KR100255717B1

KR100255717B1 - 항체의 생산방법

Info

Publication number: KR100255717B1
Application number: KR1019940700121A
Authority: KR
Inventors: 제임스 스코트 크라우; 알란 피터 루이스
Original assignee: 그레이엄 브레레톤; 더 웰컴 파운데이션 리미티드
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1992-07-14
Publication date: 2000-05-01
Also published as: FI940144A; FI940144A0; JPH07502882A; EP0523949B1; ES2199216T3; DE69233104T2; HU220355B; WO1993002190A1; ATE243747T1; AU662752B2; TW373023B; US5876961A; HUT69798A; CA2111858A1; IL102490A0; DE69233104D1; JP3502093B2; NZ243558A; AU2279892A; IE922287A1

Abstract

본 발명은 DNA 공학에 의한 재조합 영장류 항체의 제조 방법 ; 상기 항체의 생산을 위한 미세-RNA 기술 ; 재조합 비-인간 영장류 항체 ; 상기 항체들을 함유하는 제제 ; 인간의 예방 및 치료에 상기 항체를 사용하는 방법, 및 상기 항체의 진단학적 사용 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

항체의 생산방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 DNA 공학에 의한 재조합 영장류 항체의 생산, 진핵 세포주에서의 그들의 발현, 및 인간의 치료적 및 예방적 처치에 상기 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

항체, 즉 면역글로불린은 2 중 기능성의 단백질 분자이다. 하나의 영역은 상이한 항체들 사이에서 매우 가변적인 영역으로서, 항원, 예를 들면 신체가 만날 수 있는 많은 상이한 감염원에 결합을 담당하며, 한편 제2과 영역은 불변 영역으로서, 세포의 Fc 수용체에 결합을 담당하며, 또한 보체, 즉 세포 용해를 담당하는 단백질들의 복합체 시스템을 활성화한다. 이런 방식으로, 항체는 외래 미생물 및 비루스를 파괴하는데 있어서 포유류의 면역 반응의 중요한 요소를 대표한다.

항체는 불변 영역의 구조에 근거하여 상이한 부류로 나눈다. 인간에서는 예를 들면 5 종의 주요 구조적 부류를 면역 글로불린 G, 즉 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 로 확인할 수 있다. 면역계에서 면역글로불린의 기능에 관련되는 물리적 및 생물학적 특징을 근거로 각 부류는 구별된다. IgG는 중쇄 아미노산 조성의 차이 및 이황화물 결합의 차이에 근거하여(하기 설명 참조) 생물학적 특성에 차이를 나타내는 4 개의 세부 부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 로 더 나눌 수 있다. 상기 부류와 세부 부류에 관한 설며은 이반 로이트의 “Essential Immunology” (블랙웰 사이언티픽 퍼블리켕션즈)에 제시되어 있다.

항체 분자는 2 개의 경쇄(light chains)와 2 개의 중쇄(heavy chains)가 쇄간 이황화물 결합으로 함께 연결되어 있는 구조로 이루어져 있다. 각각의 경쇄는 이황화물 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있으며, 2 개의 중쇄는 서로 이화화물 결합에 의해 연결되어 있다. 각각의 중쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인, 그 다음에 다수의 불변 도메인을 가지고 있으며, 각각의 경쇄는 한쪽 단부에 가변 도메인, 다른 쪽 단부에 불변 도메인을 갖고 있다. 경쇄 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인과 나란히 위치하고 있다. 경쇄 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 위치하고 있다. 중쇄의 나머지 불변 도메인은 서로 나란히 위치하고 있다. 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데 직접 관계하지는 않는다.

경쇄 및 중쇄의 각 쌍의 가변 도메인은 항원 결합 부위를 이룬다. 그들은 영역의 서열이 상대적으로 보존되고 3 개의 상보성 결정 영역(CDR : complementarity determining region)에 의해 연결되어 있는 4개 영역의 골격을 포함하는 각각의 도메인을 가진 동일한 일반 구조를 가진다. 4 개 골격 영역은 주로 베타-시이트 모양을 채택하며, CDR은 베타-시이트 구조를 연결하는, 그리고 어떤 경우에는 베타-시이트 구조의 일부를 포함하는 루푸를 이룬다. CDR은 골격 영역에 매우 근접하여 있으며, 기타 도메인의 CDR과 함께 항원 결합 부위의 형성에 기여한다.

항체쇄는 상이한 염색체상의 3 개의 분리된 유전자좌의 유전자가 암호화한다. 하나의 유전자좌가 중쇄 아이소타입을 암호화하고, κ 경쇄 및 λ 경쇄에 대해서는 분리된 유전자좌가 있지만, B-림프구는 이들 경쇄 유전자좌의 하나에서만 전사된다. 항체 가변 도메인을 암호화하는 유전자는 V, D 및 J 유전자 영역의 연결에 관련된 재조합 과정에 의해 B-림프구 개체 발생중에 생성된다. 하나의 B-림프구는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 재조합된 가변 도메인만을 사용하여 하나의 항원 특이성만을 가질 것이다. 그러므로, 중쇄의 하나의 대립 유전자 및 경쇄의 하나의 대립 유전자만이 하나의 B-림프구에 의해 발현된다. 이것은 대립 유전자 배타 현상(allelic exclusion)으로 알려져 있다.

감염 또는 면역화에 의해 동물을 항원에 노출시키면, 상이한 특이성과 친화도를 가진 상이한 항체가 생산된다. 그러므로, 면역화된 동물에서 얻은 항혈청은 이종성이며, 많은 상이한 림프구 클론에 의해 생산된 항체의 집단을 함유한 것이다. 이렇게 얻어진 항체는 다클론 항체로 언급되며, 이 다클론성이 치료용의 이용 및 진단 분석에 항체를 사용할 경우 주요한 결점이 되어 왔다.

1975 년에 중요한 진일보가 이루어졌는데, 콜러 및 밀스타인(네이쳐, 1975, 256, 495-497)이 항원으로 면역화시킨 생쥐의 비장 세포를 쥐의 골수종 계열의 세포와 성공적으로 융합시켰다고 보고한 것이다. 하이브리도마로 명명된 생성된 혼성 세포는 비장 세포에서 유래한 항체를 생성하는 성질과 골수종 세포에서 유래한 연속 증식 성질을 가진다. 각 하이브리도마는 본래의 항원의 특정 결정부에 대한 단일의 항체를 합성하고 분비한다. 배양내 모든 세포가 동일하다. 즉 그 세포들이 특정 항체종의 합성에 필요한 유전자 정보를 포함한다는 것을 확실히 하기 위해, 세포 융합에서 생긴 하이브리도마를 클로닝하고 재클로닝한다. 이런 식으로, 클로닝된 하이브리도마는 비장 세포가 유래된 본래의 동물종의 동종 항체를 생산한다.

단일 클론 항체를 생산하는 능력이 많은 질병의 진단에 형명적 성과를 가져왔으며, 다수의 병리학적 질환의 예방 및 면역 치료의 가능성을 제공한다. 불행하게도, 외래 항체, 즉 생쥐 또는 쥐와 같은 비-인간 종의 항체를 예방 접종 또는 치료용으로 인간에게 반복 투여하면, 개인의 면역계가 그 항체를 인지할 것이며, 그 항체는 바람직하지 못한 항-글로불린 반응을 야기하는 것 같다. 이러한 항-항체 반응은 불변 도메인 및 4 개의 골격 영역의 외래 기원에 기인한다. 이 반응의 결과는 치료용 항체를 중화시키고, 해로운 아나필락시(과민) 또는 알레르기 반응을 야기하는 것 같다. 게다가, 비-인간 단일 클론 항체는 인간의 보체를 특히 잘 고정시키지는 못하며, 항체의 불변 영역의 효과기 작용의 차이의 관점에서 볼 때, 항체-의존 성 세포-매개 세포 독성(ADCC : antibody-dependent cell-mediated cytotoxcity)와 같은 세포 제거의 비-특이적 메카니즘을 덜 유발하는 것 같다. 그러므로 비-인간 단일 클론은 감염되거나 질병을 가진 세포를 제거하는데 있어 인간 항체만큼 효과적이지 못하다. 그러므로, 치료용 항체가 효과적이고, 항-항체 반응을 일으킴이 없이 순환계에 유지되도록 하기 위해서는, 수용자의 면역계에 의한 인지를 피할 수 있어야 한다.

이 문에 대한 한가지 해결책은 상기한 바와 같은 하이브리도마에서 유래한 외래종의 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역에 이식한 키메라 항체를 형성하는 것으로서, 그것은 모리슨 등의 문헌(P.N.A.S., 1984, 81, 6851-6855)과 뉴버거 등의 문헌(네이쳐, 1985, 314, 268-271)에 기술되어 있다. 그러나, 이 상황에서는 가변 영역이 수용자에게 외래성으로 유지돈다 ; 따라서, 그것이 인지될 수 있으며, 여전히 중대한 면역 유발 문제를 야기할 수 있다. 조운스 등의 문헌(네이쳐, 1986, 321, 522-525), 및 라이히만 등의 문헌(네이쳐, 1988, 332, 323-327)에 기술된 바와 같이 외래 항체종의 CDR을 인간 항체 골격상에 이식한 항체의 인간화는 상기 문제점들을 많이 경감시킨다. 그러나, 항체의 CDR-이식은 복잠한 과정이며, 생성된 항체는 그 결합 친화도를 유지하기 위해 추가 수정을 필요로할 수도 있다. 그러므로 인간 면역계에 의한 인지를 피하기 위해, 항체의 최적 형태는 인간 항체, 또는 인간 항체와 실질적으로 동일한 항체라는 것이 명백하다.

일화적 보고서가 실험 동물로 통상 사용하는 에이프(예 : 침팬지) 및 멍키(예 : 사이노몰구스, 붉은털 원숭이, 아오투스)가 인간의 면역 반응과 충분히 유사한 면역 반응을 가져 감염의 양호한 모형을 제공한다는 것을 제안하였다. 상기 항체들이 인간 항체와 충분히 상도성이어서 예를 들어 설치류 항체에서 직면했던 문제으 일부를 극복할 수 있다는 것이 또한 제안되었다. 이것에 관해 발표된 증거는 없으며, 시험을 위해 임의의 비-인간 영장류 세포주를 입수할 수 있는지에 관한 증거도 거의 없다. 그러므로 상기 항체를 얻는 방법이 과도한 문제가 된다. 세포주들은 인간 림프구에서 생산도었지만, 그러한 세포주는 낮은 안정성을 가지며, 보다 안정할 수 있는 혼성체를 용이하게 형성하지 못하며, 보통 시험관내 배양시 저수율의 항체를 생산한다. 영장류 세포는 또한 외래의 감염성 핵산, 예를 들어 비루스의 핵산을 보유할 수 있으며, 이러한 핵산은 치료할 인간의 교차-감염 문제를 약한다. 생산된 항체가 인간에의 투여에 허용 가능한 형태이기 위해서는 시간이 걸리는 정제 절차, 멸균 절차, 또는 그 둘다가 적용되어야 한다.

유럽 특허 제314161 호에서는 진핵 숙주 세포에서의 인간 면역글로불린의 생산 방법이 개시되어 있다. 숙주 세포는 인간 중쇄 가변 영역 및 불변 영역을 각각 암호화하는, 작동적으로 연결된 제1 및 제2 유전자로 형질 감염된다. 숙주 세포는 또한 인간 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역을 암호화하는 작동저긍로 연결된 유전자로 형질감염된다. 이 형질감염된 세포를 배양하고, 바람직한 결합 특이성의 가변 영역을 갖는 재조합 인간 면역글로불린은 세포 배양물로부터 회수할 수 있다. 그러나, 이 방법은 하기와 같은 다수의 문제점을 안고 있다 : I) 이 방법을 실시하기에 충분한 게놈 DNA를 회수한 위해 다량의 림프구가 필요하다. 상기 명세서는 121㎍의 게놈 DMA를 회수한 1-2 × 10⁸림프구의 수거를 개시하고 있다 ; ii) 추가 처리를 위한 유전자의 기능적 쌍형성(중쇄에 대해 하나 및 경쇄에 대해 하나)을 얻기 위해서 4 개 대립 유전자 모두(중쇄에 대해 2 개 및 경쇄에대해 2 개)가 게놈 DNA에서 회수되며, 광범위한 서열 분석 클로닝에의한 선별, 발현 및 결합 연구를 필요로 한다 ; iii) 상기 방법에 의해 형질감염된 숙주 세포를 배양하므로써 항체의 약한 발현 레벨이 얻어진다. 상기 명세서는 평균 20 ㎍/ml 가 되는 6.7-34.5 ㎍/ml의 수율 범위를 개시하고 있는데, 그것은 시이토메갈로비루스(CMV) 발현 증폭 부위 1 ㎍/ml 만을 포함하는 구성체를 사용하여 얻었다.

