HU211881A9 - Recombinant antibodies for human therapy - Google Patents

Description

A találmány humán terápiás célokra szolgáló rekombináns antitestekre és ezen antitestek előállítási eljárására vonatkozik.

A murin (patkány és egér) monoklonális antitesteket felhasználják a humán betegségek diagnosztizálásában és biológiai alapkutatási problémák megoldásában. Ilyen reagenseket alkalmaznak a klinikai kísérletekben is terapeutikumként mind az akut mind a krónikus humán betegségeknél, elsősorban a leukémiák, limfómák, szolid tumorok (pl. vastagbél, emlő, máj), AIDS és az autoimmun betegségek esetén.

Előállítottak egér/humán kimér antitesteket és kimutatták, hogy ezek rendelkeznek a szülő egér antitestek kötő tulajdonságaival, és effektor funkciókkal a humán konstans régióval való összekapcsolás révén (lásd például Cabilley et al.: US-PS 4,816,397; Shoemaker et al.: US-PS 4,978,745; Beavers et al.: UP-PS 4,975,369; és Boss et al.: US-PS 4,816,397, mely szabadalmakat referenciaként beépítettünk ezen bejelentésbe). Általában az ilyen kimér antitesteket úgy állítják elő, hogy már előzőleg meglévő murin hibridómákból extrahált DNS-ből preparálnak egy genomiális génkönyvtárat (Nishimura et el.: Cancer Research 47, 999 /1987/). A könyvtárat ezután átvizsgálják mind a nehéz mind a könnyű láncokból származó variábilis régió génekre, amelyek kimutatják a korrekt antitest fragmens átrendezett szülőket. A klónozott variábilis gén szakaszokat ezután egy expressziós vektorba ligálják, mely tartalmazza a megfelelő nehéz vagy könnyű láncú humán konstans génszakasz klónozott kazettáját. A kimér géneket ezután kifejezik egy tetszőleges sejtvonalban, rendszerint egy murin mielóma sejtvonalban.

Az ilyen kimér antitesteket felhasználják a humán terápiában. Az esetek többségében azonban a humán befogadó szervezet ezen kimér antitestek ellen antitesteket termel. Az ilyen kimér antitest elleni antitestek károsak a kimér antitesttel végzett terápiában.

Erlich és mtsai megállapították, hogy a humán monoklonális antitestektől várható, hogy azok felülmúlják az egér antitesteket az in vivő terápiában (Erlich et al.: Clinical Chemistry 34, 1681 /1988/; Erlich et al.: Hybridoma 7, 385 /1988/; Erlich et al.: Hybridoma 6, 151, /1987/ és Erlich et al.: Humán Antibody Hybridomas 1, 23 /1990/, ezek nem tartoznak jelen bejelentésnél a prior art-hoz). Ők tehát feltételezik, hogy a nemhumán főemlős antitestek, például csimpánz monoklonális antitestek, tolerálhatok lesznek az emberi szervezetben, mert azok szerkezetileg hasonlóak a humán antitestekhez. Mivel a humán antitestek nem immunogének Rhesus majmokban (azaz nem indukálnak antitest választ), azt jósolják, hogy a főemlős antitestek nem lesznek immunogének az emberekben. Kimutatják, hogy az antitestek emberekben való kipróbálása szükségtelen, ha egy főemlős antitest rendelkezik egy konstans régióval, mely szerkezetileg azonos egy humán immunglobulinnal vagy - legalább - egy régióval, mely nem különbözik jobban egy humán immunglobulintól, mint amennyire a különböző humán antitestek különböznek egymástól. így ők felvetik, hogy a csimpánz antitesteket fel lehetnek használni a humán terápiában.

A jelen találmány az Old World majmok (a továbbiakban mint „majmok”-ra hivatkozunk, mint pl. a pávián vagy makákó) immunglobulinjának variábilis régióját kódoló gének antigénkötő részeinek amplifikációs és klónozó eljárásaira vonatkozik, továbbá ezen géneknek a klónozott humán, csimpánz vagy más majmok konstans régióját kódoló génekkel (és - ha szükséges - humán, csimpánz vagy más majmok leolvasási keretét kódoló génekkel) való fúziója, és ezek expressziójára humán/majom rekombináns antitestek, vagy tisztán majom rekombináns antitestek formájában. Továbbá a találmány az ilyen rekombináns antitestek (amely kifejezés magában foglalja azokat az antitesteket, melyeket azonos fajból származó, két különböző antitest gén, pl. két különböző majom antitest gén, így pl. Rhesus és cynomolgus majmok, DNS-ének fúziójával állítottunk elő, majom-majom rekombináns antitestet kapva) immunterápiás szerként való felhasználására is vonatkozik humán betegségek kezelésében.

A találmány azon a felismerésen alapul, hogy a fejlődéstanilag távoli, a csimpánztól eltérő majmok (így pl. a pávián és makákó majmok, beleértve a cynomolgus és Rhesus majmokat is), nem csak megfelelő mértékben különböznek az emberi szervezettől, és ezáltal egy fokozott antitesttermelés jön létre ezekben a majmokban az emberi antigénekkel szemben, sőt a viszonylag konzerválódott humán antigénekkel, így a CD4 és CD54-gyel szemben is; hanem megfelelő mértékben hasonlítanak is az emberi szervezethez, így a humán antitestekhez hasonló antitestekkel rendelkeznek, úgyhogy nem keletkezik anti-antitest immunválasz, amikor ilyen majom antitesteket vagy ezekből származó rekombináns antitesteket embernek beadunk.

Eltérően a humán terápiában már korábban alkalmazott antitestektől, a találmány szerinti antitestek nem rendelkeznek bizonyos hátrányokkal, így például 1) immungenicitás és humán anti-antitest (HAA) válasz indukálása ismételt adás esetén, mely krónikus tünetek kezelése során szükséges; 2) viszonylag rövid felezési idő összehasonlítva a humán antitestekkel; és

3) effektor funkciók hiánya a humán sejtekkel és komplementerekkel. Ezen hátrányok hiánya kiemelkedő előnyt jelent a találmány szerinti antitestekkel végzett humán terápiában. így például, krónikus humán betegségek esetében, melyek közé tartoznak az autoimmun betegségek, vagy bármely olyan betegség esetén, amely az antitestek prolongált beadását teszi szükségessé, az ismételt antitest-terápiában a legnagyobb akadályok egyike a gazdaszervezet válasza a terápiás antitestre. A HAA válaszok gyakran nem jósolhatók meg előre egyik beteg alapján a másikra. Az ilyen válaszok túlnyomóan, bár nem kizárólag, az antitest molekula konstans régiója ellen irányulnak, és ha egyszer megjelennek, gyakran meggátolják vagy csökkentik a hatékonyságát bármilyen további terápiának azzal az antitesttel, vagy ugyanilyen izotípusú másik antitesttel.

Feltételesen, a HAA okozta problémákat el lehetne kerülni humán monoklonális antitestek alkalmazásá2

HU 211 881 A9 val. Ez a megközelítés, azonban, etikai, klinikai és immunológiai korlátokkal jár együtt, mely utóbbi az antitest termelésére a humán egyéneknek választott antigénekkel (így pl. a humán antigének, amely kifejezés magában foglalja bármely fehérje antigén vagy immunválaszt kiváltó részét; polipeptidek vagy ezek ekvivalensei, melyek az emberi szervezetben jelen vannak) történő immunizálásában rejlik.

A találmány értelmében ezt a problémát megfelelő specifitású és kívánt effektor funkciójú antitestek származtatásával oldjuk meg, és ezek felhasználásával rekombináns antitestek termelésében. Ezek a rekombináns antitestek általában magukban foglalják egy immunizált majomból származó antitest variábilis régiójának egy megfelelő szakaszát, és egy emberből vagy csimpánzból származó antitest konstans régióját. Ezáltal a monoklonális antitestek specificitását és nagy affinitását megtartjuk, és a megfelelő humán vagy csimpánz konstans régiót, mely a kívánt effektor funkció funkciót hordozza, könnyen ki tudjuk választani.

A találmány továbbá majom immunglobulin gének amplifikációs eljárásán alapul, pl. polimeráz láncreakcióval (PCR), majom limfocitáktól extrahált RNS-bŐl, szintetikus oligonukleotid primereket használva a gén családok nehéz és könnyű láncú variábilis régióihoz. Az amplifikált géneket vagy alkalmas szakaszokat (pl. a komplementer determináns régiót (CDR) kódoló régiók; lásd Winter 2 188 638 sz. nagy-britanniai közrebocsátási irat) egy expressziós vektorba klónozzuk, mely egy humán vagy csimpánz konstans régiót foglal magában, majom/humán rekombináns antitestek termelése céljából, vagy egy olyan vektorba, amely egy majom konstans régiót hordoz, a kívánt izotípusú, teljesen majom rekombináns antitest termelésére. Ezek az antitestek immunterápiás szerekként képesek a megfelelő célsejteket (pl. tumorsejtek) lokalizálni és/vagy elölni in vivő beadás után.

A fentiek alapján a találmány egyik tárgya eljárás egy majom antitest gén variábilis régiója antigént-felismerő részének a klónozására. Ez a módszer magában foglalja a nukleinsav, pl. RNS izolálását majomból, a cDNS szintetizálását az RNS-hez reverz transzkriptáz alkalmazásával, egy primer előállítását, mely komplementer az antitest gén 5 vezető szekvenciáját kódoló cDNS-szekvenciával, a cDNS és a primer egyesítését egy hibrid komplex képzésére és a cDNS amplifikálást nukleinsav termelése céljából, mely a majom antitest gén variábilis régióját kódolja.

Az „antigént-felismerő rész” alatt egy majom antitest variábilis régiójának egy vagy több részét értjük, amelyek felelősek a kötődésért és /vagy a cél (target) antigén felismeréséért (vagy epitóp és/vagy idiotípus). Az hordozza például a CDR régiókat (lásd alább) vagy a teljes variábilis régiót, vagy bármely kombinációját ezen két régiónak beleértve bármi változtatást a kódoló régiókban, amelyek bevezetésével a régió inkább humán-szerűvé tehető, mint majom-szerűvé, az antitest specifikus kötőtulajdonságainak megváltoztatása nélkül. Ha a teljes variábilis régió csak egy részét használjuk, akkor a maradék részek, pl. az ún. „framework” (keret), átvehetők egy másik antitestből, előnyösen egy humán vagy csimpánz antitestből (lásd alább) a fentiekben idézett, a szakember számára ismert módon.

A „variábilis régió”, „vezető szekvencia”, „konstans régió” és „keret” (framework) kifejezéseket általános értelemben használjuk az alábbi példákban és a fent idézett cikkekben, melyeket referenciaként beépítünk a bejelentésbe.

A találmány egy előnyös kiviteli módja szerint a vezető szekvencia egy kb. 6 bázisból álló humán, csimpánz vagy majom vezető szekvencia, amelyek pl. az 1. ábrán láthatók.

Megállapítottuk, hogy a majom, csimpánz és humán variábilis régió vezető szekvenciák elégségesen hasonlóak ahhoz, hogy az egyikhez megszerkesztett primerek alkalmasak legyenek a másiknak az amplifikálására. Az eljárásban az RNS-t amplifikáljuk olyan mennyiségben, hogy elég nukleinsav termelődjön, hogy ezt a nukleinsavat egy vektoron belülre helyezzük a későbbi klónozáshoz.

A találmány egy másik tárgya humán antigén elleni antitest termelésére szolgáló eljárás, amely antitest nem immunogén emberekben. Ez az eljárás abban áll, hogy megnöveljük a majomban a humán antigén elleni majom antitestek számát, és izoláljuk a majom nukleinsavat, mely a majom antitest variábilis régiójának antigént-felismerő részét kódolja. A humán nukleinsavat is előállítjuk, mely egy antitest humán konstans régióját kódolja, ligáljuk a majom nukleinsavhoz és így rekombináns nukleinsavat hozunk létre. Ezt a rekombináns nukleinsavat azután expresszáljuk a kívánt antitest termelése céljából. Hasonlóképpen, alkalmazhatunk csimpánz vagy majom konstans régiót kódoló nukleinsavat is rekombináns antitest képzésére. Van néhány különbség a humán és csimpánz konstans régió aminosav-szekvenciája között (azaz, azok homológok). Azok a különbségek, melyek fennállnak a humán és a majom szekvenciák között, könnyen megváltoztathatók standard technikákkal, ha a majom konstans régiót kódoló nukleinsavat használjuk a rekombináns antitest képzésére. A leglényegesebb a találmányban az, hogy egy fenti módon előállított antitest kevésbé immunogén, mint a majom konstans régió, úgyhogy nincsenek szignifikáns immunválaszok, amikor a rekombináns antitestet egy embernek beadjuk. (Az ilyen antitest régiókra mint homológ régiókra hivatkozunk a következőkben.) így a géntechnológiai úton termelt rekombináns antitest funkcionálisan ugyanolyan mint egy humán antitest az aminosav-szekvenciáját tekintve, azaz rendelkezik egy konstans régióval, mely homológ a humán, csimpánz antitest konstans régióval. Összefoglalva, az antitest mint egy humán antitest éppúgy képes redukálni az antitestre adott nem-kívánt immunológiai válasz lehetőségét és egy majom antitest antigén-kötő részét tartalmazza.

A „nem immunogén” alatt azt értjük, hogy az antitest nem növeli meg az antitest választ olyan mértékben, hogy az csökkentse az antitest folyamatos adásának hatékonyságát az emberek többségében a terápiás hatás eléréséhez elegendő ideig tartó adás esetén, pél3

HU 211 881 A9 dául összehasonlítva egy murin vagy murin-humán kimér antitesttel. Előnyös, ha antitest választ egyáltalán nem figyelünk meg.

A találmány előnyös kiviteli módja szerint az eljárás magában foglalja egy majom sejt immortalizálását, amely felelős a majom antitest termelésért, pl. hibridóma fúzióval, vírus transzformációval Herpes papio vírussal, egyetlen B-sejt klónozással (ezt „átmeneti immortalizáció”-nak nevezik), és a rekombináns immunglobulinok egy könyvtárának előállítását. Egy másik előnyös kiviteli mód szerint az eljárás a következő lépéseket foglalja magában: szelektálunk egy B-sejtet majom perifériális vér leukocitából, lépből, csontvelőből vagy nyirokcsomóból; szelektálunk egy kiónt, mely a megfelelő antitestet termeli; kiszabadítjuk ezt az antitestet kódoló géneket az immortalizált sejtvonalból; és reexpresszáljuk a géneket a termelő sejtvonalban (azaz egy sejtvonalban, mely a humán terápiára felhasználható antitest megfelelő termelését idézi elő).

A találmány magukra a rekombináns antitestekre is vonatkozik, melyeket egy humán vagy csimpánz konstans régióból és egy majom variábilis régió antigéntfelismerő részéből alakítottunk ki, vagy egy első majom konstans régióból és egy második, az elsőtől különböző majom variábilis régiójának antigént-felismerő helyéből.

A találmány egy előnyös szempontja szerint az antitest egy monoklonális antitest, vagy egy Fab, (Fab)₂, egy könnyű vagy nehéz láncú dimer, vagy bármilyen minimál rekombináns fragmense ezeknek, úgymint egy Fv vagy egy SCA (single chain antibody) vagy egyéb immunológiailag aktív fragmense az antitestnek (pl. egy CDR-régió), amely az immortalizált majom B-sejt által képzett antigénhez kapcsolódik. Az ilyen fragmensek immunszuppresszív szerként használatosak. Hasonlóképpen, a találmány szerinti antitest hozzákapcsolható egy effektor vagy riporter molekulához. Például a találmány szerinti antitest egy kovalens kötő szerkezeten keresztül kapcsolódhat egy makrociklussal, egy kelátképző nehéz fématommal vagy egy toxinnal, mint pl. a ricin. Ráadásul, az Fc fragmens vagy a CH3 dómén a komplett antitest molekulában helyettesíthető egy enzim vagy toxin molekulával, és az immunglobulin lánc egy része pedig kapcsolható egy polipeptid effektor vagy riporter molekulával. Bispecifikus antitesteket szintén megszerkeszthetünk standard eljárásokkal.

