BG62656B1 - Рекомбинантни антитела за хуманната медицина - Google Patents

Description

Изобретението е частично продължение на заявка за патент на US, Newman et al., + 07/856,281 от 1992, която е частично продължение на заявка за патент US, N 07/735,064 от 1991 г, изцяло (заедно с чертежите) включена в литературната справка. Изобретението се отнася до рекомбинантни антитела, приложими за лечение на хора и методи за получаването на такива антитела.

Предшестващо състояние на техниката

За диагностициране на заболявания на хората и за разрешаване на основни проблеми при биологични изследвания, се използват миши моноклонални антитела. Тези реагенти се използват миши моноклонални антитела. Тези реагенти се използват също така за клинични и терапевтични приложения както при акутни, така и при хронични заболявания на хора, вкл.левкемии, лимфоми, тумори, например на дебелото черво, гърдата, черния дроб, СПИН и автоимунни заболявания.

Създадени са миши/човешки химерни антитела, които показват характеристиките на свързване на парентеално мише антитяло и функциите на въздействие, асоциирани с постоянната област на човешко антитяло, например описани в US 4,816,567; US 4,987,745; US 4,975,369; US 4,816,397. Тези химерни антитела са конструирани чрез създаване на геномна генна библиотека от ДНК, екстрахирана от съществуващи по-рано миши хибридоми, Nishimura et al., 47 Cancer Research 999, 1987. След това библиотеката се скринира за гени за вариабилната област от леки и тежки вериги, показващи правилно преустроените образци на фрагменти от антитялото. Клонираните вариабилни области на гени след това се лигатират в експресионен вектор, кодиращ гени, така слетите гени се клонират в постоянно кодиращи области на гени от човешки, шимпанзе или друг маймунски вид (и в човешки, шимпанзе или други маймунски рамково-кодиращи гени, ако е необходимо), и се експресират като човешки маймунски рекомбинантни антитела или изцяло маймунски рекомбинантни антитела. По нататък изобретението се отнася до употребата на такива рекомбинантни антитела (този термин включва антитела, получени чрез сливане на ДНК от два различни гена за антитяло дори от същия вид, например два различни маймунски гена за антитяло, например Rhesus и cynomolgus маймуни, за да се получи маймуно-маймунски рекомбинантно антитяло) като имнотерапевтични агенти за лечението на заболявания при човека. Изобретението се основава на откритието, че еволюционно отдалечени маймуни, като бабуини или макаки, вкл. cynomolgus и Rhesus маймуните, неприличащи на шимпанзетата, са не само достатъчно различни от хората, за да бъде възможно в тези маймуни да се изградят антитела срещу човешки антигени, дори за относително консервативни човешки антигени, като CD4 и CD54, но са достатъчно сходни с човешките, за да имат антитела, аналогични на човешките антитела, така че няма анти-антитяло имунен отговор, когато такива маймунски антитела или рекомбинантни антитела, получени от тях, се въвеждат в човек.

За разлика от някои по-рано използвани антитела за лечение на хора, антителата от настоящото изобретение са лишени от някои недостатъци например имуногенност и индукция на човешки-анти- антитяло (НАА) отговор при повторно въвеждане, необходимо за лечение на хронични състояния; относително къс полуживот в сравнение с човешките антитела; и отсъствие на функции на въздействие върху човешки клетки или комплемент. Отсъствието на тези недостатъци е забележително преимущество при лечението на хора с антитела .създадени съгласно изобретението. Например в случаите на хронични заболявания на хора, вкл. автоимунни заболявания, или каквато и да е болест, при която е необходимо продължително въвеждане на дадено антитяло, едно от главните препятствия за повтаряща се терапия с антитяло е отговорът на приемника спрямо терапевтичното антитяло. НАА отговорите често са непредсказуеми при всеки следващ. Такива отговори са преобладаващо, макар и не изключително, насочени към постоянна област от молекулата на антитялото и веднъж появили се, те често предотвратяват или редуцират ефективността на каквото и да е по-нататъшно лечение с това антитяло или друго антитяло от същия изотип.

Потенциално проблемите на НАА могат да бъдат заобиколени чрез използването на човешки моноклонални антитела. При този подход обаче съществуват редица етични, клинични и имунологични ограничения при избора на антигените за имунизация на хора (напр. човешки антигени, която фраза включва протеини, полипептиди или техни еквиваленти, присъстващи в човека) за генериране на антитела. Подходът на заявителите при заобикалянето на този проблем включва генерирането на антитела с подходяща специфика и желани функции на въздействие, както и тяхната употреба при получаване на рекомбинантни антитела. Тези рекомбинантни антитела обикновено включват подходяща част от вариабилната област на дадено антитяло, получено от имунизирана маймуна, и постоянната област от дадено антитяло от човек или шимпанзе. По този начин спецификата и високият афинитет на моноклоналните антитела се съхраняват, а подходящата област от човек или шимпанзе, показващи желаните ефекторни функции, може да бъде подбрана.

Изобретението се основава на метод за амплификация на маймунски имуноглобулинови гени например с използване на полимеразната верижна реакция (PCR) от РНК, екстрахирана от маймунски лимфоцити с помощта на синтетични олигонуклеотидни праймери, специфични за генното семейство на вариабилната област от тежката и леката верига. Амплифицираните гени или подходящи части, например определящата комплементарността област (CDR)-кодиращи области, виж Winter, GB 2188638А, са клонирани в експресионен вектор, съдържащ постоянна генна област от човек или шимпанзе за получаването на маймунско човешко антитяло или на вектор, съдържащ постоянна генна област за получаването на пълното рекомбинантно маймунско антитяло от желания изотип. Тези антитела представляват имунотерапевтични агенти, способни да локализират и/или да убиват подходящи клетки мишени (например, тумурни клетки) след прилагане in vivo. Изобретението се отнася до метод за клониране на антиген разпознаваща част от вариабилната област от ген на маймунско антитяло. Този метод включва осигуряване на нуклеинова киселина, например РНК от маймуна, образуване на сДНК за тази РНК с помощта на обратна транскриптаза, осигуря ване на праймер, комплементарен на сДНК последователността, кодираща 5' лидерна последователност на гена за антитяло, съдържащ тази сДНК и паймера за формиране на хибриден комплекс и за амплифициране на сДНК за получаване нуклеинова киселина, кодираща вариабилна област от гена за маймунско антитяло.

Под “антиген разпознаваща част” се разбира една или повече части от вариабилната област на маймунското антитяло, която (които) са отговорни са свързване и/или разпознаване на антигенна мише (или епитоп или идиотип) на антитялото. Например това включва CDR областите (виж по-долу) или цялата вариабилна област, или която и да е комбинация от тези две области, вкл.всяко изменение в кодиращите области, които могат да бъдат индуцирани, за да направят областта повече подобна на човешка, отколкото подобна на маймунска, без промяна на специфичните свойства на свързване на антитялото. Ако се използва само част от цялата вариабилна област, такова останалите части, например така наречените “рамки”, се осигуряват от друго антитяло, за предпочитане антитяло от човек или от шимпанзе, виж частта за нивото на техниката, цитирана по-горе и включена в литературната справка.

Изразите “вариабилна област”, “лидерна последователност”, “постоянна област” и “рамка на разчитане” се използват в техния общоприет смисъл.

В предпочитаните варианти лидерната последователност означава лидерна последователност от човек, маймуна или шимпанзе с приблизително 60 бази, представени на фиг.1

Установено е, че лидерни последователности на вариабилната област от маймуна, шимпанзе или човек са задоволително сходни, така че праймерите, конструирани за един, са подходящи за амплификация на друг. По метода РНК се амплифицира достатъчно, за да се получи достатъчно нуклеинова киселина, която да се включи във вектор за по-нататъшно клониране.

Изобретението се отнася и до метод за получаване на антитяло за човешки антиген, което антитяло е неимуногенно за хора. Методът включва изграждане у маймуните на маймунско антитяло за човешки антиген и изолиране на маймунска нуклеинова киселина, кодираща антигенразпознаваща част от вариабилна об ласт на маймунското антитяло. Осигурява се човешка нуклеинова киселина, кодираща човешка постоянна област за дадено антитяло, и се свързва с маймунска нуклеинова киселина за формиране на рекомбинантна нуклеинова киселина. Последната се експресира за получаване на желаното антитяло. Алтернативно нукелинова киселина, кодираща постоянна област на маймуна или шимпанзе, може да бъде използване за формиране на рекомбинантно антитяло. Налице са малко, ако изобщо има, различия в аминокиселинната последователност на постоянните области на човек и шимпанзе (т.е. те са хомоложни), и онези, които са установени, могат да бъдат лесно променени с помощта на стандартни техники, ако нуклеиновата киселина, кодираща маймунска постоянна област, се използва за формиране на рекомбинантно антитяло. Критичен съгласно изобретението е фактът на продуциране на антитяло, което е по-малко имунно от маймунската постоянна област, така че няма значителен имунен отговор като следствие от въвеждането на рекомбинантно антитяло в човека. Такива области на антитялото се отнасят тук като хомоложни области. Рекомбинантното антитяло се конструира, за да бъде толкова функционално, колкото човешко антитяло с неговата аминокиселинна последовател-ност, т.е. то има постоянна област, хомоложна на област от човек или шимпанзе. Следователно антитялото е толкова необходимо за редуциране на случаите на нежелан имунологичен отговор, колкото е необходимо едно човешко антитяло, и съдържа една антигенсвързваща част от маймунско антитяло.

Под “неимуногенност” се разбира, че антитялото не предизвиква антитяло отговор със задоволителна стойност за редуциране на въздействието на продължително въвеждано антитяло в повечето от хората за достатъчно време за достигане на терапевтичен ефект, например в сравнение с миши или мише - човешко антитяло. За предпочитане не се наблюдава антитяло отговор.

В предпочитаните варианти за изпълнение методът включва имортализиране (обезсмъртяване) на клетки от маймуната, които се отговорни за продуциране на маймунско антитяло, например чрез хибридомно сливане, вирусна трансформация с Herpes papio, клониране на единични В-клетки, наречено още “временно обезсмъртяване”, и получаване на библиотека от рекомбинантни имуноглобулини.

В други предпочитани вариантни за изпълнение методът включва подбор на В-клетки от маймуната, независимо дали са левкоцити от периферна кръв, далак, костен мозък или лимфни възли; подбор на клон, който продуцира подходящо антитяло; изолиране на имуноглобиновите гени, кодиращи това антитяло от обезсмъртената клетъчна линия; и експресиране на гените в продуциращата клетъчна линия, т.е. клетъчна линия, която причинява достатъчно продуциране на антитялото, необходимо да лечение на хора.

Изобретението се отнася до рекомбинантно антитяло, формирано от постоянна област, както от човек, така и от шимпанзе, и антиген, разпознаващ част от маймунска вариабилна област, или първа маймунска постоянна област и втора антиген разпознаваща част от вариабилна област на друга маймуна.

Изобретението се отнася до моноклонално антитяло, и Fab, (Fab)₂, димер с лека верига или тежка верига, или който и да е техен минимален рекомбинантен фрагмент, например Εν или SCA (едноверижно антитяло) или друг имнологично активен техен фрагмент (например CDR област), до човешки антиген, формиран чрез имобилизиране на маймунски Вклетки. Такива фрагменти са приложими като имуносупресивин агенти. Алтернативно антитялото от изобретението може да има прикачена към себе си ефекторна или репортерна молекула. Например едно антитяло от изобретението може да има макропръстен, за свързване на атоми на тежки метали като хелати или токсини, например рицин, прикачен чрез ковалентни структури, образуващи мостове. В допълнение Fc фрагментът или СНЗ домена на пълната молекула на антитялото може да бъде заместен от ензимна или токсинова молекула и част от имуноглобулиновата верига може да бъде свързана с полипептидна ефекторна или репортерна молекула. Биспецифични антитела могат също да бъдат конструирани с помощта на стандартни техники.

Изобретението се отнася и до фармацевтични състави ,в които антителата съгласно изобретение се предоставят за терапевтични или профилактични приложения. Такива антитела могат да бъдат използвани и като имунотоксини, т.е. молекули, които се характеризират с два компонента, и са изключител но полезни за убиване на подбрани клетки in vitro или in vivo. Един компонент е цитотоксичен агент,т който е обикновено фатален за клетката, когато е прикачен или абсорбиран. Вторият компонент, познат като “доставящ носител”, осигурява средството за доставяне на токсичния агент на определен тип клетки, например карциномни клетки. Двата компонента са свързани заедно по обичаен химичен начин с помощта на който и да е добре известен химичен или генетичен метод. Например, когато цитотоксичният агент е протеин, а вторият компонент е интактен имуноглуболин, свързването може да бъде по пътя на хетеробифункционалното кръстосано свързване чрез агенти, например карбодиимид, глутаралдехид и други. Получаването на различни имунотоксини е добре известно в областта.

В друг сходен аспект изобретението се отнася до нуклеинова киселина, кодираща човешко/маймунско рекомбинантно антитяло. В предпочитаните варианти за изпълнение нуклеиновата киселина кодира константна област от човек или шимпанзе и антиген, разпознаващ част от маймунска вариабиилна област, след това нуклеиновата киселина се пречиства, т.е. отделя се от биологични съставки, с които се среща в природата, или за предпочитане се осигурява във вид на хомогенен разтвор.

