DE69233628T2

DE69233628T2 - Rekombinante Antikörper zur humanen Therapie

Info

Publication number: DE69233628T2
Application number: DE69233628T
Authority: DE
Inventors: Roland A. San Diego Newman; Nabil Olivenhain Hanna; W. Ronald San Diego Raab
Original assignee: Biogen Idec Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2012-07-25
Also published as: KR0137806B1; PT100735A; AP9200413A0; JPH06509708A; EP0605442A4; BG98411A; SK285960B6; BG62656B1; ES2265005T3; FI940336A; HUT70272A; AU2425592A; CA2114015C; FI940336A0; IL102640A0; SK8894A3; DE69233628D1; RO116404B1; CZ14994A3; WO1993002108A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Diese Anmeldung stellt eine Teilfortsetzung von Newman et al., United States-Patentanmeldung der laufenden Nr. 07/856.281, eingereicht am 23. März 1992, dar, welche eine Teilfortsetzung der US-Patentanmeldung der laufenden Nr. 07/735.064, eingereicht am 25. Juli 1991, darstellt, wobei diese insgesamt, einschließlich der Zeichnungen, jeweils hierin als Verweise aufgenommen sind. Diese Erfindung betrifft für die Humantherapie nützliche rekombinante Antikörper, als auch Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper.
Hintergrund der Erfindung
Monoklonale Maus-Antikörper finden in der Diagnose von Humankrankheiten und beim Lösen von Problemen der biologischen Grundlagenforschung Verwendung. Diese Reagenzien werden auch bei klinischen Studien als Therapeutika für akute, aber auch chronische Humankrankheiten eingesetzt, zu denen Leukämien, Lymphome, feste Tumoren (z.B. Dickdarm, Brust, Leber), AIDS und Autoimmunkrankheiten zählen.
Chimäre Maus/Human-Antikörper wurden geschaffen und der Nachweis erbracht, dass diese die Bindungseigenschaften des parentalen Maus-Antikörpers als auch die mit der humanen konstanten Region verbundenen Effektorfunktionen aufweisen. Siehe z.B. Cabilly et al., US-Patentschrift Nr. 4.816.567; Shoemaker et al., US- Patentschrift Nr. 4.978.745; Beavers et al., US-Patentschrift Nr. 4.975.369 und Boss et al., US-Patentschrift Nr. 4.816.397, die allesamt hierin als Verweise aufgenommen sind. Allgemein werden diese chimären Antikörper durch Herstellen einer genomischen Genbank aus einer DNA konstruiert, die aus bereits vorliegenden murinen Hybridomen extrahiert wird. Nishimura et al., 47 Cancer Research 999, 1987. Die Bank wird dann auf Gene der variablen Region sowohl der schweren als auch der leichten Ketten durchsucht, die das korrekte Rearrangementmuster des Antikörper-Fragments zeigen. Die klonierten Gene der variablen Region werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der klonierte Kassetten des geeigneten Human-Gens der konstanten Region der schweren und leichten Ketten enthält. Die chimären Gene werden dann in einer Zelllinie der Wahl, gewöhnlich einer murinen Myelomlinie, exprimiert.
Solche chimären Antikörper wurden bereits in der Humantherapie eingesetzt. In einer Reihe von Fällen führte dies allerdings zur Produktion von Antikörpern gegen diese chimären Antikörper durch den menschlichen Empfänger. Solche Anti-chimärer Antikörper-Antikörper sind für die fortgesetzte Therapie mit dem chimären Antikörper nachteilig.
Erlich et al., 34 Clinical Chemistry 1681, 1988, Erlich et al., 7 Hybridoma 385, 1988, Erlich et al., 6 Hybridoma 151, 1987 und Erlich et al., 1 Human Antibody Hybridomas 23, 1990 (nicht als Stand der Technik für die vorliegende Anmeldung zugelassen) behaupten, dass monoklonale humane Antikörper eine Verbesserung gegenüber monoklonalen Maus-Antikörpern für die in vivo-Humantherapie darstellen. Sie behaupten außerdem, dass nicht-humane Primaten-Antikörper, z.B. monoklonale Schimpansen-Antikörper, von Menschen tolerierbar wären, da sie den Human-Antikörpern strukturell ähnlich sind. Da Human-Antikörper bei Rhesusaffen nicht-immunogen sind (d.h. keine Antikörperreaktion induzieren), sagen sie voraus, dass Primaten-Antikörper beim Menschen nicht-immunogen sein werden. Sie geben an, dass das Testen der Antikörper beim Menschen nicht erforderlich ist, wenn ein Primaten-Antikörper eine konstante Region mit einer Struktur identisch zu der eines Human-Immunglobulins aufweist oder zumindest eine Struktur, die von einem Human-Immunglobulin nicht unterschiedlicher ist als die Abweichung der verschiedenen Human-Antikörper voneinander. Folglich schlagen sie vor, dass Schimpansen-Antikörper in der Humantherapie nützlich seien.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Amplifikation und Klonierung der Antigenbindenden Abschnitte der die variable Region von Immunglobulin codierenden Gene von Altweltaffen (hierin bezeichnet als „Affe", z.B. Pavian und Makakaffe), die Fusion dieser Gene an klonierte Menschen- oder Schimpansen-Konstantregion-codierende Gene (und Menschen- oder Schimpansen-Framework-codierende Gene, sofern erforderlich) und deren Expression als rekombinante Antikörper. Solche rekombinanten Antikörper (welcher Begriff Antikörper umfasst, die durch Fusion von DNA aus zwei verschiedenen Antikörper-Genen produziert sind) können als immuntherapeutische Mittel für die Behandlung von Erkrankungen des Menschen verwendet werden. Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass evolutionär weit zurückliegende Affen (z.B. Paviane oder Makakaffen (einschließlich Javaneraffen und Rhesusaffen)), anders als Schimpansen, nicht nur verschieden genug vom Menschen sind, um die Zucht von Antikörpern gegen humane Antigene, selbst gegen relativ konservierte humane Antigene, z.B. CD4 und CD54, in diesen Affen zu erlauben, doch ausreichend ähnlich zum Menschen sind, um Antikörper ähnlich den humanen Antikörpern zu enthalten, so dass keine Wirts-Antikörper-Immunreaktion stattfindet, wenn solche Affen-Antikörper, oder davon abstammende rekombinante Antikörper, in einen Menschen eingebracht werden.
Demgemäß wird mit der Erfindung ein chimärer Antikörper bereitgestellt, der spezifisch an ein humanes Antigen bindet, der im wesentlichen nicht-immunogen in einem Menschen ist und der nicht derselbe wie ein Menschen- oder Schimpansen-Antikörper ist, wobei der Antikörper leichte und schwere Polypeptidketten umfasst, die jeweils beinhalten: eine variable Region mit der Aminosäuresequenz einer variablen Region eines Antikörpers eines Altweltaffen, ausgewählt aus Rhesusaffen, Cynomolgusmakaken und Pavianen, und eine konstante Region mit der Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines Antikörpers eines Menschen oder Schimpansen.
Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines chimären Antikörpers der Erfindung in einem pharmazeutisch geeigneten Träger. Ebenfalls bereitgestellt wird eine rekombinante Nukleinsäure, umfassend Nukleinsäuresequenzen, die leichte und schwere Polypeptidketten eines chimären Antikörpers der Erfindung umfasst. Ein chimärer Antikörper, der spezifisch an ein humanes Antigen bindet und im wesentlichen nicht-immunogen in einem Menschen ist, kann mittels eines Verfahrens produziert werden, umfassend das Exprimieren solch einer rekombinanten Nukleinsäure.
Ein chimärer Antikörper der Erfindung kann in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, Störung oder Bedingung verwendet werden, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Krebs, Infektionskrankheit, Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes und einer Autoimmun- oder Entzündungskrankheit, -störung oder -bedingung.
Anders als einige bisher für die Humantherapie verwendete Antikörper leiden die Antikörper der vorliegenden Erfindung nicht unter den folgenden verschiedenen Nachteilen, zum Beispiel 1) Immunogenität und Induktion von humaner Anti-Antikörper-(HAA)-Reaktion auf wiederholte, zur Behandlung chronischer Zustände erforderliche Verabreichung, 2) relativ kurze Halbwertszeit im Vergleich zu humanen Antikörpern und 3) Fehlen der Effektorfunktionen bei humanen Zellen oder Komplement. Das Nichtauftreten dieser Nachteile stellt einen signifikanten Vorteil für die Humantherapie mit den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Antikörpern dar. Zum Beispiel stellt im Falle chronischer Humankrankheiten, einschließlich Autoimmunkrankheiten, oder jeglicher Krankheit, bei der eine längerfristige Verabreichung eines Antikörpers erforderlich ist, eines der Haupthindernisse für eine repetitive Antikörpertherapie die Wirtsreaktion auf den therapeutischen Antikörper dar.
Die Vorhersagbarkeit des Auftretens von HAA-Reaktionen ist oftmals nicht von einem Patienten auf den anderen übertragbar. Solche Reaktionen richten sich hauptsächlich, wenn auch nicht ausschließlich, gegen die konstante Region des Antikör permoleküls, wobei sie, wenn sie einmal auftreten, oftmals jegliche weitere Therapie mit jenem Antikörper oder einem anderen Antikörper desselben Isotyps ausschließen oder dessen Wirksamkeit herabsetzen.
Potentiell könnten die Probleme von HAA durch die Verwendung humaner monoklonaler Antikörper umgangen werden. Dieser Ansatz unterliegt jedoch ethischen, klinischen und immunologischen Beschränkungen bezüglich der Immunisierung menschlicher Patienten mit einer Vielzahl von Antigenen der Wahl (z.B. humanen Antigenen, welcher Ausdruck antigene oder immunogene Anteile jeglicher Proteine, Polypeptide oder ihrer Äquivalente umfasst, die in einem Menschen vorhanden sind) zur Antikörper-Produktion. Der Ansatz der Anmelder zur Umgehung dieses Problems umfasst die Erzeugung von Antikörpern der geeigneten Spezifität und gewünschten Effektorfunktion, als auch deren Verwendung bei der Herstellung rekombinanter Antikörper. Diese rekombinanten Antikörper beinhalten allgemein einen geeigneten Abschnitt der variablen Region eines Antikörpers, der von einem immunisierten Affen stammt, und der konstanten Region eines Antikörpers von einem Menschen oder Schimpansen. So werden die Spezifitäten und hohen Affinitäten der monoklonalen Antikörper beibehalten und können die geeigneten konstanten Regionen vom Mensch oder Schimpansen, die die gewünschten Effektorfunktionen zeigen, ohne weiteres ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung basiert außerdem auf einem Verfahren zur Amplifikation von Affen-Immunglobulin-Genen, z.B. mittels der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction – PCR), aus RNA, die aus Affen-Lymphozyten unter Verwendung synthetischer Oligonukleotid-Primer, die für Genfamilien der variablen Region der Schwer- und Leichtkette spezifisch sind, extrahiert wurde. Die amplifizierten Gene oder geeigneten Abschnitte (z.B. complementarity determining region (CDR)-Kodierregionen; siehe Winter, Britische Patentanmeldung Nr. GB 2188638 A ) werden in einen Expressionsvektor kloniert, der ein Human- oder Schimpansen-Gen der konstanten Region zur Herstellung eines rekombinanten Affe/Human-Antikörpers des gewünschten Isotyps enthält. Diese Antikörper stellen immuntherapeutische Mittel dar, die zur Lokalisierung und/oder Abtötung entsprechender Zielzellen (z.B. Tumorzellen) nach der in vivo-Verabreichung in der Lage sind.
Ein Antigen-Erkennungsabschnitt der variablen Region eines Affen-Antikörper-Gens kann kloniert werden durch Bereitstellen einer Nukleinsäure, zum Beispiel RNA vom Affen, Bilden der cDNA zur RNA (unter Verwendung von reverser Transkriptase), Bereitstellen eines Primers, der zu der cDNA-Sequenz komplementär ist, die eine 5'-Leader-Sequenz des Antikörper-Gens kodiert, Zusammenbringen jener cDNA und des Primers zum Erhalt eines Hybridkomplexes und Amplifizieren der cDNA zur Generierung der Nukleinsäure, die die variable Region des Affen-Antikörper-Gens kodiert.
Mit "Antigen-Erkennungsabschnitt" sind ein oder mehrere Abschnitte einer variablen Region eines Affen-Antikörpers gemeint, der/die für die Bindung und/oder Erkennung des Ziel-Antigens (oder Epitops oder Idiotyps) des Antikörpers verantwortlich ist/sind. Zum Beispiel umfasst er die CDR-Region (siehe unten) oder die gesamte variable Region, oder jegliche Kombination dieser beiden Regionen, einschließlich jeglicher Veränderungen in codierenden Regionen, die induziert werden können, um die Region Menschen-ähnlicher als Affen-ähnlich zu machen, ohne die spezifischen Bindungseigenschaften des Antikörpers zu verändern. Wird lediglich ein Abschnitt der gesamten variablen Region verwendet, so werden die verbliebenen Abschnitte, z.B. die sogenannte „Framework", von einem anderen Antikörper, vorzugsweise einem Menschen- oder Schimpansen-Antikörper, erhalten (siehe unten und in den oben zitierten Quellen).
Die Ausdrücke "variable Region", "Leader-Sequenz", "konstante Region" und "Framework" werden in ihrer im Fachgebiet anerkannten Weise verwendet, wobei Beispiele dafür unten und in den oben zitierten Quellen angegeben sind.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Leader-Sequenz eine humane, Schimpansen- oder Affen-Leader-Sequenz von etwa 60 Basen, wofür Beispiele in 1 angegeben sind.
Der Anmelder hat festgestellt, dass die Affen-, Schimpansen- und Human-Leader-Sequenzen der variablen Region ausreichend ähnlich sind, damit Primer, die zu ei ner davon konstruiert wurden, zur Amplifikation der anderen geeignet sind. Bei dem Verfahren wird die RNA ausreichend amplifiziert, damit genug Nukleinsäure produziert wird, um diese Nukleinsäure in einen Vektor für die spätere Klonierung einbringen zu können.
Ein Antikörper gegen ein humanes Antigen, welcher Antikörper im Menschen nicht immunogen ist, kann durch Züchten in einem Affen eines Affen-Antikörpers gegen das humane Antigen und Isolieren der Affen-Nukleinsäure, die einen Antigen-Erkennungsabschnitt einer variablen Region des Affen-Antikörpers kodiert, erzeugt werden. Humane Nukleinsäure, die eine humane konstante Region eines Antikörpers kodiert, wird bereitgestellt und an die Affen-Nukleinsäure zum Erhalt einer rekombinanten Nukleinsäure ligiert. Diese rekombinante Nukleinsäure wird dann zur Erzeugung des gewünschten Antikörpers exprimiert. Alternativ kann eine Schimpansen- oder Affen-Nukleinsäure, die die konstante Region kodiert, zum Erhalt des rekombinanten Antikörpers verwendet werden. Sofern überhaupt, so liegen nur wenige Unterschiede bei der Aminosäure-Sequenz der konstanten Regionen von Menschen und Schimpansen vor (d.h. sie sind homolog), wobei diese zwischen Menschen und Affen vorhandenen Unterschiede ohne weiteres mittels standardmäßiger Techniken verändert werden können, wenn die für eine konstante Region des Affen kodierende Nukleinsäure zum Erhalt eines rekombinanten Antikörpers verwendet wird. Das wirklich Entscheidende bei der Erfindung liegt in der Erzeugung eines Antikörpers, der weniger immunogen als die konstante Region des Affen ist, so dass keine signifikante Immunantwort erfolgt, wenn der rekombinante Antikörper in einen Menschen eingebracht wird. (Solche Antikörper-Regionen werden hierin als homologe Regionen bezeichnet.) Folglich wird der rekombinante Antikörper technisch so hergestellt, dass er funktionell einem humanen Antikörper in seiner Aminosäuresequenz gleicht, d.h. er eine zur konstanten Region eines Menschen- oder Schimpansen-Antikörpers homologe konstante Region aufweist. Zusammengefasst ist der Antikörper so human wie erforderlich, um die Wahrscheinlichkeit einer unerwünschten immunologischen Reaktion auf den Antikörper zu vermindern, wobei er aber den Antigen-bindenden Abschnitt eines Affen-Antikörpers enthält.