A találmány továbbá farmakológiai kompozíciókra is vonatkozik, amelyekben a találmány szerinti antitestek szolgálnak terápiás vagy profilaktikus felhasználásra. Az ilyen antitestek alkalmazhatók mint immuntoxinok is, azaz olyan molekulák, amelyek két komponens által jellemezhetők és különösen felhasználhatók kiválasztott sejtek in vitro és in vivő elölésére. Az egyik komponens egy citotoxikus szer, amely rendszerint halálos a sejtre, miután hozzákapcsolódott vagy abszorbeálódott. A második komponens, „delivery vehicle”ként ismert, ami azt jelenti, hogy a toxikus szert átadja a különleges sejttípusnak, így pl. karcinóma sejteknek. A két komponens közönséges kémiai kötéssel kapcsolható egymáshoz bármilyen jól-ismert kémiai vagy genetikai eljárással. Például, amikor a citotoxikus szer egy protein és a második komponens egy intakt immunglobulin, a kötés heterobifunkcionális keresztkötőszerek, pl. karbodiimid, glutáraldehid és hasonlók segítségével létrehozható. Különféle immuntoxinok termelése a szakember számára jól ismert.

A találmány tárgya továbbá a humán/majom antitestet kódoló nukleinsav. Egy előnyös kiviteli mód szerint, a nukleinsav egy humán vagy csimpánz konstans régiót kódol és a majom variábilis régió egy antigént-felismerő részét; a nukleinsavat tisztítjuk, azaz elválasztjuk azoktól a biológiai komponensektől, melyekkel együtt természetesen előfordul, vagy még előnyösebben homogén oldatként állítjuk elő.

A találmány még további tárgya egy CDR-beillesztést tartalmazó antitest, melyet legalább egy komplementer determináns régióból (CDRs), azaz az Old World majom variábilis régió specifikus nehéz láncának 31-35 (CDR 1), 50-65 (CDR 2) és 95-102 (CDR

3) aminosav részeiből és a specifikus könnyű láncának 24-34 (CDR 1), 50-56 (CDR 2) és 89-97 (CDR 3) aminosav részeiből (a Kabat-féle standard aminosav jelző rendszert használva), és egy második faj immunglobulin variábilis régió keretéből alakítottunk ki. A CDR-betoldást tartalmazó antitest ugyanazon antigénhez képes kötődni, mint az eredeti majom antitest. Az antitest konstans régiója egy humán vagy csimpánz immunglobulinból származik. Az ilyen antitestek előállításának módszertanát általánosan leírták Jones és mtsai: Natúré, 321,522 (1986). Az ilyen CDR-betoldások módosíthaatók, ha azt kívánjuk biztosítani, hogy ezek inkább humán-szerűek legyenek, úgyhogy az antitestre adott válaszreakciónak a valószínűsége csökkenjen.

Egy előnyös kiviteli mód szerint ez az eljárás magában foglalja makákó majomból egy, a makákó antitest termelésért felelős sejt immortalizálását vagy szelekcióját, és a sejtből az immunglobulin gének kiszabadítását; az antitest-termelésért felelős gének klónozását és szekvenálását; egy humán variábilis régió keret szekvencia szelektálást (előnyösen a makákó variábilis régió kerethez legközelebbi homológgal); és a makákó CDR-szekvenciák szubsztituálását a humán CDRszekvéneiákhoz és kisebb módosításokat a humán keret régiókban, melyeket tehetünk, hogy megnöveljük az antitest affinitását az antigénhez.

A „kisebb módosítások” azt jelentik, hogy a keretben kevesebb mint 6 aminosavat lehet más aminosavakkal helyettesíteni. Rendszerint ilyen helyettesítéseket vagy módosításokat csak akkor végzünk, amikor azokat az aminosavakat konformációs kölcsönhatások magukba foglalják, melyek a keretet megfelelő formában tartják, úgy hogy a kívánt antigén felismerhető legyen az antitest által. Az ilyen módosítások általában vissza fogják tükrözni azokat az eltérő aminosavakat, melyek jelen vannak egy majom antitestben, összehasonlítva egy humán antitesttel. Például, egy humán antitest aminosav-szekvenciája a CDR 3 nehéz láncot megelőzően, a 92-94 általában cisztein-alanin-arginin

HU 211 881 A9 (az argininről ismert, hogy helyettesíthető az antitestek egy kisebb részében szerinnel vagy treoninnal); néhány majom antitestben ez a szekvencia cisztein-alanin-szerin; így, ebben a példában előnyös lehet lehet a szerint 94. aminosavként használni (lásd a 9D ábrát).

A találmány egy további tárgya olyan emberek kezelésére szolgáló eljárás, akik egy különleges, pl. betegséggel kapcsolatos, antigénnel rendelkeznek. Ez az eljárás magában foglalja a különleges antigénre specifikus rekombináns antitest egy terápiásán hatékony mennyiségének beadását, ahol a rekombináns antitest egy humán vagy egy csimpánz konstans régióval és egy majom variábilis régiónak az antigént-felismerő részével rendelkezik, vagy egy első majom konstans régióval és egy második, eltérő majom variábilis régiónak az antigént-felismerő részével.

A találmány egy előnyös kiviteli szempontja szerint az antigén egy tumor antigén, egy immun rendellenesség antigénje, egy autoimmun válasz antigénje, egy receptor, amely egy gazdasejten kifejeződik, vagy egy antigén az alábbi humán antigének közül szelektálva: CD58, VLA4 «χ4β1 integrin), CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD25, CD4, CD 19, CD20, humán T-sejt receptor, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNFalfa, TNFbéta, Tn antigén, IL-1, IL-8, C5a, adhéziós molekulák, pl. VCAM, CD54, CD28, CDI la, CDI le, CD18, és CDllb, az új onkogén termék, MDR-1 (P-glikoprotein), TFGalfa és annak receptora, és PDGF; és a rekombináns antitest aktív vagy azáltal, hogy kivonja (elöli vagy eliminálja) a nem-kívánt sejteket (pl. anti-CD4) a komplementer aktiválásával, vagy az ölősejteket, vagy aktív mint egy citotoxikus szer vagy az Fc-receptor kötését okozza egy fagocitán. Hasonlóképpen, az antitest blokkolja vagy stimulálja a receptor funkciókat, vagy semlegesíti az aktív oldható termékeket, úgy mint egy vagy több interleukin, INF és C5a.

A találmány továbbá a fenti antitesteket vagy ezek fragmenseit tartalmazó gyógyszerkészítményekre is vonatkozik. A találmány szerinti kompozíciók vagy termékek előállíthatók megfelelően oldatok formájában, melyek alkalmasak parenterális vagy nazális vagy orális beadásra. A megfelelő antitest készítmények összekeverhetők más szerek alkalmas készítményeivel egy növelt klinikai hatékonyságot eredményezve.

A találmány további jellemzői és előnyei a leírásban következő, előnyös kiviteli módokat ismertető példákból és az igénypontokból fognak előtűnni.

Az ábrák ismertetése:

1. ábra: táblázatos bemutatása 20 kodonnak kilenc különböző humán lg nehéz lánc (HV) vezető szekvenciában és tíz majom lg nehéz lánc vezető szekvenciában;

2. ábra: a különböző Ig-láncok szerkezetének diagramon való bemutatása, amely megmutaja a vezető, variábilis és konstans régiókat a restrikciós helyek pozícióival együtt, és az amplifikálásra használt primereket;

3. ábra: humán vagy kimér antitestek expressziójára szolgáló egy nehéz láncot hordozó vektor kazetta diagramja;

4. ábra: humán vagy kimér antitestek expressziójára szolgáló egy könnyű láncot hordozó vektor kazetta diagramja;

5. és 6. ábra: immunglobulinok expressziójára szolgáló vektorok diagramjai, melyek a kappa illetve lambda könnyű lánc cDNS-t tartalmazzák. Ezekben a vektorokban az immunglobulin gének tandem konfigurációban vannak elrendezve és szelektálható markerként neomycin foszfotranszferázt használunk;

7. és 8. ábra: a 7a-7a, 7b—7b és 8. ábrák a találmányban alkalmazható különböző vezető szekvencia primerek nukleinsav-szekvenciáit mutatják be (a 8. ábrán látható primerek megfelelnek a SEQ. ID Nos. 112-ben megadott szekvenciáknak);

9. ábra: a 9a-9h ábrákon összehasonlítjuk a humán konszenzus VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VKI, VKII És VlamdbalII szekvenciákat a klónozott majom variábilis régiókkal;

10. ábra: a humán és majom VH3 szekvenciák összehasonlítása és egy összehasonlítás a humán VH2 szekvenciával;

11. ábra: egy találmány szerinti antitest kötődésének grafikus ábrázolása egy humán CD4 antigénhez;

12. ábra: grafikus ábrázolása az IF3-kötődés gátlásának a 10. ábrán bemutatott antitestekkel;

13. ábra: az anti-CD4 VH régió nukleotid-szekvenciájának egy része: 1-420 bp; lefordítva a vezetőszekvenciából metionin ATG (bp 4)-tőI bp 420-ig. A fehérje-szekvencia az antitest leolvasási keret +1 maradékától a +120 utolsó VH-maradékig tart;

14. ábra: az anti-CD4 VL régió nukleotid-szekvenciájának egy része: 1-387 bp; lefordítva a vezetőszekvenciából metionin ATG (bp 4)-től bp 387-ig. A fehérjeszekvencia az antitest leolvasási keret +1 maradékától a Vlambda +109 utolsó maradékig tart;

15. ábra: az anti-CD54 aktivitását bemutató grafikon; és

16. ábra: egy hisztogram, mely összehasonlítja a plazmidok expressziós jellemzőit.

Majom antitestek

Az Old World majmok közé tartoznak a pávián és a makákó majmok (beleértve a Rhesus és a cynomolgus majmot is). A jelen találmány különböző majom génekkel történő eljárásokat szolgáltat, de ezek nem korlátozódnak a találmány szerinti példákra és más, Old World majmokra is alkalmazhatók.

A 2. ábrán olyan gének általános szerkezetének diagramját mutatjuk be, melyek az immunglobulin nehéz láncát, kappa könnyű láncát és lambda könnyű láncát kódolják. Ezen láncok mindegyike egy ATG start kodonnal kezdődik, amit egy kb. 60 bázisból álló vezető szekvencia, majd az immunglobulin variábilis régióját kódoló régió és az immunglobulin konstans régiója követ. A különféle vezető szekvenciákra vagy szignálpeptidekre és a nehéz láncokra példák az 1. ábrán láthatók. Ezeket a szekvenciákat és ezek ekvivalenseit majmokban, meghatározhatjuk standard technikákkal, melyek a területen jártas szakember számára jól ismertek és az alábbiakban leírásra kerülnek.

HU 211 881 A9

Az 1. ábra alsó részén humán vezető szekvenciákat mutatunk be. Kimutattuk, hogy ezekkel a vezető szekvenciákkal komplementer primerek megszerkesztése lehetővé teszi a majmokból származó Ig-gének amplifikációját. Hasonlóképpen, a majom vezető szekvenciákkal homológ primerek (lásd az 1. ábra felső részét) alkalmazhatók majom immunglobulin gének amplifikációjában, sőt humán immunglobulin gének amplifikációjára is.

A standard amplifikációs eljárásokban ilyen primereket használva, a különböző majom immunglobulin géneket kódoló géneket könnyen izolálhatjuk, és az antitestek variábilis régióit kódoló szekvenciákat meghatározhatjuk. Ilyen eljárásokra példákat az alábbiakban szolgáltatunk. Az analízis eredményeit a 9a-9h ábrákon és a 10. ábrán mutatjuk be. Meglepő módon azt találtuk, hogy majmokban a relatíve konzerválódott humán antigének elleni antitest termelő képesség ellenére, az így termelt antitestek variábilis régiójának keret szekvenciái megkülönbözhetetlenek voltak a humán antitestek ezen szekvenciáitól. Azaz, a majmoknál az immunglobulin szekvenciában megfigyelt variábilitás mértéke hasonló az embernél megfigyelthez, és lehetetlen meghatározni, hogy melyik antitest származik emberből és melyik majomból magának az eredetének az analízise nélkül.

így, például, a 10. ábrán a humán VH3 régió aminosav-szekvenciáját hasonlítjuk össze a majoméval. A humán antitestek homológiájának mértéke egymás között 83-98%, míg a majom szekvenciák 90-95%-ban homológok a humán VH3 régióval. Ezzel ellentétben, a humán VH2 régió csak 60%-ban homológ a humán VH3 régióval. (Ezen az ábrán, mint a többi ábrán is, ugyanazon aminosavaknak a helyét egy vonallal jelöljük, míg az eltérő aminosavat standard egybetűs kóddal jelöljük. A nem-konszenzus aminosavak helyén egy X-jelölést alkalmazunk.) A fentiekhez hasonlóan, a 9a9h ábrákon a VH1, VH2, VH3, VH4 ÉS VH5, illetőleg a VKI és VKII és VlambdaHI régiókkal való homológiát mutatjuk be. Ismét szignifikáns a homológiát figyelhetünk meg a majom és a humán immunglobulin régió között minden egyes variábilis régióban, mely az immunglobulin J régió szekvenciákat tartalmazza. Ez a magas homológia hasonló a humán antitestek között megfigyelt homológiához.

A módszereket - melyekkel a szekvenciákat meghatározhatjuk - az alábbi példákban ismertetjük. A területen jártas szakember számára ismert, hogy ezek a módszerek nem korlátozódnak a példákban megadottakra és ekvivalens eredményeket, monoklonális és kimér antitesteket kaphatunk hasonló, a szakember számára jól ismert módszerekkel (lásd például US-PS 4,816,567; 4,978,745; 4,975,369; 4,816,397). Például, egy majom variábilis régiót kódoló gén klónozása után egy ilyen gént könnyen ligálhatunk egy majom vagy humán konstans régiót kódoló génhez, és a fúzionált gént expresszáltatjuk egy termelő sejtvonalban a kívánt antitest termelése céljából. Az ilyen eljárásokat az alábbi példákban ismertetjük.

A következő példákban, az eljárás első lépése a teljes

RNS izolálását foglalja magában majom perifériás vér vagy lép sejtekből. Immunizált majmok B-sejtjeit megkaphatjuk perifériás vérből vagy nyirokcsomóból, és felhasználhatjuk közvetlenül vagy azokat kedvezően felszaporíthatjuk. A szaporítás (expanzió) magában foglalja a Herpes papio vírus transzformációját, fúziót egy heterológ mielóma sejthez ezt követő szelekcióval, vagy az egyes B-sejtek klónozását mérsékelt hígításban stimulált humán T-sejtek jelenlétében.