국제 공개 WO91/04336 호는 또한 게놈 DNA과 회수를 통해 인간 단일 클론의 생산 방법을 개시하고 있다. 이 방법이 EP 314161 호에 대해 상술한 것과 동일한 결점을 갖는다는 것이 명백하다.

PCR의 출현은 적은 수의 세포에서 유래한 mRNA 로부터 cDNA 클론의 생성을 허용하였다. PCR 이 매우 강력한 수단으로 존재하지만, 표적 cDNA 서열의 5′ 및 3′ 단부 서열을 알아야 할 필요성이 다양한 서열을 가진 단백질, 특히 인간 항체족과 같은 다양한 리더 서열을 가진 분비된 산물을 암호화하는 mRNA 로부터 cDNA 클론을 생성시키기 위한 상기 기술의 사용을 방해한다. 많은 인간 H 쇄 서열이 보고되어 있고(커뱃 E.A. 등의 ‘면역학적으로 관심있는 단백질 서열’, 제4판, US Dept. of Health and Human Services, US Govt. Printing Service 1987), 이들의 일치 서열(consensus sequence)로부터 PCR 프라이머가 고안되어 있지만, Taq 폴리머라제에 의한 신장에 적합하지 못한 3′ 염기 때문에 상기 프라이머를 사용하여 모든 인간의 V 영역을 증폭시킬 수는 없다.

그러므로 본 발명은 기능적 항체의 불멸화를 위해 수준의 진핵 세포 발현 백터를 사용하여, 진핵 세포에서 인간의 완전한 중쇄 및 경쇄 항체 유전자의 구제 및 그 발현을 용이하게 하기 위해 일반적인 재조합 cDNA 클로닝 기술을 포함하는 신규의 방법을 제공한다.

게다가, 본 발명자들은 비-인간 영장류 말초 혈액 림프구로부터 클로닝된 cDNA 와 그로부터 생산된 항체쇄는 사실 잠재적으로 유용한 치료제를 제공하도록 인간 항체쇄 서열과 충분한 상동성을 보인다는 것을 증명할 수 있었다. 그러므로 본 발명은 비-인간 영장류 중쇄 및 경쇄 항체 유전자의 구제 및 그 발현을 위한 상기한 바와 같은 방법을 포함한다.

그러므로 본 발명은 하기 단게들을 포함하는 재조합 영장류 항체의 생산 방법을 제공한다 :

(i) 목적 항체를 발현시킬 수 있는 영장류 림프구-유래 세포주를 선별하는 단계 ;

(ii) 상기 세포주로부터 RNA를 분리하고, 그렇게 분리된 기타 RNA 중에서 mRNA를 분리하는 단계 ;

(iii) mRNA로부터 cDNA를 합성하고, cDNA를 클로닝 벡터 속으로 삽입하는 단계 ;

(iv) cDNA를 함유하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 라이브러리를 얻는 단계 ;

(v) 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 암호화하는 cDNA에 대해 상기 라이브러리를 검색(screening)하는 단계 ;

(vi) 상기 유전자들을 암호화하는 cDNA를 발현 벡터 속으로 삽입하는 단계 ;

(vii) 상기 cDNA를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 ; 및

(viii) 형질감염된 숙주 세포를 배양하고, 목적 항체를 분리하는 단계.

‘영장류’란 용어는 프로시미언(예: 여우원숭이), 신세계(아메리카) 멍키(예: 아오투스), 구세계(유럽·아시아·아프리카) 멍키(예: 사이노몰구스), 에이프(예: 침팬지) 및 인간을 지칭하는 것이다.

영장류 림프구-유래 세포주와 관련해서는 단일 항체를 생산할 단일 영장류 림프구에서 유래한 세포주를 으미한다. 세포주는 RNA를 회수할 수 있게 충분히 안정해야 하며, 따라서 종래의 비루스 형질 전환 및/또는 하이브리도마 기법(하이브리도마 형질전환의 방법, 바아털 및 허어소트(편집), 휴마나 프레스, 클립톤, N.H. 1985)을 사용하여 안정화시키는, 즉 불멸화시키는 것이 바람직하다. 그러한 세포주는 미국 매릴랜드주 로크빌 소재의 미국 모식균 매양 수집소와 같은 기탁 기관에서 얻을 수 있다.

상기 세포주는 말초 혈액 림프 결절로부터 또는 비장으로부터 림프구를, 즉 림프아세포 또는 B-림프구를 수거하므로써 생산할 수 있는데, 상기 비장 또는 림프결절은 예를 들면, 질병 상태로부터 경감중이거나 또는 회복된 것으로 알려진 개인(인간 또는 비-인간 영장류)으로부터 ; 병원성 유기체로 감염되었거나, 또는 암이나 자가면역 질병을 앍호 있으나, 완전한 질병 증후를 나타내지 않는 것으로 알려진 개인으로부터 ; 예방 접종하였거나 항원으로 접종하고, 항체 반응을 일으킨 개인으로부터 ; 유용한 항체에 대한 검색이 뒤따르는 건강한 개인으로부터 얻어진다. 질병 상태의 예로는 병원성 유기체(예 ; 비루스 또는 박테리아)에 의한 감염을 들 수 있는데, 이 경우 림프구의 수거는 회복후 2-3 개월내에 또는 항체 역가가 높을 때 일어나는 것이 바람직하며, 상기 질병 상태의 예로는 또한 항원, 예를 들어 병원성 유기체의 항원에 대한 에방접종을 받은 개인을 들 수 있는데, 이 경우의 림프구의 수거는 면역화후 2-3개월 이내에 일어나는 것이 바람직하다. 비루스와 같은 병원성 유기체를 검출 할 수 있으나 완전한 질병 상태로 진행하지 않는 개인 역시 매우 유용한 항체 생산 세포 공급원을 제공 할 수 있다. 명백히, 비-인간 영장류를 사용할 때 인간의 예방 접종에 자주 사용되는 형태인 병원성 유기체의 약화된 형태보다는 그 유기체로 접종하는 것이 가능하다. 이 유기체에 대한 면역 반응은 당연히 훨씬 더 클 것이며, 따라서 예방접종된 개인보다는 항체 생산 세포의 보다 양호한 공급원을 제공한다.

세포주는 또한 암이나 자가면역 질병과 같은 질병을 앓고 있는 것으로 알려지고 종양 세포나 자기 항원에 대해 항체 반응을 일으키는 것으로 입증될 수 있는 개인에게서 림프구를 수거하므로써 생산할 수 있다. 림프구는 또한 암의 자발적인 경감을 나타내는 것으로 확인된 개인, 또는 종양 항원으로 예방접종되고 항체 반응을 일으킨 개인으로부터 얻을 수 있다. 유용한 림프구를 동정하기 위한 다른 방법은 특정 환경 요소에 노출을 통해, 또는 군집내 평균 암 발생룰보다 높은 발생률을 보이는 “암”가족과 같은 유전적 소질을 통해 암을 발전시킬 위험이 있는 것으로 알려진 개인의 코호트(cohorts)를 검색하는 것에 관련된다. 이들 코호트는 특히 종양 항원에 대한 항체를 생성시키는 능력의 결과로서 암을 일으키지 않는 환자에 대해 검색할 수 있다. 암세포가 모든 개인에게 존재하며 면역계는 일반적으로 항체의 생산에 의해 반응을 일으킬 수 있고, 암 상태에도달하기 전에 돌연변이된 세포를 제거할 수 있다. 이론을 근거로 항-종양 항체에 대해 건강한 개인을 검색하는 것이 가능할 수도 있다. 이것이 사실이라면, 유용한 림프구는 임의의 개인으로부터 얻을 수 있다. 그렇게 동정된 림프구는 하기하는 바와 같은 비루스 형질전환 및/또는 융합에 의해 안정화 될 수 있다.

비루스 형질 전환은 엡스타인 바르 비루스(EBV)를 사용하여 실시하는 것이 바람직하다. 대부분의 말초 혈액 B-림프구는 EBV에 대한 수용체를 가지며, 상기 비루스로 감염될 때, 상기 세포는 EBV 핵 항원(EBNA)의 발현을 수반하며 형질 전환된다. 그러나, 약 20%의 세포만이 생체외에서 불멸화되며, 이들은 일반적으로 단지 작은 활성화되지 않은 B 세포이다. 혈장 세포(활성화된 B-세포)는 EBV 수용체가 결핍되어 EBV 감염에 대한 내성은 회수도니 림프구가 성숙될 때 상기 경로에 의한 비루스 형질감염의 효율을 감소시키면서 성숙하멩 따라 증가하는 것 같다.

그러므로 EBV를 사용한 비루스 형질감염을 위해서는, 비-혈장 세포 말초 혈액 림프구를 사용하는 것이 바람직하다. 세포주를 확립하기 위해서 B95.8(밀러 등 1972 Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 69 383-387)과 같은 비루스를 생산하는 세포주의 상층액은 일반적으로 충분한 감염성 비루스 입자를 함유한다. 실제로 10⁷이하의 세포 펠렛을 약 1 ml의 비루스 배양 상층액에 현탁시키고, 37℃에서 약 1 시간 동안 항온배양한다. 이것은 B-세포상의 특이 수용체에 비루스가 부착하여 세포를 투과하도록 한다. 침강을 방지하기 위해 용기를 부드럽게 교반하는 것이 바람직하다. 그렇게 감염된 세포를 배양할 수 있고, 목적 항체에 대한 유전자를 클로닝할 수 있다.

비루스 형질전환에 대한 대체 단계 또는 추가 단계는 골수종 세포를 융합하여 안정화를 제공하는 것이다(크로포드, D.H. 1985 인간 하이브리도마 및 단일 클론 항체 Ed. D.G. 엔겔만, S.K.H. 풍, J. 래릭 및 A. 로비체크 37-50 면 또는 로더 J.C. 등의 엡스타인-바르 비루스-하이브리도마 기법, 동일 부분 55-67 면), 골수종은 생쥐/인간 기원의 것이 바람직한 헤테로하이브리도마일 수 있다. 적합한 헤테로하이브리도마는 HT01과 같은 항체 분비 세포주로부터 생성시킬 수 있다. 적합한 세포는 그들이 아미노프테린 민감성이기 때문에, 8-아자구아닌 함유 배지를 통한 연속 통과에 세포를 적용시키므로써 하이포크산틴 아미노프테린 및 티미딘에 민감도에 근거하여 선별할 수 있다.

그러한 헤테로하이브리도마를 사용하기 위하여, 내인성 인간 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자를 결실시켜야 하며, 그렇지 않으면, 최종 세포주는 하나 이상으 항체를 생산할 수 있을 것이며, 목적하는 항체만에 대한 중쇄 및 경쇄를 함유하지는 않을 것이다. 이것은 세포를 90% 치사 투여량의 자외선 조사에 적용시키고, 항-인간 Ig에 의한 세포질 염색에 의해 적합한 콜로니와 60-140의 염색체 수, 즉 다배체의 생쥐 염색체를 선별하므로써 이루어질 수 있다.

왕성하게 증식하는 세포를 선별하는 것이 또한 유리하다. 이것은 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(또는 프리스탄) 프라이밍된 생쥐의 복강을 통해 통과시키므로써 수행할 수 있다.

그 후 증식 핵형 및 융합성에 대해 최종 선별을 실시하는데, 핵형이 가장 중요하다. 이상적인 헤테로하이브리도마는 주로 생쥐 염색체를 함유한다.

표적 림프구 세포주의 선별은 목적 항원에 친화성을 갖는 항체의 생산 및 항체 작용성에 대해 검색하므로써 실시할 수 있다.