Изобретението се отнася и до CDR присадено антитяло, формирано от поне една от определящите комплементарността области (CDRs), които са имунокиселинни остатъци (използвайки стандартната аминокиселинно маркираща система на Kabat) 31-35 (CDR 1), 5060 (CDR2) и 95 - 102 (CDR 3) на определената тежка верига , и аминокселинните остатъци 24-34 (CDR 1), 50-60 (CDR 2) и 89-97 (CDR 3) от определената лека верига на вариабилна област на маймуна от Стария свят (Европа, Азия и Африка), и имуноглобулинова рамка на вариабилна област от втори вид. CDR присаденото антитяло е способно да се свърже към същия антиген, както оригиналното маймунско антитяло. Постоянната област на антитялото е получена от имуноглуболин от човек или шимпанзе. Методологията за осъществяването на този вариант на изобретението е описана в общи линии от Jones et al., 321 Nature 522, 1986. Подобни CDR присаждания могат да бъдат променени при желание, за гарантиране на това, че са повече подобни на човеш ките, така че вероятността от провокиране на неблагоприятна реакция за антитялото е намалена.

В предпочитаните варианти за изпълнение методът включва обезсмъртяване или подбор на клетка от вида макак, която е отговорна за получаване на макак антитяло, както и освобождаването на имуноглобулиновите гени от клетката; клониране и секвениране на гена за антитялото, отговорни за получаването на антитяло; подбор на последователност, рамка, за човек с вариабилна област (за предпочитане с най-близка хомоложност на рамката на вариабилната област от макак; и заместване на макак CDR последователности с човешки CDR последователности и минимални модификации в областта на рамката от човек е възможно да бъдат включени за поддържане на афинитета на антитялото за неговия антиген.

Под “малки модификации” се разбира, когато по-малко от приблизително 6 аминокиселини в рамката могат да бъдат заместени от други аминокиселини. Обикновено такива замествания или модификации се правят само когато в конформационните взаимодействия са включени онези аминокиселини, които поддържат рамката в подходяща форма така ,че да бъде възможно разпознаването на желания антиген от антитялото. Подобни модификации биха се отразили главно на различаващите се аминокиселини, намиращи се в маймунското антитяло в сравнение с човешко антитяло. Например аминокиселинната последователност на човешко антитяло, предхождаща тежката верига CDR 3,92-94, е предимно цистеинала-нинаргинин, като аргининът е възможно да бъде заместен в малък брой антитела със серин или треонин. В някои антитела в маймуната последователността е цистиналанинсерин. В този пример може да се предпочита да бъде използван серин при аминокиселина 94 (виж фиг.9О).

Изобретението се отнася и до метод за лечение на хора и имащи специален антиген, например асоцииран със заболяване. Методът включва въвеждане на терапевтично ефективно количество от рекомбинантно антитяло, специфично за дадения антиген, където рекоминантното антитяло е такова, че има постоянна област от човек или от шимпанзе и една антиген разпознаваща част от маймунска вариабална област или маймунска постоянна област от една първа маймуна и антигенразпознаваща част от втора вариабилна област от различна маймуна.

В предпочитаните варианти за изпълнение в горния аспект антигенните са следните: туморен, антиген, включен в имунологично дебалансирано състояние, антиген, включен в автоимунен отговор, рецептор, експресиран в клетка гостоприемник или антиген, подбран от човешки антиген CD58, VLA4 (α4β1 интегрин), CD2, LFA3, FLAM, LAM, CD25, CD4 CD19, CD20, човешки Т-клетъчен рецептор, CD3 CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNF a, TNF β, Τη антиген, IL-l,IL-8, С5а адхезионни молекули например, VCAM, CD54, CD28, CDlla, CD1 lc, CD18 и CD1 lb, новият онкогенен продукт, MDR-1 (Р-гликопропетин), TGFa и неговият рецептор и PDGF; рекомбинантното антитяло е активно или до изчерпване (убиване или елиминиране) на нежеланите клетки (напр.анth-CD-4) чрез действие на комплемента, или килърни клетки, или активен като цитотоксичен агент или причинява Fc-рецепторно свързване чрез фагоцит. Алтернативно, антитялото блокира или стимулира рецепторните функции или неутрализира активни разтворими продукти, като един или повече от интерлевкините, TNF и С5а.

Изобретението се отнася и до фармацевтични състави от посочените антитела или техни фрагменти. Състави или продукти съгласно изобретението могат да бъдат приготвени удобно във формата на разтвори, подходящи за парентерално или назално или орално въвеждане. Подходящи продукти от антитялото могат да бъдат смесени с подходящи продукти от други агенти, което води до повишената им клинична приложимост.

Другите особености и предимства на изобретението биха станали очевидни от следното описание на предпочитаните варианти на изпълнение от патентните претенции.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 табуларно представяне на 20 кодона в девет различни тежки вериги на лидерни последователности на Ig и десет маймунски тежки вериги на лидерни последователности на Ig;

фигура 2 е диаграмно представяне на структурите на различни Ig вериги, които показват относително разположение на лидерната, вариабилната и постоянната област спрямо позициите на рестрикционните сайтове и праймерите, използвани за амплификация;

фигура 3 - е диаграмно представяне на тежка верига на касета на експресионен вектор на човешки или химерни антитела;

фигура 4 - диаграмно представяне на лека верига на касета на вектор, конструиран за екпресия на човешки или химерни антитела;

фигура 5 и 6 представят във вид на диаграма векторите, които са конструирани за експресия на имуноглобулин от κ или λ лека верига на сДНК, съответно. В тези вектори имноглобулиновите гени са разположени в тандемна конфигурация с помощта на неомицин фосфотрансфераза като селективен маркер;

фигурите 7-1, 7-2 и 8 показват последователността на нуклеинова киселина на различни праймери на лидерни последователности, приложими съгласно изобретението (тези праймери на фиг.8 съответстват на изброените като SEQ.ID Nos 1-12 по-долу;

фигура 9А до 9Н са сравнения на човешкия и маймунски области в VH1, VH2, VH3, VH4, и VH5 последователности и VKI и VUII, и Υλ III последователности, съответно;

фигура 10 е сравнение на човешка и маймунски последователности, с едно сравнение с човешка VH2 последователност;

фигура 11 е графично представяне на свързването на антитяло от изобретението към човешки CD4 антиген;

фигура 12 е графично представяне на инхибиторното свързване на 1F3 чрез антитялото от фиг. 10;

фигура 13 и 14 са части от нуклеотидните последователности на анти-СО4 VH, и VL областите, съответно;

фигура 15 - е графика, представяща анти-СБ54 активността; и фигура 16 е хистограма, сравняваща особеностите на плазмидното експресиране.

Описание на предпочитаните варианти на изпълнение съгласно изобретението

Маймунски антитела

Маймуните на Стария свят са такива като бабуини и макаки (вкл. Rhesus и супоmolgus маймуните). Съгласно изобретението са представени детайлите на приложение на претендираното изобретение с различни маймунс ки гени. Тези примери не са ограничени в изобретението и могат да бъдат прилагани и на други маймуни от Стария свят.

На фиг.2 е показана диаграма на основната структура на гени, кодиращи имунуглобулинови тежки, κ леки и λ леки вериги. Всяка от тези вериги е образувана от един ATG старт кодон, следван от лидерна последователност с приблизително 60 бази, област, кодираща вариабилен регион от имунглобулина и постоянен регион от този имуноглобулин. Примери за различни лидерни последователности или сигнални пептиди на тежки вериги са показани на фиг. 1. Тези последователности и техният еквивалент в маймуна могат да бъдат определени чрез стандартни техники, които са добре известни на специалистите в областта, както са описани по-долу.

Последователностите, показани на фиг.1 долу, са човешки лидерни последователности. Ус-тановено е, че конструирането на праймери, комплементарни на тези на лидерните области, позволяват амплифициране на Ig гените от маймуна. Аналогично на това праймери, хомоложни на маймунски лидерни последователности (виж например горната част на фиг.1), могат да бъдат използвани в амплификацията на имуноглобулинови гени и също за амплифициране на човешки имуноглобулинови гени.

Чрез използването на такива праймери в стандартни процедури на амплифиициране гените, кодиращи различни маймунски имуноглобулинови гени, могат да бъдат изолирани наготово и последователностите, кодиращи вариабилнте области на антителата -да бъдат определени. Примери за подобни процедури са представени по-нататък. Резултатите от анализа са представени на фиг.9А до 9Н и на фиг. 10. Установено е, че освен способността да продуцира антитела спрямо относително запазени човешки антигени у маймуните, вариабилните регионални структурни последователности от така продуцираните антитела са неотличими от тези на човешките антитела. С други думи вариабилността на имуноглобулиновата последователност в количествено отношение, наблюдавана за маймуни, е аналогична на тази за хора и е невъзможно да бъде определено кое антитяло е получено от човек или маймуна без анализ на самия източник.

Например съгласно фиг. 10 аминокиселинната последователност от VH3 областта на човек се сравнява с маймунска. Човешките антитела показват степен на хомоложност помежду си от 83 до 98 %, докато онези от маймуните са от 90 до 95 % хомоложни с човешката VH3 област. В противоположност на това човешката VH2 област е хомоложна на човешка VH3 на 60%. На тази фигура, както и на други фигури, присъствието на същата аминокиселина при каквото и да е разположение е показано с тирета, докато присъствието на различна аминокиселина е показано чрез стандартния еднобуквен код. Позициите, при които не би могло да бъдат означени консенсус аминокиселини, са показани като X]. Аналогично на това, хомология за VH1, VH2, VH3, VH4 и VH5, както и за VKI и VKII и VX III е показана на фиг.от 9А до 9Н, съответно. Отново се наблюдава значителна хомоложност между маймунска имуноглобулинова област и тази на човешка във всяка вариабилна област вкл. последователностите на областите от имуноглобулин J. Такава висока хомоложност е аналогична на наблюдаваната сред човешките антитела.

Методологията за определяне на последователностите е представена по-нататък в примерите. За специалистите в областта е очевидно, че тези примери не са ограничителни за изобретението и еквивалентни резултати и химерни антитела могат да бъдат получени по сходни процедури, добре познати за целта. Виж например US патенти 4, 816, 567; 4, 978, 745; 4,975, 369; 4,816,397 по-горе. Например след клониране на ген, кодиращ маймунска вариабилна област, последната се прикрепва към друг ген, кодиращ маймунска или човешка постоянна област, като слетите гени се експресират в продуцираща клетъчна линия за получаване на желано антитяло. По-нататък са представени примери за подобни процедури.

В следните примери първият етап на метода включва изолирането на общото количество РНК от маймунски клетки от периферна кръв или далак. В-клетки от имунизиарни маймуни могат да бъдат получени от периферна кръв или лимфни възли и да се използват директно или , ако се предпочита, да се размножат. Това размножаване може да включва Herpes papio вирусна трансформация, фузия в хетероложни миеломни клетки с последващ подбор или клониране на единични В-клетки при гранично разреждане в присъствието на сти мулирани човешки Т-клетки.

Общата РНК след това се превръща в едноверижна (ss) сДНК чрез обратна транскриптаза с помощта на неспецифични (олигоdT или случайни хексамери) или специфични (имуноглобулин СН1 или СК или СХ постоянни региони) олигонуклеотидни праймери. Едноверижната сДНК, получена по тази реакция, се амплифицира чрез полимеразна верижна реакция, в която ss сДК, заедно с дезоксинуклеотид трифосфати, ДНК полимераза (напр.термостабилна полимераза) и специфични праймери, се използват за амплифициране на тежко или лековерижни вариабилни области на имуноглобулинови гени. Използваните праймери са едноверижни синтетични олигонуклеотиди в границите на 20 до 40 бази, които съдържат някои дегенерирали бази, свързани с имуноглобулин 5' лидерни последователности. Шест различни 5' лидерни секвенционни праймери (виж фиг. 7-1, включващ сайт за рестрикционен ензим (напр. Sail), са конструирани за амплифициране на семейство маймунски тежковерижни вариабилни области, основани на тяхното сходство със семейството на човешки гени с тежковерижни вариабилни области. С всеки от шестте 5' лидерни секвенционни праймери се използва 3' праймер, специфичен за областите с постоянни региони от релевантен изотип (напр. IgG, IgM, IgA или IgE) и включващ сайт за рестрикционен ензим например Nhel). Аналогично на това за маймунски κ или λ леки вериги, се използват други двойки праймери за амплифициране на подходяща лековерижна вариабилна област (фиг. от 7 до 2).

За инокорпориране на различни уникални ерстрикционни сайтове, с което да се позволи директно клониране на PCR амплифицирана ДНК в подходящ експресионен вектор, имащ същия рестрикционен сайт, се използва друга система от праймери. Система от праймери, свързващи към 3' края на антитялото тежковерижна лидерна последователност, инкорпорираща Mlul сайт, или система от праймери, свързващи към първите 23 бази от структурата един инкорпориращ Xhol сайт, може също да бъдат използвани и са описани на фиг.7-1. Маймунските имуноглобулинови гени с тежко- и лековерижни вариабилни области могат да бъдат клонирани в совалков вектор директно след PCR амплификация, за да позволи по-нататъшни молекулни манипулации, ако е необходимо, или да се колнират директно в един експресионен вектор, който съдържа човешки гени с тежко, или лековерижни области. Молекулната конфигурация на имуноглобулиновите гени в експресионния вектор може да бъде геномна, в която имуноглобулиновата промоторно/усилваща или други регулаторни области са представени като свързани донор/акцепторни последователности при интрон/екзоновата връзка. Обратно, химерни имуноглобулинови гени могат да бъдат инсертирани в сДНК конфигурация с помощта на хетероложни вирусни промоторно/усилващи последователности.

