（Anal. Biochem.162：1
56-159（1987））に従って、PBLから単離した。

（実施例2）
パニング又はFACS選別による抗原反応性B細胞の濃縮（任意）
試料採取されたB細胞レパートリーの複雑性を低下させて、組換えFabファージディスプ
レイライブラリーの効率的なクローニングを可能にするために、抗原反応性B細胞を、蛍
光標識抗原と（B細胞マーカーとしての）ラクダ科動物の通常型抗体を特異的に認識するm
Abとを用いるFACS選別（Weitkampらの文献、J. Immunol. Meth., 275：223-237（2003）
）によるか、又は固定化した抗原に対するパニング手順（Lightwoodらの文献、J. Immuno
l. Meth. 316：133-143（2006））によって濃縮した。

免疫動物由来のPBLを、上記のようなFicoll-Paque上での密度遠心分離によって単離し
た。任意に同時精製した赤血球細胞は、PBLペレットを室温で20mlの溶解緩衝液（8.29g／
L NH4Cl、1.09g／L KHCO3、及び37mg／L EDTA）に再懸濁し、その後、200×gで10分間遠
心分離することにより溶解させた。単球をT150培養フラスコのプラスチック表面に付着さ
せることによる単球の除去も任意とした。これを実現するために、細胞を、10％胎仔ウシ
血清、Glutamax、25mM Hepes、ペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen社）、及び0
.38％クエン酸ナトリウムが補充された70mlのRPMI（Invitrogen社）に再懸濁し、フラス
コ内で37℃及び5％CO2で2時間インキュベートした。選択されたBを含む上清画分を回収し
、細胞をカウントした。

標的特異的な通常型抗体を提示する（生きた）B細胞のFACSにおけるバルク選別を、ラ
クダ科動物の通常型抗体を特異的に認識する蛍光標識mAbと、また別の蛍光色素で標識さ
れた標的抗原とによる同時染色により行なった。1,000〜100,000個の抗原特異的細胞を選
別し、Goughと同僚（Goughの文献、Anal. Biochem. 173：93-95（1988））のプロトコル
を適用することによるか、又はTRIzol（商標）キット（Invitrogen社）を用いることによ
って、RNA抽出に用いた。トータルRNAを、抗体重鎖及び軽鎖の可変遺伝子の増幅用の鋳型
としてのランダムプライムcDNAに変換した（実施例3以降を参照されたい）。

（実施例3）
可変領域遺伝子の増幅及びクローニング
ランダムプライムcDNAは、RT-PCR用のSuperscript III（商標）ファーストストランド
合成システム（Invitrogen社）を用いて、80μgのPBL RNAから調製した。RNAを、20μlの
反応液の8つの独立した反応において、2.5μMのランダムヘキサヌクレオチドプライマー
及び500μMのdNTPの存在下にて65℃で5分間熱変性させた。その後、供給業者の指示に従
って、8×40μlの総最終容量中に、緩衝液及びジチオスレイトール、並びに640ユニット
のRNaseOUT（40ユニット／μl、Invitrogen社）、及び3200ユニットのSuperscriptIII逆
転写酵素（200ユニット／μl；Invitrogen社）を添加した。50℃で50分間、85℃で5分間
、及び1℃で1分間の後、RNAse Hを添加し（約4ユニット）、37℃で20分間インキュベート
した。プールしたcDNAを、供給業者の推奨に従ってQIAquick（商標）PCR精製キットを用
いて浄化し、PCRに用いた。

CH1の3'末端並びにVHの5'及び3'末端にアニールするプライマーを、リャマ及びヒトコ
ブラクダの生殖系列配列を基にして設計した。これらの配列に関しては、その寄託配列を
、De Genstと同僚（De Genstらの文献、Dev. Comp. Immunol., 30：187-198（2006））か
らの引用に従って、IMGT及び他のデータベースから検索することができた。軽鎖を増幅す
るためのオリゴヌクレオチドの設計のために、学位論文（I. Legssyer、ブリュッセル自
由大学）に公表されている、再編成されたヒトコブラクダ配列及び体細胞突然変異したヒ
トコブラクダ配列を用いた。

最大多様性を維持するために、鋳型としての比較的大量のランダムプライムcDNA（最大
2.5μl、6μgのトータルRNAに相当）に対して、可変領域の5'末端にアニールする個別のB
ACKプライマーを用いて、CH1の3'末端にアニールするFORプライマーと組み合わせて、全
ての一次PCRを実施した。重鎖由来のアンプリコンを、VHの3'末端にアニールし、かつ天
然のBstEII部位を含むJHFORプライマーとVH遺伝子の5'末端にアニールするSfiI-タグ付き
VHBACKプライマーの組合せを用いて再増幅し、その後、VH断片としてクローニングするこ
とができる。軽鎖V-遺伝子を、定常ドメインの3'末端にアニールするCKFOR又はCLFORプラ
イマーとV-領域の5'末端でプライミングするBACKプライマーのセットを用いるPCRで得た
。最初のPCR反応からのアンプリコンを、伸長型のCH1FORプライマー（NotI部位を含む）
又はCKFOR及びCLFORプライマー（AscI部位を含む）を用いて再増幅し、その後、リャマFa
b断片としてクローニングした。或いは、DNAセグメントを、制限部位をタグ付けしたプラ
イマー（AscI部位を含むFORプライマー及びXhoI部位を含むFR4ベースのBACKプライマー）
を用いて再増幅し、VL断片としてクローニングし、それにより、ヒトC領域と組み合わさ
れたリャマ由来V領域を含むキメラFabを作製することができる。

PCRを、Phusion（商標）ポリメラーゼ（Finnzymes社）及び500pMの各プライマーを用い
て、容量50μlの反応液中で、28サイクル（96℃で1分間、60℃で1分間、及び72℃で1分間
）実施した。全ての産物を、QIAex-II抽出キット（Qiagen社）を用いて、アガロースゲル
から精製した。制限部位を導入するための再増幅用のインプットとして、100〜200ngの精
製DNA断片を100μlの反応容量で鋳型として用いた。大量のインプットは、多様性の維持
を保証するが、これについて、4μlの「未増幅の」PCR混合物をアガロースゲル上で解析
することによりチェックした。

（実施例4）
一次及び二次ラクダ科動物Fabレパートリーの構築
一次重鎖レパートリー及び2つの一次軽鎖レパートリーの構築のために、制限部位が付
加されたPCR産物をゲル精製し、その後、消化し、様々なVH、Vκ、及びVλファミリーを
組み合わせて3つのグループにした。VHCH1断片をSfiI及びNotIで消化し、VκCκ及びVλC
λ断片をApaLI及びAscIで消化し、ファージミドベクターpCB3（適合したマルチクローニ
ングサイトを有するベクターpCES1に類似している）にクローニングした。消化した断片
（1〜2μg）を、消化及び精製したpCB3（2〜4μg）に、T4-DNAリガーゼ（Fermentas社）
を用いて、室温で数時間、その後、37℃で1〜2時間連結させた。軽鎖又は重鎖プールの脱
塩したライゲーション混合液を、大腸菌株TG1のエレクトロポレーションに用いて、1つの
鎖のライブラリーを作製した。

