ES2199216T3 - Produccion de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION ESTA RELACIONADA CON LA PREPARACION DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES DE PRIMATES MEDIANTE TECNOLOGIA DE ADN; LAS TECNICAS DE MICRO-ARN PARA LA PRODUCCION DE LOS MISMOS; LOS ANTICUERPOS RECOMBINANTES DE PRIMATES NO HUMANOS; LAS FORMULACIONES QUE LOS CONTIENEN; EL USO DE TALES ANTICUERPOS EN LA PROFILAXIS Y EL TRATAMIENTO DE LOS HUMANOS Y LOS USOS DE DIAGNOSTICO DE TALES ANTICUERPOS.

Description

Producción de anticuerpos.

Esta invención se refiere a la producción de anticuerpos de primate recombinantes por tecnología de DNA, a su expresión en líneas de células eucariotas y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento terapéutico y profiláctico de seres humanos.

Los anticuerpos, o inmunoglobulinas, son moléculas bifuncionales proteináceas. Una región, que es muy variable entre diferentes anticuerpos, es responsable de la unión a un antígeno, por ejemplo, los muchos agentes infecciosos diferentes que puede encontrar el cuerpo, mientras que la segunda, la región constante es responsable de la unión a los receptores Fc de células y también activa el complemento, un sistema complejo de proteínas responsable de la lisis celular. De este modo, los anticuerpos representan un componente vital de la respuesta inmune de los mamíferos en la destrucción de microorganismos y virus exógenos.

Los anticuerpos se dividen en diferente clases en función de la estructura de la región constante. En seres humanos, por ejemplo, se pueden identificar cinco clases estructurales mayoritarias, inmunoglobulina G o IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Cada clase se diferencia en base a sus características físicas y biológicas que se relacionan con la función de la inmunoglobulina en sistema inmune. Las IgG pueden dividirse además en cuatro subclases: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, en base a las diferencias en la composición de aminoácidos de la cadena pesada y en los puentes disulfuro (véase más adelante la explicación), dando lugar a diferencias en el comportamiento biológico. En "Essential Immunology" de Ivan Roitt, Blackwell Scientific Publications se puede encontrar una descripción de las clases y subclases.

Una molécula de anticuerpo está formada por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que se mantienen juntas por puentes disulfuro entre cadenas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por enlaces disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido por una serie de dominios constantes, y cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en el otro extremo. El dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los demás dominios constantes de las cadenas pesadas están alineados entre sí. Los dominios constantes de las cadenas ligera y pesada no están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno.

Los dominios variables de cada pareja de cadenas ligera y pesada forman el sitio de unión al antígeno. Estos tienen la misma estructura general comprendiendo cada dominio un marco conservado de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas por tres regiones que determinan la complementariedad (CDR). Las cuatro regiones marco conservado adoptan en gran medida una conformación de lámina-beta y las CDR forman bucles de conexión y en algunos casos comprenden parte de la estructura de lámina-beta. Las CDR se mantienen muy próximas por las regiones marco conservado y, con las CDR de otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno.

Las cadenas de anticuerpo están codificadas por genes en tres loci separados en diferentes cromosomas. Un loci codifica los isotipos de la cadena pesada y tres son loci separados para las cadenas ligeras \kappa y \lambda, aunque sólo un linfocito B transcribe desde uno de estos loci de la cadena ligera. Los genes que codifican dominios variables de anticuerpo se generan durante la ontogenia de linfocitos B por un procedimiento de recombinación que implica la unión de las regiones génicas V, D y J. Un único linfocito B usará sólo una cadena pesada y un dominio variable recombinado de cadena ligera para asegurar que sólo él tiene una especificidad por el antígeno. De este modo, sólo un alelo de la cadena pesada y un alelo de la cadena ligera se expresan por un único linfocito B. Esto se conoce como exclusión alélica.

La exposición de un animal a un antígeno por infección o inmunización, tiene como resultado la producción de diferentes anticuerpos con diferentes especificidades y afinidades. Un antisuero obtenido del animal inmunizado será por tanto heterogéneo y contendrá un acúmulo de anticuerpos producidos por muchos clones de linfocitos diferentes. Los anticuerpos así obtenidos se denominan anticuerpos policlonales y esta naturaleza policlonal ha sido un inconveniente importante en el uso de anticuerpos en aplicaciones terapéuticas y en ensayos diagnósticos.

Una etapa importante de avance se produjo en 1975 cuando Kohler and Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) explicaron la fusión con éxito de células de bazo de ratones inmunizados con un antígeno con células de una línea de mieloma murino. Las células híbridas resultantes, denominadas hibridomas, tienen las propiedades de la producción de anticuerpos derivadas de las células de bazo y de crecimiento continuo derivado de las células de mieloma. Cada hibridoma sintetiza y secreta un único anticuerpo para un determinante particular del antígeno original. Para garantizar que todas las células en un cultivo son idénticas, es decir, que contienen la información genética requerida para la síntesis de una especie de anticuerpo características, los hibridomas resultantes de la fusión celular se clonan y subclonan. De este modo, los hibridomas clonados producen anticuerpos homogéneos de la especie animal original de la que se derivaban las células de bazo.

La capacidad para producir anticuerpos monoclonales ha revolucionado el diagnóstico de muchas enfermedades y proporcionado la posibilidad de prevenir y de inmunotratamiento de numerosos estados patológicos. Desafortunadamente, los anticuerpos exógenos, a saber, anticuerpos de especies no humanas, tales como un ratón o una rata, administrados repetidamente a un ser humano para su vacunación o tratamiento serán reconocidos por el sistema inmune del individuo y es posible que provoquen una respuesta antiglobulina indeseable. Esta respuesta anti-anticuerpo se debe al origen exógeno de los dominios constantes de las cuatro regiones marco conservado. El resultado de esta respuesta es posible que neutralice el anticuerpo terapéutico y desencadene reacciones anafilácticas o alérgicas perjudiciales. Además, los anticuerpos monoclonales no humanos no se fijan al complemento humano de forma particularmente buena y son menos propensos a desencadenar mecanismos no específicos de aclaramiento celular tales como la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), a la vista de las diferencias en la función efectora de la región constante de anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales no humanos son por tanto no tan eficaces como los anticuerpos humanos en aclarar células infectadas o enfermas. Por tanto, para que un anticuerpo terapéutico sea eficaz y permanezca en circulación sin desencadenar una respuesta anti-anticuerpos, éste debe ser capaz de escapar al reconocimiento por el sistema inmune del receptor.

Una solución a este problema es formar anticuerpos quiméricos como se describe en Morrison et al. (P.N.A.S., 1984, 81, 6851-6855); y Neuberger et al. (Nature, 1985, 314, 268-270), en la que se injerta con una región constante de anticuerpo humano la región variable de una especie exógena derivada de un hibridoma como se ha descrito antes. No obstante, en esta situación la región variable sigue siendo exógena al receptor; así, puede reconocerse y puede todavía constituir un problema de inmunogenicidad significativo. La humanización de un anticuerpo, como se describe en Jones et al, (Nature, 1986, 321, 522-525); y Riechmann et al, (Nature, 1988, 332, 323-327), en la que las CDR de un anticuerpo de especie exógena se injerta sobre un marco de anticuerpo humano, no alivia muchos de estos problemas. No obstante, el injerto con CDR de anticuerpos es un proceso complicado y el anticuerpo resultante puede requerir una modificación adicional para mantener su afinidad de unión. Por tanto, es evidente que para evitar el reconocimiento por el sistema inmune humano, la forma óptima de anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo que sea sustancialmente idéntico a un anticuerpo humano.

Informes anecdóticos han sugerido que simios (por ejemplo, chimpancés) y monos (por ejemplo, Cynomolgus, Rhesus, Aotus) que se usan corrientemente como animales de laboratorio, tienen respuestas inmunes suficientemente similares a la de los humanos para proporcionar buenos modelos de infección. También se ha sugerido que sus anticuerpos pueden ser suficientemente homólogos a los anticuerpos humanos para superar algunos de los problemas encontrados con, por ejemplo, anticuerpos de roedores. No hay ninguna evidencia publicada de esto y están disponibles pocas, si hay alguna, línea de células de primate no humana para ensayo. El procedimiento de obtención de tales anticuerpos es por tanto, sumamente problemático. Se han producido líneas de células a partir de linfocitos humanos pero tales líneas de células tienen poca estabilidad, no forman fácilmente híbridos que puedan ser más estables, y normalmente producen bajos rendimientos de anticuerpos cuando se cultivan in vitro. Las células de primate pueden incorporar ácidos nucleicos infecciosos exógenos, por ejemplo, de un virus, lo que plantea problemas de infección cruzada del ser humano a tratar. Se deben aplicar largos procedimientos de purificación y/o esterilización antes de que el anticuerpo producido de las mismas esté en una forma aceptable para administración a seres humanos.

La publicación de patente europea nº 314161 describe un procedimiento para la producción de inmunoglobulina humana en una célula hospedadora eucariota. La célula hospedadora se transfecta con los genes primero y segundo unidos de forma operativa, que codifican las regiones variable y constante de la cadena pesada humana, respectivamente. La célula hospedadora también se transfecta con genes unidos de forma operativa que codifican las regiones variable y constante de una cadena ligera humana. Esta célula transfectada se cultiva y se pueden recuperar del cultivo celular inmunoglobulinas humanas recombinantes, que tienen regiones variables de la especificidad de unión deseada. Sin embargo este procedimiento conlleva una serie de problemas: i) se requiere una gran cantidad de linfocitos para recuperar DNA genómico suficiente para llevar a cabo el procedimiento. La memoria descriptiva describe, la eliminación de 1-2 x 10^{8} linfocitos de los cuales 121 \mug de DNA genómico se recuperan; ii) los cuatro alelos (dos para la cadena pesada y dos para la cadena ligera) se recuperan en el DNA genómico y requieren una extensa secuenciación y selección por estudios de clonación, expresión y unión, para obtener el emparejamiento funcional de los genes (uno para la cadena pesada y uno para la cadena ligera) para el procesamiento posterior; iii) se consiguen bajos niveles de expresión de anticuerpo cultivando las células hospedadora transfectadas por el procedimiento descrito. La memoria descriptiva describe rendimientos de 6,7 - 34,5 \mug/ml que se promedian en 20 \mug/ml, y usando una construcción que incluye un potenciador de expresión citomegalovirus (CMV) de sólo 1 \mug/ml.

La publicación internacional WO91/04336 también describe un procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales humanos a través de la recuperación de DNA genómico.

Es bastante evidente que este procedimiento adolece de las mismas desventajas descritas antes para el documento EP 314161.

La llegada de la PCR ha permitido la generación de clones de cDNA a partir de mRNA derivados de menores números de células. Aunque la PCR sigue siendo una herramienta muy potente, los requisitos de conocer las secuencias de los extremos 5' y 3' de la secuencia de cDNA diana dificultan el uso de esta técnica para la generación de clones de cDNA a partir de mRNA que codifiquen proteínas con secuencias variadas, en especial productos secretados con diversas secuencias guía tales como la familia de anticuerpos humanos. Aunque se han descrito muchas secuencias de cadena pesada humana [Kabat E.A. et al., Secuences of Proteins of Immunological Interest, 4ª Edición, US Depot of Health and Human Services, US Govt. Printing Service, 1987] y los cebadores para PCR se diseñan a partir de secuencias de consenso de estos, no todas las regiones V humanas se pueden amplificar usando estos cebadores debido a que las bases 3' son incompatibles con el alargamiento por polimerasa Taq.