Пример 1. Последователност на маймунски антитела.

На фиг.7 и 8 са показани праймери с или без рестрикционни сайтове, респ., използвани в PCR амплификацията на имуноглобулинови гени от маймунски и/или човешки сДНК. Детайлите на използваната процедура са описани по-долу. РНК се изолира от клетки на далак, периферна кръв и лимфни възли на маймуна с помощта на стандартен гуанидин изоцианатен метод. Цялата РНК фракция, изолирана по този метод, след това се използва като матрица за последващи реакции на амплифициране. Определено количество РНК се инкубира в присъствие на 200 единици обратна транскриптаза, произхождащ от Moloney миши левкемиен вирус и неспецифични (олиro-dT или случайни хексамери) или специфични (имуноглобулин IgG СН1 регион или верижен постоянен регион СК) олигонуклеотидни праймери (50-100 pmol) за генериране на некодираща смислова едноверижна сДНК. Едноверижната сДНК, получена по тази реакция, след това се амплифицира с помощта на полимеразна верижна реакция (PCR). Определено количество от едноверижната сДНК се инкубира заедно с дезоксинуклеотид трифосфати (20 μΜ), термостабилна ДНК полимераза (2-5 единици) и получени от човек синтетични олигонуклеотидни праймери (50 pmol), за амплифициране както на тежко-, така и на лековерижните вариабилни области на имуноглобулиновите гени.

С помощта на двойки от праймери, показани на фиг.8, се амплифицират няколко представителни cynomolgus имуноглобулин леко- и тежковерижни вариабилни области от различни генни семейства. Тези амплифицирани последователности се клонират в EcoRV сайт от плазмидния вектор р- Blue-script (pBS, достъпен от Stratagene, СА) и се използват за секвениране на ДНК. Това секвениране се осъществява с помощта на плазмидна ДНК, съдържаща клонирания инсерт като двойно верижна ДНК матрица и стандартния метод на крайно секвениране на веригата.

Представителни имуноглобинови последователности от маймуни cynomolgus са показани на фиг. 9А до 9Н. Във фиг. 9А до 9Н са включени консенсус аминокиселинни последователности за човешки гени с вариабилни области, представящи всяко от големите генни семейства с вариабилни области. Показана е процентната хомоложност на всяка маймунска последователност с човешка консенсус последователност, изключвайки постоянните области и CDR областите. Нивото на хомоложност между човешки и маймунски последователности за дадено семейство е толкова високо, колкото между две човешки последователности в рамките на едно семейство. Поради това е невъзможно да се направи отличаване на имуноглобулиновите последователности с вариабилни области, произхождащи от маймуни от Стария свят, и тези, произхождащи от хора единствено на базата на сравнение на аминокиселинните последователности.

Изолиране на РНК

Маймунски антигенспецифични В-клетки са получени по няколко начина. Посредством сливане на клетки от лимфни възли на имунизирана маймуна с човешко/миша хетеромиеломна клетъчна линия К5Н6/В5 и последващо скриниране на хибридомните линии чрез вирусно трансформирани В-клетки или чрез in vitro В-клетъчно клониращи техники. В последния случай култивирането на отделни маймунски В-клетки се поддържа in vitro чрез кокултивиране с човешки Т-клетки, стимулирани с антитяло. По една В-клетка се поставя във всяко кладенче от 96-кладенчова плочка за тъканна култура заедно с приблизително 150 000 анти-СОЗ-стимулирани, третирани с митомицин С човешки Т-клетки. След две седмици инкубационен период единичната В-клетка се препосява в поне 200 диференцирани плазмени клетки. Културалната супернатанта от тези кладенчета се изпитва за присъствие на имуноглобулин чрез ELISA техниката с помощта на улавящо антитяло от кози антимаймунски имуноглобулин.

Клетките както от антигенспецифичните вирусно трансформирани клетки или хибридоми се култивират в достатъчно количество за екстрахиране на РНК. Кладенчетата от in vitro В-клетъчното клониране, които са позитивни за имуноглобулин, се отстраняват, промиват се със студен фосфатен буфер с pH 7,5 и се центрофугират (1000 х g 10 min). Промитите клетки се суспендират в 100 μΐ лизисен разтвор (4М гуанидин изотиоцианат, 25 mM натриев цитрат с pH 7,0, 0,5% натриев саркозин, 0,1 М 2-меркаптоетанол), добавя се 10 μΐ 2М натриев ацетат с pH 4,0 и се смесват. Протеинът се отстранява чрез добавяне на 100 μΐ воден наситен фенол, смесвайки и добавяйки 20 μΐ хлороформ/изоамилов алкохол (49:1). След разбъркване на Vortex и инкубиране върху лед за 15 min пробите се центрофугират при 10 000 х g за 20 min. Водната фаза се прехвърля в нова епруветка, смесва се с еднакъв обем изопропанол и се инкубира за 1 h при -20°С. Преципитатът се събира чрез центрофугиране при 10 000 х g за 15 min, промива се с етанол, рецентрофугира се и утайката се изсушава в Speedivac (Savant). Изсушената РНК се разтваря повторно в 100 μΐ от лизисния буфер. Еднакъв обем от изопропанола се добавя и се инкубира при -20°С за 1 h. Преципитатът се събира чрез центрофугиране при 10 000 х g за 15 min и се промива със 70% етанол. Утайката се изсушава в Speedivac (Savant) и се съхранява при -20°С в 70% етанол до използването й.

Синтез на едноверижна сДНК

Цялото количество РНК, екстрахирано от клетките, произхождащи от едно отделно кладенче на плочката за тъканни култури, се разтваря в 32 μΐ (50-100 pmol) от праймера (независимо дали са случайни хексамери, олиго dT или 3' имуноглобинспецифични праймери) и 10 μΐ от 5Х буфер за обратна транскриптаза (0,25 Tris-HCl pH 8,3, 0,375 М КС1, 15 mM MgCl₂, 50 тМ дитиотреитол). Сместа се загрява при 65°С за 5 min, след което се поставя в лед за 2 min. След нагряването се добавят 1 μΐ PHKsin (Promega), 5 μΐ от 5 mM дезоксинуклеотид трифосфати и 1 μΐ (200 единици) обратна транскриптаза от Moloney миши левкемичен вирус (BRL) и сместа се инкубира при 37°С за 1,5 h. След осъществяване на обратно транскриптазната реакция едноверижната сДНК/РНК смес се екстрахира с фенол/хлороформ и се пропуска през 1 ml SEP

HADEX spin-колона. Материалът, преминал през тази колона, се използва като матрична ss сДНК за PCR амплификация.

Амплификация на ss сДНК

От 3 до 10 μΐ ss сДНК се смесват с 10 μΐ 10Х PCR буфер (500 mM KCi, 100 тМ Tris НС1 pH 8,3, 15 mM MgCl₂), 1,6 μΐ 1,25 mM дезоксинуклеотид трифосфати, 50 pmol от специфичния имуноглобулинов 5' праймер, 50 pmol от специфичния имуноглобулинов 3' праймер и 2-5 единици термостабилна ДНК полимераза (Synthetic Genetics). Обемът на реакцията се довежда до 100μ 1 с вода и се покрива със 100 μΙ минерално масло. Реакционната смес се инкубира при следната температура за определено време: 94°С за 1 min; 48°С за 2 min и 72°С за 2 min.

Този цикъл се повтаря 30-35 пъти. Амплифицираните продукти се изпитват чрез агарозна гел електрофореза с помощта на 1,2% агарозен гел и молекулярно тегловни стандарти. Амплифицираните имуноглобулинови гени с вариабилни региони показват между 350-500 Ьр маркера. PCR амплифицираните продукти след това се използват за клониране в подходящ плазмиден вектор.

Пример 2. Клониране на гени за маймунско антитяло

Докато последователностите на гените за маймунски вариабилни области на сДНК ниво, е невъзможно да бъдат отличени от членовете на еквивалентно генно семейство за хора, имунният отговор на маймунско/човешки химерни антитела, ако има, е малко вероятно да бъдат различни от тези, отчетени срещу човешки антитяло молекули.

PCR технологията може да бъде използвана за въвеждане на специфични сайтове на рестрикционни ензими, включително (но не ограничени до) Sail, Bglll, ΚρπΙ и Nhel, в последователности на вариабилни области на гени на маймуни по време на реакции на амплифициране с помощта на праймери, основани на тези от фиг.6. По-рано съществуващи клонирани гени са амплифицирани от техен специфичен вектор с помощта на тези праймери за въвеждане на специфичен рестрикционен сайт, който впоследствие се използва за клониране на гена в експресионен вектор. Обратно, тези праймери са използвани за директно амплифициране от клетъчна РНК.

Конструираните вектори са два типа. Първият от тях (виж фиг. 3 и 4) позволяват клонираните сДНК за вариабилните области на имуноглобулина от маймуни да бъдат инсертирани във векторна касета с помощта на уникални рестрикционни сайтове, при които гениите елементи на имуноглобина са аранжирани в геномна конфигурация. Този тип вектори инкорпорират един имуноглобулинов промотор, двата екзона, които изграждат имуноглобулиновата лидерна последователност, два клониращи сайта Spel и Nhel, които свързват в посока down-strean прикрепящи донорни последователности, един имуноглобин усилващ регион, човешки постоянен генен регион (леко- или тежковерижен) и полиаденилационни сигнали в посока down-stream по последователността на веригата. В допълнение те включват бактериално начало на репликация, β-лактамазен ген за бактериален подбор и неомицин фосфотрансферазен ген за G418 подбор, или ксантин - гуанин фосфорибозил трансферазен ген (gpt) за микофенол-киселинна селекция в клетките на бозайник. Тежко- и лековерижните експресионни вектори използват неомицин фосфотрансферазни (Neo) и ксантин-гуанин фосфорибозил трансферазни (Gpt) гени, съответно като селективен маркер.

Вторият тип експресионна система (виж фиг.5 и 6) използва имуноглобулинови гени в сДНК конфигурация. Това означава, че няма интронни или свързващи сайтове между 5' лидерната последователност и 3' последователността на постоянната област. Този тип вектор използва хетероложни вирусни промоторни/усилващи последователности, водещи имуноглобулиновите леко- и тежковерижни гени, аранжирани като тандем, полиаденилационните последователности и селективния маркер за клетки на бозайници (Neo). Neo генът може да бъде модифициран за отслабване на неговата способност на транслиране, например чрез изменение на кодона в посока up-stream и в съседство на стартовия сайт от гена на АСС до ТСТ. В допълнение дихидрофолат редуктазният ген (dhfr) е предоставен за последваща генамплификация с метотрексат. За клониране на маймунски гени с променливи части в експресионни вектори със сДНК конфигурация, те се амплифицират или от по-рано съществуващи клонирани последователности в совалков вектор (PBS), или от РНК с праймери, съдържащи или рестрикционните сайтове Sall или Mlul и Nhel, за тежковерижни, или Bglll и ΚρηΙ или BsiWI за к или λ леки вериги. Други потенциални уникални сайтове за рестрикция обаче не са изключени.

Химерните гени на тежката или леката верига на имуноглобулините се въвеждат поотделно или успоредно (за структури с геномна конфигурация) или в същия вектор (за структури със сДНК конфигурация) чрез електропорация в продуцираща клетъчна линия. Електропорацията се използва за въвеждане на линеаризирани ДНК структури в клетки от яйчник на Китайски хамстер (СНО) или миши миеломни клетки, последвано от клониране на отделни клетки от трансфектантите в 96-ямкови плаки за тъканни култури. Условията на електропорация с помощта на ВТХ-100 (ВТХ, San Diego) електропорационно разделяне и 1 ml достъпни пластмасови кювети дават оптимално число трансфектанти от даденото количество векторна ДНК. СНО клетките, които са адаптирани за растеж в суспензия в среда без серум (CHO-S SFM II без хипоксантан и тимидин, Gibco), се използват в структури, съдържащи вирусни регулаторни елементи.

Субклониране на Ig гени с променливи части

Продуктите на PCR реакцията се екстрахират с фенол-хлороформ и се пропускат през 1 ml SEPHADEX G-25 spin колона. Ако ДНК фрагментът е клониран, за да бъде със сляп край в плазмид, добавят се 1 μΐ 1М MgCl₂, 0,5 ml 1,25 mM дезоксинуклеотид трифосфати и 1 μΐ ДНК полимераза на Klenow (5 единици) към общата PCR реакционна смес (100 μΐ) и се инкубират при 37°С за 15 min за запълване на всеки 5' край. Преди клонирането на тъпите краища в плазмид, 5' краищата се фосфорилират както следва: 5 μΐ 10 mM АТФ и 1 μΐ Т4 полинуклеотид киназа (10 единици) се добавят към общата реакционна смес и се инкубират при 37°С за 30 min. Амплифицираните фрагменти, които съдържат вътрешни рестрикционни сайтове, най-напред се срязват с подходящ рестрикционен ензим и се използват директно за лигиране без фосфорилиране. В двата случая, за да бъде клониран, фрагментът се екстрахира с фенол/хлороформ преди свързване в подходящия вектор.