Mit "nicht immunogen" ist gemeint, dass der Antikörper keine Antikörperreaktion von solcher Größe hervorruft, als dass die Effektivität einer fortgesetzten Verabreichung des Antikörpers beim Großteil der Menschen über ausreichend lange Zeit hinweg zur Erzielung einer therapeutischen Wirksamkeit, z.B. im Vergleich zu einem murinen oder chimären Maus/Human-Antikörper, herabgesetzt wäre. Vorzugsweise wird keine Antikörperreaktion beobachtet.
Bei bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren das Immortalisieren einer Zelle des Affen, die für die Erzeugung des Affen-Antikörpers verantwortlich ist, z.B. durch Hybridomfusion, virale Transformation mit Herpes papio, einzelne B-Zell-Klonierung (auch bezeichnet als "transiente Immortalisierung") und Herstellung einer Bank von rekombinanten Immunglobulinen. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren das Auswählen einer B-Zelle des Affen entweder von einem peripheren Blut-Leukozyten, der Milz, dem Knochenmark oder einem Lymphknoten; das Auswählen eines Klons, der den geeigneten Antikörper produziert; das Sicherstellen der Immunglobulin-Gene, die jenen Antikörper kodieren, aus der immortalisierten Zelllinie; und das Reexprimieren der Gene in einer Erzeuger-Zelllinie (d.h. eine Zelllinie, die eine ausreichende Produktion des Antikörpers bewirkt, um für die Humantherapie nützlich zu sein).
Die Erfindung stellt einen rekombinanten Antikörper bereit, der gebildet wird aus der konstanten Region entweder eines Menschen oder Schimpansen, und einem Antigen-Erkennungsabschnitt einer variablen Region vom Affen.
Ebenfalls hierin beschrieben sind ein monoklonaler Antikörper, oder ein Fab, (Fab)₂, ein Leichtketten- oder Schwerketten-Dimer oder irgendein minimales rekombinanten Fragment davon, wie etwa ein Fv oder ein SCA (einzelkettiger Antikörper) oder anderes immunologisch aktives Fragment davon (z.B. eine CDR-Region) gegen ein humanes Antigen, das durch eine immortalisierte Affen-B-Zelle gebildet wird. Solche Fragmente sind als immunsuppressive Agentien nützlich. Alternativ kann an den Antikörper der Erfindung ein Effektor- oder Reporter-Molekül gebunden sein. Zum Beispiel kann an den Antikörper der Erfindung ein Makrocyclus zur Komplexbildung mit einem Schwermetallatom, oder ein Toxin, z.B. Ricin, durch eine kovalente Brücken struktur gebunden sein. Außerdem kann das Fc-Fragment oder die CH3-Domäne eines vollständigen Antikörper-Moleküls durch ein Enzym oder Toxin-Molekül ersetzt sein, und kann ein Teil der Immunglobulin-Kette mit einem Polypeptid-Effektor- oder Reporter-Molekül gekoppelt sein. Auch bispezifische Antikörper können mittels standardmäßiger Verfahrensweisen konstruiert werden.
Bei einer anderen Erscheinungsform werden durch die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, in denen Antikörper der vorliegenden Erfindung für therapeutische oder prophylaktische Anwendungen vorhanden sind. Solche Antikörper können auch als Immuntoxine bereitgestellt werden, d.h. Moleküle, die durch zwei Komponenten gekennzeichnet sind und besonders nützlich zur Abtötung ausgewählter Zellen in vitro oder in vivo sind. Bei einer Komponente handelt es sich um ein zytotoxisches Mittel, das bei Bindung oder Absorbtion an die Zelle gewöhnlich tödlich ist. Die zweite Komponente, bekannt als das "Darreichungsvehikel", bietet ein Mittel zum Transport des toxischen Agens zu einem bestimmten Zelltyp, z.B. Karzinomzellen. Die beiden Komponenten werden gewöhnlich mittels einer aus einer Vielzahl wohlbekannter chemischer oder genetischer Verfahrensweisen chemisch aneinander gebunden. Ist z.B. das zytotoxische Agens ein Protein und die zweite Komponente ein intaktes Immunglobulin, so kann die Verknüpfung mittels heterobifunktionaler Vernetzungsmittel, z.B. Carbodiimid, Glutaraldehyd und ähnlichem erfolgen. Die Herstellung verschiedener Immuntoxine ist im Fachgebiet wohlbekannt.
Bei einer anderen verwandten Erscheinungsform wird mit der Erfindung eine Nukleinsäure bereitgestellt, die für einen rekombinanten Human/Affe-Antikörper kodiert. Bei bevorzugten Ausführungsformen kodiert die Nukleinsäure für eine konstante Region eines Menschen oder Affen und einen Antigen-Erkennungsabschnitt einer variablen Region eines Affen; und wird die Nukleinsäure gereinigt, d.h. von den biologischen Komponenten getrennt, mit denen sie natürlich vorkommt, oder noch bevorzugter als eine homogene Lösung bereitgestellt.
Außerdem hierin beschrieben ist ein CDR-grafted Antikörper, der aus mindestens einer der Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) gebildet ist, das heißt den Aminosäure-Resten (unter Verwendung des standardmäßigen Aminosäure- Markierungssystems von Kabat) 31–35 (CDR 1), 50–65 (CDR 2) und 95–102 (CDR 3) der spezifizierten Schwerkette, und den Aminosäure-Resten 24–34 (CDR 1), 50–56 (CDR 2) und 89–97 (CDR 3) der spezifizierten Leichtkette einer variablen Region eines Altweltaffen, und eines Framework der variablen Region von Immunglobulin von einer zweiten Spezies. Der CDR-grafted Antikörper ist zur Bindung an dasselbe Antigen in der Lage wie der ursprüngliche Affen-Antikörper. Die konstante Region des Antikörpers stammt von menschlichem oder Schimpansen-Immunglobulin. Die Methodologie zur Ausführung dieser Erscheinungsform ist allgemein beschrieben bei Jones et al., 321 Nature 522, 1986. Solche CDR-Grafts können, sofern erwünscht, verändert werden, um sicher zu gehen, dass sie human-ähnlicher erscheinen, so dass die Wahrscheinlichkeit der Initiierung von nachteiligen Reaktionen auf den Antikörper vermindert ist.
Dies kann durch Immortalisation oder Selektion einer Zelle von einem Makak erreicht werden, die für die Produktion von Makaken-Antikörper verantwortlich ist, und Sicherstellen der Immunglobulin-Gene aus der Zelle; Klonieren und Sequenzieren der Antikörper-Gene, die für die Produktion von Antikörper verantwortlich sind, Selektieren einer humanen Framework-Sequenz der variablen Region (vorzugsweise mit der engsten Homologie zum Framework der variablen Region vom Makak); und Substituieren von Makak-CDR-Sequenzen für humane CDR-Sequenzen, und geringfügigere Modifikationen in der humanen Framework-Region können zur Aufrechterhaltung der Affinität des Antikörpers für sein Antigen einbezogen werden.
Mit „geringfügige Modifikationen" ist gemeint, dass weniger als insgesamt etwa 6 Aminosäuren im Framework durch andere Aminosäuren substituiert sein können. Gewöhnlich werden solche Substitutionen oder Modifikationen lediglich dann vorgenommen, wenn jene Aminosäuren an konformationellen Interaktionen beteiligt sind, die das Framework in einer geeigneten Form halten, so dass das gewünschte Antigen durch den Antikörper erkannt wird. Solche Modifikationen werden allgemein jene abweichenden Aminosäuren widerspiegeln, die in einem Affen-Antikörper, verglichen zu einem menschlichen Antikörper, vorhanden sind. Zum Beispiel ist die Aminosäuresequenz eines humanen Antikörpers unmittelbar vor der Schwerketten-CDR 3, 92–94, allgemein Cystein-Alanin-Arginin (Arginin ist in einer Minderheit von Antikörpern als durch Serin oder Threonin ersetzt bekannt); bei einigen Antikörpern im Affen ist die Sequenz Cystein-Alanin-Serin; daher mag es in diesem Beispiel bevorzugt sein, Serin bei Aminosäure 94 zu verwenden (siehe 9D).
Bei einer weiteren Erscheinungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Menschen bereit, der ein bestimmtes Antigen, z.B. ein mit einer Erkrankung assoziiertes Antigen, aufweist. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines rekombinanten Antikörpers, der für das bestimmte Antigen spezifisch ist, wobei der rekombinante Antikörper ein solcher ist, der entweder eine konstante Region vom Menschen oder vom Schimpansen und einen Antigen-Erkennungsabschnitt einer variablen Region vom Affen aufweist, oder eine erste konstante Region vom Affen und einen Antigen-Erkennungsabschnitt einer zweiten, unterschiedlichen variablen Region vom Affen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der obigen Erscheinungsform ist das Antigen ein Tumor-Antigen, ein an einer Immunerkrankung beteiligtes Antigen, ein an einer Autoimmunreaktion beteiligtes Antigen, ein an einer Wirtszelle exprimierter Rezeptor oder ein Antigen, gewählt aus den Human-Antigenen CD58, CLA4 (α4β1-Integrin), CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, humaner T-Zell-Rezeptor, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNFα, TNFβ, Tn-Antigen, IL-1, IL-8, C5a, Adhäsionsmolekülen, z.B. VCAM, CD54, CD28, CD11a, CD11c, CD18 und CD11b, dem neu-Onkogen-Produkt, MDR-1 (P-Glycoprotein), TGFα und seinem Rezeptor, und PDGF; und ist der rekombinante Antikörper entweder darin wirksam, unerwünschte Zellen abzureichern (abzutöten oder zu eliminieren) (z.B. Anti-CD4) durch Wirken mit Komplement oder Killerzellen, oder ist als ein zytotoxisches Agens oder auf eine Fc-Rezeptorbindung durch einen Phagozyten hin wirksam. Alternativ blockiert oder stimuliert der Antikörper die Rezeptorfunktionen oder neutralisiert aktive lösliche Produkte, wie etwa einen oder mehrere der Interleukine, TNF und C5a.
Bei einer anderen Erscheinungsform werden mit der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen der obigen Antikörper oder Fragmente davon bereitgestellt. Die Zusammensetzungen oder Produkte gemäß der Erfindung können in bequemer Weise in Form von zur parenteralen oder nasalen oder oralen Verabreichung geeigneten Lösungen bereitgestellt werden. Geeignete Präparationen des Antikörpers können mit geeigneten Präparationen anderer Agenzien gemischt werden, was einen erhöhten klinischen Nutzen erbringt.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen ersichtlich werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Zunächst sollen kurz die Abbildungen beschrieben werden.
Abbildungen
1 zeigt eine tabellarische Darstellung der 20 Codons in neun unterschiedlichen Ig-Schwerketten-Leader-Sequenzen und zehn Affen-Ig-Schwerketten-Leader-Sequenzen;
2 zeigt eine schematische Darstellung der Struktur verschiedener Ig-Ketten, die die relative Position der Leader-, variablen und konstanten Regionen zu den Positionen der Restriktionsstellen und zur Amplifikation verwendeten Primern zeigt;
3 zeigt eine schematische Darstellung eines Schwerketten-Kassettenvektors zur Expression der humanen oder chimären Antikörper;
4 zeigt eine schematische Darstellung eines Leichtketten-Kassettenvektors zur Expression der humanen oder chimären Antikörper;
5 und 6 zeigen schematische Darstellungen der Vektoren zur Expression von Immunglobulin aus Kappa- bzw. Lambda-Leichtketten-cDNA. Bei diesen Vektoren sind die Immunglobulin-Gene in einer Tandem-Konfiguration unter Verwendung von Neomycinphosphotransferase als dem selektierbaren Marker angeordnet;
7-1, 7-2 und 8 zeigen die Nukleinsäure-Sequenz verschiedener Leader-Sequenz-Primer, die bei der Erfindung nützlich sind (diese Primer in 8 entsprechen den als SEQ. ID Nrn. 1 bis 12 infra aufgelisteten Sequenzen);
9A bis 9H zeigen Vergleiche von Human- und Affen-Regionen in den VH1-, VH2-, VH3-, VH4- und VH5-Sequenzen, bzw. VKI- und VKII- und VlambdaIII-Sequenzen;
10 zeigt einen Vergleich von Human- und Affen-VH3-Sequenzen, bei einem Vergleich zur Human-VH2-Sequenz;
11 zeigt eine graphische Darstellung der Bindung eines Antikörpers der Erfindung an ein Human-CD4-Antigen;
12 zeigt eine graphische Darstellung der Hemmung der Bindung von 1F3 durch den in 10 gezeigten Antikörper;
13 und 14 zeigen Abschnitte der Nukleotidsequenzen von Anti-CD4-VH- bzw. VL-Regionen;
15 zeigt ein Diagramm der Anti-CD54-Aktivität; und
16 zeigt ein Histogramm eines Vergleichs der Merkmale der Plasmid-Expression.
Affen-Antikörper
Zu Altweltaffen zählen als Paviane und Makakaffen (einschließlich Rhesusaffen und Javaneraffen) bezeichnete Affenarten. Mit dieser Erfindung wird die Anwendung der beanspruchten Erfindung bei verschiedenen Affen-Genen ausführlich erläutert. Diese Beispiele sollen die Erfindung nicht beschränken und können ohne weiteres auch auf andere Altweltaffen übertragen werden.
In 2 ist in schematischer Form die allgemeine Struktur der Gene gezeigt, die die Immunglobulin-Schwerkette, Kappa-Leichtkette und Lambda-Leichtkette kodieren. Jede dieser Ketten ist mit einem ATG-Startcodon versehen, gefolgt von einer Leader-Sequenz von etwa 60 Basen Länge, einer Region, die für eine variable Region des Immunglobulins kodiert, und einer konstanten Region jenes Immunglobulins. Beispiele der verschiedenen Leader-Sequenzen, oder Signalpeptide, der schweren Ketten sind in 1 gezeigt. Diese Sequenzen, ebenso wie ihr Äquivalent im Affen, können mittels standardmäßiger Techniken bestimmt werden, wie sie einem Fachmann des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis wohlbekannt und nachstehend beschrieben sind.
Die im unteren Abschnitt der 1 gezeigten Sequenzen sind humane Leader-Sequenzen. Die Anmelder haben entdeckt, dass die Konstruktion von zu diesen Leader-Regionen komplementären Primern die Amplifikation der Ig-Gene von Affen zulässt. Entsprechend können Primer, die zu den Affen-Leader-Sequenzen homolog sind (siehe z.B. oberer Abschnitt der 1) zur Amplifikation von Affen-Immunglobulin-Genen, ebenso wie zur Amplifikation humaner Immunglobulin-Gene, verwendet werden.