친화성에 대한 시험은 방사선 면역 분석 또는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)와 같은 면역 분석 기술에 과해 수행할 수 있다. 상기와 같은 면역 분석 기술은 항체와 항원의 특이적 상호 작용을 이용하여 항원 특이성에 대한 정보를 제공한다. 방사선 면역 분석은 항체가 방사성 항원과 복합체를 형성하는 능력을 측정하거나 또는 불용성 하원 제제에 항체 결합의 양을 측정하므로써 항체 레벨을 평가한다. ELISA 기술은 효소를 항원 또는 항체와 접합시키는 것을 요한다. 효소들은 보통 간단한 역할을 근거로 선택되며, 발색 반응 산물에 의해 예를 들어 분광 분석에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 효소로는 알칼리 포스파타제, β-D-갈락토시다제 및 양고추냉이 퍼록시다제가 있다. ELISA는 1 차 결합 또는 경쟁적 결합 분석으로 이용될 수 있다. 예를 들면 비루스로 감염된 개인에서 분리된 림프구는 전체 비루스 입자 또는 무해산 비루스 입자의 형태일 수 있는 적당히 표지시킨 비루스 항원의 존재하에 하나의 림프구 세포주의 상층액 배지를 배양하므로써 선별할 수 있다. 그 후 항체/항원 복합체를 상술한 바와 같이 동정할 수 있고, 관련 림프구 세포주를 추가 연구를 위해 선별할 수 있다.

감염체의 경우 항체 작용성에 대한 시험은 비루스 중화와 같은 중화에 대한 경쟁 연구를 요할 수 있다. 중화 연구는 방사선 면역 집중 분석법(RIFA)을 사용하여 실시할 수 있는데, 이 방법에서는 정제된 항체의 고정된 농축물을 비루스의 10 배 희석액의 동일 부피로 배양하고 비루스 역가에 대해 분석한다. 또 다른 시험은 보체를 하용하고 세포 용해에 대해 시험하는 것일 수 있다.

인간 또는 비-인간 영장류 IgG, IgG1, IgG2 또는 IgG3, IgM, IgA, IgD 또는 IgE를 분비하는 세포를 얻는 것이 가능하다. 이들은 아우치톨로니(Ouchtolony) 아가 이중 확산 또는 ELISA에 의해 선별할 수 있다.

바람직한 특이성을 가진 기능적 항체를 발현시키는 림프구 세포즈의 선별후, 전체 세포 RNA는 촘크진스키 및 사찌의 방법(1987, ANAL. Biochem. 162, 156-159)과 같은 표준 재조합 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 항체를 암호화하는 특이 전령 RNA(mRNA)를 분리하기 위하여, 예를 들어 문헌〔분자클로닝 : 매니어티스 등의 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 래버러토리 프레스〕에 기술된 바와 같은 표준 기술이 이용된다.

그 후 상보성 DNA(cDNA)를 전술한 분자 클로닝 매뉴얼에 개시된 것과 같은 표준 재조합 기술에 의해 mRNA 로부터 합성한다.

본 발명이 불안정한 항체 생산 하이브리도마 또는 미지의 안정성의 EBV 형질전환된 B 세포에게서 필요로되는 것과 같은 훨씬 작은 수의 세포로부터 전길이의 항체 유전자를 클로닝하는 방법을 추가로 제공하지만, 전체 세포 RNA의 분리를 위해서는 1-3×10⁴및 1-3×10⁷림프구를 이용하는 것이 가능하다. 그러므로 상기 방법은 불안정한 세포주로부터 인간 또는 비-인간 영장류 항체를 구제하는데 특히 유용하지만, 임의의 항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자의 구제에 적용될 수 있다. 이것은 종래의 cDNA 클로닝을 위한 시판되는 효소 및 벡터 시스템의 재현성 및 질의 발전과 미세-RNA 분리 기술의 도입으로 가능하게 된다.

이 개량된 방법은 1000 하이브리도마 세포돠 같은 적은 수의 세포로부터의 크기-선별 cDNA 라이브러리를 생성시키므로써 달성할 수 있다. 이 라이브러리 또는 그 분획을 면역블로불린 쇄에 대해 검색할 수 있다.

그러므로 본 발명은 i) 약 1000개 세포로부터의 atp-RNA 분비, ii) 크기-선별된 cDNA 라이브러리의 형성, iii), 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA에 대해 상기 라이브러리의 검색, 및 iv) 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA의 분리를 포함하는, 전길이의 항체 유전자를 클로닝하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는데, 이 방법은 하기 단계들을 포함한다 :

i) 약 1000 개 세포로부터 미세-RNA 준비 단계 ;

ii) 크기-선별된 cDNA 라이브러리의 형성 단계 ;

iii) 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA에 대해 상리 라이브러리를 검색하고 상기 cDNA를 분리하는 단계 ;

iv) 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA를 발현 벡터속으로 삽입하는 단계 ;

v) cDNA를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 ; 및

vi) 형질감염된 숙주 세포를 배양하고 목적 항체를 분리하는 단계.

항체 중쇄 및 경쇄 단백질을 암호화하는 cDNA 클론의 동정은 cDNA를 플라스미드와 같은 복제 가능한 벡터속으로 클로닝하고, 원핵 세포(예 : 이, 콜리)와 같은 숙주 세포를 형질전환시키므로써 달성될 수 있다. 생성된 라이브러리를 하기 방법으로 항체 경쇄 및 중쇄 cDNA에 대해 검색할 수 있다.

검색은 예를 들어 D.M. 글로버의 유전자 클로닝(런던의 채프먼 앤드 홀 리미티드 출판)에 기술된 바와 같은 검출 방법 및 검출가능한 표지를 가진 중쇄 및 경쇄 DNA 탐침을 사용하여 실시할 수 있다. 이들 기술을 방사선 표지법 및 방사전 사진법에 의한 검출, 또는 딕옥시제닌 11 dUTP와 같은 비-방사성 표지 및 베링거 만하임에서 입수 가능한 비방사성 DNA 표지 및 검출 키트와 같은 검출 키트를 필요로 할 수 있다. 이 검색 방법은 또한 혼합된 탐침, 예를 들어 인간의 ν, μ 및 aH 쇄 탐침, 또는 κ 및 λL 쇄 탐침을 사용하여 아이소타입에 대해 완전히 분류되지 않은 항체가 검색되게 한다.

클론들은 선별할 수 있으며, 원한다면, 항체 중쇄 및 경쇄 서열을 결정할 수 있다. 발현 벡터의 제조전의 이 단계에서 항체 cDNA 속으로 변형을 도입시키는 것 역시 가능하다 ; 이것은 단일 코돈 또는 전체 영역 변영을 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체 아이소타입의 부류 또는 종의 교환을 일으킬 수 있다(즉 : 키메라 항체 형성). 이것은 선택한 아이소타입으로부터의 cDNA와 분리된 V 영역의 융합체를 생성시키므로써 달성될 수 있다.

일단 적합한 세포 콜로니가 선별되면, 발현을 위한 숙주 세포속으로 삽입하기에 적합한 벡터속으로 경쇄 및 중쇄 유전자를 위한 cDNA 서열을 재클로닝시킬 수 있다. 발현 벡터는 제조는 당 분야에 공지된 절차(분자 클로닝 : 실험실 내뉴얼, 제2 판, 매니어티스 등, 콜드 스프링 하버)에 따라 실시할 수 있다.

숙주 세포는 기능적 형태로 항체를 발현시킬 수 있어야 하며, 따라서 포유류 세포(예 ; 골수종 또는 중국산 햄스터 난소(CHO) 세포)와 같은, 항체의 불변 영역의 효과적 기능성에 필수적일 수 있는 해독후 변형, 특히 쇄의 정확한 접힘 및 당부가를 수행할 수 있는 진핵 세포여야 한다. 진핵 세포는 시험관내에서 매우 성공적으로 배양할 수 있으며, 기능적 항체를 발현시키는 것으로 알려져 있다. 효모 또는 곤충 세포 역시 그들이 바람직한 해독후 변형을 수행할 수 있기 때문에 숙주 세포로서 이용될 수 있다.

중쇄 및 경쇄 cDNA는 WO87/04462 호에 기술된 바와 같이 단일 벡터내에 형질감염시키거나 하기하는 바와 같이 두 벡터내에 함께 형질감염시킬 수 있다. 발현 벡터에 의한 숙주 세포주의 형질감염에 대한 전후의 언급은 공동-형질감염만이 언급되고 있다는 것이 문맥상 분명하지 않은한, 하나 이상의 벡터를 이용하는 숙주 세포의 공동-형질감염을 그 의미내에 포함한다.

공동-형질감염용 벡터는 독립적으로 선별 가능한 마아커를 함유하는 것이 바람직하며, 따라서 생성된 콜로니는 두 마아커에 대해 선별될 수 있다. 이중 표현형을 나타내는 콜로니는 일반적으로 경쇄 및 중쇄 둘다를 함께 발현시킬 수 있다. 선별 가능한 마아커는 우성일 수도 아닐 수도 있다. 선별 가능한 마아커의 예로는 아데노신 디아미나제(카우프만 등, P.N.A.S., 1989, 83 3136-40), 아스파라긴 신써타제(카티어 등, Mol, Cell Biol,. 1987, 7, 1623-28), 이, 콜리 trp B 유전자 및 살모넬라 his D 유전자(하트먼 등, P.N.A.S., 1988, 85, 8407-51), M2 생쥐 리보누클레오티드 리덕타제(덜랜더 등, EMBO J, 1989, 8, 2475-79), 인간 다종약제 내성 유전자(케인 등, 유전자, 1989, 84, 439-446), 글루타민 신써타제(베빙턴 등, DNA 클로닝, 제III권, 1987, D.M. 글로버 편집, 163-188, IRL 프레스), 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(gpt)(멀리건 등, 사이언스, 1980, 209, 1422-27), 하이그로마이신 B(샌터리 등, 유전자, 1984, 30, 147-156), 네오마이신 유전자(서던 등, J, Mol, Appl, Genet., 1982, 1, 327-341) 및 디히드로폴레이트 리덕타제(수브라마니 등, Mol, Cell Biol., 1981, 1, 854-868)가 있다.

벡터중의 하나와 함께 사용하기에 바람직한 선별 가능한 마아커는 dhfr 인데, 이것은 보통 dhfr- 표현형의 중국산 햄스터 난소(CHO) 모세포주와 함께 이용된다(얼롭 등, P.N.A.S., 1980, 77, 4216-4220). 성공적으로 형질감염된 CHO세포는 dhfr⁺표현형을 가질 것이며, 티미딘과 하이포크산틴이 없고, 임의로 메토트렉세이트(MTX)를 함유하는 배지상에서 콜로니를 배양하므로써 쉽게 선별할 수 있다. 벡터중의 다른 하나와 함께 사용하기에 바람직한 선별 가능한 마아커는 네오마이신(neo)과 같은 우성의 내성 마아커이다. 이 마아커로 성공적으로 형질감염된 CHO 세포는 항생 물질 제네티신(네오마이신의 유사체)을 함유하는 배지에서 콜로니를 배양하므로써 쉽게 선별할 수 있다.

CHO 또는 골수종 세포와 함께 사용하기 위한 또 다른 발현 시스템은 본원에 참고로 인용한 WO87/04462 호 방법에 기술된 글루타민 신써타제(GS) 증폭 시스템이다. 이 시스템은 GS 효소를 암호화하는 유전자 및 목적 항체 중쇄 및 경쇄 유전자에 의한 글루타민 의존성 세포의 형질전환을 포함한다. 그 후 글루타민이 없는 배지에서 증식하는 세포를 선별한다. 이들 선별된 클론을 메티오닌 설폭시민(Msx)을 사용하여 GS 효소의 억제에 적용시킨다. 세포들은 생존하기 위해, 항체를 암호화하는 유전자의 동시 증폭과 함께 GS 유전자를 증폭시킬 것이다.

GS 와 같은 전술한 선별 가능한 마아커는 또한 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 증폭시킬 수 있다는 근거를 제공한다. 세포주의 형질 감염시, 벡터 DNA는 종종 동일 유전자좌에서 세포의 염색체 속으로 통합된다. 따라서, 증폭을 위한 근거로서 선별 가능한 마아커의 이용은 정상적으로 두 유전자의 사본 수의 대당한 증가를 초래한다. 유사하게, dhfr은 억제 물질 MTX의 농도 증가를 통해 바람직한 증폭을 가능하게 하는 선별 가능한 마아커이다.

선별 가능한 마아커는 물론 그 마아커의 발현을 위해 제공되는 DNA의 조절요소의 통제하에 있다. 조절 요소는 DNA 종양 비루스에서 유래한 것과 같은 비루스원이 바람직하다. SV40 또는 아데노비루스의 주 후기 프로모터가 특히 바람직하다. 이 점에서 상기 프로모터로부터 증폭 부위 요소를 제거하여 그것을 효과적으로 “무력화”하는 것이 특히 유리하다. 이 변형은 강한 프로모터를 사용한다면 달리 일어나는 것 보다 억제 물질의 각 농도에서 유전자 증폭의 증가된 레벨을 허용한다. 선별 마아커로서 GS를 사용할 경우, 적합한 프로모터의 예는 생쥐 메탈로티오네인 프로모터이며, PCT 특허 공고 번호 WO89/01036 호에 기술된 인간 사이토메갈로 비루스(hCMV)-MIE 프로모터가 바람직하다.