或いは、合計1.5μgのVH断片をSfiI及びBstEII（VH中に存在する）で消化し、100〜200
μlの反応混合液中、室温で、9ユニットのT4-DNAリガーゼを用いて、4μgのゲル精製した
ベクターpCB4（ベクターpCB3に類似しているが、pIII遺伝子を欠失している）に連結させ
ることができる。さらに、VH遺伝子セグメントをSfiI及びBstEIIを介して、並びにVκ／V
λ遺伝子セグメントをApaLI及びXhoIを介してクローニングし、キメラFd及びVκCκ及びV
λCλを得ることができる。

Fabライブラリーは、軽鎖レパートリーから調製されたプラスミドDNAから消化された軽
鎖断片を重鎖レパートリーを含むプラスミドコレクションにクローニングすることにより
得られた。VLライブラリーの少なくとも3×10⁹個の細菌から単離されたプラスミドDNA（
ドナーベクター）をApaLI及びAscIで消化し、ゲル精製したDNA断片を、重鎖ライブラリー
を既に含むアクセプターベクターにクローニングし、それにより、1〜10×10⁹クローンの
サイズの、カッパ軽鎖を有する個別のFabライブラリーと、ラムダ軽鎖を有するFabからな
る別のライブラリーとを作製した。同様に、単鎖ライブラリー由来のVλCλ又はVκCκを
ApaLI／AscIを用いてアガロースゲルから抽出し、同じ制限部位を用いて、VHCHライブラ
リーベクターにクローニングすることができる。

（実施例5）
ライブラリーの選択
出発接種菌中に各クローン由来の少なくとも10個の細菌が確実に存在するように、ライ
ブラリー由来の代表的な数の細菌を接種に用いて、ヘルパーファージM13-KO7又はVCSM-13
によるファージミド粒子のレスキューを2Lスケールで実施した。選択のために、10¹³個の
コロニー形成単位を、イムノチューブ（Maxisorp（商標）チューブ、Nunc社）もしくは96
ウェルマイクロタイタープレート（Maxisorp（商標）、Nunc社）中に固定化した抗原とと
もに、又は可溶性ビオチン化抗原とともに用いた。固定化した抗原の量は、第1ラウンド1
の10μg／mlから始めて、その後の選択ラウンドの間に10〜100倍減少させた。抗原を、供
給業者の推奨に従って、抗原1分子当たりNHS-ビオチン（Pierce社）3〜10分子の比でビオ
チン化し、その生体活性についてバイオアッセイで試験した。特に明記しない限り、該抗
原を、第1ラウンドの間は1〜10nMの濃度で、その後のラウンドの間は10pM〜1nMの濃度で
選択に用いた。

（実施例6）
拮抗性サイトカインx特異的Fabのスクリーニング
可溶性Fabは、Marksらの文献（Marksらの文献、J. Mol. Biol. 222：581-597（1991）
）に記載されているように個々のクローンから、しかし、好ましくは感度を高めるために
モノクローナルファージ（Leeらの文献、Blood、108：3103-3111（2006））として産生し
た。可溶性Fab又はFab提示ファージを含む培養上清を、直接コーティングされた抗原を用
いるELISAで試験したか、又は固定化したストレプトアビジンを介して捕捉した。組換え
ヒトサイトカインx及びストレプトアビジンを、0.1M NaHCO₃（pH9.6）中10μg／mlで、4
℃で16時間コーティングした。PBS、0.1％（v／v）Tween 20で3回洗浄した後、ビオチン
化抗原を、0.5μg／mlの濃度で、室温で30〜60分間添加した。プレートを、PBS中の2％（
w／v）半脱脂粉乳（Marvel）又は（PBS中の）1％カゼイン溶液を用いて、室温で30分間ブ
ロッキングした。培養上清を、2％（w／v）Marvel／PBS中で1倍又は5倍希釈し、2時間イ
ンキュベートし；結合したFabを、重Fd鎖のカルボキシル末端にあるmyc-ペプチドタグを
認識する抗myc抗体9E10（5μg／ml）、及びウサギ抗マウスHRPコンジュゲート（Dako社）
で検出した。最後のインキュベーションの後、染色を、テトラメチルベンジジン及びH₂O₂
を基質として用いて行ない、0.5容量の1M H₂SO₄を添加して停止させ；光学密度を450nmで
測定した。ELISAで陽性シグナル（バックグラウンドの2倍を上回るもの）を生じるクロー
ンを、オリゴヌクレオチドプライマーのM13-リバース及びgeneIII-フォワード（4）を用
いる増幅で得られたPCR産物の、又は個別のFd及びVκCκ又はVλCλアンプリコンのBstNI
又はHinfIフィンガープリントによって解析した。

サイトカインxのその受容体への結合を妨害するFabの能力のスクリーニングを適当な受
容体-リガンド結合ELISAにおいて実施した。このために、少量のビオチン化サイトカイン
xを、サイトカインx受容体をコーティングしたプレート上で培養上清中のFabとともにイ
ンキュベートし、その後、結合したサイトカインxを、ストレプトアビジン-HRPコンジュ
ゲートで検出した。陽性ヒットの配列を決定し、インビトロ受容体-リガンドアッセイで
その効力（IC50）を決定するために、及び固定化したサイトカインxに対するBIAcoreでそ
の親和性を評価するために、Fabを精製した。

個々のクローンからの可溶性Fab断片の大規模誘導を、100μg／mlカルベニシリン及び2
％グルコースを含む2×TY中で、50ml又は250mlスケールで行なった。OD600が0.9になるま
で37℃で増殖させた後、細胞をペレットにし（2,934×gで10分間）、カルベニシリン及び
1mMイソプロピル-1-チオ-D-ガラクトピラノシド（IPTG）を含む2×TYに再懸濁した。別の
De Bellis手順（De Bellis及びSchwartzの文献、NAR（1990）18（5）：1311）を、2％で
はなく、0.2％のグルコースを用いて進め、それにより、対数増殖期後期の細胞の培地へ
のIPTGの直接添加を可能にした。30℃で3.5時間増殖させた後、（前述のような）遠心分
離によって細菌を回収し；細胞ペレットを1mlの氷冷PBSに再懸濁することによって、ペリ
プラズム画分を調製した。4℃で2〜16時間、縦に（head-over-head）回転させた後、2回
の遠心分離工程によって、スフェロプラストを除去し；3,400×gで10分間スピンさせた後
、エッペンドルフ遠心機にて13,000×gで10分間の追加の遠心分離工程により、上清を透
明化した。得られたペリプラズム画分を、様々な機能アッセイ（標的結合ELISA、インビ
トロ受容体-リガンド結合アッセイ、及びBiacore）で直接用いた。

配列決定のために、プラスミドDNAを、Qiagenミニキット（Qiagen社）を用いて、100μ
g／mlカルベニシリン及び2％グルコースを含むLB培地中、30℃で増殖させた5ml培養物か
ら、又はFabインサートの境界でアニールするベクタープライマーのM13-リバース及びgen
eIII-フォワードを用いてアンプリコンを基にして調製した。