Durch Verwendung solcher Primer bei standardmäßigen Amplifikationsverfahren lassen sich Gene, die für verschiedene Affen-Immunglobulin-Gene kodieren, ohne weiteres isolieren und die Sequenzen bestimmen, die für die variablen Regionen der Antikörper kodieren. Beispiele dieser Verfahrensweisen sind nachstehend angegeben. Die Ergebnisse der weiter unten gezeigten Analyse sind in 9A bis 9H und in 10 dargestellt. Überraschenderweise stellten die Anmelder fest, dass trotz der Erzeugbarkeit von Antikörpern gegen relativ konservierte humane Antigene in den Affen die variablen regionalen Framework-Sequenzen der derart erzeugten Antikörper von jenen der humanen Antikörper nicht unterscheidbar waren. Das heißt, der Umfang der bei Affen festgestellten Variabilität der Immunglobulin-Sequenz war ähnlich dem bei Menschen festgestellten Umfang, und es war unmöglich, zu bestimmen, welcher Antikörper von einem Menschen oder einem Affen abstammte, ohne die Quelle selbst zu analysieren.
So wurde zum Beispiel und bezugnehmend auf 10 die Aminosäure-Sequenz der VH3-Region des Menschen mit der des Affen verglichen. Die humanen Antikörper ergaben einen Homologiebereich untereinander von 83 bis 98 %, während die des Affen zu 90 bis 95 % homolog zu der humanen VH3-Region waren. Im Gegensatz dazu war die humane VH2-Region zu der humanen VH3-Region zu 60 % homolog. [Bei dieser Abbildung, ebenso wie in den anderen Abbildungen, ist das Vorliegen derselben Aminosäure an einer bestimmten Lokalisation durch einen Strich angegeben, das Vorliegen einer unterschiedlichen Aminosäure dagegen durch den standardmäßigen Einbuchstabencode. Positionen, denen keine Konsensus-Aminosäure zugeordnet werden kann, sind als ein X gezeigt.] Entsprechend ist die Homologie für VH1, VH2, VH3, VH4 und VH5, und für VKI und VKII und VlambdaIII jeweils in 9A bis 9H gezeigt. Auch hier wurde eine signifikante Homologie zwischen der Affen-Immunglobulin-Region und der des Menschen in jeder variablen Region, einschließlich der Sequenzen der Immunglobulin-J-Regionen, beobachtet. Eine derart hohe Homologie entspricht der unter den humanen Antikörpern beobachteten Homologie.
Die Methodik, mittels derer die Sequenzen bestimmt wurden, ist nachstehend in den Beispielen dargestellt. Fachleute des Gebiets werden bei üblicher Sachkenntnis erkennen, dass diese Beispiele für diese Erfindung nicht beschränkend sind und äquivalente Ergebnisse und monoklonale und chimäre Antikörper mittels ähnlicher Verfahrensweisen erhalten werden können, wie sie einem Fachmann des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis wohlbekannt sind. Siehe zum Beispiel US-Patentschriften Nrn. 4.816.567; 4.978.745; 4.975.369; 4.816.397, supra. Zum Beispiel ist nach dem Klonieren eines Gens, das eine variable Region beim Affen kodiert, dieses Gen ohne weiteres an ein Gen ligierbar, das eine konstante Region beim Affen oder Menschen kodiert, und die fusionierten Gene in einer Erzeuger-Zelllinie zum Erhalt des gewünschten Antikörpers exprimierbar. Weiter unten sind Beispiele für diese Verfahrensweisen wiedergegeben.
In den folgenden Beispielen umfasst der erste Verfahrensschritt die Isolierung der Gesamt-RNA aus peripherem Blut oder Milzzellen eines Affen. Die B-Zellen von immunisierten Affen können aus peripherem Blut oder Lymphknoten gewonnen und direkt verwendet werden oder können vorzugsweise expandiert werden. Die Expansion kann eine Herpes papio-Virustransformation, eine Fusion an eine heterologe Myelomzelle mit anschließender Selektion oder eine Klonierung einzelner B-Zellen unter beschränkter Verdünnung in Gegenwart stimulierter humaner T-Zellen umfassen.
Die Gesamt-RNA wird dann zu einzelsträngiger (single stranded-ss) cDNA mittels reverser Transkriptase unter Verwendung nicht-spezifischer (Oligo-dT oder zufälliger (random) Hexamere) oder spezifischer (Immunglobulin-CH1 oder CK oder CLambda-Konstantregion) Oligonukleotid-Primer umgewandelt. Die durch diese Reaktion erzeugte einzelsträngige cDNA wird unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert, wobei ss cDNA, zusammen mit Desoxynukleotidtriphosphaten, einer DNA-Polymerase (z.B. einer wärmestabilen Polymerase) und spezifischen Primern zur Amplifikation von Immunglobulin-Genen der variablen Region der schweren oder leichten Kette verwendet werden. Bei den verwendeten Primern handelt es sich um einzelsträngige synthetische Oligonukleotide im Mengenbereich von 20 bis 40 Basen, die einige degenerierte Basen umfassen, die an die Immunglobulin-5'-Leader-Sequenzen binden. Sechs verschiedene 5'-Leader-Sequenz-Primer (siehe 7-1, die eine Restriktionsenzym-Schnittstelle (z.B. SalI umfasst)) wurden zur Amplifikation der Affen-Genfamilien der variablen Region der schweren Kette ausgehend von ihrer Ähnlichkeit zu den Human-Genfamilien der variablen Region der schweren Kette designed. Mit jedem der sechs 5'-Leader-Sequenz-Primer wird ein 3'-Primer verwendet, der spezifisch für die Konstantregiondomäne des relevanten Isotyps (z.B. IgG, IgM, IgA oder IgE) ist und außerdem eine Restriktionsenzym-Schnittstelle (z.B. NheI) umfasst. Entsprechend werden für Affen-Kappa- und -Lambda-Leichtketten andere Primer-Paare zur Amplifikation der entsprechenden variablen Region der Leichtkette eingesetzt (7-2).
Weitere Primer-Paare können verwendet werden, um unterschiedliche, einzigartige Restriktionsspaltstellen einzubauen, die eine gerichtete Klonierung der PCR-amplifizierten DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, der dieselbe Restriktionsspaltstelle besitzt, ermöglichen. Ein Primer-Paar, das an das 3'-Ende der Antikörper-Schwerketten-Leader-Sequenz bindet und eine Mlu1-Stelle umfasst, oder ein Primer-Paar, das an die ersten 23 Basen des Framework bindet, wobei einer eine XhoI-Stelle umfasst, können ebenfalls Verwendung finden und sind in 7-1 beschrieben. Die Affen-Immunglobulin-Gene der variablen Region der Schwer- und Leichtkette können direkt nach der PCR-Amplifikation in einen Pendelvektor kloniert werden, um weitere molekulare Manipulationen zu ermöglichen, sofern erforderlich, oder können direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden, der humane Gene der konstanten Region der Schwer- oder Leichtkette enthält. Die molekulare Konfiguration der Immunglobulin-Gene im Expressionsvektor kann eine genomische sein, in der immunglobulinäre Promotor/Enhancer und andere regulatorische Regionen vorhanden sind, ebenso wie Spleiß-Donor/Akzeptor-Sequenzen an der Intron/Exon-Grenze. Alternativ können chimäre Immunglobulin-Gene in eine cDNA-Konfiguration unter Verwendung heterologer viraler Promotor/Enhancer-Sequenzen inseriert werden.
Beispiel 1: Sequenz von Affen-Antikörpern
In 7 und 8 sind die Primer mit bzw. ohne Restriktionsstellen gezeigt, die bei der PCR-Amplifikation der Immunglobulin-Gene von Affen- und/oder Human-cDNAs verwendet werden. Die Einzelheiten der angewandten Verfahrensweisen sind nachstehend angegeben. Die RNA wurde aus den Milz-, peripheren Blut- und Lymphknoten-Zellen von Affen unter Anwendung der standardmäßigen Guanidinisothiocyanat-Methode isoliert. Die mittels dieser Methode isolierte gesamte RNA-Fraktion wurde dann als eine Matrize für die anschließenden Amplifikationreaktionen verwendet. Eine Teilmenge der RNA wurde in Gegenwart von 200 Einheiten reverser Transkriptase von Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus und nicht-spezifischen (Oligo-dT oder zufälligen (random) Hexameren) oder spezifischen (Immunglobulin-IgG-CH1-Region oder Kappa-Ketten-Konstantregion-CK) Oligonukleotid-Primern (50 bis 100 Pikomol) zur Erzeugung eines nicht-kodierenden Sense-cDNA-Einzelstrangs inkubiert. Die mittels dieser Reaktion erhaltene einzelsträngige cDNA wurde dann unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Eine Teilmenge der einzelsträngigen cDNA wurde mit Desoxynukleotidtriphosphaten (20 μM), einer wärmestabilen DNA-Polymerase (2 bis 5 Einheiten) und human-abgeleiteten synthetischen Oligonukleotid-Primern (50 Pikomol) zur Amplifikation von Immunglobulin-Genen der variablen Region entweder der Schwer- oder der Leichtkette inkubiert.
Unter Verwendung der in 8 gezeigten Primer-Paare wurden mehrere repräsentative Javaneraffen-Immunglobulin-Sequenzen der variablen Region der Schwer- und Leichtketten von einer Reihe von Genfamilien amplifiziert. Diese amplifizierten Sequenzen wurde in die EcoRV-Stelle des Plasmidvektors p-Bluescript (pBS, beziehbar von Stratagene, CA) kloniert und für die DNA-Sequenzierung verwendet. Die DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung der Plasmid-DNA, die das klonierte Insert als eine doppelsträngige DNA-Matrize enthielt, und der standardmäßigen Kettenabbruch-Sequenziermethode durchgeführt.
Die repräsentativen Javaneraffen-Immunglobulin-Sequenzen sind in 9A bis 9H gezeigt. Ebenfalls enthalten in 9A bis 9H sind die Konsensus-Aminosäure-Sequenzen der variablen Region von Human-Genen, die jede der varia blen Regionen der Gen-Hauptfamilien repräsentieren. Die prozentuale Homologie jeder Affensequenz mit der humanen Konsensus-Sequenz, ausschließlich der Konstantregiondomäne und der CDR-Regionen, ist gezeigt. Der Grad der Homologie zwischen den Menschen- und Affensequenzen für eine gegebene Familie ist ebenso hoch wie zwischen zwei Humansequenzen innerhalb jener Familie. Daher ist die Unterscheidung zwischen der variablen Region von Immunglobulin-Sequenzen, die von Altweltaffen stammen, und jenen, die von Menschen stammen, lediglich auf der Basis von Sequenzvergleichen möglich.
Isolierung der RNA
Affen-Antigen-spezifische B-Zellen wurden auf mehrere Weisen erhalten: durch Fusion immunisierter Affen-Lymphknoten-Zellen an die Human/Maus-Heteromyelom-Fusionspartner-Zelllinie K5H6/B5 und anschließendes Screening der Hybridomlinien, durch viral transformierte B-Zellen oder durch in vitro Einzel-B-Zell-Kloniertechniken. In letzterem Fall wurde das Wachstum einer einzelnen Affen-B-Zelle in vitro durch gleichzeitige Kultivierung mit humanen T-Zellen gefördert, die durch Antikörper stimuliert wurden. Eine einzelne B-Zelle wurde in jeden Trog einer 96-Well-Gewebekulturplatte zusammen mit etwa 150.000 Anti-CD3-stimulierten Mytomycin-C-behandelten humanen T-Zellen eingebracht. Nach einer zweiwöchigen Inkubationsperiode expandierte die einzelne B-Zelle auf mindestens 200 differenzierte Plasmazellen. Der Kulturüberstand aus diesen Trögen wurde auf das Vorhandensein von Immunglobulin mittels ELISA-Technik unter Verwendung eines Einfang-Antikörpers von Ziege-Anti-Affe-Immunglobulin untersucht.
Die Zellen entweder von Antigen-spezifischen viral transformierten Zellen oder Hybridomen wurden in ausreichenden Zahlen zur Extraktion der RNA gezüchtet. Die Tröge aus der in vitro-Einzel-B-Zell-Kloniertechnik, die Immunglobulin-positiv waren, wurden entfernt, zweimal mit kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5, gewaschen und zentrifugiert (1000 × g, 10 Min). Die gewaschenen Zellen wurden in 100 μl Lyselösung (4 M Guanidinisothiocyanat, 25 mM Natriumcitrat, pH 7,0, 0,5 % Natriumsarcosin, 0,1M 2-Mercaptoethanol) suspendiert. 10 μl an 2M Natriumacetat, pH 4,0, wurden zugegeben und gemischt. Das Protein wurde durch Zugeben von 100 μl Wasser/gesättigtem Phenol, Mischen und Zugeben von 20 μl Chloro form/Isoamylalkohol (49:1) entfernt. Nach Verwirbeln und Inkubieren auf Eis für 15 Minuten wurden die Proben bei 10.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde auf ein neues Röhrchen übertragen, mit einem gleichen Volumen an Isopropanol gemischt und 1 Stunde lang bei –20°C inkubiert. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 Minuten abgesammelt, mit 70 % Ethanol gewaschen, nochmals zentrifugiert und das Pellet in einem Speedivac (Savant) getrocknet. Die getrocknete RNA wurde ein zweites Mal in 100 μl Lysepuffer gelöst. Ein gleiches Volumen an Isopropanol wurde zugegeben und bei –20°C eine Stunde lang inkubiert. Das Präzipitat wurde mittels Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 Minuten abgesammelt und mit 70 % Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde in einem Speedivac (Savant) getrocknet und bei –20°C in 70 % Ethanol bis zur Verwendung gelagert.
Synthese von einzelsträngiger cDNA
Die gesamte RNA, die aus den aus einem einzigen Trog stammenden Zellen extrahiert wurde, wurde in 32 μl zweifach destilliertem Wasser gelöst, dem 1 μl (50–100 Pikomol) an Primer (entweder zufällige Hexamere, Oligo-dT oder 3'-Immunglobulinspezifische Primer) und 10 μl an 5 × reverse Transkriptase-Puffer (0,25 Tris-HCl, pH 8,3, 0,375 M KCl, 15 mM MgCl₂, 50 mM Dithiothreitol) zugegeben wurde. Das Gemisch wurde bei 65°C 5 Minuten lang erhitzt, woraufhin es 2 Minuten lang in Eis plaziert wurde. Nach dem Erhitzen wurde 1 μl RNAsin (Promega), 5 μl an 5 mM Desoxynukleotidtriphosphaten und 1 μl (200 Einheiten) an reverser Transkriptase von Moloney-Mäuse-Leukämie-Virus (BRL) zugegeben und das Gemisch bei 37°C 1,5 Stunden lang inkubiert. Nach Abschluss der reverse Transkriptase-Reaktion wurde das einzelsträngige cCNA/RNA-Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch eine 1 ml G-25-SEPHADEX-Spinsäule passiert. Das durch diese Säule wandernde Material wurde als Matrizen-ss cDNA für die PCR-Amplifikation verwendet.
Amplifikation von ss cDNA
3 bis 10 μl der ss cDNA wurden mit 10 μl 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl₂), 1,6 μl an 1,25 mM Desoxynukleotidtriphosphaten, 50 Pikomol an spezifischem Immunglobulin-5'-Primer, 50 Pikomol an spezifischem Immunglobulin-3'-Primer und 2 bis 5 Einheiten wärmestabiler DNA-Polymerase (Synthetic Genetics) gemischt. Das Reaktionsvolumen wurde mit Wasser auf 100 μl ge bracht und mit 100 μl Mineralöl überdeckt. Das Reaktionsgemisch wurde bei den folgenden Temperaturen über die spezifizierte Dauer hinweg inkubiert.
