TW202118790A - 雙特異性抗體 - Google Patents

雙特異性抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW202118790A
TW202118790A TW109125604A TW109125604A TW202118790A TW 202118790 A TW202118790 A TW 202118790A TW 109125604 A TW109125604 A TW 109125604A TW 109125604 A TW109125604 A TW 109125604A TW 202118790 A TW202118790 A TW 202118790A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody
arm
Prior art date
Application number
TW109125604A
Other languages
English (en)
Inventor
柴山史朗
新坊拓也
手智也
馬克 索羅斯比
克夫 科尼利斯 阿德里安 迪
羅 彼得 福克 凡
林斯 克羅斯特
Original Assignee
日商小野藥品工業股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 日商小野藥品工業股份有限公司 filed Critical 日商小野藥品工業股份有限公司
Publication of TW202118790A publication Critical patent/TW202118790A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本發明之課題為提供一種用於對於自體免疫疾病等之預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療之新穎藥劑。
本發明之發明人等深入研究之結果，著眼於PD-1/CD3雙特異性抗體作為可解決相關課題之物質，確認此等為可減輕被稱為輸注反應或細胞激素釋放症候群之副作用表現之製劑。又，確認該雙特異性抗體具有容許PD-1及為其配位子之PD-L1相互作用之特徵，並且發現此等特徵對於自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療賦予增強或持續之效果。

Description

雙特異性抗體
本發明係有關可分別與PD-1及CD3特異性結合之雙特異性抗體(以下，簡稱為「PD-1/CD3雙特異性抗體」)或其抗體片段(以下，將此等合稱為「PD-1/CD3雙特異性抗體等」)、含有將此作為有效成分之醫藥組成物及此等之醫藥治療用途。
PD-1為屬於免疫球蛋白家族之免疫抑制受體，為具有抑制藉由來自抗原受體之刺激而被活化之T細胞之免疫活化信號之功能之分子。從PD-1剔除(knockout)小鼠之分析等明瞭PD-1信號係在自體免疫性擴張型心肌症、類狼瘡症候群、自體免疫性腦脊髓炎、全身性紅斑狼瘡、移植物對抗宿主疾病、I型糖尿病及風濕性關節炎等自體免疫疾病的抑制中扮演重要角色。因此，提出增強PD-1信號之物質可成為自體免疫疾病等之預防或治療劑。
至今，增強PD-1信號之物質已知有識別PD-1之雙特異性抗體(專利文獻1至3)。此雙特異性抗體係將識別屬於T細胞受體複合體成員之CD3的抗體抗原識別部位與識別PD-1的抗體抗原識別部位以基因工學連結而成者，藉由提昇PD-1位於T細胞受體複合體附近之頻率，而具有增強PD-1對T細胞受體複合體之抑制信號之作用。再者，於同專利文獻亦記載PD-1雙特異性抗體可 用於自體免疫疾病等之預防或治療。
此處，蛋白質製劑中，有於剛投予後表現被稱為輸注反應或細胞激素釋放症候群之副作用之虞，因而尋求減輕或抑制此等作用之製劑。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等可充分地減低成為此等副作用原因之投予後之細胞激素產生刺激，因此，期待成為可抑制有虞慮之副作用表現之醫藥。至今仍完全無報告具有此等特徵之雙特異性抗體。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2003/011911號說明書
[專利文獻2]國際公開第2004/072286號說明書
[專利文獻3]國際公開第2013/022091號說明書
本發明之目的為提供一種用以對自體免疫疾病等之預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療之新穎藥劑。
本發明之發明人等深入研究之結果，著眼於本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體作為可解決相關課題之物質，確認此等為可減輕稱為輸注反應或細胞激素釋放症候群之副作用表現之製劑，因而完成本發明。
再者，本發明之發明人等確認該PD-1/CD3雙特異性抗體等具有 容許PD-1及為其配位子之PD-L1之相互作用之特徵，發現此等特徵賦予增強或持續該PD-1/CD3雙特異性抗體等對於自體免疫疾病等之預防、症狀進展抑制、復發抑制或治療效果。
亦即，本發明為如下所述。
[1]一種PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性抗體(以下，對於此亦與前述同樣地簡稱為「PD-1/CD3雙特異性抗體」)或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂具有選自下列(A)至(E)之任一種VH：
(A)具有(a)由序列編號6之胺基酸序列構成之重鏈可變區域之互補性決定區域1(以下，將「重鏈可變區域之互補性決定區域1」簡稱為VH-CDR1)、
(b)由序列編號7之胺基酸序列構成之重鏈可變區域之互補性決定區域2(以下，將「重鏈可變區域之互補性決定區域2」簡稱為VH-CDR2)及
(c)由序列編號8之胺基酸序列構成之重鏈可變區域之互補性決定區域3(以下，將「重鏈可變區域之互補性決定區域3」簡稱為VH-CDR3)之重鏈可變區域(以下，將「重鏈可變區域」簡稱為「VH」)，
(B)具有(a)由序列編號9之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號10之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號11之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
(C)具有(a)由序列編號12之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號13之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號14之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
(D)具有(a)由序列編號15之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號16之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號17之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，及
(E)具有(a)由序列編號18之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號19之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號20之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；
與CD3特異性結合之第二臂為具有：
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
此處，與PD-1特異性結合之第一臂中之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之任一個或複數個VH-CDR中，各者之任意1至5個胺基酸殘基可經其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)置換及/或與CD3特異性結合之第二臂中之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之任一個或複數個VH-CDR中，各者之任意1至5個胺基酸殘基可經其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)置換。
[2]如前項[1]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂具有選自下列(A)至(E)之任一種VH：
(A)具有(a)由序列編號6之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號7之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號8之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
(B)具有(a)由序列編號9之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號10之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號11之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
(C)具有(a)由序列編號12之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號13之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號14之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
(D)具有(a)由序列編號15之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號16之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號17之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，及
(E)具有(a)由序列編號18之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號19之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號20之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；
與CD3特異性結合之第二臂具有：
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH。
[3]如前項[1]或[2]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，
(i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH係具有
(a)由序列編號6之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號7之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號8之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
(ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH係具有
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
[4]如前項[1]或[2]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，
(i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH係具有
(a)由序列編號9之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號10之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號11之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
(ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH係具有
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
[5]如前項[1]或[2]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，
(i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH係具有
(a)由序列編號12之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號13之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號14之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
(ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH係具有
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
[6]如前項[1]或[2]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，
(i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH係具有
(a)由序列編號15之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號16之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號17之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
(ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH係具有
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
[7]如前項[1]或[2]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，
(i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH係具有
(a)由序列編號18之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號19之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號20之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
(ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH係具有
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
[8]一種PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂具有：
(a)由HYJ1LH表示之胺基酸序列[序列中，J1表示G(甘胺酸)或A(丙胺酸)，此處，以J1表示者或其他字母分別代表各胺基酸之一字母簡稱]構成之VH-CDR1、
(b)由WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG表示之胺基酸序列[序列中，J2表示L(白 胺酸)或I(異白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)或G(甘胺酸)，X2表示F(苯丙胺酸)或Y(酪胺酸)，此處，J2、U2及X2所分別表示者或其他字母分別與上述同意義]構成之VH-CDR2及
(c)由GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V表示之胺基酸序列[序列中，J3表示M(甲硫胺酸)或L(白胺酸)，U3表示H(組胺酸)或Y(酪胺酸)，X3表示F(苯丙胺酸)或Y(酪胺酸)，Z3表示D(天冬胺酸)或E(麩胺酸)，此處，J3、U3、X3及Z3所分別表示者或其他字母分別與上述者同意義]構成之VH-CDR3之VH及與CD3特異性結合之第二臂具有
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH。
[9]如前項[8]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，(a)J1表示G(甘胺酸)，J2表示L(白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)，X2表示F(苯丙胺酸)，J3表示M(甲硫胺酸)，U3表示H(組胺酸)，X3表示F(苯丙胺酸)及Z3表示D(天冬胺酸)；
(b)J1表示G(甘胺酸)，J2表示I(異白胺酸)，U2表示G(甘胺酸)，X2表示Y(酪胺酸)，J3表示(白胺酸)，U3表示H(組胺酸)，X3表示Y(酪胺酸)及Z3表示E(麩胺酸)；
(c)J1表示A(丙胺酸)，J2表示L(白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)，X2表示Y(酪胺酸)，J3表示M(甲硫胺酸)，U3表示Y(酪胺酸)，X3表示Y(酪胺酸)及Z3表示D(天冬胺酸)；或
(d)J1表示A(丙胺酸)，J2表示L(白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)，X2表示F(苯 丙胺酸)，J3表示M(甲硫胺酸)，U3表示H(組胺酸)，X3表示F(苯丙胺酸)及Z3表示D(天冬胺酸)。
[10]如前項[1]至[9]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH之架構(framework)(以下，將「架構」簡稱為FR)區域中，架構1(以下，簡稱為FR1)、架構2(以下，簡稱為FR2)及架構3(以下，簡稱為FR3)區域分別對應於生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1或於其受到體細胞突變之該基因所編碼之胺基酸序列。
[11]如前項[10]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH之架構4(以下，將「架構4」簡稱為FR4)區域係由生殖細胞系列型J基因JH6c或於其受到體細胞突變之該基因所編碼之胺基酸序列(惟排除VH-CDR3區域含有之胺基酸序列)構成。
[12]如前項[10]或[11]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH之FR區域包含FR1區域，該FR1區域係由可接受生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1之體細胞突變之該基因所編碼，藉由該體細胞突變，序列編號21之胺基酸序列中位置13之離胺酸被置換為麩醯胺酸，位置16之丙胺酸被置換為纈胺酸，位置19之離胺酸被置換為甲硫胺酸，或者是，經該等之任意複數組合置換或可置換。
[13]如前項[10]至[12]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH之FR區域包含FR2區域，該FR2區域係由可接受生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1之體細胞突變之該基因所編碼，藉由該體細胞突變，序列編號21之胺基酸序列中位置37之纈胺酸經置換或可置換為白胺酸。
[14]如前項[10]至[13]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH之FR區域包含FR3區域，該FR1區域係由可接受生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1之體細胞突變之該基因所編碼，藉由該體細胞突變，序列編號21之胺基酸序列中位置77之絲胺酸被置換為蘇胺酸或位置84之半胱胺酸被置換為絲胺酸或天冬醯胺酸，或者是，經該等任意複數組合置換或可置換。
[15]如前項[10]至[14]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH之FR4區域係由可接受生殖細胞系列型J基因JH6c之體細胞突變之該基因(惟排除編碼VH-CDR3區域之基因區域)編碼，其FR4區域之胺基酸序列(Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser)(序列編號41)中之離胺酸(Lys)被置換或可被置換為麩醯胺酸或天冬醯胺酸，及/或＊印之蘇胺酸(Thr)置換或可置換為白胺酸。
[16]如前項[1]至[15]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列、或與該VH之胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列構成。
[17]如前項[1]及[3]至[7]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成。
[18]如前項[1]至[17]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列、或與該VH之胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列 構成。
[19]如前項[1]及[3]至[18]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
[20]如前項[1]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
[21]一種PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段，其中，
與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列、或與該VH胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列構成，
與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列、或與該VH之胺基酸序列至少80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列構成。
[22]如前項[1]或[3]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由序列編號1之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