（実施例7）
リードFabの大規模産生及び精製
3〜6個の異なるリード由来のFabインサートを、Fdのカルボキシ末端に融合したヘキサ
ヒスチジンタグ及びC-MYCタグを含むが、バクテリオファージM13 gene3を欠くpCB3と同一
の発現ベクター（pCB5と符号化）にApaLI-NotIを介して再クローニングした。同時に、V
領域を、適切な組合せの制限酵素を用いて再クローニングし、その後、ヒトCH1及びCκ又
はCλを含む、キメラFab発現用のgene3欠失ベクターにクローニングした。フィンガープ
リント解析後、再クローニング後に得られた個々のクローンを、50ml又は250mlスケール
で増殖させ、ペリプラズム画分を上記のように調製した。Fab断片をIMACで精製し、正し
く形成されたFabを、Superdex（商標）75HRカラム（Amersham Pharmacia Biotech社）を
用いるサイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した。細胞ベースのアッセイによって
は、1M NaOH中で一晩増感させ、その後、D-PBS中で平衡化する陰イオン交換カラム（Sour
ce30Q、GE Healthcare社）に通すことによって、エンドトキシンを除去した。Fabのモル
吸光係数13を用いて280nmで光学密度を測定することにより、収量を決定した。

精製したFabを、インビトロ受容体-リガンド結合アッセイ及びBiacoreで試験して、gen
e3を含むpCB3ベクターによって産生されたFab断片で得られた観察結果を確認した。最後
に、Fabの効力をバイオアッセイで決定した。

（実施例8）
本実施例では、親和性ベースの選択（引用により本明細書中に組み込まれている、US20
03／0190317 A1号）によって高親和性フレームワーク配列を同定するために、わずかなフ
レームワーク残基のセットを標的とするソフトランダム化手順を用いて、及び得られたFa
bライブラリーの繊維状ファージ表面での一価ディスプレイによって、サイトカインxに対
するリャマ由来のリードFabをヒト化した。例えば、ヒトコブラクダ由来の生殖系列VH（I
GHV1S20）の場合、野生型残基の70％を維持して、位置5（Val、Leu）、55（Gly、Ala）、
83（Ala、Ser）、95（Lys、Arg）、96（Ser、Ala）、及び101（Met、Val）について、小
さいライブラリーを作製した（IMGT付番）。超可変ループ中のアミノ酸について同様に対
処することができた。

PCRエラーを補正するための、又はさらなる特異的単一コドン変化を導入するための部
位特異的突然変異誘発を、本質的にKunkelらの文献（Curr. Protoc. Mol. Biol. CH8U8.1
（2001））に記載されているように実施したか、或いはこれらの変異体をコードする合成
遺伝子をGeneArtに発注した。部位特異的実験のための鋳型は、ヒト化Fabクローン由来の
一本鎖DNAとした。

部位特異的突然変異誘発は、野生型Fab又はヒト化FabをコードするDNA中で、ヒト化又
は修飾の目的で、限定された数のアミノ酸コドンを直接変化させるためにも用いた。

選択後、個々のリードを親和性及び効力について試験し、最も優れたリードをヒトFab
／IgGへの再フォーマット化のために選んだ。

（実施例9）
ヒトFab断片及びヒトモノクローナル抗体の発現
ヒト化VH及びVL領域から出発して、ヒト化Fabの発現を、Rauchenbergerらの文献（J. B
iol. Chem. 278：38194-204（2003））に記載されているように実施した。ヒトモノクロ
ーナル抗体の発現のために、1つは軽鎖コンストラクト用、1つは重鎖コンストラクト用の
2つの個別の発現ベクターを、pcDNA3.1ベクターを基にして構築した。軽鎖用の発現ベク
ターは、CMVプロモーターの下流にあるヒトCカッパ又はヒトCラムダのいずれかの配列、
及び該CMVプロモーターの下流にあり、かつ軽鎖定常ドメインとインフレームになったKPN
1 BsmB1断片としての軽鎖コンストラクトのクローニングを可能にする制限部位を含んで
いた。次に、重鎖用の発現ベクターは、CMVプロモーターの下流にあるヒトCH1-ヒンジ-CH
2-CH3配列、及び該CMVプロモーターの下流にあり、かつ重鎖定常ドメインとインフレーム
になったKPN1 BsmB1断片としてのVHコンストラクトのクローニングを可能にする制限部位
を含んでいた。

これらのVL及びVH断片を、コザック配列と、それに続くそれぞれのVL又はVH配列とイン
フレームになったマウスIgGカッパリーダー配列とを含むKPN1 BsmB1断片として、適当な
発現ベクターにクローニングした。これらの配列は遺伝子合成により得られ、哺乳動物細
胞内での発現のために最適化された（Geneart社）。

完全長IgG産生のために、VH及びVL発現ベクターコンストラクトを、哺乳動物細胞（HEK
-293（一過性）又はCHO（安定））に共トランスフェクトした。一過性にトランスフェク
トした細胞又は安定にトランスフェクトした細胞由来の上清をプロテインAクロマトグラ
フィーにより精製した。

モノクローナル抗体又はFabを受容体結合アッセイ及びバイオアッセイで試験し、最も
優れたリードをさらなる開発のために選択した。

（実施例10−IL-1βに対するFabの作製）
特に指示しない限り、以下の試験で用いる材料及びプロトコルは、実施例1〜9で用いた
ものと類似していた。

（リャマをIL-1βで免疫するのに成功した）
2頭のリャマ（ラマ・グラマ）を（実施例1に記載したような）標準的なプロトコルに従
って、ヒトIL-1βで免疫した。

両方のリャマ由来の血清を、免疫前（0日目）及び免疫後（28日目）のELISAでIL-1βに
対する抗体の存在について試験した。図1に示すように、IL-1βに対する特異的シグナル
は、免疫後のELISAで認められ、血清を10,000倍希釈した後でも認められた。この高い抗
体力価は、特異的かつ適切な免疫応答を示している。

（良好な多様性を有するFabライブラリーを構築した）
両方の免疫リャマから単離されたPBLを、Haardらの文献（JBC 1999）に記載されている
戦略を用いて、RNA抽出、RT-PCR、及びファージミドへのFabのPCR-クローニングに用いて
、良好な多様性を有する多様なライブラリー（2〜5×10⁸）を得た。

以下のプライマーを用いた：

独立したVλCλ及びVκCκライブラリーを、単一の（タグ付き）-PCR工程（30サイクル
）を用いて構築し、より大きいクローン多様性を保存した。

同時に、VHCH1ライブラリーを、2工程PCR（タグなしプライマーで25サイクル（工程1）
、その後、タグ付きプライマーで10サイクル（工程2））を用いて構築した。

次に、VλCλ及びVκCκライブラリー由来の軽鎖を、VHCH1-発現ベクターに個別に再ク
ローニングして、それぞれ、「ラムダ」及び「カッパ」リャマFab-ライブラリー（各々の
免疫リャマにつき2つ）を作製した。これらのライブラリーの品質管理を、PCRを用いて通
常通りに行なった。

無作為に試験したクローンの最大93％が完全長Fab配列を含み、これらのライブラリー
の高い品質を示した。

（ヒトIL-1β特異的Fabを選択した）
ファージディスプレイを用いて、ビオチン化IL-1βに結合する非常に多様なリャマFab
を同定した。タンパク質の活性のある立体構造を保存するために、ビオチン化IL-1βを捕
捉用に用いた。2ラウンドの選択の後、対照と比べて良好な濃縮が認められた。ファージE
LISAにより、サイトカイン特異的Fabを発現するクローンの存在が明らかになった（デー
タは示さない）。