94°C für 1 Minute
48°C für 2 Minuten
72°C für 2 Minuten
Dieser Zyklus wurde 30 bis 35-mal wiederholt. Die amplifizierten Produkte wurden mittels Agarosegel-Elektrophorese unter Verwendung eines 1,2 % Agraosegels und Molekulargewichts-Standardgrößen untersucht. Die amplifizierten Immunglobulin-Gene der variablen Region betrugen etwa 350 bis 500 bp-Marker. Die PCR-amplifizierten Produkte wurden dann zur Klonierung in den geeigneten Plasmidvektor verwendet.
Beispiel 2: Klonierung von Affen-Antikörper-Genen
Da die Affen-Gensequenzen der variablen Region auf der cDNA-Ebene nicht von den humanen Mitgliedern der entsprechenden Genfamilie unterscheidbar sind, ist es unwahrscheinlich, dass Immunantworten auf Affe/Human-chimäre Antikörper, sofern sie auftreten, sich irgendwie von denen unterscheiden, die gegen humane Antikörper-Moleküle gerichtet sind.
Die PCR-Technologie kann genützt werden, um spezifische Restriktionsenzym-Schnittstellen, einschließlich (doch nicht beschränkt auf) SalI, BglII, KpnI und NheI, in die Sequenzen der variablen Region von Altweltaffen während der PCR-Amplifikationsreaktion unter Verwendung von Primern einzuführen, die auf den in 6 gezeigten basieren. Bereits vorliegende klonierte Gene wurden aus ihrem spezifischen Vektor unter Verwendung dieser Primer amplifiziert, um die spezifische Restriktionsstelle einzuführen, welche anschließend zur Klonierung des Gens in einen Expressionsvektor genutzt wurde. Alternativ wurden diese Primer zur direkten Amplifikation aus zellulärer RNA verwendet.
Die Expressionsvektoren, die konstruiert wurden, entsprechen zwei Typen. Der erste (siehe 3 und 4) erlaubt die Einführung von kloniertem Affen-cDNA-Immunglobulin der variablen Regionen in einen Kassettenvektor unter Verwendung einzigartiger Restriktionsspaltstellen, wobei die Immunglobulin-Genelemente in einer genomischen Konfiguration angeordnet sind. Diese Art von Vektor beinhaltet einen Immunglobulin-Promotor, die beiden Exons, die die Immunglobulin-Leader-Sequenz ausmachen, zwei Klonierstellen SpeI und NheI, flussabwärts gelegene Spleiß-Donor-Sequenzen, eine Immunglobulin-Enhancer-Region, ein Human-Konstantregion-Gen (Schwer- oder Leichtkette) und flussabwärts gelegene Polyadenylierungssignale. Außerdem enthalten sie einen bakteriellen Replikationsursprung, ein Beta-Lactamase-Gen für die bakterielle Selektion und ein Neomycinphosphotransferase-Gen für die G418-Selektion oder ein Xanthin-Guaninphosphoribosyltransferase-(Gpt)-Gen für die Mycophenolsäure-Selektion in Säugerzellen. Die Schwer- und Leichtketten-Expressionsvektoren verwenden Neomycinphosphotransferase-(Neo)- bzw. Xanthin-Guaninphosphoribosyltransferase-(gpt)-Gene als den selektierbaren Marker.
Der zweite Typ von Expressionssystem (siehe 5 und 6) verwendet Immunglobulin-Gene in einer cDNA-Konfiguration. Das heißt, keine Introns oder Spleißstellen sind zwischen der 5'-Leader-Sequenz und den 3'-Konstantregion-Sequenzen vorhanden. Dieser Typ von Vektor verwendet heterologe virale Promotor/Enhancer-Sequenzen, die in einer Tandem-Weise angeordnete Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten-Gene, Polyadenylierungs-Sequenzen und einen selektierbaren Säugerzell-Marker (Neo) antreiben. Das Neo-Gen kann zur Abschwächung seiner Translation modifiziert werden, zum Beispiel durch Austauschen des Codons flussaufwärts und angrenzend an die Startstelle des Gens von ACC zu TCT. Außerdem ist ein Dihydrofolatreduktase-(dhfr)-Gen zur anschließenden Genamplifikation mit Methotrexat vorhanden. Affen-Immunglobulin-Gene der variablen Region, die in cDNA-konfigurierte Expressionsvektoren kloniert werden sollen, wurden entweder aus bereits vorhandenen klonierten Sequenzen im Pendelvektor (PBS) amplifiziert oder direkt aus RNA mit Primern, die entweder die Restriktionsstellen SalI oder MluI und NheI für die Schwerkette enthielten oder BglII und KpnI oder BsiWI für die Kappa- oder Lambda-Leichtketten. Weitere potentielle einzigartige Restriktionsspaltstellen sind jedoch nicht ausgeschlossen.
Chimäre Schwer- und Leichtketten-Immunglobulin-Gene wurden separat oder sequentiell (für genomisch konfigurierte Konstrukte) oder auf demselben Vektor (für cDNA-konfigurierte Konstrukte) mittels Elektroporation in eine Erzeuger-Zelllinie eingeführt. Die Elektroporation wurde zur Einführung linearisierter DNA-Konstrukte in entweder Chinesischer Hamster-Ovar-(CHO)-Zellen oder Mäuse-Myelomzellen, gefolgt von Einzelzellklonierung der Transfektanden in 96-Well-Gewebekulturplatten eingesetzt. Die Elektroporations-Bedingungen unter Verwendung eines BTX-100-(BTX, San Diego)-Elektroporationsgeräts und einer 1-ml-Einweg-Plastikküvette ergaben optimale Zahlen an Transfektanden aus einer gegebenen Menge an Vektor-DNA. Die CHO-Zellen, die zum Wachsen in Suspension in Serum-freiem Medium (CHO-S SFM II minus Hypoxanthin und Thymidin, Gibco) adaptiert waren, wurden in Konstrukten verwendet, die virale regulatorische Elemente enthielten.
Subklonierung von Ig-Genen der variablen Region
Die Produkte der PCR-Reaktion wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch eine 1 ml SEPHADEX G-25-Spinsäule passiert. Sollte das DNA-Fragment stumpfendig in ein Plasmid kloniert werden, so wurden 1 μl an 1 M MgCl₂, 0,5 ml 1,25 mM Desoxynukleotidtriphosphate und 1 μl Klenow-DNA-Polymerase (5 Einheiten) dem gesamten PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) zugegeben und bei 37°C 15 Minuten lang inkubiert, um jegliche 5'-Überhänge aufzufüllen. Vor der stumpfendigen Klonierung in ein Plasmid wurden die 5'-Enden wie folgt phosphoryliert: 5 μl an 10 mM ATP, 1 μl an T4 Polynukleotid-Kinase (10 Einheiten) wurden dem gesamten Reaktionsgemisch zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die amplifizierten Fragmente, die interne Restriktionsstellen enthielten, wurden zunächst mit dem geeigneten Restriktionsenzym gerschnitten und zur Ligation ohne Phosphorylierung direkt verwendet. In beiden Fällen wurde das zu klonierende Fragment mit Phenol/Chloroform vor der Ligation in den geeigneten Vektor extrahiert.
Vor der Ligationsreaktion wurden 10 % des phosphorylierten oder Restriktionsenzym-geschnittenen PCR-amplifizierten Fragments mit etwa 2 ng des geeigneten Vektors (Gesamtvolumen 8 μl), der zuvor mit dem/n Restriktionsenzym(en) verdaut worden war, gemischt. Für die stumpfendige Klonierung wurde mit EcoRV verdautes pBluescript verwendet. Für die klebrigendige Klonierung wurde der Vektor TCAE 5.2 oder 6.0 oder pGenex-H oder pGenexL, geschnitten mit den geeigneten Restriktionsenzymen, verwendet. 1 μl an 10 × Ligationspuffer (500 mM Tri-HCl, pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 10 mM Dithiothreitol), 1 μl T4-DNA-Ligase (1 Einheit) wurde zugegeben und die Reaktion bei 14°C über Nacht ablaufen gelassen. Das ligierte Material wurde zum Transformieren der kompetenten E. coli-HB101-Zellen unter Anwendung der standardmäßigen Calciumchlorid-Transformationsmethode verwendet. Die transformierten Bakterien wurden durch Zucht auf LB-Ampicillin-enthaltenden Agarplatten selektiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und über Nacht in LB-Medium, enthaltend Ampicillin und unter Anwendung der standardmäßigen alkalischen Lysemethode extrahierte Plasmid-DNA, gezüchtet. Nach der Restriktionsanalyse zur Bestimmung der Klone, die Immunglobulin-Inserte enthielten, wurde die DNA zur Sequenzierung präpariert.
Sequenzierung der klonierten Gene
Klonierte Immunglobulin-Gene der variablen Regionen wurden unter Anwendung eines standardmäßigen Kettenabbruch-Verfahrens sequenziert. Doppelsträngige Plasmid-DNA, die das klonierte Insert enthielt, wurde als Sequenziermatrize verwendet. Vor der Sequenzierung wurde doppelsträngige DNA chemisch denaturiert. Die DNA wurde unter Verwendung der T7-DNA-Polymerase SEQUENASE (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), radiomarkierter Alpha-DesoxyATP und der folgenden Sequenzier-Primer sequenziert: (5' CAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3') und (5' GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3') für das Immunglobulin-Gen der variablen Region der Schwerkette in 5' nach 3'- bzw. 3' nach 5'-Richtung. (5' CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3') und (5' GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3') für das Immunglobulin-Lambda-Gen der variablen Region der Leichtkette in 5' nach 3'- bzw. 3' nach 5'-Richtung. Die Reaktionsprodukte wurden auf 6 % Polyacrylamidgelen aufgetrennt und abgelesen.
Die Ergebnisse der Sequenzierung einer Reihe von Altweltaffen-Immunglobulin-Genen der variablen Regionen von Schwer- und Leichtketten sind in 9A bis 9H zusammengestellt. Die Klonierung und Sequenzierung von Javaneraffen-Immunglobulin-Genen wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben, noch war es bisher möglich, den Grad der Homologie zwischen humanen und Javaneraffen-V- Region-Genen zu definieren. Die Homologie zwischen einem einzelnen Schimpansen-Lambda-Gen der variablen Region und seinem human-genomischen Gegenstück wurde beschrieben und mit einer Differenz in den Framework-Regionen von lediglich 2 % aufgezeigt.
Transfektion und Selektion
Nach der Sequenzierung der klonierten Gene der variablen Region der schweren und leichten Kette wurden diese zur Expression in geeignete Vektoren subkloniert. Hierbei kann es sich um Vektoren handeln, die mit regulatorischen Immunglobulin-Elementen in einer genomischen Konfiguration (wie in 3 und 4 gezeigt) oder mit viralen regulatorischen Elementen unter Verwendung einer cDNA-Konfiguration (5 und 6) konstruiert werden. Die geeigneten Restriktionsstellen (SpeI und NheI) können in die PCR-Amplifikations-Primer während des einleitenden Amplifikationsschritts designed werden, oder es können umgekehrt Amplifikations-Primer, die Restriktionsstellen enthalten, zur Amplifizierung der Immunglobulin-Gene aus den Pendelvektoren, in die sie kloniert wurden, verwendet werden. Alternativ können Immunglobulin-Gene der variablen Region nach der PCR-Amplifikation aus RNA direkt in Expressionsvektoren kloniert werden, so dass eine Subklonierung überflüssig wird.
Elektroporation
Die Elektroporation wurde entweder zur gleichzeitigen Transfizierung genomischer Konstrukte der Schwer- und der Leichtkette oder zur sequentiellen Transfizierung der genomischen Konstrukte der Schwer- und der Leichtkette in Sp2/0-Zellen angewandt. Bei den sequentiellen Transfektionen folgte der Elektroporation des chimären Leichtketten-Konstrukts eine Selektion in Mycophenolsäure. Das Durchsuchen der Kulturüberstände von Klonen, die in 96-Well-Platten zur Leichtketten-Produktion mit Antiseren gegen Human-Gene der konstanten Region der Leichtkette unter Anwendung einer ELISA-Technik gezüchtet worden waren, erlaubte die Selektion der im höchsten Grade Leichtketten-exprimierenden Klone. Die anschließende Elektroporation der Leichtketten-Transfektanden mit einem Vektor, der das chimäre Affe/Human-Schwerketten-Immunglobulin-Konstrukt enthielt, ermöglichte die Selektion der Transfektomas, die den chimären Antikörper von gewünschter Spezifität und Isotyp exprimieren.
Das Leichtketten-Konstrukt pGENEX-L (3 und 4) wurde in die murine Myelom-Zelllinie Sp2/0 mittels Elektroporation wie folgt transfiziert. Sp2/0-Zellen in einer Konzentration von 1 × 10⁷/ml in Transfektionspuffer (272 mM Sucrose, 7 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM MgCl₂) wurden mit 50 μg pGENEX-L, enthaltend das entsprechende klonierte Leichtketten-Gen, das zuvor durch Verdau mit dem Restriktionsenzym PvuII linearisiert worden war, gemischt. Die Zellen wurden in eine 1 ml-Einweg-Spektrophotometrie-Kunststoffküvette eingebracht, und es wurden Plattenelektroden im Abstand von 3,5 mm in die Küvette eingeführt. Unter Verwendung eines BTX-100-(BTX, Inc.)-Transfektionsapparates wurde den Zellen ein Strompuls von 500 Mikrosekunden verabreicht, so dass etwa bei 50 % ein Zelltod eintrat. Dieser Wert wurde vor der Transfektion durch Pulsen der Zellen in Abwesenheit der DNA bei steigenden Spannungen und durch Messen der Zellzahlen, die 24 Stunden später überlebt hatten, bestimmt. Spannung versus Zelllebensfähigkeit wurde schematisch aufgetragen und die Spannung entsprechend einem 50 % Zelltod für alle anschließenden Elektroporations-Experimente angelegt. Unter Verwendung des BTX-100-Apparates wurde der optimale Wert als ein Puls bei einer Amplitude von 200 über 500 Mikrosekunden hinweg befunden. Nach dem Pulsen der Zellen durften sich diese auf Eis 15 Minuten lang erholen, bevor sie auf 96-Well-Gewebekulturplatten in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM), enthaltend 5 % fötales Kälberserum und 10 % SP2/0-konditioniertes Medium, übertragen wurden. Die Zellen wurden bei einer Konzentration ausplattiert, bei der ein Zellwachstum in etwa 1 von 3 Trögen nach der Selektion mit dem geeigneten Inhaltsstoff zu erkennen war. Dieser Parameter wurde für jedes Elektroporations-Experiment durch Ausplattieren variierender Zahlen der elektroporierten Zellen pro Trog (1000–10.000) und Auswählen der Zellen, die das Plasmid inkorporiert hatten, bestimmt. Die Anzahl der Tröge auf jeder Platte, die ein Zellwachstum zeigte, wurde nach 2 bis 3 Wochen der Selektion gezählt. Auf diese Weise wurde die entsprechende Zahl der Zellen, die 1 von 3 positiven Trögen bei einer gegebenen Konzentration eines bestimmten Plasmids ergaben, zur Verwendung in weiteren Experimenten bestimmt.