За реакцията на свързване 10% от фосфорилирания или срязания с рестрикционен ензим PCR амплифициран фрагмент се смесва с приблизително 2 ng от подходящия вектор (общ обем 8 μΐ), предварително подложен на въздействието на рестрикционен ензим (и). За клониране на тъп край се използва pBluescript, смлян с EcoRV. За клониране на леплив край се използва векторът ТСАЕ 5,2 или 6,0 или pGenex-H или pGenexL, срязан с подходящи рестрикционни ензими. Добавят се 1 μΐ 10Х лигационен буфер (500 mM Tris - НС1 pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 10 mM АТФ, 10 тМ дитиотреитол), 1μ 1 Т4 ДНК лигаза (1 единица) и реакцията се оставя да се осъществи при 14°С за една нощ. Свързаният материал се оизползва за трансформиране на компетентни Е. coli НВ101 клетки с помощта на стандартния метод за трансформация с калциев хлорид. Трансформираните бактерии се селекционират чрез култивиране върху LB ампицилинсъдържащи агарни пластинки. Отделните колонии се подбират и култивират една нощ в LB-среда, съдържаща ампицилин, и плазмидната ДНК се екстрахира с помощта на стандартния метод на алкален лизис. След рестрикционния анализ за определяне кои клонове съдържат имуноглобулинови инсерти, ДНК е готова за секвениране.

Секвениране на клонираните гени

Клонираните имуноглобулинови гени с вариабилен регион се секвенират с помощта на стандартния метод за терминиране на веригата. Двойноверижна плазмидна ДНК, съдържаща клонирания инсерт, се използва като матрица за секвениране. Преди секвенирането двойно верижната ДНК се денатурира химично. ДНК се секвенира с помощта на Т7 ДНК полимераза SEQUENASE (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), радиоактивно белязан рдезокси АТФ и следните праймери за секвениране: (5’CAGAGCTGGGTACGTCCTCA З¹) и (5’GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3') и имуноглобулин G тежка верига на вариабилен регион в 5' до 3' и 3' до 5' посоки съответно. (5’CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3') и (5’CGCTTGAAGCTCCTCAGAGAGG 3') за имуноглобулин ламбда лека верига на вариабилен регион в 5' до 3' и 3’ до 5' посоки, съответно. Продуктите на реакцията се отделят върху 6% полиакриламидни гелове и се разчитат.

Резултатите от секвенирането на множество гени за леката и тежката верига на вариабилните региони на имуноглобулина на маймуни са обобщени на фиг. 9А-9Н. Клонирането и секвенвирането на cynomolgus имуноглобулинови гени не е описвано по-рано в литературата. Поради това не е било възможно да се определи степента на хомоложност между човешки и cynomolgus гени с V регион. Хомоложността между отделен вариабилен λ ген на шимпанзе и неговия човешки геномен двойник е описано в литературата, показвайки само 2% разлика в структурните региони.

Трансфекция и подбор

След секвенирането на клонираните гени за леко- и тежковерижни вариабилни региони те се подлагат на субклониране в подходящи вектори за експресия. Това могат да бъдат вектори, конструирани с имуноглобулинови регулаторни елементи в геномна конфигурация (както е показано на фиг.З и 4) или с вирусни регулаторни елементи, използвайки сДНК конфигурация (фиг. 5 и 6). Подходящи рестрикционни сайтове (Spel и Nhel) могат да бъдат създадени в PCR амплификационните праймери по време на началния етап на амплифициране или да бъдат използвани преобразувани амплификационни праймери, съдържащи рестрикционни сайтове за амплифициране на имуноглобулинови гени от совалкови вектори, в които те са били клонирани. Обратно, имуноглобулинови гени с вариабилни региони могат да бъдат клонирани директно в експресионни вектори след PCR амплификация от РНК, така че субклонирането да не е необходимо.

Електропорация

Електропорацията се използва или за котрансфектиране на тежко- и лековерижните геномни структури или за секвенционна трансфекция на тежко- и лековерижни геномни структури в Sp2/0 клетки. При секвенционното трансфектиране електропорацията на химерните лековерижни структури е последвано от селекция в микофенолна киселина. Скринингът на културалните супернатанти от клоновете, култивирани в 96-ямкови блюда, за лековерижни продукти с антисерум срещу човешки лековерижен постоянен регион се провежда с помощта на ELISA техника, която позволява селекция на най-високо експресираните лековерижни клонове. Последващата електропорация на лековерижните трансфектанти с вектор, съдържащ маймунски човешки химерни тежковерижни имуноглобулинови структури, позволява подбор на трансфектоми, експресиращи химерно антитяло със специално създадена специфич ност и изотип.

Лековерижната структура pGENEX-L (фиг. 3 и 4) се трансфектира в муринова миеломна клетъчна линия Sp2/0 чрез електропорация както следва: Sp2/0 клетки с концентрация 1 х 10⁷/ml в трансфекционен буфер (272 тМ захароза, 7 тМ натриев фосфат pH 7, 4, 1 тМ MgCl₂) се смесват с 50 ug pGENEX-L, съдържащ подходящ клониран лековерижен ген, който е предварително линеаризиран чрез смилане с рестрикционния ензим PvuII. Клетките се поставят в 1 ml спектрофотометрична пластмасова кювета и в нея се поставят платинови електроди 3,5 mm. С помощта на ВТХ - 100 (ВТХ, Inc.) трансфекционен апарат се въздейства на клетките с електричен импулс в продължение на 500 ps, така че 50% от тях загиват. Тази стойност е определена преди трансфекцията на клетките с импулс, в отсъствие на ДНК, с повишаване на волтажа и измерване на оцелелите клетки 24 h по-късно. Преживяемостта на клетките при повишаване на волтажа се представя графично и волтовете, съответстващи на 50% клетъчна смърт, се използват за всички по-нататъшни електропорационни експерименти. С помощта на ВТХ100 апарат е установена оптималната степен на импулса при амплитуда от 200 до 500 ps. След въздействието клетките се оставят за възстановяване върху лед за 15 min, преди да бъдат прехвърлени в 96-ямкови блюда за тъканни култури в Dulbecco модифицирана среда на Eagle (DMEM), съдържаща 5% зародишен телешки серум и 10% Sp2/0 кондиционирана среда. Клетките се посяват при концентрация, при която клетъчният растеж достига приблизително една трета от кладенчетата след селекция с подходящо лекарство. Този параметър се определя за всеки електропорационен експеримент чрез посяване на различен брой електропорирани клетки в една ямка (1000-10 000) и селекция на клетките, които са включили плазмид. Броят на ямките за всяка паничка, които показват клетъчен растеж, се преброява 2-3 седмици след селекцията. Така е определен броят на клетките, които дават 1 от 3 позитивни ямки с определена концентрация на специфичен плазмид за нуждите на бъдещи експерименти.

Веднага след електропорацията клетките се поставят в среда без лекарство. Добавя се прясна среда два дни след това, съдържа12 ща или G418 или микофенолна киселина за клетките, проявяващи неомицин фосфотрансферазна или гуанидил фосфотрансферазна активност, съответно. Клетките се подхранват всеки два дни през първата седмица и след това два пъти седмично. Концентрацията на използваното лекарство е определена чрез инкубиране на клетките в присъствие на повишени концентрации и наблюдаване на клетъчната преживяемост. Концентрацията на използваното лекарство е два пъти по-голяма от необходимата за 100% смъртност. За Sp2/0 е необходимо приблизително 1 pg микофенолна киселина/ml, а за G418 - приблизително 800 pg/ml.

Клетките се електропорират по няколко начина, независимо дали се ко- електропорират леко- или тежковерижни геномни вектори (pGeneex-H и pGenex-L) или лековерижните се електропорират поотделно. В последния случай клоновете се скринират за високо ниво на експресия на химерна имуноглобулинова лека верига с помощта на ELISA техника. Тези клонове след това се култивират и електропорират с тежковерижни, съдържащи вектор. Ако се използват сДНК тандемни структури, експресионният вектор (ТСАЕ5.2 или ТСАЕ6) найнапред се линеаризира чрез разграждане с рестрикционния ензим Notl. Една единствена електропорация е достатъчна за постигане на интегриране между тежко- и лековерижни гени. След 2-3 седмици супернатантите от ямките, които продължават развитието си в присъствие на подходящо лекарство, се изпитват за секретиране на химерни имуноглобулинови леки вериги или на цял имуноглобулин с помощта на ELISA техника. Имуноглобулиновите гени в сДНК конфигурация се подлагат на електропорация или в Sp 2/0 клетки, както е описано по-горе, или в овариални клетки на китайски хамстер (СНО), адаптирани да се развиват в суспензия на среда без серум. СНО клетките се електропорират с помощта на ВТХ 600 електропорационен апарат, поставен при условия за достигане на максимално число G418 резистентни колонии. Това са 210 V, 400 pF и 13 υ. След електропорация, клетките се преброяват, промиват се в трансфекционен буфер, ресуспендират се в същия буфер и се поставят в лед за 15 min. Клетките се довеждат до концентрация 1 х 10’ живи клетки/ml и 400 μΐ от клетъчната суспензия се поставя в 0,4 ml стерилна кювета (ВТХ Inc.). 25 pg линеаризиран с Not I ТСАЕ 5,2 или ТСАЕ 6-векторна ДНК, съдържаща клонирани имуноглобулинови гени от макак с вариабилни региони, се ресуспендира в ТЕ буфер (10 mM Tris, 1 тМ EDTA, pH 8,0) при 1 pg/ml и се добавя към клетъчната суспензия. Електропорацията се провежда чрез пускане на апарата с помощта на автоматично зареждане и бутона за пускане. Кюветата се поставя на лед за 15 min, клетките се разреждат в 120 ml среда без серум и се поставят в шест 96-ямкови плочки (200 pl за една ямка, съдържаща приблизително 6,667 електропорирани или 3,333 живи клетки на ямка). Независимите параметри за електропорацията са установени с тази клетъчна линия, а селекцията чрез G418 е осъществена при 400 pg/ml.

Изследване за получаване на антитяло

Присъствието на човешко, маймунско или химерно антитяло, секретирано чрез трансфектанти, се изпитва с използване на ELISA техниката както следва: 96-ямкови плоски плочки (Dynatech) се покриват с кози античовешки IgG или к при 200 ng/ямка в покриващ буфер (натриев карбонат 0,8 mg/ml, натриев бикарбонат 1,55 mg/ml, pH 9,6) и се инкубира поне за 16 h при 4°С. Покриващият буфер се отстранява и ямките се блокират със 120 pl блокиращ буфер (I % телешки серумен албумин във фосфатно буферен разтвор, съдържащ 0,2% натриев азид) и се инкубира при 37°С за 1 h. Добавят се до 125 pl от клетъчно културалната супернатанта към кладенчетата, съдържаща блокиращ буфер, и се инкубират 2 h при 37°С. Плочките след това се промиват петкратно с PBS. Добавят се 100 pl, белязан с пероксидаза от ряпа кози анти-човешки IgG (или κ), разреден 1:1000-1:5000 в буфер за разреждане (1 % телешки серумен албумин, 0,05% Tween20, 0,02% натриев азид в PBS). Плочките се инкубират при 37°С за 1 h, след което се промиват пет пъти с PBS. Химерното антитяло се открива със 100 pl хидроген пероксид и субстрата, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (1:1 v/v) за ямка. Цветната реакция се провежда в рамките на 2 до 5 min със 100 pl 2М сярна киселина за ямка.

Съгласно изобретението за целта могат да се приложат и еквивалентни на описаните по-горе методи. Примерите за подобна техника включват обезсмъртяване на подбрани Вклетки чрез хибридомно сливане, както е описано по-горе, с клетъчната линия Н5Н6/В5, описана от Carrol et al., 164 J. Experimental Medicine 1566, 1986, или еквивалентна клетъчна линия, като SPAZ4 (предоставена от Sandoz, виж Ehrlich et al., 34 Clin. Chem. 1681, 1988). Подобни клетъчни линии могат да бъдат създадени по стандартни техники с помощта на достъпни методи. Алтернативно имуноглобулиновите гени могат да бъдат клонирани от: (а) клетки, обезсмъртени чрез вирусна трансформация с Herpes papio, описано от Marcova et al., 30 Vorp Virusol 549, 1985, или c еквивалентен вирус, или (b) чрез В-клетъчно клониране за обезпечаване на временно обезсмъртяване, описано от Amaroso and Lipske 145 J. Immunology 3155, 1990, или (c) чрез използване на рекомбинантни имуноглобулинови бактериофагни библиотеки, описани от Huse et al., 246 Science 1275, 1989 and McCafferty et al., 348 Nature 552, 1990. Изследването за подходящи антитялосъдържащи клонове може да бъде осъществено, както е описано по-горе, или чрез еквивалентни техники на описаните по-горе, за да се получи желаният ген от така обезсмъртената клетъчна линия. В допълнение антитялото, продуцирано от изолирани маймунски В-клетки, може да бъде използвано за лечение на хора, без манипулиране за формиране на химерно антитяло.