항체 경쇄 및 중쇄 유전자는 또한 그들의 발현을 위해 제공되는 DNA과 조절 요소의 통제하에 있다. 그 발현이 실질적으로 균형을 이루도록 두 쇄에 대한 동일한 조절 요소를 사용하는 것이 바람직하다. 조절 요소는 비루스 기원일 수 있으며, 예로는 선별 마아커로서의 dhfr 또는 GS의 발현과 관련하여 상기에 언급한 것들이 있다. 또 다른 예로는 β-액틴 프로모터 및 동족 β-액틴 폴리아데닐화 신호의 사용이다.

벡터들중 하나 또는 둘다는 또한 SV40의 복제 기점을 포함하여 벡터 구성체가 COS 세포에서와 같이 급속한 일시적 분석에 의해 점검될 수 있게 한다.

상기 발현 벡터들에 의한 상기 세포주의 공동-형질감염은 동일한 양의 두 벡터와 표준 형질감염 절차(예 : 인산 칼슘 침전 또는 리포펙틴)를 사용하여 간단히 실시할 수 있다. 바람직한 공동-형질감염된 세포주의 선별은 특정 선별 마아커에 대해 공지된 표준 절차에 따라 실시할 수 있다.

그러므로 본 발명은 영장류 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA를 포함하는 숙주 세포의 형질감염에 적합한 벡터를 포함한다.

그러므로 본 발명은 영장류 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 cDNA 로 형질감염시킨 진핵 세포주를 포함한다.

본 발명은 추가로 영장류 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA의 발현 방법을 포함하는데, 이 방법은 상기 cDNA의 발현에 적합한 벡터(들)로 진핵 숙주 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다.

세포주의 배양은 혈청-함유의 또는 바람직하게는 무-혈청 배지에서 실시할 수 있다. 무-단백질 배지를 이용한다면 정제중이 특히 유리하다. 세포주가 CHO dhfr⁺형질전환체일 경우, 배지는 하이포크산틴과 티미딘이 없고, 선택적으로 MTX를 함유하는 것이 바람직하다. GS 시스템을 사용할 때, 글루타민 의존성 세포주 및 무글루타민 배지를 이용하는 것이 유리하다. 실질적으로 동일 몰비의 두쇄의 발현은 최적 수율의 기능적 항체를 얻을 수 있게 한다. 두 쇄들은 세포내에서 조립되고, 기능적 항체로서 배양 배지속으로 분비된다. 생성된 재조합 상체를 표준 절차에 따라 정제하고 재형화할 수 있다.

본 발명의 일 양태로서 재조합 비-인간 영장류 항체, 보다 구체적으로는 재조합 침팬지 또는 구세계 멍키 항체, 예를 들어 재조합 사이노몰구스 멍키 항체를 포함한다.

본 발명은 하기 단계들에 의해 생산되거나 생산 가능한 재조합 영장류 항체를 추가로 포함한다 :

i) 목적 항체를 발현시킬 수 있는 영장류 림프구에서 유래된 세포주를 선별하는 단계 ;

ii) 상기 세포주에서 RNA를 분리하고, 그렇게 분리된 다른 RNA로부터 mRNA를 분리하는 단계 ;

iii) 상기 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, cDNA를 클로닝 벡터 속으로 삽입하는 단계 ;

iv) 상기 cDNA를 함유하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 라이브러리를 얻는 단계 ;

v) 상기 항체를 암호화하는 cDNA에 대해 상기 라이브러리를 검색하는 단계 ;

vi) 상기 항체를 암호화하는 cDNA를 발현 벡터속으로 삽입하는 단계 ;

vii) cDNA를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 ; 및

viii) 형질감염된 숙주 세포를 배양하고, 목적 항체를 분리하는 단계.

cDNA 로 형질감염된 진핵 세포주의 사용으로 50 ㎍/ml 이상의 항체, 바람직하게는 250 ㎍/ml 까지 또는 그 이상의 항체를 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 또 다른 양태로는 영장류 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA를 발현시킬 수 있는 진핵 숙주 세포주의 배양 방법에 의해 생산되거나 생산 가능한 재조합 영장류 항체가 있다.

생성된 항체는 그 특이성에 따라 치료용으로 사용될 수 있다. 하기에 제공되는 한가지 예는 A 형 간염의 감염의 치료에 사용되는 인간 항-A 형 간염 항체이다. 다른 항-비루스 항체를 얻을 수 있는데, 그들은 기타 간염 비루스(예 : B 형 및 C 형 간염) 또는 허피스 비루스(단순 포진 미루스), 사이토메갈로비루스, 엡스타인 바르 비루스, 바리셀라 조스터 비루스와 같은 비루스를 표적으로 하는 것이다. 항-HIV 항체는 본 발명에 따라 얻을 수 있다. 이들 항체는 AIDS를 치료하는데, HIV 양성 또는 ARC 환자에서, AIDS과 발병을 예방하거나 지연시키는데, 또는 바늘 손상등을 통해 상기 비루스와 접촉한 개인에서 예방용으로 사용할 수 있다. 또 다른 용도는 임신중 또는 출산시에 HIV 양성 모체로부터 그 유아에게로의 비루스의 전염의 예방이 있다. 이것은 출산전, 출산중 및/또는 출산후 상기 항체에 의한 치료를 포함할 수 있다.

박테리아, 원생동물 등과 같은 기타 병원성 유기체를 표적으로 하는 항체들을 또한 얻을 수 있다. 암 세포는 또한 인간 항체에 대한 표적이 될 수 있다. 임의로 상기 항체들은 화학적 또는 생물학적 화합물을 운반하는 표적 작용 부위로서 사용될 수 있다. 상기 항체들을 세포내 이입에 의해 세포속으로 혼입시키는데, 세포속에서 항체들은 독성이거나, 또는 대사되어 독성 작용제를 형성하여 세포를 죽인다. 본 발명의 항체는 다발성 경화와 같은 자가면역 질병에 또는 관절염과 같은 염증 질환에 존재하는 것과 같은 기타 항-자기 항원을 표적으로 할 수 있다. 항-붉은털 원숭이 D 항체는 동물 모형에서는 만들어질 수 없다- 그러므로 인간 항체가 혈액형 분류에서 진단 수단으로서 큰 가치가 있으며/또는 치료용으로 이용될 수도 있다. 항-붉은털 원숭이 D 항체는 임신중 또는 출산중 어느 때에 붉은 털 원숭이 음성 모체에 투여하여 태아에 대해 또는 후속 임신중에 항체 형성을 방지할 수 있다. 그러므로 본 발명의 또 다른 양태로는 붉은털 원숭이 D 항원에 붉은털 원숭이 음성 개인의 노출의 예방 또는 치료에 재조합 인간 항체를 사용하는 방법이 포함된다.

본 발명에 따라 구제된 항체는 일반 진단 방법에 이용될 수 있다.

본 발명은 주로 전체 항체 중쇄 및 경쇄 유전자의 구제와 관계되지만, F(ab)F(ab)₂및 FV 와 같은 단편들을 구제하고, 발현시키고, 따로따로 사용할 수 있다는 것은 본 명세서로부터 명백할 것이다. 그러한 단편들은 ‘항체’의 정의내에 포함된다.

그러므로 본 발명은 전술한 질병 및 상태의 치료약의 제조에 영장류 항체의 사용 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 상술한 인간 질병 및/또는 상태의 예방 및/또는 치료 방법에까지 그 범위가 미치며, 이 방법은 효과적인 양의 영장류 항체를 인간에게 투여하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 진단 방법을 포함한다.

항체의 투여량은 치료할 상태 및 치료의 수용자에 따라 다를 것이지만, 성인 환자에게는 1 내지 약 100 mg, 바람직하게는 1-10 mg의 범위이며, 보통 1 일 내지 30 일 동안 매을 투여할 수 있다. 두 부분 투여 방식이 바람직한데, 1-5 mg을 5-10 일 동안 투여하고, 6-15 mg을 추가의 5-10 일 동안 투여한다.

재조합 영장류 항체를 함유하는 약학적 제제가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 그러한 제제는 항체외에도, 기타 항체 및/또는 항생 물질과 같은 기타 작용제와의 혼합물일 수 있는 생리적으로 허용가능한 회석제 또는 담체를 포함하는 것이 바람직하다. 적합한 담체로는 생리적 식염수, 인산염 완충 염수, 포도당 및 완충 염수가 있으며, 이들에 제한되지는 않는다. 한편 항체는 동결 건조시킬 수 있으며, 상기 완충 수용액의 첨가에 의해 필요할 때 사용하기 위해 재구성할 수 있다. 투여 경로는 통상 정맥내, 근육내, 피하, 및 복강내 주입 또는 운반을 포함하는 비경구적 경로이다.

[도면에 간단한 설명]

제1도는 생쥐 염색체 및 많은 인간 염색체의 다배체 양식의 숫자를 나타내는 HTO1 세포의 핵형 분석이다.

제2도 및 제3도는 각각 항체 D 중쇄 및 경쇄의 누클레오티드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 나타낸다. pH210H2 삽입체의 완전 서열이 나타나 있다. 신호 펩티드와 CDR 서열에 밑줄을 그었으며, 예측된 폴리아데닐화 신호는 서열 위에 줄을 그었다. 아미노산은 커뱃 등의 문헌(1987)에 따라 숫자를 표시하였다.

제4도는 사이노몰구스 카파 경쇄 가변 영역의 핵산 배열과, 인간, 토끼 및 생쥐 서열을 나타낸 것이다. CDR 이 나타나 있고, 점들은 인간 워커(Walker) 서열과의 동일성을 나타낸다. 코돈은 커뱃 등의 문헌에 따라 숫자를 표시하였다.

제5도는 사이노몰구스 카파 경쇄 가변 영역의 아미노산 배열과, 인간, 토끼 및 생쥐 서열을 나타낸 것이다. CDR 이 나타나 있고, 점들은 인간 워커 서열과의 동일성을 나타낸다. 아미노산 잔기는 커뱃 등의 문헌에 따라 숫자를 표시하였다.

제6도는 사이노몰구스 카파 경쇄 불변 영역의 핵산 배열과, 인간, 토끼 및 생쥐 서열을 나타낸 것이다. 점들은 인간 배선(germline) 서열과의 동일성을 나타낸다. 코돈은 커뱃 등의 문헌에 따라 숫자를 표시하였다. 10 마리 원숭이 서열중 하나는 밑줄친 누클레오티드 위치에서 G를 보유하였다.

제7도는 사이노몰구스 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 배열과, 인간, 토끼 및 생쥐 서열을 나타낸 것이다. 점들은 인간 배선 서열과의 동일성을 나타낸다. 아미노산 잔기는 커뱃 등의 문헌에 따라 숫자를 표시하였다.

[실시예]

혼성화를 위한 인간/생쥐 키메라 세포의 생산

실시예 1 : 인간 항-A 형 간염 항체의 구제

a) 세포주 HT01과 생산

건강한 인간 공여자로부터 50 ml의 혈액을 채취하고, 파상풍 톡소이드로 항원투여 면역화하고 7일후, 응고 방지제로서 무방부제 헤파린과 혼합하였다. 단구 세포를 피콜/하이패크(보이엄 A. 1986 Scand. J. Clin. Invest. 21, 77-89)상에서 분리하고, 행크스 완충 염수에서 세척하고, 하기와 같은 통상의 기술로 생쥐 골수종 세포주와 융합하였다.

NS-0 생쥐 골수종 세포(갤프레 G. 및 밀스타인 C. (1982) 면역학 45, 125-128)를 로그-상 배양에서 수집하고, 행크스 염수에서 세척하였다. 단구 세포(4.7×10⁷) 및 NS-O 세포(6×10⁷)를 혼합하고, 50 ml 시험관내에서 원심분리하였다. 그 후 세포 펠렛을 1 ml의 50% 폴리에틸렌 글리콜 용액에 재현탁시키고, 실온에서 1 분간 부드럽게 혼합하였다. 융합된 세포를 10% 태내 송아지 혈청을 가진 RPMI 배지에서 재현탁시키고, 24 개 웰 평판에 상기 성장 배지의 1 ml 분할 물 60 개 속으로 적가하였다.

