DE69233104T2

DE69233104T2 - Herstellung von Antikörpern

Info

Publication number: DE69233104T2
Application number: DE69233104T
Authority: DE
Inventors: James Scott Beckenham Crowe; Alan Peter Beckenham Lewis
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1992-07-14
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2012-07-15
Also published as: AU2279892A; AU662752B2; HUT69798A; KR100255717B1; TW373023B; DE69233104D1; IE922287A1; FI940144A0; US5876961A; EP0523949A1; WO1993002190A1; CA2111858A1; HU220355B; FI940144A; JPH07502882A; NZ243558A; IL102490A0; HU9400110D0; ATE243747T1; ES2199216T3

Description

Diese Erfindung betrifft die Herstellung rekombinanter Primaten-Antikörper durch DNA-Technik, ihre Expression in eukaryotischen Zellinien und die Verwendung solcher Antikörper in der therapeutischen und prophylaktischen Behandlung von Menschen.
Antikörper oder Immunglobuline sind proteinartige bifunktionelle Moleküle. Eine Region, die zwischen unterschiedlichen Antikörpern hoch variabel ist, ist verantwortlich für die Bindung an ein Antigen, z. B. die vielen unterschiedlichen infektiösen Mittel, denen der Körper begegnen kann, während die zweite, konstante Region für die Bindung an die Fc-Rezeptoren von Zellen verantwortlich ist und ebenfalls das Komplement aktiviert, ein komplexes System von Proteinen, die für die Zellyse verantwortlich sind. Auf diese Weise stellen Antikörper eine vitale Komponente der Immunreaktion von Säugetieren bei der Zerstörung fremder Mikroorganismen und Viren dar.
Antikörper werden in verschiedene Klassen auf der Basis der Struktur der konstanten Region unterteilt. Bei Menschen können z. B. fünf Hauptstrukturklassen identifiziert werden, Immunglobulin G oder IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Jede Klasse unterscheidet sich auf der Basis ihrer physikalischen und biologischen Charakteristika, die in Beziehung zur Funktion des Immunglobulins im Immunsystem stehen. IgGs können ferner in vier Unterklassen unterteilt werden: IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4, beruhend auf Unterschieden in der Aminosäure-Zusammensetzung der schweren Kette und in der Disulfid-Verbrückung (siehe nachfolgend für eine Erläuterung), was zu Unterschieden im biologischen Verhalten führt. Eine Beschreibung der Klassen und Unterklassen wird angegeben in "Essential Immunology" von Ivan Roitt, Blackwell Scientific Publications.
Ein Antikörpermolekül ist aus zwei leichten Ketten und zwei schweren Ketten zusammengesetzt, die durch Interketten-Disulfidbindungen zusammengehalten werden. Jede leichte Kette ist an eine schwere Kette durch Disulfidbindungen gebunden, und die zwei schweren Ketten sind aneinander durch Disulfidbindungen gebunden. Jede schwere Kette hat an einem Ende eine variable Domäne, gefolgt von einer Anzahl von konstanten Domänen, und jede leichte Kette hat eine variable Domäne an einem Ende und eine konstante Domäne am anderen Ende. Die variable Domäne der leichten Kette ist angeglichen an die variable Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der leichten Kette ist angeglichen an die erste konstante Domäne der schweren Kette. Die verbleibenden konstanten Domänen der schweren Kette sind aneinander angeglichen. Die konstanten Domänen in den leichten und schweren Ketten sind nicht direkt an der Bindung des Antikörpers an das Antigen beteiligt.
Die variablen Domänen jedes Paars von leichten und schweren Ketten bilden die Antigen-Bindungsstelle. Sie haben die gleiche allgemeine Struktur, wobei jede Domäne ein Gerüst von vier Regionen umfaßt, deren Sequenzen relativ konserviert sind, verbunden durch drei komplementär bestimmende Regionen ("complementarity determining regions", CDRs). Die vier Gerüstregionen nehmen weitgehend eine beta-Faltblatt-Konformation an, und die CDRs bilden Schleifen, die die beta-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon umfassen. Die CDRs werden in enger Nähe durch die Gerüstregionen gehalten und tragen mit den CDRs aus der anderen Domäne zur Bildung der Antigen-Bindungsstelle bei.
Die Antikörperketten werden durch Gene an drei separaten Genorten auf unterschiedlichen Chromosomen codiert. Ein Genort codiert die Isotypen der schweren Kette, und es gibt separate Genorte für die leichten κ- und λ-Ketten, obwohl ein B-Lymphozyt nur aus einem dieser Genorte der leichten Kette transkribiert. Die Gene, die die variablen Domänen des Antikörpers codieren, werden während der B-Lymphozyten-Ontogenese durch einen Prozeß der Rekombination erzeugt, der die Verbindung der V-, D- und J-Genregionen beinhaltet. Ein einzelner B-Lymphozyt wird nur eine rekombinierte variable Domäne der schweren Kette und eine der leichten Kette verwenden um sicherzustellen, daß er nur eine Antigen-Spezifität besitzt. So werden nur ein Allel der schweren Kette und ein Allel der leichten Kette durch einen einzelnen B-Lymphozyt exprimiert. Dies ist als Allelausschluß bekannt.
Der Kontakt eines Tieres mit einem Antigen durch Infektion oder Immunisierung führt zur Erzeugung unterschiedlicher Antikörper mit unterschiedlichen Spezifitäten und Affinitäten. Ein aus dem immunisierten Tier erhaltenes Antiserum wird daher heterogen sein und eine Ansammlung von Antikörpern enthalten, die durch viele verschiedene Lymphozytenklone erzeugt werden. So erhaltene Antikörper werden als polyklonale Antikörper bezeichnet, und die polyklonale Natur war ein Hauptnachteil in der Ver- wendung von Antikörpern in therapeutischen Anwendungen und in diagnostischen Tests.
Ein Hauptschritt nach vorne fand 1975 statt, als Kohler und Milstein (Nature, 1975, 256, 495–497) die erfolgreiche Fusion von Milzzellen aus mit einem Antigen immunisierten Mäusen mit Zellen einer mausartigen Myelomlinie berichteten. Die resultierenden Hybridzellen, als Hybridome bezeichnet, besitzen die Eigenschaften der aus den Milzzellen stammenden Antikörperproduktion und des aus den Myelomzellen stammenden kontinuierlichen Wachstums. Jedes Hybridom synthetisiert und sezerniert einen einzelnen Antikörper für eine besondere Determinante des ursprünglichen Antigens. Um sicherzustellen, daß alle Zellen in einer Kultur identisch sind, d. h. daß sie die für die Synthese einer einzigen Antikörperart erforderliche genetische Information enthalten, werden die aus der Zellfusion resultierenden Hybridome kloniert und subkloniert. Auf diese Weise produzieren die klonierten Hybridome homogene Antikörper der ursprünglichen Tierart, aus der die Milzzellen stammten.
Die Fähigkeit zur Erzeugung monoklonaler Antikörper hat die Diagnose vieler Krankheiten revolutioniert und stellt die Möglichkeit der Prävention und Immuntherapie zahlreicher pathologischer Störungen bereit. Unglücklicherweise werden fremde Antikörper, und zwar Antikörper nichtmenschlicher Arten, wie von Maus oder Ratte, die wiederholt an einen Menschen zur Impfung oder Behandlung verabreicht werden, durch das Immunsystem des Individuums erkannt und werden wahrscheinlich eine ungewünschte Anti-Globulinreaktion verursachen. Diese Anti-Antikörperreaktion erfolgt aufgrund des fremden Ursprungs der konstanten Domänen und der vier Gerüstregionen. Das Ergebnis dieser Reaktion ist wahrscheinlich die Neutralisierung des therapeutischen Antikörpers und die Auslösung schädlicher anaphylaktischer oder allergischer Reaktionen. Außerdem fixieren nicht-menschliche monoklonale Antikörper menschliches Komplement nicht besonders gut und lösen weniger wahrscheinlich nicht-spezifische Mechanismen der Zellklärung aus, wie Antikörper-abhängige Zell-vermittelte Cytotoxizität (ADCC), hinsichtlich der Unterschiede der Effektorfunktion der konstanten Region des Antikörpers. Nicht-menschliche monoklonale Antikörper sind daher nicht so wirksam wie menschliche Antikörper in der Klärung infizierter oder erkrankter Zellen. Damit ein therapeutischer Antikörper wirksam ist und im Kreislauf ohne Hervorrufung einer Anti-Antikörperreaktion verbleibt, muß er daher der Erkennung durch das Immunsystem des Empfängers entkommen können.
Eine Lösung für dieses Problem ist die Bildung chimärer Antikörper wie in Morrison et al. (P. N. A. S., 1984, 81, 6851–6855) und Neuberger et al. (Nature, 1985, 314, 268–240) beschrieben, worin die variable Region einer fremden Art, die aus einem Hybridom wie oben beschrieben stammt, an die konstante Region von menschlichem Antikörper gepfropft wird. Jedoch bleibt die variable Region in dieser Situation fremd für den Empfängerp daher kann sie erkannt und noch immer ein signifikantes Immunogenitätsproblem darstellen. Die Humanisierung eines Antikörpers, wie beschrieben in Jones et al. (Nature, 1986, 321, 522–525) und in Riechmann et al. (Nature 1988, 332, 323–327), worin die CDRs einer fremden Antikörperart an ein menschliches Antikörpergerüst gepfropft werden, mildert tatsächlich viele dieser Probleme. Jedoch ist die CDR-Pfropfung von Antikörpern ein komplizierter Prozeß, und der resultierende Antikörper kann eine weitere Modifizierung erfordern, um seine Bindungsaffinität aufrechtzuerhalten. Es ist daher klar, daß die optimale Form eines Antikörpers zur Vermeidung der Erkennung durch das menschliche Immunsystem ein menschlicher Antikörper oder ein Antikörper ist, der im wesentlichen identisch mit einem menschlichen Antikörper ist.
Einzelberichte haben angeregt, daß Menschaffen (z. B. Schimpansen) und Affen (z. B. Cynomolgus, Rhesus, Aotus), die üblicherweise als Labortiere verwendet werden, Immunreaktionen aufweisen, die ausreichend nahe an denjenigen von Menschen sind, um gute Infektionsmodelle bereitzustellen. Es wurde ebenfalls angeregt, daß ihre Antikörper ausreichend homolog zu menschlichen Antikörpern sein können, um einige der Problem auszuräumen, denen man sich z. B. bei Nagetier-Antikörpern gegenübersieht. Es gibt keinen veröffentlichten Nachweis dafür, und wenige nicht-menschliche Primaten-Zellinien, falls überhaupt, sind zum Testen verfügbar. Der Prozeß zum Erhalt solcher Antikörper ist daher äußerst problematisch. Zellinien wurden aus menschlichen Lymphozyten produziert, aber solche Linien besitzen eine geringe Stabilität, bilden nicht leicht Hybride, die stabiler sein könnten, und produzieren gewöhnlich geringe Ausbeuten von Antikörpern, wenn sie in vitro kultiviert werden. Primatenzellen können ebenfalls fremde infektiöse Nukleinsäure beherbergen, z. B. aus einem Virus, was Problem der Kreuzinfektion des zu behandelnden Menschen verursacht. Langwierige Reinigungsund/oder Sterilisationsverfahren müssen eingesetzt werden, bevor der daraus produzierte Antikörper in einer zu Verabreichung an Menschen akzeptablen Form ist.
EP-A-314161 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Immunglobulin in einer eukaryotischen Wirtszelle. Die Wirtszelle wird mit funktionsfähig verknüpften ersten und zweiten Genen transfiziert, die für die menschlichen variablen bzw. konstanten Regionen der schweren Kette codieren. Die Wirtszelle wird ebenfalls mit funktionsfähig verknüpften Genen transfiziert, die für variable und konstante Regionen einer menschlichen leichten Kette codieren. Diese transfizierte Zelle wird kultiviert, und rekombinante menschliche Immunglobuline mit variablen Regionen der gewünschten Bindungsspezifität können aus der Zellkultur gewonnen werden. Dieses Verfahren bereitet jedoch eine Anzahl von Problemen: i) eine große Menge von Lymphozyten ist zur Gewinnung von ausreichend genomischer DNA zu Durchführung des Verfahrens erforderlich. Die Beschreibung offenbart die Entfernung von 1 – 2 × 10⁸ Lymphozyten, aus denen 121 μg genomische DNA gewonnen wurden; ii) alle vier Allele (zwei für die schwere Kette und zwei für die leichte Kette) werden in der genomischen DNA gewonnen und erfordern eine umfangreiche Sequenzierung und Selektion durch Klonierung-, Expressions- und Bindungsuntersuchungen, um die funktionale Paarung der Gene (eine für die schwere Kette und eine für die leichte Kette) zur weiteren Verarbeitung zu erhalten; iii) schlechte Expressionsstärken der Antikörper werden durch Kultivieren der Wirtszellen erreicht, die durch das beschriebene Verfahren transfiziert wurden. Die Beschreibung offenbart Ausbeuten von 6,7 bis 34,5 μg/ml, deren Durchschnitt sich auf 20 μg/ml beläuft, und unter Verwendung eines Konstrukts, das einen Cytomegalovirus-(CMV)-Expressionsverstärker einschließt, nur 1 μg/ml.
WO 91/04336 offenbart ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper durch die Gewinnung genomischer DNA. Es ist ganz klar, daß dieses Verfahren an den gleichen Nachteilen leidet, die oben für EP 314161 beschrieben wurden.
Das Aufkommen von PCR hat die Erzeugung von cDNA-Klonen aus mRNA erlaubt, die aus kleinen Mengen von Zellen stammt. Obwohl PCR ein sehr mächtiges Werkzeug bleibt, behindert die Notwendigkeit des Wissens um die Sequenzen des 5'- und 3'-Endes der Ziel-cDNA-Sequenz die Verwendung dieser Technik zur Erzeugung von cDNA-Klonen aus mRNA, die für Proteine mit verschiedenartigen Sequenzen codiert, speziell sezernierte Produkte mit unterschiedlichen Leitsequenzen, wie die menschliche Antikörperfamilie. Obwohl viele menschliche H-Kettensequenzen angegeben wurden [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage, US Dept. of Health and Human Services, US Govt. Printing Service 1987] und die PCR- Primer aus den Konsensus-Sequenzen daraus konstruiert werden, werden nicht alle menschlichen V-Regionen unter Verwendung dieser Primer amplifiziert werden, weil die 3'-Basen inkompatibel mit Verlängerung durch Taq-Polymerase sind.
Larrick et al., Biotechnology, 7(9), 1989: 934–938 und Levy et al., Gene 54(2–3) 1987: 167–173 offenbaren die Verwendung von cDNA zur Codierung nur der variablen Region von Antikörpern, aber nicht der konstanten Region.
Die vorliegende Erfindung stellt im Gegensatz ein neues Verfahren bereit, das die herkömmliche rekombinante cDNA-Klonierungstechnik beinhaltet, um die Gewinnung von Antikörpergenen vollständiger (d. h. variabler und konstanter) menschlicher schwerer und leichter Ketten und ihre Expression in eukaryotischen Zellen unter Verwendung starker eukaryotischer Expressionsvektoren zur Immortalisierung von funktionalen Antikörpern zu erleichtern.
Außerdem konnten die Erfinder zeigen, daß cDNA, die aus einem nichtmenschlichen Primaten-Lymphozyt aus peripherem Blut kloniert ist, und die daraus hergestellte Antikörperkette tatsächlich eine ausreichende Homologie mit einer menschlichen Antikörper-Kettensequenz zeigt, um potentiell nützliche Therapeutika bereitzustellen. Die Erfindung schließt daher ein Verfahren zur Gewinnung von Primaten-Antikörpergenen für die nicht-menschliche schwere und leichte Kette und ihre Expression wie oben beschrieben ein.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Primaten-Antikörpers bereit, umfassend:

(i) Auswählen einer aus Lymphozyten eines Primaten stammenden Zellinie, die zur Expression eines gewünschten Antikörpers fähig ist;
(ii) Isolieren der RNA aus der Zellinie und Abtrennen der mRNA von den anderen so isolierten RNAs;
(iii) Synthetisieren von cDNA aus der mRNA und Inserieren der cDNA in einen Klonierungsvektor;
(iv) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, der die cDNA enthält, um eine Bank zu erhalten;
(v) Durchmustern der Bank auf cDNA, die die Gene für die schwere und leichte Kette des Antikörpers codiert;
(vi) Inserieren der cDNA, die die Gene codiert, in einen Expressionsvektor;
(vii) Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, der die cDNA enthält; und
(viii) Kultivieren der transfizierten Wirtszelle und Isolieren des gewünschten Antikörpers.

Der Begriff "Primat" wird verwendet, um Halbaffen (z. B. Lemuren), Neuweltaffen (z. B. Aotus), Altweltaffen (z. B. Cynomolgus), Menschenaffen (z. B. Schimpansen) und Menschen zu bezeichnen.
Ein Verweis auf eine aus Primaten-Lymphozyten stammende Zellinie bezeichnet eine Zellinie, die aus einem einzelnen Primaten-Lymphozyten stammt, der einen einzelnen Antikörper produzieren wird. Die Zellinie muß ausreichend stabil sein, um die Gewinnung von RNA zu ermöglichen, und ist daher bevorzugt unter Verwendung einer herkömmlichen viralen Transformations- und/oder Hybridomtechnik stabilisiert oder unsterblich gemacht (wie beschrieben in Methods of Hybridoma Transformation, Bartal und Hirsaut (Hrsg.), Humana Press, Clifton, N. H. 1985). Solche Zellinien können von Hinterlegungsstellen wie der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA erhalten werden.
Die Zellinie kann durch Entfernen von Lymphozyten, und zwar Lymphoblastoidzellen oder B-Lymphozyten, aus dem peripheren Blut von Lymphknoten oder aus der Milz hergestellt werden, z. B. aus einem Individuum (menschlicher oder nicht-menschlicher Primat), von dem bekannt ist, daß es sich von einem Krankheitszustand erholt hat oder sich in Remission davon befindet; aus einem Individuum, von dem bekannt ist, daß es mit einem pathogenen Organismus infiziert ist oder an Krebs oder einer Autoimmunkrankheit leidet, aber nicht die vollen Krankheitssymptome zeigt; aus einem Individuum, das mit Antigen geimpft oder beimpft wurde und eine Antikörperreaktion aufgebaut hat; aus gesunden Individuen, gefolgt von Durchmusterung auf einen nützlichen Antikörper. Beispiele für Krankheitszustände schließen eine Infektion durch einen pathogenen Organismus (z. B. Virus oder Bakterien) ein, worin die Entfernung der Lymphozyten bevorzugt innerhalb von zwei bis drei Monaten nach der Genesung oder während der Phase mit hohem Antikörpertiter erfolgt, oder ein Individuum, das eine Impfung gegen ein Antigen erhalten hat, z. B. für einen pathogenen Organismus, worin die Entfernung von Lymphozyten bevorzugt innerhalb von zwei bis drei Monaten nach der Immunisierung stattfindet. Individuen, in denen ein pathogener Organismus wie ein Virus nachgewiesen werden kann, die aber nicht zu einem vollständigen Krankheitszustand fortschreiten, können ebenfalls eine äußerst nützliche Quelle für Antikörper-produzierende Zellen bereitstellen. Eindeutig ist es möglich, wenn nicht-menschliche Primaten verwendet werden, mit einem pathogenen Organismus anstelle mit einer abgeschwächten Form des Organismus zu beimpfen, die häufig die zur Impfung von Menschen verwendete Form ist. Die Immunreaktion auf diesen Organismus wird weit größer sein als aus dem geimpften Individuum, wodurch eine bessere Quelle für Antikörperproduzierende Zellen bereitgestellt wird.
Eine Zellinie kann ebenfalls durch Entfernen von Lymphozyten aus einem Individuum erzeugt werden, von dem bekannt ist, daß es an einem Krankheitszustand leidet, wie an Krebs oder einer Autoimmunkrankheit, und von dem gezeigt werden kann, daß es eine gegen entweder die Tumorzellen oder Selbstantigene gerichtete Antikörperreaktion aufweist. Lymphozyten können ebenfalls aus einem Individuum erhalten werden, das danach identifiziert wird, daß es eine spontane Remission seines Krebses zeigt, oder das mit Tumor-Antigenen geimpft wurde und eine Antikörperreaktion aufgebaut hat. Ein alternativer Ansatz zur Identifizierung nützlicher Lymphozyten beinhaltet die Durchmusterung von Gruppen von Individuen, die für das Risiko der Krebsentwicklung durch Kontakt mit bestimmten Umweltfaktoren oder durch eine genetische Prädisposition bekannt sind, z. B. "Krebsfamilien", die ein mehr als durchschnittliches Auftreten von Krebs innerhalb der Bevölkerung zeigen. Diese Gruppen können insbesondere auf Individuen durchmustert werden, die als Ergebnis ihrer Fähigkeit zum Aufbau von Antikörpern gegen die Tumor-Antigene keinen Krebs entwickeln. Es kann ebenfalls möglich sein, gesunde Individuen auf Antitumor-Antikörper auf Basis einer Theorie zu durchmustern, daß krebsartige Zellen in allen Individuen vorhanden sind, das Immunsystem allgemein eine Reaktion aufbauen kann, und zwar durch die Produktion von Antikörpern, um die mutierten Zellen zu entfernen, bevor ein krebsartiger Zustand erreicht wird. Falls dies so ist, können nützliche Lymphozyten aus jedem Individuum erhalten werden. Die so identifizierten Lymphozyten können dann durch virale Transformation und/oder Fusion wie nachfolgend beschrieben stabilisiert werden.
Virale Transformation wird bevorzugt unter Verwendung von Epstein-Barr-Virus (EBV) durchgeführt. Die meisten B-Lymphozyten aus peripherem Blut haben eine Rezeptor für EBV, und bei Infektion durch das Virus werden diese Zellen mit der begleitenden Expression des nukleären EBV-Antigens (EBNA) transformiert. Jedoch werden nur ca. 20% der Zellen in vitro "unsterblich gemacht", und diese sind allgemein nur kleine nicht-aktivierte B-Zellen. Plasmazellen (aktivierte B-Zellen) fehlt der EBV-Rezeptor, so daß die Resistenz gegen eine EBV-Infektion mit der Reife zuzunehmen scheint, was die Effektivität der viralen Transformation durch diesen Weg reduziert, wenn die gewonnenen Lymphozyten reif sind.
Zur viralen Transformation unter Verwendung von EBV ist es daher bevorzugt, Nicht-Plasmazell-Lymphozyten aus peripherem Blut zu verwenden. Zur Einrichtung einer Zellinie enthält der Überstand aus einer Zellinie, die das Virus produziert, wie B95.8 (Miller et al. 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 383–387), allgemein ausreichende infektiöse Viruspartikel. In der Praxis werden Pellets von bis zu 107 Zellen in ca. 1 ml des viralen Kulturüberstands suspendiert und für ca. 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Dies erlaubt die Anhaftung des Virus an spezifische Rezeptoren auf B-Zellen und die Zellpenetration. Es ist bevorzugt, den Behälter vorsichtig zu bewegen, um eine Absetzung zu verhindern. Die so infizierten Zellen können dann kultiviert werden, und die Gene für den gewünschten Antikörper können kloniert werden.
Ein alternativer oder zusätzlicher Schritt zur viralen Transformation ist das Fusionieren mit Myelomzellen, um eine Stabilisierung bereitzustellen (Crawford, D. H. 1985, Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Hrsg. E. G. Engelman, S. K. H. Foung, J. Larrick und A. Raubitschek, S. 37–50, oder Roder J. C. et al., The Epstein-Barr virus-hybridoma technique, ibid., S. 55–67). Das Myelom ist gegebenenfalls ein Heterohybridom, bevorzugt mit Ursprung Maus/Mensch. Ein geeignetes Heterohybridom kann z. B. aus einer Antikörper-sezernierenden Zellinie wie HT01 erzeugt werden. Geeignete Zellen können auf Basis ihrer Empfindlichkeit gegenüber Hypoxantinaminopterin und Thymidin selektiert werden, indem sie einer sequentiellen Passage durch Medium unterworfen werden, das 8-Azaguanin enthält, da sie Aminopterin-empfindlich sind.
Um ein solches Heterohybridom zu verwenden, müssen die Gene, die endogene menschliche schwere und leichte Ketten codieren, deletiert werden, andernfalls wird die fertige Zellinie zur Produktion von mehr als einem Antikörper in der Lage sein und wird nicht allein schwere und leichte Ketten für den gewünschten Antikörper enthalten. Dies kann erreicht werden, indem die Zellen einer 90%igen letalen Dosis von UV-Bestrahlung unterworfen werden und auf geeignete Kolonien durch cytoplasmatische Anfärbung mit Anti-Mensch-Ig und auf eine Chromosomenzahl, und zwar polyploid mit zwischen 60 und 140 Maus-Chromosomen, selektiert wird.
Es ist ebenfalls vorteilhaft, stark wachsende Zellen zu selektieren. Dies kann erreicht werden, indem durch die peritoneale Höhle einer mit 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (oder Pristan) behandelten Maus passagiert wird.
Die letzte Selektion auf Wachstum, Karyotyp und Verschmelzbarkeit wird dann durchgeführt, wobei der Karyotyp am wichtigsten ist. Das ideale Heterohybridom enthält hauptsächlich Mauschromosomen.
Die Selektion einer Ziel-Lymphozyten-Zellinie kann durch Durchmusterung auf die Produktion von Antikörper, der Affinität für das gewünschte Antigen besitzt, und auf Antikörperfunktionalität durchgeführt werden.
Die Untersuchung auf Affinität kann durch Immuntesttechniken erreicht werden, z. B. Radioimmuntest oder enzymgekoppelten Immunoadsorptionstest (ELISA). Immuntesttechniken wie diese verwenden die spezifische Wechselwirkung von Antikörper mit Antigen, um Informationen zur antigenen Spezifität bereitzustellen. Radioimmuntests beurteilen den Antikörpergehalt entweder durch Bestimmung der Fähigkeit des Antikörpers, mit radioaktivem Antigen zu komplexieren, oder durch Messung der Menge von Antikörper, der an eine unlösliche Antigenzubereitung bindet. Die ELISA-Technik beinhaltet die Konjugation von Enzymen an Antigene oder Antikörper. Die Enzyme werden gewöhnlich auf Basis einer einfachen Kinetik selektiert und können durch ein gefärbtes Reaktionsprodukt gemessen werden, z. B. durch Spektrophotometrie. Bevorzugte Enzyme schließen alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase und Meerrettichperoxidase ein. ELISA kann als primärer Bindungs- oder kompetitiver Bindungstest eingesetzt werden. Z. B. können Lymphozyten, die aus einem mit einem Virus infizierten Individuum isoliert werden, durch Kultivieren von überstehendem Medium aus einer Lymphozyten-Zellinie in Gegenwart eines geeignet markierten viralen Antigens, möglicherweise in Form von ganzen oder leeren viralen Partikeln, selektiert werden. Die Antikörper/Antigen-Komplexe können dann wie oben beschrieben identifiziert und die entsprechende Lymphozyten-Zellinie für weitere Untersuchungen selektiert werden.
Der Test auf Funktionalität des Antikörpers im Falle eines infektiösen Mittels kann kompetitive Untersuchungen zur Neutralisation beinhalten, z. B. zur viralen Neutralisation. Neutralisationsuntersuchungen können unter Verwendung des "Radioimmunofocussing Assay" (RIFA) durchgeführt werden, in dem ein fixiertes Konzentrat von gereinigtem Antikörper mit gleichem Volumen von 10-fachen Verdünnungen von Virus kultiviert wird und dann auf den Virustiter getestet wird. Ein alternativer Test kann darin bestehen, Komplement zu verwenden und auf Zellyse zu untersuchen.
Es ist möglich, Zellen zu erhalten, die menschliches oder nichtmenschliches Primaten-IgG, -IgG1, -IgG2 oder -IgG2, IgM, IgA, IgD oder IgE sezernieren. Diese können durch Ouchtolony-Agar-Doppeldiffusion oder ELISA selektiert werden.
Im Anschluß an Selektion einer Lymphozyten-Zellinie, die einen funktionellen Antikörper mit der gewünschten Spezifität exprimiert, kann die gesamte Zell-RNA unter Verwendung von rekombinanten Standardtechniken isoliert werden, wie mit dem Verfahren von Chomczynski und Sacchi (1987, Anal. Biochem. 162, 156–159). Um die spezifische Boten-RNA (mRNA) zu isolieren, die den Antikörper codiert, werden ebenfalls Standardtechniken eingesetzt, z. B. wie beschrieben in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Komplementäre DNA (cDNA) wird dann aus der mRNA durch rekombinante Standardtechniken synthetisiert, z. B. wie im zuvor genannten "Molecular Cloning Manual" offenbart.
Es ist möglich, zwischen 1 – 3 × 10⁴ und 1 – 3 × 10⁷ Lymphozyten zur Isolierung der gesamten Zell-RNA einzusetzen, jedoch stellt die Erfindung ferner ein Verfahren zum Klonieren von Antikörpergenen voller Länge aus einer viel kleineren Anzahl von Zellen bereit, wie es aus einem instabilen Antikörper erforderlich wäre, der Hybridomen oder EBV-transformierte B-Zellen unbekannter Stabilität produziert. Dieses Verfahren ist daher besonders nützlich zur Gewinnung von menschlichen oder nicht-menschlichen Primaten-Antikörpern aus instabilen Zellinien, aber kann auf die Gewinnung aller Antikörpergene für die schwer und/oder leichte Kette eingesetzt werden. Dies wird durch die Fortschritte in der Reproduzierbarkeit und Qualität handelsüblicher Enzyme und Vektorsysteme zum herkömmlichen cDNA-Klonieren und durch die Einführung von Mikro-RNA-Isolationstechniken möglich gemacht.
Dieses verbesserte Verfahren kann durch Erzeugen einer größenselektierten cDNA-Bank aus nur 1000 Hybridomzellen erreicht werden. Diese Bank oder ein Bruchteil davon kann dann auf Immunglobulinketten durchmustert werden.
Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zum Klonieren von Antikörpergenen voller Länge bereit, umfassend i) Mikro-RNA-Herstellung aus ca. 1000 Zellen, ii) Erzeugung einer größenselektierten cDNA-Bank, iii) Durchmustern der Bank auf cDNA, die die schweren und leichten Ketten codiert, und iv) Isolieren der cDNA, die die schweren und leichten Ketten codiert.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers bereit, umfassend:

i) Mikro-RNA-Herstellung aus ca. 1000 Zellen;
ii) Erzeugung einer größenselektierten cDNA-Bank;
iii) Durchmustern der Bank auf cDNA, die die schweren und leichten Ketten codiert, und isolieren derselben;
iv) Inserieren der cDNA, die die schweren und leichten Ketten codiert, in einen Expressionsvektor;
v) Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, der die cDNA enthält; und
vi) Kultivieren der transfizierten Wirtszelle und Isolieren des gewünschten Antikörpers.

Die Identifizierung von cDNA-Klonen, die die Proteine der schweren und leichten Kette des Antikörpers codieren, kann durch Klonieren der cDNA in einen replizierbaren Vektor, z. B. ein Plasmid, und Transformieren einer Wirtszelle, z. B. ein Prokaryot wie E. coli, erreicht werden. Die resultierende Bank kann dann auf cDNA der leichten und schweren Kette des Antikörpers in der folgenden Weise durchmustert werden.
Die Durchmusterung kann unter Verwendung von DNA-Sonden der schweren und leichten Kette mit nachweisbaren Markern und einem Detektionsverfahren wie z. B. beschrieben in Gene Cloning von D. M. Glover (veröffentlicht von Chapman and Hall Ltd., London) durchgeführt werden. Diese Techniken können die Radiomarkierung und den Nachweis durch Radiographieverfahren oder nicht-radioaktive Marker, z. B. Digoxigenin 11 dUPT, und ein Detektionskit, z. B. das Nonradioactive DNA labelling and Detection kit, erhältlich von Boehringer Mannheim, beinhalten. Dieses Durchmusterungsverfahren erlaubt ebenfalls die Durchmusterung vollständig unklassifizierter Antikörper auf Isotyp unter Verwendung gemischter Sonden, z. B. Sonden für die menschliche γ-, μ- und α-H-Kette oder Sonden für die κ- und λ-L-Kette.
Klone können selektiert werden, und nach Wunsch kann die Sequenz der schweren und leichten Ketten des Antikörper bestimmt werden. Es ist ebenfalls möglich, Modifizierungen in die Antikörper-cDNA in dieser Stufe vor der Herstellung von Vektoren zur Expression einzuführen. Dies kann eine Modifizierung eines einzelnen Codons oder der gesamten Region beinhalten. Z. B. kann ein Klassen- oder Artenwechsel des Antikörper-Isotyps vorgenommen werden (d.h. zur Bildung chimärer Antikörper). Dies kann durch Erzeugen von Fusionen der isolierten V-Regionen mit der cDNA aus dem Isotyp der Wahl erreicht werden.
Sobald eine geeignete Zellkolonie selektiert wurde, können die cDNA-Sequenzen für die Gene der leichten und schweren Kette in Vektoren sub kloniert werden, die zum Inserieren in eine Wirtszelle zur Expression geeignet sind. Die Konstruktion der Expressionsvektoren kann gemäß in diesem Fach bekannten Verfahren durchgeführt werden (Molecular Clonings A Laboratory Manual, zweite Auflage, Maniatis et al., Cold Spring Harbor).
Die Wirtszelle muß zum Exprimieren des Antikörpers in einer funktionellen Form fähig sein und sollte daher eine eukaryotische Zelle sein, wie eine Säugetierzelle, z. B. Myelomzellen oder Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), die zur Durchführung posttranslationaler Modifizierungen, insbesondere korrektes Falten der Ketten, und Glycosylierung, die wesentlich zur effektiven Funktionalität der konstanten Region eines Antikörpers sein kann, fähig sind. Eukaryotische Zellen können in vitro ziemlich erfolgreich kultiviert werden und sind dafür bekannt, funktionelle Antikörper zu exprimieren. Hefe oder Insektenzellen können ebenfalls als Wirtszellen dienen, da sie ebenfalls die gewünschten posttranslationalen Modifikationen durchführen können.
Die cDNA der schweren und leichten Kette kann in einen einzelnen Vektor wie in WO 87/04462 beschrieben oder in zwei Vektoren wie nachfolgend beschrieben cotransfiziert werden. Ein Verweis hier zuvor und hiernach auf die Transfektion einer Wirtszellinie mit einem Expressionsvektor schließt in seiner Bedeutung die Cotransfektion der Wirtszelle unter Einsatz von mehr als einem Vektor ein, es sei denn, es ist aus dem Kontext klar, daß nur die Cotransfektion bezeichnet wird.
Die Vektoren zur Cotransfektion enthalten bevorzugt unabhängig selektierbare Marker, und die resultierenden Kolonien können somit für beide Marker selektiert werden. Kolonien, die den dualen Phänotyp zeigen, sind allgemein zum Coexprimieren sowohl der leichten als auch schweren Ketten fähig. Die selektierbaren Marker können von dominanter Natur sein oder nicht. Beispiele für selektierbare Marker schließen Adenosindesaminase (Kaufman et al., P. N. A. S., 1989, 83, 3136–40), Asparaginsynthetase (Cartier et al., Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 1623–28), E. coli trpB-Gen und Salmonella hisD-Gen (Hartman et al., P. N. A. S., 1988, 85, 8407–51), M2-Maus-Ribonukleotidreduktase (Thelander et al., EMBO J, 1989, 8, 2475–79), menschliches Mehrfacharzneistoff-Resistenzgen (Kane et al., Gene, 1989, 84, 439–446), Glutaminsynthetase (Bebbington et al., DNA Cloning, Bd. III, 1987, Hrsg. D. M. Glover, 163–188, IRL Press), Xanthinguaninphosphoribosyltransferase (gpt) (Mulligan et al., Science, 1980, 209, 1422–27), Hygromycin B (Santerre et al., Gene, 1984, 30, 147–156), Neomycin-Gen (Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1982, 1, 327, 341), und Dihydrofolatreduktase (Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1981, 1, 854-868) ein.
Ein bevorzugter selektierbarer Marker zur Verwendung mit einem der Vektoren ist dhfr, der gewöhnlich mit einer parenteralen CHO-Zellinie (Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters) des dhfr--Phänotyps eingesetzt wird (Urlaub et al., P. N. A. S., 1980, 77, 4216–4220). Erfolgreich transfizierte CHO-Zellen werden den dhfr⁺-Phänotyp besitzen und können leicht durch Kultivierung der Kolonien auf Medien ohne Thymidin und Hypoxanthin, die gegebenenfalls Methotrexat enthalten (MTX), selektiert werden. Ein bevorzugter selektierbarer Marker zur Verwendung mit dem anderen der Vektoren ist ein dominanter Resistenzmarker wie Neomycin (neo). CHO-Zellen, die erfolgreich mit diesem Marker transfiziert wurden, können leicht durch Kultivieren der Kolonien in Medien selektiert werden, die das Antibiotikum Geneticin enthalten, ein Analog von Neomycin.
Ein anderes Expressionssystem zur Verwendung mit CHO- oder Myelomzellen ist das Glutaminsynthetase-(GS)-Amplifikationssystem, das in WO 87/04462 beschrieben wird, dessen Verfahren hier durch Verweis eingeführt wird. Dieses System beinhaltet die Transfektion einer glutaminabhängigen Zelle mit einem Gen, das das GS-Enzym und die gewünschten Gene der schweren und leichten Kette des Antikörpers codiert. Zellen werden dann selektiert, die in glutaminfreiem Medium wachsen. Diese selektierten Klone werden dann der Hemmung des GS-Enzyms unter Verwendung von Methioninsulfoximin (Msx) unterworfen. Die Zellen werden, um zu überleben, das GS-Gen mit begleitender Amplifikation des Gens amplifizieren, das den Antikörper codiert.
Wie zuvor beschrieben wurde, stellt ein selektierbarer Marker wie GS bevorzugt ebenfalls die Basis bereit, auf der die Gene, die die leichten und schweren Ketten codieren, amplifiziert werden können. Bei der Transfektion einer Zellinie werden die Vektor-DNAs häufig in das Chromosom der Zelle am gleichen Locus integriert. Daher resultiert die Verwendung eines selektierbaren Markers als Basis für die Amplifikation normalerweise in einer parallelen Zunahme der Kopiezahl beider Gene. In ähnlicher Weise ist dhfr ein selektierbarer Marker, der die Amplifikation durch die Verwendung zunehmender Konzentrationen des Inhibitors MTX ermöglicht.
Die selektierbaren Marker sind natürlich unter der Kontrolle der regulatorischen Elemente von DNA, um ihre Expression bereitzustellen. Die regulatorischen Elemente sind bevorzugt aus einer viralen Quelle, wie aus DNA-Tumorviren. Besonders bevorzugt sind der SV40- oder späte Adenovirus- Hauptpromotor. Es ist in dieser Hinsicht besonders bevorzugt, das Verstärkerelement aus dem Promotor zu entfernen, um ihn so wirksam zu "verkrüppeln". Diese Modifikation erlaubt erhöhte Stärken der Genamplifikation bei jeder Konzentration von Inhibitor als sie ansonsten auftreten würden, falls ein starker Promotor verwendet würde. Im Falle der Verwendung von GS als selektierbarer Marker ist ein Beispiel für einen geeigneten Promotor der Maus-Metallothionein-Promotor oder bevorzugt der menschliche Cytomegalovirus-(hCMV)-MIE-Promotor, beschrieben in WO 89/01036.
Die leichten und schweren Gene des Antikörpers befinden sich ebenfalls unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen von DNA, um ihre Expression bereitzustellen. Die Verwendung der gleichen regulatorischen Elemente für beide Ketten ist bevorzugt, so daß ihre Expression im wesentlichen ausgeglichen ist. Die regulatorischen Elemente können viralen Ursprungs sein, und Beispiele schließen die oben im Zusammenhang mit der Expression von dhfr oder GS als selektierbarer Marker genannten ein. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung des β-Actin-Promotors und des erkennenden β-Actin-Polyadenylierungssignals.
Einer oder beide Vektoren können ebenfalls einen SV40-Replikationsursprung enthalten, damit die Vektorkonstrukte durch einen schnellen vorübergehenden Test überprüft werden können, z. B. in COS-Zellen.
Die Cotransfektion der Zellinie mit den Expressionsvektoren kann einfach unter Verwendung äquimolarer Mengen beider Vektoren und von Standard-Transfektionsverfahren durchgeführt werden, wie durch Calciumphosphat-Ausfällung oder Lipofectin. Die Selektion der gewünschten cotransfizierten Zellinie kann gemäß Standardverfahren durchgeführt werden, die für die besonderen selektierbaren Marker bekannt sind.
Die Erfindung schließt daher einen Vektor ein, der zur Transfektion einer Wirtszellinie geeignet ist, die cDNA umfaßt, die schwere und leichte Ketten eines Primaten-Antikörpers codiert. Die Erfindung schließt daher eine eurkaryotische Zellinie ein, die mit cDNA zur Expression von schweren und leichten Ketten von Primaten-Antikörper transfiziert ist.
Die Erfindung schließt ferner ein Verfahren zur Expression von cDNA ein, die schwere und leichte Ketten eines Primaten-Antikörpers codiert, umfassend das Transfizieren einer eukaryotischen Wirtszelle mit einem Vektor oder Vektoren, der/die zur Expression der cDNA geeignet ist/sind.
Die Kultur der Zellinie kann in serumhaltigen oder bevorzugt serumfreien Medien durchgeführt werden. Es ist besonders vorteilhaft während der Reinigung, wenn proteinfreies Medium eingesetzt wird. Wenn die Zellinie eine CHO dhfr⁺-Transformante ist, fehlt dem Medium bevorzugt Hypoxanthin und Thymidin, und es enthält gegebenenfalls MTX. Wenn das GS-System verwendet wird, ist es vorteilhaft, eine glutaminabhängige Zellinie und ein glutaminfreies Medium einzusetzen. Die Expression beider Ketten in im wesentlichen äquimolaren Anteilen ermöglicht den Erhalt optimaler Ausbeuten von funktionellem Antikörper. Die zwei Ketten vereinigen sich innerhalb der Zelle und werden dann in das Kulturmedium als funktioneller Antikörper sezerniert. Der resultierende rekombinante Antikörper kann gemäß Standardverfahren gereinigt und formuliert werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt rekombinante nichtmenschliche Primaten-Antikörper ein, insbesondere rekombinante Schimpansenoder Altweltaffen-Antikörper, z. B. rekombinanten Cynomolgusaffen-Antikörper.
Die Erfindung umfaßt ferner einen rekombinanten Primaten-Antikörper, hergestellt oder herstellbar durch:

i) Auswählen einer aus Lymphozyten eines Primaten stammenden Zellinie, die zur Expression eines gewünschten Antikörpers fähig ist;
ii) Isolieren von RNA aus der Zellinie und Abtrennen der mRNA von der anderen so isolierten RNA;
iii) Synthetisieren von cDNA aus der mRNA und Inserieren der cDNA in einen Klonierungsvektor;
iv) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, der die cDNA enthält, um eine Bank zu erhalten;
v) Durchmustern der Bank auf cDNA, die den Antikörper codiert;
vi) Inserieren der cDNA, die den Antikörper codiert, in einen Expressionsvektor;
vii) Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, der die cDNA enthält; und
viii) Kultivieren der transfizierten Wirtszelle und Isolieren des gewünschten Antikörpers.

Man kann erwarten, daß die Verwendung von eukaryotischen Zellinien, die mit cDNA transfiziert sind, mehr als 50 μg/ml von Antikörper liefert, bevorzugt bis zu oder mehr als 250 μg/ml.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt einen rekombinanten Primaten-Antikörper, der durch das Verfahren des Kultivierens einer eukaryotischen Wirtszellinie hergestellt wird oder herstellbar ist, die zum Exprimieren von cDNA fähig ist, die schwere und leichte Ketten des Primaten-Antikörpers codiert.
Der resultierende Antikörper kann als Therapie gemäß seiner Spezifität verwendet werden. Ein nachfolgend bereitgestelltes Beispiel ist ein menschlicher Anti-Hepatitis-A-Antikörper zur Verwendung in der Behandlung von Hepatitis A-Infektionen. Andere antivirale Antikörper können mit Zielviren wie anderen Hepatitis-Viren (z. B. Hepatitis B und C) oder Herpes-Viren erhalten werden: Herpes simplex-Virus, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Varicella-zoster-Virus. Anti-HIV-Antikörper können erfindungsgemäß erhalten werden. Diese Antikörper können verwendet werden, um AIDS zu behandeln, um das Einsetzen von AIDS in HIV-positiven oder ARC-Patienten zu verhindern oder zu verzögern, oder prophylaktisch in Individuen, die mit dem Virus z. B. durch eine Nadelstich-Verletzung in Kontakt gekommen sind. Eine weitere Verwendung liegt in der Verhinderung der Übertragung des Virus von einer HIV-positiven Mutter auf ihr Kind während der Schwangerschaft oder bei der Geburt des Kindes. Dies kann die Behandlung mit dem Antikörper vor, während und/nach der Geburt beinhalten.
Antikörper können ebenfalls erhalten werden, die auf andere pathogene Organismen gerichtet sind, wie Bakterien, Protozoen etc. Krebsartige Zellen sind ebenfalls mögliche Ziele für menschliche Antikörper. Gegebenenfalls können die Antikörper als Zieleinheiten verwendet werden, die chemische oder biologische Verbindungen übertragen. Diese werden in die Zellen durch Endocytose aufgenommen, wo sie toxisch sind oder unter Bildung eines toxischen Mittels metabolisiert werden, das die Zelle tötet. Antikörper der Erfindung können auf andere Anti-Selbstantigene gerichtet sein, wie diejenigen, die bei Autoimmunerkrankungen vorhanden sind, z. B. bei multipler Sklerose, oder z. B. bei entzündlichen Störungen wie Arthritis. Anti-Rhesus-D-Antikörper können in Tiermodellen nicht hergestellt werden – ein menschlicher Antikörper wäre daher von sehr großem Wert als diagnostisches Werkzeug in der Blutgruppenbestimmung und/oder könnte therapeutisch eingesetzt werden. Anti-Rhesus-D-Antikörper können an eine Rhesus-negative Mutter zu jedem Zeitpunkt während der Schwangerschaft oder Geburt verabreicht werden, um zu verhindern, daß sie Antikörper gegen den Fötus oder während nachfolgender Schwangerschaften aufbaut. Ein weiterer Aspekt der Erfindung schließt daher die Verwendung eines rekombinanten menschlichen Antikörpers in der Behandlung oder Prophylaxe des Kontakts eines Rhesus-negativen Individuums mit Rhesus D-Antigen ein.
Erfindungsgemäß gewonnene Antikörper könnten in allgemeinen diagnostischen Verfahren eingesetzt werden.
Obwohl die Erfindung sich primär mit der Gewinnung der Gene der schweren und leichten Ketten des gesamten Antikörpers befaßt, wird aus der Offenbarung ersichtlich sein, daß Fragmente wie F(ab) und F(ab)₂ und FV separat gewonnen, exprimiert und verwendet werden können. Solche Fragmente sind in der Definition von "Antikörper" eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher die Verwendung von Primaten-Antikörpern in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der zuvor genannten Krankheiten und Zustände bereit. Somit erstreckt sich die Erfindung auf Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung einer menschlichen Krankheit und/oder eines menschlichen Zustands wie oben beschrieben, welche die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Primaten-Antikörpers an einen Menschen umfassen. Solche Verfahren schließen Diagnoseverfahren ein.
Die Dosierungen der Antikörper werden mit dem behandelten Zustand und dem Empfänger der Behandlung variieren, aber werden im Bereich von 1 bis ca. 100 mg für einen erwachsenen Patienten, bevorzugt 1–10 mg sein, gewöhnlich täglich verabreicht für einen Zeitraum zwischen 1 und 30 Tagen. Ein zweiteiliges Dosierungsschema kann bevorzugt sein, in dem 1 bis 5 mg für 5 bis 10 Tage verabreicht werden, gefolgt von 6 bis 15 mg für weitere 5 bis 10 Tage.
Ebenfalls eingeschlossen in der Erfindung sind pharmazeutische Formulierungen, die einen rekombinanten Primaten-Antikörper enthalten. Solche Formulierungen schließen bevorzugt zusätzlich zum Antikörper einen physiologisch akzeptablen Verdünnungsstoff oder Träger ein, möglicherweise im Gemisch mit anderen Mitteln, wie anderen Antikörpern und/oder einem Antibiotikum. Geeignete Träger schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf physiologische Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Glucose und gepufferte Kochsalzlösung. Alternativ kann der Antikörper lyophilisiert (gefriergetrocknet) sein und zur Verwendung nach Bedarf durch Zugabe einer wäßrigen gepufferten Lösung wie oben beschrieben rekonstituiert werden. Verabreichungswege sind routinemäßig parenteral, einschließlich intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Injektion oder Übertragung.
Beschreibung der Figuren
1. Karyotyp-Analyse von HT01-Zellen, die polyploide Ordnungszahlen von Maus-Chromosomen und vielen menschlichen Chromosomen zeigen.
2 und 3. Nukleotid- bzw. abgeleitete Aminosäuresequenzen der schweren Kette und leichten Kette von Antikörper D. Die vollständige Sequenz des pH21OH2-Inserts ist gezeigt. Das Signalpeptid und CDR-Sequenzen sind unterstrichen und das vorhergesagte Polyadenylierungssignal überstrichen. Aminosäuren sind gemäß Kabat et al. (1987) numeriert.
4. Nukleotid-Angleichung der variablen Regionen der leichten kappa-Kette von Cynomolgus mit menschlichen, Kaninchen- und Maus-Sequenzen. CDRs sind angegeben, und Punkte geben eine Identität mit der menschlichen Walker-Sequenz an. Codonen sind gemäß Kabat et al. numeriert.
5. Aminosäure-Angleichung der variablen Regionen der leichten kappa-Kette von Cynomolgus mit menschlichen, Kaninchen- und Maus-Sequenzen. CDRs sind angegeben, und Punkte geben eine Identität mit der menschlichen Walker-Sequenz an. Aminosäurereste sind gemäß Kabat et al. numeriert.
6. Nukleotid-Angleichung der konstanten Region der leichten kappa-Kette von Cynomolgus mit menschlichen, Kaninchen- und Maus-Sequenzen. Punkte geben eine Identität mit der menschlichen Keimbahn-Sequenz an. Codonen sind gemäß Kabat et al. numeriert. Eine der zehn Affen-Sequenzen besaßen ein G an der unterstrichenen Nukleotidposition.
7. Aminosäure-Angleichung der konstanten Regionen der leichten kappa-Kette von Cynomolgus mit menschlichen, Kaninchen- und Maus-Sequenzen. Punkte geben eine Identität mit der menschlichen Keimbahn-Sequenz an. Aminosäurereste sind gemäß Kabat et al. numeriert.
Beispiele
Herstellung von chimären Zellen von Mensch/Maus zur Hybridisierung
Beispiel 1: Gewinnung von menschlichem Anti-Hepatitis-A-Antikörper
a) Herstellung der Zellinie HT01
50 ml Blut aus einem gesunden menschlichen Spender entnommen, 7 Tage nach Auffrischimpfung mit Tetanustoxoid, und mit konservierungsmittelfreiem Heparin als Antigerinnungsmittel vermischt. Mononukleäre Zellen auf Ficoll/Hypaque abgetrennt (Boyum A., 1986, Scand. J. Clin. Invest. 21, 77-89), in gepufferter Hanks-Kochsalzlösung gewaschen und fusioniert mit einer Maus-Myelom-Zellinie durch herkömmliche Techniken wie folgt: NS-O-Maus-Myelomzellen (Galfre G. und Milstein C. (1982), Immunology 45, 125–128) wurden aus einer Kultur in der logarithmischen Phase geerntet und in Hanks-Kochsalzlösung gewaschen. Mononukleäre Zellen (4,7 × 107) und NS-O-Zellen (6 × 10⁷) wurden in einem 50 ml Reagenzglas vermischt und zentrifugiert. Das Pellet der Zellen wurde dann in 1 ml 50%iger Polyethylenglykol-Lösung resuspendiert und vorsichtig für 1 Minute bei Raumtemperatur vermischt. Die fusionierten Zellen wurden in RPMI-Medium mit 10% Kalbfötusserum resuspendiert und in 60 l ml-Teilmengen dieses Wachstumsmediums in Platten mit 24 Vertiefungen getropft.
24 Stunden später wurde 1 ml Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (GAT) und 1 × 10⁶ Balb/c-Maus-Milzzellen enthielt, zu jeder Vertiefung hinzugegeben. Die Platte wurde bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert.
20 Tage nach der Fusion wurden die Überstände durch Radioimmuntest auf menschliche Anti-Tetanustoxoid-Antikörper durchmustert. Eine Vertiefung, die eine kleine Kolonie von Zellen enthielt (ca. 20) wurde identifiziert. Diese Kolonie wuchs langsam, eine Eigenschaft, die mit der erhöhten Stabilität der Antikörpersezernierung aufgrund der erhöhten Retention menschlicher Chromosomen verbunden ist.
Diese Zellen wurden in eine frische Vertiefung überführt und nach drei Wochen durch Grenzwertverdünnung ("limiting dilution", LD) kloniert. Alle untersuchten Subklone waren positiv im Radioimmuntest (RIA).
Ein Klon, PB47 1.A1.B9.E10, wurde als HT01 bezeichnet und die Zellen tiefgefroren. Diese Zellen synthetisierten menschlichen Anti-Tetanustoxoid-IgM-Antikörper.
Karyotyp-Analyse zeigte, daß die Zellen eine polyploide Ordnungszahl von Maus-Chromosomen und viele menschliche Chromosomen enthielten (siehe 1). Diese Zellen wurden als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines polyploiden Fusionspartners zur Herstellung weiterer Hybridome ausgewählt.
Die Zellinie HT01, die menschlichen Antitetanus-IgM-Antikörper sezernierte, wurde als Ausgangsmaterial zur Herstellung eines polyploiden Fusionspartners verwendet. Gegenüber HAT empfindliche Zellen wurden selektiert, indem die Aminopterin-resistenten HT01-Zellen einer sequentiellen Passage durch Medium, das 8-Azaguanin vom 1 μg–20 μg/ml enthielt, unterworfen wurden.
Zur Stimulierung von Verlust der schweren und leichten Gene des menschlichen Antikörpers wurde eine Probe von Zellen einer 90%igen letalen Dosis von UV-Bestrahlung unterworfen. Bestrahlte Zellen wurden bei der Grenzverdünnung kloniert, und eine Anzahl von Kolonien wurde auf Basis von Mangel an cytoplasmatischer Anfärbung mit anti-Mensch-Ig und nukleärer Größe, die mit der Chromosomenanzahl korreliert, selektiert. Ein Klon, HT01.A, wurde selektiert, nachdem die Karyotyp-Analyse zeigte, daß er polyploid mit 60 bis 140 Maus-Chromosomen war.
Die Selektion von stark wachsenden HT01.A-Zellen wurde erreicht durch Passage einer Probe durch die peritoneale Höhle einer Pristan-behandelten Maus (PRISTAN ist 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan von Aldrich). Diejenigen Zellen, die überlebten, wuchsen als einzelne Kolonien auf Mikrotiterplatten. Diese wurden kultiviert und auf Wachstum, Karyotyp und Fusions fähigkeit untersucht. Eine, bezeichnet als HT01.A.P1, wurde schließlich auf Basis der Ordnungszahlen von 135 Maus- und 3 menschlichen Chromosomen ausgewählt. Die Zellinie wurde als Fusionspartner mit Lymphozyten aus peripherem Blut aus dem Hepatitis A-Virus-seropositiven Spender verwendet.
b) Entfernung und Stabilisierung von Antikörper-sezernierenden Zellen
Eine Blutprobe (30 ml) wurde aus einem Hepatitis A-Virus (HAV) seropositiven Spender erhalten, ca. vier Monate nach einer Infektion mit Hepatitis A, die aus verunreinigter Nahrung im Vereinigten Königreich übertragen worden war.
Lymphozyten aus peripherem Blut wurden an einem Lymphoprep-Gradienten (Flow Labs) getrennt, mit Epstein-Barr-Virus (EBV) transformiert und für 10 Tage in Medium kultiviert, das Phätohämaglutinin und 10% Kalbfötusserum enthielt. Sie wurden dann mit geeigneten chimären Mensch/Maus-Zellen wie oben beschrieben unter Verwendung von PEG 1500 fusioniert und in Gegenwart von HAT und 10^–5 M Ouabin in 2 ml-Vertiefungen kultiviert. Überstehendes Medium wurde durch Sandwich-ELISA auf Anti-HAV-Aktivität durchmustert, 10 Tage nach der Fusion, als einzelne Kolonien mikroskopisch sichtbar waren. Individuelle Kolonien wurden aus positiven Vertiefungen gepickt und monoklonale Zellinien aus diesen durch zweimaliges Klonieren aus einzelnen Zellen bei der Grenzwertverdünnung geschaffen. Von den ursprünglichen 42 2 ml-Vertiefungen waren 17 stark positiv in anfänglichen ELISA-Durchmusterungen im Anschluß an umfangreiche Rückzufuhr, aber sezernierende monoklonale Linien wurden nur erfolgreich aus vieren daraus geschaffen. Die anderen stoppten das Sezernieren von Antikörper zu verschiedenen Stufen von Isolierung oder Klonieren, einschließlich nach dem doppelten Klonieren, vermutlich aufgrund der innewohnenden chromosomalen Instabilität von Heterohybriden.
c) Selektion von Hybridom
ELISA-Untersuchungen
Die vier Antikörper (A, B, C und D) aus den oben beschriebenen Zellinien wurden in sowohl Sandwich- als auch direktem ELISA gegen volle und natürliche leere HAV-Partikel titriert. Die Titer, ausgedrückt als reziproke dekadische logarithmische Verdünnungen, die 50% des maximalen Extinktionsplateaus erzeugen, sind in Tabelle 1a gezeigt. Diese Werte, ausgedrückt als Prozentanteil der Titer der individuellen Antikörper gegen native Partikel im Sandwich-Test, sind in Tabelle 1b angegeben.
ELISA-Titer menschlicher Antikörper gegen volle und natürliche leere HAV-Partikel Tabelle 1a
Tabelle 1b
d) Kompetitive Untersuchungen
Die Fähigkeit der Antikörper zur gegenseitigen Hemmung und von Maus-Antikörpern zur Bindung an das Virus wurde unter Verwendung von Festphasen-Radioimmuntest- (RIA) und ELISA-Techniken durchgeführt, die sich nur in der letzten Stufe unterscheiden. Die Ergebnisse, ausgedrückt in Tabelle 2 als maximale Konkurrenz (%), erhalten zwischen Antikörperpaaren, zeigen:

I) Antikörper A und B sind ununterscheidbar und sind ähnlich dem K24F2-Maus-Antikörper (MacGregor A. et al. 1983, J. Clin. Mirob. 18, S. 1237).
II) Antikörper D ist der Natur nach näher dem Maus-Antikörper B5B3 (Stapleton J. T. und Lemmon S. M. 1987, J. Virol. 61, S. 491) und wechselwirkt mit Antikörper A nur bis zu einem Maximum von ca. 30% in reziproken Untersuchungen.
III) Antikörper C scheint funktionell intermediär zwischen Antikörper A und D zu sein.
IV) Beide Antikörper A und Antikörper D waren individuell fähig, die Bindung von menschlichen polyklonalen HAV-Seren (Lemmon S. M. et al. 1983, J. Clinical Microb. 17, S. 834, und zwar Foxwell und Chulay) sehr wirksam zu hemmen.

Die hohen, mit Antikörpern A und B gegen B5B3 erhaltenen Konkurrenzwerte wurden mit 10-fach konzentriertem Antikörper erhalten, wohingegen die Gewebekulturüberstände nur 20% Konkurrenz oder weniger erzeugten. Im Gegensatz erforderten die gleichen Überstände eine substantielle Verdünnung, um volle Konkurrenzkurven gegen die K24F2- und K34C8-Antikörper (MacGregor A. et al. 1983, J. Clin. Microb. 18, S. 1237) zu erhalten, wie es der Antikörper D-Überstand gegen B5B3 tat.
Maximale Konkurrenz (%) der Antikörperbindung an den 18F-HAV-Stamm Tabelle 2
e) RIFA-Untersuchungen
Alle durch das anfängliche Durchmusterungs-ELISA detektierten Antikörper waren ebenfalls positiv im "Radioimmunofocussing Assay" gegen das 18f-Virus (Daemer R. J. et al. (1981), Infec & Immunol. 32, S. 388; und Stapleton J. T. und Lemmon S. M. (1987) J. Virol. Bd. 61, S. 492; und Ping L. A. et al., 85, S. 821). Die Reduktionen der Virus-RIFA-Titer, erhalten aus dem Umsetzen gleicher Volumina einer festen Konzentration (1 mg/ml) von Affinitäts-gereinigtem Antikörper mit 10-fachen Verdünnungen der 18f- und 43c-Virusstämme (der 43c-Stamm stammte aus dem 18f-Stamm durch Passagieren unter Druck aus einem monoklonalem Maus-Antikörper), sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Diese zeigen, daß die Mutante 43c sehr schlecht durch irgendeinen Antikörper neutralisiert wird, aber eine signifikante, wenn auch reduzierte Neutralisierung mit polyklonalem Foxwell-Serum zeigt.
Obwohl beide Antikörper das 18f-Virus weit weniger wirksam als polyklonales Serum zu "neutralisieren" scheinen, beruht dies weitgehend auf einer relativ konstanten Anzahl von verbleibenden Plaques, die bei jeder Virusverdünnung überleben und entsprechend die Spearman-Karber-Berechnung des Titers verzerren. Die Reaktion mit polyklonalem Serum eliminiert jedoch die gesamte Plaque-Bildung. Ähnliche Reaktionssteigungen der Antikörper gegen polyklonale Seren in kompetitiven Untersuchungen und ihre gesamte ELISA-Reaktivität geben keinen Hinweis, daß sie Antikörper mit niedriger Affinität darstellen.
Reduktion von Titer log₁₀ plaquebildende Einheiten/ml von HAV Isolate mit spezifischem Antikörper umgesetzt Tabelle 3
f) Klonieren und Sequenzieren der schweren und leichten Ketten des Anti-Hepatitis A-Virus monoklonalen Antikörpers D
Verfahren 1
Vollständige RNA wurde aus 2,5 × 107 Antikörper-D-exprimierenden Zellen unter Befolgen des Verfahrens (1) von Chomczyski und Sacchi (1987 Anal. Biochem. 162, 156–159) unter Verwendung von 1 ml Extraktionslösung auf 1 × 10⁷ Zellen isoliert. Das resultierende RNA-Pellet wurde in 50 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem destilliertem Wasser erneut gelöst und spektrophotometrisch mit einer Konzentration von 4,4 μg/μl festgestellt. Dynabeads Oligo (dT)₂₅ (Dynal Winal, UK) wurde verwendet, um polyadenylierte RNA aus 75 μg vollständiger RNA unter Verwendung der Herstelleranweisungen zu extrahieren.
Verfahren 2
Ein alternatives Verfahren (2) zur Isolierung von polyadenylierter RNA beinhaltete die direkte Isolierung aus 10³ Antikörper-D-sekretierenden Zellen unter Verwendung des Micro-FastTrack mRNA-Isolationssystems (Invitrogen, San Diego, USA) unter Befolgen des vom Hersteller empfohlenen Verfahrens.
Die Fähigkeit zur Klonierung von Genen eines menschlichen Antikörpers aus einer begrenzten Anzahl von Zellen wurde untersucht. Eine cDNA-Bank wurde mit polyadenylierter RNA erzeugt, die aus 1000 Antikörper-D-sekretierenden Zellen unter Verwendung des obigen Verfahrens 2 isoliert wurde. Es wurde berechnet, daß die Bank ein Potential von ca. 2000 größenselektierten (> 500 bp) cDNA-Inserten besitzt. Die Hälfte der Bank wurde plattiert und auf menschliche κ-L-Kette durchmustert und zwei positive Klone detektiert. Eine Teilsequenzierung bestätigte, daß beide Klone Gene voller Länge der L-Kette besaßen und Signalpeptidsequenzen beinhalteten. Obwohl diese Bank nicht mit der H-Kettensonde durchmustert wurde, sollten H-Ketteninserte voller Länge vorhanden sein, wie berechnet aus der Häufigkeit der H-Ketten-Positiven (2/500), erhalten aus der ursprünglichen cDNA-Bank.
cDNA wurde aus der isolierten mRNA synthetisiert und in das Plasmid pSPORT-1 unter Verwendung des "SUPERSCRIPT Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning kit" (GIBCO/BRL, Paisley, UK) unter Befolgen des vom Hersteller empfohlenen Verfahrens kloniert. "Escherichia coli MAX EFFICIENCY DH5α Competent Cells" (GIBCO/BRL) wurden mit der resultierenden cDNA/pSPORT-1-Ligation transformiert. Ca. 4500 Kolonien wurden auf Hybond-N-Nylonfilter (Amersham) übertragen und unter Befolgen des Verfahren von Buluwela et al. lysiert, denaturiert und fixiert (Nucleic Acids Res., 1989 17, 452). Die Filter wurden mit Proteinase K (50 μg/ml in 0,2xSSC, 0,1% SDS bei 55°C für 30 min) behandelt und dann überschüssige Trümmer mit einem Gewebe entfernt. Die Banken wurden dann auf Sequenzen der schweren und leichten Kette von menschlichem Antikörper unter Verwendung von Sonden für schwere und leichte Kette durchmustert.
Die schwere Kettensonde war ein menschliches IgGl-Antikörper-cDNA-Insert (CDRs der schweren Kette von Ratte-Campath-Antikörper [Campath ist eine Marke von The Wellcome Foundation Limited], umgeformt auf schwere Kette des menschlichen NEW IgGl-Antikörpers; Riechmann et al., 1988, Nature 382, 323–327), das mit Digoxigenin-11-dUTP unter Verwendung des "Nonradioactive DNA-Labelling and Detection Kit" (Boehringer Mannheim) markiert wurde, und wurde eingesetzt, um Filter, die ca. 500 übertragene Kolonien besaßen, auf die schwere Kette von Antikörper D unter Befolgen der Herstelleranweisungen zu durchmustern. Zwei potentielle positive Kolonien wurden nachgewiesen und zur weiteren Analyse ausgewählt. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des "QIAGEN PLASMID KIT" (DIAGEN, DÜSSELDORF, Deutschland) oder des Verfahrens von Del Sal et al. (1988 Nucleic Acids Res 16, 9878) hergestellt, und es wurde gefunden, daß beide der potentiellen positiven Klone Inserte der erwarteten Größe für cDNA der schweren Kette von menschlichem Immunglobulin enthielten. Ein Klon, pH21OH2, wurde ausgewählt und in beide Richtungen mit Plasmidprimer unter Befolgen des Didesoxy-Kettenabschlußverfahrens (Sanger et al., Proc. Natl. Acad Sci USA, 1977, 74, 5463–5467) gemäß dem Protokoll des Sequenase-Kits (United States Biochemicals, USB, Cleveland, USA) sequenziert. Die C-Region der schweren Kette wurde als γ1 bestimmt. Die Sequenz der variablen Region ist in 2 gezeigt.
Die leichten Kettensonden waren menschliche λ-cDNA (humanisierter Anti-CD3-mAb) λ L-Ketteninsert [Ratte-Anti-CD3 mAb L-Ketten-CDRs, umgeformt an Mensch- λ Kern^-Oz^-Ab L-Kette: E. Routledge Eur. J. Immunol. 1991; 21: 2717) und ein Campath-1H κ L-Kette-cDNA-Insert (Ratte Campath 1 mAb L-Kette-CDRs, umgeformt an Mensch-REI κ AB L-Kette; Page und Sysenham Bio/technology 1991; 9: 64), das mit Digoxigenin-11-dUTP unter Verwendung des "Nonradioactive DNA Labelling and Detection Kit" (Boehringer Mannheim, Lewes, UK) markiert wurde und eingesetzt wurde zum Durchmustern von Filtern, die ca. 4000 übertragene Kolonien besaßen, auf die leichte Kette von Antikörper D unter Befolgen der Herstelleranweisungen. 20 potentielle positive Kolonien wurden nachgewiesen und 10 zur weiteren Analyse ausgewählt. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des "QIAGEN Plasmid kit" (DIAGEN, Düsseldorf, Deutschland) oder des Verfahrens von Del Sal et al. (1988) hergestellt, und 8 enthielten Inserte der erwarteten Größe für die cDNA der leichten Kette des menschlichen Antikörpers. Ein Klon, pH210L2, wurde ausgewählt und in beide Richtungen mit Plasmidprimer unter Befolgung des Didesoxy-Kettenabschlußverfahrens (Sanger et al., 1977) gemäß dem Protokoll des "Sequenase kit" (USB, Cleveland, USA) sequenziert. Die leichte Kette wurde als λ-Sequenz bestimmt, deren variable Region in 3 gezeigt ist.
g) Aufbau der Expressionskonstrukte
Beispiel g.i)