Човешката постоянна област може да бъде получена по стандартни техники с който и да е желан изотип, добре познат на специалистите в областта, а вариабилната област от маймунско антитяло да бъде свързана към тази маймунска постоянна област. Специално приложими в имунотерапията на хора химерни антитела срещу специфични клетъчни повърхностни рецептори са CD4, ICAMs, CD19, CD20, CD8, CD1 la, CD1 lb, CD28, CD18, CD45, CD71 и TCR.

Пример 3. Клониране и експресия на маймуно/човешко химерно антитяло, специфично за CD4.

Примерът е специфичен за методите и антителата съгласно изобретението.

Получаване на безсмъртна маймунска Вклетъчна линия

Възрастна маймуна cynomolgus (White Sands New Mexico Primat Center) се имунизира интрамускулно на различни места със 150-300 pg разтворим CD4 (sCD4) или клетъчни мембрани (1 х 10⁸ клетки) от CD4 позитивна клетъчна линия supTl с помощта на стандартно помощ но средство. Имунизирането се повтаря всеки 23 седмици общо шест пъти. Маймуната се имунизира повторно чрез инжектиране на 100 pg sCD4 в ингвиналната област на едното бедро и една седмица по-късно лимфният възел от същото бедро се отделя хирургично. Лимфоцитите се отделят от лимфния възел чрез срязване на тъканта и промиване със стерилна DMEM среда. Клетъчната суспензия се прекарва през найлонова марля и се събира чрез центрофугиране при 1000 х g за 10 min.

Приблизително 1 х 10⁶ лимфоцити се суспендират в Tris-амониево хлориден буфер (16 тМ, pH 7,5) и се загряват до 37°С за 5 min за лизис на еритроцитите. Лимфоцитите се събират чрез центрофугиране и се ресуспендират в Lлевцин метилов естер (LME) и се инкубират на 37°С за 45 min. Третираните с LME клетки се филтрират през найлонов екран и се центрофугират. Добавя се 1 ml фетален телешки серум, клетките се суспендират и промиват двукратно в свободен от серум RPMI. Клетките се преброяват и смесват в единична 50 ml конична центрофужна епруветка заедно с еднакъв брой К6Н6/В5 хетеромиеломни клетки и се промиват още два пъти в свободна от серум среда. След това клетките внимателно се суспендират в 1 ml 50% PEG (полиетиленгликол), добавян бавно при внимателно разбъркване за време над 1 min. След това клетките се ресуспендират в 20 ml свободна от серум среда, добавяна бавно за повече от 5 min, с внимателно смесване за доразреждане на PEG. След промиване двукратно със свободна от серум среда клетките се ресуспендират при концентрация 5 х 10⁵/0,1 ml в RPMI среда, съдържаща 20% фетален телешки серум и гентамицин, и се поставят в 96-ямкови микротъканни плочки при 0,1 ml за ямка. Еднакъв обем от НАТ средата (0,1 ml) се добавя към всяка ямка и хибридите се оставят да растат в продължение на 14-17 дни преди изследването (скрининга) им.

Изследване на слети клетъчни хибриди за продуциране на анти-СО4

Изследването за определяне на анти-СО4 специфичност се провежда както следва: ELISA плочки се покриват с рекомбинантни sCD4 при концентрация 100 ng за една ямка и се блокират с 1 % телешки серумен албумин в BPS. Количество, равняващо се на 50 μΐ от хибридомната супернатанта, се отстранява от всяка ямка и се оставя за инкубиране с покритите с sCD4 плочки за 60 min. Свързването се установява при инкубиране с I¹²⁵ белязан кози античовешки или кози анти-маймунски Ig за 60 min. След четирикратно промиване с дестилирана вода ямките се преброяват в гамаброяч. Позитивните ямки се изпитват повторно и хибридомните клетки от тях се субклонират три пъти, първо при 5 клетки за една ямка, след това при една клетка за ямка. На този етап позитивните aHTH-sCD4 се изследват за способността им да се свързват към клетъчната повърхност на CD4. Това се осъществява чрез инхибиране свързването на анти-СО4 миша моноклонална, означена като 1F3, към CD4 позитивната клетъчна линия supTl. Накратко това е осъществено чрез ко-инкубиране на различни количества маймунско анти-СО4 и 10 ng от 1^ш-белязаната 1F3 с 3 х 10⁵ supTl клетки/ямка в 96ямкова плочка. След инкубиране за 1 h при стайна температура (около 20-25°С), клетките се отстраняват под вакуум върху стъклен филтър. След екстензивно промиване с PBS филтрите се преброяват в гамаброяч за определяне инхибицията на 1F3 свързването към supTl клетки от супернатантите на маймунската хибридома.

Изборът на клона се извършва на основата на проява на силно инхибиране на 1F3. Клонът, който е избран, е подложен на въздействието на изотипиращи реагенти и е установено, че представлява IgG2, имащ λ лека верига. Тази клетъчна линия се култивира до поголямо количество за клониране на нейните имуноглобулинови гени.

Клониране на гени с леко- и тежковерижни вариабилни области от маймунски обезсмъртени В-клетки

Чрез гуанидин изотиоцианатния метод, описан по-горе, се изолира общото количество РНК от 1 х 10⁷маймунски обезсмъртени Вклетки. Една десета част от общото количество РНК се използва за получаване на едноверижна сДНК с помощта на олиго-dT олигонуклеотиден праймер и обратна транскриптаза, също както е описано по-горе. Една десета от количеството на ss сДНК се използва за провеждане на PCR реакциите. Всяка от шестте PCR реакции включва една от шестте 5’V_H специфични за семейството олигонуклеотидни праймери, съдържащи Sal 1 рестрикционен сайт заедно с IgG 3' олигонуклеотидна постоянна област, която съдържа от своя страна Nhe I сайт, като и двата са показани на фиг. 7-1. По аналогичен начин се провеждат пет PCR реакции, използвани един от петте 5'λ лидерни секвенционни олигонуклеотидни праймери, съдържащи Bgl II сайт и 3'λ праймер с постоянна област, която съдържа Avr II сайт. Условията на реакцията са такива, каквито са описани по-горе, Всяка PCR реакция се провежда три пъти. Продуктите от всяка лековерижна и тежковерижна амплификационни реакции се провеждат върху 1,2% агарозни гелове. VH4 тежковерижният праймер (SEQ.ID.No.: 13:5' ACTAAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3') и λ праймерът (SEQ.ID.No.: 14:(5'ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3) показват силно свързване при агарозна гел електрофореза. Продуктите от тези реакции се използват за клониране във вектора ТСАЕ 6, който съдържа от човешка IgGl и λ човешка постоянна област последователности.

След това се осъществява клониране на двата гена с вариабилни области в експресионния вектор ТСАЕ 6. Най-напред тежковерижният PCR продукт и векторът ТСАЕ 6 се разграждат с рестрикционния ензим Sal I и Nhe I, продуктите се екстрахират с фенол/хлороформ и се пропускат през SEPHADEX G-25 spin колона. PCR продуктът се свързва със срязания вектор за една нощ при 14°С в присъствието на Т4 ДНК лигаза. Приблизително 500 ng от общото количество ДНК се свързва в обем от 10 μΐ в моларно съотношение на инсърта към вектора, възлизащо на 10:1. Свързаният материал се използва за трансформиране на XL-1 Blue компонентни клетки (Stratagene) и трансформираните гени се поставят в LB агарни плочки, съдържащи 50 pg/ml ампицилин. Колониите от ампицилин резистентни бактерии се взимат и култивират като 5 ml миникултури. Плазмидна ДНК се екстрахира от всяка от тези култури по стандартния метод на алкално лизиране с рестрикционните ензими Sal I и Nhe I и продуктите се включват в 1,2% агарозен гел. Плазмидите с инсърти от приблизително 450 Ьр се използват като матрици за последващо клониране на лековерижни вариабилни области. Продуктите от лековерижната PCR реакция, както и плазмидът, съдържащ тежковерижния инсърт, се срязват с рестрикционния ензим Bgl II и Avr II и се свързват заедно. Плазмидните миникултури се екранират чрез срязване с Bgl II и Arv II. Срезовете, даващи инсърт от приблизително 400-450 Ьр са отчетени като позитивни. Плазмидите, съдържащи едновременно Sal I/Nhe I и Bgl II/ Arv II инсърти, се култивират в по-големи количества за ДНК секвениране.

Тандемните химерни антитяло експресионни вектори ТСАЕ 5.2 и ТСАЕ 6 са получени от вектори CLDN, който сам по себе си е произведен на вектора RLDNIOb (253 Science 77-99,1991). RLDNIOb на свой ред е произведен на експресионния вектор TND (7 ДНК 651-661, 1988).

RLDNIOb се различава от вектора TND по следния начин. Дихидрофолат редуктазната (DHFR) транскрипционна касета (промотор, сДНК, и област на полиаденилация) се поставя между тъканна плазминоген активаторна касета (t-PA експресионна касета) и неомицин фосфотрансферазна (ΝΕΟ) касета, така че всичките три касети са в тандем с еднаква транскрипционна ориентация. В допълнение промоторът на DHFR гена в CLDH се замества от мишия бетаглобин голям промотор (3 mol.Cell Biol. 1246-54, 1983), a t-3b сДНК се замества от полилинкер. Всичките три еукариотни транскрипционни касети (Expresion, DHFR, ΝΕΟ) могат да бъдат разделени чрез бактериални плазмидна ДНК (pUC9 производна) чрез разграждане с рестрикционната ендонуклеаза Not I.

CLDN се отличава от RLDN, поради това, че Rous LTR пред полилинкера е изместен от човешки цитомегаловирусен ранен генен промоторен енхансер (41 Cell, 521, 1985).

Експресионните вектори ТСАЕ 5.2 и ТСАЕ 6 се отличават от CLDN в следното:

1) Те съдържат четири транскрипционни касети (вместо три) в следния тандемен порядък:

a) Човешка имуноглобулинова лековерижна постоянна област получена чрез амплифициране на сДНК с полимеразна верижна реакция. В ТСАЕ 5.2 това е човешка имуноглобулинова лековерижва постоянна област (Kabat номерирани аминокиселини 108-214, алотин Km³) и в ТСАЕ 6 човешка имуноглобулинова лековерижна постоянна област (Kabat номерирани аминокиселини 108-215, генотип Oz минус, Mcg минус, Не минус алотип)

b) Човешка имуноглобулинова тежковерижна постоянна област; в двата случая човешката имуноглобулинова тежка верига е гама 1, постоянна област (Kabat номерирани амино киселини 114-478 алотип Gmla, Gmlz), която се получава чрез амплифициране на сДНК с полимеразна верижна реакция.

c) DHFR, съдържащ свой собствен еукариотен промотор и област на полиаденилация;

d) ΝΕΟ, също съдържащ свой собствен еукариотен промотор и област на полиаденилация.

3) Човешките имуноглобулинови лекои тежковерижни касети съдържат синтетични сигнални последователности за секретиране на имуноглобулиновите вериги.

4) Човешките имуноглобулинови лекои тежковерижни касети съдържат специфични ДНК линкери, които позволяват инсерция на леко- и тежкоимуноглобулинови вариабилни области, които поддържат транслационната рамка на разчитане и не изменят аминокиселините, нормално намерени в имуноглобулиновите вериги. Инкорпорирането на описаните изменения води до структурата на векторите ТСАЕ 5.2 и ТСАЕ 6. Клонирането на имуноглобулиновите леко- и тежковерижни гени, от анти-СО4 хетерохибридомната клетъчна линия Е9.1, в ТСАЕ 6 води до структурата, която е депозирана в АТСС, + 69030 от 09.07.92. Депозираната структура съдържа имуноглобулинова маймунска (cynomolgus) тежковерижна и лековерижна вариабилни области, чиито последователности са показани на фигури 13 и 14, съответно, клонирани от анти-СО4 хибридомната клетъчна линия Е9.1. Тежковерижната постоянна област е с човешки произход от гама 1 изотип и Gmla, Gmlz алотип. Лековерижната постоянна област е също с човешки произход, от Oz минус, mcg минус генотип и Ке минус алотип. Имуноглобулиновите гени са клонирани в бозайников експресионен вектор ТСАЕ 6, показан на фиг. 6, който, когато е подложен на електропорция в клетъчна линия на бозайници СНО, продуцира маймунско/човешко анти-СО4 химерно антитяло. Описаната тук ДНК структура е използвана за трансформиране на бактериалния щам XL1 Blue, селекциониран в среда на антибиотика ампицилин и депозиран като бактериална клетъчна суспензия в стерилна LB среда, съдържаща 15% глицерол.