Direkt nach der Elektroporation wurden die Zellen in Medium ohne Inhaltsstoff eingebracht. Zwei Tage nach der Elektroporation wurde frisches Medium zugegeben, das entweder G418 oder Mycophenolsäure für Zellen enthielten, die eine Neomycinphosphotransferase- bzw. Guanasylphosphotransferase-Aktivität zeigten. Die Zellen wurden alle zwei Tage für die erste Woche und danach zweimal wöchentlich gefüttert. Die Konzentration des zu verwendenden Inhaltsstoffs wurde durch Inkubieren der Zellen in Gegenwart steigender Konzentrationen des Inhaltsstoffs und Überwachen der Zelllebensfähigkeit bestimmt. Die Konzentration des verwendeten Inhaltsstoffs betrug das Zweifache dessen, was eine 100%ige Abtötung ergab. Für Sp2/0 war etwa 1 μg Mycophenolsäure/ml erforderlich und für G418 etwa 800 μg/ml.
Die Zellen wurden in mehreren Weisen elektroporiert, wobei entweder genomische Schwer- und Leichtketten-Vektoren (pGenex-H und pGenex-L) gemeinsam elektroporiert oder die Leichtkette alleine elektroporiert wurde. In letzterem Fall wurden die Klone auf eine hochgradige Expression der chimären Immunglobulin-Leichtkette unter Anwendung einer ELISA-Technik gescreent. Diese Klone wurden dann gezüchtet und mit Schwerkette-enthaltendem Vektor elektroporiert. Wurden cDNA-Tandem-Genkonstrukte verwendet, so wurde der Expressionsvektor (TCAE5.2 oder TCAE6) durch Verdau mit dem Restriktionsenzym NotI zunächst linearisiert. Eine einzige Elektroporation reichte aus, um die Integration sowohl der Schwer- als auch Leichtketten-Gene zu erzielen. Nach 2 bis 3 Wochen wurden die Überstände von Trögen, die in Gegenwart des geeigneten Inhaltsstoffs ein weiteres Wachstum zeigten, auf die Sekretion der chimären Immunglobulin-Leichtkette oder des Gesamt-Immunglobulins unter Anwendung einer ELISA-Technik untersucht. Die Immunglobulin-Gene in einer cDNA-Konfiguration wurden entweder in Sp2/0-Zellen, wie oben beschrieben, oder in Chinesischer Hamster-Ovar-(CHO)-Zellen, die für ein Wachstum in Suspension in Serum-freiem Medium adaptiert waren, elektroporiert. Die CHO-Zellen wurden unter Verwendung eines BTX 600-Elektroporations-apparates elektroporiert, der auf Bedingungen zur Erreichung der maximalen Zahlen an G418-resistenten Kolonien eingestellt war. Diese waren 210 Volt, 400 μF und 13 Ohm. Nach der Elektroporation wurden die Zellen gezählt, in Transfektionspuffer gewaschen, in demselben Puffer resuspendiert und 15 Minuten lang auf Eis plaziert. Die Zellen wurden auf 1 × 10⁷ Lebendzellen/ml eingestellt, und 400 μl der Zellsuspension wurden in eine sterile 0,4 ml-Einwegküvette (BTX Inc.) eingebracht. 25 μg an Not1-linearisierter TCAE 5.2- oder TCAE 6-Vektor-DNA, enthaltend die klonierten Makak-Immunglobulin-Gene der variablen Region, wurden in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) bei 1 μg/ml resuspendiert und der Zellsuspension zugegeben. Die Elektroporation wurde durch Entladen des Apparates durch Betätigen des automatischen Lade- und Pulsknopfes vorgenommen. Die Küvette wurde 15 Minuten lang auf Eis plaziert, die Zellen in 120 ml Serum-freiem Medium verdünnt und in sechs 96-Well-Platten (200 μl pro Trog, enthaltend etwa 6,667 elektroporierte oder 3,333 Lebendzellen pro Trog) eingebracht. Für diese Zelllinie wurden unabhängige Elektroporations-Parameter bestimmt, wobei die Selektion durch G418 400 μg/ml betrug.
Screening auf die Produktion von Antikörpern
Das Vorhandensein des durch die Transfektanden sekretierten Human-, Affe- oder chimären Antikörpers wurde mittels einer ELISA-Technik wie folgt analysiert: 96-Well-Flachbodenplatten (Dynatech) wurden mit Ziege-Anti-Human-IgG oder Kappa bei 200 ng/Trog in Beschichtungspuffer (Natriumcarbonat 0,8 mg/ml, Natriumbicarbonat 1,55 mg/ml, pH 9,6) beschichtet und mindestens 16 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Der Beschichtungspuffer wurde entfernt und die Tröge mit 120 μl Blockierpuffer (1 % Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,2 % Natriumazid) blockiert und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Bis zu 125 μl des Zellkultur-Überstands wurden den Blockierpuffer enthaltenden Trögen zugegeben und dies 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann fünfmal mit PBS gewaschen. 100 μl Meerrettichperoxidase-markiertes Ziege-Anti-Human-IgG (oder Kappa), verdünnt 1 : 1000 bis 1 : 5000 in Verdünnungspuffer (1 % Rinderserumalbumin, 0,05 % Tween-20, 0,02 % Natriumazid in PBS) wurden zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert, dann fünfmal mit PBS gewaschen. Der chimäre Antikörper wurde mit 100 μl Wasserstoffperoxid und dem Substrat, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (1:1 Vol/Vol), pro Trog nachgewiesen. Die Farbreaktion wurde nach 2 bis 5 Minuten mit 100 μl an 2M Schwefelsäure pro Trog beendet.
Fachleute des Gebiets sind bei üblicher Sachkenntnis durchaus in der Lage, gleichwertige andere Methoden wie die oben beschriebenen durchzuführen. Zu Beispielen solcher Techniken zählen die Immortalisierung der ausgewählten B-Zellen durch Hybridomfusion, wie oben beschrieben, mit der Zelllinie K5H6/B5, wie beschrieben bei Carroll et al., 164 J. Experimental Medicine 1566, 1986, oder einer äquivalenten Zell linie, wie z.B. SPAZ4 (beziehbar von Sandoz, siehe Ehrlich et al., 34, Clin. Chem. 1681, 1988). Ähnliche Zelllinien lassen sich mittels standardmäßiger Techniken unter Anwendung öffentlich zur Verfügung stehender Methoden ohne weiteres konstruieren. Alternativ können Immunglobulin-Gene kloniert werden aus: (a) Zellen, die durch virale Transformation mit Herpes papio unsterblich gemacht wurden, wie beschrieben bei Markova et al., 30 Vopr Virusol 549, 1985, oder mit einem äquivalenten Virus, (b) durch einzelne B-Zellklonierung, um eine transiente Immortalisierung zu erreichen, wie beschrieben bei Amaroso und Lipske 145 J. Immunology 3155, 1990, oder (c) durch Verwendung einer rekombinanten Immunglobulin-Bakteriophagenbank, wie beschrieben bei Huse et al., 246 Science 1275, 1989, und McCafferty et al., 348 Nature 552, 1990. Das Durchsuchen auf geeignete Antikörper-enthaltende Klone kann mittels der oben beschriebenen Techniken vorgenommen werden, oder mittels einem Fachmann des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis wohlbekannter äquivalenter Techniken, und das gewünschte Immunglobulin-Gen kann dann aus der immortalisierten Zelllinie sichergestellt werden. Außerdem kann der durch isolierte Affen-B-Zellen erzeugte Antikörper in der Humantherapie Verwendung finden, ohne dass zum Erhalt eines chimären Antikörpers manipuliert wird.
Die humane konstante Region kann mittels standardmäßiger Techniken mit jeglichem gewünschten, einem Fachmann des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis wohlbekannten Isotop erhalten werden, und die variable Region des Affen-Antikörpers mit dieser humanen konstanten Region ligiert werden. Zu besonders nützlichen chimären Antikörpern gegen spezifische Zelloberflächenrezeptoren, die in der Immuntherapie von Menschen Verwendung finden können, zählen CD4, ICAMs, CD19, CD20, CD8, CD11a, CD11b, CD28, CD18, CD45, CD71 und TCR.
Beispiel 3: Klonierung und Exprimierung eines chimären Affe/Human-Antikörpers mit Spezifität für CD4
Bei folgendem handelt es sich um ein spezifisches Beispiel der Methoden und Antikörper dieser Erfindung.
Erzeugung der unsterblich gemachten Affen-B-Zelllinien
Ein erwachsener Javaneraffe (White Sands New Mexico Primate Center) wurde intramuskulär an vielfältigen Stellen mit 150–300 μg löslichem CD4 (sCD4) oder Zellmembranen (1 × 10⁸ Zellen) aus der CD4-positiven Zelllinie supT1 unter Verwendung eines standardmäßigen Adjuvans immunisiert. Die Immunisierung wurde alle 2 bis 3 Wochen insgesamt sechsmal wiederholt. Der Affe erhielt eine Auffrischungsinjektion von 100 μg sCD4 in die Leistengegend einer Hüfte, woraufhin eine Woche später der ableitende Lymphknoten aus derselben Hüfte operativ entfernt wurde. Die Lymphozyten wurden aus dem Lymphknoten durch Schneiden des Gewebes in Scheiben und Spülen mit sterilem DMEM-Medium entfernt. Die Zellsuspension wurde durch eine Nylongaze passiert und mittels Zentrifugation bei 1000 × g über 10 Minuten hinweg abgesammelt.
Etwa 1 × 10⁸ Lymphozyten wurden in Trisammoniumchlorid-Puffer (16 mM, pH 7,5) suspendiert und auf 37°C für 5 Minuten zur Lyse der Erythrozyten erwärmt. Die Lymphozyten wurden mittels Zentrifugation abgesammelt und in L-Leucinmethylester (LME) resuspendiert und bei 37°C für 45 Minuten inkubiert. Die LME-behandelten Zellen wurden durch ein Nylonsieb filtriert und zentrifugiert. 1 ml fötales Kälberserum wurde zugegeben, die Zellen suspendiert und zweimal in Serum-freiem RPMI gewaschen. Die Zellen wurden gezählt und in einem einzelnen konischen 50 ml-Zentrifugierröhrchen zusammen mit einer gleichen Anzahl an K6H6/B5-Heteromyelomzellen gemischt, die zweimal in Serum-freiem Medium vorgewaschen worden waren. Die Zellen wurden in 1 ml 50%igem PEG (Polyethylenglycol) vorsichtig suspendiert, wobei sie unter leichtem Rühren über einen Zeitraum von 1 Minute langsam zugegeben wurden. Die Zellen wurden dann durch Zugabe von 20 ml Serum-freiem Medium über einen Zeitraum von 5 Minuten unter vorsichtigem Vermengen zum Herauslösen des PEG resuspendiert. Nach zweimaligem Waschen mit Serum-freiem Medium wurden die Zellen bei einer Konzentration von 5 × 10⁵/0,1 ml in RPMI-Medium, das 20 % fötales Kälberserum und Gentamycin enthielt, resuspendiert und in 96-Well-Mikrogewebekulturplatten zu 0,1 ml pro Trog eingebracht. Ein gleiches Volumen an HAT-Medium (0,1 ml) wurde jedem Trog zugegeben, woraufhin die Hybride 14 bis 17 Tage lang vor dem Screening wachsen konnten.
Screening der fusionierten Zellhybride auf die Erzeugung von Anti-CD4
Der Assay zur Bestimmung der Anti-CD4-Spezifität war der folgende: ELISA-Platten wurden mit rekombinantem sCD4 bei einer Konzentration von 100 ng pro Well beschichtet und mit 1 % Rinderserumalbumin in PBS blockiert. Teilmengen von 50 μl des Hybridom-Überstands wurden aus jedem Trog entnommen und mit den sCD4-beschichteten Platten für 60 Minuten inkubiert. Die Bindung wurde durch Inkubation mit ¹²⁵I-markiertem Ziege-Anti-Human- oder Ziege-Anti-Affe-Ig für 60 Minuten nachgewiesen. Nach viermaligem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Tröge in einem Gammazähler ausgezählt. Positive Tröge wurden im Duplikat nochmals untersucht und die Hybridomzellen aus diesen Trögen dreimal subkloniert, und zwar zunächst bei 5 Zellen pro Trog, dann zweimal bei 1 Zelle pro Trog. In diesem Stadium wurden Anti-sCD4-Positive auf ihre Bindungsfähigkeit an Zelloberflächen-CD4 gescreent. Dies erfolgte durch Hemmung der Bindung eines monoklonalen Anti-CD4-Maus-Antikörpers, bezeichnet als 1F3, an die CD4-positive Zelllinie supT1. Kurz gesagt wurde dies durch gemeinsame Inkubation unterschiedlicher Mengen des Affen-Anti-CD4 und 10 ng des ¹²⁵I-markierten 1F3 mit 3 × 10⁵ supT1-Zellen/Trog in einer 96-Well-Platte vorgenommen. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur (etwa 20 bis 25°C) wurden die Zellen durch Vakuum auf Glasfaserfiltern entfernt. Nach ausführlichem Waschen mit PBS wurden die Filter in einem Gammazähler ausgezählt, um die Hemmung der 1F3-Bindung an die supT1-Zellen durch die Affen-hybridom-Überstände zu bestimmen.
Ein Kandidat-Klon wurde ausgewählt, der einen Antikörper erzeugte, der eine starke Inhibition gegen 1F3 zeigte. Der gewählte Klon wurde unter Verwendung von humanen Isotypisier-Reagenzien isotypisiert und als ein IgG2, das eine Lambda-Leichtkette besaß, befunden. Diese Zelllinie wurde zu größeren Anzahlen für die Klonierung seiner Immunglobulin-Gene herangezüchtet.
Klonierung der Schwer- und Leichtketten-Gene der variablen Region von immortalisierten Affen-B-Zellen
Die Gesamt-RNA wurde aus 1 × 10⁷ immortalisierten Affen-B-Zellen unter Anwendung der oben beschriebenen Guanidinisothiocyanat-Methode isoliert. Ein Zehntel der Gesamt-RNA wurde zur Erzeugung einzelsträngiger cDNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Oligonukleotid-Primers und reverser Transkriptase, wie ebenfalls oben beschrieben, verwendet. Ein Zehntel der Menge der ss cDNA wurde zur Durchführung der PCR-Reaktionen verwendet. Die sechs PCR-Reaktionen enthielten jeweils einen von sechs 5'-V_H-Familien-spezifischen Oligonukleotid-Primern, die eine SalI-Restriktionsstelle enthielten, zusammen mit einem IgG-3'-Konstantregion-Oligonukleotid, das eine NheI-Stelle enthielt, wie beide in 7-1 gezeigt. Entsprechend wurden fünf PCR-Reaktionen unter Verwendung von einem von fünf 5'-Lambda-Leader-Sequenz-Oligonukleotid-Primern, der eine BglII-Stelle enthielt, und einen 3'-Lambda-Konstantregion-Primer, der eine AvrII-Stelle enthielt, vorgenommen. Die Reaktionsbedingungen waren wie oben beschrieben. Jede PCR-Reaktion wurde im Triplikat vorgenommen. Die Produkte jeweils der Schwerketten- und Leichtketten-Amplifikationsreaktionen wurden auf 1,2 % Agarosegelen ablaufen gelassen. Der VH4-Schwerketten-Primer (SEQ. ID. NR. 13: 5' ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') und Lambda-Primer (SEQ. ID. NR. 14: 5' ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3') ergaben starke Bande bei der Agarosegel-Elektrophorese. Die Produkte dieser Reaktionen wurden zur Klonierung in den Vektor TCAE 6 verwendet, welcher Human-IgG1 und Human-Lambda-Konstantregion-Sequenzen enthält.