[23]如前項[1]或[4]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由序列編號2之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂之VH由序列編號36之胺基酸序列構成。
[24]如前項[1]或[5]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與 PD-1特異性結合之第一臂之VH係由序列編號3之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
[25]如前項[1]或[6]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由序列編號4之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
[26]如前項[1]或[7]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由序列編號5之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
[27]如前項[1]至[26]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂及/或與CD3特異性結合之第二臂分別具有輕鏈可變區域(以下，將「輕鏈可變區域」簡稱為「VL」)，該VL係具有
(a)由序列編號26之胺基酸序列構成之輕鏈可變區域之互補性決定區域1(以下，將「輕鏈可變區域之互補性決定區域1」簡稱為VL-CDR1)、
(b)由序列編號27之胺基酸序列構成之輕鏈可變區域之互補性決定區域2(以下，將「輕鏈可變區域之互補性決定區域2」簡稱為VL-CDR2)及
(c)由序列編號28之胺基酸序列構成之輕鏈可變區域之互補性決定區域3(以下，將「輕鏈可變區域之互補性決定區域3」簡稱為VL-CDR3)。
[28]如前項[1]至[27]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂及/或與CD3特異性結合之第二臂分別具有由序列編號25之胺基酸序列構成之VL。
[29]一種PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段，並且 具有
(A)與PD-1特異性結合之第一臂具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL，及
(B)與CD3特異性結合之第二臂具有由序列編號36之胺基酸序列構成之VH及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL。
[30]一種PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該與PD-1特異性結合之第一臂係與下列者對PD-1之結合進行交叉競爭：(1)與PD-1特異性結合之第一臂之PD-1，其係具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；或(2)與PD-1特異性結合之單株抗體可變區域，其係由該VH及VL構成。
[31]一種PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性抗體或其抗體片段，其中，利用該與PD-1特異性結合之第一臂進行對PD-1之結合係與下列者進行交叉競爭：(1)與PD-1特異性結合之第一臂，其係具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；或(2)與PD-1特異性結合之單株抗體之可變區域，其係由該VH及VL構成。
[32]如前項[30]或[31]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該與CD3特異性結合之第二臂係更與下列者對CD-之結合進行交叉競爭：(1)與 CD3特異性結合之第二臂，其係具有由序列編號36之胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；或(2)與CD3特異性結合之單株抗體的可變區域，其係由該VH及VL構成。
[33]如前項[30]或[31]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂係具有
(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
(b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
(c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH。
[34]如前項[30]、[31]及[33]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列或與該VH之胺基酸序列至少有80%、90%、95%、98%或99%相同之胺基酸序列構成。
[35]如前項[30]或[31]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
[36]如前項[30]、[31]及[33]至[35]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂係具有VL，該VL具有
(a)由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、
(b)由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及
(c)由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3。
[37]如前項[30]、[31]及[33]至[35]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂係具有由序列編號25之胺基酸序列構成之VL。
[38]如前項[1]至[37]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，PD-1/CD3雙特異性抗體為IgG抗體。
[39]如前項[38]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，前項[38]所述之IgG抗體為IgG1抗體或IgG4抗體。
[40]如前項[38]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，前項[38]所述之IgG抗體為IgG1抗體。
[41]如前項[38]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，前項[38]所述之IgG抗體為IgG4抗體。
[42]如前項[40]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，該IgG1抗體對Fc受體之結合係經消失或減弱。
[43]如前項[40]或[42]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，於前項[40]所述之IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中EU編號系統第235號之白胺酸分別被置換為甘胺酸、及/或第236號之甘胺分別被置換為精胺酸。
[44]如前項[40]、[42]或[43]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，於具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈恆定區域中EU編號系統第351號之白胺酸及第366號蘇胺酸一起被置換為離胺酸，於具有CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈恆定區域中第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸。
[45]如前項[40]、[42]或[43]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，於具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈恆定區域中EU編號系統第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸，於具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈恆定區域中，第351號之白胺 酸及第366號之蘇胺酸一起被置換為離胺酸。
[46]如前項[40]及[42]至[45]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，前項[40]及[42]至[45]中任一項所述之IgG1抗體2個重鏈恆定區域中分別缺失EU編號系統第447號之離胺酸。
[47]如前項[38]至[46]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，對胎兒性Fc受體(以下，簡稱為「FcRn」)之結合經消失或減弱。
[48]如前項[40]、[42]至[47]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，於該IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中之(1)EU編號系統第252號之甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸，(2)EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸、及/或(3)EU編號系統第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸。
[49]如前項[40]、[42]至[48]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，於該IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中EU編號系統第252號之甲硫胺酸被置換為天冬胺酸。
[50]如前項[48]或[49]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，前項[48]或[49]所述之IgG1抗體於血液中之半衰期比該胺基酸未經置換之原本抗體更為縮短。
[51]如前項[48]或[49]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，相較於該胺基酸未經置換之原本抗體比較，前項[48]或[49]所述之IgG1抗體於血液中之半衰期縮短至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
[52]如前項[41]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，於前項[41]所述之IgG4抗體之2個重鏈恆定區域中EU編號系統第228號之絲胺酸分 別被置換為脯胺酸。
[53]如前項[1]至[38]、[40]、[42]、[43]及[45]至[51]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈，係包含由選自序列編號23、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域。
[54]如前項[1]至[38]、[40]、[42]、[43]、[45]至[51]及[53]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈，係包含由選自序列編號24、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域。
[55]如前項[1]至[54]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，具有與PD-1特異性結合之第一臂之VL之輕鏈及/或具有與CD3特異性結合之第二臂之VL之輕鏈，係包含由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域。
[56]一種PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂，其中，
(A)具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈，係包含由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及由選自序列編號23、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域，
(B)具有與PD-1特異性結合之第一臂之VL之輕鏈，係包含由序列編號25之胺基酸序列構成之VL及由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域，
(C)具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈，係包含由選自序列編號36之胺基酸序列構成之VH，及由選自序列編號24、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域，及
(D)具有與CD3特異性結合之第二臂之VL之輕鏈包含由序列編號25之胺基酸序列構成之VL及由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域。
[57]如前項[1]至[56]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係分別與表現於標的細胞之PD-1及CD3特異性結合。
[58]如前項[1]至[57]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂容許PD-1及PD-L1間之相互作用。
[59]如前項[1]至[58]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，係於投予中或從投予起24小時以內，充分地減低細胞激素產生。
[60]如前項[1]至[57]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂容許PD-1及PD-L1間之相互作用，並且，充分地減低細胞激素產生。
[61]如前項[59]或[60]所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，細胞激素至少為IL-2、IFN-γ或TNF-α。
[62]如前項[1]至[61]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，PD-1及CD3分別為人類PD-1及人類CD3。
[63]如前項[1]至[62]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片 段，其中，CD3為CD3ε。
[64]如前項[1]至[63]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，PD-1/CD3雙特異性抗體為單株抗體。
[65]如前項[1]至[64]中任一項所述之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段，其中，PD-1/CD3雙特異性抗體為單離抗體。
[1-1]一種醫藥組成物，係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分。
[1-2]如前項[1-1]所述之醫藥組成物，係更含有藥學上容許之載體。
[2-1]一種自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分。
[2-2]如前項[2-1]所述之劑，其中，自體免疫疾病為貝賽特氏症(Behçet's disease)、全身性紅斑性狼瘡、慢性圓板狀紅斑性狼瘡、多發性硬化症、系統性硬皮症、進行性系統性硬化症、硬皮症、多發性肌炎、皮膚肌炎、結節性動脈周圍炎(結節性多發動脈炎、顯微鏡性多發血管炎)、大動脈炎症候群(高安動脈炎(Takayasu arteritis))、惡性類風濕性關節炎、類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、脊椎關節炎、混合性結締組織病、卡斯爾曼症(Castleman disease)、修格蘭氏症候群(Sjögren's syndrome)、成人史迪爾氏病(Adult Still's disease)、血管炎、過敏性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、類風濕性血管炎、大型血管炎、抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA，antineutrophil cytoplasmic antibody)相關血管炎(例如肉芽腫性多血管炎及嗜酸性球性肉芽腫性多血管炎)、柯根症候群(Cogan's syndrome)、RS3PE症候群(Remitting Seronegative Symmetrical Synovitis with Pitting oedema)、 顳動脈炎、風濕性多發肌痛症、纖維肌痛症、抗磷脂質抗體症候群、嗜酸性球性肌膜炎、IgG4關連疾病(例如原發性硬化性膽道炎、自體免疫性胰臟炎等)、格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)、重症肌無力症、慢性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、原發性膽汁性肝硬變、古德巴斯捷氏症候群(Goodpasture's syndrome)、快速進行性腎絲球腎炎(Rapid Progressive Glomeluronephritis)、狼瘡腎炎、巨紅血球貧血、自體免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自體免疫性嗜中性球減少症、特發性血小板減少性紫斑病(Idiopathic thrombocytopenic purpura)、巴塞多氏病(Basedow’s disease)(葛瑞夫茲病(Graves disease)(甲狀腺機能亢進症))、橋本氏病、自體免疫性腎上腺機能不全、原發性甲狀腺機能低下症、愛迪生氏病(Addison's disease)(慢性腎上腺機能減退症)、特發性愛迪生氏病、I型糖尿病、緩進行性I型糖尿病(成人潛在性自體免疫性糖尿病)、局部性硬皮症、乾癬、乾癬性關節炎、水疱性類天疱瘡(Bullous pemphigoid)、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線狀IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症(epidermolysis bullosa acquisita)、圓形禿、白斑、尋常性白斑、視神經脊髓炎、慢性炎症性脫髓性多發神經炎、多灶性運動神經病、類肉瘤病、巨細胞性動脈炎、肌萎縮性側索硬化症、原田氏症、自體免疫性視神經症、特發性無精子症、習慣性流產、炎症性腸疾病(例如潰瘍性大腸炎、克隆氏症(Crohn's disease))、乳糜瀉病(coeliac disease)、僵直性脊椎炎、重症氣喘、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、嗜酸性球性副鼻腔炎、擴張型心肌症、全身性肥大細胞增生症或包涵體肌炎。
[2-3]一種移植物對抗宿主疾病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗 體片段作為有效成分。
[2-4]一種I型糖尿病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，並且，與選自下列任一種以上之藥劑一起投予：胰島素製劑(例如人類胰島素、甘精胰島素(Insulin Glargine)、賴脯胰島素(insulin lispro)、地特胰島素(Insulin Detemir)、門冬胰島素(Insulin Aspart)等)、磺醯基尿素劑(例如格列苯脲(Glibenclamide)、格列齊特(Gliclazide)、格列美脲(Glimepiride)等)、速效型胰島素分泌促進藥(例如那格列奈(Nateglinide)等)、雙胍類製劑(例如二甲雙胍(Metformin)等)、胰島素抵抗性改善藥(例如吡格列酮(Pioglitazone)等)、α-葡萄糖苷酶抑制藥(例如阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)等)、糖尿病性神經症治療藥(例如依帕司他(Epalrestat)、脈息禮延(Mexiletine)、咪達普利(Imidapril)等)、GLP-1類似物製劑(例如利拉魯肽(Liraglutide)、艾塞那肽(Eexenatide)、利西拉來(Lixisenatide)等)及DPP-4阻礙劑(例如西格列汀(Sitagliptin)、維格列汀(Vildagliptin)、阿格列汀(Alogliptin)等)。
[2-5]一種多發性硬化症之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，並且，與選自下列任一種以上之藥劑一起投予：類固醇藥(例如可體松(Cortisone)、乙酸可體松、氫化可體松、氫化可體松磷酸鈉、氫化可體松琥珀酸鈉、氟氫可體松乙酸酯、去氫皮質醇(prednisolone)、去氫皮質醇乙酸酯、去氫皮質醇琥珀酸鈉、丁基乙酸去氫皮質醇、去氫皮質醇磷酸鈉、鹵潑尼松(Halopredone)乙酸酯、甲基去氫皮質醇、甲基去氫皮質醇乙酸酯、甲基去氫皮質醇琥珀酸鈉、去炎松(Triamcinolone)、乙酸去炎松、去炎松縮酮、地塞米松(dexamethasone)、 地塞米松乙酸酯、地塞米松戊酸酯、地塞米松培酸酯、地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松丙酸酯、地塞米松磷酸鈉、地塞米松間磺基苯甲酸酯鈉、對氟米松(Paramethasone)、對氟米松乙酸酯、倍他米松(Betamethasone)、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松乙酸酯、倍他米松丁酸酯丙酸酯及倍他米松磷酸鈉等)、干擾素β-1a、干擾素β-1b、乙酸格拉替雷(Glatiramer Acetate)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、環孢素(ciclospolin)、胺甲蝶呤(Methotrexate)、克拉屈濱(Cladribine)、促腎上腺皮質素(ACTH)、促皮質素(corticotropin)、咪唑立賓(Mizoribine)、他克莫司(Tacrolimus)、芬戈莫德(Fingolimod)及阿侖單抗(Alemtuzumab)。