A teljes RNS-t ezután konvertáljuk egy egyszálú cDNS-hez reverz transzkriptáz segítségével nem-specifikus (oligo-dT vagy random hexamerek) vagy specifikus (immunglobulin CH1 vagy CK vagy Clambda konstans régió) printereket használva. Ezzel a reakcióval előállított egyszálú cDNS-t amplifikáljuk polimeráz láncreakcióval, melyben egyszálú cDNS-t dezoxinukleotid-foszfátokkal együtt, egy DNS-polimerázt (pl. hőstabil polimerázt) és specifikus printereket használunk a nehéz vagy a könnyű lánc variábilis régió immunglobulin gének amplifikálására. A használt primerek egyszálú szintetikus oligonukleotidok, 20-tól 40 bázis hosszúságig, és néhány degenerált bázist tartalmaznak, amelyek az immunglobulin 5’ vezető szekvenciákhoz kötődnek. Hat különböző 5’ vezető szekvencia prímért (lásd 7a. ábrát) - beleértve a restrikciós helyeket is - választottunk ki a majom nehéz lánc variábilis régió család amplifikálására, mely a humán nehéz lánc variábilis régió családhoz való hasonlóságon alapul. Az 5’ vezető szekvencia primerek mindegyikével egy 3’ prímért is alkalmazunk, mely a releváns izotípus konstans régió doménre specifikus (pl. IgG, IgM, IgA vagy IgE), szintén beépítve egy restrikciós enzim (pl. Nhel) helyet (7a’. ábra). Hasonlóképpen, majom kappa és lambda könnyű láncokhoz, más primer-párok is felhasználhatók a megfelelő könnyű lánc variábilis régió amplifikálására (lásd 7b. és 7b’. ábrát).

Egyéb primer-készletek is alkalmazhatók különböző, egyedülálló restrikciós helyek beépítésére, melyek lehetővé teszik a PCR-amplifikált DNS direkt klónozását egy alkalmas expressziós vektorba, mely ugyanazzal a restrikciós hellyel rendelkezik. Az antitest nehéz lánc vezető szekvencia 3’ végéhez kötődő primer-készlet a Miül hellyel, vagy a keret szekvencia első 23 bázisához kötődő primer-készlet, magában foglalva az Xhol helyet (melyeket a 7a. és 7a’. ábrán írtunk le), szintén alkalmazható. A majom immunglobulin nehéz és könnyű lánc variábilis régió géneket klónozhatjuk egy shuttle vektorba is közvetlenül a PCR-amplifikálás után további molekuláris manipulációkhoz, ha szükséges, vagy klónozhatjuk közvetlenül egy expressziós vektorba, amely tartalmazza a humán nehéz vagy könnyű lánc konstans régió géneket. Az immunglobulin gének molekuláris konfigurációja az expressziós vektorban lehet genomiális, amelyben jelen vannak immunglobulin promoter/enhancer és egyéb regulátor régiók, valamint összekötő donor/akceptor szekvenciák az intron/exon kapcsolásoknál. Hasonlóan a kimér immunglobulin gének inszertálhatók egy cDNS-konfigurációba heterológ virális prometer/enhancer szekvenciák használatával.

HU 211 881 A9

7. példa: Majom antitestek szekvenciája

A 7. és 8. ábrákon primereket mutattunk be restrikciós helyekkel vagy anélkül, melyeket a majom és/vagy humán cDNS-ekből származó immunglobulin gének amplifikálására használunk. Az eljárást részletesen az alábbiakban ismertetjük. RNS-t izolálunk majom perifériás vér, lép és nyirokcsomó sejtekből standard guanidin-izotiocianát módszer alkalmazásával. Ezzel a módszerrel izolált teljes RNS frakciót a következőkben mint templátot használjuk az amplifikációs reakcióban. Az RNS egy alikvotját inkubáljuk 200 egység Moloney murin leukémia vírus reverz transzkriptáz és nem-specifikus (oligo-dT vagy random hexamerek) vagy specifikus (immunglobulin IgG CH1 régió vagy kappa lánc konstans régió CK) oligonukleotid primerek (50-100 pikomol) jelenlétében, hogy létrehozzuk a nem-kódoló „sense” egyetlen cDNS szálat. Ezzel a reakcióval előállított egyszálú cDNS-t amplifikáljuk ezután a polimeráz lánc reakcióval (PCR). Az egyszálú cDNS egy alikvotját inkubáljuk dezoxinukleotid-trifoszfátokkal (20 gm), egy hőstabil DNS polimerázzal (2-5 egység) és humán eredetű szintetikus oligonukleotid primerekkel (50 pikomol) együtt a nehéz vagy könnyű lánc variábilis régió immunglobulin gének amplifikálása céljából.

A 8. ábrán bemutatott primer párokat használva, néhány jellegzetes cynomolgus immunglobulin nehéz és könnyű lánc variábilis régió szekvenciát, melyeket nagyszámú géncsaládból választottunk ki, amplifikálunk. Ezeket az amplifikált szekvenciákat klónozzuk a p-Bluescript (pBS, beszerezhető a Stratagene-től, CA) plazmid vektor EcoRV helyére, és használjuk a DNSszekvenálására. A DNS-szekvenálás kivitelezése során plazmid DNS-t, mely a klónozott inszertet mint duplaszálú DNS templátot tartalmazza, és standard lánc terminációs szekvenáló módszert alkalmazunk.

A jellegzetes cynomolgus majom immunglobulin szekvenciák a 9a-9h ábrán láthatók. Ezeken az ábrákon rajta vannak a humán variábilis régió génekre vonatkozó aminosav-szekvenciák, melyek a nagyszámú variábilis régió géncsaládok mindegyikét képviselik. Bemutatjuk az egyes majom szekvenciák homológiáját százalékban, összehasonlítva a humán konszenzus szekvenciával, mely magában foglalja a konstans dómén régiókat és a CDR régiókat. A homológja szintje a humán és majom szekvenciák között egy családra megadva éppoly magas, mint két humán szekvencia között ezen családon belül. Lehetetlen különbséget tenni ezért az Old World majmokból származó variábilis régió immunglobulin szekvenciák között és az emberből származók között is, egyedül a szekvenciák összehasonlítása alapján.

Az RNS izolálása

Majom antigén-specifikus B-sejteket különféle módokon nyerhetünk: immunizált majom nyirokcsomó sejtek fúziójával a humán/egér heteromielóma fúziós partner sejtvonalhoz (K5H6/B5), és a hibridóma sejtvonalak ezt követő screenelésével, virálisan transzformáit B-sejtekkel, vagy in vitro egyetlen B-sejtet klónozó technikákkal. Az utóbbi esetben az egyetlen B-sejt növekedését úgy fokozzuk in vitro, hogy az antitest által stimulált, humán T-sejtekkel együtt tenyésztjük. Az egyes B-sejteket behelyezzük egy 96 lyukú tenyésztő edény minden egyes mélyedésébe körülbelül 150,000 anti-CD3-stimulált mytomycin C-kezelt humán T-sejttel együtt. Két hetes inkubációs periódus után az egyes B-sejteket expandáltatjuk legalább 200 differenciált plazma sejtté. Ezekből a mélyedésekből a tenyészet felülúszóját megvizsgáljuk immunglobulin jelenlétére ELISA teszttel, melyhez a kecske anti-majom immunglobulin antitest használjuk.

A sejteket - akár antigén-specifikus virálisan transzformált sejtek, akár hibridómák - felszaporítjuk az RNS extrakciójához szükséges számban. Az egyetlen B-sejtet klónozó módszernél azokat a mélyedéseket, melyek immunglobulin pozitívak voltak, eltávolítjuk, mossuk kétszer hideg foszfáttal pufferolt só-oldattal (pH 7,5) és centrifugáljuk 10 percig (1000>g). A mosott sejteket szuszpendáljuk 100 μΐ lizáló oldatban (4 M guanidinin-izocianát, 15 mM nátrium-citrát pH 7,0, 0 ,5% nátrium-szarkozin, 0,1 M 2-merkaptoetanol). 10 μΐ 2M nátrium-acetátot (pH 4,0) adunk hozzá és kevertetjük. A fehérjét eltávolítjuk 100 μΐ vizes telített fenol-oldattal, keverjük és 20 μΐ kloroform/izoamil-alkoholt (49:1) adunk hozzá. Rázatás és inkubálás után (jégen 15 percig), a mintákat centrifugáljuk 20 percig (10,000>g). A vizes fázist átvisszük egy új csőbe, azonos térfogatú izopropanollal összekeverjük és inkubáljuk egy órán át -20 °C-on. A csapadékot centrifugálással (10,000>g, 15 perc) összegyűjtjük, mossuk 70%-os etanollal, újra centrifugáljuk és a pelletet Speedivacban (Savant) szárítjuk. A szántott RNS-t újra oldjuk másodszor is 100 μΐ lizáló pufferben. Azonos térfogatú izopropanolt adunk hozzá és inkubáljuk -20 °C-on egy órán át. A csapadékot összegyűjtjük centrifugálással (10,000>g, 15 perc) és mossuk 70%-os etanollal. A pelletet szárítjuk Speedivac-ban (Savat) és fagyasztva tároljuk 70%-os etanolban -20 °C-on felhasználásig.

Az egyszálú cDNS szintézise

Az egyes mélyedésekből származó sejtekből extrahált teljes RNS-t feloldjuk 32 μΐ kétszer desztillált vízben és hozzáadunk 1 μΐ (50-100 pikomol) primer (vagy random hexamer, oligo dT vagy 3’ immunglobulin-specifikus primer) és 10 μΐ 5X reverz transzkriptáz puffért (0,25 Tris-HCl pH 8,3, 0,375 M KC1, 15 mM MgCl₂, 50 mM ditiotreitol). A keveréket melegítjük 65 ”C-on 5 percig, majd ezután két percre jégre teszszük. Melegítés után 1 μΐ RNSsin-t (Promega), 5 μΐ 5 mM dezoxinukleotid-trifoszfátot és 1 μΐ (200 egység) Moloney murin leukémia vírus reverz transzkriptázt (BRL) adunk hozzá, és a keveréket másfél órán át 37 °C-on inkubáljuk. A komplett reverz transzkriptáz reakció után az egyszálú cDNS RNS keveréket fenol/kloroform eleggyel extraháljuk, és átengedjük 1 ml G-25 SEPHADEX töltetű oszlopon. Az oszlopon átfolyó anyagot használjuk mint templát ss cDNS-t és PCR amplifikáláshoz.

HU 211 881 A9

Az ss cDNS amplifikálása

3-10 μΐ ss cDNS-t összekeverünk 10 μΐ 10X PCR pufferrel (500 mM KCI, 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 15 mM MgCl₂), 1,6 μΐ 1,25 mM dezoxinukleotid-trifoszfáttal, 50 pikomol specifikus immunglobulin 5’ primerrel, 50 pikomol specifikus immunglobulin 3’ prímeméi és 2-5 egység termostabil DNS polimerázzal (Synthetic Genetics). A reakciótérfogatot kiegészítjük vízzel 100 μΙ-re és felülrétegezzük 100 μΐ ásványi olajjal. A reakciókeveréket ezután az alábbi hőmérsékleten inkubáljuk a megadott ideig:

'C-on 1 percig, °C-on 2 percig és

C-on 2 percig.

Ezt a ciklust megismételjük 30-35-ször. Az amplifikálódott terméket agaróz gélelektroforézissel megvizsgáljuk 1,2%-os agaróz gélt és molekula tömeg standardokat használva. Az amplifikált immunglobulin variábilis régió gének körülbelül a 350-500 bp-ú markerek közé futnak. A PCR amplifikált termékeket ezután alkalmas plazmid vektorba történő klónozásra használjuk fel.

2. példa: Majom antitest gének klónozása

Mivel a majom variábilis régió gén-szekvenciák cDNS szinten - megkülönbözhetetlenek az ekvivalens géncsalád humán tagjaitól, a majom/humán kimér antitestre adott immunválaszok, ha vannak, sem mutatnak semmi különbséget azoktól, melyek a humán antitest molekulákra lépnek fel.

A PCR technológiát lehet használni specifikus restrikciós enzimhelyek, többek között (de nemcsak ezekre limitálva) Sáli, Bgin, KpnI és Nhel, bevezetésére az Old World variábilis régió szekvenciákra a PCR amplifikációs reakció során olyan primereket használva, melyek a 6. ábrában megadottakon alapulnak. Az előzőleg klónozott géneket amplifikáljuk a specifikus vektoraikból ilyen primereket használva a specifikus restrikciós hely bevezetésére, amelyet ezt követően a gén klónozására használunk egy expressziós vektorba. Altematíve ezeket a primereket használhatjuk amplifikálásra közvetlenül a celluláris RNS-ből.

Az expressziós vektorok, amelyeket megszerkesztettünk, két típusba tartoznak. Az első (lásd 3. és 4. ábrát) lehetővé teszi a majomból származó klónozott sDNS immunglobulin variábilis régiók beépítését, egyetlen restrikciós hely használatával, egy vektor kazettába, amelyben az immunglobulin gén elemek genomiális konfigurációba vannak elrendezve. Ez a vektor típus hordoz egy immunglobulin promotert, két exont kiegészítve az immunglobulin vezető szekvenciát, a Spel és Nhel klónozó helyeket, downstream összekötő donor szekvenciákat, egy immunglobulin enhancer régiót, egy humán konstans régió gént (nehéz vagy könnyű lánc) és downstream poliadenilációs szignálokat. Ráadásul magában foglal egy bakteriális origót a replikációhoz, egy béta-laktamáz gént a bakteriális szelekcióhoz, és egy neomicin foszfotranszferáz gént a G418 szelekcióhoz, vagy egy xantin-guanin foszforibozil-transzferáz (gpt) gént a mikofenolsav szelekcióhoz emlős sejtekben. A nehéz és könnyű lánc expreszsziós vektoroknál a neomicin foszfotranszferáz (Neo) és a xantin-guanin foszforibozil-transzferáz (Gpt) géneket alkalmazzuk szelekciós markerként.

Az expressziós rendszer másik típusánál (lásd 5. és

6. ábrát) az immunglobulin géneket cDNS-konfigurációban használjuk. Azaz nincsenek intronok vagy öszszekötő helyek az 5’ vezető szekvencia és 3’ konstans régió szekvenciák között. Ez a vektor típus hasznosít heterológ virális promoter/enhancer szekvenciákat, hordozza az immunglobulin nehéz és könnyű lánc géneket tandem módon, poliadenilációs szekvenciákat és egy szelektálható emlős sejt markert (Neo). Az Neo gén lehet módosítva, hogy megkönnyítsük a transzlációját, pl. az upstream és a gén start helye melletti kodon megváltoztatásával ACC-ről TCT-re. Ezen túlmenően a dihidrofolát-reduktáz (dhfr) gén is jelen van a metotrexátos gén amplifikációra. Majom immunglobulin variábilis régió géneket - klónozva a cDNS konfigurációval rendelkező expressziós vektorba - amplifikálunk vagy előzőleg klónozott szekvenciákból a shuttle vektorba (PBS), vagy közvetlenül RNS-ből primereket segítségével, melyek vagy a Sáli vagy Miül és Nhel restrikciós helyeket, a nehéz lánchoz, vagy a Bgin és KpnI vagy BsiWI helyeket tartalmazzák a kappa és lambda láncokhoz. Egyéb lehetséges egyedülálló restriciós helyeket azonban nem tartalmaznak.