24 시간 후, 하이포크산틴 아미노프테린 및 티미딘(HAT)와 1×10⁶Balb/c 생쥐 비장 세포를 함유하는 배지 1 ml를 각 웰에 첨가하였다. 그 평판을 5% CO₂내에서 37℃로 항온 배양하였다.

융합 20 일 후, 인간 항- 파상풍 톡소이드 항체에 대해 방사선-면역 분석으로 상층액을 검색하였다. 하나의 작은 세포들의(약 20 개) 콜로니를 함유하는 하나의 웰을 확인하였다. 이 콜로니는 증식이 느렸으며, 이것은 인간 염색체의 보유량 증가에 기인하여 항체 분비의 지속된 안정성과 관련된 특징이다.

이들 세포를 새로운 평판으로 옮기고, 3 주 후에 제한 희석(LD)으로 클로닝 하였다. 시험된 모든 아클론은 방사선 면역 분석(RIA)에서 양성이었다.

하나의 클론, PB47 1.A1.B9.E10은 HTO1 로 명명되었고, 세포를 냉동시켰다. 이들 세포는 인간 IgM 항-파상풍 톡소이드 항체를 합성하였다.

핵형 분석은 상기 세포들이 다배체 양식의 숫자의 생쥐 염색체 및 많은 인간 염색체를 포함함을 보여주었다(제1도). 이들 세포를 추가 하이브리도마의 제조를 위한 다배체 융합 파트너의 제조에 출발 재료로서 선택하였다.

세포주 HTO1은 인간 IgM 항-파상풍 항체를 분비하는 것으로서, 출발 재료로서 사용하여 다배체 융합 파트너를 생산하였다. HAT에 민감한 세포는 아미노프테린 내성의 HTO1 세포를 8-아자구아닌을 1 ㎍ - 20 ㎍/ml 함유하는 배지를 연속 통과 시키므로 선별하였다.

인간 항체 중쇄 및 경쇄 유전자의 상실을 자극하기 위해, 세포 샘플을 90% 치사량의 자외선 조사에 적용시켰다. 조사된 세포를 제한 희석액에서 클로닝하고, 많은 콜로니를 항-인간 Ig에 의한 세포질 염색의 결핍 및 염색체 숫자와 상호관계되는 핵의 크기에 근거하여 선별하였다. 하나의 클론, HTO1.A를 핵형 분석 후에 선별하였는 데, 핵형 분석은 이 클론이 60 내지 140 생쥐 염색체를 가진 다배체임을 보여주었다.

활발하게 증식하는 HTO1.A 세포의 선별은 프리스테인-프라이밍된 생쥐의 복강을 통해 샘플을 통과시키므로써 수행되었다(프리스테인(PRISTANE)은 알드리치에서 입수 가능한 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸임). 생존한 세포들은 미세역가평판상에서 단일 클로니로서 증식하였다. 이들을 배양하고, 증식, 핵형 및 융합성에 대해 평가하였다. HT01.A.P1 으로 명명된 세포는 135 생쥐 염색체 및 3 인간 염색체의 양식 숫자에 근거하여 최종적으로 선별하였다. 이 세포주를 A 형 간염 비루스 혈청 양성 공여자의 말초 혈액 림프구와의 융합 파트너로 사용하였다.

b) 항체 분비 세포의 수거 및 안정화

오염된 식품으로부터 발병되는 A 형 간염(영국)에 의한 감염 약 4 달후, A형 간형 비루스(HAV) 혈청 양성 공여자로부터 혈액 샘플(30 ml)을 얻었다.

말초 혈액 림프구를 림포프렙 구배(플로우 랩)상에서 분리하고, 엡스타인 바르 비루스(EBV)로 형질전환시키고, 파에토헤마글루티닌 및 10% 태내 송아지 혈청을 함유하는 배지에서 10 일간 배양하였다. 그들을 PEG 1500을 사용하여 상기한 바와 같은 적합한 인간/생쥐 키메라 세포와 융합시키고, 2 ml 웰내에서 HAT 및 10^-5M 우아바인의 존재하에 배양하였다. 항-HAV 활성에 대해 샌드위치 ELISA 로 상층액 배지를 검색하였는 데, 융합 10 일 후에 분명한 콜로니를 현미경으로 관찰할 수 있었다. 각각의 콜로니를 양성 웰로부터 취하고, 제한 희석액에서 단일 세포로부터 두 번 클로닝하므로써 단일 클론 세포주를 각각의 콜로니로부터 확립되었다. 본래의 42 개의 2 ml 웰중에서, 17 개가 광범위한 재공급후에 초기 ELISA 스크린에서 강한 양성이었으나, 분비성 단일 클론 세포주는 이들 중 4 개로 부터만 성공적으로 확립되었다. 아마도 헤테로혼성체의 본래의 염색체 불안정성에 기인하여 다른 것들은 2 중 클로닝후와 같이 분리 또는 클로닝의 여러 상태에서 항체 분비를 종결하였다.

c) 하이브리도마의 선별

ELISA 연구

상술한 세포주로부터 4 개 항체(A, B, C 및 D)를 완전 HAV 입자 및 천연 무핵산 HAV 입자에 대한 샌드위치 및 다이렉트 ELISA에서 적정하고, 최대 흡광 고평부의 50%를 생산하는 log 10 역 희석률로 표현하고 표 1a에 나타내었다. 샌드위치 시험에서 천연 입자에 대한 각각의 항체 역가의 % 로 표현되는 이 값들은 표 1b에 제시되어 있다.

완전 HAV 입자 및 천연 무색산 입자에 대한 인간 항체의 ELISA 역가

[표 1a]

샌드위치 시험에서 완전 입자에 대한 상동성 항체 역가의 % 로 표현된 항체의 ELISA 활성

[표 1b]

d) 경쟁 연구

서로 및 쥐 항체가 비루스에 결합하는 것을 상기 항체가 역제하는 능력을 고체상 방사선 면역 분석(RIA) 및 ELISA 기술(두 기술은 최종 단계에서만 다름)을 사용하여 시험하였다. 결과는 표 2에 항체쌍들 사이에서 얻어진 최대 경쟁률(%)로서 표현되는데, 하기 사항을 보여주고 있다 : I) 항체 A 및 B는 구별할 수 없으며, K24F2 쥐 항체(맥그리거 등 1983, J. Clin. Microb. 18, 1337 면)와 유사하다.

II) 항체 D는 성질상 쥐 항체 B5B3 와 유사하고(스테이플턴 J.T. 및 레몬 S.M. 1987 J. Virol. 61, 491 면), 역시험에서 최대 약 30% 까지 항체 A 만을 방해한다.

III) 항체 C는 기능적으로 항체 A 와 D과 중간인 것 같다.

IV) 항체 A 와 항체는 D는 각각 인간 HAV 다클론 혈청(레몬 S.M. 등 1983 J. Clinical Microb. 17, 834 면, 즉 파웰 및 츌레이)의 결합을 매우 효율적으로 억제할 수 있었다.

B5B3에 대한 항체 A 및 B 로 얻은 높은 경쟁률 값은 10 배 농축 항체로 얻은 반면, 조직 배양 상층액은 단지 20% 이하의 경쟁률을 생산하였다. 대조적으로, 동일한 상층액은 B5B3에 대한 항체 D 상층액과 마찬가지로 K24F2 및 K34C8 항체(맥그리거 A. 등 1983, J. Clin. Microb, 18, 1237 면)에 대한 완전한 경쟁률 곡선을 얻기 위해 실질적인 희석을 필요로 하였다.

18F HAV 균주에 대한 항체 결합의 최대 경쟁률(%)

[표 2]

(1) 최대 경쟁률에 필요한 농축 항체

e) RIFA 연구

초기 검색 ELISA 로 검출한 모든 항체 역시 18f 비루스에 대해 방사선 면역 집중 분석에서 양성이었다(대머 R.J. 등(1981) Infec ＆ Immunol, 32, 388 면 ; 및 스테이플턴 J.T. 및 레몬 S.M.(1987) J. Virol 제61권, 492 면 ; 및 핑 L.A. 등 85, 821 면). 비루스 RIFA 역가의 감소는 고정된 농도(1 mg/ml)의 친화도 정제 항체의 동일 부피를 10 배 희석률의 18f 및 43c 비루스 균주(43c 균주는 쥐 단일 클론으로부터 압력하에 통과시켜 18f 균주에서 유래한 것임)와 반응시켜 얻어지는 것으로서 표 3에 요약하였다. 이들은 돌연변이체 43c 가 두 항체 어느 것에 의해서도 매우 약하게 중화되지만, 다클론 팍스웰 혈청과의 중화도는 감소 되었지만 상당한 중화도를 나타냄을 입증한다.

두 항체가 다클론 혈청보다 훨씬 덜 효율적으로 18f 비루스를 ‘중화시키는’것 같지만, 이것은 주로 각각의 비루스 희석에서 생존하고 결국 역가의 스피어먼-카아버 계산을 왜곡하는 상당히 일정한 수의 잔류 플라크에 기인한다. 그러나, 다클론 혈청과의 반응은 모든 플라크 형성을 배제시켰다. 경쟁 연구에서 다클론 혈청에 대한 항체의 유사한 반응 경사도, 그 전체 ELISA 반응도는 이들이 낮은 친화도의 항체를 표현한다는 지표를 제공하지 못한다.

특이 항체와 반응한 HAV 분리물의 역가 log₁₀플라크 형성 단위/ml과 감소

[표 3]

f) 항-A 형 간염 비루스 단일 클론 항체 D 중쇄 및 경쇄의 클로닝 및 서열 분석

[방법 1]

1 × 10⁷세포당 1 ml의 추출 용액을 사용하여 촘크진시키 및 사찌(1987 Anal. Biochem. 163, 156-159)의 방법(1)에 따라 2.5 × 10⁷항체 D 발현 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. 생성된 RNA 펠렛을 50 ㎕ 디에틸 피로카르 보네이트(DEPC)-처리된 증류수에 재용해시키고, 분광학적으로 측정하여 4.4 ㎍/㎕의 농도임을 확인했다. 다이나비이드(Dynabeads) 올리고(dT)₂₅(영국 다이널위널)를 사용하여 75 ㎍의 전체 RNA 로부터 제조자의 프로토콜을 이용하여 폴리아데닐화된 RNA를 추출하였다.

[방법 2]

폴리아데닐화된 RNA과 분리를 위한 또 다른 방법(2)은 마이크로-패스트트랙 mRNA 분리 시스템(미국 산디에고 소재의 인비트로겐)을 사용하여 제조자가 추천한 방법에 따라 10³항체 D 분비 세포로부터의 직접 분리를 포함하였다.

제한된 숫자의 세포로부터 인간 항체 유전자를 클로닝하는 능력을 조사하였다. 상기 방법 2를 사용하여 천개의 항체 D 분비 세포로부터 분리된 폴리아테닐화된 RNA 로 cDNA 라이브로리를 생성시켰다. 상기 라이브러리는 약 2000 크기-선별된(〉500 bp) cDNA 삽입물의 잠재력을 보유하는 것으로 계산되었다. 상기 라이브러리의 반을 플레이트에 깔고, 인간 κL 괘에 대해 검색하여 2 개의 양성 클론을 검출하였다. 부분적 서열 분석은 두 클론이 신호 펩티드 서열을 포함하여 완전한 길이의 L 쇄 유전자를 보유함을 확인시켰다. 이 라이브러리가 H 쇄 탐침으로 검색되지는 않지만, 완전한 길이의 H 쇄 삽입체는 초기 cDNA 라이브러리에서 얻은 H 쇄 양성체의 빈도(2/500)로부터 계산된 대로 존재한다.

cDNA 합성을 위한 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템, 및 플라스미드 클로닝키트(깁코/BRL, 영국 페이즐리)를 사용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라, 분리된 mRNA 로부터 cDNA를 합성하고, 플라스미드 pSPORT-1 속으로 클로닝하였다. 에스케리챠 콜리 최대 효율 DH5_a경쟁 세포(깁코/BRL)를 생성된 cDNA/pSPORT-1 연결체로 형질전환시켰다. 약 4500 개 콜로니를 하이본드-N 나일론 필터(애머샴)상에 올리고 용균시키고, 변성시키고, 뷸루웰라등(핵산 Res, 1989 17 452)의 방법에 따라 고정시켰다. 그 필터를 프로티나제 K 로 처리하고 (0.2 × SSC, 0.1% SDS so 50 ㎍/ml, 55℃, 30 분), 과다 잔류물을 휴지로 제거하였다. 그 후 상기 라이브러리를 중쇄 및 경쇄 탐침을 사용하여 인간 항체 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 검색하였다.