Larrick et al. Biotechnology, 7(9), 1989: 934-938 y Levy et al. Gene 54 (2-3) 1987: 167-173 describen el uso de cDNA para codificar sólo la región variable de anticuerpos pero no la región constante.

La presente invención proporciona por el contrario un nuevo procedimiento que implica tecnología de clonación de cDNA recombinante convencional para facilitar el rescate de los genes de anticuerpos de cadena pesada y ligera humanos completos (es decir, variable y constante) y su expresión en células eucariotas usando vectores de expresión eucariotas de alto nivel para la inmortalización de anticuerpos funcionales.

Por otro lado, los autores de la presente invención han podido demostrar que el cDNA clonado a partir de linfocitos de sangre periférica de primates no humanos y la cadena de anticuerpo producida a partir del mismo muestra de hecho suficiente homología con una secuencia de cadena de anticuerpos humana para proporcionar agentes terapéuticos potencialmente útiles. La invención incluye por tanto un procedimiento para el rescate de los genes de anticuerpos de cadena pesada y ligera de primate no humanas y su expresión como se ha descrito antes.

La invención proporciona por tanto un procedimiento para la producción de un anticuerpo de primate recombinante que comprende:

(i) seleccionar una línea de células derivada de linfocitos de primate que puede expresar un anticuerpo deseado;

(ii) aislar el RNA de la línea de células y separar el mRNA del resto de RNA aislado;

(iii) sintetizar el cDNA a partir del mRNA e insertar el cDNA en un vector de clonación;

(iv) transformar una célula hospedadora con el vector que contiene el cDNA para obtener una genoteca;

(v) rastrear en la genoteca el cDNA que codifica los genes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo;

(vi) insertar el cDNA que codifica los genes en un vector de expresión;

(vii) transfectar una célula hospedadora con el vector de expresión que contiene el cDNA; y

(viii) cultivar la célula hospedadora transfectada y aislar el anticuerpo deseado.

El término "primate" se adopta para prosimios (por ejemplo, Lemures), monos del nuevo mundo (por ejemplo, Aotus), monos del viejo mundo (por ejemplo, Cynomolgus), simios (por ejemplo, chimpancés) y seres humanos.

Las referencias a una línea de células derivada de linfocitos de primate se refieren a una línea de células derivada de un linfocito único de primate que producirá un único anticuerpo. La línea de células deberá ser suficientemente estable para permitir recuperar RNA y por ello preferiblemente se estabiliza o inmortaliza usando tecnología de transformación y/o hibridación viral convencional (como se describe en Methods of Hybridoma Transformation, Bartal and Hirsaut (eds.), Humana Press, Clifton, N.H. 1985). Tales líneas de células se pueden obtener de depositarios tales como la American Type Culture Collection of Rockville MD, Estados Unidos.

La línea de células se puede producir extrayendo linfocitos, a saber, células linfoblastoides o linfocitos B, de ganglios linfáticos de sangre periférica o del bazo, por ejemplo, de un individuo (humano o primate no humano) conocido por haberse recuperado de, o estar en remisión de un estado de enfermedad; de un individuo conocido por estar infectado con un organismo patógeno o sufrir cáncer o una enfermedad autoinmune pero que no manifiesta síntomas de enfermedad completa; de un individuo que se ha vacunado o inoculado con antígeno y ha desplegado una respuesta de anticuerpos; de individuos sanos seguido por rastreo de anticuerpos útiles. Ejemplos de estados de enfermedad incluyen una infección por un organismo patógeno (por ejemplo, virus o bacterias), en la que la extracción de linfocitos tiene lugar preferiblemente en los dos o tres meses después de la recuperación o durante la fase de alto título de anticuerpos, o un individuo que ha recibido vacunación contra un antígeno, por ejemplo, de un organismo patógeno, en el que la extracción de linfocitos tiene lugar preferiblemente en los dos a tres meses después de la inmunización. Individuos en los que se puede detectar un organismo patógeno tal como un virus pero que no progresa hasta un estado de enfermedad completo también pueden proporcionar una fuente extremadamente útil de células productoras de anticuerpos. Evidentemente, cuando se usan primates no humanos es posible inocular con un organismo patógeno en lugar de una forma atenuada del organismo que con frecuencia es la forma usada para la vacunación de seres humanos. La respuesta inmune a este organismo puede ser bastante mayor, proporcionando así una mejor fuente de células productoras de anticuerpo, que a partir del individuo vacunado.

También se puede producir una línea de células extrayendo linfocitos de un individuo que se sepa que padece un estado de enfermedad tal como cáncer o una enfermedad autoinmune y se puede demostrar que genera una respuesta de anticuerpos dirigida contra células tumorales o sus propios antígenos. Los linfocitos también se pueden obtener de un individuo que se identifique por mostrar una remisión espontánea de su cáncer a que haya sido vacunado con antígenos tumorales y ha desplegado una respuesta de anticuerpos. Una técnica alternativa para la identificación de linfocitos útiles implica rastrear cohortes de individuos conocidos por tener riesgo de desarrollar cáncer por la exposición a ciertos factores ambientales o por una predisposición genética por ejemplo, "familias con cáncer" que presenten una aparición mayor que la media de cáncer en la población. Estas cohortes pueden rastrearse en particular, para buscar individuos que no desarrollen cáncer como resultado de su capacidad para generar anticuerpos frente a antígenos tumorales. Puede ser posible también rastrear a individuos sanos para detectar anticuerpos antitumorales en base a una teoría de que las células cancerosas están presentes en todos los individuos, el sistema inmune es por lo general capaz de desplegar una respuesta, a saber, mediante la producción de anticuerpos, para eliminar las células mutadas antes de alcanzarse el estado canceroso. Si esto es así, se pueden obtener linfocitos útiles de cualquier individuo. Los linfocitos así identificados se pueden establecer entonces por transformación y/o fusión viral como se describe más adelante.

La transformación viral se lleva a cabo preferiblemente usando el Virus de Epstein Barr (EBV). Los linfocitos B de la sangre más periférica tienen un receptor para el EBV y cuando se infectan por el virus éstas células se transforman con la expresión implícita del antígeno del núcleo del EBV (EBNA). No obstante, sólo aproximadamente el 20% de las células se "inmortalizan" in vitro y estas son por lo general células B no activadas pequeñas. Las células plasmáticas (células B activadas) carecen del receptor de EBV por lo que la resistencia a la infección por EBV parece aumentar con la madurez reduciendo la eficacia de la transformación viral por esta ruta cuando los linfocitos recuperados son maduros.

Para la transformación viral usando EBV es por tanto preferible usar linfocitos de sangre periférica de células no plasmáticas. Para establecer una línea de células, el sobrenadante de una línea de células que produce el virus tal como B95.8 (Miller et al. 1972 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 383-387) contiene por lo general partículas de virus infecciosos suficientes. En la práctica, se suspenden sedimentos de hasta 10^{7} células en aproximadamente 1 ml de sobrenadante de cultivo viral y se incuban a 37ºC durante aproximadamente 1 hora. Esto permite la unión del virus a receptores específicos en células B y la penetración celular. Es preferible agitar el recipiente suavemente para evitar la sedimentación. Las células infectadas de este modo se pueden cultivar y se pueden clonar los genes del anticuerpo deseado.

Una alternativa o una etapa adicional a la transformación viral es fusionar con células de mieloma proporcionando la estabilización (Crawford, D. H., 1985, Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies Ed. E. G. Engelman, S.K.H. Foung, J. Larrick and A. Raubitschek, páginas 37-50 o Roder, J. C. et al., The Epstein-Barr virus-hybridoma technique ibid páginas 55-57). El mieloma es opcionalmente un heterohibridoma preferiblemente de origen de ratón/humano. Se puede generar un heterohibridoma adecuado por ejemplo, a partir de una línea de células que secreten el anticuerpo tal como HT01. Se pueden seleccionar células adecuadas en base a su sensibilidad a hipoxantina aminopterina y timidina sometiéndolas a pases secuenciales a través de medio que contiene 8-azaguanina puesto que éstas son sensibles a la aminopterina.

Con el fin de usar dicho heterohibridoma, los genes que codifican las cadenas pesada y ligera humana endógena se deben eliminar, en caso contrario, la línea de células final será capaz de producir más de un anticuerpo y no contendrá las cadenas pesada y ligera del único anticuerpo deseado. Esto se puede conseguir sometiendo las células a una dosis letal al 90% de irradiación ultravioleta y seleccionando las colonias adecuadas por tinción citoplásmica con Ig anti-humana y el número de cromosomas, a saber, poliploide con 60 a 140 cromosomas de ratón.

También resulta ventajoso seleccionar células que se desarrollen rápidamente. Esto se puede conseguir haciendo pases a través de la cavidad peritoneal de un ratón cebado con 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (o pristano).

A continuación, se lleva a cabo la selección final del crecimiento, cariotipo y capacidad de fusión, siendo la más importante la del cariotipo. El heterohibridoma ideal contiene fundamentalmente cromosomas de ratón.

La selección de una línea de células de linfocitos diana se puede llevar a cabo rastreando la producción de anticuerpo que tiene afinidad por el antígeno deseado y la funcionalidad del anticuerpo.

El ensayo de la afinidad se puede conseguir por técnicas de inmunoensayo por ejemplo, radioinmunoensayo o Ensayo Inmunoabsorbente con Enzimas Ligadas (ELISA). Las técnicas de inmunoensayo tales como éstas usan la interacción específica de anticuerpos, con antígenos para proporcionar información acerca de la especificidad antigénica. Los radioinmunoensayos determinan el nivel de anticuerpos, bien determinando la capacidad de los anticuerpos para complejarse con antígenos radiactivos o midiendo la cantidad de anticuerpos que se unen a una preparación de antígeno insoluble. La técnica ELISA implica conjugar enzimas con antígenos o anticuerpos. Las enzimas se seleccionan normalmente en base a una cinética sencilla y se pueden medir por un producto de reacción coloreado, por ejemplo, por espectrofotometría. Las enzimas preferidas incluyen fosfatasa alcalina, \beta-D-galactosidada y perosidaxa de rábano picante. El ELISA se puede emplear como ensayo de unión primaria o de unión competitiva. Por ejemplo, se pueden seleccionar linfocitos aislados de un individuo infectado por un virus cultivando el medio sobrenadante en una línea de células linfocíticas en presencia de un antígeno viral marcado de forma adecuada, posiblemente en forma de partículas virales completas o vacías. Los complejos de anticuerpo/antígeno se pueden identificar entonces como se ha descrito antes y seleccionarse la línea de células linfocítica respectiva para estudios posteriores.

El ensayo de la funcionalidad del anticuerpo en el caso de un agente infeccioso puede implicar estudios competitivos para la neutralización, por ejemplo, neutralización viral. Los estudios de neutralización se pueden llevar a cabo usando un Ensayo de Radioinmunoenfoque (RIFA) en el que se cultiva un concentrado fijo de anticuerpo purificado con igual volumen de diluciones a la décima parte de virus y luego se ensaya para determinar el título del virus. Un ensayo alternativo puede ser usar el complemento y ensayar la lisis celular.

Es posible obtener células que secreten IgG, IgG1, IgG2 o IgG3, IgM, IgA, IgD o IgE de primate humanas/no humanas. Estas se pueden seleccionar por difusión doble en agar de Ouchterlony o ELISA.