[2-6]一種全身性紅斑性狼瘡之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，其係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，並且，與選下列任一種以上藥劑一起投予：類固醇藥(例如前項[2-5]所述之類固醇藥)、免疫抑制劑(例如環孢素、他克莫司、芬戈莫德等)及貝利木單抗(Belimumab)。
[2-7]一種類風濕性關節炎之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，其係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分，並且，與選自下列任一種以上藥劑一起投予：類固醇藥(例如前項[2-5]所述之類固醇藥)、抗風濕藥(例如胺甲蝶呤、柳胺磺胺吡啶、布西拉明(Bucillamine)、來氟米特(Leflunomide)、咪唑立賓、他克莫司等)、抗細胞激素藥(例如英利昔單抗(Infliximab)、阿達木單抗(Adalimumab)、特昔利單抗(Tocilizumab)、依那西普(Etanercept)、戈利木單抗(Golimumab)、賽妥珠單抗(Certolizumab)及阿巴西普(Abatacept)。
[2-8]一種自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，其係與前項[2-4]至[2-7]列舉之任一種以上的藥劑一起投予，並且，含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段作為有效成分。
[2-9]如前項[2-4]至[2-8]所述之各疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，其係對患者投予前項[2-4]至[2-7]列舉之任一種以上的藥劑。
[2-10]如前項[2-4]至[2-8]所述之各疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，其係於前項[2-4]至[2-7]列舉之任一種以上的藥劑投予後進行投予。
[2-11]如前項[2-4]至[2-8]所述之各疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，其係於前項[2-4]至[2-7]列舉之任一種以上的藥劑前進行投予。
[3-1]一種靜脈內注射用製劑，係含有選自前項[1]至[65]中任一項之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段及藥學上容許之載體。
[3-2]如前項[3-1]所述之靜脈內注射用製劑，係用於自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療。
[3-3]如前項[3-1]或[3-2]所述之靜脈內注射用製劑，係點滴用。
[4-1]一種自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療方法，係包含對患者投予有效量之選自前項[1]至[65]中任一項之該雙特異性抗體或其抗體片段。
[4-2]如選自前項[1]至[65]中任一項之該雙特異性抗體或其抗體片段，係使用於自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療。
[4-3]一種選自前項[1]至[65]中任一項之該雙特異性抗體或其抗體片段之用途，係用於用以製造自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療之醫藥。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體由於可減低誘導細胞激素之產生，故可期待可抑制投予後之輸注反應或細胞激素釋放症候群之表現。又，容許PD-1及PD-L1間相互作用之特徵，係可期待賦予增強或持續其之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療效果。
圖1表示共同輕鏈之VL及恆定區域之胺基酸序列。
圖2表示共同輕鏈之VL各CDR之胺基酸序列。
圖3表示由生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1及IGHV3-33所分別編碼之胺基酸序列。
圖4表示與PD-1特異性結合之抗體(以下，簡稱為抗PD-1抗體)各殖株之VH及生殖細胞系列型基因IGHV7-4-1及JH6c之序列比對。圖中，各殖株之胺基酸序列中之“-”表示與對應之生殖細胞系列型基因IGHV7-4-1或JH6c之胺基酸序列為相同之胺基酸，胺基酸簡字記載之部分表示與同生殖細胞系列型基因之胺基酸序列不同之胺基酸。
圖5表示抗PD-1抗體各殖株之VH之胺基酸序列。
圖6表示抗PD-1抗體各殖株之VH中各CDR之胺基酸序列。
圖7表示與CD3特異性結合之抗體(以下，簡稱為抗CD3抗體)殖株CD3-2之VH之胺基酸序列。
圖8表示抗CD3抗體殖株CD3-2之VH中各CDR之胺基酸序列。
圖9表示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各重鏈恆定區域之胺基酸序列。
圖10表示於WO2005/118635記載之抗CD3抗體殖株15C3之VH之胺基酸序列。此外，以底線表示之胺基酸表示於製作殖株CD3-1中變換為丙胺酸之第55號之甘胺酸。
圖11表示對於PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株之PD-1及CD3之結合活性分別經確認之Biacore(註冊商標)測定結果。
圖12表示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株對PD-1及CD3之同時結合性經確認之流式細胞術。
圖13表示於PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株對PD-1/PD-L1相互作用之影響經確認之流式細胞術。
圖14表示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株對於從活化人類T細胞產生IFN-γ之作用結果。此外，圖中之「Ctrl」表示對照組。
圖15表示於實驗性過敏性腦脊髓炎小鼠模型(EAE模型)，PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株(PD1-1(Bi)、PD1-2(Bi))之治療效果。
圖16表示於實驗性過敏性腦脊髓炎小鼠模型，PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株(PD1-3(Bi)、PD1-4(Bi))之治療效果。
圖17表示於實驗性過敏性腦脊髓炎小鼠模型，PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株(PD1-5(Bi)、PD1-6(Bi))之治療效果。
圖18表示PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株對於從人類末梢血單核細胞產生細胞激素之作用結果。
圖19表示PD1-5(Bi)對於在PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株對PD-1之結合之交叉競爭性。
圖20表示於末梢血單核球細胞移植小鼠模型，PD-1/CD3雙特異性單株抗體之作用結果。圖中，「*」、「**」及「***」表示藉由與比較對象之t檢定，分別為p<0.05、p<0.01及p<0.001，為有意義。
圖21表示於小鼠抗體產生模型，PD-1/CD3雙特異性單株抗體之作用結果。圖中，「*」及「**」表示於各評估日藉由與對照組之t檢定，各個為p<0.05及p<0.01，為有意義。
圖22表示於自然發症糖尿病模型小鼠，PD-1/CD3雙特異性單株抗體之治療效果。
圖23表示利用Biacore(註冊商標)評估PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株PD1-5(Bi)及Mut1至Mut3之人類FcRn結合性之結果。
圖24表示利用Biacore(註冊商標)評估PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株Mut4至Mut6之人類FcRn結合性之結果。
圖25表示利用Biacore(註冊商標)評估PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株PD1-5(Bi)、Mut1及Mut4之小鼠FcRn結合性之結果。
圖26表示於EAE模型，PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株Mut4之治療效果。圖中，「**」表示藉由Wilcoxon順位和檢定(正確法)，p<0.01為有意義。
PD-1(程序性細胞死亡1(Programmed Cell Death-1)為於人類，由以GenBank登錄編號NP_005009表示之胺基酸序列構成之膜型蛋白質。於本說明書中以「PD-1」記載時在無特別限定下，亦有作為包含其所有同型體及保存本發 明之「與PD-1特異性結合之第一臂」之抗原決定位之此等改變體使用之情況。於本發明，PD-1較佳為人類PD-1。
CD3為與T細胞受體締合形成T細胞受體複合體之膜型蛋白質。於本說明書中以「CD3」記載時在無特別限定下，亦有作為包含其亞型(ε、δ、γ及ζ亞型)及保存本發明之「與CD3特異性結合之第二臂」之抗原決定位之此等改變體使用之情況。於本發明，CD3較佳為CD3ε或為人類CD3，更佳為人類CD3ε。
於本說明書中，「單離」係指從由宿主細胞萃取之含有複數或無數成分之夾雜物中藉由鑑定、分離及/或精製，成為實質上為單一之純粹成分。
於本說明書中，「單株抗體」係指從對同一特定之抗原結合且實質上為均勻之抗體集團獲得之抗體。
於本說明書，「雙特異性抗體」係指將於一分子中具備對於二種不同抗原分子或抗原決定位之結合特異性之抗體，「雙特異性單株抗體」係指從實質上為均勻之抗體集團獲得之雙特異性抗體。
本發明係有關可與PD-1及CD3各個特異性結合之雙特異性抗體(於本說明書，亦簡稱為PD-1/CD3雙特異性抗體)。於本發明，PD-1/CD3雙特異性抗體較佳為PD-1/CD3雙特異性單株抗體，更佳為單離PD-1/CD3雙特異性單株抗體，再佳為單離人類PD-1/人類CD3雙特異性單株抗體。此處，「單離人類PD-1/人類CD3雙特異性單株抗體」係指對於人類PD-1及人類CD3之經分離之雙特異性單株抗體。
此處，雙特異性抗體之形態有例如雙價抗體、雙特異性sc(Fv)2、雙特異性微抗體、雙特異性F(ab')2、雙特異性雜交抗體、共價型雙價抗體(雙特 異性DART)、雙特異性(FvCys)2、雙特異性F(ab'-zipper)2、雙特異性(Fv-zipper)2、雙特異性三鏈抗體、雙特異性mAb2、Addbody(註冊商標)及Mirabody(註冊商標)等。
雙價抗體為識別不同抗原之VH、VL之間以肽連結基連結而成之單鏈肽之二聚體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993),Vol.90,No.14：p.6444-6448)。
雙特異性sc(Fv)2為識別不同抗原之2種抗體的2組VH/VL以隔著肽連結基產生連續之單鏈形態之方式，而經改變之低分子化抗體(參照J.Biological Chemistry(1994),Vol.269：p.199-206)。
雙特異性F(ab')2為識別不同2種抗原之抗體之Fab'片段藉由二硫鍵等而經共價鍵結之低分子化抗體。
雙特異性微抗體為將低分子抗體片段藉由其CH3結構域上之二硫鍵等而經共價鍵結之低分子化抗體，該低分子抗體片段係以使識別各個不同抗原之scFv與恆定區域CH3結構域連結之方式而經改變者(參照Biochemistry(1992),Vo.31,No.6,p.1579-1584)。
雙特異性雜交抗體為識別不同之二種抗原之抗體之重鏈/輕鏈複合體藉由二硫鍵等而經共價鍵結之完整之抗體。
於本發明，較佳之雙特異性抗體之形態為雙特異性雜交抗體。
雙特異性雜交抗體可從例如以雜交雜交瘤法(參照US4474893)製作之雜交瘤產生。又，可使分別編碼識別不同抗原之抗體之重鏈及輕鏈的合計4種類之cDNA於哺乳動物細胞共表現且分泌而製造。
於本發明使用之單株抗體可以雜交瘤法(參照例如Kohler及Milstein人等，Natur(1975)，Vol.256,p.495-97、Hongo人等之Hybridoma(1995),Vol.14,No.3,p.253-260、Harlow人等之Antibodies：A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988),Vol.2)及Hammerling人等之Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,p.563-681(Elsevier,N.Y.,1981))、重組DNA法(參照例如US4816567)、噬菌體展示方法(參照例如Ladner人等之US5223409、US5403484及US5571698，Dower人等之US5427908及US5580717、McCafferty人等之US5969108及US6172197及Griffiths人等之US5885793、US6521404、US6544731、US6555313、US6582915及US6593081)製作。
對人類投予抗體或單株抗體時，為了使其抗原性減低或消失，可以嵌合體抗體、人類化抗體或完全人類型抗體之形態製作。
「嵌合體抗體」係指可變區域序列及恆定區域序列源自各別哺乳動物之抗體，例如可變區域序列源自小鼠抗體，恆定區域序列源自人類抗體。嵌合體抗體可將從以上述之雜交瘤法、重組DNA法或噬菌體展示方法單離之抗體產生雜交瘤藉由公知之手法單離出編碼抗體可變區域之基因，將該基因使用公知之方法與編碼源自人類之抗體恆定區域編碼之基因連結而製作(參照例如Cabilly人等之US4816567)。
「人類化抗體」係指將源自如小鼠之其他哺乳動物之生殖細胞型之互補性決定區域(CDR)序列移植到人類架構(Framework)序列上之抗體。於人類化抗體時，亦可從以上述方法單離之抗體產生雜交瘤藉由公知之手法單離出編碼抗體CDR區域之基因，將該基因使用公知之方法，與編碼源自人類之抗體 架構區域之基因連結而製作(參照例如Winter之US5225539及US5530101、Queen人等之US5585089號及US6180370)。
「人類抗體」或「完全人類型抗體」係指由架構區域及CDR區域構成之可變區域及恆定區域兩者皆為源自人類生殖細胞型免疫球蛋白序列之抗體。於本發明中使用之人類抗體係可以使用如產生人類抗體之經轉形(Transformation)之小鼠，例如使用Humab小鼠(參照例如Lonberg及Kay人等之US5545806、US5569825、US5625126、US5633425、US5789650、US5877397、US5661016、US5814318、US5874299及US5770429)、KM小鼠(參照例如Ishida人等之WO2002/43478)、Xeno小鼠(參照例如US5939598、US6075181、US6114598、US6150584及US6162963)或Tc小鼠(參照例如Tomizuka人等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000),p.722-727)之方法製作。又，亦可使用如藉由免疫引起人類抗體應答之方式將人類免疫細胞再構築之SCID小鼠(參照例如Wilson中等之US5476996及US5698767)調製。再者，於本發明中使用之人類抗體亦可以上述之噬菌體展示方法製作。
於本說明書，PD-1/CD3雙特異性抗體之「抗體片段」為全長抗體之一部分，為具有對於PD-1之抗原結合部分及對於CD3之抗原結合部分之抗體，可列舉例如F(ab')2等。此處，抗原結合部分係指抗體可與其抗原結合之最少單位，例如，以藉由在VH及VL具有分別各3個CDR及此等CDR之組合而可識別目標抗原之方式，由配置CDR之架構區域構成。
於本說明書，「共同輕鏈」係指與不同之2種以上重鏈締合，且可對於各個抗原顯示結合能力之輕鏈(De Wildt RM人等，J.Mol.Biol.(1999),Vol.285,p.895-901、De Kruif人等，J.Mol.Biol.(2009),Vol.387,p.548-58、 WO2004/009618、WO2009/157771及WO2014/051433)。如此之共同輕鏈較佳為例如藉由人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01(根據IMGT數據庫命名法)生殖細胞系列型基因所編碼之輕鏈(以下，亦簡稱為IGVK1-39/JK1共同輕鏈)，更佳為例如具有VL之該輕鏈，該VL含有由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3，再佳為例如具有由序列編號25之胺基酸序列構成之VL之該輕鏈。又，共同輕鏈之恆定區域較佳可列舉由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域。圖1表示於本發明使用之共同輕鏈之VL及恆定區域之各個胺基酸序列，圖2表示其可變區域之各CDR之胺基酸序列。
於本說明書，「同型」係作為稱為藉由重鏈恆定區域基因而被編碼之抗體種類(class)(例如IgM或IgG)者使用。本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體較佳之同型為IgG，更佳為IgG1或IgG4。此處，IgG1較佳為對Fc受體(例如Fcγ受體)之結合經消失或減弱者。具體而言，藉由置換、缺失或插入其重鏈恆定區域之任意胺基酸，可獲得對Fc受體之結合消失或減弱之IgG1抗體。可列舉例如：於雙特異性抗體之分別二個重鏈恆定區域或鉸鏈區域上，EU編號系統第235號之白胺酸被置換為甘胺酸及/或第236號之甘胺酸被置換為精胺酸之抗體。又，為了減低抗體之不均勻性，較佳為缺失C末端之胺基酸，例如EU編號系統第447號之離胺酸之抗體。再者，為了縮短於血液中之半衰期，特佳為對FcRn之結合經消失或減弱者。具體而言，藉由置換或缺失屬於重鏈恆定區域中之FcRn結合部位之胺基酸，可使對同受體之結合消失或減弱，為IgG1抗體時，此等抗體可列舉例如(1)EU編號系統第252號之甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸、(2)EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸及/或 (3)EU編號系統第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸者。另一方面，雙特異性抗體為IgG4時，更佳為如抑制抗體分子內調換(swapping)之方式，其重鏈恆定區域之任意胺基酸經置換、缺損或插入之改變體。例如，較佳為將位置於鉸鏈區域之EU編號系統第228號之絲胺酸經置換為脯胺酸之抗體。此外，於本說明書，分配抗體之可變區域之CDR及架構之胺基酸位置，係有依照Kabat規定之情況(參照Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,(1987)及(1991))。又，恆定區域之胺基酸係根據以Kabat之胺基酸位置為基準之EU編號系統(參照Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242)表示。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體的Fc區域可以使二種不同重鏈容易締合之方式，置換其區域之任意胺基酸。較佳之態樣可列舉例如：具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈上之恆定區域中EU編號系統第351號之白胺酸被置換為離胺酸且第366號之蘇胺酸被置換為離胺酸，具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈中之恆定區域中第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸之PD-1/CD3雙特異性抗體。又，亦可列舉：具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈中之恆定區域中EU編號系統第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸，具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈中之恆定區域中第351號之白胺酸被置換為離胺酸且第366號之蘇胺酸被置換為離胺酸之PD-1/CD3雙特異性抗體。
與PD-1特異性結合之第一臂
於本說明書，「與PD-1特異性結合之第一臂」(以下，亦簡稱為「第一臂」)係指不論是否含於抗體或抗體片段之一部，或者是，不是一部分而是以其本體單體之方式存在，皆至少含有與PD-1特異性結合之抗體(以下，亦簡稱為抗PD-1抗體)之VH，並且可與PD-1特異性結合之抗體部分，例如，如此之第一臂為由抗PD-1抗體之VH及構成該抗PD-1抗體之共同輕鏈之VL構成，再者，第一臂亦包含含有該VH及VL之抗體之Fab部。此處，「與PD-1特異性結合」係指對於PD-1可以至少具有高於1x10-5M，較佳為1x10-7M，更佳為1x10-9M之親和性(解離常數(Kd值))之結合活性直接結合，並且，至少實質上不與CD28、CTLA-4及ICOS等屬於所謂CD28家族受體之外之受體成員結合之特徵使用。又，「與PD-1特異性結合之抗體」或「抗PD-1抗體」中之「抗體」係指全長抗體，亦即，由以二硫鍵連結之2個重鏈及2個輕鏈構成之完全長之抗體，較佳為其單株抗體。
此處，「與PD-1特異性結合之第一臂」可列舉例如具有VH者，該VH具有
(a)由以HYJ1LH表示之胺基酸序列[序列中，J1表示G(甘胺酸)或A(丙胺酸)，此處J1表示者或其他字母係表示各個胺基酸一字母之簡稱]構成之VH-CDR1、
(b)由以WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG表示之胺基酸序列[序列中，J2表示L(白胺酸)或I(異白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)或G(甘胺酸)，X2表示F(苯丙胺酸)或Y(酪胺酸)，此處，J2、U2及X2所分別表示者或其他字母係分別與上述者同意義]構成之VH-CDR2、及
(c)由以GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V表示之胺基酸序列[序列中，J3表示M(甲硫胺酸)或L(白胺酸)，U3表示H(組胺酸)或Y(酪胺酸)，X3表示F(苯丙胺 酸)或Y(酪胺酸)，Z3表示D(天冬胺酸)或E(麩胺酸)，此處，J3、U3、X3及Z3所分別表示者或其他字母，係分別與上述者同意義]構成之VH-CDR3。
此處，較佳之「與PD-1特異性結合之第一臂」之態樣可列舉例如具有下列VH者：
(1a)具有下列各VH-CDR之VH：其VH-CDR1為HYJ1LH序列中之J1表示G(甘胺酸)，其VH-CDR2為WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中之J2表示L(白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)，X2表示F(苯丙胺酸)，其VH-CDR3為GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中之J3表示M(甲硫胺酸)，U3表示H(組胺酸)，X3表示F(苯丙胺酸)，Z3表示D(天冬胺酸)；