중쇄 탐침은 인간 IgG1 항체 cDNA 삽입체(쥐 CAMPATH-1〔캠패드는 더웰컴 파운데이션 리미티드의 상표명임〕 항체 중쇄 CDR을 인간의 새로운 IgG1 항체 중쇄상에 재형성한 것임 ; 라이히만 등, 1988 네이쳐 382 323-327)였는데, 그것은 비방사성 DNA 표지 및 검출 키트(베링거 만하임)을 사용하여 딕옥시제닌-11-dUTP 로 표지되었고, 제조자의 프로토콜에 따라 항체 D 중쇄에 대해 약 500개의 성장된 콜로니를 보유하는 필터를 검색하는데 이용되었다. 2 개의 잠재적 양성 콜로니가 검축되었고 추가 분석을 위해 선택되었다. 콰이어젠 플라스미드 키트(독일연방공화국 뒤셀도르프 소재의 다이아젠) 또는 델 살 등(1988 핵산 Res. 16 9878)의 방법을 사용하여 플라스미드 DAN를 제조하였으며, 잠재적 양성 클론 둘다는 인간 면역글로불린 중쇄 cDNA에 대해 기대되는 크기의 삽입체를 함유하는 것으로 관찰되었다. 클론 pH210H2를 선별하고, 디데옥시쇄종결 방법(생거 등, Proc. Natl. Acad. Sci 미국, 1977 74 5463-5467)에 따른 플라스미드 프라이밍에 의해 시쿼나제 키트(유나이티드 스테이츠 바이어케미컬즈 -USA, 미국 클리블랜드) 프로토콜에 따라 양방향으로 서열 분석하였다. 중쇄의 C 영역은 γ1 으로 측정되었다. 가변 영역 서열은 제2도에 도시한다.

경쇄 탐침은 인간 람다 cDNA(인간화된 항-CD3 mAb γL 쇄 삽입체〔쥐 항-CD3 mAb L 쇄 CDR을 인간 γ Kern^-Oz^-Ab L 쇄상에 재형성한 것임 ; E. 루틀레지, Eur. J. Immunol. 1991 ; 21 ; 2717〕 및 캠패드-1H κL 쇄 cDNA 삽입체〔쥐 캠패드 1 mAb L 쇄 CDR을 인간 REI κAB L 쇄상에 재형성한 것임 ; 페이지 및 시든 햄 바이오/테크놀로지 1991 ; 9 : 64〕)이었는데, 이 인간 람다 cDNA는 비방사성 DNA 표지 및 검출 키트(베링거 만하임, 영국 류스 소재)를 사용하여 딕옥시제닌-11-dUTP 로 표지시키고, 제조자의 프로토콜에 따라 항체 D 경쇄에 대해 약 4000 개의 성장된 콜로니를 보유하는 필터를 검색하는데 이용하였다. 20 개 잠재적 양성 콜로니를 검출하고, 10 개를 추가 분석을 위해 선택하였다. 콰이어젠 플라스미드 키트(독일연방공화국 뒤셀도르프 소재의 다이아젠) 또는 델 살등(1988)의 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였으며, 8 개 클론이 인간 항체 경쇄 cDNA에 대해 기대되는 크기의 삽입체를 함유하였다. 클론 pH210L2를 선별하고, 디데옥시 쇄종결 방법(생거 등, 1977)에 따른 플라스미드 프라이밍에 의해 시쿼나제 키트(USB, 미국 클리불랜드 소재)프로토콜에 따라 양 방향으로 서열 분석하였다. 경쇄는 가변 영역을 제3도에 도시한 λ 서열로 측정되었다.

g) 발현 구성체의 조립

[실시예 g. i)]

발현 벡터 pRDN1은 하기와 같이 pLD9 플라스미드(페이지, M. 및 시든햄 M.A.(1991) 바이오테크놀로지 9 64-68)로부터 개조하였다. SV40 복제 기점을 삽입하기 위해 사용된 Hind III 부위 및 DHFR 암호 서열의 5′의 기타 Hind III 부위는 Hind III 처리에 의해 파괴시켰고, DNA 폴리머라제의 클리나우 단편을 사용하여 갭을 채우고 재연결하였다. 두 제한 부위가 없는 클론은 Eco R₁으로 처리하고, 클리나우 효소로 갭을 채우고, 재연결하였다. 모든 내부 Hind III 및 Eco R₁부위가 없는 생성된 플라스미드를 사용하여 인간 β 액틴 발현 카세트를 DHFR 전사 단위의 하류에 삽입하였다. 이 플라스미드는 기능적인 SV40 복제 기점을 갖며, pRDN1은 β 액틴 프로모터의 하류에 특이한 Hind III 및 Eco R₁제한 부위를 가진다. 개조된 pRDN1 벡터를 Eco RI 으로 처리하고, 클리나우 효소로 블런트 말단을 만들고, 송아지 소장 포스파타제를 사용하여 탈인산화 하였다. 항체 D 중쇄 및 경쇄 삽입체를 Hind III 및 Eco R₁를 사용하여 그 관련 클론 pH210H2 및 pH210L2로부터 절단하고, 클리나우 효소로 불런트 말단을 만들었다. 블런트 말단의 삽입체는 pRDN1 속으로 연결시키고, 에스케리챠 콜리 최대 효율 DH5 수용성(受用性) 세포(베데스다 리서치 랩, BRL)를 형질전환시키는데 사용하였다. 소규모의 플라스미드 제제화(델 살, G 등(1988) 헥산 Res. 16 9878)를 다수의 생성 콜로니상에서 수행하였으며, 삽입체는 적합한 제한 처리를 사용하여 배향시켰다. 제조자의 프로토콜에 따라 콰이어젠(상표)를 사용하여 하나의 중쇄 클론 및 하나의 경쇄 클론(각각 pRDHH9 pRDHL27)으로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다.

[COS 세포의 형질 감염]

12-웰 조직 배양 접시의 각 웰내 D-MEM(헐청 포함)에 2×10⁵COS 세포를 깔았다. 24 시간 후, 제조자가 추천한 대로 세포 단일층을 무혈청 배지로 세척하고, 각 DNA 구성체(pRDHH9 및 pRDHL27) 1 ㎍ 및 트랜스펙탐(노르덤브리아 바이올로지칼즈 리미티드) 5 ㎍을 함유하는 무혈청 배지 0.5 ml 로 세척하였다. 6 시간 더 항온 배양한 후, 형질감염 배지를 흡출하고 1 ml D-MEM (혈청 포함)으로 대체하였다. 48-72 시간 후, 배지를 제거하고 인간 항체에 대해 분석하였다.

[인간 항체에 대한 ELISA 분석]

COS 세포 형질감염시킨 배지를 인간 항체의 존재에 대해 분석하였다. 경쇄 합성의 부재시, 중쇄는 세포로부터 분비되지 않으며, 내부에서 분해된다 (헨더샷 L. 등, Immunol. 투데이 8 111-114). 따라서 항체는 배양 배지내 중쇄의 검출에 의해 분석할 수 있다. 미세역가 평판을 항-인간 IgG 로 코팅하고, 배양 배지로 항온 배양하였다. 항체를 항-인간 감마쇄 특이 퍼록시다제 접합체로 시각 관철에 의해 검출하였다.

[실시예 g. ii)]

H 및 L 쇄를 암호화하는 DNA를 각각 pEE6hCMV(스티븐스 및 코켓 Nucl. Acids Res. M : 7110, 1989 ; 베빙턴 등, 바이오테크놀로지 10, 169, 1992) 및 pEE12(롤페, 미공개) 발현 벡터속으로 클로닝하였다. 플라스미드 pEE12는 SV40 초기 프로모터와 pSv2.Gs(베빙턴 및 헨트셸 DNA 클로닝 III권, 뉴욕 아카데믹, 글로버 DM 편집, 1987)로부터 얻은 SV40 스플라이싱 신호 및 폴리아데닐화 신호의 통제하에 있는 햄스터 글루타민 신써타제 유전자(GS : 독성 글루타메이트 유사물인 L-메티오닌 설폭시민 〔MSX〕을 사용하여 선별하고 증폭시킬 수 있는 마아커)를 암호화하는 cDNA를 함유한다. 이 선별 카세트의 하류에는 완전한 증폭 부위, 프로모터, 및 인간 사이토메갈로비루스(hCMV)의 주요 직접 초기(MIE : major immediate darly) 유전자의 5′ UTR 이 있으며, 이것은 항체 유전자의 발현을 일으키는데 사용된다. 그 관련 복제 기점 및 β-락타마제 유전자를 가진 이 발현 카세트는 pEE6.HCMV(스티븐스 및 코켓 Nucl. Acids. 17 : 7110, 1989)로부터 얻었다. 그러므로 벡터 pEE6hCMV 및 pEE12 로 형질감염된 세포는 글루타민을 뺀 배지에서 증식시킬 수 있다. 플라스미드 pEE6hCMV 및 pEE12는 셀텍 리미티드 (영국, SL1 4EN, 버어크셔, 슬로우 소재)으로부터 입수하였다.

재조합 플라스미드(각각 5 ㎍)을 제조자가 추천하는 조건하에 트랜스펙탐 시약(프로메가, 영국 사우쓰앰프턴 소재)을 사용하여 5 × 10⁵COS-1 세포 또는 10⁷YO 골수종 세포속으로 형질감염시켰다. 결국, 선별은 pEE12 플라스미드상에서만 실시하며, 효과적인 발현은 두 개 플라스미드의 동시-통합에 달려 있다.

H 및 L 쇄는 COS 세포에 공동-형질감염시켜 구성체가 프레임에 정확히 삽입되고, 효율적으로 전사되고 해독되게 하며, 생성된 인간 항체가 적절히 분비되게 하였다. ELISA에 의해 항체의 일시적 발현을 확인하였으므로, 플라스미드는 YO 골수종 세포 속으로 공동-형질감염되었다.

원 COS-1 세포(소스 ECACC 영국 포오턴 다운)를 10% 태내 송아지 혈청(APP, 영국 더들리)으로 보충시킨 DMEM 배지(플로우, 영국 어빈)에서 유지하였다. COS 세포 형질감염을 DMEM 배지(플로우, 영국 어빈)에서 실시하였다.

원 YO 세포(소스 ECACC, 영국 포오턴 다운)를 DMEM 배지(플로우, 영국 어빈 ; 글루타민 및 페릭 나이트레이트는 없지만, 피부르산 나트륨〔110 mg/L〕 함유 ; 깁코/BRL, 영국 페이즐리), 1X 비필수 아미노산(플로우, 영국 어빈) 및 10% 태내 송아지 혈청(APP, 영국 더들리)을 함유하는 완전 배지에 유지시켰다. 형질감염된 세포를 50 ㎕ 완전 배지내 96 웰 평판으로 3×10⁵, 7.5×10⁴및 1.5×10⁴세포/ml의 밀도로 옮기고, 37℃에서 24 시간 동안 항온 배양하였다. 이어서, 글루타메이트(60 ㎍/ml), 아스파라긴(60 ㎍/ml ; 시그마, 영국 푸울), 1X 비필수 아미노산, 7 mg/l의 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 유리딘, 2.4 mg/l의 티미딘(시그마, 영국 푸울), 10% 투석된 태내 송아지 혈청(APP, 영국 더들리) 및 4 μM NSX (YO 세포의 내생 글루타민 신써타제 효소를 적정하기 위해)로 보충된 DMEM 배지(플로우, 영국 어빈 ; 글루타민 및 페릭 나이트레이트는 없지만, 피부르산 나트륨〔110 mg/l〕함유 ; 깁코/BRL, 영국 페이즐리)를 함유하는 100 ㎕의 선별 배지를 첨가하여 인간 항체 유전자를 함유하는 형질감염된 플라스미드를 통합시킨 클론을 선별하였다.

형질감염 4 일후 COS-1 세포로부터 및 플라스미드 통합의 선별을 위한 배지에서 증식시킨 YO 세포로부터의 증식 배지를 포획 항체로서 다클론 항-인간 IgG(시그마, 영국 푸울)로 코팅시킨 가요성 미세 역가 평판(팔콘, 영국 플라이마우쓰 벡턴-디킨슨)을 사용한 샌드위치 ELISA 분석법으로 분석하였다. 분석 샘플을 첨가하고, 기질로서 항-인간 γ 쇄 특이 퍼록시다제 접합체(시그마, 영국 푸울) 및 오르토페닐렌 디아민-HCL(시그마, 영국 푸울)로 검출을 실행했다. 양성 클론을 선택 배지에서 추가 증식을 위해 24 웰 평판으로 옮겼다.