ビオチン化IL-1βに結合するファージをpHショックにより溶出させた。溶出物（output
）の連続希釈物（10^-1〜10^-5）を用いて、新鮮な大腸菌TG1細胞に感染させた。得られた
コロニー数は、この選択時に結合したファージの数を示す。上記の例では、100nM及び10n
Mのbiot-IL-1βを用いて選択を行なったときに、5μlの溶出物から、約10⁵個のファージ
が得られた。非特異的結合により得られた10²個のファージと比べると、これは、1000倍
の濃縮を生じさせている。

94個の単一クローンを増殖させ、それを用いてモノクローナルファージを産生した。こ
れらのファージをファージELISAで用いた。多くのファージは、ビオチン化IL-1βに対す
る2ラウンドの選択の後に、biot-IL-1βに対する良好な結合を示した。

（ヒトIL-1β特異的Fabはヒト生殖系列との高い出発相同性を有する）
標的特異的VH及びVλドメインを、同一のCDR1及びCDR2長、並びに対応するカノニカル
フォールドを示すよく見られるヒト生殖系列と一致させた。その後、最も近いヒト生殖系
列を、そのフレームワーク領域における配列相同性に基づいて選択した。一致しないアミ
ノ酸残基を、関連する他のヒト生殖系列におけるその存在についてチェックした。一致す
るものが存在しない場合、これらの残基を外来のもの（foreign）とカウントした。

考察及び結論：
・合計14種の標的特異的VHファミリー、9種の標的特異的Vλファミリー、及び3種のVκフ
ァミリーを、このまさに最初の選択に基づいて同定した。
・14種の抗IL-1βWT VHと12種の抗IL-1βWT VLのこの最初のパネルは、ヒト生殖系列との
顕著に高い配列相同性を示している。
・これらのVHドメインの33％はヒト状況との95％以上の出発相同性を有し、かつVLドメイ
ンの約44％はヒト状況との95％以上の出発相同性を有しており、さらなるヒト化の必要が
なくなっている。
・VHドメイン2D8はVH 1C2のヒト化バージョンであるが、その理由は、これが最も近いヒ
ト生殖系列と比べて逸脱するアミノ酸残基が1つ少ないことによる。その対応するVLドメ
イン（VL 2D8）は、最も近いヒト生殖系列との95％の出発相同性を有しており、これはさ
らに、1つの復帰突然変異（VL 2G7）によって96％に増大した。
・上記の方法を用いて評価したとき、VH及びVLドメインは全て、1つの例外もなく、ヒト3
-D結合部位構造（すなわち、一致するヒト生殖系列セグメントに生じるのと同一のCDR1及
びCDR2についてのカノニカルフォールド組合せ）を示した（データは示さない）。

（Fab 1E2及び1F2のヒト化）
1E2及び1F2と符号化した2つのIL-1β特異的Fabに対してヒト化を行なった。最も近いヒ
ト生殖系列に対するアラインメントに基づいて、そのVH及びVλフレームワーク領域にお
ける突然変異が提案された（図2）。ヒトVH3ファミリーと一致するVHの生殖系列化は、多
くの場合、公知のラマ・グラマ、ラマ・パコス、又はカメルス・ドロメダリウス由来の生
殖系列配列において既に逸脱している、いくつかの残基を含む。例えば、位置71のアラニ
ン（付番はKabatによる）及び83のリジン及び84のプロリンは、それぞれ、セリン（しか
し、特定のヒト生殖系列VH3メンバーでは、アラニンが存在する）、アルギニン（しかし
、いくつかのヒトVH3生殖系列によってリジンが用いられている）、及びアラニンに変化
させることができる。軽鎖可変配列については、ラクダ科動物に利用可能な生殖系列配列
はないが、大部分のリード抗体で変化させられることになる、FRにおけるヒト生殖系列か
らのいくつかの逸脱が存在する可能性は極めて高い。完全ヒト化（hum）及び野生型（wt
）V領域の他に、3つの野生型残基しか残存していない「安全変異体」（safe）も提案され
た。

Fab 1E2を段階的アプローチでフォーマット化し、それにより、ヒト定常ドメインに融
合したVλの様々なバージョン（wt、safe、及び完全にヒト化したもの）を、ヒト定常CH1
ドメインに融合したVHの様々なバージョンと組み合わせて、表12に示すFabを作製した：

これらのFab遺伝子を、GeneArt社（ドイツ）に合成遺伝子として注文し、その後、大腸
菌で産生し、精製し、biot-IL-1βに結合するその能力について試験した。このために、
抗mycコーティングしたMaxisorpプレート上でFabを捕捉した。ビオチン化ヒトIL-1βを添
加し、結合したサイトカインを、HRP-コンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検
出した。このアッセイの読み出しを、下記の図3に示す。

・野生型定常ドメインCH1及びCλをそのヒト対応物に置き換えても、結合能に影響はなか
った。
・1E2のVHドメインの部分ヒト化（wt Vλ／safe VH）及び完全ヒト化（wt Vλ／hum VH）
によって、機能的Fabが生成された。

クローン1F2のヒト化変異体を、gene3-Fab融合体を発現するファージを用いて試験した
（図4）。ファージは、各コンストラクトにつき4つの独立したクローンから産生した。
・wt 1F2及びwt 1E2（リャマVλ及びVHをヒトCλ及びCH1に融合したもの）
・safe変異体1F2及びsafe変異体1E2（部分ヒト化VλをヒトCλ及びCH1に融合したもの）
・hum 1F2及びhum 1E2（完全ヒト化Vλ及びVHをヒトCλ及びCH1に融合したもの）

（細菌増殖、ファージ産生効率、及び毒性などによる）クローンのばらつきをなくすた
めに、各Fabにつき4つのクローンを試験した。ニュートラビジンをコーティングしたMaxi
sorpプレート上でビオチン化IL-1βを捕捉し、その後、粗ファージ抽出物（すなわち、細
菌培地）をインキュベートすることにより、ファージELISAを行なった。徹底的な洗浄の
後、結合したファージを抗M13-HRPモノクローナル抗体で検出した。ニュートラビジンで
コーティングしたウェル（ビオチン化IL-1βを含まない）上で試験したときの同じファー
ジ調製物からは、シグナルが得られなかった（データは示さない）。
・1F2 VL及びVHドメインのフレームワーク領域中での最も近いヒト生殖系列への復帰突然
変異によって、抗原特異性を維持する、部分ヒト化（safe）及び完全ヒト化（hum）変異
体を得ることに成功した。

（ヒト定常ドメインを用いたラクダ科動物可変ドメインの良好なフォーマット化）
IL-1β特異的クローン1E2のVL及びVH可変ドメインをヒトCλ及びCH1定常ドメインに融
合させることに成功し、産生及び精製される「キメラ」Fabを生じさせた。

このキメラ1E2 Fabは、37℃で4時間（o／d）又は28℃で16時間（o／n）の誘導を行なう
ことによって、pCB5ファージミド（Δgene3）から産生した。野生型リャマ1E2 Fabは、30
℃で16時間の誘導を行なうことによって、pCB3（gene3含むファージミド）から産生した
。精製後、これらのFabを、DTTあり（還元型）又はDTTなし（非還元型）のSDS-PAGEにロ
ーディングした。クマシー染色を行ない、これらのFab又はそれらを構成する軽鎖及び重
鎖の存在が、予想された分子量バンド（図示せず）に見事に示された。