(2a)具有下列各VH-CDR之VH：其VH-CDR1為HYJ1LH序列中之J1表示G(甘胺酸)，其VH-CDR2為WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中之J2表示I(異白胺酸)，U2表示G(甘胺酸)，X2表示Y(酪胺酸)，其VH-CDR3為GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中之J3表示L(白胺酸)，U3表示H(組胺酸)，X3表示Y(酪胺酸)，Z3表示E(麩胺酸)；
(3a)具有下列各VH-CDR之VH：其VH-CDR1為HYJ1LH序列中之J1表示A(丙胺酸)，其VH-CDR2為WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中之J2表示L(白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)，X2表示Y(酪胺酸)，其VH-CDR3為GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中之J3表示M(甲硫胺酸)，U3表示Y(酪胺酸)，X3表示Y(酪胺酸)，Z3表示D(天冬胺酸)；或
(4a)具有下列各VH-CDR之VH：其VH-CDR1為HYJ1LH序列中之J1表示A(丙胺酸)，其VH-CDR2為WJ2NTNTU2NPTX2AQGFTG序列中之J2表示L(白胺酸)，U2表示E(麩胺酸)，X2表示F(苯丙胺酸)，其VH-CDR3為 GDJ3VVPTTIWNYYU3X3MZ3V序列中之J3表示M(甲硫胺酸)，U3表示H(組胺酸)，X3表示F(苯丙胺酸)，Z3表示D(天冬胺酸)。
又，「與PD-1特異性結合之第一臂」之其他態樣較佳可列舉例如具有選自下列VH中之任一種的VH者：
(1b)含有由序列編號6之胺基酸序列構成之VH-CDR1、由序列編號7之胺基酸序列構成之VH-CDR2及由序列編號8之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；
(2b)含有由序列編號9之胺基酸序列構成之VH-CDR1、由序列編號10之胺基酸序列構成之VH-CDR2及由序列編號11之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；
(3b)含有由序列編號12之胺基酸序列構成之VH-CDR1、由序列編號13之胺基酸序列構成之VH-CDR2及由序列編號14之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；
(4b)含有由序列編號15之胺基酸序列構成之VH-CDR1、由序列編號16之胺基酸序列構成之VH-CDR2及由序列編號17之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；及
(5b)含有由序列編號18之胺基酸序列構成之VH-CDR1、由序列編號19之胺基酸序列構成之VH-CDR2及由序列編號20之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH。
再者，於本發明，「與PD-1特異性結合之第一臂」亦包含任一種選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)之VH中之各個VH-CDR中，其任意1至5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)，並且，具有與未置換為該 胺基酸之原本第一臂對PD-1之結合活性實質上同等結合活性者。例如，VH-CDR1之情形中，1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)，VH-CDR2或VH-CDR3之情形中，分別1至5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)者。又，如圖4所示，分別對應與PD-1特異性結合之第一臂的抗PD-1抗體殖株之各CDR，於各殖株間，不同之各胺基酸或該等之任意複數組合可於該殖株間相互置換。此處，由保守性胺基酸進行之置換，係指具有類似側鏈之殘基的可換性，例如，於具有脂肪族側鏈之胺基酸群係甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸，於具有脂肪族羥基側鏈之胺基酸群係絲胺酸及蘇胺酸，於具有含有醯胺基側鏈之胺基酸群係天冬醯胺酸及麩醯胺酸，於具有芳族側鏈之胺基酸群係苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸，於具有鹼性側鏈之胺基酸群係離胺酸、精胺酸及組胺酸，於具有含有硫側鏈之胺基酸群為半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳之由保守性胺基酸進行之置換之例可列舉：於纈胺酸、白胺酸及異白胺酸間之置換，於苯丙胺酸及酪胺酸間之置換，於離胺酸及精胺酸間之置換，於丙胺酸及纈胺酸間之置換及於天冬醯胺酸及麩醯胺酸間之置換。又，此處，上述之「具有與未置換為該胺基酸之原本第一臂對PD-1之結合活性實質上同等之結合活性」係指置換為該胺基酸之第一臂對PD-1之結合活性，係未置換為該胺基酸之原本第一臂結合活性之95%以上，較佳為98%以上，更佳為99%以上。
再者，本發明之「與PD-1特異性結合之第一臂」亦包含具有下列VH者，該VH係於其VH中，包含具有上述特定胺基酸序列之各個VH-CDR，其VH之架構之胺基酸序列係由特定之生殖細胞系列型基因或於其受到體細胞突變之該基因所編碼。例如，選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)之任一者表示之VH，係可由生殖細胞系列型V基因為IGHV7-4-1、生殖細胞系列型J基因為 JH6c之VDJ重組基因或其受到體細胞突變之該基因所編碼。此處，由生殖細胞系列型之V基因IGHV7-4-1分別編碼之胺基酸序列係對應序列編號21之胺基酸序列(圖3)。
本發明之與PD-1特異性結合之第一臂之VH之架構，係有由生殖細胞系列型之VDJ重組基因受到體細胞突變之該基因所編碼之情況。例如，生殖細胞系列型V基因為IGHV7-4-1之選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中之任一種表示之VH之FR1、FR2、FR3，係於圖4表示之胺基酸位置中，由於與IGHV7-4-1基因編碼之胺基酸序列不同，該各位置受到體細胞突變。例如，關於FR1區域，序列編號21之胺基酸序列中位置13之離胺酸被置換為麩醯胺酸，位置16之丙胺酸被置換為纈胺酸或位置19之離胺酸被置換為甲硫胺酸，或者是可以此等任意之複數組合置換。關於FR2區域，序列編號21之胺基酸序列中位置37之纈胺酸可被置換為白胺酸。關於FR3區域，序列編號21之胺基酸序列中位置77之絲胺酸被置換為蘇胺酸，位置84之半胱胺酸被置換為絲胺酸或天冬醯胺酸，或者是，可以任意複數之組合置換。又，關於選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中之任一種表示之VH之FR4區域，源自J基因JH6c之FR4區域胺基酸序列(Trp-Gly-Lys-Gly-Thr-Thr*-Val-Thr-Val-Ser-Ser)(序列編號41)中之離胺酸(Lys)可被置換為麩醯胺酸或天冬醯胺酸及/或＊印之蘇胺酸(Thr)可被置換為白胺酸。具有上述任一種胺基酸置換組合之各個FR1、FR2、FR3及FR4亦不會對與PD-1特異性結合之第一臂之功能造成實質上的影響，可作為架構使用。
再者，本發明之「與PD-1特異性結合之第一臂」係包含具有上述特定之胺基酸序列之各CDR，並且，其VH之FR之胺基酸序列包含由特定之生 殖細胞系列型基因或其受到體細胞突變之該基因所編碼者。例如，此等第一臂可列舉具有由選自序列編號1至5之胺基酸序列構成之VH者。
再者，如此之「與PD-1特異性結合之第一臂」亦包含例如具有與由選自序列編號1至5中之任一種胺基酸序列至少80%相同，較佳至少90%相同，更佳至少95%相同，再佳至少98%相同，再更佳至少99%相同之胺基酸序列構成之VH，並且，與原本第一臂之VH之胺基酸序列間的不同，不會對PD-1之結合活性造成實質上影響者(以下，亦簡稱為相同第一臂)。此處，與胺基酸序列相關之相同性之比較中使用之「%相同」，係定義為將2個序列對齊，與作為參照之胺基酸序列(此處，為了達成最大百分比相同性，在必要的情形中，係導入了間隙後之作為參照之胺基酸序列)相同之胺基酸序列之百分率。又，此處，「與原本第一臂之VH之胺基酸序列間的不同，不會對PD-1之結合活性造成實質不影響」，係指相同第一臂對PD-1之結合活性為原本第一臂之該結合活性之95%以上，較佳為98%以上，更佳為99%以上。
於其他態樣，本發明之「與PD-1特異性結合之第一臂」亦包含具有抗PD-1抗體之可變區域(此處，該可變區域包含構成此之VH及VL)者，該抗PD-1抗體之可變區域係與下列者對PD-1之結合進行交叉競爭：(1)第一臂，係具有選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中之任一種表示之VH或由選自序列編號1至5之胺基酸序列構成之VH及共同輕鏈之VL；或(2)與PD-1特異性結合之單株抗體可變區域，係由該VH及VL構成；
又，亦包含具有抗PD-1抗體之可變區域者，其中，對PD-1之結合係藉由下列者進行交叉競爭：(3)第一臂，係具有選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中之任一種表示之VH或選自由序列編號1至5之胺基酸序列構成之VH及共同輕鏈之 VL；或(4)與PD-1特異性結合之單株抗體可變區域，係由該VH及VL構成。此處，「對PD-1之結合進行交叉競爭」係指藉由與和本說明書中例示之第一臂相同或一部分重複之抗原決定位進行結合，該第一臂對PD-1之結合不論其程度皆進行阻礙，或者是，與和該例示之第一臂相同或一部分重複之抗原決定位結合之抗體所致之對PD-1之結合，係藉由該例示之第一臂不論其程度皆進行阻礙，是否交叉競爭可藉由競爭結合分析評估。例如可使用Biacore分析、ELISA分析、流式細胞術、酵素結合免疫吸附檢定法(ELISA)、螢光能量轉移測定法(FRET)或螢光微量測定技術(FMAT(註冊商標))判斷。
例如，由具有上述(5b)表示之VH及共同輕鏈之VL之第一臂所致之對PD-1之結合，與該對PD-1之結合進行交叉競爭者可列舉例如：具有選自上述(1b)至(4b)中之任一種表示之VH及共同輕鏈之VL(較佳為具有由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之VL)之第一臂，再者，具有由選自由序列編號1至4之胺基酸序列構成之VH及共同輕鏈之VL(較佳為由序列編號25之胺基酸序列構成之VL)之第一臂。
又，具有例如選自上述(1b)至(4b)中之任一種表示之VH或由選自序列編號1至4之胺基酸序列構成之VH及共同輕鏈之VL之第一臂，與由該第一臂進行之對PD-之結合進行交叉競爭者可列舉例如：具有上述(5b)表示之VH及共同輕鏈之VL(較佳為由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之VL)之第一臂、具有由序列編號5之胺基酸序列構成之VH及共同輕鏈之VL(較佳為由序列編號25之胺基酸序列構成之VL)之第一臂。
此處，本發明中之「與PD-1特異性結合之第一臂」較佳可列舉具有選自上述(1b)至(5b)中之任一種表示之VH之第一臂，再者，此較佳第一臂係如上所述，包含於其VH之各CDR中，其任意1至5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)，並且，其胺基酸置換不會對PD-1之結合活性造成實質上影響者，再者，如上所述，VH之架構之胺基酸序列包含具有由生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1、同J基因JH6c或此等受到體細胞突變之該基因所編碼之VH者。因此，該第一臂更佳為具有由選自序列編號1至5中之任一種胺基酸序列構成之VH者。
再者，本發明之「與PD-1特異性結合之第一臂」較佳為含有共同輕鏈之VL者，如此之共同輕鏈較佳為例如IGVK1-39/JK1共同輕鏈，更佳為例如具有含有由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之VL之輕鏈，再佳為例如具有由序列編號25之胺基酸序列構成之VL之輕鏈。又，共同輕鏈之恆定區域較佳可列舉由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域。
又，「與PD-1特異性結合之第一臂」更佳為容許PD-1及PD-L1間之相互作用、PD-1及PD-L2間之相互作用或此等兩相互作用者。此處，「容許PD-1及PD-L1間之相互作用、PD-1及PD-L2間之相互作用或此等兩相互作用」係指即使本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體存在於可溶型PD-L1或PD-L2濃度20倍過剩之狀況下，與不存在本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體不存在時之該相互作用相比，該PD-L1及PD-1間之相互作用、該PD-L2及PD-1間之相互作用或此等兩相互作用維持在50%以上，較佳維持在70%以上，更佳維持在 80%以上。又，「容許PD-1及PD-L1間之相互作用、PD-1及PD-L2間之相互作用或此等兩相互作用」之定義以與「不會實質上阻礙PD-1及PD-L1間之相互作用、PD-1及PD-L2間之相互作用或此等兩相互作用」同意義使用。
將為了構築本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體而取得之抗PD-1單株抗體之各殖株、及此等VH之胺基酸序列與及其序列編號間之對應關係示於圖5，將該抗PD-1單株抗體各殖株之VH中各CDR之胺基酸序列與其序列編號之對應關係示於圖6。
與CD3特異性結合之第二臂
於本說明書，「與CD3特異性結合之第二臂」(以下，亦簡稱為「第二臂」)係指不論是否含於抗體或抗體片段之一部，或者是，不是一部分而是作為其本體單體存在，至少含有與CD3特異性結合之抗體(以下，亦簡稱為抗CD3抗體)之VH，且可與CD3特異性結合之抗體部分，例如，如此之第二臂為由抗CD3抗體之VH及構成該抗CD3抗體之共同輕鏈之VL構成，再者，第二臂亦包含含有該VH及VL之抗體之Fab部。此處，「與CD3特異性結合」係相對於CD3，可具有至少高於1x10-5M，較佳為1x10-7M，更佳為1x10-9M之親和性(解離常數(Kd值))之結合活性直接結合，且實質上不與其他蛋白質結合之特徵使用。又，「與CD3特異性結合之抗體」或「抗CD3抗體」中之「抗體」係指由全長抗體，亦即，以二硫鍵連結之2個重鏈及2個輕鏈構成之完全長之抗體，較佳為其單株抗體。
此處，此等「與CD3特異性結合之第二臂」可列舉例如具有VH者，該VH係含有
(1c)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
再者，於本發明中之「與CD3特異性結合之第二臂」亦包含於上述(1c)之VH中之各個CDR，其任意1至5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)，並且，具有與未置換為該胺基酸之原本第二臂對CD3之結合活性實質上同等之結合活性者。可列舉例如：CDR1之情形，1個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)者，CDR2或CDR3之情形，分別1至5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)者。此處，「具有與未置換為該胺基酸之原本第二臂對CD3之結合活性實質上同等之結合活性」係指於置換為該胺基酸之第二臂對CD3之結合活性為未置換為該胺基酸之原本第二臂結合活性之95%以上，較佳為98%以上，更佳為99%以上。此外，於第二臂之各VH-CDR之「由保守性胺基酸進行之置換」可列舉例如上述第一臂中之胺基酸置換之例。
再者，本發明之「與CD3特異性結合之第二臂」亦包含具有VH者，於該VH中包含具有上述特定之胺基酸序列之各個CDR，該VH之FR之胺基酸序列係由生殖細胞系列型基因或於其受到體細胞突變之該基因所編碼。例如上述(1c)之VH，係由生殖細胞系列型V基因為IGHV3-33之VDJ重組基因或其受到體細胞突變之該基因所編碼。此處，將藉由生殖細胞系列型之V基因IGHV3-33編碼之胺基酸序列(序列編號22)示於圖3。再者，如此之第二臂可列舉具有由序列編號36之胺基酸序列構成之VH者。又，如此之第二臂亦包含例如具有由與序列編號36之胺基酸序列至少80%相同，較佳為至少90%相同，更佳為至少95%相同，再佳為至少98%相同，再更佳為至少99%相同之胺基酸序 列構成之VH，並且，與原本第二臂之VH胺基酸序列間之不同不會對CD3之結合活性造成實質上影響(以下，亦簡稱為相同第二臂)。此處，「與原本第二臂之VH胺基酸序列間之不同不會對CD3之結合活性造成實質上影響」係指於相同第二臂CD3之結合活性為原本第二臂之該結合活性之95%以上，較佳為98%以上，更佳為99%以上。
於其他態樣，本發明之「與CD3特異性結合之第二臂」亦包含具有抗CD3抗體之可變區域(此處，該可變區域包含構成此之VH及VL)者，該抗CD3抗體之可變區域係與下列者對CD3之結合進行交叉競爭：(1)第二臂，係具有上述(1c)表示之VH或由序列編號36之胺基酸序列構成之VH及共有輕鏈之VL；或(2)與CD3特異性結合之單株抗體可變區域，係由該VH及VL構成。此處，「對CD3之結合進行交叉競爭」係指藉由與和本說明書中例示之第二臂相同或一部分重複之抗原決定位進行結合，該第二臂對CD3之結合不論其程度皆進行阻礙。此處，是否交叉競爭可以關於「與PD-1特異性結合之第一臂」之說明中記載之方法為基準，進行相同之測定。
此處，本發明之「與CD3特異性結合之第二臂」較佳可列舉具有上述(1c)表示之VH之第二臂，再者，此較佳之第二臂包含，如上所述，於其VH之各CDR，其任意1至5個胺基酸殘基置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)且其胺基酸置換不會對CD3之結合活性造成實質影響者，再者，如上所述，VH之架構之胺基酸序列亦包含具有由生殖細胞系列型基因IGHV3-33或其受到體細胞突變之該基因所編碼之VH者。因此，該第二臂更佳可列舉具有由序列編號36之胺基酸序列構成之VH者。
以下，將用以構築本發明PD-1/CD3雙特異性抗體之抗CD3抗體之各殖株與此等VH之胺基酸序列與其序列編號之對應關係示於圖7，將該抗CD3抗體之各殖株之VH中各CDR之胺基酸序列與其序列編號之對應關係示於圖8。
本發明之「與CD3特異性結合之第二臂」較佳為包含共同輕鏈之VL者，如此之共同輕鏈較佳為例如IGVK1-39/JK1共同輕鏈，更佳為例如具有包含由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之輕鏈，再佳為例如具有由序列編號25之胺基酸序列構成之VL之輕鏈。又，共同輕鏈之恆定區域較佳可列舉由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域。
本發明之「與CD3特異性結合之第二臂」較佳可列舉與CD3ε特異性結合者。
作為本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體之較佳同型為IgG抗體，再佳為IgG1或IgG4抗體，再更佳為IgG1抗體。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等之較佳態樣可列舉例如，以具有下列與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂為特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，其中，與PD-1特異性結合之第一臂具有：
(A)選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中之任一種表示之VH中，選自VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3中之任一種或複數個CDR，各者之任意1至5個胺基酸殘基可被置換為其他胺基酸(較佳為其保守性胺基酸)之VH，及
(B)包含由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之共同輕鏈之VL；以及
與CD3特異性結合之第二臂具有：
(C)於上述(1c)表示之VH中，選自VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3中之任一種或複數個CDR，各者之任意之1至5個胺基酸殘基可被置換為其他胺基酸(較佳為保守性胺基酸)之VH，及
(D)含有由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之共同輕鏈之VL。
更佳可列舉，例如，以具有下列與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂為特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，其中，與PD-1特異性結合之第一臂具有：
(A)選自上述(1a)至(4a)或(1b)至(5b)中之任一種之VH，及
(B)含有由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之共同輕鏈之VL；及
與CD3特異性結合之第二臂具有：
(C)上述(1c)表示之VH，及
(D)含有由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之共同輕鏈之VL。
又，本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等之較佳其他態樣可列舉，例如，以具有下列與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂為特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，其中，與PD-1特異性結合之第一臂具有：
(A)由選自序列編號1至5中之任一種胺基酸序列構成之VH或由與該VH之胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列構成之VH，及
(B)由序列編號25之胺基酸序列構成之共同輕鏈之VL；及
與CD3特異性結合之第二臂具有：
(C)由序列編號36之胺基酸序列構成之VH或由與該VH之胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列構成之VH，及
(D)由序列編號25之胺基酸序列構成之共同輕鏈之VL。
此其他態樣更佳可列舉，例如，以具有下列與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂為特徵之PD-1/CD3雙特異性抗體，其中，與PD-1特異性結合之第一臂具有：
(A)由選自序列編號1至5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及
(B)由序列編號25之胺基酸序列構成之共同輕鏈之VL；及
與CD3特異性結合之第二臂具有：
(C)由序列編號36之胺基酸序列構成之VH，及