Die Klonierung der beiden Gene der variablen Region in den Expressionsvektor TCAE 6 wurde sequentiell vorgenommen. Zunächst wurden das Schwerketten-PCR-Produkt und der Vektor TCA6 mit den Restriktionsenzymen SalI und NheI verdaut, die Produkte mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch eine SEPHADEX-G-25-Spinsäule passiert. Das PCR-Produkt wurde an den Schnittvektor über Nacht bei 14°C in Gegenwart von T4-DNA-Ligase ligiert. Etwa 500 ng Gesamt-DNA wurden in einem Volumen von 10 μl bei einem Insert/Vektor-Molverhältnis von 10:1 ligiert. Das ligierte Material wurde zum Transformieren der XL-1-Blue-kompetenten Zellen (Stratagene) verwendet und die transformierten Zellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 μg/ml Ampicillin, ausplattiert. Die Kolonien der Ampicillin-resistenten Bakterien wurden herausgesucht und als 5 ml-Minikulturen gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde aus jeder dieser Kulturen mittels einer standardmäßigen alkalischen Lysemethode extrahiert, mit den Restriktionsenzymen SalI und NheI geschnitten und die Produkte auf einem 1,2 % Agarosegel ablaufen gelassen. Die Plasmide mit Inserten von 450 bp wurden als Matrizen für die anschließende Klonierung der variablen Regionen der Leichtketten verwendet. Die Produkte der Leichtketten-PCR-Reaktion als auch das Plasmid, das das Schwerketten-Insert enthielt, wurden mit den Restriktionsenzymen BglII und AvrII geschnitten und zusammen ligiert. Die Plasmid-Minikulturen wurden durch Schneiden mit BglII und AvrII gescreent. Die Produkte aus dem Verdau, die ein Insert von 400 bis 450 bp ergaben, wurden als positiv bewertet. Die Plasmide, die sowohl SalI/NheI als auch BglII/AvrII-Inserte enthielten, wurden zu größeren Quantitäten für die DNA-Sequenzierung vermehrt.
Die chimären Tandem-Antikörper-Expressionsvektoren TCAE 5.2 und TCAE 6 stammten vom Vektor CLDN, der selber ein Derivat des Vektors RLDN10b ist (253 Science 77–79, 1991). RLDN10b wiederum ist ein Derivat des Expressionsvektor TND (7 DNA 651–661, 1988).
RLDN10b unterscheidet sich vom Vektor TND in folgenden Aspekten. Die Dihydrofolat-Reduktase-(DHFR)-Transkriptionskassette (Promotor, cDNA und Polyadenylierungsregion) wurde zwischen die Gewebeplasminogen-Aktivatorkassette (t-PA-Expressionskassette) und die Neomycinphosphotransferase-(NEO)-Kassette eingebracht, so dass alle drei Kassetten in Tandem und in derselben transkriptionalen Orientierung vorlagen. Außerdem wurde der DHFR-Genpromotor in CLDN durch den Maus-beta-Globin-major promoter ersetzt (3 Mol. Cell Biol. 1246–54, 1983) und die t-PA-cDNA durch einen Polylinker ersetzt. Alle drei eukaryontischen Transkriptionskassetten (Expression, DHFR, NEO) können von der bakteriellen Plasmid-DNA (pUC9-Derivat) durch Verdau mit der Restriktionsendonuklease NotI getrennt werden.
CLDN weicht von RLDN10b ab, da der Rous-LTR vor dem Polylinker durch den humanen Zytomegalovirus-immediate early-Gen-Promotor/Enhancer ersetzt wurde (41 Cell, 521, 1985).
Die Expressionsvektoren TCAE 5.2 und TCAE 6 unterscheiden sich von CLDN darin, dass:

1) sie vier Transkriptionskassetten (anstelle von drei) in Tandem-Reihenfolge enthalten: (a) Eine humane Immunglobulin-Leichtketten-Konstantregion, die über Amplifikation von cDNA mittels einer Polymerase-Kettenreaktion erhalten wird. In TCAE 5.2 ist dies die humane Immunglobulin-Leichtketten-Kappa-Konstantregion (Kabat-Nummerierung: Aminosäuren 108–214, Allotyp Km3), und in TCAE 6 ist dies die humane Immunglobulin-Leichtketten-Lambda-Konstantregion (Kabat-Nummerierung: Aminosäuren 108–215, Genotyp Oz minus, Mcg minus, Ke minus-Allotyp). (b) Eine humane Immunglobulin-Schwerketten-Konstantregion; in beiden Konstrukten war die humane Immunglobulin-Schwerkette eine Gamma-1-Konstantregion (Kabat-Nummerierung: Aminosäuren 114–478, Allotyp Gm1a, Gm1z), die über eine Amplifikation von cDNA mittels einer Polymerase-Kettenreaktion erhalten wurde. (c) DHFR; enthält ihren eigenen eukaryontischen Promotor und Polyadenylierungsregion. (d) NEO; enthält ebenfalls ihren eigenen eukaryontischen Promotor und Polyadenylierungsregion.
3) die humanen Immunglobulin-Leicht- und Schwerketten-Kassetten synthetische Signalsequenzen für die Sekretion der Immunglobulinketten enthalten.
4) die humanen Immunglobulin-Leicht- und Schwerketten-Kassetten spezifische DNA-Linker enthalten, die die Insertion von Immunglobulin der variablen Regionen der Leicht- und Schwerketten erlauben, die das translationale Leseraster beibehalten und die die normalerweise in Immunglobulinketten vorzufindenden Aminosäuren nicht verändern. Die Einbeziehung der beschriebenen Veränderungen führte zur Konstruktion der Vektoren TCAE 5.2 und TCAE 6. Die Klonierung der Immunglobulin-Gene der variablen Region der Leicht- und Schwerketten aus der Anti-CD4-Heterohybridom-Zelllinie E9.1 in TCAE 6 führte zu dem Konstrukt, der in der ATCC hinterlegt ist. Der Konstrukt, der hinterlegt wurde, umfasst die Javaneraffen-Immunglobulin-Gene der variablen Region der Schwerkette und die Javaneraffen-Immunglobulin-Gene der variablen Region der Leichtkette, deren Sequenzen in 13 bzw. 14 gezeigt sind, und zwar kloniert aus der Anti-CD4-Hybridom-Zelllinie E9.1. Die Schwerketten-Konstantregion ist von humanem Ursprung des Gamma-1-Isotyps und Gmla, Gmlz-Allotyps. Die Lambda-Leichtketten-Konstantregion ist ebenfalls von humanem Ursprung des Oz minus, mcg minus-Genotyps und Ke minus- Allotyps. Die Immunglobulin-Gene sind in den Säuger-Expressionsvektor TCAE 6 kloniert, wie in 6 gezeigt, der bei Elektroporation in die Säuger-Zelllinie CHO einen chimären Affe/Human-Anti-CD4-Antikörper erzeugte. Das hierin beschriebene DNA-Konstrukt wurde zur Transformation des Bakterienstamms XL-1 Blue verwendet, im Antibiotikum Ampicillin selektiert und als eine Bakterienzellsuspension in sterilem LB-Medium, enthaltend 15 % Glycerol, hinterlegt.

Ein weiteres nützliches Expressionssystem ist ein solches, bei dem das für einen selektiven Marker kodierende Gen auf eine höhere Ausbeute an rekombinanten Systemen, die für eine gewünschte Sequenz kodieren, hin modifiziert ist. Zum Beispiel führt eine Beeinträchtigung der Translationsinitiation eines dominanten selektierbaren Markers zu einer geringeren Zahl Wirkstoff-resistenter Kolonien im Vergleich zu einem nicht-beeinträchtigten Vektor, doch exprimiert jede einzelne Kolonie signifikant höhere Mengen an colinked Genprodukt als beim unbeeinträchtigten Vektor. So stellt zum Beispiel die Translationsinitiation den ersten Schritt der Proteinsynthese dar. Die Translationsinitiationsstelle des Neomycinphosphotransferase-Gens (G418-Resistenzgen) wurde von einer Kozak-Konsensussequenz (Sequenz-ccAccATGG) gegen eine schwache Kozak-Konsensussequenz (Sequenz-ccTccATGC) ausgetauscht. Die Beeinträchtigung der Translationsinitiation des G418-Resistenzgens führte zu: 1) einer signifikanten (5-fachen) Abnahme der Zahl der G418-resistenten Kolonien, wie aus einer gleichen Menge an pro Zelle transfizierter Plasmid-DNA erhalten, und 2) einer signifikanten Zunahme der Menge an in jedem Klon exprimiertem colinked Genprodukt. In den Klonen, die die Kozak-Konsensussequenz enthielten, erzeugten 73 % der gescreenten Kolonien weniger als 25 ng/ml, bei lediglich 3 % mit mehr als 100 ng/ml. Bei Klonen mit der veränderten, schwächeren Kozak-Konsensussequenz erzeugten 8 % der gescreenten Kolonien weniger als 25 ng/ml, im Vergleich zu 63 % der Kolonien mit mehr als 100 ng/ml. Spezifisch gesagt und wie in 16 gezeigt (worin TCAE 5.2 eine Kozak-Konsensussequenz und TCAE 12 eine schwächere Kozak-Konsensussequenz aufweist) wurden 258 Kolonien aus 2 Elektroporationen von 25 μg der DNA erhalten, welche ein Neomycinphosphotransferase-Gen mit einer Konsensus-(unverändert)-Translationsstartstelle enthält. 201 dieser Kolonien (78 %) exprimierten keinerlei nachweisbares Genprodukt (d.h. < 25 ng/ml des chimären Immunglobulins), und lediglich 8 Kolonien (3 %) exprimierten mehr als 100 ng/ml. 98 Kolonien wurden aus 6 Elektroporationen von 25 μg DNA hergeleitet, welche das Neomycinphosphotransferase-Gen mit einer veränderten Translationsstartstelle enthält. 63 % dieser Kolonien exprimierten mehr als 100 ng/ml, und lediglich 8 % dieser Kolonien exprimierten weniger als 25 ng/ml.
DNA-Seguenzierung
Plasmid-DNA wurde aus 100-ml-Kulturen präpariert. Sie wurde durch Ausfällen (1 Volumeneinheit) mit einem Gemisch aus 2,5 M Natriumchlorid und 20 % Polyethylenglycol (6 Volumeneinheiten) auf Eis für 15 Minuten weiter gereinigt. Nach der Zentrifugation bei 10.000 × g für 20 Minuten wurde das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, nochmals zentrifugiert und in einer Speedivac (Savant) getrocknet. Das Pellet der DNA wurde in entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 150 bis 250 μg/ml resuspendiert. Die Sequenzierung wurde an 5 μg der doppelsträngigen DNA unter Anwendung der Technik von Sanger vorgenommen. Sequenzier-Primer, die homolog zu Sequenzen innerhalb des Expressionsvektors flussaufwärts und flussabwärts entweder der Leichtketten- oder der Schwerketten-Inserte waren, wurden verwendet. Die Inserte wurden sowohl in 5' nach 3'- als auch 3' nach 5'-Richtungen sequenziert. Zwei Klone der Anti-CD4-Leichtkette und zwei Klone der Anti-CD4-Schwerkette, die jeweils aus separaten PCR-Reaktionen erzeugt wurden, wurden parallel sequenziert, um zu bestimmen, ob irgendwelche Nukleotid-Veränderungen während der PCR-Reaktion eingeführt worden waren. Beide gewählten Schwerketten- als auch beide Leichtketten-Klone wurden über ihre gesamte Länge hinweg als identisch befunden, was bestätigte, dass keine Fehler während des Amplifikationsvorgangs aufgetreten waren. Die Sequenzen der Anti-CD4-Schwer- und Leichtketten sind in 13 und 14 und in der Sequenzliste als Nrn. 15 und 16 gezeigt.
Expression des chimären Affe/Human-Anti-CD4
Die Expressionsvektoren TCAE 5.2 und TCAE 6 sind nicht nur für eine stabile integrierte Expression in die Zelllinien Sp2/0 und CHO verwendbar, sondern, da sie den SV40-Ursprung enthalten, auch vorübergehend in der Zelllinie COS exprimierbar. Die COS-Zellexpression wurde wie folgt vorgenommen: Die COS-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion so ausgesät, dass sie am folgenden Tag zu 50 bis 70 % konfluent sein würden. Das Kulturmedium wurde entfernt und die Zellen zweimal mit Transfektionspuffer (TB – 140 mM NaCl, 25 mM Tris, 5 mM KCl, 0,5 mM Na₂HPO₄, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂) gewaschen. 30 μg des Cäsiumchloridgereinigten TCAE 6-Plasmids, enthaltend die chimären Anti-CD4-Affe/Human-Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten, wurden mit 3 ml DEAE-Dextran pro Schale gemischt (1 mg/ml in TB). Die DNA wurde mit den Zellen 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die DNA-Lösung wurde entfernt und durch 3 ml 20 % Glycerol für 1,5 bis 2,5 Minuten ersetzt, woraufhin die Zellen zweimal mit TB gewaschen wurden. Die Zellen wurden in 5 ml frischem Medium, enthaltend 100 μg Chloroquin, für 3 bis 5 Stunden bei 37°C inkubiert, woraufhin sie zweimal mit Medium gewaschen und mit normalem DMEM 72 Stunden lang inkubiert wurden. Der Überstand (100 μl) von den transfizierten COS-Zellen wurde bei verschiedenen Verdünnungen auf das Vorhandensein von Antikörper mittels einer auf ELISA basierenden Technik untersucht. Ziege-Anti-Human-Lambda wurde zur Beschichtung von 96-Well-Assayplatten und ein Peroxidase-markiertes Ziege-Anti-Human-IgG als der Detektions-Antikörper unter standardmäßigen ELISA-Bedingungen verwendet. Von den COS-Zellen wurde festgestellt, dass sie 10 bis 40 ng/ml an chimärem Affe/Human-Antikörper produzieren. Größere Volumina des Überstandes wurden 10-fach konzentriert und in einem Direktbindungs-RIA an CD4-positive supT1-Zellen verwendet. Der parentale Voll-Affen-Antikörper und ein irrelevantes Human-Immunglobulin wurden als positive bzw. negative Kontrollen verwendet (11). Weiterhin wurden der Affe-Anti-CD4 und der chimäre Affe/Human-Anti-CD4 zur Hemmung der Bindung eines Hochaffinitäts-Maus-Anti-CD4-(1F3)-Antikörpers verwendet (12). Es ist zu erkennen, dass der rekombinante Affe/Human-Antikörper nicht nur an CD4-positive Zellen bindet, sondern auch zur Hemmung der Bindung von 1F3 an CD4-positive Zellen in etwa denselben Konzentrationen des vollständigen Affen-Antikörpers oder 1F3 selbst fähig ist.
Im folgenden wird ein Beispiel für die Methoden und Antikörper dieser Erfindung gegeben.