A kimér nehéz és könnyű lánc immunglobulin géneket bevezethetjük a termelő sejtvonalba elszeparáltan vagy egymást követően (genomiális konfigurációjú szerkezetben) vagy ugyanazon a vektoron (cDNS konfigurációjú szerkezetben) elektroporációval. Elektroporációt használhatunk a linearizált DNS szerkezetek bevezetésére vagy kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtekbe vagy egér mielóma sejtekbe, ezt követi a transzfektánsoknak egyetlen sejt klónozása 96 lyukú tenyésztő edényekben. Az elektroporációhoz a BTX-100 (BTX, San Diego) elektroporációs eszközt alkalmazzuk és 1 ml-es eldobható plasztik küvettát, így optimális számú transzfektánst kapunk az adott mennyiségű vektor DNS-ből. ACHO-sejteket, amelyeket szuszpenzióban, szérummentes tápközegben való növekedéshez adaptáltunk, virális regulátor elemeket tartalmazó szerkezetekben használjuk.

lg variábilis régió gének szubklónozása

A PCR reakció termékeit extraháljuk fenol/kloroform eleggyel és átengedjük 1 ml SEPHADEX G-25 töltetű oszlopon. Ha a DNS-fragmens tompa végű lett klónozzuk egy plazmidba, 1 μΐ IM MgCl-ot, 0,5 ml 1,25 mM dezoxinukleotid-trifoszfátot és 1 μΐ Klenow DNS polimerázt (5 egység) adunk a teljes PCR reakcióelegyhez (100 μΐ) és 15 percig 37 ’C-on inkubáljuk, hogy elkészítsük az 5’ túlnyúló végeket. Mielőtt a tompa véget egy plazmidba klónozzuk, az 5’-végeket foszforiláljuk a következőképpen: 5 μΐ 10 mM ATP-t, 1 μΐ T4 polinukleotid-kinázt (10 egység) adunk a teljes reakcióelegyhez és 37 ’C-on 30 percig inkubáljuk. Az amplifikált fragmenseket, amelyek a közbenső restrikciós helyeket tartalmazzák, először elhasítjuk a megfe8

HU 211 881 A9 lelő restrikciós enzimmel, és ligáljuk közvetlenül, foszforilálás nélkül. Mindkét esetben a fragmenseket klónozzuk és extraháljuk fenol/kloroform eleggyel mielőtt a megfelelő vektorba ligálnánk.

A ligációs reakcióban 10%-ban foszforilált vagy restrikciós enzimmel hasított PCR-amplifikált fragmenst összekeverünk körülbelül 2 ng alkalmas vektorral (teljes térfogat 8 μΐ), melyet előzőleg restrikciós enzim(ek)kel emésztettünk. A tompa végű-klónozáshoz pBluescript-et használunk, melyet EcoRV-vei hasítottunk. A ragadós végű-klónozáshoz a TCAE 5.2 vagy 6.0 vagy pGenex-H vagy pGenexL vektorokat használjuk, melyeket egy alkalmas restrikciós enzimmel hasítottunk. 1 μΐ 10X ligáló puffért (500 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 10 mM ATP, 10 mM ditio-treitol), 1 μΐ T4 DNS-ligázt (1 egység) adunk a komponensekhez és a reakciót hagyjuk egy éjszakán át 14 “C-on lejátszódni. A ligáit eleggyel transzformáljuk a kompetens E. coli HB101 sejteket, a transzformálás standard kalcium-klorid módszerét használva. A transzformált baktériumsejteket LB ampicillin-tartalmú agar-lemezeken való növekedés alapján szelektáljuk. Az egyes kolóniákat kiválasztjuk és növesztjük ampicillin-tartalmű LB tápközegen egy éjszakán át, a plazmid DNS-t kinyerjük standard alkálikus lízis módszerrel. Restrikciós analízis után, mellyel meghatározzuk, hogy melyik kiónok tartalmazzák az immunglobulin inszerteket, kipreparáljuk a DNS-t a szekvenáláshoz.

A klónozott gének szekvenálása

A klónozott immunglobulin variábilis régió gének szekvenálására standard lánc terminációs módszert alkalmazunk. A kettős szálú plazmid DNS-t, amely a klónozott inszertet tartalmazza, szekvenáló templátként használjuk. Szekvenálás előtt a kettős szálú DNS-t kémiai úton denaturáljuk. A DNS szekvenálását T7 DNS polimeráz SEQUENASE-zal (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH), radiojelzett alfa-deoxi-ATP-vel és a következő szekvenáló primerekkel végezzük:

5’ CAGAGCTGGGTACGTCCTCA 3’ és 5’ GCCCCCAGAGGTGCTCTTGG 3’ az immunglobulin G nehéz lánc variábilis régióhoz az 5’-végtől a 3’ irányában illetve a 3’-végtől az 5’ irányában; 5’ CAGAGCTGGGTACGTGAACC 3’ és 5’ GGCTTGAAGCTCCTCAGAGG 3’ az immunglobulin lambda könnyű lánc variábilis régióhoz az 5’-végtől a 3’ irányában illetve a 3’-végtől az 5’ irányában. A reakciótermékeket 6%-os poliakrilamid-gélen szeparáljuk és leolvassuk.

Számos Old World majom immunglobulin nehéz és könnyű lánc variábilis régió gén szekvenálásának eredményét a 9a-9h ábrákon foglaljuk össze. Klónozó és szekvenáló cynomolgus immunglobulin géneket mindezideig nem írtak le az irodalomban. Ezért a homológja fokát sem lehetett meghatározni a humán és cynomolgus V régió gének között. A homológiát egy egyetlen csimpánz variábilis lambda gén és annak humán genomiális megfelelője között írták le, mely csak 2% különbséget mutatott a keret régiókban.

Transzfekció és szelekció

A klónozott nehéz és könnyű lánc variábilis régió gének szekvenálása után, szubklónozzuk azokat alkalmas vektorokba az expresszióra. Ezeket a vektorokat megszerkesztjük immunglobulin regulátor elemekkel genomiális konfigurációban (lásd 3. és 4. ábrát) vagy virális regulátor elemekkel cDNS-konfigurációban (lásd 5. és 6. ábrát). A megfelelő restrikciós helyeket (Spel és Nhel) bejelölhetjük a PCR-amplifikációs primerekbe a kezdő ampliftkációs lépés során, vagy fordítva, a restrikciós helyeket tartalmazó amplifikációs primereket használhatjuk a shuttle vektorokból nyert immunglobulin gének amplifikálására, melyekbe azokat előzőleg klónoztuk. Egy másik lehetőség szerint, az immunglobulin variábilis régió géneket klónozhatjuk közvetlenül az expressziós vektorokba az RNS-ből történő PCR-amplifikálás után, úgyhogy a szubklónozós szükségtelen.

Elektroporáció

Az elektroporációt vagy a nehéz és könnyű lánc genomiális szerkezetek ko-transzfektálására vagy a nehéz és könnyű lánc genomiális szerkezetek szekvenciális transzfektálására használjuk Sp2/0 sejtekbe. A szekvenciális transzfekciókban a kimér könnyű láncszerkezet elektroporációját mycofenolsavas szelekcióval követjük nyomon. A kiónokat 96 lyukú lemezen növesztve, screeneljük a tenyészet felülúszóját könnyű lánc régió termékre ELISA-módszerrel, amely lehetővé teszi a nagyobb könnyű lánc expressziós kiónok kiválasztását. Ezt követi a könnyű lánc transzfektánsok elektroporációja egy vektorral, amely majom/humán kimér nehéz lánc immunglobulin szerekezetet tartalmaz, így lehetővé válik a kívánt specifitású és izotípusú transzfektáns expresszáló kimér antitestek szelekciója.

A pGENEX-L könnyű lánc szerekezetet (3. és 4. ábra) Sp2/0 murin mielóma sejtvonalban transzfektáljuk az alábbiak szerint. Sp2/0 sejteket lxl0⁷/ml transzfekciós puffer (272 mM sucrose, 7 mM nátrium-foszfát pH 7,4, 1 mM MgCl₂) koncentrációban összekeverjük 50 pg pGENEX-L-lel, amely a megfelelő klónozott könnyű lánc gént hordozza, és amelyet előzőleg PvuII restrikciós enzimmel történő emésztéssel linearizáltunk. A sejteket behelyezzük 1 ml-es eldobható, műanyag spektrofotométer küvettákba, és lapelektródokat helyezünk a küvettába 3,5 mm távolságra egymástól. BTX-100 (BTX, Inc.) transzfekciós készüléket használva egy 500 mikromásodpercig tartó áramütést adunk a sejteknek úgy, hogy körülbelül a sejtek 50%-a elhal. Ezt az értéket a transzfekció előtt határozzuk meg a sejtek áramütésével, DNS távollétében, növelve a feszültséget és mérve a 24 órát túlélő sejtek számát. A sejt életképességét a feszültség függvényében grafikusan ábrázoljuk és az 50% elhalt sejthez tartozó feszültséget használjuk fel az összes ezt követő elektroporációs kísérletben. BTX-100 készülék alkalmazásánál az optimális értéket a 200 amplitúdójú ütésnél találtuk 500 mikroszekundumnál. A sejtek pulzálása után azokat jégen 15 percig feltárjuk, mielőtt átvinnénk őket a 96-lyukú tenyésztő lemezre Dulbecco által módosított

HU 211 881 A9

Eagle-tápközegbe (DMEM), amely 5% fötális borjú szérumot és 10% Sp2/0 kondicionált tépközeget tartalmaz. Alkalmas szerrel történő szelekció után a sejteket behelyezzük a lyukakba olyan koncentrációban, melynél a sejtek növekedése látható, 3 mélyedésből körülbelül 1-ben. Ezt a paramétert minden egyes elektroporációs kísérletnél meghatározzuk úgy, hogy különböző számú elektroporált sejtet helyezünk el lyukanként (1000-10 000) és a plazmidot hordozó sejteket szelektáljuk. Két-három héttel a szelekció után minden egyes lemezen megszámoljuk azokat a lyukakat, melyekben a sejtek növekedést mutatnak. így megfelelő számú sejtet, mely az adott koncentrációjú különleges plazmiddal 3-lyukból 1 pozitívnak adódott, határozunk meg a további kísérletekhez.

Közvetlenül az elektroporáció után a sejteket szer nélküli tápközegbe tesszük. Két nappal az elektroporáció után friss tápközeget adunk hozzá, amely vagy G418-at vagy mikofenolsavat tartalmaz a neomicinfoszfotranszferáz- vagy guanizil-foszfotranszferáz-aktivitással rendelkező sejtek számára. A sejteket etetjük kétnaponként az első héten és kétszer egy héten ezután. A felhasznált szer koncentrációját az inkubálódó sejteknél határozzuk meg a szer növekvő koncentrációjának jelenlétében és megfigyeljük a sejtek életképességét. A kétszer használt szer koncentrációja az, amely 100%-ban elölte a sejteket. Az Sp2/0 sejtekhez kb. 1 gg mikofenolsav/ml szükséges, a G418-hoz pedig kb. 800 gg/ml.

A sejtek elektroporációját különböző módokon végezzük, vagy a nehéz és könnyű lánc genomiális vektorokat (pGENEX-H és pGENRX-L) ko-elektroporáljuk, vagy a könnyű láncút elektroporáljuk egyedül. Ez utóbbi esetben a kiónokat screeneljük a kimér immunglobulin könnyű lánc magas-szintű expressziójára ELISA-módszerrel. Ezeket a kiónokat aztán növesztjük és elektroporáljuk a nehéz láncot tartalmazó vektorral. Ha cDNS tandem génszerkezeteket használunk, az expressziós vektort (TCAE5.2 és TCAE6) először linearizáljuk NotI restrikciós enzimes emésztéssel. Egy egyetlen elektroporáció elégséges ahhoz, hogy integráljuk mind a nehéz mind a könnyű lánc géneket. Két-három hét múlva a mélyedések felülúszóiból, melyek folyamatosan növekednek a megfelelő szer jelenlétében, megmérjük a kimér immunglobulin könnyű láncnak vagy a teljes immunglobulinnak a szekrécióját ELISA-módszerrel. A cDNS-konfigurációban lévő immunglobulin géneket elektroporáljuk vagy az Sp2/0 sejtekbe - amint azt a fentiekben leírtuk - vagy kínai hörcsög ovárium sejtekbe (CHO), alkalmassá téve azokat szuszpenzióban, szérum-mentes tápközegben való növekedésre. A CHO-sejtek elektroporálásánál BTX 600 készüléket használunk, és olyan körülmények közé helyezzük, hogy maximális számú G418-rezisztens kolóniát érjünk el (210 volt, 400 μΡ és 13 ohm). Elektroporáció után a sejteket megszámoljuk, mossuk transzfekciós puffenel, reszuszpendáljuk ugyanebben a pufferben és jégre tesszük 15 percig. A sejteket ezután lxlO⁷ élő sejt/ml-re beállítjuk és 400 μΐ sejtszuszpenziót behelyezünk 0,4 ml-es steril eldobható küvettába (BTX Inc.). 25 μg Notl-gyel linearizált TCAE5.2 vagy TCAE6 vektor DNS-t, amely a klónozott makákó immunglobulin variábilis régió géneket tartalmazza, reszuszpendálunk TE-pufferben (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) 1 gg/ml-nél és hozzáadjuk a sejtszuszpenzióhoz. Az elektroporációt a készülék tehermentesítésével végezzük, automata üzemmódot és a pulzus gombot használva. A küvettát 15 percig jégre tesszük, a sejteket meghígítjuk 120 ml-re szérum-mentes tápközeggel, és 96 lyukú tenyésztő edénybe tesszük (200 μΐ mélyedésenként, amely kb. 6,667 elektroporált vagy 3,333 élő sejtet tartalmaz mélyedésenként). Független elektroporációs paramétereket állapítunk meg erre a sejtvonalra, és a szelekciót G418-cal 400 gg/ml-nél végezzük.

Az antitest-termelés screenelése

A transzfektánsok által kiválasztott humán, majom vagy kimér antitestek jelenlétét ELISA-módszerrel mérjük az alábbiak szerint: 96 lyukú sima aljú lemezeket (Dynatech) bevonunk kecske anti-humán Ig-vel vagy kappa-val mélyedésként 200 ng-mal „bevonó puffer”-ben (nátrium-karbonát 0,8 mg/ml, nátrium-bikarbonát 1,55 mg/ml, pH 9,6) és 16 órán át 4 °C-on inkubáljuk. A bevonó puffért eltávolítjuk és a mélyedseket blokkoljuk 120 μΐ „blokkoló puffer”-rel (1% marha szérum albumin foszfáttal pufferolt sóoldatban, amely 0,2% nátrium-azidot tartalmaz) és 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk. A blokkoló puffért tartalmazó mélyedésekhez hozzáadjuk a sejttenyészet felülúszóját 125 μΐ-ig és inkubáljuk 2 órán keresztül 37 C-on. A lemezeket ezután mossuk ötször PBS-sel. 100 μΐ ló retek peroxidáz-radioaktív jelzett kecske anti-humán IgG (vagy kappa)-t adunk hozzá, melyet „hígító puffer”-rel (1% marha szérumalbumin, 0,05% Tween-20, 0,02% nátrium-azid PBS-ben) 1:1000-1:5000 arányban meghígítunk. A lemezeket 1 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd mossuk ötször PBS-sel. A kimér antitesteket lyukanként 100 μΐ hidrogén-peroxiddal és 3,3’,5,5’-tetrametil-benzidin (1:1 térf/térf) szubsztráttal mutatjuk ki. A színreakciót 2-5 perc után mélyedésenként 100 μΐ 2M kénsavval szüntetjük meg.

A területen jártas szakember számára a fent leírtakkal ekvivalens módszerek is kivitelezhetők. Az ilyen technológiák közé tartozik például a hibridóma fúzióval szelektált B-sejtek immortalizációja, mint azt fent leírtuk, K5H6/B5 sejtvonallal (Caroll et al.: J. Experimental Medicine 164, 1566 /1986/), vagy egy ekvivalens sejtvonallal, mint az SPAZ4 (beszerezhető a Sandoztól, lásd Ehrlich et al.: Clin. Chem. 34, 1681 /1988/). Hasonló sejtvonalakat könnyen megszerkeszthetünk standard technikákkal publikált módszerek felhasználásával. Hasonlóképpen, immunglobulin géneket klónozhatunk: (a) sejtekből, melyeket immortalizáltunk virális transzformációval Herpes papio vírussal, mint azt Markova és mtsai leírták (Vopr Virusol 30, 549 /1985/) vagy egy ekvivalens vírussal, (b) egyetlen B-sejt klónozással, mely egy átmeneti immortalizációt nyújt, Amaroso és Lipske leírása szerint (J. Immunology 145, 3155 (1990/), vagy (c) rekombináns bakte10

HU 211 881 A9 riofág könyvtárak felhasználásával, mint azt Huse és mtsai ismertetik (Scince 246, 1275 /1989/) és McCafferty et al.: Natúré 348, 552 /1990/). A megfelelő kiónokat tartalmazó antitestek screenelését kivitelezhetjük a fent ismertetett technikákkal vagy ekvivalens, a szakember számára ismert technikákkal, és a kívánt immunglobulin géneket kiszabadítjuk az immortalizált sejtvonalból. Továbbmenően, az izolált majom B-sejtek által termelt antitest felhasználható a humán terápiában, egy kimér antitest megalkotása nélkül.