上記の精製リャマ及びキメラ1E2 Fabを、抗mycコーティングしたMaxisorpプレート上で
捕捉した。ビオチン化ヒトIL-1βとともにインキュベートし、徹底的に洗浄した後、Fab
に結合したビオチン化IL-1βを、HRP-コンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検
出した。精製リャマ1E2 Fabとキメラ1E2 Fabは両方とも、機能的標的結合を示した（図5
）。この知見は、ラクダ科動物由来の可変ドメインとヒトIgGの定常ドメインとの会合の
実現可能性を示している。

（Fabのサブセットは標的の機能阻害を示した）
下記の表は、以下のELISA実験から得られたOD値を示している。ウェルを、IL1-βとそ
の受容体との結合を阻害することが知られているマウスモノクローナル抗体（Diaclone S
AS社により提供されたもの）でコーティングした。

ビオチン化IL-1βを、ビオチン化IL-1βに対する2ラウンドの選択の後に同定されたFab
のペリプラズム抽出物とともにウェルに添加した。結合したビオチン化IL-1βの検出は、
HRP標識ストレプトアビジンによってもたらされた。シグナルの低下は、特異的Fabとブロ
ッキングマウスモノクローナル抗体との競合を示し、拮抗作用を示唆した。

大量の競合するマウスモノクローナルに中に添加することにより、陽性対照をウェルG1
2に含めた（表13のウェル12G）。

ブロッキングマウスモノクローナル抗体と良好に競合する多くのFab（表13において影
付きのセルで示したもの）を同定した。競合するクローンの配列解析により、スクリーニ
ングした48クローン中に存在する、異なるVHを有する3つのFabの存在が明らかになった（
表13で6Aと符号化されたプレートの部分）。拮抗性Fab 1A1（表13の競合アッセイで0.205
のシグナルを生じるもの）、1B3（0.444のシグナル）、及び関連クローン1G1（0.498のシ
グナル）、並びに最後に1C3（0.386のシグナル）のVHの最も近いヒト生殖系列に対する配
列アラインメント及び構造相同性解析を以下に示す。

3つとも、一致するヒト生殖系列との非常に高度な配列相同性を有し、かつヒト生殖系
列に見られるのと同一のカノニカルフォールド組合せを有する。これは、3つの拮抗性リ
ードのラムダ軽鎖についても認められた（データは示さない）。Fab 1A1は、拮抗性参照
モノクローナル抗体と強く競合する（ELISAベースの競合アッセイで12μg／mlのIC50）の
に対し、Fab 1C3は、競合をほとんど示さない（50μg／mlを超える濃度でのみ）。しかし
ながら、バイオアッセイでは、1C3は、1A1（10μg／mlのIC50）よりも強力（3μg／mlのI
C50）であり、これにより、異なるエピトープ認識が示唆される。異なる拮抗性Fabの高い
頻度（スクリーニングした48クローン中の3つの異なる抗体）及びこれらのうちの2つに見
られるエピトープ認識の違いは、リャマの非近交系の性質の結果としての抗体の高い多様
性を例証している。（強力な）抗体の高い多様性及び広範なエピトープ範囲と組み合わさ
れた、ヒト生殖系列V領域との高度な配列相同性により、免疫ラクダ科動物由来の治療抗
体のパネルの同定が可能になる。

（実施例11）
以下の実施例は、確立されたマウスモノクローナル抗体アプローチと比較して、ラクダ
科動物の免疫により達成し得る機能的多様性を示している。

10匹のBALB／cマウスを、組換えで産生された分子量の小さいサイトカインで免疫した
。この免疫プロトコルの終了後、動物を屠殺し、その脾臓細胞を不死化することによって
、ハイブリドーマを作製した。得られたハイブリドーマの上清を、サイトカイン結合ELIS
Aで、その後、好適なバイオアッセイで試験した。1つの非常に強力なアンタゴニストと1
つの弱いアンタゴニストを同定することができた。

また、4頭のリャマを、本明細書に記載の一般プロトコルを用いて、組換えで産生した
同じサイトカインで免疫した。この免疫プロトコルの終了後、末梢Bリンパ球を採取し、
そのRNAを抽出し、精製した。リャマ特異的プライマーのセットを用い、ファージディス
プレイ技術を用いて、Fabライブラリーを作製した。これらのFabを、サイトカイン／サイ
トカイン受容体結合ELISAで試験した。5種の異なるVHファミリーを最初の2頭のリャマか
ら同定し、さらに6種の異なるVHファミリーを次の2頭のリャマから同定することができた
。これらのVHファミリーは、高い効力でサイトカイン／受容体相互作用を阻止し、このこ
とは、これらのVHドメインが、長さとアミノ酸配列の両方において独自に異なるCDRを含
んでいたことを意味する。

したがって、より大きい機能的多様性を、より多数の近交系BALB／cマウスではなく、
少数の非近交系リャマから達成することができる。リャマの能動免疫によって得られたVH
ファミリーは全て、最も近いヒト生殖系列と比較して並外れた配列相同性を示し、かつ一
致するヒト生殖系列と同じCDR1及びCDR2のカノニカルフォールド組合せを有していた。

（実施例12）
以下の表は、アルパカ（ラマ・パコス）の生殖系列VHドメインと、最も良く一致するヒ
ト生殖系列VHドメインの間のアミノ酸配列相同性比較の結果をまとめたものである。相同
性％は、ラマ・グラマについて本明細書で記載したのと同じアルゴリズムを用いて算出し
た。ラマ・パコスについての生のVH配列データは示していない：

（実施例13 - ヒト化のためのアミノ酸置換の導出）
成熟ラクダ科動物VHドメインをコードする複数のcDNA配列をクローニングし、完全に配
列決定した。さらに、ラクダ科動物Vλ／Vκドメインをコードする複数のラクダ科動物生
殖系列断片の配列を得た。

次に、この大量の生の配列情報（図示せず）をバイオインフォマティックス的に処理し
た。これらの生のラクダ科動物配列の各々について、最も良く一致するヒト生殖系列配列
は、本明細書中の別所に記載されているアプローチに従って得られた。次に、これは、異
なるファミリー又はサブファミリーに属するラクダ科動物VH及びVλ／Vκドメインのコン
センサス配列の導出を可能にし、かつ各ファミリー又はサブファミリーのメンバーとその
最も良く一致するヒト生殖系列との直接的な比較も可能にした。次に、各ラクダ科動物フ
ァミリー又はサブファミリーのコンセンサス配列を整列させ、複数の異なるヒト生殖系列
ファミリー又はサブファミリーのコンセンサス配列と比較した。これらの配列アラインメ
ントを添付の図に示す。

合計で、163個の成熟VH配列、78個のVκ配列、及び148個のVλ配列を解析した。Vκに
ついては、78個の配列のうち75個が、体細胞突然変異したヒトVκの大部分に認められる9
個のAAを有するCDR3を含み、これら全てが位置95にプロリンを有し、これら75個のうち73
個が位置90にグルタミンを有していた。この位置90のグルタミンは、ヒトVκにも典型的
なカノニカルフォールドタイプ1と関連している（Knappikらの文献、J Mol. Biol. 296：
57-86（2000））。2個のVκのみが8残基のCDR3を有し、1個のVκは10残基のCDR3を有して
いた。ラクダ科動物Vλのコレクションについて、解析した148個の配列のうち80個が10ア
ミノ酸残基のCDR3を有し、23個が9残基のCDR3長を有し、2個が8残基を有し、30個が11残
基を有し、8個が12残基を有し、4個が13残基を有し、1個が14残基を有していた。これら
の観察結果はヒトのシステムと相関している。ヒトのシステムでは、VλにCDR3の長さの
大きなばらつきが認められ、体細胞突然変異したヒトVλの92％は9〜11残基のCDR3長を有
する（リャマ免疫系で認められるのは90％）。