Beispiel 4: Erzeugung von Affen-Antikörpern gegen humane Lymphozyten-Antigene
Ein erwachsener Javaneraffe (White Sands New Mexico Primate Center) wurde intramuskulär an vielfältigen Stellen mit 5 × 10⁸ Gesamt-CD54-positiven humanen Lymphozyten immunisiert. Die verwendeten Zellen waren alternierend SB-Zellen (humane B-lymphoide Linie) und aktivierte periphere humane Lymphozyten, wie durch Präinkubieren mit einem Gemisch aus Phytolacca-Mitogen (2,5 mg/ml), Phorbolmonoacetat (40 nM) und Phytohämagglutinin (4 mg/Trog) unter Einbeziehung eines standardmäßigen Adjuvans aktiviert. Die Immunisierung wurde alle 2 bis 3 Wochen über einen Zeitraum von 8 Monaten wiederholt. Die Seren der immunisierten Tiere wurden zu verschiedenen Zeitpunkten anhand der Hemmung der Bindung eines murinen Antikörpers, 84H10, dessen Bindungsfähigkeit an ICAM-1 bekannt ist, gescreent. Eine sättigende Menge an 84H10 wurde an Chinesischer Hamster-Ovarzellen (CHO), die zuvor mit einem Expressionsvektor transfiziert worden waren, der humane CD54 c-DNA enthielt und wegen seiner hohen Expression des Zelloberflächen-CD54 ausgewählt worden war, zusammen mit steigenden Verdünnungen des Affenserums gebunden. Die Inhibition der 84H10-Bindung ist in 15 gezeigt.
Weitere monoklonale Maus-Antikörper, die andere humane Lymphozyt-Antigene erkennen, wurden anhand der Hemmung unter Verwendung von Affenseren getestet, die mittels derselben Immunisierungsmethoden erhalten worden waren.
Verwendung
Die in oben beschriebener Weise oder mittels äquivalenter Techniken erzeugten Antikörper können durch eine Kombination von Affinitäts- und Größenausschluss-Chromatographie zur Charakterisierung bei funktionellen biologischen Assays gereinigt werden. Diese Assays umfassen die Bestimmung der Spezifität und Bindungsaffinität als auch der mit dem exprimierten Isotyp, zum Beispiel ADCC, verbundenen Effektorfunktion oder Komplementfixierung. Solche Antikörper können als passive oder aktive therapeutische Mittel gegen eine Vielzahl von Humankrank-heiten verwendet werden, einschließlich B-Zell-Lymphom, Infektionskrankheiten einschließlich AIDS, Autoimmun- und entzündliche Erkrankungen und Transplantationen. Die Antikörper können entweder in ihrer nativen Form oder als Teil eines Antikörper/Chelat-, Antikörper/Wirkstoff- oder Antikörper/Toxin-Komplexes verwendet werden. Außerdem können Voll-Antikörper oder Antikörper-Fragmente (Fab₂, Fab, Fv) als bildgebende Reagenzien oder als potentielle Impfstoffe oder Immunogene bei der aktiven Immuntherapie zur Erzeugung anti-idiotypischer Reaktionen verwendet werden.
Die sinnvolle Menge an Antikörper zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung lässt sich mittels standardmäßiger Techniken bestimmen, wie Fachleuten des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis wohlbekannt. Die Antikörper werden generell mittels einer standardmäßigen Methode in einem pharmazeutisch geeigneten Puffer bereitgestellt oder können auf jeglichem gewünschten Wege verabreicht werden. Aufgrund der Wirksamkeit der hierin vorliegenden Antikörper und ihrer Verträglichkeit für Menschen ist die wiederholte Verabreichung dieser Antikörper möglich, um gegen verschiedene Krankheiten oder Erkrankungszustände beim Menschen vorzugehen.
Die rekombinanten Anti-CD4-Antikörper (oder Fragmente davon) dieser Erfindung sind auch zur Induzierung einer Immunsuppression, d.h. der Induzierung einer Unterdrückung eines menschlichen oder tierischen Immunsystems, nützlich. Diese Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Induzierung einer Immunsuppression bei einem Menschen oder einem Tier, bei dem dies erforderlich ist, durch Verabreichung einer wirksamen, nicht-toxischen Menge eines solchen Antikörpers dieser Erfindung an diesen Menschen oder das Tier.
Das Induktionsvermögen der Verbindungen dieser Erfindung einer Immunsuppression lässt sich anhand standardmäßiger und zu diesem Zweck angewandter Tests nachweisen, z.B. einem Lymphozytengemisch-Reaktionstest oder einem Test, der die Hemmung der T-Zellvermehrung misst, wie mittels Thymidin-Aufnahme gezeigt.
Die Tatsache, dass die Antikörper dieser Erfindung zum Induzieren einer Immunsuppression nützlich sind, bedeutet, dass sie zur Behandlung oder Verhütung einer Resistenz gegenüber oder Abstoßung von transplantierten Organen oder Geweben nützlich sind (z.B. Niere, Herz, Lunge, Knochenmark, Haut, Hornhaut etc.); der Behandlung oder Verhütung von Autoimmunkrankheiten, entzündlichen, proliferativen und hyperproliferativen Erkrankungen und von Hautmanifestationen immunologisch vermittelter Krankheiten (z.B. rheumatoide Arthritis, Lupus erythematosus, systemischer Lupus erythematosus, Hashimoto Thyreoiditis, Multiple Sklerose, Myasthenia gravis, Typ 1-Diabetes, Uveitis, nephrotisches Syndrom, Psoriasis, atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis und andere exzematöse Dermatitis, seborrhoische Dermatitis, Lichen planus, Pemplugus, bullöser Pemphigus, Epidermolysis bullosa, Urticaria, angioneurotisches Ödem, Vaskulitis, Erythema, kutane Eosinophilie, Alopecia areata etc.); die Behandlung reversibler obstruktiver Luftwegserkrankungen, Magen/Darmentzündungen und Allergien (z.B. Zöliakie, Proktitis, Eosinophilia gastroenteritis, Mastozytose, Crohn-Krankheit und ulzerative Kolitis) und ernährungsbedingte Allergien (z.B. Migräne, Rhinitis und Ekzem).
Ein Fachmann des Gebiets wäre durch routinemäßiges Experimentieren dazu in der Lage, eine wirksame, nicht-toxische Menge des Antikörpers zum Zwecke der Induzierung einer Immunsuppression zu bestimmen. Allgemein wird jedoch eine wirksame Dosis im Bereich von etwa 0,05 bis 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegen.
Die Antikörper (oder Fragmente davon) dieser Erfindung sollten auch zur Behandlung von Tumoren bei einem Säuger nützlich sein. Spezifischer gesagt sollten sie zur Verminderung der Tumorgröße, Hemmung des Tumorwachstums und/oder Verlängerung der Lebenszeit des Tumor-tragenden Tieres nützlich sein. Demgemäß betrifft diese Erfindung auch ein Verfahren zur Behandlung von Tumoren in einem Menschen oder Tier durch Verabreichen an den Menschen oder das Tier einer wirksamen, nicht-toxischen Menge eines Antikörpers. Ein Fachmann des Gebiets wäre durch routinemäßiges Experimentieren zur Bestimmung einer wirksamen, nichttoxischen Menge des Antikörpers zum Zwecke der Behandlung karzinogener Tumoren in der Lage. Allgemein wird jedoch erwartet, dass die wirksame Dosis im Bereich von etwa 0,05 bis 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegt.
Die Antikörper der Erfindung können einem Menschen oder Tier gemäß der zuvor genannten Behandlungsmethoden in einer ausreichenden Menge verabreicht werden, um eine solche Wirkung in einem therapeutischen oder prophylaktischen Grad zu erzeugen. Die Antikörper der Erfindung können einem Menschen oder Tier in einer herkömmlichen Dosierungsform verabreicht werden, die durch Kombinieren des Antikörpers der Erfindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel gemäß bekannter Methoden zubereitet wird. Für einen Fachmann des Gebiets wird zu erkennen sein, dass die Form und der Charakter des pharmazeutisch geeigneten Trägers oder Verdünnungsmittels durch die Menge an Wirkstoff, mit der er kombiniert werden soll, dem Verabreichungsweg und weiteren wohlbekannten Variablen vorgegeben ist.
Der Verabreichungsweg des Antikörpers (oder Fragments davon) der Erfindung kann oral, parenteral, durch Inhalation oder topisch sein. Der Begriff parenteral, wie hierin verwendet, umfasst die intravenöse, intramuskuläre, subkutane, rektale, vaginale oder intraperitoneale Verabreichung. Die subkutanen und intramuskulären Formen der parenteralen Verabreichung sind allgemein bevorzugt.
Die täglichen parenteralen und oralen Dosierungsmengen zur Anwendung der Verbindungen der Erfindung für die prophylaktische oder therapeutische Induktion einer Immunsuppression oder zur therapeutischen Behandlung karzinogener Tumoren liegen allgemein im Bereich von etwa 0,05 bis 100, doch bevorzugt etwa 0,5 bis 10 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag.
Der Antikörper der Erfindung kann auch durch Inhalation verabreicht werden. Mit "Inhalation" ist eine Verabreichung mittels Intranasal- oder Oralinhalation gemeint. Geeignete Dosierungsformen für diese Verabreichung, wie z.B. eine Aerosolformulierung oder ein Inhalator mit abgemessenen Dosen, können mittels herkömmlicher Methoden hergestellt werden. Die bevorzugte Dosierungsmenge der anzuwendenden Verbindung der Erfindung liegt allgemein im Bereich von etwa 10 bis 100 Milligramm.
Der Antikörper der Erfindung kann auch topisch verabreicht werden. Mit topischer Verabreichung ist eine nicht-systemische Verabreichung gemeint, die den äußeren Auftrag einer Antikörper-(oder eines Fragments davon)-Verbindung der Erfindung auf die Haut, auf die Mundhöhle und das Eintröpfeln dieses Antikörpers in das Ohr, Auge oder die Nase umfasst, wobei er im wesentlichen nicht in den Blutstrom eintritt. Mit systemischer Verabreichung ist die orale, intravenöse, intraperitoneale und intramuskuläre Verabreichung gemeint. Die erforderliche Menge eines Antikörpers zur Erzielung einer therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung variiert natürlich mit dem gewählten Antikörper, der Natur und dem Schweregrad des zu behandelnden Zustands und dem zu behandelnden Tier und unterliegt letztendlich dem Ermessen des behandelnden Arztes. Eine geeignete topische Dosis eines Antikörpers der Erfindung liegt generell im Bereich von etwa 1 bis 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag.
Formulierungen
Zwar ist es möglich, einen Antikörper oder ein Fragment davon alleine zu verabreichen, doch wird er vorzugsweise als eine pharmazeutische Formulierung dargeboten. Der Wirkstoff kann für die topische Verabreichung 0,001 bis 10 Gew.-%, z.B. 1 bis 2 Gew.-% der Formulierung umfassen, obschon er auch bis zu 10 Gew.-% umfassen kann, doch vorzugsweise nicht mehr als 5 Gew.-%, und noch bevorzugter 0,1 bis 1 Gew.-% der Formulierung.
Die topischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen einen Wirkstoff in Verbindung mit ein oder mehreren geeigneten Trägern dafür und wahlweise ein oder mehrere weitere therapeutische Inhaltsstoffe. Der/die Träger muss in dem Sinne "geeignet" sein, als er mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung verträglich und für deren Empfänger nicht schädlich ist.
Zu geeigneten Formulierungen für die topische Verabreichung zählen flüssige oder halbflüssige Präparationen, die sich zur Durchdringung der Haut an der Stelle, an der die Behandlung erforderlich ist, eignen, wie z.B. Liniments, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten, und zur Verabreichung an das Auge, Ohr oder Nase geeignete Tropfen.
Die Tropfen gemäß der vorliegenden Erfindung können sterile wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen und können durch Lösen des Wirkstoffs in einer geeigneten wässrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Agens und/oder eines anderen geeigneten Konservierungsstoffs, und vorzugsweise einschließlich ein grenzflächenaktiven Mittels, zubereitet werden. Die resultierende Lösung kann dann durch Filtration geklärt und in einen geeigneten Behälter eingebracht werden, der dann versiegelt und durch Behandlung im Autoklaven oder durch Halten bei 90° bis 100°C für eine halbe Stunde sterilisiert wird. Alternativ kann die Lösung durch Filtration sterilisiert und in den Behälter mittels einer aseptischen Methode ü bertragen werden. Beispiele der bakteriziden und fungiziden Agenzien, die sich zur Aufnahme in die Tropfen eignen, sind Phenylmercurinitrat oder -acetat (0,002 %), Benzalkoniumchlorid (0,01 %) und Chlorhexidinacetat (0,01 %). Geeignete Lösungsmittel für die Zubereitung einer öligen Lösung umfassen Glycerol, verdünnten Alkohol und Propylenglycol.
Zu Lotionen gemäß der vorliegenden Erfindung zählen solche, die sich zum Auftrag auf die Haut oder das Auge eignen. Eine Augenlotion kann eine sterile wässrige Lotion umfassen, die wahlweise ein Bakterizid enthält, und kann mittels Methoden ähnlich denen zur Herstellung der Tropfen zubereitet werden. Lotionen oder Liniments zum Auftrag auf die Haut können auch ein Mittel zur Beschleunigung der Trocknung und Abkühlung der Haut enthalten, wie etwa einen Alkohol oder Aceton, und/oder einen Feuchtigkeitsspender, wie etwa Glycerol oder ein Öl, zum Beispiel Rizinusöl oder Erdnussöl.
Bei Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich um halbfeste Formulierungen des Wirkstoffs für den äußeren Auftrag. Sie können durch Mischen des Wirkstoffs in fein zerteilter oder pulveriger Form, einzeln oder in Lösung oder Suspension in einem wässrigen oder nicht-wässrigen Fluidum mit Hilfe eines geeigneten Geräts, bei einer fetten oder nicht-fetten Basis hergestellt werden. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe, wie etwa hartes, weiches oder flüssiges Paraffin, Glycerol, Bienenwachs, eine Metallseife umfassen; einen Pflanzenschleim; ein Öl eines natürlichen Ursprungs wie Mandel-, Mais-, Erdnuss-, Rizinus- oder Olivenöl; Wollfett oder seine Derivate, oder eine Fettsäure wie Stearin- oder Oleinsäure, zusammen mit einem Alkohol wie Propylenglycol oder Makrogole. Die Formulierung kann jegliches geeignete grenzflächenaktive Mittel enthalten, wie etwa ein anionisches, kationisches oder nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel wie Sorbitanester oder dessen Polyoxyethylen-Derivate. Suspendiermittel wie Naturgummis, Cellulose-Derivate oder anorganische Stoffe wie kieselsäurehaltiges Silica, und andere Inhaltsstoffe wie Lanolin, können ebenfalls aufgenommen werden.
Für einen Fachmann des Gebiets wird zu erkennen sein, dass die optimale Menge und zeitliche Beabstandung der einzelnen Dosen eines Antikörpers oder dessen Fragments der Erfindung entsprechend der Natur und dem Ausmaß des zu behandelnden Zustands, der Verabreichungsform, -weg und -stelle und dem jeweils zu behandelnden Tier bestimmt wird, und dass solche Optima mittels herkömmlicher Techniken bestimmt werden können. Es wird für einen Fachmann des Gebiets auch zu erkennen sein, dass der optimale Behandlungsverlauf, d.h. die Anzahl der Dosen eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung, die pro Tag über eine definierte Anzahl von Tagen hinweg gegeben wird, von den Fachleuten des Gebiets unter Anwendung herkömmlicher Bestimmungstests für den Behandlungsablauf ermittelt werden können.
Ohne weitere Ausführung wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann unter Zugrundelegung der vorangegangenen Beschreibung in der Lage sein wird, die vorliegende Erfindung in ihrem vollständigen Umfang zu nützen. Im folgenden handelt es sich daher um lediglich der Veranschaulichung dienende Beispiele, die in keinster Weise den Rahmen der vorliegenden Erfindung einschränken sollen.