Después de la selección de una línea de células linfocíticas que exprese un anticuerpo funcional con una especificidad deseada, se puede aislar el RNA celular total usando técnicas recombinantes convencionales tales como el procedimiento de Chomczynsky and Sacchi (1987, Anal. Biochem. 162, 156-159). Con el fin de aislar el RNA mensajero específico (mRNA) que codifica el anticuerpo, también se emplean técnicas convencionales, por ejemplo, como se describe en Molecular Cloning: A Laboratory Manual de Maniatis et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

El DNA complementario (cDNA) se sintetiza entonces a partir del mRNA por técnicas recombinantes convencionales como por ejemplo las descritas en Molecular Cloning Manual anteriormente citado.

Es posible emplear de 1-3 x 10^{4} y 1-3 x 10^{7} linfocitos por aislamiento de RNA celular total, no obstante, la invención proporciona además un procedimiento para clonar genes de anticuerpos de longitud completa a partir de un número mucho menor de células que las requeridas a partir de anticuerpos inestables que producen hibridomas de células B transformadas con EBV de estabilidad desconocida. Este procedimiento es por tanto particularmente útil para rescatar anticuerpos de primate humanos o no humanos de líneas de células inestables, pero puede aplicarse para rescatar cualquiera de los genes de la cadena pesada y/o ligera de anticuerpo. Esto es posible por avances en la capacidad de reproductibilidad y por la calidad de las enzimas y sistemas de vectores disponibles comercialmente para la clonación de cDNA convencional y la introducción de técnicas de microaislamiento de RNA.

Este procedimiento mejorado se puede conseguir generando una genoteca de cDNA seleccionado por tamaños de tan sólo 100 células de hibridoma. Esta genoteca o una fracción de la misma pueden rastrearse entonces para detectar cadenas de inmunoglobulinas.

La invención proporciona entonces un procedimiento para clonar genes de anticuerpos de longitud completa que comprenden i) la micropreparación de RNA de aproximadamente 1000 células, ii) la generación de una genoteca de cDNA seleccionado por tamaños, iii) rastreo de la genoteca para determinar el cDNA que codifica las cadenas pesada y ligera y iv) aislamiento del cDNA que codifica las cadenas pesada y ligera.

La invención también proporciona un procedimiento para la producción de un anticuerpo recombinante que comprende:

i) micropreparación de RNA a partir de aproximadamente 1000 células;

ii) generación de una genoteca de cDNA seleccionado por tamaños;

iii) rastreo de la genoteca para determinar al cDNA que codifica las cadenas pesada y ligera y aislar el mismo;

iv) insertar el cDNA que codifica las cadenas pesada y ligera en un vector de expresión;

v) transfectar una célula hospedadora con el vector de expresión que contiene el cDNA; y

vi) cultivar la célula hospedadora transfectada y aislar el anticuerpo deseado.

La identificación de los clones de cDNA que codifican las proteínas de la cadena pesada y ligera de anticuerpo se puede conseguir clonando el cDNA en un vector replicable, por ejemplo, un plásmido, y transformando una células hospedadora, por ejemplo, una procariota tal como E. Coli. La genoteca resultante se puede rastrear entonces para determinar el cDNA de la cadena pesada y ligera de la siguiente forma.

El rastreo se puede llevar a cabo usando sondas de DNA de cadena pesada y ligera con marcadores detectables y un procedimiento de detección, por ejemplo, como se describe en Gene Cloning de D. M. Glover (Publicado por Chapman and Hall Ltd., Londres). Estas técnicas pueden implicar el radiomarcado y la detección por procedimientos radiográficos o marcadores no radiactivos, por ejemplo, digoxigenina 11 dUTP y un kit de detección, por ejemplo, kit de marcado y detección de DNA no radiactivos disponible de Boehringer Mannheim. Este procedimiento de rastreo también permite rastrear anticuerpos totalmente no clasificados para el isotipo usando sondas mixtas, por ejemplo, sondas de la cadena pesada \gamma, \mu y \alpha o sondas de la cadena ligera \kappa y \lambda humanas.

Los clones se pueden seleccionar y, si se desea, se puede determinar la secuencia de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo. También es posible introducir modificaciones en el cDNA de anticuerpo en esta etapa antes de preparar los vectores para la expresión; esto puede implicar modificación de un codón sencillo o de una región completa. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo cambios de clase o especie del isotipo del anticuerpo (es decir, para formar anticuerpos quiméricos). Esto se puede conseguir generando fusiones de las regiones V aisladas con el cDNA a partir del isotipo a elegir.

Una vez que se ha seleccionado la colonia de células adecuadas, se pueden subclonar las secuencias de cDNA de los genes de las cadenas pesada y ligera en vectores adecuados para la inserción en una célula hospedadora para la expresión. La construcción de los vectores de expresión se puede llevar a cabo conforme a procedimientos conocidos en la técnica (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Maniatis et al, Cold Spring Harbor).

La células hospedadora deben ser capaces de expresar el anticuerpo en una forma funcional y, por tanto, deberán ser células eucariotas tales como una célula de mamífero, por ejemplo, células de mieloma o de ovario de hámster chino (CHO) que sean capaces de llevar a cabo modificaciones después de la traducción, en particular, corregir el plegamiento de las cadenas, y glicosilación, que puede ser esencial para la funcionalidad eficaz de la región constante de un anticuerpo. Las células eucariotas se pueden cultivar in vitro con bastante éxito y se conocen por expresar anticuerpos funcionales. También pueden servir células de levaduras o insectos como células hospedadora ya que éstas también llevan a cabo las modificaciones deseadas después de la traducción.

El cDNA de las cadena pesada y ligera se puede transfectar en un vector sencillo como se describe en el documento WO87/04462 o transfectar conjuntamente en dos vectores como se describe a continuación. La referencia, antes y a continuación, a transfección de una línea de células hospedadoras con un vector de expresión, incluye en su significado la transfección conjunta de la célula hospedadora que emplea más de un vector, a no ser que sea evidente por el contexto que sólo se haga referencia a la transfección conjunta.

Los vectores para la transfección conjunta contienen preferiblemente marcadores de selección de forma independiente, las colonias resultantes pueden seleccionarse así para ambos marcadores. Las colonias que presentan el fenotipo dual son generalmente capaces de expresar conjuntamente tanto la cadena ligera como la pesada. Los marcadores de selección pueden o no ser de naturaleza dominante. Ejemplos de marcadores de selección incluyen adenosina desaminasa (Kaufman, et al., P.N.A.S., 1989, 83 3136-40), asparragina sintetasa (Cartier et al, Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 1623-28), gen trpB de E. Coli y gen hisD de Salmonella (Hartman et al, P.N.A.S., 1988, 85, 8407-51), reductasa ribonucleotídica de ratón M2 (Thelander et al, EMBO J, 1989, 8, 2475-79), gen de la resistencia humana a varios fármacos (Kane et al, Gene, 1989, 84, 439-446), glutamina sintetasa (Bebbington et al, DNA Cloning, Vol. III, 1987, Ed. D.M. Glover, 163-188, IRL Press), xantina guanina fosforribosil transferasa (gpt) (Mulligan et al, Science, 1980, 209, 1422-27), higromicina B (Santerre et al, Gene, 1984, 30, 147-156), gen de neomicina (Southern et al, J. Mol. Appl. Genet., 1982, 1, 327- 341) y dihidrofolato reductasa (Subramani et al, Mol. Cell. Biol., 1981, 1, 854-868).

Un marcador de selección preferido para usar con uno de los vectores es dhfr, que se emplea normalmente con una línea de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) del fenotipo dhfr (Urbaub, et al. P.N.A.S., 1980, 77, 4216-4220). Las células CHO transfectadas con éxito poseerán el fenotipo dhfr^{+} y pueden seleccionarse fácilmente cultivando las colonias en medios exentos de timidina e hipoxantina y que opcionalmente contienen metotrexato (MTX). Un marcador de selección preferido para usar con el resto de vectores es un marcador de resistencia dominante, tal como neomicina (neo). Las células CHO transfectadas con éxito con este marcador se pueden seleccionar fácilmente cultivando las colonias en medios que contienen el antibiótico Geneticina, un análogo de la neomicina.

Otro sistema de expresión para usar con células CHO o de mieloma es el sistema de amplificación de glutamina sintetasa (GS) descrito en el documento WO87/04462, cuyo procedimiento se incorpora en la presente memoria como referencia. Este sistema implica la transfección de una célula dependiente de la glutamina con un gen que codifica la enzima GS y los genes de la cadena pesada y ligera de anticuerpo deseado. Las células se seleccionan entonces y se desarrollan en medio exento de glutamina. Estos clones seleccionados se someten entonces a inhibición de la enzima GS usando metionina sulfoximina (Msx). Las células, con el fin de sobrevivir, amplificarán el gen GS con amplificación concomitante del gen que codifica el anticuerpo.

Como se ha descrito antes, un marcador de selección tal como GS también proporciona la base sobre la que se pueden amplificar los genes que codifican las cadenas ligera y pesada. En la transfección de una línea de células, los DNA vectoriales se integran con frecuencia en el cromosoma de la célula en el mismo locus. Así, el uso de un marcador de selección como base para la amplificación normalmente da como resultado un aumento paralelo en el número de copias de ambos genes. De igual modo, dhfr es un marcador de selección que permite la amplificación deseada a través del uso de concentraciones crecientes del inhibidor MTX.

Naturalmente, los marcadores de selección están bajo el control de elementos reguladores de DNA para proporcionar su expresión. Los elementos reguladores son preferiblemente de origen viral, tal como virus de tumores DNA. Son particularmente preferidos SV40 o promotor tardío principal adenovirus. Es particularmente ventajoso en este sentido retirar el elemento potenciador del promotor, "deformando" de forma eficaz el mismo. Esta modificación posibilita mayores niveles de amplificación génica en cada concentración de inhibidor que los que se producirían en otro caso si se usara un promotor fuerte. En el caso del uso de GS como marcador de selección, un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor de metalotioneína de ratón o preferiblemente el promotor de citomegalovirus humano (hCMV)-MIE descrito en la publicación de patente PCT número WO89/01036.

Los genes de cadena ligera y pesada de anticuerpo también están bajo control de elementos reguladores de DNA para proporcionar su expresión. El uso de los mismos elementos reguladores para ambas cadenas se prefiere porque su expresión está sustancialmente equilibrada. Los elementos reguladores pueden ser de origen viral y los ejemplos incluyen los citados antes en combinación con la expresión de dhfr o GS como marcador de selección. Otro ejemplo es el uso del promotor \beta-actina y la señal de poliadenilación análoga de \beta-actina.

Uno o ambos vectores pueden contener también un origen SV40 de replicación para permitir que las construcciones de vectores sean verificadas por un ensayo transitorio rápido, por ejemplo, en células COS.

La transfección conjunta de la línea de células con los vectores de expresión puede llevarse a cabo simplemente usando cantidades equimolares de ambos vectores y procedimientos convencionales de transfección, tales como precipitación en fosfato de calcio o lipofectina. La selección de la línea de células deseada transfectada conjuntamente se puede llevar a cabo conforme a procedimientos convencionales conocidos para los marcadores de selección particulares.

La invención incluye por tanto un vector adecuado para la transfección de una célula hospedadora que comprende cDNA que codifica las cadenas pesada y ligera de anticuerpo de primate.

La invención incluye además un procedimiento para la expresión de cDNA que codifica las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de primate que comprende transfectar una célula hospedadora eucariota con un vector o vectores adecuados para la expresión de dicho cDNA.