上で概説した配列比較に基づいて、1）ヒトVH及びVλ／Vκ配列との不一致をよく示す
ラクダ科動物VH及びVλ／Vκドメイン内の位置を同定し、それにより、交換が考慮される
べき候補残基を同定すること、並びに2）ヒトVH及びVλ／Vκドメイン配列中のこれらの
位置の各々での異なるアミノ酸の利用％を算出し、それにより、各位置での好適な交換用
残基を同定することが可能であった。この利用％データを図30〜42にまとめる。

（等価物）
前述の記載を考慮して、本発明の多くの修正及び別の実施態様が当業者には明らかであ
ろう。したがって、本記載は、単に例示的なものであるとみなされるべきであって、当業
者に本発明を実施する最良の形態を教示する目的のためのものである。構造の詳細は、本
発明の精神から逸脱することなく、大幅に変更することができ、添付の特許請求の範囲の
範囲内に入る全ての修正の排他的使用が留保される。本発明は、添付の特許請求の範囲及
び適用可能な法規により必要とされる範囲にのみ限定されることが意図される。

特許、特許出願、論文（article）、書籍、論文（treatise）、論文（dissertation）
、ウェブページ、図、表、別表、及び／又は添付書類を含む、本出願に引用された文献及
び同様の資料は全て、そのような文献及び同様の資料の形式を問わず、その全体が引用に
より本明細書中に明示的に組み入れられる。組み入れられた文献及び同様の資料のうちの
1つ又は複数が、定義された用語、用語の用法、記載された技術などを含む、本出願と異
なるか、又は矛盾する場合、本出願が優先される。そのような等価物は、以下の特許請求
の範囲に包含されることが意図される。

Claims (73)