(D)由序列編號25之胺基酸序列構成之共同輕鏈之VL。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體中，同抗體為IgG1抗體時較佳為於各個二個重鏈恆定區域或鉸鏈區域上，EU編號系統第235號之白胺酸被置換為甘胺酸，及/或第236號之甘胺酸被置換為精胺酸之IgG1抗體。再者，此等雙特異性抗體重鏈C末端之胺基酸更佳為例如缺失EU編號系統第447號之離 胺酸之抗體。又，PD-1/CD3雙特異性抗體為IgG4抗體時，較佳為位於其鉸鏈區域中之EU編號系統第228號之絲胺酸被置換為脯胺酸之抗體。
再者，此等PD-1/CD3雙特異性抗體為IgG1抗體時之較佳態樣可列舉：於具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈恆定區域中，EU編號系統第351號之白胺酸被置換為離胺酸且第366號之蘇胺酸被置換為離胺酸，於具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈恆定區域中，第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸之IgG1抗體。亦同樣較佳為：於具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈恆定區域中，EU編號系統第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸，於具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈之恆定區域中，第351號之白胺酸被置換為離胺酸且第366號之蘇胺酸被置換為離胺酸之IgG1抗體。
再者，此等PD-1/CD3雙特異性抗體為IgG1抗體時之較佳態樣可列舉於各個二種重鏈恆定區域中，(1)EU編號系統第252號之甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸、(2)EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸及/或(3)EU編號系統第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸之IgG1抗體。藉由此等胺基酸置換，該PD-1/CD3雙特異性抗體於血液中之半衰期與同胺基酸未經置換之同抗體相比，可期待縮短至少50%，較佳至少60%，更佳至少70%，再佳至少80%，最佳至少90%。
於重鏈恆定區域中採用上述胺基酸置換之PD-1/CD3雙特異性IgG1抗體之較佳態樣可列舉例如：具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈，係具有由選自序列編號23、序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區 域；具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈，係具有由選自序列編號24、序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域之抗體。將數種此等之胺基酸序列示於圖9。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等之最佳態樣為：於本說明書實施例8製作之殖株PD1-1(Bi)、殖株PD1-2(Bi)、殖株PD1-3(Bi)、殖株PD1-4(Bi)及殖株PD1-5(Bi)，及於實施例19製作之殖株Mut1、殖株Mut2、殖株Mut3、殖株Mut4、殖株Mut5及殖株Mut6。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等之較佳特徵可列舉：(1)容許PD-1及PD-L1間之相互作用、PD-1及PD-L2間之相互作用或此等兩相互作用及/或(2)充分地減低細胞激素產生者。此處，「容許PD-1及PD-L1間之相互作用、PD-1及PD-L2間之相互作用或此等兩相互作用」表示與關於「與PD-1特異性結合之第一臂」之說明中記載之定義為同意義。另一方面，「充分地減低細胞激素產生」係指例如將本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等藉由點滴等靜脈內投予中或從投予開始之24小時內，例如，血中或組織中含有IL-2、IFN-γ及/或TNF-α之細胞激素之濃度未增加，或者是，即使增加亦為藉由投予類固醇可抑制之程度。
PD-1/CD3雙特異性抗體等之製造及精製方法
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體及其抗體片段亦可以WO2014/051433、WO2013/157953或WO2013/157954中揭示之方法製造。
具體而言，將(1)編碼具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH之重鏈之多核苷酸、(2)編碼具有與CD3特異性結合之第二臂之VH之重鏈之多核 苷酸、及(3)編碼共同輕鏈之多核苷酸分別插入至表現載體，將該表現載體基因導入至哺乳動物細胞中並使其轉形，將兩重鏈及共有輕鏈一起表現並分泌而製造。
此處，表現本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體之宿主細胞可為可將表現載體基因導入，可將經導入之表現載體表現之任一種宿主細胞。較佳為如SF-9及SF-21細胞之昆蟲細胞，更佳為含有CHO細胞、BHK細胞、SP2/0細胞及NS-0骨髓瘤細胞之小鼠細胞；如COS及Vero細胞之靈長類細胞；MDCK細胞、BRL 3A細胞、雜交瘤、腫瘍細胞、不杇化之初代細胞；如W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或PER.C6之胚胎視網膜細胞等哺乳類細胞。此外，於表現系統之選擇中，有使抗體適當地糖基化之方式，使用哺乳類細胞之表現載體及宿主之情形。為了獲得與人類中之糖基化模式一致之抗體，可有利地使用人類細胞株，較佳為PER.C6。
藉由表現載體之基因導入而經轉形之宿主細胞中蛋白質之產生係可參考例如：Current Protocols in Protein Science(1995),Coligan JE,Dunn BM,Ploegh HL,Speicher DW,Wingfield PT,ISBN 0-471-11184-8，Bendig,1988實施，再者，用以將宿主細胞培養之生產性最大化之通常指南、步驟及實用方法可參考：Mammalian Cell Biotechnology：a Practical Approach(M.Butler,ed.,IRL Press,1991)實施。於宿主細胞中抗體的表現係記述於例如EP0120694、EP0314161、EP0481790、EP0523949、US4816567及WO2000/63403等公開公報。
此處，宿主細胞之培養條件可藉由公知之方法最佳化，可最佳化蛋白質之生產量。培養係可藉由例如培養皿、滾瓶或於反應槽中，以批式培養、饋料批式培養、連續培養、利用中空纖維進行之培養實施。為了藉由細胞培養， 大規模且連續地產生重組蛋白質，較佳為使細胞於懸濁液中增殖。又，較佳為在源自動物或人類之血清或沒有源自動物或人類之血清之構成要素之條件下進行細胞培養。
於宿主細胞表現，從其細胞或細胞培養基藉由公知方法回收之抗體，係可使用公知之方法精製。精製方法包含免疫沈降法、離心分離法、過濾、尺寸排除層析法、親和層析法、陽離子及/或陰離子交換層析法、疏水性相互作用層析法等。再者，有適合使用蛋白質A或蛋白質G親和層析法之情況(參照例如US4801687及US5151504)。
[醫藥的用途]
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等係對自體免疫疾病或移植物對抗宿主疾病(GVHD)之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療有用。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等可預防、症狀進展抑制及/或治療之自體免疫疾病可列舉例如：貝賽特氏症、全身性紅斑性狼瘡、慢性圓板狀紅斑性狼瘡、多發性硬化症、系統性硬皮症、進行性系統性硬化症、硬皮症、多發性肌炎、皮膚肌炎、結節性動脈周圍炎(結節性多發動脈炎、顯微性多發血管炎)、大動脈炎症候群(高安動脈炎)、惡性類風濕性關節炎、類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、脊椎關節炎、混合性結締組織病、卡斯爾曼症、修格蘭氏症候群、成人史迪爾氏病、血管炎、過敏性肉芽腫性血管炎、過敏性血管炎、類風濕性血管炎、大型血管炎、ANCA關連血管炎(例如肉芽腫性多血管炎及嗜酸性球性肉芽腫性多血管炎)、柯根症候群、RS3PE症候群、顳動脈炎、風濕性多發肌痛症、纖維肌痛症、抗磷脂質抗體症候群、嗜酸性球性肌膜炎、IgG4關連疾病(例如原發性硬化性膽道炎、自體免疫性胰臟炎等)、格林-巴利症候群、重症肌無 力症、慢性萎縮性胃炎、自體免疫性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、原發性膽汁性肝硬變、古德巴斯捷氏症候群、快速進行性腎絲球腎炎、狼瘡腎炎、巨紅血球貧血、自體免疫性溶血性貧血、惡性貧血、自體免疫性嗜中球減少症、特發性血小板減少性紫斑病、巴塞多氏病(Basedow's disease)(葛瑞夫茲病(Graves' disease)(甲狀腺功能亢進症))、橋本病、自體免疫性腎上腺機能不全、原發性甲狀腺功能低下症、愛迪生氏病(慢性腎上腺機能減退症)、特發性愛迪生氏病、I型糖尿病、緩進行性I型糖尿病(成人潛在性自體免疫性糖尿病)、限局性硬皮症、乾癬、乾癬性關節炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、類天疱瘡、妊娠性疱疹、線狀IgA水疱性皮膚症、後天性表皮水疱症、圓形禿、白斑、尋常性白斑、視神經脊髓炎、慢性炎症性脫髓性多發神經炎、多灶性運動神經病、類肉瘤病、巨細胞性動脈炎、肌萎縮性側索硬化症、原田氏症、自體免疫性視神經症、特發性無精子症、習慣性流產、炎症性腸疾病(例如潰瘍性大腸炎、克隆氏症)、乳糜瀉病、僵直性脊椎炎、重症氣喘、慢性蕁麻疹、移植免疫、家族性地中海熱、嗜酸性球性副鼻腔炎、擴張型心肌症、全身性肥大細胞增生症及包涵體肌炎等。
本發明之「治療」係指例如治癒或改善某疾病或其症狀，「預防」係指防範某疾病或症狀之表現於未然或延遲一定期間，「症狀進展抑制」係指抑制症狀之進展或惡化，並中止病態之進行。又，「預防」亦包含復發抑制。「復發抑制」係指防止某疾病或症狀之復發或減低復發之可能性。
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等通常於全身或局部，以非經口之形態投予。投予方法具體而言可列舉：注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予可列舉例如：靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射等，於靜脈內注射時，較佳為藉由點滴投予。其投予量依年齡、體重、症狀、治療效果、 投予方法、處理時間等而異，通常成人每人每次於0.1μg/kg至300mg/kg之範圍，較佳於0.1mg/kg至10mg/kg之範圍，一日一次至數次非經口投予，或者是，每日於30分鐘至24小時之範圍靜脈內持續投予。當然，如前述，由於投予量依各種條件而變動，因此有於比上述投予量少之量即足夠之情況，亦有需投予超過此範圍量之情況。
製劑
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等有作為注射劑或用於點滴之輸液而製劑化使用之情況，該注射劑或輸液可為水溶液、懸濁液或乳濁液中之任一形態，又，以藉由於使用時添加溶劑使溶解、懸濁或乳濁使用之方式，可與藥學上容許之載體一起製劑化成固形劑。注射劑或用於點滴之輸液中使用之溶劑可使用例如：注射用蒸餾水、生理食鹽水、葡萄糖溶液及等張液(例如氯化鈉、氯化鉀、甘油、甘露醇、山梨糖醇、硼酸、硼砂、丙二醇等溶液)等。
此處，藥學上容許之載體可列舉例如：穩定劑、溶解補助劑、懸濁化劑、乳化劑、無痛化劑、緩衝劑、保存劑、防腐劑、pH調整劑、抗氧化劑等。穩定劑可使用例如：各種胺基酸、白蛋白、球蛋白、明膠、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、檸檬酸鈉、二丁基羥基甲苯等。溶解補助劑可使用例如：醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(例如聚山梨醇酯20(註冊商標)、聚山梨醇酯80(註冊商標)、HCO-50等)等。懸濁化劑可使用例如：單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二烷基硫酸鈉等。乳化劑可使用例如阿拉伯膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。無痛化劑可使用例如：苯甲醇、氯丁醇、山梨糖醇等。緩衝劑可使用例如：磷酸 緩衝液、乙酸緩衝液、硼酸緩衝液、碳酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、Tris緩衝液、麩胺酸緩衝液、ε-氨基己酸緩衝液等。保存劑可使用例如：對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、氯化烷基二甲基苯甲基銨、脫氫乙酸鈉、乙二胺四乙酸鈉、硼酸、硼砂等。防腐劑可使用例如氯化烷基二甲基苯甲基銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。pH調整劑可使用例如：鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、乙酸等。抗氧化劑可使用例如：(1)如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉及亞硫酸鈉等水溶性抗氧化劑、(2)如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯、卵磷脂、五倍子酸丙酯及α-生育醇等油溶性抗氧化劑、及(3)如檸檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸及磷酸等金屬螯合劑等。
注射劑或點滴用之輸液可於其最終步驟滅菌或以無菌操作法，例如以過濾器等過濾滅菌，接著填充於無菌之容器製造。又，注射劑或點滴用之輸液，係可將利用真空乾燥及將凍結乾燥所致之無菌粉末(可含有藥學上容許之載體之粉末)於使用時溶解於適當之溶劑而使用。
併用或調配劑
再者，本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等亦可與於自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療中使用之其他藥劑組合使用。於本發明，與其他藥劑組合使用時(併用)之投予形態，係可為於1個製劑中調配兩成分之調配劑之形態，亦可為分別作成製劑之投予形態。藉由該併用，可補齊其他藥劑之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療效果，可維持或減低投予量或投予次數。本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等與其他藥劑分別投予時可於一定期間同時投予，之後，僅投予PD-1/CD3雙特異性抗體等或僅投予其他藥劑。又，可先投 予本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等，於其投予完成後再投予其他藥劑；或先投予其他藥劑，於其投予完成後再投予本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等，各個投予方法可相同亦可不同。亦可以含有本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等之製劑與含有其他藥劑之製劑之套組之形式提供。此處，其他藥劑之投予量可以臨床上使用之用量為基準適當地選擇。又，其他藥劑可將任意2種以上以適當比率組合投予。又，前述其他藥劑不僅包含到現在為止發現者，亦包含以後發現者。
例如，將本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等適用於I型糖尿病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，可與選自下列之任一種以上藥劑組合使用：胰島素製劑(例如人類胰島素、胰島素甘精胰島素、賴脯胰島素、賴脯胰島素、門冬胰島素等)、磺醯基尿素劑(例如格列苯脲、格列齊特及格列美脲等)、速效型胰島素分泌促進藥(例如那格列奈等)、雙胍類製劑(例如二甲雙胍等)、胰島素抵抗性改善藥(例如吡格列酮等)、α-葡萄糖苷酶抑制藥(例如阿卡波糖、伏格列波糖等)、糖尿病性神經症治療藥(例如依帕司他、脈息禮延、咪達普利等)、GLP-1類似物製劑(例如利拉魯肽、艾塞那肽、利西拉來等)及DPP-4阻礙劑(例如西格列汀、維格列汀、阿格列汀等)等。
又，例如將本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等適用於多發性硬化症之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，可與選自下列之任一種以上藥劑組合使用：類固醇藥(例如可體松、乙酸可體松、氫化可體松、氫化可體松磷酸鈉、氫化可體松琥珀酸鈉、氟氫乙酸可體松、去氫皮質醇、去氫皮質醇乙酸酯、去氫皮質醇琥珀酸鈉、丁基乙酸去氫皮質醇、去氫皮質醇磷酸鈉、鹵潑尼松乙酸酯、甲基去氫皮質醇、甲基去氫皮質醇乙酸酯、甲基去氫皮質醇琥珀酸鈉、去炎松、乙酸去炎松、去炎松縮酮、地塞米松、地塞米松乙酸酯、地塞米松戊酸 酯、地塞米松培酸酯、地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松丙酸酯、地塞米松磷酸鈉、地塞米松間磺基苯甲酸鈉、對氟米松、對氟米松乙酸酯、倍他米松、倍他米松二丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍他米松乙酸酯、倍他米松酪酸酯丙酸酯及倍他米松磷酸鈉等)、干擾素β-1a、干擾素β-1b、乙酸格拉替雷、米托蒽醌、硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢素、胺甲蝶呤、克拉屈濱、促腎上腺皮質素(ACTH)、促皮質素、咪唑立賓、他克莫司、芬戈莫德及阿侖單抗等。
又，例如將本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等適用於全身紅斑性狼瘡之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，可與選自下列之任一種以上藥劑組合使用：類固醇藥(例如上述記載之類固醇藥)、免疫抑制劑(例如環孢素、他克莫司、芬戈莫德等)及貝利木單抗(Belimumab)。
例如，將本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等適用於類風濕性關節炎之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，可與選自下列之任一種以上藥劑組合使用：類固醇藥(例如上述記載之類固醇藥)、抗風濕藥(例如胺甲蝶呤、柳胺磺胺吡啶、布西拉明、來氟米特、咪唑立賓、他克莫司等)或抗細胞激素藥(例如英利昔單抗、阿達木單抗、特昔利單抗、依那西普、戈利木單株及賽妥珠單抗等)及阿巴西普等。
適用於其他之自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療時，可將本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體等與上述記載之其他藥劑之任一種以上組合使用。
將本發明藉由下述實施例作更詳細之說明，惟本發明之範圍不限定於此等。所屬技術領域具有通常知識者可以本發明之記載為基礎，進行各種變更、修飾，此等變更、修飾亦包含於本發明。
[實施例]
實施例1：於使用重組人類PD-1-Fc融合蛋白質之MeMo(註冊商標)小鼠之免疫
取得本發明之與PD-1特異性結合之第一臂之方法，係選擇對MeMo(註冊商標)小鼠(參照WO2009/157771)將重組人類PD-1蛋白質免疫之方法。MeMo(註冊商標)小鼠係以含有非重組人類重鏈V基因區域、D基因區域及J基因區域及重組人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型基因之基因片段與小鼠恆定區域基因連結之方式，而使基因經改變之小鼠，藉由將抗體之標的蛋白質進行直接免疫，可使由具有多樣性之重鏈及共同輕鏈構成之抗體產生。
對12至16週齡之12隻MeMo(註冊商標)MS5B/MS9小鼠，將使用Gerbu adjuvant MM(Gerbu Biotechnik、型號#3001)而經乳劑化之重組人類PD-1-Fc融合蛋白質(R&D Systems、型號1086-PD)，以間隔14日之方式分別進行免疫。於免疫第0日、第14日及第28日皮下投予相同重組人類PD-1-Fc融合蛋白質，於後續之時間點，皮下投予溶解於PBS之相同重組人類PD-1-Fc融合蛋白質。於免疫第21日、第35日、第56日、第77日及第98日藉由使用人類PD-1強制表現HEK293T細胞株之流式細胞術評估血清中抗體價。將小鼠之淋巴組織使用於噬菌體展示基因庫的構築，該淋巴組織係於稀釋1000倍之血清中，將人類PD-1強制表現HEK293T細胞株染色時，相較於作為對照之人類PD-1非表現HEK293T細胞株，MFI值增加3倍以上者。滿足進行基因庫構築基準之小鼠，係於從抗體價評估日起3日以重組PD-1-Fc融合蛋白質進行追加免疫，回收脾臟及鼠徑淋巴節。血清中抗體價相對於人類PD-1及食蟹獼猴PD-1為1/100以 上，並且，藉由追加免疫抗體價未上昇之小鼠亦回收脾臟及鼠徑淋巴節。從此等淋巴組織萃取RNA後進行cDNA合成。
實施例2：用以取得具有與PD-1特異性結合之第一臂之抗PD-1抗體的噬菌體展示基因庫之構築(蛋白質免疫)
使用於實施例1調製之DNA，對免疫球蛋白重鏈可變區域家族使用特異性引子進行PCR反應。將相同PCR產物以限制酵素SfiI及XhoI切斷後插入至使用相同限制酵素切斷之MV1473噬菌粒(Phagemid)載體[包含編碼共同輕鏈之基因(人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01生殖細胞系列型基因)，構築同基因庫]，構築相同基因庫。
實施例3：篩選具有與PD-1特異性結合之第一臂之抗PD-1抗體
使用將人類PD-1-Fc融合蛋白質、人類PD-1-His標籤融合蛋白質、食蟹獼猴PD-1-His標籤融合蛋白質或小鼠PD-1-His標籤融合蛋白質編碼之盤，實施以對PD-1之結合性為基礎之噬菌體篩選。使用人類PD-1-Fc融合蛋白質時，與噬菌體進行培養之期間，藉由添加人類IgG(SIGMA、型號I4506)將Fc反應性殖株吸收。將與人類PD-1、食蟹獼猴PD-1及小鼠PD-1結合之結合噬菌體濃縮。藉由食蟹獼猴PD-1表現HEK293T細胞株之篩選，將與食蟹獼猴PD-1結合之噬菌體濃縮。利用藉由篩選獲得之噬菌體取得經轉形之大腸桿菌株TG1之殖株，並製作母盤(master plate)。
再者，以吸附了人類PD-1-Fc融合蛋白質之盤上對PD-1之結合性為基礎，從由上述篩選獲得之殖株之周質間隙萃取物實施噬菌體篩選。此外，選擇之基準係相對於於陰性對照孔(PBS)獲得之信號(OD450值)，獲得3倍以上信號者作為陽性殖株。
實施例4：具有與PD-1特異性結合之第一臂之抗PD-1抗體之候補殖株之DNA定序