Der Expressionsvektor pRDN1 wurde aus dem pLD9-Plasmid (beschrieben in Page, M. und Sydenham M. A. (1991), Biotechnology 9, 64–68) wie folgt angepaßt. Die HindIII-Stelle, die zum Inserieren des SV₄₀-Ursprungs der Replikation verwendet wurde, und die andere HindIII-Stelle 5' zur DGFRcodierenden Sequenz wurden durch HindIII-Digestion zerstört, mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase aufgefüllt und religiert. Ein Klon, dem beide Restriktionsstellen fehlten, wurde mit EcoR₁ verdaut, mit Klenow-Enzym aufgefüllt und religiert. Das resultierende Plasmid, dem alle internen HindIII- und EcoR₁-Stellen fehlten, wurde verwendet, um die menschliche β-Actin-Expressionskassette stromabwärts der DHFR-Transkriptionseinheit zu inserieren. Dieses Plasmid hat einen funktionellen SV40-Ursprung der Replikation, und pRDN1 hat besondere HindIII- und EcoR1-Restriktionsstellen stromabwärts des β-Actin-Promotors. Der angepaßte pRDN1-Vektor wurde mit EcoRI verdaut, mit Klenow-Enzym abgestumpft und unter Verwendung von Kalbdarmphosphatase dephosphoryliert. Die Inserte der schweren und leichten Kette von Antikörper D wurden aus ihren entsprechenden Klonen, pH210H2 und pH210L2, unter Verwendung von HindIII und EcoR1 geschnitten und mit Klenow-Enzym abgestumpft. Die stumpfendigen Inserte wurde in pRDN1 ligiert und verwendet, um "Escherichia coli MAX Efficiency DH5 Competent Cells" (Bethesda Research Labs, BRL) zu transformieren. Plasmidherstellungen in kleinem Maßstab (Del Sal, G. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 9878) wurden an einer Anzahl der resultierenden Kolonien durchgeführt und die Inserte unter Verwendung geeigneter Restriktionsverdauungen ausgerichtet. Plasmid-DNA wurde aus einem Klon der schweren und einem der leichten Kette (pRDHH9 bzw. pRDHL27) unter Verwendung von QIAGEN-Säulen (Marke, Hybaid) und Befolgen der Herstelleranweisungen hergestellt.
Transfektion von COS-Zellen
2 × 10⁵ COS-Zellen wurden in D-MEM (plus Serum) in jede Vertiefung einer Gewebekulturschale mit 12 Vertiefungen plattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zell-Einzelschichten zweimal mit serumfreiem Medium gespült, gefolgt von 0,5 ml serumfreiem Medium, das 1 μg jedes DNA-Konstrukts (pRDHH9 und pRDHL27) und 5 μg TRANSFECTAM (Northumbria Biologicals Limited) enthielt, wie vom Hersteller empfohlen. Nach weiterer Inkubation für 6 Stunden wurde das Transfektionsmedium abgesaugt und mit 1 ml D-MEM (plus Serum) ersetzt. Nach 48 bis 72 Stunden wurde das Medium entfernt und auf menschlichen Antikörper untersucht.
ELISA-Test auf menschlichen Antikörper
Das Medium aus der COS-Zelltransfektion wurde auf die Gegenwart von menschlichem Antikörper getestet. In Abwesenheit der leichten Kettensynthese werden schweren Ketten nicht aus einer Zelle sezerniert und werden intern abgebaut (Hendershot L. et al., Immunol. Today 8, 111–114.). Antikörper kann daher durch Nachweis der schweren Kette im Kultumedium untersucht werden. Mikrotiterplatten wurden mit Anti-Mensch-IgG beschichtet und mit dem Kulturmedium inkubiert. Antikörper wurde durch Visualisierung mit einem Anti-Mensch-gamma-Kette-spezifischen Peroxidase-Konjugat nachgewiesen.
Beispiel g.ii)
Die DNA, die die H- und L-Ketten codiert, wurde in die pEE6hCMV(Stephens and Cockett, Nucl. Acids Res. M: 7110, 1989; Bebbington et al., Biotechnology 10, 169, 1992) bzw. pEE12- (Rolfe, unveröffentlicht) Expressionsvektoren kloniert. Plasmid pEE12 enthält eine cDNA, die das Hamster-Glutaminsynthetase-Gen (GS; ein Marker, der unter Verwendung des toxischen Glutamat-Analogs, L-Methioninsulfoximin [MSX], selektiert und amplifiziert werden kann) unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors und SV40-Spleiß- und Polyadenylierungssignale enthält, erhalten aus pSv2.GS (Bebbington und Hentschel, "DNA cloning", Band III, New York Academic, Glover DM, Hrsg. 1987). Stromabwärts dieser Selektionskassette ist der vollständige Verstärker, Promotor und 5'-UTR aus dem unmittelbaren frühen Hautgen (MIE-Gen) des menschlichen Cytomegalovirus (hCMV), und dies wird verwendet, um die Expression des Antikörper-Gens zu treiben. Diese Expressionskassette mit ihrem verbunden Replikationsursprung und R-Lactamase-Gen wurden aus pEE6.HCMV erhalten (Stephens und Cockett, Nucl. Acids Res. 17: 7110, 1989). Mit den Vektoren pEE6hCMV und pEE12 transfizierte Zellen sind daher zum Wachstum in Glutamin-minus-Medium fähig. Plasmide pEE6hCMV und pEE12 wurden von Celltech Ltd. erhalten (Slough, Berkshire, SL1 4EN, UK).
Rekombinante Plasmide (jeweils 5 μg) wurden in 5 × 105 COS-1-Zellen oder 10⁷ YO-Myelomzellen unter Verwendung des Transfectam-Reagens (Promega, Southampton, UK) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen transfiziert. Als Ergebnis ist die Selektion nur am pEE12-Plasmid, und eine wirksame Expression beruht auf der Cointegration der zwei Plasmide.
H- und L-Ketten wurden in COS-Zellen cotransfiziert um sicherzustellen, daß die Konstrukte korrekt im Raster inseriert, effizient transkribiert und translatiert wurden, und daß der resultierende mensch- 1iche Antikörper angemessen sezernieriert wurde. Nach Bestätigung vorübergehender Expression des Antikörpers durch ELISA wurden die Plasmide in YO-Myelomzellen cotransfiziert.
Vorrats-COS-1-Zellen (Quelle ECACC, Porton Down, UK) wurden in DMEM-Medium (Flow, Irvine, UK), ergänzt mit 10% Kalbfötusserum (APP, Dudley, UK), aufrechterhalten. COS-Zelltransfektionen wurden in DMEM-Medium (Flow, Irvine, UK) durchgeführt.
Vorrats-YO-Zellen (Quelle ECACC, Porton Down, UK) wurden in voll- ständigem Medium aufrechterhalten, das DMEM-Medium (Flow, Irvine, UK; ohne Glutamin und Eisen(III)-nitrat, aber mit Natriumpyruvat [110 mg/l]; GIBCO/BRL, Paisly, UK), 1 × nicht-essentielle Aminosäuren (Flow, Irvine, UK) und 10% Kalbfötusserum (APP, Dudley, UK) enthielt. Transfizierte Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen mit Dichten von 3 × 10⁵, 7,5 × 104 und 1,5 × 10⁴ Zellen/ml in 50 μl Komplettmedium überführt und bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 100 μl Selektivmedium hinzugegeben, das DMEM-Medium enthielt (Flow, Irvine, UK; ohne Glutamin und Eisen(III)-nitrat, aber mit Natriumpyruvat [110 mg/l]; GIBCO/BRL, Paisley, UK), ergänzt mit Glutamat (60 μg/ml), Asparagin (60 μg/ml; Sigma, Poole, UK), 1 × nicht-essentielle Aminosäuren, 7 mg/l Adenosin, Cytidin, Guanosin und Uridin, 2,4 mg/l Thymidin (Sigma, Poole, UK), 10% dialysiertes Kalb-fötusserum (APP, Dudley, UK) und 4 μM MSX (zum Austitrieren des endogenen Glutaminsynthetase-Enzyms der YO-Zellen), um Klone auszuwählen, die die transfizierten Plasmide, die die Gene des menschlichen Antikörpers entlzielten, integriert hatten.
Wachstumsmedium von COS-1-Zellen vier Tage nach der Transfektion und von YO-Zellen, die in Medium zur Auswahl der Plasmid-Integration gezüchtet worden waren, wurde durch einen Sandwich-ELISA-Test unter Verwendung flexibler Mikrotiterplatten (Falcon, Becton-Dickinson, Plymouth, UK), die mit polyklonalem Anti-Mensch-IgG (Sigma, Poole, UK) als Fangantikörper beschichtet waren, untersucht. Die Testprobe wurde hinzugegeben und die Detektion mit einem für die Anti-Mensch-γ-Kette-spezifischen Peroxidasekonjugat (Sigma, Poole, UK) und Orthophenylendiamin-HCl (Sigma, Poole, UK) als Substrat durchgeführt. Positive Klone wurde auf Platten mit 24 Vertiefungen zur weiteren Vermehrung im Selektivmedium überführt.
Drei Klone wurde erhalten, die zum Wachstum bei Mengen von MSX fähig waren, die für untransfizierte YO-Zellen toxisch sind. Zwei von diesen waren sezernierter menschlicher Antikörper, bestimmt durch ELISA-Test, während die andere Linie eine falsch-positive zu sein schien.
Beispiel 2: Bestimmung der Ketten-Sequenzen von Cynomolgusaffe-Antikörper
a) Ouchterlony-Immundiffusion
Ein Ouchterlony-Immundiffusionstest unter Verwendung von Serum aus Schimpansen, Cynomolgus- und Aotus-Affen wurde durchgeführt, um einen Hinweis auf die Ähnlichkeit zu geben, die vielleicht zwischen Proteinsequenzen von menschlichen und Primaten-Immunglobulinen bestehen könnte.
Mikro-Ouchterlony-Platten – bereitgestellt von The Binding Site.
Schaf-Anti-Mensch-IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 – The Binding Site.
Ziege-Anti-Mensch-IgM und Ziege-Anti-Mensch-IgA – bereitgestellt von Sigma.
Schaf-Anti-Mensch-Ig κ leichte Kette – Serotec.
Schaf-Anti-Mensch-Ig λ leichte Kette – Serotec.
Seren aus Cynomolgus-Affe (Altwelt), Aotus-Affe (Neuwelt) und Schimpanse (Menschenaffe) wurden auf Reaktion gegen eine Reihe von Anti-Mensch-Immunglobulinen untersucht. Der unverdünnte Schaf-Anti-Mensch-Antikörper (10 μl) wurde in die zentrale Vertiefung einer Ouchterlony-Platte gegeben und die Primatenseren (10 μl) in die umgebenden äußeren Vertiefungen gegeben. Alle Seren wurden in PBS gemäß Herstellerempfehlungen verdünnt. Kaninchen- und Mausseren wurden im Test eingeschlossen ebenso wie menschliches Serum, das als positive Kontrolle fungierte. Die Platte wurde bei Raumtemperatur unter feuchten Bedingungen über Nacht oder bis zum Sichtbarwerden von Präzipitinbanden inkubiert.
Präzipitinbanden wurden zwischen Schimpansenserum und allen Anti-Mensch-Unterklassen gebildet. Einige, aber nicht alle menschlichen Ig-Klassen, und zwar Igel, IgM, IgA und κ und λ leichte Ketten, bildeten Präzipitinbanden mit Cynomolgus-Affenserum. Aotus-Affenserum (ein Neuweltaffe) wurde durch die wenigsten menschlichen Antikörper erkannt – die einzige starke Reaktion wurde mit den leichten κ- und λ-Ketten beobachtet. Überraschend reagierte das Kaninchenserum mit der Anti-Menschleichten λ-Kette – dies legt nahe, daß es ein gemeinsames Epitop zwischen Kaninchen- und Mensch-Ig-Proteinsequenzen geben kann, damit eine Erkennung auftritt. Mausserum erkannte überhaupt keine menschlichen Ig-Klassen.
Dieser Test ergab die erwarteten Ergebnisse unter Berücksichtigung der evolutionären Verwandtschaft jeder Art mit dem Menschen – d. h. die Neuweltaffen wichen früher ab als die Altweltaffen, die eine größere Proteinhomologie mit dem Menschen zeigen. Zur Untersuchung des Grades der Nukleotidhomologie zwischen Primaten- und menschlichen Ig-Genen wurden die leichten κ-Gene des Altweltaffen Cynomolgus für diese Untersuchung ausgewählt.