El cultivo de la línea de células se puede llevar a cabo en medios que contienen suero o preferiblemente exentos de suero. Resulta particularmente ventajoso durante la purificación el uso de medio exento de proteína. Cuando la línea de células es un transformante dhfr^{+} de CHO, el medio carece preferiblemente de hipoxantina y timidina y opcionalmente contiene MTX. Cuando se usa el sistema GS, resulta ventajoso emplear una línea de células dependiente de la glutamina y un medio exento de glutamina. La expresión de ambas cadenas en cantidades sustancialmente equimolares permite la obtención de rendimientos ópticos de anticuerpo funcional. Las dos cadenas se ensamblan en la célula y se secretan entonces en el medio de cultivo como anticuerpo funcional. El anticuerpo recombinante resultante se puede purificar y formular conforme a procedimientos convencionales.

Un aspecto de la presente invención incluye un anticuerpo de primate no humano recombinante, más particularmente un anticuerpo de chimpancé o de mono del viejo mundo recombinante, por ejemplo, anticuerpo de mono Cynomolgus recombinante.

La invención comprende además un anticuerpo de primate recombinante producido o que puede producirse por:

i) seleccionar una línea de células linfocíticas de primate que pueda expresar un anticuerpo deseado;

ii) aislar RNA de la línea de células y separar el mRNA del resto de RNA aislado;

iii) sinterizar cDNA a partir del mRNA e insertar el cDNA en un vector de clonación;

iv) transformar una célula hospedadora con el vector que contiene el cDNA para obtener una genoteca;

v) rastrear en la genoteca el cDNA que codifica el anticuerpo;

vi) insertar el cDNA que codifica el anticuerpo en un vector de expresión;

vii) transfectar una célula hospedadora con el vector de expresión que contiene el cDNA; y

viii) cultivar la célula hospedadora transfectada y aislar el anticuerpo deseado.

Cabe esperar que el uso de líneas de células eucariotas transfectadas con cDNA proporcione más de 50 \mug/ml de anticuerpo, preferiblemente, hasta o mas de 250 \mug/ml.

Un aspecto adicional de la invención comprende un anticuerpo de primate recombinante producido o que puede producirse por el procedimiento de cultivar una línea de células hospedadora eucariotas capaces de expresar cDNA que codifica las cadenas pesada y ligera de anticuerpo de primate.

El anticuerpo resultante se puede usar como terapia, conforme a su especificidad. Un ejemplo proporcionado más adelante es un anticuerpo humano anti-hepatitis A para usar en el tratamiento de infecciones por hepatitis A. Se pueden obtener otros anticuerpos antivirales que se dirigen a virus tales como otros virus de la hepatitis (por ejemplo, hepatitis B y C) o virus del herpes: virus del herpes simple, citomegalovirus, virus de Epstein Barr, virus de la varicela zoster. Se pueden obtener anticuerpos anti-VIH conforme a la invención. Estos anticuerpos se pueden usar para tratar SIDA, para prevenir o retrasar el inicio de SIDA en pacientes positivos a VIH o ARC, o profilácticamente en individuos que han entrado en contacto con el virus a través de, por ejemplo, lesiones por agujas. Otro uso es la prevención de la transmisión del virus de una madre seropositiva a su hijo durante el embarazo o durante la infancia. Esto puede implicar el tratamiento con el anticuerpo antes, durante y/o después del nacimiento.

También se pueden obtener anticuerpos que se dirigen a otros organismos patógenos tales como bacterias, protozoos y similares. Las células cancerosas son también posibles dianas para anticuerpos humanos. Opcionalmente, los anticuerpos se pueden usar como restos que se dirigen a diana que liberan compuestos químicos o biológicos. Estos se incorporan en la célula por endocitosis cuando son tóxicos o se metabolizan formando un agente tóxico, destruyendo la célula. Los anticuerpos de la invención pueden dirigirse a otros anti-autoantígenos tales como los presentes en enfermedades autoinmunes, por ejemplo, esclerosis múltiple o por ejemplo en trastornos inflamatorios tales como artritis. Los anticuerpos anti-Rhesus D no se pueden preparar en modelos animales - un anticuerpo humano por tanto será de gran valor como herramienta de diagnóstico en determinación del grupo sanguíneo y/o se podría emplear terapéuticamente. El anticuerpo anti-Rhesus D se puede administrar a una madre negativa a Rhesus en cualquier momento durante el embarazo o nacimiento para prevenir que genere anticuerpos contra el feto o durante posteriores embarazos. Otro aspecto de la invención incluye por tanto el uso de un anticuerpo humano recombinante en el tratamiento o profilaxis de la exposición de un individuo negativo a Rhesus al antígeno Rhesus D.

Los anticuerpos rescatados conforme a la invención se podrán emplear en procedimientos generales de diagnóstico.

A partir de la descripción será evidente que aunque la invención se refiere fundamentalmente al rescate de los genes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos completos, se pueden rescatar fragmentos tales como F(ab),

\hbox{F(ab) _{2} }

y FV, expresarlos y usarlos por separado. Tales fragmentos se incluyen en la definición de anticuerpo.

Por tanto, la presente invención proporciona el uso de anticuerpos de primate en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades y estados patológicos anteriormente citados. Así, la invención se extiende a procedimientos de profilaxis y/o tratamiento de una enfermedad y/o estado patológico en seres humanos como los descritos antes, que comprenden la administración a un ser humano de una cantidad eficaz de un anticuerpo de primate. Tales procedimientos incluyen, procedimientos de diagnóstico.

Las dosificaciones de los anticuerpos variarán con el estado patológico que se esté tratando y el receptor del tratamiento, aunque variarán en el intervalo de 1 a aproximadamente 100 mg para un paciente adulto, preferiblemente de 1 a 10 mg, normalmente administrados diariamente durante un período de 1 a 30 días. Puede ser preferible una pauta de administración en dos partes en la que se administren 1 a 5 mg durante 5 a 10 días, seguidos por 6 a 15 mg durante otros 5 a 10 días.

También se incluyen en la invención formulaciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo de primate recombinante. Tales formulaciones incluyen preferiblemente, además del anticuerpo, un diluyente o vehículo fisiológicamente aceptable, posiblemente mezclado con otros agentes tales como otros anticuerpos y/o un antibiótico. Vehículos adecuados incluyen aunque no quedan limitados a los mismos, solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato, glucosa y solución salina tamponada. Como alternativa, el anticuerpo puede liofilizarse (secarse por pulverización) y reconstituirse para usar cuando sea necesario, mediante la adición de una solución tamponada acuosa como las descritas antes. Las vías de administración son de forma rutinaria parenteral, incluyendo la infección o liberación intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.

Descripción de las figuras

Figura 1. Análisis cariotípico de células HT01 que presentan números modales poliploides de cromosomas de ratón y muchos cromosomas humanos.

Figura 2 y Figura 3. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducidas de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpo D, respectivamente. Se muestra la secuencia completa del inserto pH210H2. El péptido señal y las secuencias CDR están subrayadas y la señal de poliadenilación predicha está sobrerayada. Los aminoácidos están numerados conforme a Kabat et al, (1987).

Figura 4. Alineación de nucleótidos de las regiones variables de la cadena ligera de Cynomolgus con secuencias humanas, de conejo y de ratón. Se indican las CDR y los puntos indican identidad con la secuencia humana de Walker. Los codones están numerados conforme a Kabat et al.

Figura 5. Alineación de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera \kappa de Cynomolgus con secuencias humanas, de conejo y de ratón. Se indican las CDR y los puntos indican identidad con la secuencia humana de Walker. Los residuos aminoacídicos están numerados conforme a Kabat et al.

Figura 6. Alineación de nucleótidos de la región constante de la cadena ligera \kappa de Cynomolgus con secuencias humanas, de conejo y de ratón. Los puntos indican identidad con la secuencia línea germinal humana. Los codones están numerados conforme a Kabat et al. Una de las diez secuencias de mono poseía una G en la posición nucleotídica subrayada.

Figura 7. Alineación de aminoácidos de las regiones constantes de la cadena ligera \kappa de Cynomolgus con secuencias humanas, de conejo y de ratón. Los puntos indican identidad con la secuencia línea germinal humana. Los residuos aminoacídicos están numerados conforme a Kabat et al.

Ejemplos Producción de células quiméricas humanas/de ratón para hibridación Ejemplo 1 Rescate de anticuerpo humano anti-hepatitis A a) Producción de la línea de células HT01

Se extraen 50 ml de sangre de un donante humano sano, 7 días después de la inmunización de refuerzo con toxoide del tétano, y se mezclan con heparina exenta de conservante como anticoagulante. Las células mononucleares se separan en Ficol/Hypaque (Boyum A. 1986, Scand. J. Clin. Invest. 21, 77-89), se lavan en solución salina tamponada de Hanks y se fusionan con una línea de células de mieloma de ratón por técnicas convencionales como sigue:

Se recolectaron las células de mieloma de ratón NS-O (Galfre G. and Milstein C. (1982) Immunology, 45, 125-128) de un cultivo en fase logarítmica y se lavaron en solución salina de Hanks. Se mezclaron las células mononucleares (4,7x10^{7}) y las células NS-O (6x10^{7}) y centrifugaron en un tubo de ensayo de 50 ml. Se resuspendió a continuación el sedimento en 1 ml de solución de polietilenglicol al 50% y se mezcló suavemente durante 1 minuto a temperatura ambiente. Las células fusionadas se resuspendieron en medio RPMI con suero bovino fetal al 10% y se dispensaron gota a gota en 60 alícuotas de 1 ml de este medio de crecimiento en placas de 24 pocillos.

24 horas después se añadió a cada pocillo 1 ml de medio que contenía hipoxantina aminopterina y timidina (HAT) y 1x10^{6} células de bazo de ratón Balb/c. Se incubó la placa a 37ºC en CO_{2} al 5%.

20 días después de la fusión se rastrearon los sobrenadantes por radioinmunoensayo para detectar anticuerpos del toxoide antitetánico humano. Se identificó un pocillo que contenía una pequeña colonia de células (aproximadamente 20). Esta colonia crecía lentamente, una característica asociada con estabilidad prolongada de la secreción de anticuerpos debida a la mejor retención de cromosomas humanos.

Se transfectaron estas células a un pocillo limpio y después de tres semanas se clonaron por dilución limitante (DL). Todos los subclones ensayaron fueron positivos en el radioinmunoensayo (RIA).

Se denominó un clon PB47, 1.A1.B9.E10, HT01 y las células se congelaron. Estas células sintetizaban anticuerpo del toxoide antitetánico IgM humano.

El análisis cariotípico mostró que las células contenían un número modal poliploide de cromosomas de ratón y muchos cromosomas humanos (véase la Figura 1). Estas células se seleccionaron como material de partida para la producción de una pareja de fusión poliploide para la preparación de otros hibridomas.

La línea de células HT01, que secretaba anticuerpo anti-tétanos IgM humano se usó como material de partida para producir una pareja de fusión poliploide. Las células sensibles a HAT se seleccionaron sometiendo las células HT01 resistentes a aminopterina a pases secuenciales a través de medio que contenía 8-azaguanina, de 1 \mug a 20 \mug/ml.

Con el fin de estimular la pérdida de los genes de la cadena pesada y ligera de anticuerpo humano, se sometió una muestra de células a dosis letal al 90% de irradiación ultravioleta. Las células irradiadas se clonaron a dilución limitante y se seleccionaron una serie de colonias en base a la falta de tinción cioplásmica con Ig anti-humana y al tamaño del núcleo que se relaciona con el número de cromosomas. Se seleccionó un clon, HT10 después de que el análisis cariotípico del mismo mostró que era poliploide con 60 a 140 cromosomas de ratón.