A humán konstans régiót kinyerhetjük standard technikákkal, bármely kívánt izotípussal ismert módon, és a majom antitest variábilis régiót ligáljuk a humán konstans régióval. Különösen felhasználhatók a specifikus sejtfelszín receptorok elleni kimér antitestek, így a CD4, ICAMs, CD19, CD20, CD8, CDlla, CDllb, CD28, CDI 8, CD45, CD71, és TCR, amelyeket embereknél az immunterápiában alkalmazhatunk.

3. példa: A CD4-specificitású majom/humán kimér antitest klónozása és expresszálása A következőkben a találmány szerinti antitestekre és eljárásokra jellemző példát mutatunk be.

Majom immortalizált B-sejtvonalak megalkotása

Egy felnőtt cynomolgus majmot (White Sands New Mexico Primate Center) immunizálunk intramuszkulárisan, több oldalon, 150-300 pg oldható CD4-gyel (sCD4) vagy supTl jelű CD4 pozitív sejtvonalból származó sejtmembránnal (lxlO⁸ sejt) standard adjuvánsban. Az immunizációt megismételjük két-három hetente összesen 6 alkalommal. A majom egyik combjának lágyéki (inguinalis) régiójába egy 100 pg-os sCD4 injekciót adunk be és egy héttel később ugyanebből a combból a drénező nyirokcsomót műtétileg eltávolítjuk. A limfocitákat a nyirokcsomóból a szövet feldarabolásával és steril DMEM tápközeges átöblítésével nyerjük ki. A sejtszuszpenzót átvezetjük egy nylon gézen és 10 perces centrifugálással összegyűjtjük (1000 >g).

Körülbelül lxlO⁸ limfocitát szuszpendálunk Trisammónium-klorid pufferben (16 mM, pH 7,5) és melegítjük 37 “C-on 5 percig, hogy az eritrocitákat lizáljuk. A limfocitákat centrifugálással összegyűjtjük és reszuszpendáljuk L-leucin-metilészterben (LME), majd 45 percig 37 ’C-on inkubáljuk. Az LME-kezelt sejteket átszórjük egy nylon szűrőn és centrifugáljuk. Hozzáadunk 1 ml magzati borjúszérumot, a sejteket szuszpendáljuk és mossuk kétszer szérum-mentes RPMIvel. A sejteket összeszámoljuk és egy 50 ml-es kónikus centrifugacsőben összekeverjük azonos számú K6H5/B5 heteromielóma sejttel, melyeket előzőleg kétszer átmostunk szérum-mentes tápközeggel. A sejteket óvatosan szuszpendáljuk 1 ml 50%-os PEG-ben (polietilén-glikol), melyet lassanként, enyhe keverés mellett 1 perc elteltével adunk hozzá. Öt perc múlva a sejteket reszuszpendáljuk 20 ml szérum-mentes tápközeg hozzáadásával, enyhe keveréssel, meghígítva a PEG-et. Kétszeri, szérum-mentes tápközeggel való mosás után, a sejteket reszuszpendáljuk 5X1O⁵ sejt/0,1 ml tápközeg koncentrációban RPMI-ben, mely 20% magzati borjú szérumot és gentamicint tartalmaz, és 0,1 ml-enként szétosztjuk egy 96 lyukú mikro szövettenyésztő lemez mélyedéseibe. Ugyanolyan térfogatú (0,1 ml) HAT médiumot adunk minden egyes mélyedéshez és a hibrideket 14-17 napig növesztjük a screenelés előtt.

Az anti-CD4 termelésére fuzionált sejthibridek screenelése

Az anti-CD4-specificitás meghatározási módszere a következő:

ELISA-teszt lemezeket bevonunk rekombináns sCD4-gyel 100 ng/mélyedés koncentrációban, és blokkoljuk 1%-os marha szérum albuminnal PBS-ben. A hibridóma tartalmú felülúszó 50 pl alikvotjait eltávolítjuk minden egyes mélyedésből és inkubáljuk a sCD4gyel bevont lemezekkel együtt 60 percen át. A 60 perces inkubálás során a kötődést ¹²⁵I-dal jelzett kecske anti-humán vagy kecske anti-majom Ig-vel detektáljuk. Négyszeri desztillált vizes mosás után a mélyedéseket megszámoljuk gamma-számlálóban. A pozitívnak adódó mélyedéseket újra mérjük kétszeresen és a hibridóma sejteket ezekből a mélyedésekből háromszor szubklónozzuk (először 5 sejt per lyuk, majd kétszer 1 sejt per lyuk). Ebben az állapotban az anti-sCD4 pozitívokat screeneljük a sejtfelületi CD4-hez való kötődés képességére. Ezt úgy végezzük, hogy gátoljuk egy anti-CD4 murin monoklonális lF3-nak a supTl jelű CD4 pozitív sejtvonalhoz való kötődését. Részletesebben, együtt inkubálunk különböző mennyiségű majom anti-CD4-et és 10 ng ¹²⁵I-jelzett lF3-at lyukanként 3x10⁵ supTl sejttel egy 96 lyukú lemezen. Egy órás inkubálás után szobahőmérsékleten (kb. 20-25 perc) a sejteket vákuummal távolítjuk el üvegszálas szűrőkre. A szűrőket alaposan mossuk PBS-sel, majd megszámláljuk egy gamma-számlálóban, hogy meghatározzuk az 1F3 supTl sejtekhez való kötődésének - a majom hibridóma felülúszók általi - gátlását.

Egy jelölt kiónt kiválasztunk, amely olyan antitestet termel, amelyik erős gátlást mutat az lF3-mal szemben. A kiválasztott kiónt izotipizáltuk humán izotipizáló reagensekkel és úgy találtuk, hogy az egy lambda könnyű láncú IgG2. Ezt a sejtvonalat tenyésztjük nagyszámban az immunglobulin génjeinek klónozásához.

Majom immortalizált B-sejtekból származó nehéz és könnyű lánc variábilis régió gének klónozása A teljes RNS-t lxlO⁷ majom immortalizált B-sejtből izoláljuk, a fent leírt guanidinin-izotiocianát módszerrel. A teljes RNS egy tizedét használjuk fel az egyszálú cDNS képzésére egy oligo-dT oligonukleotid primerrel és reverz transzkriptázzal együtt, a fentiekben leírtak szerint. Az ss cDNS mennyiségének egy tizedét visszük PCR reakcióba. A hat PCR reakció mindegyike magában foglalja a hat 5’ V_H család specifikus oligonukleotid primerek egyikét, hordozva egy Sáli restrikciós helyet, egy IgG 3’ konstans régió oligonukleotiddal együtt, hordozva egy Nhe I helyet, amint az a 7a. ábrán látható. Hasonlóan, a másik öt PCR

HU 211 881 A9 reakciót öt 5’ lambda vezető szekvencia oligonukleotid primer, hordozva egy BglII helyet, és egy 3’ lambda konstans régió primer, hordozva egy Avrll helyet, felhasználásával futtatjuk le. A reakciófeltételek azonosak a fent megadottakkal. Minden egyes PCR reakciót háromszor játszatjuk le. Az egyes nehéz lánc és könnyű lánc amplifikációs reakciók termékeit megfuttatjuk 1,2%-os agaróz gélen. A VH4 nehéz lánc primer (SEQ ID NO: 13 szekvencia: 5’ACT AAGTCGACATGAAACACCTGTGGTTCTT 3’) és a lambda primer (SEQ ID NO: 14 szekvencia: 5’ ATCACAGATCTCTCACCATGACCTGCTCCCCTCTCCTCC 3’) erős csíkot ad agaróz gélelektroforézisben. Ezeknek a reakcióknak a termékeit klónozzuk a TCAE 6 vektorba, amely humán IgG 1-t és humán lambda konstans régió-szekvenciákat tartalmaz.

A két variábilis régió gént a TCAE 6 expressziós vektorba szekvenciálisán klónozzuk. Első lépésben, a nehéz lánc PCR-terméket és a TCAE 6 vektort emésztjük a Sáli és Nhel restrikciós enzimekkel, a kapott termékeket extraháljuk fenol/kloroformmal és átengedjük egy SEPHADEX G-25 forgó oszlopon. A PCR-terméket ligáljuk a hasított vektorba egy éjszakán át 14on T4 DNS-ligáz jelenlétében. Körülbelül 500 ng teljes RNS-t ligálunk 10 μΐ térfogatban, ahol az inszert és a vektor tömegaránya 10:1. A ligáit terméket használjuk az XL-1 Blue kompetens sejtek (Stratagene) transzformálására és a transzformált sejteket ráhelyezzük LBagar lemezekre, melyek 50 pg/ml ampicillint tartalmaznak. Az ampicillin-rezisztens baktérium kolóniákat kiemeljük és 5 ml-es minikultúrákként tenyésztjük. Minden egyes kultúrából a plazmid DNS-t extraháljuk standard alkálikus lizáló módszerrel, hasítva Sáli és Nhel restrikciós enzimekkel és a termékeket 1,2%-os agaróz gélen futtatva. A kb. 450 bp inszerteket tartalmazó plazmidokat használjuk templátként a könnyű lánc variábilis régiók ezt követő klónozásához. A könnyű lánc PCR reakció termékeit valamint a nehéz lánc inszerteket tartalmazó plazmidokat hasítjuk BglII és Avrll restrikciós enzimekkel és egymásba ligáljuk őket. A plazmid minikultúrákat screeneljük BglII és Avrll hasítással. Az emésztés egy kb. 400-450 bp inszertet szolgáltat, amely pozitívnak bizonyult. A plazmidokat, melyek mind a Sall/Nhel mind a BglII/Avrll inszerteket hordozzák, nagyobb mennyiségben tenyésztjük a DNS szekvenálásához.

A TCAE 5.2 és a TCAE 6 tandem kimér antitest expressziós vektorok a CLDN vektorból származnak, amely maga is az RLDNIOb vektor származéka (Science 253, 77-79 /1991/). Az RLDNIOb pedig a TND expressziós vektor származéka (DNS 7,651-661 /1988/).

Az RLDN1 Ob vektort a TND vektorból a következőképpen vezetjük le. A dihidroftalát-reduktáz (DHFR) transzkripcionális kazettát (promoter, cDNS és poliadeniláló régió) behelyezzük a szöveti plazminogén aktivátor kazetta (t-PA expressziós kazetta) és a neomicin-foszfotranszferáz (NEO) kazetta közé úgy, hogy mindhárom kazetta tandem elrendezésben és ugyanabban a transzkripcionális orientációban legyen. Ezen túlmenően, a DHFR gén promotert a CLDN-ben helyettesítjük az egér béta-globin promoterrel (Mól. Cell Bioi. 3, 1246-54 /1983/) és a tPA cDNS-t helyettesítjük egy polilinkerrel. Mind a három eukarióta expressziós kazetta (Expression, DHFR, NEO) kinyerhető a bakteriális plazmidból (pUC9 származék) Notl restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel.

A CLDN különbözik az RLDNIOb-től, mert a Rous LTR a polilinker elején helyettesítve van a humán citomegalovírus középső korai gén promoter enhancerrel (Cell 41, 521 /1985/).

A TCAE 5.2 és TCAE 6 expressziós vektorok a CLDN-től az alábbiakban különböznek:

1) Négy transzkripcionális kazettát tartalmaznak (három helyett) tandem elrendezésben:

(a) Egy humán immunglobulin könnyű lánc konstans régiót, mely a cDNS amplifikálásából - polimeráz láncreakcióval - származik. A TCAE 5.2-ben ez a humán immunglobulin könnyű lánc kappa konstans régió (a Kabat-féle aminosav számozás szerint 108— 214, allotípus Km3) és a TCAE 6-ban ez a humán immunglobulin könnyű lánc lambda konstans régió (Kabat-féle aminosav számozás szerint 108-215, genotípus Oz mínusz, Meg mínusz, Ke mínusz allotípus).

(b) Egy humán immunglobulin nehéz lánc konstans régiót; mindkét szerkezetben a humán immunglobulin nehéz lánc egy gamma 1 konstans régió (Kábát aminosav számozás szerint 114-478 allotípus Gmla, Gmlz), amely a cDNS amplifikálása útján polimeráz láncreakcióval keletkezett.

(c) DHFR; amely a saját eukarióta promoterét és apoliadenilációs régióját tartalmazza.

(d) NEO; szintén tartalmazza a saját eukarióta promoterét és poliadenilációs régióját.

3) A humán immunglobulin könnyű és nehéz lánc kazetták specifikus DNS linkereket hordoznak, melyek lehetővé teszi olyan könnyű és nehéz immunglobulin variábilis régiók beépülését, melyek fenntartják a transzlációs leolvasási keretet és nem változtatják meg az immunglobulin láncokban normálisan előforduló aminosavakat. A leírt változtatások beépítse vezetett a TCAE 5.2 és TCAE 6 vektorok megszerkeszetéséhez. Az immunglobulin könnyű és nehéz variábilis régió gének, melyek az E9.1 jelű, anti-CD4 heterohibridóma sejtvonalból származnak, klónozása a TCAE 6-ba vezetett ahhoz a szerkezethez, melyet az ATCC-nél letétbe helyeztünk. Ez a szerkezet, melyet deponáltunk, tartalmazza a cynomolgus majom immunglobulin nehéz lánc variábilis régiót és a immunglobulin könnyű lánc variábilis régiót, melynek szekvenciáit a 13. illetve a 14. ábrán mutatjuk be, klónozva az antiCD4 hibridóma E9.1 sejtvonalból. A nehéz lánc konstans régió a gamma 1 izotípusnak és Gmla, Gmlz allotípusnak a humán eredetije. A lambda könnyű lánc konstans régió is a Oz mínusz, meg mínusz genotípusnak és Ke mínusz allotípusnak az eredetije. Az immunglobulin géneket az emlős expressziós vektorba, a TCAE 6-ba (lásd 5. ábrát) klónozzuk, amely, ha elektroporáljuk az emlős CHO sejtvonalba, termeli a majom/humán antiCD4 kimér antitestet. Az itt leírt DNS-szerkezetet használjuk a bakteriális XL-1 Blue törzs transzformálására, ampicillinnel szelektálva és letétbe helyezve mint bakte12

HU 211 881 A9 riális sejtszuszpenziót steril, 15% glicerint tartalmazó LB táptalajon.