형질감염되지 않은 YO 세포에 독성인 MSX과 레벨에서 증식할 수 있는 3개 클론을 얻었다. 이중 2개가 ELISA 분석으로 측정되는 바와 같이 인간 항체를 분비하는 것이었으며, 반면 다른 세포주는 허위 양성으로 나타났다.

[실시예 2]

[사이노몰구스 멍키 항체 쇄 서열의 결정]

a) 아우치털로니(Ouchterlony) 면역 확산

침팬지 사이노몰구스 및 아오투스 멍키의 헐청을 사용하여 아우치털로니 면역 확산 시험을 실시하여 인간 및 영장류 면역글로불린의 단백질 서열 사이에 존재할 수도 있는 유사성의 지표를 제공하여UT다.

미세-아우치털로니 평판-더 바인징 사이트에 과해 제공됨.

양의 항-인간 IgG1, IgG3 및 IgG4 - 더 바인딩 사이트에 의해 제공됨.

염소의 항-인간 IgM 및 염소의 항-인간 IgA - 시그마에 의해 제공됨.

양의 항-인간 Igκ 경쇄 - 세로텍에 의해 제공됨.

양의 항-인간 Igλ 경쇄 - 세로텍에 의해 제공됨.

사이노몰구스(구세계) 멍키, 아오투스(신세계) 멍키 및 침팬지(에이프)의 혈청을 일련의 항-인간 면역글로불린에 대한 반응에 대해 시험하였다. 희석되지 않은 양의 항-인간 항체(10 ㎕)를 아우치털로니 평판의 중앙 웰에 놓고, 영장류 혈청(10 ㎕)를 주위의 바깥 웰에 놓았다. 모든 혈청을 제조자의 추천에 따라 PBS 내에서 희석시켰다. 토끼 및 생쥐 혈청은 양성 대조용으로 작용한 인간 혈청처럼 분석에 포함되었다. 상기 평편을 습운 조건하에서 실온으로 하루밤 동안 침전 밴드가 보일때까지 항온배양했다.

침전 밴드가 침팬지 혈청과 모든 항-인간 세부 부류 사이에서 형성되었다. 전부는 아닌 일부 인간 Ig 부류, 늑 IgG1, IgM, IgA 및 κ 및 λ 경쇄는 사이노몰구스 멍키 혈청으로 침전 밴드를 형성하였다. 아오투스 멍키 혈청(신세계 멍키)는 최소 인간 항체에 의해 인지되었다 - 유일한 강한 반응은 κ 및 λ 경쇄일 경우만 나타났다. 놀랍게도, 토끼 혈청이 항-인간 λ경쇄와 반응하였는데, 이것은 토끼와 인간의 Ig 단백질 서열들 사이에 인지가 일어나도록 공통된 에피토프가 있을 수 있음을 암시한다. 생쥐 혈청은 어떤 인간 Ig 부류도 인지하지 못했다.

이 시험은 인간에 대한 각 종의 진화 관계를 고려하는 기대 결과 - 즉, 신세계 멍키가 구세계 멍키보다 먼저 분화되어 인간에 대해 보다 높은 단백질 상동성을 보인다는 사실을 제공하였다. 영장류 유전자와 인간 Ig 유전자 사이에 누클레오티드 상동성의 정도를 조사하기 위해, 구세계 사이노몰구스 멍키의 κ 경쇄 유전자를 본 연구에 선택하였다.

b) 사이노몰구스 멍키 전체 RNA는 추출 REF과 구아니듐 티오시아네이트를 사용하여 10 ml과 말초 혈액 림프구로부터 제조하였다.

제1 가닥 cDNA는 BRL 슈퍼스크립트 시스텝(BRL)을 사용하여 전체 RNA 로부터 합성하였다. 13 ㎕ 부피의 전체 RNA(5 ㎕)를 1 ㎕의 올리고-d프라이머에 첨가하고, 70℃에서 10 분 동안 가열하여 접합되게 하고, 얼음에서 냉각시켰다.

제1 가닥 cDNA를 2 ㎕ 반응 완충액, 1 ㎕ dNTP, 2 ㎕ DTT 및 1 ㎕ 역전사 효소의 첨가로 역전사시켰다. 반응물을 실온에서 10 분간 항온 배양하고, 42℃에서 50 분간 항온 배양하였다. 90℃에서 5 분간 가열하므로써 반응을 중지시키고, 얼음에 10 분간 유지하였다. mRNA 주형을 37℃에서 20분간 1 ㎕의 RNase H 로 처리하였다.

c) 제1 가닥 cDNA과 PCR의 중폭

PCR 프라이머

151-인간 V_κ1과 5′ 단부(FR1)과 상동성

5′ GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA SEQ ID NO : 1

301 - 인간 C_κ(Hind III 제한 부위 포함)의 3′ 단부와 상동성

5′ GATCAAGCTTCTAACACTCTCCCC SEQ ID NO : 2

언급한 이들 프라이머와 모든 후속 PCR 및 시쿼싱 프라이머를 올리고데옥시누클레오티드 합성기상에서 합성하였고, 200 ng/㎕의 농도로 사용하였다.

제1 가닥 cDNA는 제2 가닥 합성의 필요 없이 프라이머 151 및 301을 사용하여 PCR 로 직접 증폭시켰다. 프라이머 151은 인간 κ1 경쇄의 가변 영역(FR1)의 5′ 단부에 특이성이 있으며, 프라이머 301은 인간 κ 경쇄의 불변 영역의 3′ 단부에 특이성이 있다.

경쇄는 하기 반응으로 증폭시켰다 ; 완전한 제1 가닥 cDNA 반응 혼합물을 21 ㎕ dH₂O, 8 ㎕ 합성 완충액(베링거), 4 ㎕ 프라이머 301, 4 ㎕ 프라이머 151 및 0.5 ㎕ Taq 폴리머라제에 첨가하였다. 이 혼합물에 광물성 오일을 도포하고, 진술한 프로그램을 사용하여 PCR 20 사이클에 적용시켰다. 반응은 전과 같이 1% 아가로즈 겔상에서 점검하였다.

d) 사이노몰구스 κ 경쇄의 클로닝

PCR 프라이머 260-인간 V_κ(Hind III 제한 부위 포함)의 5′단부와 상동성

5′ GATCAAGCTTGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA SEQ ID NO : 3

i) 경쇄 단편의 한쪽 단부에 Hind III 부위의 도입

전술한 PCR 로부터 얻은 사이노몰구스 멍키 κ 경쇄 cDNA를 pUC18과 Hind III 부위에 클로닝하였다(매니어티스 등의 J. 분자 클로닝, 콜드 스프링 하버래버러토리 프레스, 1989). 증폭된 경쇄는 프라이머 301 서열에 기인하여 불변영역의 3′ 단부에 Hind III 부위를 포함하지만, 5′단부에는 그러한 제한 부위가 결핍되어 있다. 그러므로, 경쇄를 pUC18 속으로 직접 클로닝하기 위해서, 프라이머 260 및 301을 사용한 제2 PCR에 의해 가변 영역의 5′ 단부에 Hind III 부위를 도입시켰다. 프라이머 260은 프라이머 151과 동일 서열을 가지나, 5′ 단부에 Hind III 부위가 첨가되어 있다.

반응은 전술한 바와 같이 1 ㎕의 사이노몰구스 cDNA(PCR 혼합물에서 유래)를 사용하여 최종 부피 100 ㎕로 설정되었다. 20 사이클의 PCR 로 DNA를 증폭시키고, 1% 아가로즈 겔상에서 검사하였다. 겔은 증폭된 경쇄에 대해 기대되는 것과는 다른 다수의 밴드를 나타내었다. 일부의 보다 작은 밴드가 서로에게 접합되어 소위 프라이머-이량체를 형성하는 프라이머에 기인한 것일 수도 있다.

ii) PCR 산물의 정제

경쇄는 pUC18에 클로닝하기 전에 하기 방식으로 PCR 혼합물로부터 정제하였다 ; PCR 반응물은 -20℃에서 냉동시키고, 액체 광물성 오일을 흡출시켰다. 그 후 DNA를 페놀/클로로포름으로 2 회 추출하고, 클로로포름만으로 1 회 추출하였다. 용액은 5 mM EDTA, 10mM Tris pH 8, 0.5% SDS 및 프로티나제 K를 50 ㎍/ml 가 될 때까지 첨가하여 조정하였다. 반응물을 37℃에서 30 분간, 그 후 68℃에서 10 분간 항온배양하였다. 두번째 페놀/클로로포름 추출하였다. DNA는 1/10 부피의 3M 초산 나트륨 및 2.5 부피의 절대 에탄올의 첨가에 의해 침전시켰다(1 ㎕ 덱스트란 설페이트를 담체로서 첨가하였다). DNA를 -20℃에서 30 분간 유지하고, 에펜도르프 원심분리기에서 펠렛화하였다. 펠렛을 70% 에탄올에서 세척하고, 건조시키고, 17 ㎕의 물에 재현탁시켰다. 이 정제 공정은 Taq 폴리모라제가 DNA에 결합한 채로 남아 제한 효소 활성을 억제하는 문제를 극복한다.

iii)클로닝을 위한 Hind III 단편의 제조

pUC18과 Hind III 부위에 클로닝하기 위해 경쇄 DNA를 제한 효소 Hind III 로 처리하였다. 17 ㎕의 경쇄 DNA에, 2 ㎕의 완충액 B 및 1 ㎕의 고농도 Hind III를 첨가하고, 37℃에서 1 시간 항온배양하였다. 효소 처리물을 1% 아가로즈 겔에서 분리하고, 경쇄에 해당하는 밴드를 겔로부터 잘라냈다. “Prep-a-gene” 정제 키트(바이오래드 리미티드)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 DNA를 아가로즈로부터 정제하였다.

e) pUC18에 사이노몰구스 경쇄의 연결

하기 방법을 사용하여, 정제된 Hind III 단편을 pUC18의 Hind III 부위에 클로닝하였다 ; 20 ㎕의 사이노몰구스 DNA(80 ㎕과 부피로부터)를 1 ㎕의 Hind III-처리한 pUC18(50 ㎕/㎕, 파마시아), 3 ㎕ 리가제 완충액(베링거), 3 ㎕ T4 DNA 리가제(베링거) 및 3 ㎕ 증류수에 첨가하였다. 반응물을 15℃에서 3 시간 항온 배양하였다.

f) pUC18-κ 쇄에 의한 DH5 수용성 세포의 형질전환

이. 콜리 DH5_α최대 효율성 세포(BRL)를 경쇄 플라스미드로 형질전환시켰다. 100 ㎕의 세포를 -70℃ 로부터 서서히 해동시키고, 5 ㎕의 연결 반응물과 부드럽게 혼합하고, 얼음에서 30 분간 유지하였다. 세포들을 42℃에서 45 초간 항온 배양하고, 얼음에서 2 분간 냉각시켰다. 1 ml의 SOC 배지(리터당 20 g과 박토트립톤, 5 g의 효모 추출물, 0.5 g의 NaCl, 10 ml의 250 mM KCl, 5 ml의 2MMgCl, 20 mM 글루코스)를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 항온배양하였다. 형질전환 반응물을 100 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 5 개 LB 평판(LB 아가 평판 : 리터당 12 g의 트립톤, 24 g의 효모 추출물, 4 ml의 글리세롤, 100 ml의 포스페이트 완충액, 15 g의 박토-아가)에 깔고, 37℃에서 하루밤 동안 항온배양하였다. 콜로니 숫자를 평판마다 세고, 형질전환 효율을 계산하였다.

5 개 콜로니를 평판에서 취해 경쇄 삽입체의 존재를 PCR로 검사하였다. 각 콜로니를 65.5 ㎕의 증류수에 재현탁시키고, 표준 반응 혼합물에서 프라이머 250 및 301을 사용하여 PCR의 20 사이클에 적용시켰다. PCR 반응물을 전과같이 겔 상에서 전개시켰다. 5 개 콜로니중 4 개가 삽입체를 포함하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 클로닝이 성공적임을 나타낸다.

g) pUC18-κ 쇄의 플라스미드 미니프랩

5 개 형질전환 평판으로부터 20 개 콜로니를 취해 100 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 2 ml 부피의 L-브로쓰(L 브로쓰-LB 평판과 같고 아가만 없음)에 접종시켰다. 배양물을 교반하면서 37℃에서 하루밤 동안 항온배양하였다. 1.5 ml의 각 배양물을 회전시켜 세포 펠렛을 1 mg/ml 라이소자임을 함유한 200 ㎕의 STET(0.1 M NaCl, 10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM ENTA, 5% 트리톤-X-100)에 재현탁시켰다. 시험관들을 실온에서 5 분간 항온배양하고, 45초간 비등시키고, 10 분간 원심분리시켰다. 생성된 펠렛을 멸균 이쑤시개로 제거하고, 8 ㎕의 8% CTAB를 상층액에 첨가하였다. 시험관을 5 분간 원심분리시켜 플라스미드를 펠렛화하였다. DNA는 이어서 300 ㎕의 1.2 M 염화나트륨에서 와동에 의해 현탁시켰다. DNA를 750 ㎕ 에탄올의 첨가에 의해 침전시키고, 진공 건조시키고, 20 ㎕의 TE 완충액(TE-10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA)에 재현탁시켰다.