Друга експресионна система, която може да бъде използвана, е тази, в която генът, кодиращ селективен маркер, се модифицира за повишаване добива на рекомбинантните системи, кодиращи желаната последователност. Например увреждане иницирането на транслацията на доминантен селективен маркер води до малко резистентни на лекарства колонии в сравнение с неувреден вектор, но всяка индивидуална колония експресира значително повисоки нива от ко-свързания генен продукт, отколкото неувредения вектор. Например инициирането на транслацията е първият етап в протеиновата синтеза. Транслационният инициаторен сайт за неомицин фосфотрансферазния ген (G418 резистентен ген) е изменен от консенсус Kozak (последователност - ссАсcATGG) до бедна Kozak (последователност ccTccATGC). Увреждането на иницирането на транслацията на G418 резистентният ген води до следните промени:

1) Значително (5-кратно) редуциране на броя на G418 резистентните колонии, получени от същото количество плазмидна ДНК, трансфектирана за една клетка, и

2) значително увеличение на броя на косвързания генен продукт, експресиран във всеки клон. В клоновете, съдържащи консенсус Kozak, 73% от изследваните колонии продуцират помалко от 25 ng/ml, само с 3% повече от 100 ng/ml. За клоновете с променена по-бедна Kozak, 8% от изследваните колонии продуцират по-малко от 25 ng/ml, в сравнение с 63% от колониите, продуциращи повече от 100 ng/ml. По-специално съгласно фиг. 16 (където JIDE 5.2 съдържа консенсус Kozak и ТСАЕ 12 съдържа по-бедна Kozak), 258 колонии се получават от 2 електропорции от 25 pg ДНК, която съдържа неомицин фосфотрансферазен ген с консенсус (непроменен) транслационен стартов сайт. 201 от тези колонии (78%) не експресират нито един генен продукт, който може да бъде открит (т.е., > 25 ng/ml от химерния имуноглобулин, и само 8 колонии (3%) експресират повече от 100 ng/ml. 98 колонии се получават от 6 електропорации от 25 pg ДНК, която съдържа неомицин фосфотрансферазния ген с един променен транслационен стартов сайт. 63 % от тези колонии експресират повече от 100 ng/ml, и само 8% от тези колонии експресират по-малко от 25 ng/ml.

ДНК секвениране

Плазмидна ДНК се получава от 100 ml култура. Последната по-нататък се пречиства чрез преципитиране (1 обем) със смес от 2,5 натриев хлорид и 20% полиетиленгликол (6 обема) върху лед за 15 min. След центрофугиране при 10 000 х g за 20 min утайката се промива със 70% етанол, рецентрофугира се и се изсушава в Speedivac (Savant). Утайката от ДНК се ресуспендира в дейонизирана вода при концентрация 150-250 pg/ml. Секвенирането се провежда на 5 pg двойноверижна ДНК с помощта на техниката на Sanger. Използват се такива праймери за секвениране, които са хомоложни на последователностите в рамките на експресионния вектор нагоре и надолу от леко- или тежковерижните инсърти. Инсъртите се секвенират в двете 5' до 3' и 3' до 5' посоки. Два клона от анти-СО4 тежка верига, всяка генерирана от отделна PCR реакция, се секвенират паралелно с оглед определяне на евентуални въведени по време на PCR реакцията изменения. Установено е, че двата от избраните тежковерижни и двата лековерижни клона са идентични по цялата им дължина, потвърждавайки, че не са въведени грешки по време на амплификационния процес. Последователността на анти-CDR тежка и лека веригите е показана на фигури 13 и 14 и на списъка с последователните, номера: 15 и 16.

Експресиране на маймунски/човешки химерни анти-СО4

Експресионните вектори ТСАЕ 5.2 и ТСАЕ 6 не само могат да бъдат използвани за стабилно интегрирана експресия в клетъчните линии Sp2/0 и СНО, но тъй като включват SV40 източника, могат да бъдат експресирани в клетъчната линия COS.COS клетъчната експресия се осъществява по следния начин: COS клетките се посяват един ден преди трансфекцията, така че да могат да се слеят до 50-70% на следващия ден. Културалната среда се отстранява и клетките се промиват двукратно с трансфекционен буфер /ТВ - 140 mM NaCl, 15 тМ Tris, 5 тМ КС1, 0,5 тМ Na₂HPO₄, 1 тМ MgCl₂, 1тМ СаС1₂). 30 pg пречистен с цезиев хлорид ТСАЕ 6 плазмид, съдържащ анTH-CD4 маймунски/човешки химерни леко- и тежковерижни имуноглобулини, се смесват с 3 ml DEAE декстран в един съд (1 mg/ml в ТВ). ДНК се оставя за инкубиране с клетките за 1 h при 37°С. ДНК разтворът се отстранява и се замества с 2 ml 20% глицерол за 1,5-2,5 min, след което клетките се промиват двукратно с ТВ. Клетките се инкубират в 5 ml прясна среда, съдържаща 100 иМ хлорокин за 3-5 h при 37°С, след които се промиват двукратно със среда и се инкубират с нормална DMEM за 72 h. Супернатантата (100 μΐ) от трансфектираните COS клетки се изпитва при различни разреждания за присъствие на антитяло чрез ELISA техники. Използва се кози анти-човешки λ за покриване на 96 ямки от плочките за изпитване и пероксидазно-белязан коси анти-човешки IgG като откриващо антитяло при стандартни ELISA условия. Установено е, че COS клетките продуцират между 10 и 40 ng/ml маймуно/човешко химерно антитяло. По-големи обеми от супернатантата се концентрират 10-кратно и се използват за директно свързващи RIA към CD4 позитивни supTl клетки. Цялото родителско маймунско антитяло и един ирелевентен човешки имуноглобулин се използват като позитивни и негативни контроли съответно (фиг. 11). По-нататък маймунското анти-СО4 и маймуно/ човешкото химерно анти-СО4 се използват за инхибиране свързването на високо афинитетното мише анти-СО4 (1F3) антитяло (фиг. 12). Може да се види, че маймуно/човешкото рекомбинантно антитяло (АТСС + 69030) не само свързва към CD4 позитивни клетки, но също така е способно да инхибира свързването на 1F3 към CD4 позитивни клетки в приблизително същите концентрации от цялото маймунско антитяло или само 1F3.

Изложеното по-долу е пример за методите и антителата от настоящото изобретение.

Пример 4. Продуциране на маймунски антитела срещу човешки лимфоцитни антигени

Възрастна маймуна cynomolgus (White Sands New Mexico Primal Center) се имунизира интрамускулно на различни места с 5 х 10⁸ изцяло позитивни CD54 човешки лимфоцити. Използваните клетки са променени, SB клетки (човешка В лимфоидна линия) и активирани човешки периферни лимфоцити, активирани чрез предварително инкубиране със смес от митоген (2,5 mg/ml), форболов моноацетат (40пМ) и фитохемаглутинин (4 mg/ за кладенче) с участието на стандартна добавка. Имунизирането се повтаря всеки 2-3 седмици за период, поголям от 8 месеца. Серумът на имунизираните животни се подлага на изследване по различно време чрез инхибиране свързването на мише антитяло, 84Н10, за което е известно, че се свързва с 1САМ-1. Разредено количество от 84Н10 се свързва с клетки от яйчник от китайски хамстер (СНО), предварително трансефктирани с експресионен вектор, съдържащ човешка CD54 сДНК и подбрани за висока експресия на клетъчни повърхностни CD54, заедно с повишаване разреждането на маймунския серум. Инхибирането на 84Н10 свързването е показано на фиг. 15.

Други миши моноклонални антитела, които разпознават други човешки лимфоцитни антигени се изпитват чрез инхибиране с участие на маймунски серум, получен по същите имунизационни методи.

Приложение

Антителата, продуцирани по описания по-горе начин, или по еквивалентни техники, могат да бъдат пречистени чрез комбиниране на афинитетна и ситова (гелна) хроматография с оглед охарактеризиране във функционални биологични изпитвания. Тези изпитвания включват специфичността и афинитета на свързване, така, както ефекторна функция се асоциира с експресирания изотип, например ADCC или с фиксиране на комлемента. Такива антитела могат да бъдат използвани като пасивни или активни терапевтични агенти срещу различни човешки заболявания, вкл. В клетъчна лимфома, инфекциозни заболявания, вкл. СПИН, автоимунни и възпалителни заболявания и трансплантации. Антителата могат да бъдат използвани както в тяхната нативна форма, така и като част от антитяло/ хелатен, антитяло/лекарствен или антитяло/ токсинов комплекс. В допълнение цялото антитяло или фрагменти от антителата (Fab₂, Fab, Fv) могат да бъдат използвани като предполагаеми реагенти или като потенциални ваксини или имуногени в активната имунотерапия за продуциране на анти-идиотипни отговори.

Количеството на антитялото, приложимо за получаване на терапевтичен ефект, може да бъде определено по стандартни техники, добре познати на специалистите в областта. Най-общо антителата се предоставят чрез стандартни методи във фармацевтично подходящ буфер и могат да бъдат въвеждани по всеки желан и подходящ за случая начин. Поради ефикасността на по-рано претендираните антитела и тяхната поносимост от хората, възможно е да се въвеждат тези антитела многократно с оглед избягване на различни заболявания или болестни състояния у човека.

Анти-CD рекомбинантните антитела (или техни фрагменти) от настоящото изобретение също така са приложими за осъществяване на имуносупресия, вкл. супресия на човешка или животинска имунна система. Поради това, настоящото изобретение се отнася до метод за профилактично или терапевтично индуциране на имуносупресия при необходимост при хора или други животни чрез въвеждане на ефективно нетоксично количество от такова антитяло съгласно изобретението.

Способността на съединенията съгласно изобретението да индуцират имуносупресия може да бъде демонстрирана със стандартни тестове, използвани за конкретната цел, например тест на смесена лимфоцитна реакция или тест за измерване инхибирането на Т-клетъчната пролиферация, измерена чрез тимидин.

Фактът, че антителата от изобретението са приложими като имуносупресорни средства, така че да могат да бъдат използвани при лечението или предотвратяването на резистентност към или отхвърляне на трансплантирани органи или тъкани (например бъбреци, сърце, сливици, костен мозък, кожа, рогова обвивка и други); лечението или предотвратяването на автоимунни, възпалителни, пролиферативни и хиперпролиферативни заболявания и остри прояви на имунологични заболявания (например ревматоидни артрити, лупус еритематозус, системен лупус еритематозус, Hashimotos thyroiditis, мултиплена склероза, миастениа гравис, диабет тип 1, ювеитис, нефротичен синдром, псориазис, атопичен дерматит, контактен дерматит и други екземни дерматити, себорейни дерматити, Lichen planus, Pemplugus, bullous pemphigus, епидермолизис булоза, уртикариа, ангиоедеми, вазикулити, еритеми, кожна еозинофилиа, Alopecia areata и други); лечението на реверсивно обструктивно заболяване на дихателните пътища, интестинални възпаления и алергии (например коремни заболявания, заболявания на правото черво, еозинофилни гастроентерити, мастоцитоза, заболяването на Crohn и язвени колити) и хранителни алергии (напр. мигрени, ринити и екземи).

Възможно е чрез рутинни експерименти да се определи какво трябва да представлява едно ефективно, нетоксично количество от антитялото за целите на индуцираната имуносупресия. Най-общо една ефективна доза е приблизително от 0,05 до 100 mg/kg телесно тегло за ден.

Антителата (или техните фрагменти) съг ласно изобретението също следва да се приложими за лечение на тумори при бозайниците. По-специално те следва да бъдат полезни за редуциране размера на туморите, инхибирайки туморния растеж и/или за удължаване времето на преживяемост на туморносещите животни. Съответно изобретението се отнася до метод за лечение на тумори при хора или други животни чрез въвеждане на ефективно нетоксично количество антитяло. Възможно е чрез рутинни експерименти да се определи какво би трябвало да е количеството на антитялото, което ще бъде достатъчно ефективно за лечение на карциногенни тумори. Най-общо ефективната доза се очаква да възлиза на от около 0,05 до 100 mg/kg телесно тегло на ден.

Антителата от изобретението могат да бъдат въвеждани в хората или други животни съгласно посочените методи за лечение в количества, достатъчни да предизвикат такъв ефект с профилактична или терапевтична значимост. Такива антитела следва да бъдат въвеждани в общоприети форми, получени чрез комбиниране на антитялото от изобретението с общоприети фармацевтично приемливи носители или разтворители съгласно известни методи. Формата и характерът на подходящия за фармацевтични цели носител се диктува от количеството на активната съставка, с която следва да бъде комбиниран, начинът на въвеждане и други добре известни необходими действия.

Начинът на въвеждане на антителата от изобретението (или неговите фрагменти) може да бъде орален, парентерален, чрез инхалация или локално. Терминът парентерално включва интравенозно, интрамускулно, субкутанно, ректално, вагинално или интраперитонеално въвеждане. Предпочитат се предимно субкутанната и интрамускулна форма на парентерално въвеждане.

Дневната парентерална и орална доза от съединенията съгласно изобретението, необходими за предизвикване на профилактично или терапевтично индуцирана имуносупресия, или за лечебно третиране на карциногенни тумори е приблизително от 0,05 до 100, за предпочитане около 0,5 до 10 mg/kg телесно тегло на ден.

Антитялото съгласно изобретението може също така да бъде въвеждано чрез инхалация. Под “инхалация” се разбира интраназално или орално инхалаторно въвеждане.

Подходящи форми за подобно въвеждане, например аерозолна форма или изчислена доза за инхалатора, може да бъде приготвена по конвенционални техники. Предпочитаната доза е обикновено приблизително от 10 до 100 mg.