b) Vollständige RNA aus Cynomolgus-Affe wurde aus 10 ml Lymphozyten aus peripherem Blut unter Verwendung des Guanidiumthiocyanat-Extraktionsverfahrens REF hergestellt.

Erststrang-cDNA wurde aus vollständiger RNA unter Verwendung des BRL SUPERSCRIPT-Systems (BRL) synthetisiert. Vollständige RNA (5 μg) in einem Volumen von 13 μl wurde zu 1 μl Oligo-dT-Primer gegeben und durch Erwärmen für 10 Minuten auf 70°C, gefolgt von Abkühlen auf Eis verschmelzen gelassen.
Erststrang-cDNA wurde durch Zugabe von 2 μl Reaktionspuffer, 1 μl dNTPS, 2 μl DTT und 1 μl reverser Transkriptase revers transkribiert. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert, gefolgt von 50 Minuten bei 42°C. Die Reaktion wurde durch Erwärmen für 5 Minuten auf 90°C und dann Stellen auf Eis für 10 Minuten beendet. Die mRNA-Matrize wurde mit 1 μl RNase H für 20 Minuten bei 37°C verdaut.

c) PCR-Amplifikation von Erststrang-cDNA PCR-Primer 151 – homolog zum 5'-Ende (FR1) von menschlichem Vκ1 5'GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA SEQ ID NO: 1 301 – homolog zum 3'-Ende von menschlichem Cκ (enthält HindIII-Restriktionsstelle) 5'GATCAAGCTTCTAACACTCTCCCC SEQ ID NO: 2

Diese Primer und alle genannten anschließenden PCR- und sequenzfierenden Primer wurden an einem Oligodesoxynukleotid-Syntheseautomaten synthetisiert und wurden mit einer Konzentration von 200 ng/μl verwendet.
Erststrang-cDNA wurde direkt durch PCR ohne Notwendigkeit zur Zweitstrangsynthese unter Verwendung der Primer 151 und 301 amplifiziert. Ersterer ist spezifisch für das 5'-Ende der variablen Region (FR1) der menschlichen leichten κ1-Kette, und letzterer ist spezifisch für das 3'-Ende der konstanten Region der menschlichen leichten κ-Kette.
Die leichte Kette wurde in der folgenden Reaktion amplifiziert: die vollständige Erststrang-cDNA-Reaktionsmischung wurde zu 21 μl dH20, 8 μl Synthesepuffer [(Boehringer)], 4 μl Primer 301, 4 μl Primer 151 und 0,5 μl Taq-Polymerase gegeben. Diese Mischung wurde mit Mineralöl überschichtet und 20 PCR-Durchläufen unter Verwendung des zuvor genannten Programms unterworfen. Die Reaktion wurde auf 1% Agarosegel wie zuvor überprüft.

d) Klonierung von leichten κ-Ketten von Cynomolgus PCR-Primer 260 – homolog zum 5'-Ende von menschlichem Vκ (enthält HindIII-Restriktionsstelle) 5'GATCAAGCTTGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA SEQ ID NO: 3

i) Einführung von HindIII-Stellen an jedem Ende des leichten Kettenfragments
Die aus der vorhergehenden PCR erhaltene cDNA der leichten κ-Kette des Cynomolgus-Affen wurde in die HindIII-Stelle von pUC18 kloniert, Maniatis T. et al. J. Molecular Cloning (Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989). Die amplifizierte leichte Kette enthält eine HindIII-Stelle am 3'-Ende der konstanten Region aufgrund der Sequenz von Primer 301, es fehlt ihr aber eine solche Restriktionsstelle am 5'-Ende. Um das Klonieren der leichten Kette direkt in pUC18 zu ermöglichen wurde daher eine HindIII-Stelle am 5'-Ende der variablen Region mittels einer zweiten PCR unter Verwendung der Primer 260 und 301 eingeführt. Ersterer hat eine mit Primer 151 identische Sequenz, aber mit einer am 5'-Ende zugefügten HindIII-Stelle.
Die Reaktion wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von 1 μl Cynomolgus-cDNA (aus PCR-Mischung) mit einem Endvolumen von 100 μl angesetzt. Die DNA wurde durch 20 PCR-Durchläufe amplifiziert und dann an 1% Agarosegel überprüft. Das Gel zeigte viele andere Banden, die verschieden von den für die amplifizierte leichte Kette erwarteten waren. Es ist möglich, daß einige der kleineren Banden aufgrund des Verschmelzens von Primern miteinander bestehen könnten, wobei sogenannte Primer-Dimere gebildet werden.
ii) Reinigung des PCR-Produkts
Die leichte Kette wurde aus der PCR-Mischung vor dem Klonieren in pUC18 in der folgenden Weise gereinigt: die PCR-Reaktion wurde bei –20°C eingefroren und das flüssige Mineralöl abgesaugt. Die DNA wurde dann zweimal mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt von einer einzelnen Extraktion mit Chloroform allein. Die Lösung wurde auf 5 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8, 0,5% SDS eingestellt und mit Proteinase K auf 50 μg/ml versetzt. Die Reaktion wurde für 30 Minuten bei 37°C und dann für 10 Minuten bei 68°C inkubiert. Eine zweite Phenol/Chloroform-Extraktion. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina absolutem Ethanol ausgefällt (1 μl Dextransulfat wurde als Träger hinzugegeben). Die DNA wurde für 30 Minuten bei –20°C aufbewahrt und dann in einer Eppendorf-Zentrifuge pelletisiert. Das Pellet wurde in 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 17 μl Wasser resuspendiert. Dieses Reinigungsverfahren räumt das Problem der Taq-Polymerase aus, die an die DNA gebunden bleibt und somit die Aktivität des Restriktionsenzyms hemmt.
iii) Herstellung des HindIII-Fragments zum Klonieren
Die DNA der leichten Kette wurde dann mit Restriktionsenzym HindIII verdaut, um in die HindIII-Stelle von pUC18 zu klonieren. Zu 17 μl DNA der leichten Kette wurden 2 μl Puffer B und 1 μl HindIII in hoher Konzentration gegeben und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Der Verdau wurde auf 1% Agarose-Gel getrennt, und die der leichten Kette entsprechende Bande wurde aus dem Gel geschnitten. Die DNA wurde aus der Agarose unter Verwendung des "Prep-a-gene"-Reinigungskits (Biorad Ltd.) unter Befolgen der Herstelleranweisungen gereinigt.
e) Ligation von Cynomolgus leichter Kette in pUC81
Das gereinigte HindIII-Fragment wurde in die HindIII-Stelle von pUC18 unter Verwendung des folgenden Verfahrens kloniert: 20 μl Cynomolgus-DNA (aus einem Volumen von 80 μl) wurde zu 1 μl HindII2-verdautem pUC18 (50 μg/μl Pharmacia), 3 μl Ligase-Puffer (Boehringer), 3 μl T4 DNA-Ligase (Boehringer) und 3 μl destilliertem Wasser gegeben. Die Reaktion wurde für 3 Stunden bei 15°C inkubiert.
f) Transformation von DH5-kompetenten Zellen durch pUC18-κ-Kette
E. coli DHSα-Zellen maximaler Effizienz (BRL) wurden mit dem Plasmid der leichten Kette transformiert. 100 μl Zellen wurden langsam von –70°C aufgetaut, vorsichtig mit 5 μl Ligationsreaktion vermischt und für 30 Minuten auf Eis aufbewahrt. Die Zellen wurden für 45 Sekunden bei 42°C inkubiert und dann für 2 Minuten auf Eis gekühlt. 1 ml SOC-Medium (20 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 10 ml 250 mM KCl, 5 ml 2 M MgCl, 20 mM Glucose pro Liter) wurde hinzugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Transformationsreaktion wurde auf fünf LB-Platten ausplattiert (LB-Agarplatten: 12 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 4 ml Glycerin, 100 ml Phosphatpuffer, 12 g Bacto-Agar pro Liter), die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Zahl der Kolonien wurde pro Platte gezählt und die Transformationseffizienz berechnet.
Fünf Kolonien wurden aus den Platten gepickt und die Gegenwart der Inserte der leichten Kette durch PCR überprüft. Jede Kolonie wurde in 65,5 μl destilliertem Wasser resuspendiert und 20 PCR-Durchläufen unter Verwendung der Primer 260 und 301 in der Standardreaktionsmischung unterworfen. Die PCR-Reaktionen wurden auf Gel wie zuvor durchgeführt. Es wurde gefunden, daß vier von fünf Kolonien das Insert enthielten, was anzeigte, daß das Klonieren erfolgreich war.
g) Plasmid-Minipreps der pUC18-κ-Kette
20 Kolonien aus den fünf Transformationsplatten wurden gepickt und in 2 ml Volumina von L-Bouillon übergeimpft (L-Bouillon – wie LB-Platten, aber ohne Agar), die 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Die Kulturen wurden über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. 1,5 ml jeder Kultur wurden abgeschleudert und die Zellpellets in 200 μl STET (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7, 1 mM EDTA, 5% Triton-X-100) mit 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Die Röhrchen wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann für 45 Sekunden gekocht und für 10 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde mit einem sterilen Zahnstocher entfernt und 8 μl 8%iges CTAB zum Überstand hinzugegeben. Das Röhrchen wurde für 5 Minuten geschleudert, um das Plasmid zu pelletisieren.
DNA, die anschließend durch Verwirbeln in 300 μl 1,2 M Natriumchlorid resuspendiert wurde. Die DNA wurde durch Zugabe von 750 μl Ethanol ausgefällt, vakuumgetrocknet und in 20 μl TE-Puffer resuspendiert (TE – 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA).
Die Minipreps wurden auf Gegenwart der leichten Kette durch Verdauung mit Restriktionsenzym überprüft (HindIII-Restriktionsenzym und Puffer B-10 μ/μl – Boehringer). 2 μl jeder DNA wurden zu 0,5 μl Puffer B, 1 μl destilliertem Wasser, 1 μl RNase A (500 μg/ml Boehringer) und 0,5 μl HindIII gegeben. Die Verdauungen wurden für 1,5 Stunden bei 37°C inkubiert und dann auf 1% Gel laufen gelassen. Die Gegenwart der leichten Kette wurde durch ein Fragment mit ca. 700 Basenpaaren angezeigt.

