RU2712251C1 - Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения - Google Patents
Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2712251C1 RU2712251C1 RU2018146031A RU2018146031A RU2712251C1 RU 2712251 C1 RU2712251 C1 RU 2712251C1 RU 2018146031 A RU2018146031 A RU 2018146031A RU 2018146031 A RU2018146031 A RU 2018146031A RU 2712251 C1 RU2712251 C1 RU 2712251C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- cell
- antibodies
- amino acid
- disease
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 94
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 88
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 75
- 101000844040 Homo sapiens T cell receptor beta variable 9 Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102100032166 T cell receptor beta variable 9 Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 60
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 55
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 45
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 31
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 91
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 claims description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 26
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 21
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 19
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 102100033108 Transketolase-like protein 1 Human genes 0.000 description 14
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 8
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 4
- -1 series Chemical compound 0.000 description 4
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 2
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000606210 Homo sapiens Probable non-functional T cell receptor beta variable 5-3 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102100039754 Probable non-functional T cell receptor beta variable 5-3 Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQTFKIKSQNCWGJ-KCDKBNATSA-N (2s,3r,4r,5s)-2-fluoro-3,4,5-trihydroxyhexanal Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](F)C=O SQTFKIKSQNCWGJ-KCDKBNATSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101500027988 Mus musculus ADGRV1 subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101150062493 TRBV9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000007845 assembly PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010038291 endodeoxyribonuclease PvuI Proteins 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical group 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 230000005415 magnetization Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000000671 osmolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002357 osmotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000013621 viresolve pro solution Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитело и его антигенсвязывающий фрагмент, способные к специфическому связыванию с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека. Также рассмотрены нуклеиновые кислоты, экспрессионные векторы, способ получения клетки-хозяина, клетка-хозяин, способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и фармацевтические композиции. Кроме того, описан способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т-клеточным рецептором человека, и применение антитела или фармацевтической композиции. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии различных состояний, в частности целиакии, Т-клеточного лейкоза и Т-клеточной лимфомы. 13 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл., 7 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и биомедицины, а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному гуманизированному антителу, которое специфически связываются с семейством Т-клеточных рецепторов человека. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с семейством Т-клеточных рецепторов человека.
Предшествующий уровень техники
Причиной возникновения аутоиммунных заболеваний являются аутореактивные Т лимфоциты (Haroon N et al. Arthritis Rheum. 2013 Oct;65(10):2645-54., Duarte J. et al. PloS One 2010 May 10;5(5):e10558; Konig M. et al. Front Immunol 2016 Jan 25;7:11). Из уровня техники известно, что маркером, позволяющим идентифицировать клон Т-лимфоцитов, вовлеченный в патогенез аутоиммунного заболевания, является последовательность Т-клеточного рецептора (ТКР). Субъединицы Т-клеточных рецепторов структурно относятся к суперсемейству иммуноглобулинов и формируются из нескольких генных сегментов. Вариабельные участки ТКР образуют антигенсвязывающий центр ТКР. Это означает, что они клоноспецифичны, т.е. отличаются у Т-лимфоцитов, реагирующих на разные антигены.
По аминокислотной гомологии вариабельных (V) генных сегментов, входящих в состав вариабельного домена ТКР, Т-клеточные рецепторы подразделяют на различные семейства. Согласно номенклатуре IMGT для бета цепи выделяют 26 различных семейств, а для альфа цепи - 41 семейство (Turner SJ et al., Nature Reviews Immunology 2006, V.6, 883-894). Для определения семейства цепи ТКР используют множественное выравнивание тестируемой аминокислотной последовательности с известными последовательностями цепей ТКР, информация о которых суммирована в базе данных IMGT («The international ImMunoGeneTics information system», Lefranc M-P., Nucl Acids Res 2001; 29:207-209), доступной в сети Интернет по адресу http://www.imgt.org. Множественное выравнивание и определение семейства цепи ТКР может быть осуществлено с помощью пакета программ IgBlast.