Kapselzusammensetzung
Eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung in Form einer Kapsel wird durch Befüllen einer standardmäßigen zweiteiligen Hartgelatinekapsel mit 50 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung in pulveriger Form, 100 mg Lactose, 32 mg Talk und 8 mg Magnesiumstearat erhalten.
Injizierbare parenterale Zusammensetzung
Eine pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung in einer zur Verabreichung durch Injektion geeigneten Form wird durch Einrühren von 1,5 Gew.-% eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung in 10 Vol.-% Propylenglycol und Wasser zubereitet. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert.
Salbenzusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Weißes Weichparaffin auf 100,0 g.

Der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung wird in einem kleinen Volumen des Vehikels dispergiert, um ein glattes, homogenes Produkt zu erzeugen. Zusammendrückbare Metalltuben werden dann mit der Dispersion befüllt.
Topische Cremezusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Polawachs GP 200 20,0 g.
Anhydrisches Lanolin 2,0 g.
Weißes Bienenwachs 2,5 g.
Methylhydroxybenzoat 0,1 g.
Destilliertes Wasser auf 100,0 g.

Polawachs, Bienenwachs und Lanolin werden zusammen auf 60°C erhitzt. Eine Lösung von Methylhydroxybenzoat wird zugegeben und die Homogenisierung unter Hochgeschwindigkeitsrühren erzielt. Die Temperatur darf dann auf 50°C fallen. Daraufhin wird der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung zugegeben und gleichmäßig dispergiert, woraufhin sich die Zusammensetzung bei Niedergeschwindigkeitsrühren abkühlen darf.
Topische Lotionzusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Sorbitanmonolaurat 0,6 g.
Polysorbat 20 0,6 g.
Cetylstearylalkohol 1,2 g.
Glycerin 6,0 g.
Methylhydroxybenzoat 0,2 g.
Gereinigtes Wasser B.P. auf 100,00 ml. (B.P. = British Pharmacopoeia)

Methylhydroxybenzoat und Glycerin werden in 70 ml des Wassers bei 75°C gelöst. Sorbitanmonolaurat, Polysorbat 20 und Cetylstearylalkohol werden bei 75°C zusammen eingeschmolzen und der wässrigen Lösung zugegeben. Die resultierende Emulsion wird homogenisiert, unter kontinuierlichem Rühren abgekühlt und dem Antikörper oder Fragment davon der Erfindung als eine Suspension im verbliebenen Wasser zugegeben. Die gesamte Suspension wird bis zu einem homogenen Zustand gerührt.
Augentropfenzusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 0,5 g.
Methylhydroxybenzoat 0,01 g.
Propylhydroxybenzonat 0,04 g.
Gereinigtes Wasser B.P. auf 100,00 ml.

Methyl- und Propylhydroxybenzoat werden in 70 ml gereinigtem Wasser bei 75°C gelöst und die resultierende Lösung abgekühlt. Der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung wird dann zugegeben und die Lösung mittels Filtration durch ein Membranfilter (0,022 μm Porengröße) sterilisiert und in geeignete sterile Behälter aseptisch abgepackt.
Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation
Für einen Aerosol-Behälter mit einem Fassungsvermögen von 15–20 ml:
10 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung werden mit 0,2–0,5 % eines Schmiermittels, wie etwa Polysorbat 85 oder Oleinsäure, gemischt und dieses Gemisch in einem Treibmittel, wie z.B. Freon, vorzugsweise in einer Kombination von (1,2-Dichlortetrafluorethan) und Difluorchlormethan, dispergiert und in einen geeigneten Aerosol-Behälter eingebracht, der auf eine Verabreichung entweder durch intranasale oder orale Inhalation angepasst ist.
Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation
Für einen Aerosol-Behälter mit einem Fassungsvermögen von 15–20 ml:
10 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung werden in Ethanol (6–8 ml) gelöst und dem 0,1–0,2 % eines Schmiermittels wie Polysorbat 85 oder Oleinsäure zugegeben; dieses Gemisch wird in einem Treibmittel, wie etwa Freon, vorzugsweise in Kombination von (1,2-Dichlortetrafluorethan) und Difluorchlormethan, dispergiert und in einen geeigneten Aerosol-Behälter eingebracht, der auf eine Verabreichung entweder mittels intranasaler oder oraler Inhalation angepasst ist.
Die Antikörper und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sind besonders nützlich für die parenterale, d.h. subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen gewöhnlich eine Lösung eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung oder ein Gemisch davon in Lösung in einem geeigneten Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger. Eine Vielzahl wässriger Träger kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 % Kochsalzlösung, 0,3 % Glycin und ähnliches. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von partikulärer Substanz. Diese Lösungen können mittels herkömmlicher, wohlbekannter Sterilisationsmethoden sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch geeignete Hilfssubstanzen je nach Erfordernissen enthalten, um sich physiologischen Bedingungen anzunähern, wie z.B. pH-einstellende und Puffermittel etc. Die Konzentration des Antikörpers oder dessen Fragment der Erfindung in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann breit variieren, d.h. von weniger als etwa 0,5 %, gewöhnlich bei oder zumindest um 1 %, bis zu sogar 15 oder 20 Gew.-%, und werden in erster Linie ausgehend von Fluidvolumina, Viskositäten etc. entsprechend der gewählten speziellen Verabreichungsform gewählt.
So könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intramuskulären Injektion so zubereitet werden, dass sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg eines Antikörpers oder dessen Fragment der Erfindung enthält. Entsprechend könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intravenösen Infusion so zubereitet werden, dass sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg eines Antikörpers oder dessen Fragment der Erfindung enthält. Die tatsächlichen Herstellungsmethoden für parenteral verabreichbare Zusammensetzungen sind wohlbekannt oder für die Fachleute des Gebiets erkennbar, und sind in größerer Ausführlichkeit beschrieben z.B. in Remington's Pharmaceutical Science, 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Die Antikörper (oder Fragmente davon) der Erfindung können zur Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor Anwendung wiederhergestellt werden. Diese Methode hat sich für herkömmliche Immunglobuline als wirksam erwiesen, wobei im Fachgebiet bekannte Lyophilisierungs- und Rekonstitutionsmethoden angewandt werden können.
In Abhängigkeit vom angestrebten Ergebnis kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung verabreicht werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden die Zusammensetzungen einem Patienten, der bereits an einer Erkrankung leidet, in einer ausreichenden Menge verabreicht, um die Erkrankung und ihre Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise zum Stillstand zu bringen. Bei prophylaktischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen, die die vorliegenden Antikörper oder ein Gemisch davon enthalten, einem Patienten verabreicht, der sich noch nicht im Erkrankungsstadium befindet, um die Resistenz des Patienten zu erhöhen.
Es können einzelne oder multiple Verabreichungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen bei Dosierungshöhen und -schemata erfolgen, die durch den behandelnden Arzt bestimmt werden. In jedem Fall sollte die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung eine Menge der veränderten Antikörper (oder Fragmente davon) der Erfindung bereitstellen, die zur wirksamen Behandlung des Patienten ausreichend ist.
Es sollte ebenfalls zur Kenntnis genommen werden, dass die Antikörper dieser Erfindung zur Konstruktion und Synthese entweder peptidischer oder nicht-peptidischer Verbindungen (Mimetika) verwendet werden können, die bei derselben Therapie wie der Antikörper nützlich wären. Siehe z.B. Saragovi et al., Science, 253, 792–795 (1991).

Claims

Chimärer Antikörper, der spezifisch an ein humanes Antigen bindet, welcher im wesentlichen nicht-immunogen in einem Menschen ist und nicht derselbe wie ein Menschen- oder Schimpansen-Antikörper ist, wobei der Antikörper leichte und schwere Polypeptidketten umfasst, die jeweils beinhalten: eine variable Region mit der Aminosäuresequenz einer variablen Region eines Antikörpers eines Altweltaffen, ausgewählt aus Rhesusaffen, Cynomolgusmakaken und Pavianen, und eine konstante Region mit der Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines Antikörpers eines Menschen oder Schimpansen.
Chimärer Antikörper nach Anspruch 1, umfassend leichte und schwere Polypeptidketten, die jeweils eine konstante Region mit der Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines humanen Antikörpers umfassen.
Chimärer Antikörper nach Anspruch 2, umfassend leichte und schwere Polypeptidketten, die jeweils eine variable Region mit der Aminosäuresequenz einer variablen Region eines Antikörpers eines Cynomolgusmakaken umfassen.
Chimärer Antikörper nach Anspruch 3, welcher spezifisch an CD4 bindet und eine Leichtkette enthält, umfassend die variable Region der Aminosäuresequenz, wie in 13 gezeigt, und eine konstante Region der humanen Lambda-Leichtkette und eine Schwerkette, umfassend die variable Region der Aminosäuresequenz, wie in 14 gezeigt, und eine konstante Region des humanen Gamma 1.
Chimärer Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend: eine leichte Polypeptidkette, welche eine konstante Region mit der Aminosäuresequenz einer konstanten Region einer Kappa- oder Lambda-Leichtkette eines humanen Antikörpers umfasst; und eine schwere Polypeptidkette, welche eine konstante Region mit der Aminosäuresequenz einer konstanten Region einer Gamma-1-Schwerkette eines humanen Antikörpers umfasst, wobei der Antikörper durch Expression vom Expressionsvektor TCAE 5.2, wie in 5 gezeigt, oder TCAE 6, wie in 6 gzeigt, produziert wird.
Chimärer Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, der spezifisch an ein humanes Antigen, das an einer Autoimmunkrankheit, -störung oder -bedingung beteiligt ist, oder an ein humanes Tumorantigen bindet.
Chimärer Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, der spezifisch an ein humanes Antigen bindet, ausgewählt aus CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF-α, TNA-β, TN-Antigen, IL-1, IL-8, humaner T-Zellrezeptor, CD3, CD28, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD5a, CD45, neu-Onkogenprodukt, MDR-1, TGF-α, TGF-α-Rezeptor, PDGF und CD71.
Chimärer Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, der therapeutisch wirksam ist, wenn in einer Dosis von 0,05 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht verabreicht.
Chimärer Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, zur Verwendung als ein Therapeutikum.
Chimärer Antikörper nach Anspruch 9, welcher spezifisch an ein humanes Antigen bindet, das an Krebs, Infektionskrankheit, einer Autoimmun- oder Entzündungskrankheit, -störung oder -bedingung, und Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes beteiligt ist, zur Verwendung in der Behandlung oder Ver hütung der Krankheit, Störung oder Bedingung.
Chimärer Antikörper nach Anspruch 9, zur Verwendung in der Behandlung einer Krankheit, Störung oder Bedingung durch eine induzierte Immunsuppression.
Chimärer Antikörper nach Anspruch 11, wobei die Krankheit, Störung oder Bedingung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus rheumatoider Arthritis, Lupus erythematosus, systemischem Lupus erythematosus, Hashimoto-Thyroiditis, Multipler Sklerose, Myasthenia gravis, Typ-1-Diabetes, Uveitis, nephrotischem Syndrom, Psoriasis, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis, seborrhoischer Dermatitis, ekzematöser Dermatitis, Lichen planus, Pemphigus, bullösem Penphigus, Epidermolysis bullosa, Urtikaria, Angioödemen, Vaskulititis, Erythem, Hauteosinophilie, Alopecia areata, reversibler obstruktiver Atemwegserkrankung, Migräne, Ekzem, Rhinitis, weiteren allergischen Bedingungen und Erkrankungen in Verbindung mit Darmentzündung, einschließlich Zöliakie, Proctitis, Eosinophilia gastroenteritis, Mastocytose, Crohn-Krankheit und ulzerativer Kolitis.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem pharmazeutisch geeigneten Träger.
Rekombinante Nukleinsäure, umfassend Nukleinsäuresequenzen, die leichte und schwere Polypeptidketten eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 codieren.
Rekombinante Nukleinsäure nach Anspruch 14, welche ein Expressionsvektor ist, wie in 5 oder 6 gezeigt.
Verfahren zum Herstellen eines chimären Antikörpers, welcher spezifisch an ein humanes Antigen bindet und im wesentlichen nicht-immunogen in einem Menschen ist, umfassend das Exprimieren der rekombinanten Nukleinsäure nach Anspruch 14 oder 15.
Fragment eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Fragment spezifisch an ein humanes Antigen bindet, im wesentlichen nicht-immunogen in einem Menschen ist und die variablen Regionen der leichten und schweren Polypeptidketten eines Antikörpers eines Altweltaffen umfasst, ausgewählt aus Rhesusaffen, Cynomolgusmakaken und Pavianen, und ein Fragment einer konstanten Region mit der Aminosäuresequenz einer konstanten Region eines Antikörpers eines Menschen oder Schimpansen, welches eine Antikörper-Effektorfunktion in einem Menschen zeigt.
Fab- oder (Fab)₂-Fragment eines chimären Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Fragment spezifisch an ein humanes Antigen bindet, im wesentlichen nicht-immunogen in einem Menschen ist und variable Regionen der leichten und schweren Polypeptidketten eines Antikörpers eines Altweltaffen umfasst, ausgewählt aus Rhesusaffen, Cynomolgusmakaken und Pavianen, und wobei die konstanten Regionen der leichten und schweren Polypeptidketten die Aminosäuresequenzen der konstanten Regionabschnitte eines Fab- oder (Fab)₂-Fragments eines Antikörpers eines Menschen oder Schimpansen aufweisen.
Antikörper-Fragment nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, welches die variablen Regionen der leichten und schweren Polypeptidketten eines Antikörpers eines Cynomolgusmakaken umfasst.
Antikörper-Fragment nach Anspruch 19, umfassend die variablen Region der Leicht- und Schwerketten der Aminosäuresequenzen, wie in 13 und 14 gezeigt.
Rekombinante Nukleinsäure, umfassend Nukleotidsequenzen, welche die variable Region-enthaltenden Polypeptide eines Antikörper-Fragments nach einem der Ansprüche 17–20 codieren.
Verfahren zum Herstellen eines Fragments eines chimären Antikörpers, welches spezifisch an ein humanes Antigen bindet und im wesentlichen nicht-immunogen in einem Menschen ist, umfassend das Exprimieren der rekombinanten Nuklein säure nach Anspruch 21.
Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhütung einer Krankheit, Störung oder Bedingung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Krebs, Infektionskrankheit, Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes und einer Autoimmun- oder Entzündungskrankheit, -störung oder -bedingung.
Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhütung einer Autoimmunstörung.
Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.
Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, Störung oder Bedingung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Transplantation, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis oder seborrhoischer Dermatitis.
Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, Störung oder Bedingung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus rheumatoider Arthritis, Lupus erythematosus, systemischem Lupus erythematosus, Hashimoto-Thyroiditis, Multipler Sklerose, Myasthenia gravis, Typ-1-Diabetes, Uveitis, nephrotischem Syndrom, Psoriasis, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis, seborrhoischer Dermatitis, ekzematöser Dermatitis, Lichen planus, Pemphigus, bullösem Penphigus, Epidermolysis bullosa, Urtikaria, Angioödemen, Vaskulititis, Erythem, Hauteosinophilie, Alopecia areata, reversibler obstruktiver Atemwegserkrankung, Migräne, Ekzem, Rhinitis, weiteren allergischen Bedingungen und Erkrankungen in Verbindung mit Darmentzündung, einschließlich Zöliakie, Proctitis, Eosinophilia gastroenteritis, Mastocytose, Crohn-Krankheit und ulzerativer Kolitis.