h) Sequenzierung der leichten κ-Ketten Sequenzierungsprimer M13 reverser Primer – verschmilzt mit -ve-Strang von pUC18, stromabwärts der Polyklonierungsstelle – bereitgestellt von Pharmacia; 5'AACAGCTATGACCATG SEQ ID NO: 4 –40-Vorwärtsprimer – verschmilzt mit +ve-Strang von pUC18, stromabwärts der Polyklonierungsstelle – bereitgestellt von USB 5'GTTTTCCCAGTCACGAC SEQ ID NO: 5 299 – Primer der menschlichen Cκ-Region 5'GCGTCAGGGTGCTGCTGAGG SEQ ID NO: 6 106 – Primer der menschlichen Cκ-Region (5'-Ende) 5'GGCGGGAAGATGAAGACAGA SEQ ID NO: 7 151 und 260 – siehe Stufen C und D 261 – Primer der menschlichen Cκ-Region 5'TTCAGCAGGCACACAACAGA SEQ ID NO: 8
i) 10 Klone aus der vorhergehenden Stufe wurden zum Sequenzieren durch das Didesoxy-Kettenabschlußverfahren ausgewählt (Klone 1, 2, 4, 5, 9, 12, 14, 15, 18 und 20). Die verbleibenden 18 μl Miniprep-DNA wurden zu 2 μl NaOH (2M) gegeben und für 20 Minuten auf 68°C erwärmt, um die DNA zu denaturieren. Die DNA wurde durch Zugabe von 8 μl 5M Ammoniumacetat (pH 5,4) und 100 μl Ethanol auf Trockeneis für 5 Minuten abgekühlt und ausgefällt. Die DNA wurde pelletisiert, in 70%igem Ethanol gewaschen, vakuumgetrocknet in in 20 μl destilliertem Wasser resuspendiert.

Eine DNA-Teilmenge (7 μl) wurde zu 2 μl Reaktionspuffer und 1 μl des entsprechenden Primers gegeben und für 2 Minuten bei 65°C inkubiert und dann langsam auf unter 30°C abgekühlt, um Primer und Matrize zu verschmelzen. Es war erforderlich, mehrere unterschiedliche Primer zu verwenden, um die gesamte leichte κ-Kette zu sequenzieren, deren Einzelheiten oben angegeben sind. Zu Matrize/Primer wurde folgendes gegeben: 1 μl DTT (0,1 m USB), 2 μl Markierungsmischung ( 5 × USB), 0,5 μl 35S-dATP (10 μCi/μl Amersham) und 2 μl Sequenaseenzym. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert, um eine ³⁵S-markierte Leitsequenz zu synthetisieren. Nach Beendigung der Markierungsreaktion wurden 3,5 μl Markierungsmischung zu vier Vertiefungen einer Multivertiefungsplatte gegeben, die 2,5 μl ddGTP, ddATP, ddTTP und ddCTP enthielt. Man ließ die Kettenabschlußreaktion für 5 Minuten bei 37°C fortschreiten, bevor 4 μl Stopplösung zu jeder Vertiefung gegeben wurden. Die Reaktionen wurden bis zur Verwendung auf Eis gelagert.
Ein 8%iges Acylamidgel (ultrareine Acylamid-Gelmischung-8, bereitgestellt von BRL) wurde zwischen siliconisierte Glasplatten gegossen und für eine Stunde mit 40 mA unter Verwendung von TBE (0,09 M TMS-Borat pH 8, 0,002 M EDTA) als Laufpuffer vorlaufen gelassen. Die Vertiefungen wurden mit Puffer vor und nach dem Vorlauf ausgewaschen, um Luftbläschen und Harnstoff zu entfernen. Vor dem Beladen des Gels wurden die Proben für 2 Minuten auf 95°C erwärmt, dann wurden 4 μl jeder Probe auf das Gel geladen. Die Proben wurden für 1,5 Stunden mit 40 mA laufen gelassen, dann wurde eine zweite Beladung auf das Gel aufgetragen und für weitere 1,5 Stunden laufen gelassen. Dies ergab einen kurzen und langen Lauf für jeden Satz von Proben. Die Platten wurden auseinandergenommen und das Gel in 10% Essigsäure/10% Methanol gegeben, bevor das Gel auf ein Blatt 3 MM-Papier übertragen wurde. Das Gel wurde bei 80°C für 1,5 Stunden getrocknet und damit Röntgenfilm über Nacht bei Raumtemperatur belichtet. Die Autoradiogramme wurden entwickelt und die Sequenz vom Boden aufwärts ausgelesen, wobei die langen und kurzen Läufe überlappten.
j) Vergleich der Sequenzdaten
Die vollständigen Sequenzen der leichten Kette der 10 Klone wurden durch Laufenlassen einer Reihe von Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung verschiedener Primer erhalten. Vergleiche der Sequenzdaten sind in den 4 bis 7 gezeigt. Es wurde gefunden, daß Klone 14 und 5 gekürzte Sequenzen der leichten Kette enthalten. Dies ist höchstwahrscheinlich ein Artefakt, das durch die reverse Transkription von mRNA oder die PCR-Amplifikation der cDNA verursacht wird. Es kann möglich sein, daß die mRNA oder cDNA eine Sekundärstruktur bildete, durch die das entsprechende Enzym nicht lesen konnte, was somit in einer Teilsequenz resultiert. Klon 15 wurde zum weiteren Vergleich mit bekannten Sequenzen der leichten Kette ausgewählt, um seine Identität zu bestätigen, und mit leichten Ketten von Mensch, Kaninchen und Maus zur Bestimmung der Nukleotid- und Aminosäurehomologie, deren Ergebnisse in den Tabellen 4 bis 7 ersichtlich sind.
Die konstante Region der leichten Kette von Cynomolgus wurde mit einem Cκ-Gen der menschlichen Keimbahn (Hieter, P. A., et al. Cell 22, 197 (1980)), einer Maus-MOPC21 Cκ-mRNA (Hamlyn, P. A. et al. Nucl. Acids Res. 9, 4485 (1981)) und einer Kaninchen-Cκ-mRNA (17D9) (McCartney – Francis N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 1794, 1984) verglichen. Die variablen Regionen von Cynomolgus wurden mit einer menschlichen Lymphoid-Zellinie, Walker verglichen (Klobek, H. G. et al. Nucl. Acids Res. 12, 6995, 1984). Diese Zellinie exprimiert ein Gen der leichten Kette, das zur Vκl-Familie gehört und das das J5-Gensegement verwendet. Die 17D9-Kaninchensequenz wurde verwendet, um variable Sequenzen von Cynomolgus zu vergleichen, ebenso wie die S107A-Maus Vκ1-Sequenz (Kwan, S.P. et al., J. Exp. Med. 153, 1366 (1981)). Dies ist ein Phosphocholin-bindendes IgA κ-Myelom, das das Maus-J1-Gensegment verwendet. Die variable Region von Klon 15 wurde ebenfalls mit einem menschlichen Antikörper verglichen, Daudi (Klobek 1984). Dieses Gen der leichten Kette gehört zur Vκ1-Familie und verwendet das J5-Gensegmemnt. Die Sequenz der konstanten Region der leichten κ-Kette von Cynomolgus-Antikörper zeigt eine hohe Homologie mit dem menschlichen Cκ-Gen sowohl auf Nukleotid- (91,6%) als auch auf Aminosäureebene (81,3%). Maus-Cκ erschien homologer mit entweder Cynomolgus-Affe- oder Mensch-Cκ zu sein als es Kaninchen tat. Jedoch schienen sich die prozentualen Homologien nicht dramatisch zu unterscheiden, wenn Mensch und Affe mit Kaninchen und Maus oder tatsächlich Kaninchen mit Maus verglichen wurde.
Tabellen 5 und 6 zeigen prozentuale Homologien für jede Gerüstregion und jedes CDR von Klon 15. Wie erwartet sind die Gerüstregionen relativ konservativ zwischen den Arten im Vergleich zu CDRs, wo es eine beträchtliche Variabilität gibt. Z. B. teilt Klon 15 eine 90–96%ige Aminosäuresequenz-Homologie mit dem Mensch in Gerüsten 1 und 3, aber nur 22% Homologie innerhalb CDR 3. Klon 15 zeigt einen hohen Homologiegrad zu den Sequenzen der menschlichen leichten Kette von sowohl Walker als auch Daudi, speziell innerhalb der Gerüste 1 und 3, obwohl er eine höhere Homologie zu Walker als zu Daudi aufweist. Die Kaninchen-Vκ-Sequenz zeigt eine stärkere Homologie zu sowohl Mensch- als auch Affe-Sequenzen als dies die Maus tut. Dies könnte erklären, warum etwas Reaktion gegenüber Anti-Mensch-Antikörpern mit Kaninchenserum im Ouchterlony-Test beobachtet wurde, aber keine Reaktion mit Mausserum beobachtet wurde.
Tabelle 4: Vergleiche von Sequenzhomologien der konstanten Region der leichten Kette
Tabelle 5: Prozentuale Homologien von Gerüst- und CDR-DNA-Sequenzen der leichten Kette
Tabelle 6: Prozentuale Homologien von Gerüst- und CDR-Aminosäuresequenzen der leichten Kette

Claims

Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Primaten-Antikörpers, umfassends (i) Auswählen einer aus Lymphozyten eines Primaten stammenden Zellinie, die zur Expression eines gewünschten Antikörpers fähig ist; (ii) Isolieren der RNA aus der Zellinie und Abtrennen der mRNA von den anderen so isolierten RNAs; (iii) Synthetisieren von cDNA aus der mRNA und Inserieren der cDNA in einen Klonierungsvektor; (iv) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor, der die cDNA enthält, um eine Bank zu erhalten; (v) Durchmustern der Bank auf cDNA, die die gesamten konstanten und variablen Regionen der Gene für die schwere und leichte Kette des Antikörpers codiert; (vi) Inserieren der cDNA, die die gesamten konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers codiert, in einen Expressionsvektor; (vii) Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, der die cDNA enthält; und (viii) Kultivieren der transfizierten Wirtszelle und Isolieren des gewünschten Antikörpers.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Primat ein Mensch ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin der Primat ein Schimpanse oder ein Altwelt-Affe ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zellinie aus Lymphozyten aus einem Individuum hergestellt wird, von dem bekannt ist, dass es sich von einem Krankheitszustand erholt hat oder in der Remission davon befindet.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zellinie aus Lymphozyten aus einem Individuum hergestellt wird, von dem bekannt ist, dass es mit einem pathogenen Organismus infiziert ist oder an Krebs oder einer Autoimmunerkrankung leidet, das aber nicht die vollen Krankheitssymptome offenbart.
Verfahren gemäss Ansprüchen 4 oder 5, worin das Individuum mit einem Virus infiziert wurde.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zellinie aus Lymphozyten aus einem Individuum hergestellt wird, das geimpft oder mit Antigen geimpft wurde und eine Antikörperreaktion aufgebaut hat.
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zellinie stabilisiert ist oder sich unbegrenzt vermehrt.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Zellinie durch Durchmustern auf die Herstellung von Antikörper mit Affinität für ein gewünschtes Antigen ausgewählt wird.
Verfahren gemäss Anspruch 9, worin die Zellinie ferner durch Durchmustern auf Antikörperfunktionalität ausgewählt wird.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers, umfassend: (i) Mikro-RNA-Herstellung aus ca. 1.000 Hybridomzellen; (ii) Erzeugung einer grössenselektierten cDNA-Bank; (iii) Durchmustern der Bank auf cDNA, die die gesamten konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers codiert, und Isolieren derselben; (iv) Inserieren der cDNA, die die gesamten konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers enthält, in einen Expressionsvektor; (v) Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Expressionsvektor, der die cDNA enthält; und (vi) Kultivieren der transfizierten Wirtszelle und Isolieren des gewünschten Antikörpers.
Vektor, der zum Transfizieren einer Wirtszelle geeignet ist und cDNA umfasst, die die gesamten konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten eines Primaten-Antikörpers codiert.
Eukaryotische Zellinie, die mit cDNA zur Expression der gesamten konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten eines Primaten-Antikörpers transfiziert ist.
Verfahren zur Expression von cDNA, die die gesamten konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten eines Primaten-Antikörpers codiert, umfassend das Transfizieren einer eukaryotischen Wirtszelle mit einem Vektor oder Vektoren, der/die zur Expression der cDNA geeignet ist/sind.