Описаны моноклональные антитела W112 и 2D1 к участкам бета цепи вариабельных доменов Т-рецептора человека, относящихся к семействам TRBV5-3 TRBV8-1 (WO 9006758), предложенные в качестве инструмента для диагностики и терапии ревматоидного артрита. Данные моноклональные антитела узнают соответственно 0.3-5% периферических Т лимфоцитов, несущих TRBV5-3 и 0.5-13% периферических Т лимфоцитов, несущих TRBV8-1. Основанием для использования моноклональных антител специфичных к участкам бета цепей Т-рецепторов послужили результаты многих исследований, демонстрирующие вовлеченность Т-лимфоцитов в патогенез ревматоидного артрита. В частности, данные статьи F.M. Brennan et al., Clin Exp Immunol. 1988 Sep; 73(3): 417-423, где было продемонстрировано увеличение процентного содержания Т-лимфоцитов, несущих TRBV5 TRBV8 в синовиальных образцах пациентов, страдающих ревматоидным артритом по сравнению со здоровыми донорами. Так же для диагностики и терапии ревматоидного артрита описаны моноклональные антитела, взаимодействующие с эпитопом вариабельной области VB3.1 Т-клеточного рецептора человека (WO 9405801), которые взаимодействуют с подсемейством ТКР V(бета)3.1.
Так же описаны моноклональные антитела, специфично узнающие бета цепь 13-го семейства ТРК крысы. На модельных животных показано, что с помощью этих антител возможно превентивное удаление небольшой популяции Т-клеток, Т-рецептор которых содержит бета цепь VB13 (VB13+Т клетки), и показано, что такая процедура защищает от развития диабета I типа у крыс предрасположенной к этому заболеванию линии, а также значительно снижает риск развития вирус-индуцированного диабета (Zhijun Liu et al., Diabetes. 2012 May; 61(5): 1160-1168). В то же время, удаление Т клеток, Т-рецептор которых содержит другое семейство бета цепи (VB16), не отличается по результату от контрольных групп. Важно отметить, что уже первое введение моноклонального антитела против VB13 приводит к 60% снижению количества VB13+ Т клеток в селезенке крыс.
Описан консенсусный вариант аутоиммунных ТКР при анкилозирующем спондилите (АС или болезнь Бехтерева), показано, что он представлен у больных АС в синовиальной жидкости и периферической крови и отсутствует при той же глубине анализа у здоровых доноров независимо от статуса по аллелю HLA*B27 (Faham М. et al., Arthritis Rheumatol. 2017;69(4):774-784; Komech E et al. 12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference; 2016 Sep 3-7; Strbske Pleso, Slovakia. Abstract book p. 39). Указанные ТКР относятся к TRBV9 семейству (согласно номенклатуре IMGT). Показано, что Т-клеточные рецепторы, несущие бета цепи семейства TRBV9, вовлечены также в развитие такого аутоиммунного заболевания как целикиа (Petersen J et al., J Immunol. 2015; 194(12): 6112-22). Также они обнаруживаются на поверхности Т клеток, подверженных маглинизации в случае Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий, в том числе Т-клеточной лимфомы, вызванной вирусом Эпштейн-Барр (EBV) (Toyabe S et al., Clin Exp Immunol. 2003; 134(1): 92-97).
Недавно описаны химерные моноклональные антитела, обладающие способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека, которые могут использоваться при терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, АС, целиакии и некоторых Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий (заявка на изобретение РФ 2017145662).
Указанные антитела являются единственными известными сегодня антителами, которые могут быть использованы для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9. Основным недостатком указанных антител является их относительно низкая степень гуманизации - они содержат свойственные человеку константные области и структурные компоненты, но имеют вариабельный домен, свойственный крысе. Степень гуманизации вариабельного фрагмента тяжелой цепи указанных антител составляет 72%, а вариабельного фрагмента легкой цепи - 69%.
Вышеуказанное родительское моноклональное антитело, включает:
1) вариабельный домен их тяжелой цепи (VH), который содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где
HCDR1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2
HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 3;
2) вариабельный домен их легкой цепи (VL), который содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,
LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,
LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Вышеуказанное родительское моноклональное антитело, включает вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 8 и 10.
Вышеуказанное родительское моноклональное антитело, включает легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID No 12 и тяжелую цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность - SEQ ID No 14.
Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей вышеуказанного родительского антитела, приведены в SEQ ID NOs: 13 и 11.
Изобретение направлено на создание моноклонального антитела, которое может быть использовано для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9, в частности, для терапии АС, целиакии и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР семейства TRBV9, и которое отличается высокой степенью гуманизации. Гуманизация в тоже время часто приводит к критическому снижению аффинности и/или растворимости антител. Таким образом, получение гуманизированных функциональных антител является актуальной задачей.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу и его антиген-связывающему фрагменту, которые обладают способностью с высокой аффинностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека. Антитело, согласно изобретению, может использоваться в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, АС, целиакии и некоторых Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий.
В преимущественных воплощениях антитело настоящего изобретения содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с тремя гипервариабельными участками
1) HCDR 1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
2) HCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2
3) HCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 3;
2) вариабельный домен легкой цепи (VL) с тремя гипервариабельными участками LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,
LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,
LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Здесь и далее при определении CDR антител используется известная номенклатура Kabat, если отдельно не оговорено иное.
При этом вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.
В преимущественных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения имеет последовательность, показанную в SEQ ID No: 16 и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 8, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.
В преимущественных воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO 18, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 10, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.
В некоторых воплощениях моноклональные тела по изобретению являются полноразмерными антителами IgG человека, например, IgG1 или IgG2 или IgG3 или IgG4.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает легкую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.
В некоторых воплощениях антитело имеет легкую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 22, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 20.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антитела согласно изобретению, нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител согласно изобретению и функциональные фрагменты антител.
Также обеспечиваются кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Вектор или кассета экспрессии могут находиться в клетке-хозяине как внехромосомный элемент или интегрироваться в геном клетки в результате введения (путем трансфекции) указанной кассеты экспрессии или вектора в клетку.
Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения, и способы их получения.
Также обеспечивается способ получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, заключающийся в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела. В некоторых воплощениях способ включает последующее выделение и очистку полученного антитела.
Также обеспечивается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
В одном из вариантов фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, выбранного из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Также обеспечивается фармацевтическая комбинация для профилактики или лечения заболевания, или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и, по меньшей мере, одно другое терапевтически активное соединение.
В одном из вариантов фармацевтическая комбинация предназначена для профилактики или лечения заболевания, или нарушения, выбранного из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
В одном из вариантов фармацевтическая комбинация или композиция включает другое терапевтически активное соединение, которое выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов, например, кортикостероидов.
Также обеспечивается способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Также обеспечивается способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции, в терапевтически эффективном количестве.
В одном из вариантов способа лечения заболевания или нарушения, заболевание или нарушение выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Также обеспечивается применение вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9.
В одном из вариантов применения, заболевание выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Технический результат настоящего изобретения состоит в получении антител с повышенной степенью гуманизации, которые специфически с высокой аффинностью связываются с ТКР, бета цепь которых относится к TRBV9 семейству и могут быть использованы для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, бета цепь которых относится к TRBV9 семейству.
В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 84%. В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент легкой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 85%.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека с повышенной степенью гуманизации относительно аналогов.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их фрагменты по изобретению, кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине.
Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.
Также обеспечиваются способ получения моноклонального антитела или его функционального фрагмента, фармацевтическая композиция и фармацевтическая комбинация, содержащая в эффективном количестве антитело настоящего изобретения, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями и способы диагностики и терапии АС и иных заболеваний с использованием антител настоящего изобретения.
Определения
С целью более легкого понимания изобретения сначала определяются некоторые термины.
Следует понимать, что материалы и способы, предлагаемые в данном документе, не ограничиваются конкретными композициями или этапами способа, поскольку они могут варьироваться. Указано, что, как используется в данном описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают и соответствующие формы во множественном числе, если контекст явно не предписывает иное.
«Т-клеточный рецептор», так же указанный как «ТРК», «Т-рецептор» или «TCR» человека представляет собой гетеродимерный белковый комплекс, расположенный на поверхности Т лимфоцита. Т-рецептор присутствует только на Т-лимфоцитах. Основная функция ТКР заключается в специфическом распознавание процессированных антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (HLA).