La selección de células HT01.A de crecimiento vigoroso se consiguió por pases de una muestra a través de la cavidad peritoneal de un ratón cebado con Pristane (PRISTANE es 1,6,10,14-tetrametilpentadecano de Aldrich). Las células que sobrevivieron, se reprodujeron como colonias individuales en placas de microvaloración. Estas se cultivaron y valoraron para determinar el crecimiento, cariotipo y capacidad de fusión. Una, denominada, HT01.A.P1 se seleccionó finalmente en base a los números modales de 135 cromosomas de ratón y 3 humanos. Esta línea de células se usó como pareja de fusión con los linfocitos de sangre periférica del donante seropositivo del virus de la hepatitis A.

b) Extracción y estabilización de células que secretan anticuerpos

Se obtuvo una muestra de sangre (30 ml) de un donante seropositivo al virus de la hepatitis A (HAV), aproximadamente cuatro meses después de una infección por hepatitis A contraída de un alimento contaminado en el Reino Unido.

Se separaron los linfocitos de sangre periférica en un gradiente Lymphoprep (Flow Labs), se transformaron con Virus de Epstein Barr (EBV) y se cultivaron durante diez días en medio que contiene fetohemaglutinina y suero bovino fetal al 10%. Se fusionaron entonces con células quiméricas humanas/de ratón apropiadas como se ha descrito antes usando PEG 1500, y se cultivaron en presencia de HAT y ouabina 10^{-5}M en pocillos de 2 ml. Se rastrearon los medios sobrenadantes por ELISA tipo sándwich para determinar la actividad anti-HAV, diez días después de la fusión cuando las colonias características fueron visibles al microscopio. Se tomaron muestras de colonias individuales de los pocillos positivos y se establecieron líneas de células monoclonales a partir de estas clonando dos veces en células simples a dilución limitante. De los 42 pocillos originales de 2 ml, 17 fueron fuertemente positivos en los rastreos de ELISA iniciales después de una realimentación extensiva, pero se determinó que sólo cuatro de éstas líneas monoclonales secretaban con éxito. Las otras dejaron de secretar anticuerpo en diversos estados de aislamiento o clonación, incluyendo después de la doble clonación, presumiblemente debido a la inestabilidad intrínseca de los cromosomas de heterohíbridos.

c) Selección del hibridoma Estudios ELISA

Los cuatro anticuerpos (A, B, C y D) de las líneas de células descritas antes se valoraron en ELISA tipo Sándwich y Directo contra partículas de HAV llenas y vacías nativos. Los títulos, expresados como las diluciones recíprocas logarítmicas en base 10 que producían 50% de la meseta de absorbancia máxima, se presentan en la Tabla 1a. Estos valores, expresados como porcentajes de los títulos de anticuerpos individuales contra partículas nativas en el ensayo tipo Sándwich se dan en la Tabla 1b.

TABLA 1a Títulos ELISA de anticuerpos humanos contra partículas de HAV llenas y vacías naturales

Anticuerpo I.D.	Sándwich	Directo
	Llenas	Vacías	Llenas	Vacías
Anticuerpo A	4,42	4,42	3,77	3,35
Anticuerpo B	4,85	4,78	4,13	3,80
Anticuerpo C	3,91	3,72	4,02	3,59
Anticuerpo D	4,10	4,15	3,92	3,60

TABLA 1b Actividad ELISA de anticuerpos expresada como porcentaje del título del anticuerpo homólogo contra partículas llenas en el ensayo tipo sándwich

Anticuerpo I.D.	Sándwich	Directo
	Llenas	Vacías	Llenas	Vacías
Anticuerpo A	100	100	22	9
Anticuerpo B	100	85	19	9
Anticuerpo C	100	65	126	48
Anticuerpo D	100	112	66	32

d) Estudios de competición

Se determinó la capacidad de los anticuerpos para inhibirse entre sí y a anticuerpos murinos a partir de la unión a los virus usando técnicas de radioinmunoensayo en fase sólida (RIA) y ELISA, que sólo difieren en la etapa final. Los resultados, expresados en la Tabla 2, como la competición máxima (%) obtenidos entre las parejas de anticuerpos, muestran que;

I) Los anticuerpos A y B son indistinguibles y son similares al anticuerpo murino K24F2 (MacGregor A. et al. 1983, J. Clin. Microb., 18, página 1237).

II) El anticuerpo D tiene una naturaleza más próxima al anticuerpo murino B5B3, (Stapleton J. T. and Lemmon S.M. 1987, J. Virol., 61, página 491) y sólo interfiere con el anticuerpo A hasta un máximo de aproximadamente 30% en los ensayos recíprocos.

III) El anticuerpo C parece estar funcionalmente entre el anticuerpo A y el D.

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IV) Tanto el anticuerpo A como el anticuerpo D fueron individualmente capaces de inhibir la unión de sueros policlonales de HAV (Lemmon, S. M. et al, 1983, J. Clinical. Microb., 17, página 834, a saber Foxwell and Chulay) de forma muy eficaz.

Los valores de alta competición obtenidos con los Anticuerpos A y B contra B5B3 se obtuvieron con anticuerpo concentrado diez veces, mientras que los sobrenadantes del cultivo tisular produjeron sólo 20% de competición o menos. Por el contrario, los mismos sobrenadantes requerían dilución sustancial para obtener curvas de competición completas contra los anticuerpos K24F2 y K34C8 (MacGregor A. et al, 1983, J. Clin. Microb., 18, página 1237) como hizo el sobrenadante del Anticuerpo D contra B5B3.

TABLA 2 Máxima competición (%) de la unión del anticuerpo a la cepa de HAV 18F

4º Ab (Detección)	A	D	K34C8	K24F2	B5B3	Antisuero policlonal
3^{er} Ab (Competidor)						humano (Chulay)
Anticuerpo A	100	32	90	100	96^{1}	94
Anticuerpo B	100	33	78	100	>65^{1}
Anticuerpo C	66	55	46	72	91
Anticuerpo D	24	100	29	69	99	92
Anticuerpo A \textamp D, mezcla 1:1						99
K34C8	100	32	100
K23F2	100	70		100
B5B3	69	100			100
Antisuero policlonal						100
humano (NF)
(1) Anticuerpo concentrado requerido para la competición máxima

e) Estudios RIFA

Todos los anticuerpos detectados por el rastreo inicial ELISA fueron positivos en el ensayo de radioinmunoenfoque contra el virus 18f. (Daemer R. J., et al, (1981). Infec & Immunol., 32, página 388; y Stapleton J. T. and Lemmon S. M. (1987) J. Virol. Vol. 61, página 492; y Ping L. A. et al, 85, página 821). Las reducciones en los títulos de virus por RIFA obtenidas a partir de volúmenes iguales de una concentración fija (1 mg/ml) de anticuerpo purificado por afinidad con diluciones a la décima parte de las cepas víricas 18f y 43c (la cepa 43c derivó de la cepa 18f por pases a presión a partir de un anticuerpo monoclonal murino) y se resumen en la Tabla 3. Esto demuestra que el mutante 43c está muy poco neutralizado por el anticuerpo pero muestra una neutralización significativa aunque reducida con suero Foxwell policlonal.

Aunque ambos anticuerpos parecen "neutralizar" el virus 18f de forma bastante menos eficaz que el suero policlonal, esto se debe en gran medida a un número casi constante de placas residuales que sobreviven a cada dilución del virus y por consiguiente distorsionan el cálculo del título por Spearman-Karber. Sin embargo, la reacción con suero policlonal, eliminó toda la formación de placa. Las pendientes de reacción similares de los anticuerpos para sueros policlonales en estudios de competición y su reactividad global por ELISA, no dan indicación de que estos representen anticuerpos de baja afinidad.

TABLA 3 Reducción en el título log_{10} de unidades formadoras de placa/ml de aislados de HAV que reaccionan con anticuerpos específicos

	Anticuerpo
Cepa de HAV	A	D	Suero policlonal
	(1 mg/ml)	(1 mg/ml)	humano (1/10)
18f	3,15	2,72	>4,56
43c	0,68	0,78	1,93

f) Clonación y secuenciación de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo D contra el virus de la hepatitis A Procedimiento 1

Se aisló RNA total de 2,5x10^{7} células que expresan anticuerpo D siguiendo el procedimiento (1) de Chomczynsky and Sacchi (1987 Anal. Biochem., 162, 156-159) usando 1 ml de solución de extracción por 1x10^{7} células. El sedimento de RNA resultante se volvió a disolver en 50 \mul de agua destilada tratada con pirocarbonato de dietilo (DEPC), y se determinó de forma espectrofotométrica que tenía una concentración de 4,4 \mug/\mul. Se usó Dynabeads Oligo (dT)_{25} (Dynal Winal. UK) para extraer RNA poliadenilado de 75 \mug de RNA total empleando el protocolo del fabricante.

Procedimiento 2

Un procedimiento alternativo (2) para aislar RNA poliadenilado implicaba el aislamiento directamente de 10^{3} células que secretan anticuerpo D usando un sistema de aislamiento de mRNA Micro-FastTrack (Invitrogen, San Diego, USA), siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante.

Se investigó la capacidad para clonar genes de anticuerpo humano a partir de un número limitado de células. Se generó una genoteca de cDNA con RNA poliadenilado aislado de mil células de anticuerpo D secretoras usando el procedimiento 2 anterior. La genoteca se calculó que poseía un potencial de aproximadamente 2000 insertos de cDNA seleccionados por tamaño (>500 pb). La mitad de la genoteca se sembró y se rastreó para la cadena ligera \kappa y se detectaron 2 clones positivos. La secuenciación parcial confirmó que ambos clones poseían los genes de la cadena ligera de longitud completa, incorporando las secuencias del péptido señal. Aunque esta genoteca no se rastreó con la sonda de la cadena pesada, estaban presentes insertos de la cadena pesada de longitud completa como se calculó a partir de la frecuencia de positivos a la cadena pesada (2/500) obtenida a partir de la genoteca de cDNA inicial.

Se sintetizó el cDNA a partir de mRNA aislado y se clonó en el plásmido pSPORT-1 usando el sistema de plásmido SUPERSCRIPT para la síntesis de cDNA y el kit de clonación de plásmido (GIBCO/BRL Paislay, UK), siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante. Se transformaron células competentes DH5\alpha de MAXIMA EFICACIA de Escherichia coli (GIBCO/BRL) con el ligamiento de cDNA/pSPORT-1 resultante. Se suspendieron aproximadamente 4500 colonias sobre filtros de nailon Hybon-N (Amersham) y se lisaron, desnaturalizaron y fijaron siguiendo el procedimiento de Buluwela et al, (Nucleic Acids Res. 1989, 17, 452). Los filtros se trataron con proteinasa K (50 \mug/ml en 0,2xSSC, SDS al 0,1% a 55ºC durante 30 minutos) y luego se eliminó el exceso de restos con una tela de tisú. Las genotecas se rastrearon a continuación para las secuencias de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo usando sondas para las cadenas pesada y ligera.

La sonda de la cadena pesada fue un inserto de cDNA de anticuerpo IgG1 humano (CDR de la cadena pesada de anticuerpo CAMPATH-1 de rata [Campath es una marca comercial de The Wellcome Foundation Limited] reconfigurado en la cadena pesada de anticuerpo IgG1 NEW humano; Riechmann et al, 1988, Nature, 382, 323-327), qué se marcó con digoxigenina-11-dUTP usando el kit de marcado y detección de DNA no radiactivos (Boehringer Mannheim) y empleado para rastrear los filtros, que poseían aproximadamente 500 colonias elevadas, para la cadena pesada de anticuerpo D siguiendo el protocolo del fabricante. Se detectaron dos colonias positivas posibles y seleccionaron para el análisis posterior. Se preparó DNA plásmido usando el kit QIAGEN PLASMID (DIAGEN, DUSSELDORFT, ALEMANIA) o el procedimiento de Del Sal et al, (1988, Nucleics Acids Res., 16, 9878) y se encontró que ambos clones positivos potenciales contenían insertos del tamaño esperado del cDNA de la cadena pesada de inmunoglobulina humana. Se seleccionó un clon, pH21OH2, y se secuenció en ambas direcciones por cebado con plásmido siguiendo el procedimiento de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1977, 74, 5463, 5467), conforme al protocolo del kit Sequenase (United States Biochemicals, USB Cleveland, USA). Se determinó que la región C de la cadena pesada era \gamma1. La secuencia de la región variable se muestra en la Figura 2.