Egy másik használható expressziós rendszer az, amelyben egy szelektív markért kódoló gént módosítunk, hogy a kívánt szekvenciát kódoló rekombináns rendszer termelését megnöveljük. így például, a domináns szelektálható marker transzlációs iniciációs károsodása kevesebb vegyszer-rezisztens kolóniát eredményez a nem-károsodott vektorhoz viszonyítva, de az egyes különálló kolóniák szignifikánsan magasabb szinten fejezik ki az összekapcsolt génterméket, mint a nemkárosodott vektorban. Például, a transzlációs iniciáció a fehérjeszintézis első lépése. A neomicin-foszfotranszferáz gén (G418 rezisztens gén) transzlációs iniciációs helyét módosítjuk a konszenzus Kozák-szekvenciáról (szekvencia - ccAccATGG) a gyenge Kozák-szekvenciára (szekvenciaccTccATGC). A G418 rezisztens gén transzlációs iniciációs károsodása a következőket eredményezi: 1) a G418 rezisztens kolóniák számának szignifikáns (ötszörös) csökkenését, melyeket sejtenként ugyanolyan mennyiségű plazmid DNS-sel való transzfektálásból kaptunk, és 2) az egyes kiónokban kifejeződött összekapcsolt (colinked) géntermék mennyiségének szignifikáns növekedését. Azokban a kiónokban, melyek a konszenzus Kozákszekvenciát tartalmazzák, a screenelt kolóniák 73%-a termel kevesebbet, mint 25 ng/ml, csak 3% termel többet, mint 100 ng/ml. A gyenge Kozak-szekvenciával módosított klónoknál, a kolóniák 8 %-a termel kevesebbet, mint 25 ng/ml, viszonyítva a kolóniák 63%-ához, mely többet termel 100 ng/ml-nél. Pontosabban hivatkozva a 16. ábrára (ahol a TCAE 5.2 rendelkezik egy Kozák, és a TCAE 12 egy gynegített Kozak-szekvenciával), 258 kolónia származik 25 pg DNS két elektroporációjából, ahol a DNS a neomicin foszfotranszferáz gént egy konszenzus (változatlan) transzlációs start hellyel együtt tartalmazza. Ezen kolóniák közül 201 (78%) nem fejez ki detektálható génterméket (azaz, kevesebb, mint 25 ng/ml kimér immunglobulint), és csak 8 kolónia (3%) fejez ki többet, mint 100 ng/ml. 98 kolónia 25 pg DNS 6 elektroporációjából származik, ahol a DNS a neomicin foszfotranszferáz gént egy módosított transzlációs hellyel együtt tartalmazza. Ezen kolóniák 63%-a expresszál többet, mint 100 ng/ml, és csak 8%-a expresszál kevesebbet, mint 25 ng/ml.

DNS-szekvenálás

A plazmid DNS-t 100 ml tenyészetből preparáljuk ki, és tovább tisztítjuk kicsapással (1 térfogat) 2,5 M nátrium-klorid és 20%-os polietilén-glikol elegyével (6 térfogat) 15 percig jégen tartva. Centrifugálás után (10,000 > g, 20 perc) a kapott pelletet mossuk 70%-os etanollal, újra centrifugáljuk és szárítjuk Speedivac-ban (Savant). A DNS-pelletet reszuszpendáljuk ionmentesített vízben 150-250 pg/ml koncentrációban. A kétszálú DNS-t 5 pgonként szekvenáljuk Sanger-féle módszerrel. Az alkalmazott szekvenáló primerek azok, melyek homológok az expressziós vektorban lévő nehéz lánc vagy a könnyű lánc ionszerkezetek upstreamm és downstream szekvenciáival. Az inszerteket szekvenáljuk mind az 5’-végtől a 3’ irányába, mind 3’-től az 5’-vég irányába. Az anti-CD!könnyű lánc két kiónját és az anti-CD4 nehéz lánc két kiónját, melyek mindegyike különböző PCR reakcióból származik, szekvenáljuk párhuzamosan acélból, hogy megállapítsuk, vajon módosult-e valamelyik nukleotid a PCR reakció során. Mind a megváltozott nehéz lánc és könnyű lánc kiónokat azonosnak találtuk a lánchosszúságukat tekintve, jelezve, hogy nem következett be hiba az amplifikációs eljárás folyamán. Az anti-CD4 nehéz és könnyű láncok szekvenciáját a 13. és 14 ábrán és a szekvencia listában a 15. és 16 szám alatt mutatjuk be.

Majom/humán kimér antiCD4 expressziója A TCAE 5.2 és TCAE 6 expressziós vektorokat nemcsak Sp2/0 és CHO sejtvonalakba stabilan integrálódott expresszióra használhatjuk fel, hanem - mivel azok az SV40 origót tartalmazzák - képesek kifejeződni átmenetileg COS sejtvonalakban is. A COS sejtek expresszióját az alábbiak szerint végezzük: a COS sejteket tenyésztjük egy nappal a transzfekció előtt úgy, hogy azok 50-70%-a egymásbafolyó legyen a következő napra. A tenyészközeget eltávolítjuk és sejteket kétszer mossuk „transzfekciós puffer”-rel (TB 140 mM NaCl, 25 mM Tris, 5 mM KC1, 0,5 mM Na₂HPO⁴, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂). 30 pg céziumkloridoddal pufferolt TCAE 6 plazmidot, mely az antiCD4 majom/humán kimér nehéz és könnyű immunglobulin láncokat tartalmazza, összekeverünk 3 ml DEAE dextránnal edényenként (’ mg/ml TB). A DNS-t inkubáljuk a sejtekkel 1 órán át 37 °C-on. A DNS-oldatot eltávolítjuk és helyettesítjük 3 ml 20%-os glicerinnel

1,5-2,5 percre, majd a sejteket mossuk kétszer TB-vel. Inkubáljuk a sejteket 5 ml friss tápközegben, mely 100pM kloroquint tartalmaz, 3-5 órán keresztül 37 °C-on, ezután mossuk kétszer a tápközeggel és inkubáljuk normál DMEM-mel 72 óráig. A transzfektált COS sejtek felülúszóját (100 pl) különböző hígításokban megvizsgáljuk az antitest jelenlétére ELISA-n alapuló technikával. Kecske anti-humán lambdát használunk egy 96 lyukú vizsgáló lemez bevonására, és jelzett-poxidáz kecske anti-humán IgG-t detektáló antitestként standard ELISA-körülmények között. Azt találtuk, hogy a COS sejtek 10 és 40 ng/ml közötti majom/humán kimér antitestet termelnek. Nagyobb mennyiségű felülúszót 10-szeresre bekoncentrálunk, és ezt használjuk a CD4 pozitív supTl sejtekhez közvetlenül kötő RIA-tesztben. A szülő teljes majom antitestet és egy irreveláns humán immunglobulint használunk pozitív illetve negatív kontrollként (11. ábra). Továbbá, a majom anti-CD4-et és a majom/humán kimér antiCD4-et használjuk a nagy affinitású egér antiCD4 (1F3) antitest (’2. ábra) kötődésének gátlására. Látható, hogy a majom/humán rekombináns antitest (ATCC No.) nem csak kötődik a CD4 pozitív sejtekhez, hanem képes az 1F3 kötődését is meggátolni a CD4 pozitív sejtekhez körülbelül a teljes majom antitesttel és magával az lF3-mal azonos koncentrációban.

4. példa: Humán limfocita antigének elleni majom antitestek létrehozása

Egy felnőtt cynomolgus majmot (White Sands New

HU 211 881 A9

Mexico Primate Center) immunizálunk intramuszkulárisan, több oldalon, SxlO⁸ egész CD4 pozitív humán limfocitákkal. Hasonlóképpen használunk SB sejteket (humán B limfoid vonal) és aktivált perifériás humán limfocitákat is, melyeket egy elő-inkubálás során aktiváltunk alkörmös mitogén (2,5 mg/ml), forbol-monoacetát (40 nM) és fitohemagglutinin (4 mg/lyuk) elegyével egy standard adjuvánssal együtt. Az immunizációs megismételjük minden 2-3. héten 8 hónapon keresztül. Az immunizált állatok szérumát screeneljük különböző időpontokban a 83H10 murin antitest kötődésének gátlása által, melyről köztudott, hogy az ICÁM-1-hez kötődik. A 84H10 antitestekkel telítettük a kínai hörcsög ovárium sejteket (CHO), melyeket előzőleg transzfektáltunk humán CD54 cDNS-t tartalmazó expressziós vektorral és szelektáltunk a sejt felületi CD54 magas szintű expressziójára, növekvő majom szérum hígításokkal együtt. A 84H10 kötődésének gátlását a 15. ábrán mutatjuk be.

Egyéb murin monoklonális antitesteket - melyek felismernek más humán limfocita antigéneket - is teszteltünk ugyanilyen immunizációs módszerrel nyert majom szérum gátlásával.

Felhasználás

A fent leírt módon vagy ekvivalens technikákkal termelt antitesteket affinitás- és méretkizárásos kromatográfia kombinációjával tisztíthatjuk a funkcionális biológiai vizsgálatokban történő jellemzés céljából. Ezek a vizsgálatok a specificitás és kötődő képesség valamint a kifejeződött izotípussal, pl. ADCC, kapcsolt effektor funkciók vagy komplement fixáció meghatározását jelentik. Az ilyen antitesteket felhasználhatjuk passzív vagy aktív terápiás szerekként számos humán betegséggel szemben, beleértve a B-sejtes limfómát, a fertőző betegségeket, köztük az AIDS-t, az autoimmun és gyulladásos betegségeket, és a transzplantációt. Az antitesteket alkalmazhatjuk natív formájukban, vagy egy antitest/kelát, antitest/gyógyszer vagy antitest/toxin komplex részeként. Ráadásul, a teljes antitestek vagy antitest fragmensek (Fab₂, Fab, Fv) használhatók elképzelt reagensekként vagy mint lehetséges vakcinák vagy immunogének az aktív immunterápiában az antiidiotíp válaszok kiváltására.

A felhasznált antitest terápiás hatást eredményező mennyiségét meghatározhatjuk standard módszerekkel, melyek a területen jártas szakemberek számára jól ismertek. Az antitesteket rendszerint gyógyászatilag elfogadható pufferben szereljük ki és bármely kívánt módon beadhatjuk. A találmány szerinti antitestek hatékonysága és az emberek általi tolerálhatósága miatt, ezeket az antitesteket ismételten is beadhatjuk, hogy legyőzzük a különféle betegségeket vagy beteg állapotokat a humán szervezetben.

A találmány szerinti anti-CD4 rekombináns antitestek (vagy fragmenseik) tehát felhasználhatók immunszuppresszió indukálásra, azaz az emberi vagy állati immunrendszer szuppressziójának előidézésére. A találmány - a fentiek alapján - profilaktikusan vagy terápiásán indukált immunszuppressziós eljárásra vonatkozik emberben vagy állatban, mely egy találmány szerinti antitest hatékony, nem-toxikus mennyiségének beadását jelenti egy embernek vagy állatnak.

A találmány szerinti vegyületek immunszuppressziót indukáló képességét megállapíthatjuk erre a célra használatos standard tesztekkel, így például, egy kevert limfocita reakció teszttel vagy a T-sejtek proliferációjának gátlását mérő teszttel, a mérést timidin-felesleggel végezve.

Tény, hogy a találmány szerinti antitestek felhasználhatók az indukált immunszuppresszióban, ami azt jelenti, hogy alkalmazhatók a transzplantált szervek vagy szövetek (így máj, szív, tüdő, csontvelő, bőr, komea, stb.) kilökődésének megakadályozásában vagy ezekkel szembeni rezisztencia kezelésében vagy megelőzésében; autoimmun, gyulladásos, proliferatív (burjánzó) és hiperproliferatív betegségek, és az immunológiailag kezelt betegségek bőr manifesztációinak kezelésében (így pl. reumatoid artritisz, lupusz erithematodesz, szisztémás lupusz erithematodesz, Hashimoto tireoiditisz, szklerózis multiplex, miaszténia grávisz, 1-es típusú diabétesz, uveitisz, nefrózis szindróma, pszoriázis, általános dermatitisz, kontakt dermatitisz és további ekcémás dermatitiszek, seborrheás dermatitisz, Lichen plánusz, pemfigusz, bullózus pemfigusz, bullózus epidermolízis, urtikária, ér-eredetű ödémák, érgyulladás, eritéma, bőr eozinofília, alopecia areáta, stb.); a reverzibilis obstruktív légúti betegségek, bélgyulladások és allergiák (így pl. genuin cöliákia, végbélgyulladás, eozinofil gasztroenteritisz, masztocitózis, Crohn-féle betegség és ulceratív kolitisz) és alimentáris allergiák (mint pl. migrén, nátha és ekcéma) kezelésében.

A szakember számára rutin kísérletekkel meghatározható az antitest hatékony, nem-toxikus mennyisége az immunszuppresszió indukálása céljára. Általában a hatékony dózis a 0,05-100 mg per testsúly kg per nap tartományba esik.

A találmány szerinti antitesteket (vagy fragmenseiket) emlősökben tumorok kezelésére is felhasználhatjuk. Még pontosabban, felhasználhatjuk azokat a tumor nagyságának csökkentésére, a tumor-növekedés gátlására és/vagy a tumort hordozó állatok élettartamának meghosszabbítására. Ezek alapján a találmány tumorok kezelési eljárására is vonatkozik emberben és állatban, mely szerint egy ilyen embernek vagy állatnak a találmány szerinti antitest egy hatékony, nem-toxikus dózisát beadjuk. A területen jártas szakember számára lehetséges rutin kísérletekkel az antitest egy hatékony, nem-toxikus dózisát beadjuk. A területen jártas szakember számára lehetséges rutin kísérletekkel az antitest egy hatékony, nem-toxikus dózisát meghatározni karcinogén tumorok kezelése céljából. Általában, azonban, a hatékony dózisnak 0,05-100 mg/testsúly kg/nap tartományban kell lenni.

A találmány szerinti antitesteket beadhatjuk embernek vagy állatnak a fentemlített kezelési módszerekkel olyan mennyiségben, amely alkalmas arra, hogy terápiás vagy profilaktikus hatást eredményezzen. Az ilyen találmány szerinti antitesteket beadhatjuk egy ilyen

HU 211 881 A9 embernek vagy állatnak a szokásos gyógyszer formában, melyet ismert technikákkal készítünk a találmány szerinti antitest és a szokásos gyógyászatilag elfogadható hordozók és hígítószerek összekeverésével. Megállapítottuk, hogy a kiszerelési formát és a gyógyászatilag akceptálható hordozó és oldószer milyenségét a hatóanyag mennyisége szabja meg, amellyel azt kombináljuk a beadás vagy egyéb ismert változatok során.

A találmány szerinti antitest (vagy fregmense) beadásának módja lehet orális, parenterális, inhaláció általi vagy helyi. A parenterális megjelölést használjuk az intravénás, intramuszkuláris, szubkután, rektális, vaginális vagy intraperitoneális beadásokra. Általában előnyösek a parenterális beadás szubkután és intramuszkuláris formái.

A találmány szerinti vegyületek napi parenterális és orális dózisai, melyek az immunszuppresszió profilaktikus vagy terápiás indukálására vagy a karcinogén tumorok terápiás kezelésére szolgálnak, rendszerint 0,05-100, előnyösen pedig 0,5-10 mg/testsúly kg/nap tartományban lesznek.

A találmány szerinti antitesteket inhalálással is bejuttathatjuk. „Inhalálás” alatt az intranazális vagy orális inhalációt értjük. Az ilyen beadáshoz megfelelő dózis formák az aerosol formulázás vagy a mért dózisú inhalátor, melyeket szokásos technikákkal állíthatunk elő. A találmány szerinti vegyületek rendszerint alkalmazott, előnyös dózisa 10-100 mg.

A találmány szerinti antitesteket beadhatjuk helyileg is. A helyi beadás a nem-szisztémás gyógyszerbeadást jelenti és magában foglalja egy találmány szerinti antitest (vagy fragmens) vegyület elkészítését külsőleg az epidermisz számára, az arcüregnek és egy ilyen antitestnek a fülbe, szembe és az orrba helyezését, ahol a lényeges mennyiségben nem kerül be a véráramba. A szisztematikus beadási mód az orális, intravénás, intraperitoneális és intramuszkuláris beadást jelenti. A terápiás és profilaktikus hatás eléréséhez szükséges antitest mennyisége természetesen függ a választott antitesttől, a kezelési feltételek és az állaton végzett kezelés természetétől és szigorúságától, és végülis az orvos diszkréciójára van bízva. A találmány szerinti antitest alkalmas helyi dózisa általában 1 és 100 mg/testsúly kg/nap közé esik.