ТКР человека состоит из двух субъединиц, α и β, либо γ и δ цепей, связанных между собой дисульфидной связью и закрепленных в клеточной мембране. Каждая из цепей ТКР имеет N-концевой вариабельный (V) домен, соединительный домен и константный (С) домен, соединенный с трансмембранным доменом, закрепляющим рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита. Протяженность константного домена альфа и бета цепей составляет 91 и 129 аминокислотных остатков, соответственно. Длина соединительного и трансмембранного домена альфа цепи - 30 и 17 аминокислотных остатков (а.о.), а у бета цепи - 21 и 22 а.о. Протяженность вариабельных доменов Т-рецепторов варьирует от 104 до 125 а.о.
Небольшая фракция Т-лимфоцитов располагает Т-рецепторами типа γ/δ. По своему устройству они аналогичны α/β рецепторам, но отличаются по первичной структуре и имеют ряд функциональных особенностей. Их вариабельность гораздо ниже (ограниченная клоноспецифичность), они распознают антигены в комплексе с «неклассическими» (не МНС) антигенпредставляющими молекулами или даже свободные антигены.
Т-рецептор взаимодействует с комплексом МНС-антиген шестью участками, определяющими его комплементарность (CDR): три участка альфа цепи и три бета цепи. Эти CDR представляют собой гипервариабельные участки, петли вариабельных доменов Т-клеточного рецептора - Vальфа и Vбета.
Термины «TRBV9» или «семейство TRBV9» относятся к девятому семейству бета-цепей Т-клеточных рецепторов, выделяемому согласно номенклатуре IMGT, которое характеризуется тем, что аминокислотная последовательность их вариабельного домена включает уникальные мотивы CDR1 (последовательность аминокислот - S-G-D-L-S) и CDR2 (последовательность аминокислот - Y-Y-N-G-E-E). Термин «ТКР семейства TRBV9» обозначает Т-клеточный рецептор, бета-цепь которого относится к TRBV9 семейству.
Термин «патологический» по отношению к Т-лимфоцитам или ТКР означает, что данное ТКР или Т-лимфоцит, его несущий, ассоциированы с заболеванием или патологией и/или являются причиной заболевания и/или способствуют развитию заболевания.
Термин «аутоиммунный» по отношению к ТКР означает, что данное ТКР вовлечено в развитие аутоиммунного заболевания.
Термин «антитело», используемый здесь, предназначен для определения молекулы иммуноглобулина, состоящей из четырех полипептидных цепей (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), связанных дисульфидными связями. Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретным константным участком.
Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенный здесь как HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (сокращенный здесь как LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен CL. Участки VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), окруженные участками, которые являются более консервативными, называемыми скелетными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR участков, расположенных от амино- до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
В данной заявке 3 CDR тяжелые цепи обозначены как «HCDR1, HCDR2 и HCDR3», а 3 CDR легкой цепи обозначены как «LCDR1, LCDR2 и LCDR3». CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. Нумерацию и позиционирование CDR-аминокислотных остатков в пределах HCVR и LCVR участков антител согласно данному изобретению осуществляют с хорошо известной номенклатурой Kabat, если не указано иного. В настоящей заявке используется, если не указано иного, общепринятые буквенные обозначения аминокислот.
Термины «анти-TRBV9-антитело», «антитело к TRBV9», «антитело, специфически связывающееся с бета цепью семейства TRBV9» или «антитело против бета цепи семейства TRBV9» и им подобные являются взаимозаменяемыми в контексте настоящей заявки и относятся к антителу, которое специфически связывается с эпитопом бета цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека.
Кроме того, «моноклональное антитело», как используется в данной заявке, может быть одноцепочечным Fv-фрагментом, который может быть получен путем связывания ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, с линкерной последовательностью (см. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Подразумевается, что вне зависимости от того, указаны ли фрагменты или части, термин «антитело», как используется в данной заявке, включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы. До тех пор, пока белок сохраняет способность специфического или предпочтительного связывания своей мишени (например, эпитопа или антигена), он относится к термину «антитело». Антитела могут быть гликозилированными, или не быть таковыми, и входят в рамки изобретения.