Las sondas de cadena ligera eran cDNA lambda humano (inserto humanizado de cadena ligera \lambda de mAb anti-CD3 [CDR de cadena ligera de mAb anti-CD3 de rata reconfiguradas a una cadena ligera \lambda de Ab Kern^{-}Oz^{-}]: E. Routledge, Eur. J. Immunol. 1991; 21: 2717) y (un inserto de cDNA de cadena L \kappa Campath-1H) (CDR de cadena ligera de mAb Campath 1 de rata reconfiguradas a la cadena ligera \kappa de Ab REI humano; Page and Sydenham, Biotechnology 1991; 9: 64), que se marcó con digoxigenina-11-dUTP utilizando el kit de marcado y detección no radiactivos de DNA (Boehringer Mannheim, Lewes, RU) y se empleó para examinar filtros, que poseían aproximadamente 4000 colonias elevadas, en busca de la cadena ligera de anticuerpo D siguiendo el protocolo del fabricante. Se detectaron veinte colonias positivas potenciales y se seleccionaron 10 para análisis adicionales. El DNA de plásmido se preparó utilizando el kit de plásmido de QIAGEN (DIAGEN, Dusseldorf, Alemania) o el procedimiento de Del Sal et al. (1988) y 8 insertos contenidos del tamaño esperado para el cDNA de cadena ligera de anticuerpo humano. Se seleccionó un clon, pH210L2, y se secuenció en ambas direcciones mediante cebado con plásmido siguiendo el procedimiento de terminación de cadena didesoxi (Sanger et al., 1977), según el protocolo del kit Sequenase (USB, Cleveland, EE.UU.). La cadena ligera se determinó que era una secuencia \lambda, cuya región variable se muestra en la Figura 3.

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g) Ensamblaje de construcciones de expresión Ejemplo g.i

El vector de expresión pRDN1 se adaptó a partir del plásmido pLD9 (descrito en Page, M. and Sydenham M.A. (1991), Biotechnology 9, 64-68) de la siguiente manera. El sitio HindIII utilizado para insertar el origen de replicación SV_{40} y el otro sitio HindIII 5' a la secuencia de codificación de DHFR se destruyeron por digestión con HindIII, se rellenaron con el fragmento Klenow de la DNA polimerasa y se religaron. Se digirió un clon que carecía de ambos sitios de restricción con EcoR_{1}, se rellenó con enzima Klenow y se religó. El plásmido resultante, que carecía de todos los sitios HindIII y EcoR_{1} internos, se utilizó para insertar el módulo de expresión de \beta-actina humana cadena abajo de la unidad de transcripción de DHFR. Este plásmido tiene un origen de replicación SV_{40} funcional, y pRDN1 tiene sitios de restricción HindIII y EcoR_{1} únicos cadena abajo del promotor de \beta-actina. El vector pRDN1 adaptado se digirió con EcoR_{1}, se hicieron los extremos romos con enzima Klenow y se desfosforiló utilizando fosfatasa intestinal bovina. Los insertos de cadena pesada y ligera de anticuerpo D se cortaron de sus respectivos clones, pH210H2 y pH210L2 utilizando HindIII y EcoR_{1}, y se hicieron los extremos romos con enzima Klenow. Los insertos con extremos romos se ligaron a pRDN1 y se utilizaron para transformar células competentes DH5 de eficacia máxima de Escherichia coli (Bethesda Research Labs BRL). Se llevaron a cabo preparaciones a pequeña escala de plásmido (Del Sal, G. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 9878) en una serie de las colonias resultantes, y los insertos se orientaron utilizando digestiones de restricción apropiadas. El DNA de plásmido se preparó a partir de un clon de cadena pesada y uno de cadena ligera (pRDHH9 y pRDHL27, respectivamente) utilizando columnas QIAGEN (marca comercial) siguiendo el protocolo del fabricante.

Transfección de células COS

Se sembraron 2 x 10^{5} células COS en D-MEM (más suero) en cada pocillo de un disco de cultivo de tejido de 12 pocillos. Después de 24 horas, las monocapas celulares se aclararon dos veces con medio exento de suero seguido de 0,5 ml de medio exento de suero que contenía 1 \mug de cada construcción de DNA (pRDHH9 y pRDHL27) y 5 \mug de TRANSFECTAM (Northumbria Biologicals Limited), como recomienda el fabricante. Después de incubación adicional durante 6 horas, se aspiró el medio de transfección y se reemplazó por 1 ml de D-MEM (más suero). Después de 48-72 horas, el medio se separó y se ensayó el anticuerpo humano.

Ensayo ELISA de anticuerpo humano

Se ensayó el medio de transfección de células COS en busca de la presencia de anticuerpo humano. En ausencia de síntesis de cadena ligera, las cadenas pesadas no se secretan de una célula y se degradan internamente (Hendershot, L., et al., Immunol. Today 8, 111-114). El anticuerpo puede ensayarse así mediante la detección de la cadena pesada en el medio de cultivo. Las placas de microvaloración se recubrieron con IgG anti-humana y se incubaron con el medio de cultivo. Se detectó anticuerpo mediante visualización con un conjugado de peroxidasa específico de cadena gamma anti-humana.

Ejemplo g.ii

Se clonó el DNA que codifica las cadenas H y L en los vectores de expresión pEE6hcMV (Stephens and Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110, 1989; Bebbington et al., Biotechnology 10, 169, 1992) y pEE12 (Rolfe, no publicado) respectivamente El plásmido pEE12 contiene un cDNA que codifica el gen de glutamina sintetasa de hámster (GS: un marcador que puede seleccionarse y amplificarse utilizando el análogo tóxico de glutamato, L-metioninasulfoximina [MSX]) bajo el control del promotor temprano SV40 y las señales de corte y empalme y poliadenilación SV40 obtenidas de pSv2.GS (Bebbington and Hentschel, "DNA cloning", volumen III, New York Academic Glover, DM ed., 1987). Cadena debajo de este módulo de selección está el potenciador, promotor y 5'UTR completo del gen temprano inmediato mayor (MIE) del citomegalovirus humano (hCMV), y éste se utiliza para conducir la expresión del gen de anticuerpo. Este módulo de expresión, con su origen de replicación y gen de \beta-lactamasa asociados, se obtuvo a partir de pEE6.HCMV (Stephens and Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110, 1989). Las células transfectadas con los vectores pEE6hCMV y pEE12 son por tanto capaces de crecimiento en medio glutamina menos. Los plásmidos pEE6hCMV y pEE12 se obtuvieron de Celltech Ltd., Sloug, Berkshire, SL1 4EN, RU.

Los plásmidos recombinantes (5 \mug de cada uno) se transfectaron en 5 x 10^{5} células COS-1 ó 10^{7} células de mieloma YO utilizando un reactivo Transfectam (Promega, Southampton, RU) en las condiciones recomendadas por el fabricante. Como resultado, la selección es sólo en el plásmido pEE12 y la expresión eficaz se basa en la cointegración de los dos plásmidos.

Las cadenas H y L se cotransfectaron en células COS para asegurar que las construcciones se insertaban correctamente en el marco, se transcribían y se traducían eficazmente, y que el anticuerpo humano resultante se secretaba apropiadamente. Habiendo confirmado la expresión transitoria del anticuerpo por ELISA, los plásmidos se cotransfectaron en células de mieloma YO.

Se mantuvieron células COS-1 madre (fuente ECACC, Porton Down, RU) en medio DMEM (Flow, Irvine, RU) suplementado con 10% de suero bovino fetal (APP, Dudley, RU). Las transfecciones de células COS se llevaron a cabo en medio DMEM (Flow, Irvine, RU).

Se mantuvieron células YO madre (fuente ECACC, Porton Down, RU) en medio completo que contenía medio DMEM (Flow, Irvine, RU; sin glutamina ni nitrato férrico, pero con piruvato de sodio [110 mg/ml]; GIBCO/BRL, Paisley, RU) 1 x aminoácidos no esenciales (Flow, Irvine, RU) y 10% de suero bovino fetal (APP, Dudley, RU). Las células transfectadas se transfirieron a placas de 96 pocillos a densidades de 3 x 10^{5}, 7,5 x 10^{4} y 1,5 x 10^{4} células/ml en 50 \mul de medio completo, y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. A continuación, se añadieron 100 \mul de medio de selección que contenía medio DMEM (Flow, Irvine, RU; sin glutamina ni nitrato férrico, pero con piruvato de sodio [110 mg/ml]: GIBCO/BRL, Paisley, RU) suplementado con glutamato (60 \mug/ml), asparragina (60 \mug/ml); Sigma, Poole, RU, 1 x aminoácidos no esenciales, adenosina, histidina, guanosina y uridina 7 mg/ml, timidina 2,4 mg/ml (Sigma, Poole, RU), 10% de suero bovino fetal dializado (APP, Dudley, RU) y MSX 4 \muM (para valorar la enzima glutamina sintetasa endógena de células YO) para seleccionar clones que hubieran integrado los plásmidos transfectados que contenían los genes de anticuerpo humano.

Se ensayaron el medio de crecimiento de células COS cuatro días después de la transfección y de células YO desarrolladas en medio para selección de la integración de plásmido mediante un ensayo ELISA sándwich, utilizando placas de microvaloración flexibles (Falcon, Becton-Dickinson, Plymouth, RU) recubiertas con IgG policlonal anti-humana (Sigma, Poole, RU) como anticuerpo de captura. Se añadió la muestra de ensayo, y se efectuó la detección con un conjugado de peroxidasa específico de cadena \gamma anti-humana (Sigma, Poole, RU) y ortofenilendiamina-HCl (Sigma, Poole, RU) como sustrato. Los clones positivos se transfirieron a placas de 24 pocillos para propagación adicional en medio de selección.

Se obtuvieron tres clones capaces de crecimiento en niveles de MSX tóxicos de células YO no transfectadas. Dos de estos secretaban anticuerpo humano, determinado por ensayo ELISA, mientras que la otra línea celular parecía ser un falso positivo.

Ejemplo 2 Determinación de las secuencias de cadena de anticuerpo de mono Cynomolgus a) Inmunodifusión Ouchterlony

Se efectuó un ensayo de inmunodifusión Ouchterlony utilizando suero de chimpancés Cynomolgus y monos Aotus para proporcionar una indicación de la similitud que podría existir entre las secuencias proteicas de las inmunoglobulinas humana y de primates.

Placas micro-Ouchterlony, suministradas por The Binding Site.

IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de oveja anti-humanas, The Binding Site.

IgM de cabra anti-humana e IgA de cabra anti-humana, Suministrada por Sigma.

Cadena ligera \kappa de Ig de oveja anti-humana, Serotec.

Cadena ligera \lambda de Ig de oveja anti-humana, Serotec.