實施藉由實施例3之篩選取得之陽性殖株之重鏈可變區域基因之DNA定序。經解析之DNA序列分類為超級團簇(CDR3為同一長度，CDR3之胺基酸序列有70%以上相同之一群)及團簇(重鏈CDR3之胺基酸序列相同之一群)。取得924個殖株，此等分類為146種之超級團簇及194種之團簇。
實施例5：利用對於PD-1表現細胞之結合性評估進行之篩選
從經分類之各個超級團簇，將滿足下述條件之抗PD-1單株抗體殖株選別、分離。
(1)於CDR區域高頻率地導入體細胞突變、
(2)具有使用頻率高之VH之生殖細胞系列型基因、及
(3)於對於人類PD-1-Fc融合蛋白質之結合性篩選中獲得高信號。
使用此等周質間隙萃取物所含有之Fab片段，將對於人類PD-1表現CHO-S細胞株、食蟹獼猴PD-1表現CHO-S細胞株之結合性，藉由抗小鼠IgG多株抗體進行檢出，藉此進行評估。經評估之117個殖株(105種團簇)中，於含有抗PD-1單株抗體殖株PD1-1、PD1-2、PD1-3及PD1-4之22個殖株中確認到對人類PD-1表現CHO-S細胞株之結合性。
實施例6：具有與PD-1特異性結合之第一臂之抗PD-1單株抗體之胺基酸置換體之製作
殖株PD1-1及PD1-4於其重鏈可變區域之架構4中含有脫醯胺化基序(Asn-Gly)。以取得脫醯胺化風險經減低之第一臂為目的，製作此脫醯胺化基序經變換之突變體。將殖株PD1-4之EU編號系統第119號之天冬醯胺酸(Asn)藉由公知 之部位特異性變異法，製作出改變成麩醯胺酸之殖株PD1-5並分離。殖株PD1-5對人類PD-1表現CHO-S細胞之結合性與殖株PD1-4為同等。
實施例7：具有與CD3特異性結合之第二臂之抗CD3單株抗體之篩選
以WO2005/118635中記載之抗CD3抗體殖株15C3之VH及由IGVK1-39/JK1共同輕鏈構成之抗CD3抗體殖株為基礎，為了取得荷電不均勻性更為減低之穩定之CD3結合Fab，利用下述方法取得本發明之具有「與CD3特異性結合之第二臂」之抗CD3抗體。
圖10表示之15C3之VH之胺基酸序列中，藉由將底線表示之第55號甘胺酸變換為丙胺酸，取得具有與前述抗CD3抗體殖株同等之人類CD3結合性，並且，荷電不均勻性經改善之抗CD3抗體殖株CD3-1。
再者，為了獲得使與共同輕鏈(IgVκ1-39*01/IGJκ1*01)之VH/VL相互作用改善之複數個CD3結合Fab，以殖株CD3-1之VH為基礎，構築複數表現Fab之噬菌體展示基因庫，該Fab係由胺基酸殘基經置換之殖株CD3-1之VH突變體構成者。將此噬菌體基因庫使用HBP-ALL細胞或重組人類CD3ε-Fc蛋白質進行篩選。將與重組人類CD3ε-Fc蛋白質結合之噬菌體以化學性溶出，並使用於細菌之再感染。去除複數倖存之細菌菌落後，萃取噬菌體並藉由流式細胞術針對細胞表面表現CD3之結合進行篩選。對於顯示CD3結合之所有噬菌體進行菌落PCR，使編碼VH之cDNA增幅，並確定其DNA序列。
其結果，所取得之具有由序列編號36之胺基酸序列構成之VH之抗CD3抗體殖株CD3-2係顯示與殖株CD3-1同等之CD3結合性及荷電均勻性。
實施例8：調製PD-1/CD3雙特異性單株抗體
表現與PD-1特異性結合之第一臂之各個重鏈之表現載體，係將於實施例5選擇之編碼抗PD-1單株抗體殖株PD1-1至PD1-5及PD1-6之各個重鏈可變區域之DNA，分別與編碼IgG1重鏈恆定區域之DNA連結而製作。另一方面，表現與CD3特異性結合之第二臂之重鏈之表現載體，係將於實施例7選擇之抗CD3單株抗體殖株中編碼CD3-2之重鏈可變區域之DNA，與將編碼IgG1重鏈恆定區域之DNA連結而製作。此處，表現此等重鏈恆定區域之基因，係在與PD-1特異性結合之第一臂時，使用表現具有L351D/L368E變異(DE變異)之Fc區域者，在與CD3特異性結合之第二臂時，使用表現具有L351K/T366K變異(KK變異)之Fc區域者。此等表現載體係以使IGVK1-39/JK1共同輕鏈一起表現，並且含有編碼此之基因之方式進行構築。再者，表現此等重鏈恆定區域之基因為了使各個的Fc效應子活性消失，以表現重鏈恆定區域第235號之白胺酸被置換為甘胺酸，第236號之甘胺酸被置換為精胺酸之方式改變，再者，為了避免轉譯後之加工，使用以缺失重鏈恆定區域C末端第447號之離胺酸之方式改變者。將此等表現載體一起基因導入至Free Style 293F細胞中，於培養上清液中使抗體產生。回收培養上清液，以蛋白質A親和層析法進行處理，將屬於本發明PD-1/CD3雙特異性單株抗體之殖株PD1-1(Bi)、殖株PD1-2(Bi)、殖株PD1-3(Bi)、殖株PD1-4(Bi)及殖株PD1-5(Bi)分別精製。又，針對殖株PD1-6(Bi)亦以同樣之方法製作。此外，此等PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株，係源自其製作所使用之抗PD-1單株抗體殖株PD1-1、PD1-2、PD1-3、PD1-4及PD1-5及PD1-6，就具有與PD-1特異性結合之第一臂之點而言，分別對應此等抗PD-1單株抗體殖株。
實施例9：評估PD-1/CD3雙特異性單株抗體之結合性
利用Biacore(註冊商標)進行測定，評估於實施例8取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體第一臂之各PD-1重組蛋白質之結合親和性，該Biacore(註冊商標)係使用了人類IgG1-Fc融合人類PD-1細胞外區域重組蛋白質或6×His標籤融合食蟹獼猴PD-1細胞外區域重組蛋白質。此外，該重組蛋白質之固定化係使用Series S Sensor Chip CM5傳感器芯片(GE醫療(GE Healthcare)，型號29-1049-88)。同樣地，利用Biacore(註冊商標)進行測定，評估同抗體第二臂之CD3結合親和性，該Biacore(註冊商標)使用了人類IgG1-Fc融合CD3δ/CD3ε細胞外區域重組蛋白質。將各殖株之第一臂對PD-1之結合親和性(Kd值)及第二臂對CD3δ/CD3ε之結合親和性示於圖11。
實施例10：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之結合性確認
確認了實施例8取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體對PD-1及CD3分別同時地特異性結合。
首先，對於表現人類CD3之人類PD-1缺失的Jurkat細胞株(人類T細胞株)分別添加殖株PD1-1(Bi)至PD1-6(Bi)，於冰上培養15分鐘。將細胞洗淨後添加3倍量之經生物素標識之可溶性PD-1重組蛋白質(R&D systems，型號1086-PD-050)，於冰上培養15分鐘。將細胞洗淨後添加100μL之Alexa Fluor 488標識鏈霉親和素(BioLegend，型號405235)1.25μg/mL，於冰上培養15分鐘。將細胞洗淨後以流式細胞術評估可溶性PD-1重組蛋白質之結合量。將該分析之結果示於圖12。
任一種殖株皆與PD-1及CD3同時結合。此外，於此實驗系統中未檢出非特異性結合。
實施例11：PD-1/CD3雙特異性單株抗體之第一臂之結合特性評估
為了評估實施例8取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體之第一臂對PD-1/PD-L1結合之影響，進行關於相同雙特異性單株抗體殖株與可溶性PD-L1重組蛋白質對PD-1之結合之競爭結合分析。首先，對於人類PD-1表現CHO-S細胞株分別添加殖株PD1-1(Bi)至PD1-6(Bi)，於冰上培養30分鐘。進一步，添加1/20量之經生物素標識之可溶性PD-L1重組蛋白質(R&D systems，型號156-B7-100)，於冰上培養30分鐘。將細胞洗淨後添加PE標識鏈霉親和素(BD Pharmingen，型號554061)，於冰上培養30分鐘。將細胞洗淨後以流式細胞術評估可溶性PD-L1重組蛋白質之結合量。將其結果示於圖13。
殖株PD1-1(Bi)至PD1-5(Bi)係即便相對於可溶性PD-L1重組蛋白質以20倍量存在，仍容許可溶性PD-L1重組蛋白質對PD-1之結合。另一方面，PD1-6(Bi)在同條件下，完全地阻礙可溶性PD-L1重組蛋白質對PD-1之結合。
實施例12：PD-1/CD3雙特異性單株抗體對活性化CD4 T細胞之體外(in vitro)抑制作用
使用源自健康人類末梢血液之CD4陽性T細胞(LONZA、型號2W-200)(人類T細胞)，評估對於來自活性化T細胞的IFN-γ產生之抑制作用。於固相化抗人類TCRVβ8抗體(Thermo Scientific，型號TCR1750)之細胞培養盤中播種人類T細胞，添加抗人類CD28抗體(BioLegend、型號302923)，進行72小時活化處置。接著，將進行此活化處置之人類T細胞於含有100Units/mL人類IL-2(R&D systems，型號202-IL)之新鮮培養基培養一晚。進一步，將回收之人類T細胞播種於固相化抗人類TCRVβ8抗體之其他細胞培養盤，同樣地添加抗人類CD28抗體，再次進行活化處置。此時，分別添加殖株PD1-1(Bi)至PD1-6(Bi)後，將再活化處置96小時後之培養上清液中所含有之IFN-γ以ELISA法定量(pg/mL)。將其結果示於圖14。殖株 PD1-1(Bi)至PD1-5(Bi)確認到IFN-γ產生抑制作用。相較於其他殖株，確認殖株PD1-6(Bi)之抑制作用有減弱的傾向。此外，對照抗體係作為非特異性抗體並使用與第一臂取得法相同之手法，免疫破傷風類毒素而取得之抗體。
實施例13：PD-1/CD3雙特異性單株抗體於實驗性過敏性腦脊髓炎小鼠模型(EAE模型)之生體內(in vivo)作用
於使用了將CD3ε及PD-1各基因分別被置換為人類CD3ε及人類PD-1基因之人類CD3ε/人類PD-1敲入(knock-in)C57BL/6小鼠之EAE模型中，評估本發明之PD-1/CD3雙特異性單株抗體於生體內(in vivo)之作用。將結核死菌H37Ra(BD Biosciences，型號231141)與不完全弗氏佐劑(Incomplete Freund's adjuvant)(BD Biosciences，型號263910)混合，調製出含有4mg/mL結核死菌H37Ra之完全弗氏佐劑(CFA)。將1mg/mL之MOG肽(ANASPEC，型號AS-60130)與等量之CFA混合，並調製出乳劑作為EAE模型之誘導劑。於該C57BL/6小鼠尾根部皮下投予該誘導劑200μL，於其免疫處置當日及第2日於尾靜脈內分別投予200μL之1μg/mL百日咳毒素(SIGMA-ALDRICH，型號P7208)。接著，於該C57BL/6小鼠，於免疫處置第6日及第7日將殖株PD1-1(Bi)至PD1-6(Bi)以分別2mg/kg之投予量1日1次腹腔內投予。免疫處置日後以大貫人等之方法為基準評估神經症狀(Onuki M，et al.,Microsc Res Tech 2001；52：731-9.)。將神經症狀之程度點數化(正常：點數0；尾弛緩：點數1；後肢部分麻痺：點數2；後肢麻痺：點數3；前肢麻痺：點數4及瀕死或死亡：點數5)，看到複數神經症狀時，採用高值作為評估日之神經症狀點數。此外，死亡例為至試驗完成為止神經症狀點數為5。其評估結果示於圖15至17。另外，人類CD3ε/人類PD-1敲入C57BL/6小鼠係將以於Genesis.2009 Jun；47(6)：414-22記載之方法為基準製作之人類CD3ε敲入小鼠及人類PD-1敲入小鼠藉由公知之方法進行交配而製作。
殖株PD1-1(Bi)至PD1-5(Bi)係於EAE模型顯著地抑制神經症狀發症，而殖株PD1-6(Bi)未顯示顯著的抑制效果。
實施例14：PD-1/CD3雙特異性單株抗體對於來自人類末梢血單核細胞之細胞激素釋出之體外(in vitro)作用評估
以解析PD-1/CD3雙特異性單株抗體之細胞激素釋出活性為目的，進行於人類末梢血單核細胞(以下，稱為人類PBMC)添加本發明之PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株或專利文獻3中揭示之PD-1/CD3雙特異性scDb(J110×UCHT1)之實驗。於人類PBMC(LONZA，型號CC-2702)以使PD-1/CD3雙特異性單株抗體之各殖株及J110×UCHT1成為30μg/mL及10μg/mL之方式進行添加，進行24小時之培養。將培養24小時後培養上清液中含有之IL-2利用多重免疫檢測儀(BIO-RAD，型號M50000007A)定量。將其結果示於圖18。此外，圖中之IL-2產生量(pg/mL)以平均值±標準誤差(N=3)表示。
相較於J110×UCHT1顯著地誘導IL-2產生，由PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株所致之IL-2產生低。
實施例15：PD1-5(Bi)相對於PD-1/CD3雙特異性單株抗體各殖株對PD-1之結合的交叉競爭性評估
為了評估於實施例8取得之PD-1/CD3雙特異性單株抗體之PD1-5(Bi)相對於各殖株PD1-1(Bi)至PD1-5(Bi)對PD-1之結合的交叉競爭性，進行競爭結合分析。
首先，對人類PD-1表現CHO-S細胞株添加殖株PD1-5(Bi)，於冰上培養20分鐘。進一步，相對於添加之殖株PD1-5(Bi)分別添加1/100量之生物素標 識之殖株PD1-1(Bi)至PD1-5(Bi)，於冰上培養20分鐘。將細胞洗淨後，添加PE標識鏈霉親和素(BD Pharmingen，型號554061)，於冰上培養20分鐘。將細胞洗淨後，以流式細胞術評估經生物素標識之殖株PD1-1(Bi)至PD1-5(Bi)之結合量。將其結果示於圖19。
PD1-5(Bi)阻礙殖株PD1-1(Bi)至PD1-4(Bi)對PD-1之結合，相同殖株係對於此等對PD-1之結合顯示交叉競爭。
實施例16：於人類末梢血單核球細胞移植超免疫不全小鼠中PD-1/CD3雙特異性單株抗體之生體內(in vivo)作用
對移植了人類末梢血液單核球細胞(PBMC)之超免疫不全小鼠(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，以下稱為NSG小鼠)，投予本發明之PD-1/CD3雙特異性單株抗體，評估於生體內(in vivo)對於T細胞增殖之作用。
將人類PBMC(LONZA，型號CC-2702)以每1隻小鼠1×107個之方式懸濁於DPBS，並移植至NSG小鼠之腹腔內。對該NSG小鼠各4例，於移植後3、7、10、14及17日，將對照抗體或PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株PD1-5(Bi)各個1日1次進行腹腔內投予。於移植後14或21日，使該NSG小鼠吸入異氟醚進行麻醉，摘出脾臟。將脾臟使用70μm之細胞過濾器(BD Falcon)將細胞單離。於調製之細胞懸濁液中添加以APC-Cy7螢光標識之抗CD4抗體(Biolegend，型號300518)或以FITC螢光標識之抗CD8抗體(Biolegend，型號301006)，使用流式細胞儀(BD Biosciences，機種BD LSR Fortessa X-20)及分析軟體FlowJo(Biolegend，型號300518社)測定人類CD4陽性細胞數及人類CD8陽性細胞數。將其評估結果示於圖20。
於人類PBMC移植後14及21日之任一日，相較於對照抗體投予群，PD1-5(Bi)投予群，係脾臟中之人類CD4陽性細胞數及人類CD8陽性細胞數有意義的少，相對於此等之細胞數增加，殖株PD1-5(Bi)顯示抑制作用。
實施例17：於小鼠抗體產生模型中PD-1/CD3雙特異性單株抗體之生體內(in vivo)作用
隊在實施例13製作之人類CD3ε/人類PD-1敲入C57BL/6小鼠投予本發明之PD-1/CD3雙特異性單株抗體，評估對於抗體產生之生體內(in vivo)作用。
將鎖眼帽血藍蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)(Thermo Scienctific，型號77600，以下稱為KLH)以DPBS溶解，調製200μg/mL之KLH溶液，進一步，與等量之ALUM(Cosmo Bio公司製造，型號LG-6000)於室溫混合30分鐘，作為誘導劑。於該小鼠腹腔內投予此誘導劑200μL進行免疫處置。將對照抗體或PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株PD1-5(Bi)於免疫後7及8日，1日1次腹腔內投予。於免疫後7至374日從小鼠尾靜脈採取血液50至80μL，調製血清。以ELISA法測定血清中之抗KLH抗體(IgG1)價。亦即，將KLH固相化，與KLH結合之抗KLH抗體使用HRP標識抗小鼠IgG1抗體(Bethyl Laboratories，型號A90-105P-38)檢出。其評估結果示於圖21。
對於該小鼠之抗KLH抗體產生，PD1-5(Bi)顯示抑制效果。又，至免疫後360日為止持續有意義的抑制效果。
實施例18：於自然發病糖尿病模型小鼠中PD-1/CD3雙特異性單株抗體之生體內(in vivo)作用
對自然病發糖尿病之人類CD3ε/人類PD-1敲入NOD小鼠投予本發明之PD-1/CD3雙特異性單株抗體，評估對於血糖值變化之生體內(in vivo)作用。
將該NOD小鼠從16週齡，每週1次以剃刀割傷尾靜脈，採取血液5至10μL，使用ACCU-CHEK Aviva(註冊商標)(Roche)測定血液中之葡萄糖濃度。將血中葡萄糖濃度連續2次顯示200mg/dL以上(高血糖域)之小鼠視為糖尿病病發，對確認病發之個體各7例腹腔內投予對照抗體或PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株PD1-5(Bi)2日。投予開始後以每週1次之頻率採血，測定血中葡萄糖濃度。將血中葡萄糖濃度未達200mg/dL視為正常血糖域。將其評估結果示於圖22。此外，該NOD小鼠係將於實施例13各個製作之人類CD3ε敲入小鼠及人類PD-1敲入小鼠以及NOD/ShiJcl小鼠藉由公知之方法進行交配而製作。
於投予開始後7及8週之時間點，PD1-5(Bi)投予群與對照抗體投予群相比，有意義正常血糖域之例數多，PD1-5(Bi)於糖尿病病發後之投予顯示治療效果。
實施例19：於人類FcRn結合部位之胺基酸導入了突變之PD-1/CD3雙特異性單株抗體之製作及FcRn結合性評估
以胺基酸置換之公知技術為基準之方法，分別將PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株PD1-5(Bi)之重鏈恆定區域中EU編號系統第252號之甲硫胺酸分別被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸及天冬胺酸而製作出抗體殖株Mut1、Mut2、Mut3及Mut4。再者，以同樣的方法分別製作於相同殖株PD1-5(Bi)之重鏈恆定區域中EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸之抗體殖株Mut5、第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸之抗體殖株Mut6。
接著，針對此等抗體殖株分別使用表面電漿共振評估對於人類FcRn或小鼠FcRn之結合親和性。於Biacore T200(GE醫療公司製造)安裝Biotin CAPture Kit(GE醫療公司製造，型號28-9202-34)之Series S Sensor Chip CAP，將 Human FcRn-human B2M(Immunitrack、型號ITF01)及Murine FcRn-murine B2M(Immunitrack、型號ITF07)分別固定化。於pH6.0之條件評估PD1-5(Bi)及Mut1至Mut6之各個結合性。將對人類FcRn之結合性實驗結果示於圖23及24，將小鼠FcRn之結合性實驗結果示於圖25。
Mut1至Mut6對人類FcRn之各親和性比，係較PD1-5(Bi)(解離常數(KD值)：2.75×10-8M)低，尤其是Mut4及Mut2顯著低。Mut1及Mut4對小鼠FcRn之各親和性，係比PD1-5(Bi)(KD值：1.61×10-8M)更低(Mut1之KD值：4.67×10-8M)，尤其是Mut4顯著低。
實施例20：PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株Mut4之血中動態
使用於實施例13製作之人類CD3ε/人類PD-1敲入C57BL/6小鼠，評估殖株Mut4於體內之血中動態。
對該C57BL/6小鼠之尾部靜脈內投予相同殖株後，於30分鐘及1、2、4、8、24及288小時之時間點將小鼠之尾靜脈以剪刀割傷一部分，將採取約40μL之血液至經肝素處理之管子中。將採取之血液離心分離，調製血漿，使用電化學發光(ECL)法測定相同殖株之血漿中濃度。從血漿中濃度之推移算出其血中半衰期。
測定之結果，相同殖株之血中半衰期為8.0小時，比原本之PD1-5(Bi)之血中半衰期約160時間縮短。
實施例21：PD-1/CD3雙特異性單株抗體殖株Mut4於EAE模型之生體內(in vivo)作用
於以實施例13記載之方法為基準製作之EAE模型，評估殖株Mut4之生體內(in vivo)作用。
對該EAE模型小鼠各8例，從免疫後6至10日之5日，1日1次腹腔內投予對照抗體或殖株Mut4。利用以大貫人等之方法(Onuki M，et al.,Microsc Res Tech 2001；52：731-9.)為基準之實施例13記載之方法，評估免疫處置日以後該小鼠之神經症狀，合計從免疫處置日至免疫後30日為止之觀察期間累積之神經症狀點數。其評估結果示於圖26。
殖株Mut4於EAE模型中有意義地抑制神經症狀。
[產業上之可利用性]
本發明之PD-1/CD3雙特異性抗體或其抗體片段係對自體免疫疾病等之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療有用。
[序列表]
P20-110WO_PCT_雙特異性抗體_20200721_163548_0.txt
<110> 日商小野藥品工業股份有限公司(ONO PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)
<120> 雙特異性抗體
<130> P20-110WO
<150> JP 2019-139751
<151> 2019-07-30
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 109125604-A0202-12-0070-1
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
331313
<213> 智人
<400> 2
Figure 109125604-A0202-12-0071-2
<210> 3
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Figure 109125604-A0202-12-0071-3
Figure 109125604-A0202-12-0072-4
<210> 4
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Figure 109125604-A0202-12-0072-5
<210> 5
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Figure 109125604-A0202-12-0073-6
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Figure 109125604-A0202-12-0073-7
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Figure 109125604-A0202-12-0074-8