Formulázás

A találmány szerinti antitestet vagy annak fragmensét beadhatjuk önmagában vagy gyógyszerkészítmény formájában. A készítmény - helyi beadáshoz - a hatóanyagot 0,001%-10% (t/t)-ban tartalmazhatja, pl. 12%-ban, de a formulázás 10%-ában is, azonban nem előnyös 5%-nál (t/t) nagyobb felesleg és még előnyösebb 0,1-1% (t/t) hatóanyag-mennyiség.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a hatóanyagot egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval és adott esetben egyéb terápiás szenei együtt tartalmazzák. Az, hogy a hordozók „elfogadhatók”, ez azt jelenti, hogy kompatibilisek a készítmény más alkotórészeivel és nem ártalmasak a készítményt befogadó személyre.

A helyi beadásra alkalmas készítmények folyékony vagy fél-folyékony, a beadás helyén a bőrön való áthatolásra alkalmas készítmények, így pl. híg kenőcsök, lotion-k, krémek, olajos vagy paszták, és cseppek, melyek alkalmasak a szembe, fülbe vagy orrba juttatásra.

A találmány szerinti cseppek tartalmazhatnak steril vizes vagy olajos oldatokat, szuszpenziókat és úgy készítjük el őket, hogy a hatóanyagot feloldjuk egy baktericid és/vagy fungicid szert és/vagy egyéb alkalmas konzerválószert, és előnyösen egy felületaktív szert tartalmazó megfelelő vizes oldatban. A kapott oldatot ezután szűréssel tisztíthatjuk, majd átvisszük egy alkalmas konténerbe, amelyet azután lezárunk és sterilizáljuk autoklávban vagy 90-100 °C-os hőkezeléssel fél órán át.

Alternatív módon az oldatot szűréssel is sterilezhetjük, és aszeptikus körülmények között visszük át a tartó edénybe. A csepphez felhasználható alkalmas baktericid és fungicid például a fenil-higany(II)-nitrát vagy -acetát (0,002%). Az olajos oldatok alkalmas oldószere a glicerin, a hígított alkohol vagy a propilén-glikol.

A találmány szerinti lotion-k a bőrre vagy szembe való beadásra alkalmas készítmények. A szem-lotion tartalmaz egy steril vizes oldatot, mely adott esetben egy baktericid szert is tartalmazhat, és a cseppekhez hasonló módszerekkel készíthetjük. A lotion-k és híg kenőcsök a bőr számára magukban foglalhatnak még a száradást elősegítő és a bőrt lehűtő szereket, úgy mint alkoholt vagy acetont, és/vagy egy nedvesítőt, úgy mint glicerint vagy egy olajat, mint pl. ricinus-olaj vagy arahisz-olaj.

A találmány szerinti krémek, kenőcsök és pasztákfélfolyékony készítmények az aktív komponens külsőleg történő beadásához. Ezeket elkészíthetjük a hatóanyag bekeverésével teljesen szétoszlatott vagy por formában, önmagában vagy oldatban vagy szuszpenzióban vizes vagy nem-vizes közegben, egy alkalmas eloszlató szer segítségével, egy síkosító vagy nem-síkosító alapanyagba. Az alapanyag tartalmazhat szénhidrogéneket, mint pl. kemény, lágy vagy folyékony paraffint, glicerint, méhviaszt, egy fémes szappant; egy ragasztót; egy természetes eredetű olajat, mint pl. mandula-, gabona-, ricinus-, arahisz- vagy olívaolajat; gyapjű zsírt vagy annak származékait, vagy egy zsírsavat, mint pl. sztearinsavat vagy olajsavat alkohollal, mint pl. propilén-glikollal vagy makrogollal együtt. A készítményben lehet egy megfelelő felületaktív szer is, mint pl. egy anionos, kationos vagy nem-ionos felületaktív szer, úgy mint szorbitán-észterek vagy annak polioxi-etilén-származékai. Szuszpendáló szerek lehetnek a természetes gumik, cellulóz-származékok vagy szervetlen anyagok, mint pl. kovasavas szilíciumdioxid vagy egyéb alkotók, mint pl. a lanolin.

A találmány szerinti antitestek és fragmenseik individuális dózisainak optimális mennyiségét és idejét a kezelés természetes és kiterjesztett körülményei során határozzuk meg, a beadás formáját, útját és módját, és ezek optimumát a szakember számára ismert, konvencionális technikákkal határozhatjuk meg. A kezelés optimális idejét, azaz a találmány szerinti antitestek vagy fragmenseik beadott napi dózisainak a számát és a napok számát szintén a szakember számára ismert, a kezelést megszabó konvencionális tesztek felhasználásával határozzuk meg.

További részletezés nélkül, a területen jártas szakember számára a leírás alapján a találmány további

HU 211 881 A9 felhasználásai is lehetségesek. Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak, anélkül, hogy ezáltal bármi módon korlátoznánk az oltalmi kört.

Kapszula kompozíció

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények egyik formáját, a kapszulát úgy készítjük el, hogy betöltünk egy standard kétrészes kemény kapszulába 50 mg találmány szerinti antitestet vagy fragmenst, por formájában, 100 mg laktózt, 32 mg talkumot és 8 mg magnézium-sztearátot.

Injektálható parenterális kompozíció

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények injekciós beadásra alkalmas formáját úgy készítjük el, hogy

1,5 t% találmány szerinti antitestet vagy fragmensét összekeverünk 10 tf%-os vizes propilén-glikollal. A kapott oldatot szűréssel sterilizáljuk.

Kenőcs kompozíció

Összetétel: 1,0 g találmány szerinti antitest vagy fragmens és

100,0 g fehér lágy paraffin.

A találmány szerinti antitestet vagy fragmensét diszpergáljuk kis mennyiségű hordozóban, hogy egy sima, homogén terméket kapjuk. Ezután összehajtható fém tubusokat megtöltünk a diszperzióval.

Krém kompozíció (külsőleg)

Összetétel: 1,0 g találmány szerinti antitest vagy fragmens

20,0 g Polawax GP 200

2,0 g vízmentes lanolin

2,5 g fehér méhviasz

0,1 g hidroxi-benzoesav-metilészter

100,0 g desztillált víz

A pola-viaszt, méhviaszt és lanolint 60 °C-ra melegítjük. Hozzáadjuk a hidroxi-benzoesav-metilésztert és homogenizáljuk nagy fordulatszámú keverőben. Ezután a hőmérsékletet 50 °C-ra csökkentjük. A találmány szerinti antitestet vagy fragmenst hozzáadjuk és diszpergáljuk, majd hagyjuk a kompozíciót lehűlni lassú keverés közben.

Lotion kompozíció (külsőleg)

Összetétel: 1,0 g találmány szerinti antitest vagy fragmens

0,6 g monolaurinsav-szorbitát

0,6 g poliszorbát 20

1,2 g cetosztearil-alkohol

6,0 g glicerin

0,2 g hidroxi-benzoesav-metilészter kiegészítve tisztított B.P. vízzel 100 ml-re (B.P. =

British Pharmacopeia)

A hidroxi-benzoesav-metilésztert és glicerint feloldjuk 70 ml vízben 75 ’C-on. A monolaurinsav-szorbitátot, poliszorbátot és a cetosztearil-alkoholt felmelegítjük együtt 75 ’C-ra és hozzáadjuk a vizes oldathoz. A kapott emulziót homogenizáljuk, hagyjuk lehűlni folyamatos keverés közben és hozzáadjuk a találmány szerinti antitestet vagy fragmensét szuszpenzió formájában a maradék vízben. A teljes szuszpenziót keveréssel homogenizáljuk.

Szemcsepp kompozíció

Összetétel: 0,5 g találmány szerinti antitest vagy fragmens

0,01 g hidroxi-benzoesav-metilészter

0,04 g hidroxi-benzoesav-propilészter kiegészítve tisztított vízzel B.P. 100 ml-re A metil- és propil-észtert feloldjuk 70 ml vízben ’C-on és a kapott oldatot hagyjuk lehűlni. A találmány szerinti antitestet vagy fragmensét hozzáadjuk, az oldatot sterilizáljuk egy membrán szűrőn keresztüli szűréssel (0,022 gm pórusméret), és aszeptikusán betol tjük alkalmas steril tartályokba.

Kompozíció inhalálással történő beadásra

Egy 15-20 ml-es aeroszol tartály számára: 10 mg találmány szerinti antitestet vagy fragmenst 0,2-0,5% kenőanyaggal összekeverünk, mint pl. poliszorbát 85 vagy olajsav, és diszpergáljuk az így kapott keveréket egy hajtóanyagban, mint pl. freonban, előnyösen 1,2diklór-tetrafluor-etán és difluor-klór-metán elegyében, és betöltjük a megfelelő aeroszol tartályba, melyet vagy intranazális vagy orális inhalációhoz készítettünk.

Kompozíció inhalálással történő beadásra

Egy 15-20 ml-es aeroszol tartály számára feloldunk 10 mg találmány szerinti antitestet vagy fragmensét 68 ml etanolban, hozzáadunk 0,1-0,2% lubrikálószert, mint pl. poliszorbát 85 vagy olajsav, és egy hajtóanyagban diszpergáljuk, úgy mint freon, előnyösen 1,2-diklórtetrafluor-etán és difluor-klór-metán kombinációja, és betöltjük a fenti aeroszol tartályba, melyet intranazális vagy orális inhaláció számára készítettünk.

A találmány szerinti antitestek és farmakológiai kompozíciók felhasználhatók különösen parenterális, így pl. szubkután, intramuszkuláris vagy intravénás beadáshoz. A parenterális beadásra készült kompozíciók a találmány szerinti antitestnek vagy fragmensének egy oldatát vagy egy abból készült koktélt tartalmaznak, feloldva egy elfogadható hordozóban, előnyösen egy vizes hordozóban. A vizes hordozók széles körét alkalmazhatjuk, így pl. víz pufferolt víz, 0,4%-os konyhasó-oldat, 0,3%-os glicin és hasonlók. Ezeket az oldatokat jól-ismert sterilizálási technikákkal sterilizálhatjuk. A kompozíciók tartalmazhatnak elfogadható segédanyagokat is, melyek arra szolgálnak, hogy megközelítsük a fiziológiás feltételeket, így pH beállító és pufferoló szereket, stb. A találmány szerinti antitestek vagy fragmensek koncentrációja az ilyen gyógyászati készítményekben különböző és tág lehet, kevesebb, mint 0,5 t%-tól egészen 15-20 t%-ig, rendszerint legalább 1% körüli, és kiválasztjuk elsődlegesen a folyadék térfogata, viszkozitása, stb. alapján, tekintettel a beadás különleges módjára.

így, a találmány szerinti gyógyászati készítmény intramuszkuláris beadásához tartalmaz 1 ml steril pufferolt vizet és 50 mg találmány szerinti antitestet vagy fragmensét. Hasonlóképpen az intravénás infúzióra szánt

HU 211 881 A9 kompozíciót úgy állítjuk össze, hogy 250 ml steril Ringer-oldatot és 150 mg találmány szerinti antitestet vagy fragmenst tartalmazzon. A parenterálisan beadható kompozíciók elkészítésének aktuális módszerei jól ismertek, és részletesen le vannak írva például a következő helyen, melyet referenciaként beépítünk ezen bejelentésbe: Remington’s Pharmaceutical Sciensce, 15. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

A találmány szerinti antitesteket vagy ffagmenseiket liofilizálhatjuk tárolás céljából és újra felhasználhatjuk azokat egy alkalmas hordozóban. Ez a technika igen hatékonynak bizonyult a szokásos immunglobulinoknál és az ismert liofilizációt és rekonstitúciós technikákat alkalmazhatjuk.

A tervezett eredménytől függően, a találmány szerinti gyógyászati kompozíciókat beadhatjuk profilaktikus és/vagy terápiás kezelés céljából. Terápiás alkalmazás során, a kompozíciókat már egy betegségtől szenvedő betegnek adjuk be gyógyító mennyiségben vagy legalább a betegséget és annak szövődményeit részlegesen gátló mennyiségben. Profilaktikus alkalmazás során, az antitesteket vagy azoknak egy koktélját tartalmazó kompozíciókat olyan betegnek adjuk be, aki már nincs a betegség állapotában, hogy megnöveljük a betegség elleni rezisztenciát.

A gyógyászati kompozíciók egyszeri vagy többszörös beadását kivitelezhetjük dózis-szintekkel és -módokkal, melyeket a kezelő orvos választ ki. Minden esetben a találmány szerinti gyógyászati kompozícióknak a találmány szerinti módosított antitestek (vagy ezek fragmenseinek) olyan mennyiségét kell szolgáltatniuk, amely alkalmas a beteg hatékony kezelésére.

Itt kell azt is megjegyezni, hogy a találmány szerinti antitesteket felhasználhatjuk peptid vagy nem-peptid vegyületek (mimetikumok) jelölésére és szintézisére, amelyek felhasználhatók ugyanabban a terápiában, mint az antitestek (lásd pl. Saragovi et al.: Science 253, 792-795(1991/).

Az E.coli XI-1 Blue, Anti CD-4 az GCAEG-ban törzset az ATCC-nél letétbe helyeztünk ATCC 69030 deponálási számon. A letétbehelyezés 1992. július 9-én történt, és a törzset életképesnek találták 1992. július 13-án.