Se ensayó en sueros de monos Cynomolgus (del Viejo Mundo), Aotus (del Nuevo Mundo) y chimpancés (simios) la reacción frente a una serie de inmunoglobulinas anti-humanas. El anticuerpo de oveja anti-humano no diluido (10 \mul) se dispuso en el pocillo central de una placa Ouchterlony, y los sueros del primate (10 \mul) se dispusieron en los pocillos exteriores circundantes. Todos los sueros se diluyeron en PBS según las recomendaciones del fabricante. Se incluyeron en el ensayo los sueros de conejo y ratón así como suero humano, que actuó como control positivo. La placa se incubó a temperatura ambiente en condiciones húmedas durante una noche o hasta que pudieron visualizarse bandas de precipitina.

Se formaron bandas de precipitina entre suero de chimpancé y todas las subclases anti-humanas. Algunas, pero no todas, las clases de Ig humana, a saber IgG1, IgM, IgA y las cadenas ligeras \kappa y \lambda formaron bandas de precipitina con suero de mono Cynomolgus. El suero de mono Aotus (un mono del Nuevo Mundo) se reconoció por los anticuerpos menos humanos, la única reacción fuerte se observó con las cadenas ligeras \kappa y \lambda. Sorprendentemente, el suero de conejo reaccionó con la cadena ligera \lambda anti-humana, esto sugiere que puede haber un epítopo compartido entre las secuencias proteicas de Ig de conejo y humana para que ocurra reconocimiento. El suero de ratón no reconoció ninguna clase de Ig humana en absoluto.

Este ensayo proporcionó los resultados esperados considerando la relación evolutiva de cada especie con el hombre, es decir los monos del Nuevo Mundo divergieron antes que los monos del Viejo Mundo, que muestran una mayor homología proteica con los seres humanos. Para investigar el grado de homología de nucleótidos entre los genes de Ig de primates y humanos, se eligieron los genes de cadena ligera \kappa de monos Cynomolgus del Viejo Mundo para este estudio.

b) Se preparó el RNA total de monos Cynomolgus a partir de 10 ml de linfocitos de sangre periférica utilizando el procedimiento de extracción REF con tiocianato de guanidio.

Se sintetizó la primera cadena de cDNA a partir del RNA total utilizando el sistema BRL SUPERSCRIPT (BRL). Se añadió el RNA total (5 \mug) en un volumen de 13 \mul a 1 \mul de cebador oligo-T y se permitió reasociar calentando a 70ºC durante 10 minutos, seguido de enfriamiento en hielo.

La primera cadena de cDNA se transcribió inversamente mediante la adición de 2 \mul de tampón de reacción, 1 \mul de dNTPS, 2 \mul de DTT y 1 \mul de transcriptasa inversa. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, seguido de 50 minutos a 42ºC. La reacción se detuvo calentando a 90ºC durante 5 minutos y disponiéndola después en hielo durante 10 minutos. El molde de mRNA se digirió con 1 \mul de RNAasa H durante 20 minutos a 37ºC.

c) Amplificación por PCR de la primera cadena de cDNA Cebadores de PCR

151 Homólogo del extremo 5' (FR1) de V\kappa1 humana

5' GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA SEC Nº ID 1

301 Homólogo del extremo 3' de C\kappa humana (contiene el sitio de restricción Hind III)

5' GATCAAGCTTCTAACACTCTCCCC SEC Nº ID 2

Estos cebadores y todos los cebadores de PCR y secuenciación posteriores citados se sintetizaron en un sintetizador de oligodesoxinucleótidos y se utilizaron a una concentración de 200 ng/\mul.

La primera cadena de cDNA se amplificó directamente por PCR, sin necesidad de síntesis de la segunda cadena, utilizando los cebadores 151 y 301. El primero es específico del extremo 5' de la región variable (FR1) de la cadena ligera \kappa humana, y el segundo es específico del extremo 3' de la región constante de la cadena ligera \kappa humana.

La cadena ligera se amplificó en la siguiente reacción: la mezcla de reacción de la primera cadena completa de cDNA se añadió a 21 \mul de H_{2}O d, 8 \mul de tampón de síntesis [(Boehringer)], 4 \mul de cebador 301, 4 \mul de cebador 151 y 0,5 \mul de polimerasa Taq. Esta mezcla se recubrió con aceite mineral y se sometió a 20 ciclos de PCR utilizando el programa citado anteriormente. La reacción se comprobó en un gel de agarosa al 1% como anteriormente.

d) Clonación de cadenas ligeras \kappa de Cynomolgus

Cebador PCR 260 homólogo con el extremo 5' de V\kappa humana (contiene el sitio de restricción de Hind III).

5' GATCAAGCTTGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA SEC Nº ID 3

i. Introducción de sitios Hind III en cada extremo del fragmento de cadena ligera

Se clonó el cDNA de cadena ligera \kappa de mono Cynomolgus obtenida a partir de la PCR anterior en el sitio Hind III de pUC18, Maniatis et al., "Molecular Cloning" (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). La cadena ligera amplificada contiene un sitio Hind III en el extremo 3' de la región constante debido a la secuencia del cebador 301, pero carece de dicho sitio de restricción en el extremo 5'. Por lo tanto, para posibilitar que la cadena ligera se clone directamente en pUC18, se introdujo un sitio Hind III en el extremo 5' de la región variable mediante una segunda PCR utilizando los cebadores 260 y 301. El primero tiene una secuencia idéntica al cebador 151, pero con un sitio Hind III añadido en el extremo 5'.

La reacción se estableció como se describe antes utilizando 1 \mul de cDNA de Cynomolgus (a partir de la mezcla de PCR) en un volumen final de 100 \mul. El DNA se amplificó mediante 20 ciclos de PCR, después se comprobó en un gel de agarosa al 1%. El gel mostró muchas otras bandas distintas a las esperadas para la cadena ligera amplificada. Es posible que algunas de las bandas pequeñas pudieran ser debidas a los cebadores reasociados entre sí, formando los denominados dímeros de cebadores.

ii) Purificación del producto de PCR

Se purificó la cadena ligera a partir de la mezcla de PCR antes de clonar en pUC18 de la siguiente manera: la reacción PCR se congeló a -20ºC, y el aceite mineral líquido se separó por aspiración. Se extrajo después el DNA dos veces con fenol/cloroformo, seguido de una sola extracción sólo con cloroformo. La solución se ajustó a EDTA 5 mM, Tris 10 mM, pH 8, y se añadieron 0,5% de SDS y proteinasa K 50 \mug/ml. La reacción se incubó a 37ºC durante 30 minutos, después a 68ºC durante 10 minutos. Se realizó una segunda extracción con fenol/cloroformo. El DNA se precipitó mediante la adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto (se añadió 1 \mul de sulfato de dextrano como vehículo). El DNA se dispuso a -20ºC durante 30 minutos, después se sedimentó en una centrífuga Eppendorf. El sedimento se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 17 \mul de agua. Este proceso de purificación supera el problema de que la polimerasa Taq permanezca unida al DNA e inhiba así la actividad de la enzima de restricción.

iii) Preparación del fragmento Hind III para clonación

Se digirió después el DNA de cadena ligera con la enzima de restricción Hind III para clonar en el sitio Hind III de pUC18. Se añadieron a 17 \mul de DNA de cadena ligera, 2 \mul de tampón B y 1 \mul de Hind III de alta concentración, y se incubó a 37ºC durante 1 hora. La digestión se separó en un gel de agarosa al 1% y la banda correspondiente a la cadena ligera se extrajo del gel. El DNA se purificó de la agarosa utilizando un kit de purificación "Prep-a-gene" (Biorad Ltd) siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

e) Ligamiento de la cadena ligera de Cynomolgus A pUC18

Se clonó el fragmento de Hind III purificado en el sitio Hind III de pUC18 utilizando el siguiente procedimiento: se añadieron 20 \mul de DNA de Cynomolgus (de un volumen de 80 \mul) a 1 \mul de pUC18 digerido con Hind III (50 \mug/\mul, Pharmacia), 3 \mul de tampón de ligasa (Boehringer), 3 \mul de DNA ligasa T4 (Boehringer) y 3 \mul de agua destilada. La reacción se incubó a 15ºC durante 3 horas.

f) Transformación de células competentes DH5 por la cadena \kappa de pUC18

Se transformaron células de eficacia máxima DH5á de E. Coli (BRL) con el plásmido de cadena ligera. Se descongelaron lentamente 100 \mul de células a partir de -70ºC, se mezclaron suavemente con 5 \mul de reacción de ligamiento y se mantuvieron en hielo durante 30 minutos. Las células se incubaron a 42ºC durante 45 segundos, después se enfriaron en hielo durante 2 minutos. Se añadió 1 ml de medio SOC (20 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levadura,

\hbox{  0,5 g}

de NaCl, 10 ml de KCl 250 mM, 5 ml de MgCl_{2} 2 M, glucosa 20 mM por litro) y se incubó a 37ºC durante 1 hora. La reacción de transformación se sembró en cinco placas LB (placas de agar LB: 12 g de triptona, 24 g de extracto de levadura, 4 ml de glicerol, 100 ml de tampón fosfato, 15 g de bacto-agar por litro) que contenían ampicilina

\hbox{100  \mu g/ml}

, y se incubó durante una noche a 37ºC. Se contó el número de colonias por placa y se calculó la eficacia de la transformación.

Se recogieron cinco colonias de las placas y se comprobó por PCR la presencia de insertos de cadena ligera. Cada colonia se resuspendió en 65,5 \mul de agua destilada y se sometió a 20 ciclos de PCR utilizando los cebadores 260 y 301 en la mezcla de reacción estándar. Las reacciones PCR se corrieron en gel como antes. Se encontró que cuatro de cinco colonias contenían el inserto que indicaba que la clonación había tenido éxito.

g) Minipreparaciones de plásmido de la cadena \kappa de pUC18

Se recogieron 20 colonias de las cinco placas de transformación y se inocularon en volúmenes de 2 ml de caldo L (caldo L, como en las placas LB pero sin agar) que contenían ampicilina 100 \mug/ml. Los cultivos se incubaron a 37ºC durante una noche con agitación. Se centrifugaron 1,5 ml de cada cultivo y se resuspendió el sedimento celular en 200 \mul de STET, NaCl 0,1 M, Tris HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, 5% de Triton-X-100 con lisozima 1 mg/ml. Los tubos se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente, después hirvieron durante 45 segundos y se centrifugaron durante 10 minutos. El sedimento resultante se eliminó con un mondadientes estéril y se añadieron 8 \mul de CTAB al 8% al sobrenadante. El tubo se centrifugó durante 5 minutos para sedimentar el plásmido.

El DNA se resuspendió a continuación en 300 \mul de cloruro de sodio 1,2 M mediante mezclado con vórtex. El DNA se precipitó mediante la adición de 750 \mul de etanol, se secó a vacío y se resuspendió en 20 \mul de tampón TE (TE- Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM).