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Figure 109125604-A0202-12-0074-9
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Figure 109125604-A0202-12-0074-10
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Figure 109125604-A0202-12-0074-11
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Figure 109125604-A0202-12-0074-13
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Figure 109125604-A0202-12-0075-14
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Figure 109125604-A0202-12-0075-15
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Figure 109125604-A0202-12-0075-16
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Figure 109125604-A0202-12-0075-17
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Figure 109125604-A0202-12-0076-18
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Figure 109125604-A0202-12-0076-19
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Figure 109125604-A0202-12-0076-20
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Figure 109125604-A0202-12-0076-21
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Figure 109125604-A0202-12-0076-22
Figure 109125604-A0202-12-0077-23
<210> 21
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Figure 109125604-A0202-12-0077-24
<210> 22
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Figure 109125604-A0202-12-0077-25
Figure 109125604-A0202-12-0078-26
<210> 23
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Figure 109125604-A0202-12-0078-27
Figure 109125604-A0202-12-0079-28
<210> 24
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Figure 109125604-A0202-12-0080-29
Figure 109125604-A0202-12-0081-30
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Figure 109125604-A0202-12-0081-31
Figure 109125604-A0202-12-0082-32
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Figure 109125604-A0202-12-0082-33
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Figure 109125604-A0202-12-0082-34
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Figure 109125604-A0202-12-0082-35
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Figure 109125604-A0202-12-0082-36
Figure 109125604-A0202-12-0083-37
<210> 30
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 30
Figure 109125604-A0202-12-0083-38
Figure 109125604-A0202-12-0084-39
<210> 31
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 31
Figure 109125604-A0202-12-0084-40
<210> 32
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 32
Figure 109125604-A0202-12-0085-41
<210> 33
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 33
Figure 109125604-A0202-12-0085-42
Figure 109125604-A0202-12-0086-43
<210> 34
<211> 381
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<400> 34
Figure 109125604-A0202-12-0086-44
Figure 109125604-A0202-12-0087-45
<210> 35
<211> 321
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 35
Figure 109125604-A0202-12-0087-46
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Figure 109125604-A0202-12-0088-47
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Figure 109125604-A0202-12-0088-48
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Figure 109125604-A0202-12-0088-49
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Figure 109125604-A0202-12-0089-50
<210> 40
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(354)
<400> 40
Figure 109125604-A0202-12-0089-51
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Figure 109125604-A0202-12-0090-52
<210> 42
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Figure 109125604-A0202-12-0090-53
Figure 109125604-A0202-12-0091-54
<210> 43
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Figure 109125604-A0202-12-0091-55
Figure 109125604-A0202-12-0092-56
Figure 109125604-A0202-12-0093-57
<210> 44
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Figure 109125604-A0202-12-0093-58
Figure 109125604-A0202-12-0094-59
<210> 45
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Figure 109125604-A0202-12-0095-60
Figure 109125604-A0202-12-0096-61
<210> 46
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Figure 109125604-A0202-12-0096-62
Figure 109125604-A0202-12-0097-63
Figure 109125604-A0202-12-0098-64
<210> 47
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Figure 109125604-A0202-12-0098-65
Figure 109125604-A0202-12-0099-66
<210> 48
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Figure 109125604-A0202-12-0099-67
Figure 109125604-A0202-12-0100-68
Figure 109125604-A0202-12-0101-69
<210> 49
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Figure 109125604-A0202-12-0101-70
Figure 109125604-A0202-12-0102-71
<210> 50
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Figure 109125604-A0202-12-0103-72
Figure 109125604-A0202-12-0104-73
<210> 51
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Figure 109125604-A0202-12-0104-74
Figure 109125604-A0202-12-0105-75
Figure 109125604-A0202-12-0106-76
<210> 52
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Figure 109125604-A0202-12-0106-77
Figure 109125604-A0202-12-0107-78
<210> 53
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Figure 109125604-A0202-12-0107-79
Figure 109125604-A0202-12-0108-80
Figure 109125604-A0202-12-0109-81

Claims (39)

  1. 一種雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂，其中，與PD-1特異性結合之第一臂含有：
    選自下列(A)至(E)之任一種VH，
    (A)具有(a)由序列編號6之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號7之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號8之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
    (B)具有(a)由序列編號9之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號10之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號11之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
    (C)具有(a)由序列編號12之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號13之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號14之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
    (D)具有(a)由序列編號15之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號16之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號17之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，及
    (E)具有(a)由序列編號18之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號19之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號20之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；以及
    (F)具有(a)由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、
    (b)由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及
    (c)由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之VL；
    與CD3特異性結合之第二臂含有：
    (A)具有(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
    (B)具有(a)由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、
    (b)由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及
    (c)由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之VL，
    此處，該IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中之(1)EU編號系統第252號之甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸、(2)EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸、及/或(3)EU編號系統第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸，
    再者，與PD-1特異性結合之第一臂中之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之任一個或複數個CDR中，各者之任意1至5個胺基酸殘基可被置換為保守性胺基酸，及/或與CD3特異性結合之第二臂中之VH-CDR1、VH-CDR2及VH-CDR3之任一個或複數個CDR中，各者之任意1至5個胺基酸殘基可被置換為保守性胺基酸。
  2. 如請求項1所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂含有：
    選自下列(A)至(E)之任一種VH，
    (A)具有(a)由序列編號6之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號7之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號8之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
    (B)具有(a)由序列編號9之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號10之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號11之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
    (C)具有(a)由序列編號12之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號13之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號14之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，
    (D)具有(a)由序列編號15之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號16之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號17之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，及
    (E)具有(a)由序列編號18之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號19之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號20之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH；以及
    (F)具有(a)由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、
    (b)由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及
    (c)由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之VL；
    與CD3特異性結合之第二臂含有：
    (A)具有(a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3之VH，及
    (B)具有(a)由序列編號26之胺基酸序列構成之VL-CDR1、
    (b)由序列編號27之胺基酸序列構成之VL-CDR2及
    (c)由序列編號28之胺基酸序列構成之VL-CDR3之VL。
  3. 如請求項1或2所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，
    (i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH具有
    (a)由序列編號6之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號7之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號8之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
    (ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH具有
    (a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
  4. 如請求項1或2所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，
    (i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH具有
    (a)由序列編號9之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號10之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號11之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
    (ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH具有
    (a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
  5. 如請求項1或2所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，
    (i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH具有
    (a)由序列編號12之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號13之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號14之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
    (ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH具有
    (a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
  6. 如請求項1或2所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，
    (i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH具有
    (a)由序列編號15之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號16之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號17之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
    (ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH具有
    (a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
  7. 如請求項1或2所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，
    (i)與PD-1特異性結合之第一臂之VH具有