제한 효소 처리(Hind III 제한 효소 및 완충액 B-10 u/μl-베링거)에 의해 경쇄의 존재에 대해 미니프렙을 검사하였다. 2 ㎕의 각 DNA를 0.5 ㎕의 완충액 B, 1 ㎕의 증류수, 1 ㎕의 RNase A(500 ㎍/ml 베링거) 및 0.5 ㎕ Hind III에 첨가하였다. 효소 처리물을 37℃에서 1.5 시간 동안 항온배양하고, 1% 겔상에서 전개시켰다. 경쇄의 존재는 약 700 염기쌍의 단편에 의해 나타났다.

h) κ 경쇄의 서열 분석

시퀀싱 프라이머

M13 리버스 프라이머 - 폴리클로닝 부위의 하류의 pUC18과 -ve 가닥에 접합 - 파마시아에 의해 제공됨 ; 5′AACAGCTATGACCATG SEQ ID NO : 4

-40 포워드 프라이머 - 폴리클로닝 부위의 하류의 pUC18과 +ve 가닥에 접합 - USB에 의해 제공됨.

5′ GTTTTCCCAGTCACGAC SEQ ID NO : 5

299 - 인간 C_κ영역 프라이머

5′ GCGTCAGGGTGCTGCTGAGG SEQ ID NO : 6

106- 인간 C_κ영역 프라이머(5′ 단부)

5′ GGCGGGAAGATGAAGACAGA SEQ ID NO : 7

151 및 260 - 단계 C 및 D 참조

261- 인간 C_κ영역 프라이머

5′ TTCAGCAGGCACACAACAGA SEQ ID NO : 8

I) 전단계로부터 10 개 클론을 디데옥시쇄 종결 방법에 의한 서열 분석(클론 1,2,4,5,9,12,14,15,18 및 20)을 위해 선택하였다. 잔존하는 18 ㎕의 미니프렙 DNA를 2 ㎕ NaOH(2M)에 첨가하고, DNA를 변성시키기 위해 68℃에서 20 분간 가열시켰다. DNA를 냉각시키고, 드리아아이스상에 8 ㎕의 5M 초산암모늄(pH 5.4) 및 100 ㎕의 에탄올의 첨가에 의해 5 분간 침전시켰다. DNA를 펠렛화하고, 70% 에탄올에서 세척하고, 진공 건조시키고, 20 ㎕ 증류수에 재현탁시켰다.

DNA 분할물(7 ㎕)을 2 ㎕의 반응 완충액 및 1 ㎕의 적합한 프라이머에 첨가하고, 65℃에서 2 분간 항온배양하고, 프라이머와 주형을 접합하기 위해 30℃ 이하로 서냉시켰다. 전체 κ 경쇄를 서열 분석하기 위해 여러 가지 상이한 프라이머를 사용하는 것이 필요하였는데, 상세한 것은 상기한 바와 같다. 주형/프라이머에 1 ㎕ DTT(0.1 m USB), 2 ㎕의 표지화 혼합물(5×USB), 0.5 ㎕³⁵S-dATP(10 μ Ci/μl, 애머샴) 및 2 ㎕의 시쿼나제 효소를 첨가하였다. 반응 혼합물은³⁵S-표지된 리더 서열을 합성하기 위해 실온에서 5분간 항온배양시켰다. 표지화 반응이 완료되었을 때, 3.5 ㎕의 표지화 혼합물을 2.5 ㎕의 ddGTP, ddATP, ddTTP 및 ddCTP를 함유하는 멀티웰 평판의 4 개 웰에 첨가하였다. 쇄 종결 반응이 4 ㎕의 정지 용액을 각 웰에 첨가하기 전에 37℃에서 5 분간 진행되게 하였다. 반응물은 필요할 때까지 얼음에서 보관되었다.

8% 아크릴아미드 겔(BRL에 의해 제공되는 초고순도의 아크릴아미드 겔 혼합물-8)을 실리콘화된 유리 평판들 사이에 주입하고, 이동 완충액으로서(TBE(0.09 M TMS-보레이트 pH 8, 0.002 M EDTA)를 사용하여 1 시간 동안 40 mA에서 예비-이동시켰다. 웰들을 예비 이동 전후에 완충액으로 세척하여 기포 및 요소를 제거하였다. 겔에 적재하기 전에, 샘플을 95℃에서 2 분간 가열하고, 4 ㎕의 각 샘플을 겔에 적재하였다. 샘플을 40 mA에서 1.5 시간 동안 이동시키고, 겔에 2 차 적재 샘플을 가하고 1.5 시간을 더 이동시켰다. 이것은 각 세트의 샘플에 대해 짧은 이동 및 긴 이동을 제공하였다. 평판을 해체하고, 겔을 3MM 종이 시이트에 옮기기 전에 겔을 10% 아세트산/10% 메탄올에 위치시켰다. 겔을 80℃에서 1.5 시간 건조시키고, 실온에서 하루밤 X-선 필름에 노출시켰다. 자동 방사선 사진을 현상하고, 긴 이동 및 짧은 이동을 중첩하여 서열을 아래로부터 위로 읽었다.

j) 서열 데이터의 비교

10 개 클론의 완전한 경쇄 서열은 상이한 프라이머를 사용한 일련의 서열 분석 반응물을 이동시켜 얻었다. 서열 데이터의 비교는 제4도 - 제7도에 나타내었다. 클론 14 및 15는 절단된 경쇄 서열을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 주로 mRNA과 역전사 반응 또는 cDNA과 PCR 증폭에 의해 야기된 인공물인 것 같다. 적합한 효소가 읽을 수 없어서 부분 서열을 초래하는 2 차 구조를 mRNA 또는 cDNA 가 형성하였을 가능성이 있다. 클론 15는 그 동일성을 확인하기 위해 기지의 경쇄 서열과의 추가 비교를 위해 선택되었고, 누클레오티드 및 아미노산 상동성을 축정하기 위해 인간, 토끼 및 생쥐 경쇄와의 비교를 위해 선택되었는데, 그 결과는 표 4-7에 나타내었다.

사이노몰구스 경쇄 불변 영역은 인간 배선 C_κ유전자(하이어터, P.A. 등, 셀 22, 197(1980)). 생쥐 MOPC21 C_κmRNA(햄린, P.A. 등, Nucl. Acids Res. 9, 4485(1981)) 및 토끼 C_κmRNA(17D9, 맥카트니-프란시스 N. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1794, 1984)와 비교되었다. 사이노몰구스 가변 영역은 인간 림프구형 세포주 워커(클로벡, H.G. 등, Nucl. Acids. Res. 12, 6995, 1984)와 비교되었다. 이 세포주는 V_κ1 족에 속하며 J5 유전자 분절을 이용하는 경쇄 유전자를 발현시킨다. 17D9 토끼 서열은 S107A 생쥐 V_κ1 서열(콴, S.P. 등, J. Exp. Med. 153, 1366(1981))과 마찬가지로 사이노몰구스 가변 서열과 비교하는데 사용하였다. 이것은 생쥐 J1 유전자 분절을 이용하는 IgA κ 골수종에 결합하는 포스포콜린이다. 클론 15의 가변 영역 역시 인간 항체 도디(Daudi, 클로벡 1984)와 비교하였다. 이 경쇄 유전자는 V_κ1 족에 속하며, J5 유전자 분절을 사용한다. 사이노몰구스 항체 κ 경쇄 불변 영역 서열은 누클레오티드(91.6%) 및 아미노산(81.3%) 레벨에서 인간 C_κ유전자와 높은 상동성을 보인다. 생쥐 C_κ는 토끼보다 사이노몰구스 멍키 또는 인간 C_κ에 보다 더 상동성인 것 같았다. 그러나, 상동성 비율은 이간 및 멍키를 토끼 및 생쥐와 비교할 때 또는 진정하게는 토끼를 생쥐와 비교할 때 크게 다른 것 같지는 않았다.

표 5 및 6에는 클론 15의 각 골격 영역 및 각 CDR에 대한 상동성 비율을 나타내었다. 기대되는 바와 같이, 골격 영역은 상당한 가변성 영역인 CDR과 비교하여 종간에 비교적 보존되어 있다. 예를 들면, 클론 15는 골격 1 및 3에서는 인간과 90-96%의 아미노산 서열 상동성을 공유하지만, CDR3 내에서는 22%의 상동성만을 가진다. 클론 15는 특히 골격 1 및 3 내에서 워커 및 도디 인간 경쇄 서열과 고도의 상동성을 보이지만, 도디보다 워커에 대한 상동성이 보다 크다. 토끼 V_κ서열은 생쥐보다 인간 및 멍키 서열에서 더 높은 상동성을 보인다. 이것이 항-인간 항체에 대한 일부 반응이 아우치털로니 시험에서 토끼 혈청에 대해서는 나타나고, 생쥐 혈청에서는 반응이 나타나지 않는 이유를 설명할 수 있다.

[표 4]

[표 5]

[표 6]

Claims

(i) 목적 항체를 발현시킬 수 있는 영장류 림프구-유래 세포주를 선별하는 단계 ; (ii) 상기 세포주로부터 RNA를 분리하고, 그렇게 분리된 기타 RNA로부터 mRNA를 분리하는 단계 ; (iii) mRNA 로부터 cDNA를 합성하고, cDNA를 클로닝 벡터 속으로 삽입하는 단계 ; (iv) cDNA를 함유하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜 라이브러리를 얻는 단계 ; (v) 항체 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 유전자를 암호화하는 cDNA에 대해 상기 라이브러리를 검색(screening)하는 단계 ; (vi) 상기 유전자들을 암호화하는 cDNA를 발현 멕터속으로 삽입하는 단계 ; (vii)상기 cDNA를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 ; 및 (viii) 형질감염된 숙주 세포를 배양하고, 목적항체를 분리하는 단계를 포함하는, 재조합 영장류 항체의 생산방법.
제1항에 있어서, 영장류가 인간인 방법.
제1항에 있어서, 영장류가 침팬지 또는 구세계(유럽·아시아·아프리카) 멍키인 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 질병 상태로부터 경감중리거나 회복된 것으로 알려진 개인의 림프구로부터 생산된 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 병원성 유기체로 감염되었거나 또는 암이나 자가 면역 질병을 앓고 있는 것으로 알려져 있으나, 완전한 질병 증후를 나타내지 않는 개인의 림프구로부터 생산된 것인 방법.
제4항에 있어서, 개인이 비루스로 감염된 개인인 방법.
제5항에 있어서, 개인이 비루스로 감염된 개인인 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 항원으로 예방 접종되거나 접종되고, 항체 반응을 일으킨 개인의 림프구로부터 생산된 것인 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 안정화된, 즉 불사멸성인 것인 방법.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 세포주가 목적 항원에 대한 친화성을 가진 항체의 생산을 검색하므로써 선별된 것인 방법.
제10항에 있어서, 세포주가 항체 기능성에 대해 검색하므로써 추가로 선별된 것인 방법.
I) dir 1000 개 세포로부터 미세-RNA를 준비하는 단계 ; ii) 크기-선별된 cDNA 라이브러리를 형성하는 단계 ; iii) 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA에 대해 상기 라이브러리를 검색하고 상기 cDNA를 분리하는 단계 ; iv) 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA를 발현 벡터속으로 삽입하는 단계 ; v) cDNA를 함유하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계 ; 및 vi) 형질감염된 숙주 세포의 배양 및 목적 항체의 분리 단계를 포함하는 재조합 항체의 생산 방법.
영장류 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA를 포함하며, 숙주 세포의 형질감염에 적합한 벡터.
영장류 항체 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 cDNA 로 형질감염시킨 진핵 세포주.
영장류 항체 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA의 발현에 적합한 벡터(들)로 진핵 숙주 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는, 상기 cDNA의 발현 방법.