Se comprobó en las minipreparaciones la presencia de la cadena ligera mediante digestión con enzimas de restricción (enzima de restricción Hind III y tampón B 10 u/\mul, Boehringer). Se añadieron 2 \mul de cada DNA a 0,5 \mul de tampón B, 1 \mul de agua destilada, 1 \mul de RNAasa A (500 \mug/ml, Boehringer) y 0,5 \mul de Hind III. Las digestiones se incubaron a 37ºC durante 1,5 horas, después se corrieron en un gel al 1%. La presencia de cadena ligera se indicó por un fragmento de aproximadamente 700 pares de bases.

h) Secuenciación de las cadenas ligeras \kappa Cebadores de secuenciación Cebador inverso M13, se reasocia a la cadena -ve de pUC18 cadena abajo del sitio de policlonación- suministrado por Pharmacia:

5' AACAGCTATGACCATG SEC Nº ID 4

Cebador de codificación –40, se reasocia a la cadena +ve de pUC18 cadena abajo del sitio de policlonación, suministrado por USB

5' GTTTTCCCAGTCACGAC SEC Nº ID 5

299, cebador de la región C\kappa humana

5' GCGTCAGGGTGCTGCTGAGG SEC Nº ID 6

106, cebador de la región C\kappa humana (extremo 5')

5' GGCGGGAAGATGAAGACAGA SEC Nº ID 7

151 y 260, véanse las etapas C y D

261 Cebador de la región C\kappa humana

5' TTCAGCAGGCACACAACAGA SEC Nº ID 8

i) Se eligieron diez clones de la etapa anterior para secuenciación (clones 1, 2, 4, 5, 9, 12, 14, 15, 18 y 20) mediante el procedimiento de terminación de cadena didesoxi. Los 18 \mul restantes de DNA de minipreparación se añadieron a 2 \mul de NaOH (2 M) y se calentaron a 68ºC durante 20 minutos para desnaturalizar el DNA. El DNA se enfrió y se precipitó mediante la adición de 8 \mul de acetato de amonio 5 M (pH 5,4) y 100 \mul de etanol en hielo seco durante 5 minutos. El DNA se sedimentó, se lavó con etanol al 70%, se secó a vacío y se resuspendió en 20 \mul de agua destilada.

Se añadió una alícuota de DNA (7 \mul) a 2 \mul de tampón de reacción y 1 \mul del cebador apropiado y se incubó a 65ºC durante 2 minutos, después se enfrió lentamente por debajo de 30ºC para reasociar cebador y molde. Fue necesario utilizar diversos cebadores diferentes para secuenciar las cadenas ligeras \kappa enteras, cuyos detalles se indican anteriormente. Se añadió al molde/cebador lo siguiente: 1 \mul de DTT (0,1 M, USB), 2 \mul de mezcla de marcado (5 x, USB), 0,5 \mul de ^{35}S-dATP (10 \muCi/\mul, Amersham) y 2 \mul de enzima Sequenase. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos para sintetizar la secuencia guía marcada con ^{35}S. Cuando se completó la reacción de marcado, se añadieron 3,5 \mul de mezcla de marcado a cuatro pocillos de una placa multipocillo que contenía 2,5 \mul de ddGTP, ddATP, ddTTP y ddCTP. Se dejó que la reacción de terminación de cadena transcurriera durante 5 minutos a 37ºC, antes de añadir 4 \mul de solución de paro a cada pocillo. Las reacciones se almacenaron en hielo hasta que fueron necesarias.

Se vertió un gel de acilamida al 8% (gel acilamida ultrapuro mix-8 suministrado por BRL) entre placas de vidrio siliconizado y se hizo correr previamente a 40 mA durante 1 hora utilizando TBE (borato de TMS 0,09 M, pH 8, EDTA 0,002 M) como tampón de desarrollo. Los pocillos se lavaron con tampón antes y después de correr para eliminar las burbujas de aire y la urea. Antes de cargar el gel, las muestras se calentaron a 95ºC durante 2 minutos, después se cargaron 4 \mul de cada muestra en el gel. Las muestras se corrieron a 40 mA durante 1,5 horas, después se aplicó una segunda carga al gel y se corrió durante otras 1,5 horas. Esto proporcionó un desarrollo corto y largo para cada conjunto de muestras. Las placas se desensamblaron y el gel se dispuso en 10% de ácido acético/10% de metanol antes de transferir el gel a una lámina de papel 3MM. El gel se secó a 80ºC durante 1,5 horas y se expuso a una película de rayos X durante una noche a temperatura ambiente. Las autorradioagrafías se revelaron y la secuencia se leyó de abajo a arriba, con los desarrollos largo y corto superponiéndose.

j) Comparación de los datos de secuencia

Se obtuvieron las secuencias de la cadena ligera completa realizando una serie de reacciones de secuenciamiento usando diferentes cebadores. Las comparaciones de los datos de secuencia se muestran en las Figura 4 a 7. Se encontró que los clones 14 y 5 contenían secuencias de cadena ligera truncadas. Esta situación es más probable que sea causada por la transcripción inversa de mRNA o la amplificación por PCR del cDNA. Puede ser posible que el mRNA o cDNA formen una estructura secundaria a través de la cual la enzima apropiada no se pudiera leer, dando lugar así a una secuencia parcial. Se eligió el clon 15 para comparar después con secuencias de cadena ligera conocidas con el fin de confirmar su identidad y las cadenas ligeras humana, de conejo y ratón para determinar la homología de nucleótidos y aminoácidos, pudiéndose ver los resultados en las Tablas 4 a 7.

La región constante de la cadena ligera de Cynomolgus se comparó con el gen C\kappa línea germinal humano (Hieter, P.A. et al, Cell 22, 197 (1980)), un mRNA de C\kappa de MPOC21 de ratón (Hamlyn, P.A. et al, Nucl. Acids Res. 9 4485 (1981)) y un mRNA de C\kappa de conejo (17D9) (McCartney - Francis N. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 81 1794, 1984). Las regiones variables de Cynomolgus se compararon con una línea de células linfoides humanas, Walker (Klobek, H.G. et al, Nucl. Acids Res. 12 6995, 1984). Esta línea de células expresa un gen de la cadena ligera que pertenece a la familia V\kappa1 y que utiliza el segmento del gen J5. La secuencia de conejo 17D9 se usó para comparar las secuencias variables de Cynomolgus con la que era la secuencia V\kappa1 de ratón S107A (Kwan, S.P. et al, J. Exp. Med. 153, 1366 (1981)). Esta es un mieloma \kappa de IgA de unión a fosfocolina que utiliza el segmento del gen J1 de ratón. La región variable del clon 15 también se comparó con un anticuerpo humano, Daudi (Klobek 1984). Este gen de cadena ligera pertenece a la familia V\kappa1 y usa el segmento del gen J5. La secuencia de la región constante de la cadena ligera \kappa de anticuerpo de Cynomolgus muestra una alta homología con el gen C\kappa humano tanto a los niveles de nucleótidos (91,6%) como de aminoácidos (81,3%). El C\kappa de ratón parece ser más homólogo con el C\kappa de mono Cynomolgus o humano que de conejo. No obstante, el porcentaje de homología no parece diferir drásticamente cuando se comparan mono con conejo y mono o conejo con ratón.

Las Tablas 5 y 6 muestran los porcentajes de homología para cada región marco conservado y cada CDR del clon 15. Como se espera, las regiones marco conservado están relativamente conservadas entre especies cuando se comparan con CDR en las que hay una variabilidad considerable. Por ejemplo, el clon 15 comparte el 90 a 96% de la homología de secuencia de aminoácidos con el humano en las regiones marco conservado 1 y 3, pero sólo el 22% de homología en CDR 3. El clon 15 presenta un alto grado de homología con las secuencias de la cadena ligera de Walker y Daudi humanas, especialmente en las regiones marco conservado 1 y 3, aunque presenta una mayor homología con Walker que con Daudi. La secuencia V\kappa de conejo muestra más homología con las secuencias humana y de mono que con la de ratón. Esto podría explicar porqué se observaron algunas reacciones con anticuerpos anti-humanos con suero de conejo en el ensayo de Ouchterlony pero no se observó la reacción con suero de ratón.

TABLA 4 Comparaciones de las homologías de secuencia de la región constante de la cadena ligera

Especie	% de homología en DNA	% de homología en AA
Cynomolgus/humano	91,6	81,3
Cynomolgus/conejo	66,0	51,0
Cynomolgus/ratón	68,0	58,0
Humano/conejo	65,7	45,8
Humano/ratón	69,8	58,9
Conejo/ratón	63,0	49,5

TABLA 5 Porcentajes de homología de secuencias marco conservado de la cadena ligera y de DNA por CDR

Cyno 15 v
	Humano W	Humano D	Conejo	Ratón
FR 1	89,9	89,9	71,0	66,7
CDR1	84,8	66,7	60,6	42,4
FR 2	95,6	80,0	86,7	75,6
CDR2	80,0	60,0	60,0	50,0
FR 3	92,6	91,6	82,1	76,8
CDR3	50,0	61,5	26,9	57,7
FR 4	75,8	75,8	66,7	66,7

TABLA 6 Porcentajes de homología de secuencias marco conservado de la cadena ligera y de aminoácidos por CDR

Cyno 15 v
	Humano W	Humano D	Conejo	Ratón
FR 1	95,7	95,7	52,2	47,8
CDR1	72,7	27,3	36,4	36,4
FR 2	73,3	86,7	66,7	60,0
CDR2	71,4	42,9	71,4	28,6
FR 3	90,6	96,9	78,1	78,1
CDR3	22,2	22,2	0,0	33,3
FR 4	80,0	70,0	60,0	70,0

Claims (14)

1. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo de primate recombinante que comprende:

(i) seleccionar una línea de células derivada de linfocitos de primate que puede expresar un anticuerpo deseado;

(ii) aislar el RNA de la línea de células y separar el mRNA del resto de RNA aislado;

(iii) sintetizar el cDNA a partir del mRNA e insertar el cDNA en un vector de clonación;

(iv) transformar una célula hospedadora con el vector que contiene el cDNA para obtener una genoteca;

(v) rastrear en la genoteca el cDNA que codifica los genes de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo;

(vi) insertar el cDNA que codifica las regiones constante y variable completas de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo en un vector de expresión;

(vii) transfectar una célula hospedadora con el vector de expresión que contiene el cDNA; y

(viii) cultivar la célula hospedadora transfectada y aislar el anticuerpo deseado.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primate es un ser humano.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primate es un chimpancé o un mono del viejo mundo.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la línea de células se produce a partir de linfocitos de un individuo conocido por haberse recuperado o por estar en fase de remisión de un estado de enfermedad.

5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la línea de células se produce a partir de linfocitos de un individuo conocido por estar infectado con un organismo patógeno o sufrir cáncer o una enfermedad autoinmune, pero que no manifiesta síntomas de enfermedad completa.

6. Un procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, en el que el individuo ha sido infectado por un virus.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la línea de células se produce a partir de linfocitos de un individuo que ha sido vacunado o inoculado con antígeno y ha desplegado una respuesta de anticuerpos.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la línea de células está estabilizada o inmortalizada.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la línea de células se selecciona rastreando la producción de anticuerpo con afinidad por un antígeno deseado.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la línea de células se selecciona adicionalmente rastreando la funcionalidad del anticuerpo.

11. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo recombinante que comprende:

i) micropreparación de RNA a partir de aproximadamente 1000 células de hibridoma;

ii) generación de una genoteca de cDNA seleccionado por tamaños;

iii) rastrear en la genoteca el cDNA que codifica las regiones constante y variable completas de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo y aislar el mismo;

iv) insertar el cDNA que codifica las regiones constante y variable de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo en un vector de expresión;

v) transfectar una célula hospedadora con el vector de expresión que contiene el cDNA; y

vi) cultivar la célula hospedadora transfectada y aislar el anticuerpo deseado.

12. Un vector adecuado para transfectar una célula hospedadora que comprende cDNA que codifica las regiones constante y variable completas de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo de primate.

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13. Una línea de células eucariotas transfectadas con cDNA para la expresión de las regiones constante y variable completas de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo de primate.

14. Un procedimiento para la expresión de cDNA que codifica las regiones constante y variable completas de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo de primate, que comprende transfectar una célula hospedadora eucariota con un vector o vectores adecuados para la expresión de dicho cDNA.