    (a)由序列編號18之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號19之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號20之胺基酸序列構成之VH-CDR3，
    (ii)與CD3特異性結合之第二臂之VH具有
    (a)由序列編號37之胺基酸序列構成之VH-CDR1、
    (b)由序列編號38之胺基酸序列構成之VH-CDR2及
    (c)由序列編號39之胺基酸序列構成之VH-CDR3。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH之FR1、FR2及FR3區域係分別對應於生殖細胞系列型V基因IGHV7-4-1之受到體細胞突變之該基因所編碼之胺基酸序列，架構4區域係由生殖細胞系列型J基因JH6c之受到體細胞突變之該基因所編碼之胺基酸序列構成，惟排除VH-CDR3區域中含有之胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一種胺基酸序列、或與該VH之胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列構成。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列、或與該VH之胺基酸序列至少80%相同之胺基酸序列構成。
  11. 如請求項1所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂之VH係由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一種胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
  12. 如請求項1或3所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂中之VH係由序列編號1之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂中之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
  13. 如請求項1或4所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其 中，與PD-1特異性結合之第一臂中之VH為係序列編號2之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂中之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
  14. 如請求項1或5所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂中之VH係由序列編號3之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂中之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
  15. 如請求項1或6所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂中之VH係由序列編號4之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂中之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
  16. 如請求項1或7所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂中之VH係由序列編號5之胺基酸序列構成，與CD3特異性結合之第二臂中之VH係由序列編號36之胺基酸序列構成。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂及/或與CD3特異性結合之第二臂分別具有由序列編號25之胺基酸序列構成之VL。
  18. 一種雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂，其中，
    (A)與PD-1特異性結合之第一臂係具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5之任一種胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；及
    (B)與CD3特異性結合之第二臂係具有由序列編號36之胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；
    該IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中之(1)EU編號系統第252號之甲硫胺 酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸、(2)EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸、及/或(3)EU編號系統第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸。
  19. 一種雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂，其中，該與PD-1特異性結合之第一臂係與下列者對PD-1之結合進行交叉競爭：(1)與PD-1特異性結合之第一臂，其係具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；或(2)與PD-1特異性結合之單株抗體之可變區域，其係由該VH及VL構成；
    該IgG1抗體之2個重鏈恆定區域中之(1)EU編號系統第252號之甲硫胺酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸、(2)EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸、及/或(3)EU編號系統第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸。
  20. 一種雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂，其中，由與該PD-1特異性結合之第一臂所進行之對PD-1之結合係與下列者進行交叉競爭：(1)與PD-1特異性結合之第一臂，其係具有由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；或(2)與PD-1特異性結合之單株抗體之可變區域，其係由該VH及VL構成；
    該IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中之(1)EU編號系統第252號之甲硫胺 酸被置換為麩胺酸、脯胺酸、精胺酸或天冬胺酸、(2)EU編號系統第434號之天冬醯胺酸被置換為白胺酸、及/或(3)EU編號系統第438號之麩醯胺酸被置換為麩胺酸。
  21. 如請求項19或20所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，該與CD3特異性結合之第二臂係更與下列者對CD3之結合進行交叉競爭：(1)與CD3特異性結合之第二臂，其係具有由序列編號36之胺基酸序列構成之VH，及由序列編號25之胺基酸序列構成之VL；或(2)與CD3特異性結合之單株抗體的可變區域，其係由該VH及VL構成。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，與PD-1特異性結合之第一臂係容許PD-1及PD-L1間間之相互作用。
  23. 如請求項1至22中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，係於投予中或從投予起24小時以內，充分地減低細胞激素的產生。
  24. 如請求項23所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，細胞激素係至少為IL-2、IFN-γ或TNF-α。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，該雙特異性IgG1抗體對Fc受體之結合經消失或減弱。
  26. 如請求項25所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，該IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中，EU編號系統第235號之白胺酸分別被置換為甘胺酸、及/或第236號之甘胺酸分別被置換為精胺酸。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH的重鏈恆定區域中，EU編 號系統第351號之白胺酸被置換為離胺酸且第366號之蘇胺酸被置換為離胺酸，具有與CD3特異性結合之第二臂之VH的重鏈恆定區域中，第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸。
  28. 如請求項1至26中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH的重鏈恆定區域中，EU編號系統第351號之白胺酸被置換為天冬胺酸且第368號之白胺酸被置換為麩胺酸，具有與CD3特異性結合之第二臂之VH的重鏈恆定區域中，第351號之白胺酸被置換為離胺酸且第366號之蘇胺酸被置換為離胺酸。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，該雙特異性IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中，分別缺失EU編號系統第447號之離胺酸。
  30. 如請求項1至29中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，該IgG1抗體中之2個重鏈恆定區域中，EU編號系統第252號之甲硫胺酸被置換為天冬胺酸。
  31. 如請求項1至30中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其對胎兒性Fc受體之結合經消失或減弱。
  32. 如請求項1至31中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，請求項1至31中任一項所述之IgG1抗體於血液中之半衰期，係比該胺基酸未經置換之原本抗體更為縮短。
  33. 如請求項1至32中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，相較於該胺基酸未經置換之原本抗體，請求項1至32中任一項所述之IgG1抗體於血液中之半衰期係縮短至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%或至少90%。
  34. 如請求項1至33中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH的重鏈係含有由選自序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域。
  35. 如請求項1至34中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，具有與CD3特異性結合之第二臂之VH的重鏈係含有由選自序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域。
  36. 如請求項1至35中任一項所述之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，其中，具有與PD-1特異性結合之第一臂之VL的輕鏈及/或具有與CD3特異性結合之第二臂之VL的輕鏈，係含有由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域。
  37. 一種雙特異性IgG1抗體或其抗體片段，係具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂，其中，
    (A)具有與PD-1特異性結合之第一臂之VH的重鏈，係包含由選自序列編號1、序列編號2、序列編號3、序列編號4及序列編號5中之任一種胺基酸序列構成之VH，及由選自序列編號42、序列編號43、序列編號44、序列編號45、序列編號46及序列編號47中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域，
    (B)具有與PD-1特異性結合之第一臂之VL的輕鏈，係包含由序列編號25之胺基酸序列構成之VL及由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域，
    (C)具有與CD3特異性結合之第二臂之VH的重鏈，係包含由選自序列編號 36之胺基酸序列構成之VH，及由選自序列編號48、序列編號49、序列編號50、序列編號51、序列編號52及序列編號53中之任一種胺基酸序列構成之重鏈恆定區域，及
    (D)具有與CD3特異性結合之第二臂之VL的輕鏈，係包含由序列編號25之胺基酸序列構成之VL及由序列編號29之胺基酸序列構成之輕鏈恆定區域。
  38. 一種醫藥組成物，係含有選自請求項1至37中任一項所述之具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段、及藥學上容許之載體。
  39. 一種自體免疫疾病之預防、症狀進展抑制、復發抑制及/或治療劑，係含有選自請求項1至37中任一項所述之具有與PD-1特異性結合之第一臂及與CD3特異性結合之第二臂之雙特異性IgG1抗體或其抗體片段作為有效成分。
TW109125604A 2019-07-30 2020-07-29 雙特異性抗體 TW202118790A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019139751 2019-07-30
JP2019-139751 2019-07-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202118790A true TW202118790A (zh) 2021-05-16

Family

ID=74229916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109125604A TW202118790A (zh) 2019-07-30 2020-07-29 雙特異性抗體

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20220281977A1 (zh)
EP (1) EP4008348A4 (zh)
JP (2) JP6856183B1 (zh)
KR (1) KR20220039720A (zh)
CN (1) CN114174343A (zh)
AU (1) AU2020322765A1 (zh)
BR (1) BR112022001473A2 (zh)
CA (1) CA3149309A1 (zh)
IL (1) IL290050A (zh)
MX (1) MX2022000971A (zh)
PH (1) PH12022550190A1 (zh)
TW (1) TW202118790A (zh)
WO (1) WO2021020416A1 (zh)
ZA (1) ZA202201247B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202438530A (zh) * 2018-02-09 2024-10-01 日商小野藥品工業股份有限公司 雙特異性抗體

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
NZ226694A (en) 1987-10-28 1994-04-27 Oncogen Human immunoglobulin produced by recombinant dna techniques
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5151504A (en) 1989-11-17 1992-09-29 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for purification of monoclonal antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0710719B1 (en) 1990-01-12 2007-03-14 Amgen Fremont Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
DE69233104T2 (de) 1991-07-15 2004-05-13 The Wellcome Foundation Ltd., Greenford Herstellung von Antikörpern
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
JP4210036B2 (ja) 1999-04-15 2009-01-14 クルセル ホランド ベー ヴェー ヒト細胞における組み換え蛋白質の生産
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
NZ519012A (en) 2001-05-21 2003-10-31 Orgapack Gmbh Manually actuated strapping unit for wrapping a steel strap around a packaged item
EP1445264B1 (en) 2001-07-31 2011-09-14 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Substance specific to pd-1
JP4836451B2 (ja) 2002-07-18 2011-12-14 メルス ベー ヴェー 抗体混合物の組換え生産
JP2004072286A (ja) 2002-08-05 2004-03-04 Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> 構造変化検出方法および通信網異常状態検出方法、並びに、その装置およびプログラム
ES2729974T3 (es) 2003-01-23 2019-11-07 Ono Pharmaceutical Co Anticuerpo específico de PD-1 y CD3 humanas
WO2005047327A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
KR101266716B1 (ko) 2004-06-03 2013-05-31 노비뮨 에스 에이 항-ｃｄ3 항체 및 그의 사용 방법
JP4652414B2 (ja) * 2004-11-12 2011-03-16 ゼンコー・インコーポレイテッド ＦｃＲｎとの変化した結合を有するＦｃ変異体
SG10201914027VA (en) 2008-06-27 2020-03-30 Merus Nv Antibody producing non-human mammals
US9701749B2 (en) * 2011-08-11 2017-07-11 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Therapeutic agent for autoimmune diseases comprising PD-1 agonist
EP3594232A1 (en) 2012-04-20 2020-01-15 Merus N.V. Methods and means for the production of ig-like molecules
WO2014051433A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Merus B.V. BISPECIFIC IgG ANTIBODIES AS T CELL ENGAGERS
EA201890028A1 (ru) * 2015-07-10 2018-08-31 Мерус Н.В. Антитело, связывающее cd3 человека
JP6764474B2 (ja) * 2015-09-25 2020-09-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体及び使用方法
PE20200294A1 (es) * 2017-06-05 2020-02-05 Janssen Biotech Inc Anticuerpos que se unen especificamente a pd-1 y metodos de uso
US20200317783A1 (en) * 2017-10-06 2020-10-08 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Bispecific antibody

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021020416A1 (ja) 2021-02-04
BR112022001473A2 (pt) 2022-03-22
KR20220039720A (ko) 2022-03-29
CA3149309A1 (en) 2021-02-04
CN114174343A (zh) 2022-03-11
MX2022000971A (es) 2022-02-14
JP7574692B2 (ja) 2024-10-29
ZA202201247B (en) 2023-08-30
JP2021075580A (ja) 2021-05-20
EP4008348A4 (en) 2023-11-15
JPWO2021020416A1 (ja) 2021-09-13
IL290050A (en) 2022-03-01
PH12022550190A1 (en) 2022-11-21
US20220281977A1 (en) 2022-09-08
EP4008348A1 (en) 2022-06-08
JP6856183B1 (ja) 2021-04-07
AU2020322765A1 (en) 2022-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7363828B2 (ja) 二重特異性抗体
JP7476997B2 (ja) 二重特異性抗体
JP7688805B2 (ja) 二重特異性抗体
WO2021025140A1 (ja) 二重特異性タンパク質
JP7574692B2 (ja) 二重特異性抗体
RU2796019C9 (ru) Биспецифическое антитело
RU2796019C2 (ru) Биспецифическое антитело
JP2022060182A (ja) 二重特異性抗体を有効成分として含む医薬組成物
HK40069431A (zh) 雙特異性抗體
HK40036202A (zh) 雙特異性抗體