1. ラクダ科動物VHドメイン、及びラムダ軽鎖クラス（Vλ）又はカッパ軽鎖クラス（Vκ）
   のいずれかのラクダ科動物VLドメインを含み、少なくとも1つのアミノ酸置換が、該VHド
   メイン及び／又は該VLドメイン中に存在し、該アミノ酸置換（複数可）が、以下からなる
   群から選択されることを特徴とする、抗体：
   （a）該ラクダ科動物VHドメイン中のアミノ酸置換（複数可）、ここで、Kabatによる、
   該ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H5、H7、H11、H12、H13、H14、H29、H30、H37、H40
   、H48、H67、H68、H69、H71、H74、H77、H78、H80、H81、H82b、H83、H84、H85、H86、H8
   9、H93、H94、及びH108からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVHドメ
   イン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される；並びに
   （b）該ラクダ科動物VLドメイン中のアミノ酸置換、ここで、該ラムダ軽鎖クラス（Vλ
   ）のラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vλドメインの位置
   L1、L2、L3、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L
   44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L
   80、L84、及びL103からなる群から選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVλドメイ
   ン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換され；かつ該カッパ軽鎖クラス（Vκ
   ）のラクダ科動物VLドメインについて、Kabatによる、該ラクダ科動物Vκドメインの位置
   K1、K3、K4、K7、K9、K11、K12、K13、K14、K15、K18、K19、K36、K42、K43、K45、K46、
   K58、K63、K70、K77、K78、K79、K80、K83、K100、K103、K104、及びK106からなる群から
   選択される1つ又は複数のアミノ酸は、ヒトVκドメイン配列中の対応する位置に見られる
   アミノ酸と交換される。
2. 前記ラクダ科動物VHドメインが、ヒトVH3ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
   ラクダ科動物VHドメインの位置H1、H13、H14、H29、H30、H37、H40、H74、H77、H78、H82
   b、H83、H84、H86、H89、H93、又はH94のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH3ドメ
   イン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体。
3. 前記H74のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。
4. 前記H74のアミノ酸がS又はA、好ましくはSと交換される、請求項3記載の抗体。
5. 前記H83のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。
6. 前記H83のアミノ酸がR又はK、好ましくはRと交換される、請求項5記載の抗体。
7. 前記H84のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。
8. 前記H84のアミノ酸がA又はT、好ましくはAと交換される、請求項7記載の抗体。
9. 前記H94のアミノ酸が交換される、請求項1又は請求項2記載の抗体。
10. 前記H94のアミノ酸がRと交換される、請求項9記載の抗体。
11. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項2記載の抗
    体：
    好ましくはQ又はEと交換されたH1；
    好ましくはQ、R、又はKと交換されたH13；
    好ましくはPと交換されたH14
    好ましくはF又はVと交換されたH29；
    好ましくはS、D、又はGと交換されたH30；
    好ましくはV、F、又はI、最も好ましくはVと交換されたH37；
    好ましくはAと交換されたH40；
    好ましくはT又はSと交換されたH77；
    好ましくはL又はA、最も好ましくはLと交換されたH78；
    好ましくはSと交換されたH82b；
    好ましくはDと交換されたH86；
    好ましくはV又はL、最も好ましくはVと交換されたH89；
    好ましくはA又はTと交換されたH93。
12. 前記ラクダ科動物VHドメインがヒトVH1ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラ
    クダ科動物VHドメインの位置H1、H7、H11、H12、H13、H69、H71、H78、H80、又はH86のう
    ちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ
    酸と交換される、請求項1記載の抗体。
13. 前記H11のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。
14. 前記H12のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。
15. 前記H13のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。
16. 前記H69のアミノ酸が、好ましくはI、M、又はS、最も好ましくはMと交換される、請求
    項1又は請求項12記載の抗体。
17. 前記H71のアミノ酸が、好ましくはR、A、E、又はT、最も好ましくはRと交換される、請
    求項1又は請求項12記載の抗体。
18. 前記H80のアミノ酸が、好ましくはMと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。
19. 前記H86のアミノ酸が、好ましくはDと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。
20. 前記H78のアミノ酸が、好ましくはV又はAと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗
    体。
21. 前記H1のアミノ酸が、好ましくはQ又はEと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗
    体。
22. 前記H7のアミノ酸が、好ましくはSと交換される、請求項1又は請求項12記載の抗体。
23. 前記ラクダ科動物VHドメインがヒトVH4ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラ
    クダ科動物VHドメインの位置H1、H16、H23、H30、H48、H49、H67、H68、H71、H81、H84、
    H85、H86のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVH4ドメイン配列中の対応する位置に見
    られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体。
24. 前記H16のアミノ酸が、好ましくはEと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
25. 前記H23のアミノ酸が、好ましくはA又はTと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗
    体。
26. 前記H30のアミノ酸が、好ましくはSと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
27. 前記H48のアミノ酸が、好ましくはIと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
28. 前記H1のアミノ酸が、好ましくはQ又はEと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗
    体。
29. 前記H67のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
30. 前記H68のアミノ酸が、好ましくはTと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
31. 前記H71のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
32. 前記H81のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
33. 前記H84のアミノ酸が、好ましくはAと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
34. 前記H85のアミノ酸が、好ましくはAと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
35. 前記H86のアミノ酸が、好ましくはDと交換される、請求項1又は請求項23記載の抗体。
36. 前記H108のアミノ酸が、好ましくはLと交換される、請求項1〜35のいずれか一項記載の
    抗体。
37. 前記ラクダ科動物VLドメインが前記ラムダ軽鎖クラス（Vλ）に属し、かつKabatによる
    、該ラクダ科動物Vλドメインの位置L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L17
    、L18、L19、L20、L38、L39、L40、L42、L44、L46、L47、L49、L58、L59、L60、L66、L67
    、L69、L70、L71、L72、L74、L76、L78、L80、L81、L84、L103、L104、L108のうちの1つ
    又は複数のアミノ酸が、ヒトVラムダドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸
    と交換される、請求項1記載の抗体。
38. ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ1ドメインと相同であり、かつKabatによる、該ラク
    ダ科動物Vλドメインの位置L11、L14、L18、L19、L38、L69、L74、L76、又はL80のうちの
    1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ1ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸
    と交換される、請求項37記載の抗体。
39. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項38記載の抗
    体：
    前記L11のアミノ酸が、好ましくはA又はVと交換される；
    前記L14のアミノ酸が、好ましくはA又はT、より好ましくはAと交換される；
    前記L18のアミノ酸が、好ましくはR又はK、より好ましくはRと交換される；
    前記L19のアミノ酸が、好ましくはVと交換される；
    前記L38のアミノ酸が、好ましくはQと交換される；
    前記L69のアミノ酸が、好ましくはTと交換される；
    前記L74のアミノ酸が、好ましくはA又はGと交換される；
    前記L76のアミノ酸が、好ましくはS又はTと交換される；
    前記L80のアミノ酸が、好ましくはS、T、又はAと交換される。
40. 前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ2ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
    ラクダ科動物Vλドメインの位置L3、L8、L14、L15、L17、L18、L39、L42、L47、L58、L59
    、又はL80のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ2ドメイン配列中の対応する位置に
    見られるアミノ酸と交換される、請求項37記載の抗体。
41. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項40記載の抗
    体：
    前記L3のアミノ酸が、好ましくはAと交換される；
    前記L8のアミノ酸が、好ましくはA、P、又はRと交換される；
    前記L14のアミノ酸が、好ましくはSと交換される；
    前記L15のアミノ酸が、好ましくはPと交換される；
    前記L17のアミノ酸が、好ましくはQと交換される；
    前記L18のアミノ酸が、好ましくはSと交換される；
    前記L39のアミノ酸が、好ましくはH又はP、より好ましくはHと交換される；
    前記L42のアミノ酸が、好ましくはK又はT、より好ましくはKと交換される；
    前記L47のアミノ酸が、好ましくはMと交換される；
    前記L58のアミノ酸が、好ましくはVと交換される；
    前記L59のアミノ酸が、好ましくはP又はSと交換される；
    前記L80のアミノ酸が、好ましくはAと交換される。
42. 前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ3ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
    ラクダ科動物Vλドメインの位置L1、L2、L3、L5、L7、L8、L9、L11、L14、L15、L19、L20