Антитялото съгласно изобретението може също да бъде въведено локално. Под локално въвеждане се разбира несисгемно въвеждане и включва прилагане на антитяло (или негов фрагмент) от изобретението външно към епидермиса, към букалните кухини и накапване на това антитяло в ушите, очите и носа, и където е възможно - в кръвния поток. Системно въвеждане означава орално, интравенозно, интраперитонеално и интрамускулно въвеждане. Количеството на необходимото антитяло за получаване на терапевтичен или профилактичен ефект естествено варира от избора на антитялото, природата на условията, при които се осъществява третирането, и животните, подлагани на неговото въздействие, и се определя категорично от лекар. Подходяща доза за локално приложение на антитяло от изобретението е в рамките на интервала от 1 до 100 mg/kg телесно тегло дневно.

Фармацевтични форми

Доколкото дадено антитяло или негов фрагмент е възможно да бъде въведено самостоятелно, за предпочитане е това да стане във вид на фармацевтична форма. Активната съставка може да включва например за локално приложение от 0,01 % до 10% т/т, например от 1 до 2% тегл. от формата, макар че може да включва до 10% т/т, но за предпочитане не повече от 5% т/т и още по-добре от 0,1 % до 1 % т/т от формата.

Формата за локално приложение от изобретението включва една активна съставка заедно с един или повече подходящи носители и която и да е от другите незадължителни съставки. Носителите следва да са съвместими с останалите съставки от формата и за не са вредни за реципиента.

Формите, подходящи за локално приложение, включват течни или полутечни препарати, подходящи за проникване през кожата към места, в които е необходимо лечение, например линименти, лосиони, кремове, масла или пасти, както и капки, подходящи за приложение в ушите, очите или носа.

Капките съгласно изобретението могат да включват стерилни водни или мастни разтвори или суспенсии и могат да бъдат получени чрез разтваряне на активната съставка в подходящ воден разтвор на бактерицидно и/или фунгицидно средство и/или който и да е друг подходящ консервант и за предпочитане включващ повърхностно активно средство. Полученият в резултат разтвор може след това да бъде осветлен чрез филтруване, да се прехвърли в подходящ съд, който след това се запечатва и стерилизира чрез автоклавиране или се държи на температура от 90 до 100°С за половин час. Алтернативно разтворът може да бъде стерилизиран чрез филтруване и прехвърлен в контейнера чрез асептична техника. Примери за бактериални и фунгицидни средства, които са подходящи за включване в капките, са фенилживачен нитрат или ацетат (0,002%), бензалкониев хлорид (0,01%) и хлорхексидинов ацетат (0,01%). Подходящите разтворители за получаване на мастен разтвор включват глицерол, разреден с алкохол, или пропилея гликол.

Лосионите съгласно изобретението са подходящи за приложение върху кожата или окото. Един лосион за очи може да включва стерилен воден разтвор, незадължително съдържащ бактерицид, като може да бъде получен по методи, аналогично на използваните при получаване на капки. Лосионите или линиментите за прилагане върху кожа могат също да включват средство, ускоряващо подсушаването и охлаждането на кожата, например алкохол или ацетон, и/или овлажнител като глицерол или мазнина като масло от бобър или бадемово масло.

Кремовете, мехлемите и пастите съгласно изобретението са полутвърди форми от активната съставка за външно приложение. Те могат да бъдат изготвени чрез смесване на активната съставка във фино разпрашена форма или във вид на пудра, самостоятелно или в разтвор или суспенсия във воден или неводен разтвор с помощта на подходяща машина, на маслена или немаслена основа. Тази основа може да включва хидрокарбони като твърди, меки или течни парафини, глицерол, пчелен восък, сапун; музилаго; мазнина с природен произход като бадем, пшеница, арахис, боброво или слънчогледово масло; памучно масло или негови производни или мастна киселина като стеаринова или олеинова киселина заедно с един алкохол като пропиленгликол или макрогол. Формите могат да включват което и да е повърхностно активно средство например анионно, катионно или нейонно повърхностно активно средство, като сорбитанови естери или техни полиоксиетиленови производни. Суспендиращите агенти като природен каучук, целулозни производни или неорганични материали като силициеви соли, но могат да бъдат включвани и други съставки като ланолин.

Оптималното количество за индивидуалните дози от дадено антитяло или негов фрагмент съгласно изобретението се определя от природата и условията на третиране, формата, начина и мястото на приложение и спецификата на животното, което се подлага на това третиране, а оптимумите могат да бъдат определени чрез конвенционални похвати. Оптималният курс на лечение, т.е. дозите от даденото антитяло или неговия фрагмент съгласно изобретението, давани на ден за определено количество дни, може да бъде пресметнато с тестовете с обикновен курс на лечение.

Описаните примери поясняват изобретението, без да ограничават обхвата му.

Състав на капсула

Фармацевтичен състав съгласно изобретението може да бъде изпълнен под формата на капсула чрез запълване на стандартни твърди желатинови капсули от две части с 50 mg от антитялото или негов фрагмент във вид на пудра, 100 mg лактоза, 32 mg талк и 8 mg магнезиев стеарат.

Инжекционен състав за парентерално приложение

Фармацевтичен състав от изобретението във форма, подходяща за инжекционно приложение, се приготвя чрез разбъркване на 1,5% тегл. от антитялото или неговия фрагмент съгласно изобретението, в 10% об. пропиленгликол във вода. Разтворът се стерилизира чрез филтриране.

Състав на мехлем

Антитяло или негов фрагмент съгласно изобретението - 1,0 g.

Твърд бял парафин - до 100 g.

Антитялото или неговия фрагмент съгласно изобретението се диспергира в малък обем от вехикулума до получаване на хомогенен, гладък продукт. С тази дисперсия след това се запълват сгъваеми метални туби.

Кремове за локално приложение

Антитяло или негов фрагмент съгласно изобретението - 1,0 g

Polawax GP 200 20,0 g

Безводен ланолин2,0 g

Бял пчелен восък2,5 g

Метил хидроксибензоат0,1 g

Дистилирана вода до 100,0 g

Восъците и ланолинасе нагряват заедно при 60°С. Добавя се разтвор на метил хидроксибензоат и се хомогенизира чрез разбъркване при висока скорост. Температурата след това се оставя да падне до 50°С. След това се добавя антитялото или неговият фрагмент съгласно изобретението и съставът се оставя за охлаждане при разбъркване на ниска скорост.

Лосион за локално приложение

Антитяло или фрагмент от него съгласно изобретението 1,0g

Сорбитан монолаурат 0,6g

Полисорбат 20 0,6g

Цетостеарилов алкохол 1,2g

Глицерин 6,0g

Метилхидроксибензоат 0,2g

Пречистена вода В. Р. до 100,00 ml (В. Р. = British Pharmacopeia)

Метилхидроксибензоатът и глицеринът се разтварят в 70 ml от водата при 75°С. Сорбитановият монолаурат, полисорбат 20 и цетостеариловият алкохол се смесват заедно при 75°С и се добавят към водния разтвор. Получената в резултат емулсия след това се хомогенизира, оставя се да се охлади при непрекъснато разбъркване и антитялото или неговия фрагмент от изобретението се добавят като суспензия в останалото количество вода. Цялата суспензия след това се разбърква до хомогенизиране.

Състав на капки за очи

Антитяло или негов фрагмент съгласно изобретението 0,5 g

Метилхидроксибензоат 0,01 g

Пропилхидроксибензоат 0,04 g

Пречистена вода В. Р. до 100,00 ml

Метил- и пропилхидроксибензоатите се разтварят в 70 ml пречистена вода при 75°С и полученият разтвор се оставя да се охлади. След това се добавят антитялото или неговия фрагмент съгласно изобретението и разтворът се стерилизира чрез филтруване през мембранен филтър (0,022 pm размер на порите), след което се опаковат стерилно в подходящи сте рилни контейнери.

Състав за инхалация

За една аерозолна опаковка с вместимост 15 - 20 ml се смесват 10 mg от антитялото или неговия фрагмент съгласно изобретението с 0,2 - 0,5 % смазващ агент, като полисорбат 85 или олеинова киселина и се диспергира в пропелент,като фреон за предпочитане в комбинация с (1,2 дихлоротетрафлуороетан) и дифлуорохлорометан и се поставят в подходящ аерозолен контейнер, пригоден както за интраназална, така и за орална инхалация.

Състав за инхалации

За аерозолна опаковка с вместимост 15 20 ml се разтварят 10 mg от дадено антитяло или негов фрагмент съгласно изобретението в етанол (6-8 ml), добавя се 0,1 - 0,2 % смазващ агент, като полисорбат 85 или олеинова киселина; диспергира се в пропелент, като фреон, за предпочитане в комбинация от (1,2 дихлоротетрафлуороетан) и дифлуорохлорометан, и се поставя в подходящ аерозолен контейнер, пригоден за интраназална или орална инхалация.

Антителата и фармацевтичните състави от изобретението са специално приложими за парентерално приложение, т.е. субкутанно, интрамускулно или интравенозно. Съставите за парентерално приложение най-общо включват разтвор на антитяло или негов фрагмент съгласно изобретението или коктейл от тях, разтворен в подходящ носител, за предпочитане воден носител. Могат да бъдат използвани множество различни носители например вода, буферна вода, 0,4 % физиологичен разтвор, 0,3 % глицин и други подобни. Тези разтвори са стерилни и обикновено свободни от замърсители. Тези разтвори могат да бъдат стерилизирани по конвенционални познати стерилизационни техники. Съставите могат да съдържат фармацевтично приемливи спомагателни вещества, необходими за довеждане до приблизителните физиологични условия като pH, буферни агенти и други. Концентрацията на антитялото или неговия фрагмент съгласно изобретението в такива фармацевтични форми може широко да варира, например от по-малко от около 0,5 %, обикновено около 1 % до 15 или 20 % тегл., като изборът се основава на обема на течностите, вискозитета и други, съобразно избрания начин на въвеждане.

Фармацевтичен състав съгласно изобретението за интрамускулно инжектиране може да съдържа 1 ml стерилна буферирана вода и 50 mg от дадено антитяло или негов фрагмент съгласно изобретението. Аналогично, фармацевтичен състав от изобретението за интравенозно вливане може да съдържа 250 ml стерилен Рингеров разтвор и 150 mg от антитялото или неговия фрагмент съгласно изобретението. Методите за получаване на състави за парентерално приложение са добре известни или биха били очевидни за специалистите в областта и са описани в Remington’s Pharmaceutical Science, 15 th ed, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Антителата (или техните фрагменти) съгласно изобретението могат да бъдат лиофилизирани за съхранение и възстановени в подходящ носител преди използването им. Тази техника е доказано ефективна за конвенционалните имуноглобулини и известните техники за лиофилизиране и възстановяване могат да бъдат използвани с успех.

В зависимост от очакваните резултати, фармацевтичният състав съгласно изобретението може да бъде прилаган за профилактика и/или лечение. При терапевтични апликации съставите се въвеждат в пациенти, страдащи от конкретно заболяване, в количество, достатъчно да ги излекува или поне частично да задържи заболяването и неговите усложнения. При профилактика съставите, съдържащи антителата или смес от тях съгласно изобретението се въвеждат за повишаване на устойчивостта.

Единично или множествено въвеждане на фармацевтичните състави може да се провежда в дози, препоръчани от лекар. При всички други случаи фармацевтичният състав би осигурил количество от антителата (или техните фрагменти) съгласно изобретението, което би било недостатъчно за ефективно лечение.

Следва да се отбележи още, че изобретението може да бъде използвано за конструиране и синтез на пептидни или непептидни съединения (миметици), които да са приложими за същото лечение както антителата. Виж, напр. Saragovi et al., 253, 792 - 795 (1991).

Депозит

Структурата е депозирана в АТСС и е заведена под номер 69030. Депозит е направен на 9 юли 1992.

Заявителите и техният представител потвърждават готовността си да възстановят тези култури, в случай че загинат преди изтича нето на срока на действие на патента, 5 години след последното изискване за културата, или 30 години, дори и повече, и своята готовност да нотифицират депозитария за изтичането на този патент, през което време депози- 5 тът ще остане непроменен за обществото. До това време депозитът ще бъде достъпен за специално упълномощено лице съгласно правилата 37 C.F.R., Раздел 1 - 14 и 35 U.S.C., Раздел 112.

Други варианти на изпълнение са в рамките на следните патентни претенции.

(1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ:

(i) ЗАЯВИТЕЛ: ROLAND A. NEWMAN NABIL HANNA RONALD W. RAAB (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ХИМЕРНИ АНТИТЕЛА ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА ХОРА (Hi) НОМЕР НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 16 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:

(A) АДРЕС: Lyon & Lyon (B) УЛИЦА: 611 West Suxth Street (C) ГРАД: Los Angeles (D) ЩАТ: California (E) ДЪРЖАВА: U.S.A.

(F) КОД: 02111 - 2658 (v) КОМПЮТЪРНО ЧИТАЕМА ФОРМА:

(А) СРЕДЕН ТИП: 3,5 “Diskette, 1,44

Mb storage” (B) КОМПЮТЪР: IBM Compatible (C) ОПЕРИРАЩА СИСТЕМА: IBM Р.С. DOS (Version 5,0) (D) СОФТУЕР: Word Perfect (Version 5,0) (vi) ДАННИ ПО ЗАЯВЯВАНЕТО:

(A) НОМЕР HA ЗАЯВЯВАНЕ:

(B) ДАТА HA ЗАЯВЯВАНЕ:

(C) КЛАСИФИКАЦИЯ:

(vii) ДАННИ ЗА ПРЕДИШНО ЗАЯВЯВАНЕ

Предишни заявявания общо, включително заявката, описана по-долу: 2 (A) НОМЕР НА ЗАЯВЯВАНЕ: 07/856, 281 (B) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 23 - МАРТ

- 1992 (A) НОМЕР НА ЗАЯВЯВАНЕ: 07/735,064 (B) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 25 - ЮЛИ

- 1991 (viii) ПАТЕНТЕН ПРЕДСТАВИТЕЛ/ АГЕНТ ПО ИНФОРМАЦИЯТА:

(A) ИМЕ: Warburg, Richard J.