A leírásban szereplő szekvenciák listája (1) Általános információk:

(1) A szekvenciák száma: 16 (ii) Komputer adatok a leolvasáshoz:

(A) A médium típusa: 3,5” Diskette, 1,44 Mb storage (B) Komputer: IBM kompatibilis (C) Operatív rendszer: IBM PC. DOS (Version 5.0) (D) Szoftver: WordPerfect (Version 5.0) (2) Információk a SEQ ID NO:1 szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 17 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

CCATGGACTG GACCTGG 17 (3) Információk a SEQ ID NO:2 szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 20 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

ATGGACATAC TTTGTTCCAC 20 (4) Információk a SEQ ID NO:3 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 20 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

CCATGGAGTT TGGGCTGAGC 20 (5) Információk a SEQ ID NO:4 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 20 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

ATGAAACACC TGTGGTTCTT 20 (6) Információk a SEQ ID NO:5 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 20 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

ATGGGGTCAA CCGCCATCCT 20 (7) Információk a SEQ ID NO: 6 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 20 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

ATGTCTGTCT CCTTCCTCAT 20 (8) Információk a SEQ ID NO:7 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 16 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

TTGGGGCGGA TGCACT 16 (9) Információk a SEQ ID NO:8 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 17 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

GATGGGCCC TTGGTGGA 17 (10) Információk a SEQ ID NO:9 szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 21 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú

HU 211 881 A9 (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

GATGACCCAG TCTCCAGCCTC 21 K (11) Információk a SEQ ID NO: 10 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 21 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

CTCACTTGCT GCACAGGGTCC 21 Y VR M (12) Információk a SEQ ID NO:11 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 19 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

AAGACAGATG GTGCAGCCA 19 (13) Információk a SEQ ID NO: 12 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 20 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

GGAACAGAGT GACCGAGGGG 20 (14) Információk a SEQ ID NO: 13 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 31 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

ACTAAGTCGA CATGAAACAC CTGTGGTTGT T 31 (15) Információk a SEQ ID NO:14 szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 39 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

ATCACAGATC TCTCACCATG ACCTGCTCCC 20 CTCTCCTCC 3 9 (16) Információk a SEQ ID NO: 15 szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 423 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

GAC

ATG

AAA

CAC

CTG

TGG

TTC

TTC

CTC

CTC

CTG

GTG

GCA

GCC

CCC

AGA

48

TGG

GTC

TTG

TCC

CAG

GTG

CAG

CTG

CAG

GAG

GCG

GGC

CCA

GGA

CTG

GTG

96

AAG

CCT

TCG

GAG

ACC

CTG

TCC

CTC

ACC

TGC

AGT

GTC

TCT

GGT

GGC

TCC

144

ATC

AGC

GGT

GAC

TAT

TAT

TGG

TTC

TGG

ATC

CGC

CAG

TCC

CCA

GGG

AAG

192

GGA

CTG

GAG

TGG

ATC

GGC

TAC

ATC

TAT

GGC

AGT

GGT

GGG

GGC

ACC

AAT

240

TAC

AAT

CCC

TCC

CTC

AAC

AAT

CGA

GTC

TCC

ATT

TCA

ATA

GAC

ACG

TCC

288

AAG

AAC

CTC

TTC

TCC

CTG

AAA

CTG

AGG

TCT

GTG

ACC

GCC

GCG

GAC

ACG

336

GCC

GTC

TAT

TAC

TGT

GCG

AGT

AAT

ATA

TTG

AAA

TAT

CTT

CAC

TGG

TTA

384

TTA

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

GTC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

423

(17) Információk a SEQ ID NO:16 szekvenciáról: (i) A szekvencia jellemzői:

(A) hossza: 387 (B) típusa: nukleinsav (C) szála: egyszálú (D) topológiája: lineáris (ix) A szekvencia leírása:

ACC

ATG

GCC

TGG

GCT

CTG

CTG

CTC

CTC

GGC

CTC

CTT

GCT

CAC

TTT

ACA

48

GAC

TCT

GCG

GCC

TCC

TAT

GAG

TTG

AGT

CAG

CCT

CGC

TCA

GTG

TCC

GTG

96

TCC

CCA

GGA

CAG

ACG

GCC

GGG

TTC

ACC

TGT

GGG

GGA

GAC

AAC

GTT

GGA

144

AGG

AAA

AGT

GTA

CAG

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

CCG

CAG

GCC

CCT

GTG

192

CTG

GTC

ATC

TAT

GCT

GAC

AGC

GAA

CGG

CCC

TCA

GGG

ATC

CCT

GCG

CGA

240

TTC

TCT

GGC

TCC

AAC

TCA

GGG

AAC

ACC

GCC

ACC

CTG

ACC

ATC

AGC

GGG

288

GTC

GAG

GCC

GGG

GAT

GAG

GCT

GAC

TAT

TAC

TGT

ACG

GTG

TGG

GAC

AGT

336

ACT

GCT

GAT

CAT

TGG

GTC

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

CGG

CTG

ACC

GTC

CTA

384

GGT 387

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy rekombináns antitest, amely tartalmaz egy humán, egy csimpánz vagy egy első Old World majom immunglobulin régiót és egy második Old World majom immunglobulin variábilis régió antigén-kötő ré55 szét; ahol a nevezett első és második Old World majom azonos vagy különböző lehet.

   2. Egy rekombináns antitest, amely tartalmaz egy immunglobulin nehéz vagy könnyű láncot, mely specificitással bír egy különösen ismert antigénre, és rendelkezik

   HU 211 881 A9 egy konstans régióval, mely homológ egy humán, csimpánz vagy egy első Old World majom antitest megfelelő konstans régiójával, és tartalmaz egy keret régiót, mely homológ a megfelelő humán, csimpánz vagy második Old World majom keret régióval, és egy antigén-kötő részt, mely homológ egy harmadik Old World majom antigén-kötő részével; ahol a nevezett első, második és harmadik Old World majom azonos vagy különböző lehet.

   3. Egy rekombináns antitest, amely tartalmaz egy immunglobulin konstans régiót, mely nem immunogén az emberre.

   egy keret régiót, mely lényegében nem immunogén az emberre, és egy első Old World majom immunglobulin variábilis régió antigén-kötő részét.

   4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti antitest, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik egy humán antigénhez.

   5. A 3. igénypont szerinti antitest, ahol a nevezett konstans régió homológ egy humán, egy csimpánz vagy egy második Old World majom immunglobulin konstans régiójával, és ahol a nevezett első és második Old World majom azonos vagy különböző lehet.

   6. A 3. igénypont szerinti antitest, ahol a nevezett keret régió homológ egy humán, egy csimpánz vagy egy Old World majom keret régióval.

   7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti antitest, ahol a nevezett Old World majom egy Rhesus majom.

   8. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti antitest, ahol a nevezett Old World majom egy cynomolgus majom.

   9. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti antitest, ahol a nevezett Old World majom egy pávián.

   10. Egy rekombináns antitest, amely tartalmaz egy első Old World majom immunglobulin konstans régiót és egy második, az elsőtől különböző Old World majom immunglobulin variábilis régió antigén-kötő részét.

   11. A 10. igénypont szerinti antitest, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik egy humán antigénhez.

   12. Az 1-3., 5-6., 10-11. igénypontok bármelyike szerinti antitest, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik az alábbi humán antigének egyikéhez: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNF-béta, Tn antigén, IL-1, IL-8, humán T-sej receptor, CD3, CD28, CD8, CDI la, CDllb, CD18, CD5a, CDI le, CD45, új onkogén termék, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF és CD71.

   113. A 4. igénypont szerinti antitest, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik az alábbi humán antigének egyikéhez: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbéta, Tn antigén, IL-1, IL-8, humán T-sejt receptor, CD3, CD28, CD8, CD 11 a, CD 11 b, CD 11 c, CD 18, CD5a, CD45, új onkogén termék, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF és CD71.

   14. A 7. igénypont szerinti antitest, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik az alábbi humán antigének egyikéhez: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD23, CD25, CD4, CD19, CD20, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbéta, Tn antigén, IL-1, IL-8, humán T-sejt receptor, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD5a, CD45, új onkogén termék, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa, receptor, PDGF és CD71.

   15. A 8. igénypont szerinti antitest, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik az alábbi humán antigének egyikéhez: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD23, CD25, CD4, CD19, CD20, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbéta, Tn antigén, IL-1, IL-8, humán T-sejt receptor, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD18, CD5a, CD54, új onkogén termék, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF és CD71.

   16. A 9. igénypont szerinti antitest, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik az alábbi humán antigének egyikéhez: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbéta, Tn antigén, IL-1, IL-8, humán T-sejt receptor, CD3, CD28, CD8, CDlla, CDllb, CDllc, CD 18, CD5a, CD45, új onkogén termék, MDR1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF és CD71.

   17. A 10. igénypont szerinti antitest, ahol mindkét Old World majom a pávián, Rhesus és cynomolgus majmok csoportjából van kiválasztva.

   18. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti antitest, ahol a nevezett antigén-kötő rész egy Old World majom variábilis régió egy vagy több CDR-régióját tartalmazza.

   19. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti antitest, ahol a nevezett antigén-kötő rész egy Old World majom teljes variábilis régióját tartalmazza.

   20. Nukleinsav, mely egy rekombináns antitestet kódol, ahol az antitest egy első Old World majom immunglobulin antigén-kötő részét tartalmazza.

   21. A 20. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nevezett rekombináns antitest egy humán, egy csimpánz vagy egy második Old World majom konstans régiót tartalmaz, ahol az említett első és második Old World majom azonos vagy különböző lehet.

   22. A 21. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nevezett antitest egy harmadik Old World majom, egy humán vagy egy csimpánz antitest keretrégióját tartalmazza, ahol az említett első, második és harmadik Old World majom azonos vagy különböző lehet.

   23. A 20. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nevezett antigén-kötő rész az említett Old World majom antitest teljes variábilis régióját tartalmazza.

   24. A 23. igénypont szerinti nukleinsav, ahol a nevezett antigén-kötő rész azt említett első Old World majom variábilis régió egy vagy több CDR-régióját tartalmazza.

   25. A 21. vagy 22. igénypont szerinti nukleinsav, ahol az említett első, második és harmadik Old World amjom eltérő s a pávián, Rhesus és cynomolgus majmok csoportjából van kiválasztva.

   26. Egy monoklonális antitest, vagy egy Fab vagy

   HU 211 881 A9

   Fv vagy (Fab)₂ fragmense, melyet egy immortalizált Old World majom B-sejt termel.

   27. A 26. igénypont szerinti monoklonális antitest, ahol a nevezett B-sejt egy cynomolgus B-sejt.

   28. A 26. igénypont szerinti monoklonális antitest, ahol a nevezett B-sejt egy Rhesus B-sejt.

   29. A 26. igénypont szerinti monoklonális antitest, ahol a nevezett B-sejt egy pávián B-sejt.

   30. A 26-29. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitest, ahol a nevezett antitest egy humán antigén ellen termelődött.

   31. A 26-29. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitest, ahol a nevezett antitest egyikéhez kötődik: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD25, CD4, CD19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbéta, Tn antigén, IL-1, IL-8, humán T-sejt receptor, CD3, CD28, CD8, CDI la, CDllb, CDI le, C5a, CD45, új onkogén termék, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF és CD71.

   32. Eljárás egy Old World majom antitest gén variábilis régiójának izolálására, azzal jellemezve, hogy:

   összekapcsolunk egy Old World majomból származó nukleinsavat és a nukleinsav-szekvenciával komplementer prímért, amely a nevezett antitest gén 5’ vezető szekvenciáját kódolja, egy hibrid komplexet képezve; és amplifikáljuk a nevezett nukleinsavat az említett hibrid komplexben amplifikált nukleinsav termelésére.

   33. A 32. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett nukleinsav DNS vagy cDNS.

   34. A 32. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett primer komplementer a humán vagy Old World majom antitest gén 5’ vezető szekvencia nem kódoló szálával.

   35. A 32. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett amplifikálási lépés egy vektorba való behelyezésre alkalmas mennyiségű nukleinsavat eredményez.

   36. Eljárás egy Old World majom antitest gén variábilis régió izolálására, azzal jellemezve, hogy érintkezésbe hozunk egy Old World majomból származó RNS-t reverz transzkriptázzal cDNS-t képezve, érintkezésbe hozunk az említett cDNS-t egy, a cDNS-sel komplementer primerrel a nevezett antitest gén 5’ vezető szekvenciát kódoló helyénél, egy hibrid komplex keletkezése mellett, és amplifikáljuk a nevezett nukleinsavat az említett hibrid komplexben amplifikált nukleinsav termelésére.

   37. Eljárás egy rekombináns, humán antigén elleni antitest termelésére, ahol a nevezett antitest nem immunogén emberben, azzal jellemezve, hogy egy Old World majomban a nevezett antigén ellen Old World majomantitestet termelünk, izolálunk egy Old World majom nukleinsavat, mely a nevezett Old World majom antitest variábilis régiójának antigén-kötő részét kódolja, veszünk egy humán nukleinsavat, mely egy humán antitest humán konstans régióját kódolja,

   Iigáljuk az említett Old World majom nukleinsavat és a humán nukleinsavat rekombináns nukleinsav előállítására és expresszáljuk a kapott rekombináns nukleinsvat a nevezett rekombináns antitest termelésére.

   38. A 37. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett anitgén-kötő rész egy Old World majom variábilis régió egy vagy több CDR-régióját tartalmazza.

   39. A 37. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett antigén-kötő rész egy Old World majom teljes variábilis régióját tartalmazza.

   40. A 37. igénypont szerinti eljárkás, ahol az említett eljárás egy további lépésként a nevezett Old World majom antitest termelésére képes sejt immortalizációját foglalja magában.

   41. A 37. igénypont szerinti eljárás, mely további lépésként a nevezett Old World majom antitest variábilis régiját kódoló Old World majom nukleinsav azonosítását foglalja magában.

   42. A 40. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett immortalizálást hibridóma fúzióval végezzük.

   43. A 40. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett immortalizálást virális transzformációval végezzük.

   44. A 40. igénypont szerinti eljárás, ahol az emb'tett immortalizálást egyetlen B-sejt klónozással végezzük.

   45. A 40. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett immortalizálást könyvtár szerkezsztés által végezzük.

   46. A 37. igénypont szerinti eljárás, ahol a nevezett humán konstans régiót úgy választjuk ki, hogy az a kívánt izotípusú.

   47. A 37. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett eljárás továbbá magában foglalja a nevezett Old World majomból egy B-sejt szelektálását.

   48. A 47. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett B-sejtet perifériális vér limfocitákból, nyirokcsomóból, csontvelőből vagy lépből kapjuk.

   49. A 37. igénypont szerinti eljárás, amely továbbá a nevezett Old World majom sejtek antitestek termelésére való screenelését is magában foglalja.

   50. A 37. igénypontok szerinti eljárás, ahol az említett expresszálás egy termelő sejtvonalban történik.

   51. A 37. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett izolálás magában foglalja a nevezett variábilis régióból egy immunglobulin gén kiszabadítását.

   52. A 37—44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az antigén az alábbiak egyike: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD25, CD4, CDI9, CD20, CED23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbéta, Tn antigén, IL-1, IL8, humán T-sejt receptor, CD3, CD28, CD8, CD18, CDI la, CDllb, CDI le, C5a, CD45, új okogén termék, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF és CD71.

   53. Egy rekombináns antitest, amely tartalmazza (1) egy humán antitest nehéz láncának konstans régióját;
2. (2) az említett humán antitest könnyű láncának konstans régióját;
3. (3) egy humán antigén elleni Old World majom antitest nehéz láncának variábilis régióját; és (4) az említett Old World majomantitest könnyű láncának variábilis régióját.

   54. Rekombináns nukleinsav, amely tartalmaz a SEQ. ID NO: 15 vagy 16-ban megadott variábilis régióból legalább egy CDR-régiót.

   55. Gyógyászati kompozíció, amely az 1., 2., 3., 10.

   HU 211 881 A9 vagy 26. igénypontok bármelyike szerinti antitest terápiásán vagy profilaktikusan hatékony mennyiségét tartalmazza framakológiailag elfogadható vivőanyagban.

   56. Az 55. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, ahol a nevezett antitest specifikusan kötődik az 5 alábbi antigénekhez: CD58, VCAM, VLA4, CD2, LFA3, ELAM, LÁM, CD25, CD4, CD 19, CD20, CD23, CD41, CD44, CD54, TNFalfa, TNFbétak, Tn antigén, IL-1, IL-8, humán T-sejt receptor, CD3, CD28, CD8, CDI 8, CDI la, CDllb, CDI le, C5a, CD54, új onkogén termék, MDR-1, TGFalfa, TGFalfa receptor, PDGF vagy CD71.

   57. Az 1. igénypont szerinti rekombináns antitest, lényegében amint azt annak bármelyik példájával és/vagy a mellékelt ábrákkal kapcsolatban leírtuk.

   58. A 20. igénypont szerinti nukleinsav, lényegében amint azt annak bármelyik példájával és/vagy a mellékelt ábrákkal kapcsolatban leírtuk.

   59. A 26. igénypont szerinti monoklonális antitest, lényegében amint azt annak bármelyik példájával és/vagy a mellékelt ábrákkal kapcsolatban leírtuk.

   60. Eljárás az Old World majom antitest-gén variábilis régiójának izolálására, lényegében amint azt annak bármelyik példájával és/vagy a mellékelt ábrákkal kapcsolatban leírtuk.

   61. Eljárás humán antigénnel szembeni rekombináns antitest előállítására, lényegében amint azt annak bármelyik példájával és/vagy a mellékelt ábrákkal kapcsolatban leírtuk.

   62. Az 55. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció, lényegében amint azt annak bármelyik példájával és/vagy a mellékelt ábrákkal kapcsolatban leírtuk.