    、L44、L46、L49、L60、L66、L67、L69、L70、L71、L72、L76、L78、又はL84のうちの1つ
    又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ3ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交
    換される、請求項37記載の抗体。
43. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項42記載の抗
    体：
    前記L1のアミノ酸が、好ましくはSと交換される；
    前記L2のアミノ酸が、好ましくはYと交換される；
    前記L3のアミノ酸が、好ましくはEと交換される；
    前記L5のアミノ酸が、好ましくはMと交換される；
    前記L7のアミノ酸が、好ましくはD又はPと交換される；
    前記L8のアミノ酸が、好ましくはP、S、L、又はH、好ましくはPと交換される；
    前記L9のアミノ酸が、好ましくはS又はAと交換される；
    前記L11のアミノ酸が、好ましくはVと交換される；
    前記L14のアミノ酸が、好ましくはA又はSと交換される；
    前記L15のアミノ酸が、好ましくはP、L、又はT、好ましくはPと交換される；
    前記L19のアミノ酸が、好ましくはA又はV、好ましくはAと交換される；
    前記L20のアミノ酸が、好ましくはR又はS、好ましくはRと交換される；
    前記L44のアミノ酸が、好ましくはPと交換される；
    前記L46のアミノ酸が、好ましくはLと交換される；
    前記L49のアミノ酸が、好ましくはYと交換される；
    前記L60のアミノ酸が、好ましくはE又はD、より好ましくはEと交換される；
    前記L66のアミノ酸が、好ましくはS、N、又はTと交換される；
    前記L67のアミノ酸が、好ましくはS又はPと交換される；
    前記L69のアミノ酸が、好ましくはT又はNと交換される；
    前記L70のアミノ酸が、好ましくはT、M、又はI、より好ましくはTと交換される；
    前記L71のアミノ酸が、好ましくはA、V、又はTと交換される；
    前記L72のアミノ酸が、好ましくはT又はS、より好ましくはTと交換される；
    前記L76のアミノ酸が、好ましくはS又はT、より好ましくはSと交換される；
    前記L78のアミノ酸が、好ましくはV、A、T、又はI、より好ましくはV又はAと交換され
    る；
    前記L84のアミノ酸が、好ましくはAと交換される。
44. 前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ5ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
    ラクダ科動物Vλドメインの位置L2、L11、L17、L19、L40、L70、L72、又はL80のうちの1
    つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVλ5ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と
    交換される、請求項37記載の抗体。
45. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項44記載の抗
    体：
    前記L2のアミノ酸が、好ましくはPと交換される；
    前記L11のアミノ酸が、好ましくはL、S、又はHと交換される；
    前記L17のアミノ酸が、好ましくはA又はE、より好ましくはAと交換される；
    前記L19のアミノ酸が、好ましくはA又はVと交換される；
    前記L40のアミノ酸が、好ましくはPと交換される；
    前記L70のアミノ酸が、好ましくはA又はT、より好ましくはAと交換される；
    前記L72のアミノ酸が、好ましくはI又はL、より好ましくはIと交換される；
    前記L80のアミノ酸が、好ましくはS又はP、より好ましくはSと交換される。
46. 前記ラクダ科動物VλドメインがヒトVλ8ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
    ラクダ科動物Vλドメインの位置L2、L11、L60、L67、L80、L81、又はL84のうちの1つ又は
    複数のアミノ酸が、ヒトVλ8ドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換さ
    れる、請求項37記載の抗体。
47. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項46記載の抗
    体：
    前記L2のアミノ酸が、好ましくはTと交換される；
    前記L11のアミノ酸が、好ましくはFと交換される；
    前記L60のアミノ酸が、好ましくはDと交換される；
    前記L67のアミノ酸が、好ましくはLと交換される；
    前記L80のアミノ酸が、好ましくはAと交換される；
    前記L81のアミノ酸が、好ましくはDと交換される；
    前記L84のアミノ酸が、好ましくはSと交換される。
48. 前記L103のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項37〜47のいずれか一項記載
    の抗体。
49. 前記ラクダ科動物VLドメインが前記カッパ軽鎖クラス（Vκ）に属し、かつKabatによる
    、該ラクダ科動物Vκドメインの位置K1、K2、K3、K4、K11、K12、K13、K14、K15、K42、K
    43、K70、K77、K79、K80、K83、K7、K9、K14、K18、K36、K46、K63、K19、K39、K45、K58
    、K68、K78、K100、K103、K104、又はK106のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVカッ
    パドメイン配列中の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項1記載の抗体
    。
50. 前記ラクダ科動物VκドメインがヒトVκ1ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
    ラクダ科動物Vκドメインの位置K1、K2、K4、K11、K12、K13、K15、K42、K43、K70、K77
    、K79、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ1ドメイン配列中の対応
    する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項49記載の抗体。
51. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項50記載の抗
    体：
    K2のアミノ酸が、好ましくはD、A、又はNと交換される；
    K4のアミノ酸が、好ましくはM又はLと交換される；
    K11のアミノ酸が、好ましくはVと交換される；
    K12のアミノ酸が、好ましくはKと交換される；
    K13のアミノ酸が、好ましくはKと交換される；
    K15のアミノ酸が、好ましくはV又はT、最も好ましくはVと交換される；
    K42のアミノ酸が、好ましくはKと交換される；
    K43のアミノ酸が、好ましくはA又はV、最も好ましくはAと交換される；
    K70のアミノ酸が、好ましくはD又はE、最も好ましくはDと交換される；
    K77のアミノ酸が、好ましくはS又はC、より好ましくはSと交換される
    K79のアミノ酸が、好ましくはQと交換される；
    K80のアミノ酸が、好ましくはP又はS、最も好ましくはPと交換される；
    K83のアミノ酸が、好ましくはF、I、又はV、最も好ましくはFと交換される。
52. 前記ラクダ科動物VκドメインがヒトVκ2ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
    ラクダ科動物Vκドメインの位置K7、K9、K12、K14、K18、K36、K46、K63、K77、K79、又
    はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ2ドメイン配列中の対応する位置に見ら
    れるアミノ酸と交換される、請求項50記載の抗体。
53. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項52記載の抗
    体：
    K7のアミノ酸が、好ましくはT又はSと交換されている
    K9のアミノ酸が、好ましくはLと交換される；
    K12のアミノ酸が、好ましくはPと交換される；
    K14のアミノ酸が、好ましくはTと交換される；
    K18のアミノ酸が、好ましくはP又はQ、最も好ましくはPと交換される；
    K36のアミノ酸が、好ましくはY、F、又はL、最も好ましくはYと交換される；
    K46のアミノ酸が、好ましくはL又はR、最も好ましくはLと交換される；
    K63のアミノ酸が、好ましくはSと交換される；
    K77のアミノ酸が、好ましくはRと交換される；
    K79のアミノ酸が、好ましくはEと交換される；
    K83のアミノ酸が、好ましくはV又はF、最も好ましくはVと交換される。
54. 前記ラクダ科動物VκドメインがヒトVκ4ドメインと相同であり、かつKabatによる、該
    ラクダ科動物Vκドメインの位置K9、K11、K12、K13、K15、K18、K19、K39、K43、K45、K5
    8、K68、K78、K80、又はK83のうちの1つ又は複数のアミノ酸が、ヒトVκ4ドメイン配列中
    の対応する位置に見られるアミノ酸と交換される、請求項50記載の抗体。
55. 以下のアミノ酸交換のうちの1つ又は複数が行なわれる、請求項1又は請求項54記載の抗
    体：
    K9のアミノ酸が、好ましくはDと交換される；
    K11のアミノ酸が、好ましくはLと交換される；
    K12のアミノ酸が、好ましくはAと交換される；
    K13のアミノ酸が、好ましくはVと交換される；
    K15のアミノ酸が、好ましくはLと交換される；
    K18のアミノ酸が、好ましくはRと交換される；
    K19のアミノ酸が、好ましくはAと交換される；
    K39のアミノ酸が、好ましくはKと交換される；
    K43のアミノ酸が、好ましくはPと交換される；
    K45のアミノ酸が、好ましくはKと交換される；
    K58のアミノ酸が、好ましくはVと交換される；
    K68のアミノ酸が、好ましくはGと交換される；
    K78のアミノ酸が、好ましくはLと交換される；
    K80のアミノ酸が、好ましくはAと交換される；
    K83のアミノ酸が、好ましくはVと交換される。
56. 前記L103のアミノ酸が、好ましくはKと交換される、請求項50〜55のいずれか一項記載
    の抗体。
57. 前記L104のアミノ酸が、好ましくはVと交換される、請求項50〜55のいずれか一項記載
    の抗体。
58. 前記L106のアミノ酸が、好ましくはIと交換される、請求項50〜55のいずれか一項記載
    の抗体。
59. 前記ラクダ科動物VH及び／又はVLドメインが、少なくとも1つの異種CDR、フレームワー
    ク領域、又はそれらの部分を含む、請求項1〜58のいずれか一項記載の抗体。
60. 前記異種CDR又はフレームワーク領域が、齧歯類、ウサギ目動物、ラクダ科動物、霊長
    類、又は軟骨魚類から得られる、請求項59記載の抗体。
61. 前記ヒトVH又はVL（VλもしくはVκ）ドメイン配列が、体細胞突然変異したヒト可変領
    域又はその部分である、請求項1〜60のいずれか一項記載の抗体。
62. 前記ヒトVH又はVL（VλもしくはVκ）ドメイン配列が、コンセンサス配列又はその部分
    を含む、請求項1〜61のいずれか一項記載の抗体。
63. 抗体断片から形成されるFab、Fab'、F（ab'）2、二重特異性Fab'、Fv断片、ダイアボデ
    ィ、線状抗体、単鎖可変断片（scFv）、抗体、又は多重特異性抗体である、請求項1〜62
    のいずれか一項記載の抗体。
64. 非ラクダ科動物抗体由来の少なくとも1つのCH1、CH2、又はCH3ドメインをさらに含む、
    請求項1〜63のいずれか一項記載の抗体。
65. 前記非ラクダ科動物抗体がヒト抗体である、請求項64記載の抗体。
66. IgG、IgM、IgD、IgE、及びIgAからなる群から選択されるヒト重鎖定常領域を含む、請
    求項1〜65のいずれか一項記載の抗体。
67. ヒトカッパ又はラムダ軽鎖定常領域を含む、請求項1〜66のいずれか一項記載の抗体。
68. 前記ラクダ科動物VH及び／又はVLドメインが、ラクダ、リャマ、ヒトコブラクダ、ビク
    ーナ、グアナコ、又はアルパカに由来する、請求項1〜67のいずれか一項記載の抗体。
69. 前記ラクダ科動物VH及び／又はVLドメイン配列が、リャマ又はアルパカに由来する、請
    求項1〜68のいずれか一項記載の抗体。
70. 請求項1〜69のいずれか一項記載の抗体をコードするポリヌクレオチド分子。
71. 宿主細胞又は無細胞発現系での前記抗体の発現を可能にする調節配列に機能的に連結さ
    れた請求項70記載のポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター。
72. 請求項71記載の発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現系。
73. 前記抗体の発現を可能にする条件下で請求項71記載の宿主細胞又は無細胞発現系を培養
    し、かつ発現された抗体を回収することを含む、組換え抗体の産生方法。

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