(B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 32,327 (C) РЕФЕРЕНС/ДОКУМЕНТ НОМЕР: 198/158 (ix) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ТЕЛЕКОМУНИКАЦИЯ:

(A) ТЕЛЕФОН: (213) 489 - 1600 (B) ТЕЛЕФАКС: (213) 955 - 0440 (C) ТЕЛЕКС: 67 - 3510

ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 1 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА : 17 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 1

CCATGGACTG (3) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 2 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА : 20 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ: ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO :

2:

ATGGACATAC TTTGTTCCAC (4) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 3 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА: 20 (B) ТИП: НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ: ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO : 3:

CCATGGAGTT TGGGCTGAGC (5) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 4 :

(i) СЕКВЕНЦИОННАХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА: 20 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ: ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO : 4:

ATGAAACACC TGTGGTTCTT (6) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 5 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА;

(A) ДЪЛЖИНА: 20 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА :SEQ ID NO : 5:

ATGGGGTCAA CCGCCATCCT (7) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 6 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА: 20 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ: ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO : 6:

ATGTCTGTCT ССТТССТСАТ (8) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID N0 : 7 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА : 16 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO : 7:

TTGGGGCGGA TGCACT (9) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 8 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА : 17 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO :

8:

GATGGGCCC TTGGTGGA (10) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 9 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА : 21 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO : 9:

GATGACCCAG TCTCCAGCCTC

K (11) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 10 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА : 21 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi). ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 10:

CTCACTTGCT GCACAGGGTCC

Y VR Μ (12) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 11:

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА : 19 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO :

И:

AAGACAGATG GTGCAGCCA' (13) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 12:

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА:

(A) ДЪЛЖИНА : 20 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 12:

GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (14) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 13 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА (A) ДЪЛЖИНА : 31 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА . (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO: 13:

ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTCT T (15) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 14:

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА : 39 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИН (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА :SEQ ID NO: 14:

ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC CTCTCCTCC (16) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO: 15:

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА: 423 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID NO : 15:

GAC

ATG

AAA

CAC

CTG

TGG

TTC

TTC

CTC

CTC

CTG

GTG

GCA

GCC

CCC

AGA

48

AAG

CCT

TCG

GAG

ACC

CTG

TCC

CTC

ACC

TGC

AGT

GTC

TCT

GGT

GGC

TCC

144

ATC

AGC

GGT

GAC

TAT

TAT

TGG

TTC

TGG

ATC

CGC

CAG

TCC

CCA

GGG

AAG

192

GGA CTG GAG TGG ATC GGC TAC ATC TAT GGC ACT GGT GGG GGC ACCAAT

240

TAC AAT ccc tcc ctc aac aat cga gtc tcc att tca ata gac acg tcc

288

AAG AAC СТС TTC TCC CTG AAA CTG AGG ТСТ GTG ACC GCC GCG GAC ACG

336

GCC GTC TAT TAC TGT GCG AGT AAT ATA TTG AAA TAT CTT CAC TGG TAT

384

TTA TAC TGG GGC CGA GGA GTC CTG GTC ACC GTC TCC TCA

423 (13) ИНФОРМАЦИЯ ЗА SEQ ID NO : 16 :

(i) СЕКВЕНЦИОННА ХАРАКТЕРИСТИКА :

(A) ДЪЛЖИНА : 387 (B) ТИП : НУКЛЕИНОВА КИСЕЛИНА (C) ВЕРИЖНОСТ : ЕДНОВЕРИЖНА (D) ТОПОЛОГИЯ : ЛИНЕАРНА (χϊ) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА : SEQ ID N0:16:

ACC ATG GCC TGG GCT CTG CTG СТС CTC GGC CTC CTT GCT CAC TTT ACA

GAC TCT GCG GCC TCC TAT GAG TTG AGT CAG CCT CGT TCA GTG TCC GTG

TCC CCA GGA CAG ACG GCC GGG TTC ACC TGT GGG GGA GAC AAC GTT GGA

144

AGG AAA AGT GTA CAG TGG TAC CAG CAG AAG CCA CCG CAG GCC CCT GTG

192

CTG GTC ATC TAT GCT GAC AGC GAA CGG CCC TCA GGG ATC CCTCGG CGA

240

TTC TCT GGC TCC AAC TCA GGG AAC ACC GCC ACC CTG ACC ATC AGC GGG

288

GTC GAG GCC GGG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG GTG TGG GAC AGT

336

ACT GCT GAT CAT TGG GTC TTC GGC GGA GGG ACC CGG CTG ACC GTC CTA

384

GGT

387

Claims (5)

Патентни претенции

1. US 4816567.

1) постоянна област от тежката верига на човешко антитяло;

1. Химерно антитяло, включващо постоянна област на имуноглобулин и област за свързване на антигена, като тази постоянна област на имуноглобулин се избира от група, състояща се от постоянна област на човешки имуноглобулин, а областта за свързване на антигена е област за свързване на антигена от маймуна от стария свят.

2. US 4987745.

2) постоянна област от леката верига на същото човешко антитяло;

2. Химерно антитяло, включващо променлива област на имуноглобулин, специфична за определен известен антиген, като антитялото включва: постоянна област, избрана от група, състояща се от постоянна област на човешко антитяло и постоянна област на антитяло от шимпанзе;

- структурна област, избрана от група, състояща се от структурна област на човешко антитяло, структурна област на антитяло от шимпанзе и структурна област на антитяло от маймуна от стария свят;

- втори участък от свързваща антигена област на антитяло от маймуна от стария свят.

3. US 4975369.

3) променлива област от тежката верига на антитяло на маймуна от стария свят, специфично за човешкия антиген; и

3. Антитяло съгласно претенция 1 или 2, характеризиращо се с това, че антитялото специфично се свързва към човешки антиген.

4. US 4816397.

4) променлива област от леката верига на същото антитяло на маймуна от стария свят.

29. Състав, характеризиращ се с това, че включва антитяло съгласно претенция 1 или 2 и приемлив носител.

30. Състав съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че антитялото специфично се свързва с D58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF a, TNF β, Τη антиген, IL-1, IL-8, човешки Т-клетъчен рецептор, CD3, CD28, CD8, CD18, CDlla, CDllb, CDllc, CD5a, CD45, нов онкогенен продукт, MDR-1, TGF a, TGF а рецептор, PDGF и CD71.

31. Антитяло съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че първата маймуна от стария свят и втората маймуна от стария свят са различни маймуни.

32. Антитяло съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че първата маймуна от стария свят и втората маймуна от стария свят са една и съща маймуна.

33. Ahtm-CD4 антитяло, включващо променливата тежка и променливата лека област, кодирани от ДНК последователностите, посочени на SEQ ID No: 20 и SEQ ID No: 19.

34. Антитяло съгласно претенция 33, ха рактеризиращо се с това, че антитялото е химерно рекомбинантно антитяло, което включва постоянна област, избрана от група, състояща се от човешки постоянни области и постоянни области от маймуна от стария свят, които об- 5 ласти са от друго антитяло от маймуна от стария свят, което се използва за получаване на посочените променлива лека и тежка област.

35. Химерно рекомбинантно антитяло съгласно претенция 34, характеризиращо се с това, 10 че човешките постоянни области се избират от група, състояща се от човешки γ 1, човешки κ и човешки λ вериги.

36. Химерно рекомбинантно антитяло съгласно претенция 35, характеризиращо се с това, 15 че антитялото се продуцира от структура, депозирана в АТСС с номер на депозиране No 69030 от 9 юли 1992 г.

37. Антитяло съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че едната маймуна от 20 стария свят е Rhesus маймуна.

38. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че рекомбинантното антитяло се експресира с помощта на вектор, включващ селекционен маркерен ген, съдържащ променена последователност за иницииране на транслацията, водеща до нарушено иницииране на транслацията по отношение на селекционния маркерен ген, който не съдържа посочената променена последователност за иницииране на транслацията.

Приложение: 16 фигури

Литература

4. Антитяло съгласно претенция I или 2, характеризиращо се с това, че посочената маймуна от стария свят е cynomolgus маймуна.

5. Антитяло съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че антитялото специфично се свързва към човешки антиген.

6. Антитяло съгласно претенция 1 или 2, характеризиращо се с това, че антитялото специфично се свързва към човешки антиген, избран от група, състояща се от CD58, VCAM, VDA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF a, TNF β, Τη антиген, IL-1, IL-8, човешки Т-клетъчен рецептор, CD3, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD5a, CDllc, CD45, нов онкогенен продукт, MDR-1, TGF a, TGF а рецептор, PDGF и CD71.

7. Антитяло съгласно претенция 3, характеризиращо се с това, че антитялото специфично се свързва към човешки антиген, избран от група, състояща се от CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF a, TNF β, Τη антиген, IL-1, IL-8, човешки Т-клетъчен рецептор, CD3, CD28, CD1 la, CD1 lb, CD1 lc, CD 18, CD5a, CD45, нов онкогенен продукт,

MDR-1, TGF a, TGF a рецептор, PDGF и CD71.

8. Антитяло съгласно претенция 3, характеризиращо се с това, че антитялото специфично се свързва към човешки антиген, избран от група, състояща се от CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD23, CD25, CD4, CD19, CD20, CD41, CD44, CD54, TNF a, TNF β, Tn антиген, IL-1, IL-8, човешки Т-клетъчен рецептор, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD5a, CD45, нов онкогенен продукт, MDR-1, TGF a, TGF a рецептор, PDGFhCD71.

9. Антитяло съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че всяко от посочените антитела от маймуна от стария свят се избира от група, състояща се от бабуин, Rhesus маймуна или cynomolgus маймуна.

10. Антитяло съгласно претенция 1 или 2, характеризиращо се с това, че областта за свързване на антигена включва комплементарни детерминантни области от променлива област на маймуна от стария свят.

11. Антитяло съгласно претенция 1 или 2, характеризиращо се с това, че областта за свързване на антигена включва цялата комплементарна област на маймуна от стария свят.

12. Метод за продуциране на рекомбинантни антитела за човешки антиген, който не е имуногенен в човека, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:

a) създава се антитяло от маймуна от стария свят към посочения антиген в маймуна от стария свят;

b) изолира се нуклеиновата киселина от маймуна от стария свят, кодираща областта за свързване с антигена на променливата област на антитялото от посочената маймуна от стария свят;

c) предоставя се нуклеиновата киселина от човек, кодираща човешка постоянна област от човешко антитяло;

d) лигират се посочената нуклеинова киселина от маймуна от стария свят и посочената човешка нуклеинова киселина за образуване на рекомбинантна нуклеинова киселина, и

e) експресира се посочената рекомбинантна нуклеинова киселина за получаване на посоченото антитяло.

13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че областта за свърз ване на антигена включва комплементарни детерминанти области от променливата област на маймуна от стария свят.

14. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че областта за свързване на антигена включва цялата променлива област на маймуна от стария свят.

15. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че преди етап Ь) и след етап а) методът включва етапа на имортализиране на клетка, способна да продуцира антитялото от маймуна от стария свят.

16. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че включва етапа на установяване дали рекомбинантното антитяло се свързва към човешкия антиген.

17. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че имортализирането се извършва чрез сливане на хибридоми.

18. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че имортализирането се извършва чрез вирусна трансформация.

19. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че имортализирането се извършва чрез единично клониране на Вклетки.

20. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че рекомбинантното антитяло се продуцира в библиотека, която е способна да експресира рекомбинантни имуноглобулини.

21. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че човешката постоянна област се избира така, че да включва желания изотоп.

22. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че преди етапа Ь) и след етапа а) методът включва селекциониране на В-клетка от маймуна от стария свят, в която В-клетката експресира антитялото от маймуна от стария свят.

23. Метод съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че В-клетката се получава от лимфоцити от периферна кръв, лимфен възел, костен мозък или сплит.

24. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че преди етап Ь) и след етап а) методът включва скриниране на клетки от маймуна от стария свят за продукция на антитяло от маймуна от стария свят.

25. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че експресирането се осъществява в продуциращата клетъчна линия.

26. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че изолирането включва освобождаването на посочената променлива област.

27. Метод съгласно която и да е претенция от 12 до 19, характеризиращ се с това, че посоченият антиген се избира от група, състояща се от CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNF a, TNF β, Τη антиген, IL-1, IL-8, човешки Т-клетьчен рецептор, CD3, CD28, CD8, CD18, CDlla, CDllb, CDllc, CD5a, CD45, нов онкогенен продукт, MDR-1, TGF a, TGF а рецептор, PDGF и CD71.

28. Рекомбинантно антитяло, състоящо се от:

5. GB 2188638.

Издание на Патентното ведомство на Република България

1113 София, бул. Д-р Г. М. Димитров 52-Б

Експерт: В.Кацарова Редактор: В.Алтаванова

Пор. № 40001 Тираж: 40 MB