Термины «антитело» и «моноклональное антитело» для нужд настоящей заявки относятся к моноклональному антителу против ТКР семейства TRBV9. Как используется в настоящей заявке «моноклональное антитело» относится к антителу грызуна, семейства приматов или Camelidae, предпочтительно к антителу мыши, макаки, верблюда или ламы, химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иное.
Популяция «моноклональных антител» относится к гомогенной или по существу гомогенной популяции антител (т.е. по крайней мере приблизительно 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 97 или 98% или еще более предпочтительно по крайней мере 99% антител в популяции будут конкурировать в анализе ELISA за тот же антиген или эпитоп, или более предпочтительно антитела являются идентичными в аминокислотной последовательности). Антитела могут быть, а могут и не быть, гликолизированными и все еще подпадать в объем изобретения.
Моноклональные антитела могут быть гомогенными, если они имеют идентичную аминокислотную последовательность, хотя они могут отличаться по посттрансляционной модификации, например, паттерн гликолизации.
Вариабельные участки каждой из пар легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Как используется в данной заявке, «антигенсвязывающая часть», или «антигенсвязывающий участок», или «антигенсвязывающий домен» или «антигенсвязывающий центр» относятся, взаимозаменяемо, к такой части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу его специфичность и аффинность по отношению к антигену. Эта часть антитела включает «каркасные» аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков.
Термин «человеческое антитело», используемый здесь, означает антитело, в котором последовательности вариабельных и константных доменов происходят от человеческих последовательностей. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут включать остатки аминокислот, нехарактерные для человека (например, мутации, интродуцированные ненаправленным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и особенно в CDR3.
Термин «гуманизированные» по отношению к антителам используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей и структурных компонентов, но имеют обусловливающие комплементарность участки (CDR), которые свойственны иммуноглобулинам иного происхождения или соответствующим фрагментам модифицированных антител.
«Родительское» антитело в данной заявке - это антитело, кодированное аминокислотной последовательностью, которая используется для получения варианта. Родительское антитело может быть из грызуна, ламы, химерным, гуманизированным или человеческим антителом.
Термин «степень гуманизации» по отношению к антителам используются для обозначения процента идентичности последовательности каркасного участка гуманизированного антитела относительно первичного человеческого акцепторного каркасного участка, который был использован для создания гуманизированного антитела и который доступен из человеческой библиотеки. Предпочтительно, антитело изобретения содержит каркасный участок с идентичностью не менее 80%, обычно не менее 82%, чаще не менее 83%, например, не менее 84%, или не менее 85%, или не менее 86%, или не менее 87% идентичностью в отношении к каркасному участку, полученному из человеческой библиотеки.
Термин «гуманизирующие замены» относятся к аминокислотным заменам, которые увеличивают степень гуманизации антитела или его фрагмента.
Термин «химерные» по отношению к антителам настоящего изобретения используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей, но имеют вариабельные домены иного происхождения. В таких антителах вариабельные домены легких и/или тяжелых цепей, имеющие нечеловеческое происхождение (например, взятые из крысы), оказываются оперативно связаны с константными доменами соответствующих цепей человеческого происхождения.
Термин «оперативно связанный» или ему подобный при описании антител относиться к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической (ковалентной, если не указано иного) и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях, функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов.
Термин «оперативно связанный» или ему подобный при описании нуклеиновых кислот означает, что нуклеиновые кислоты ковалентно связаны таким образом, что в местах их соединения отсутствуют «сбойки» рамки считывания и стоп-кодоны. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий «оперативно связанные» компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок, например, химерное антитело согласно изобретению.
Как здесь используется, термины «изолированный» и «выделенный» означают молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.
В преимущественных воплощениях антитела настоящего изобретения являются рекомбинантными, то есть полученными с помощью техники рекомбинантных ДНК.
Термин «рекомбинантное антитело», используемый здесь, включает все антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, введенного в клетку-хозяин, антитела, выделенные из набора известных рекомбинантных комбинаторных человеческих антител, антитела, выделенные из животного, которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295). В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, поскольку они выделены из последовательностей зародышевых VH и VL человека и близки к ним, не могут в естественных условиях существовать в зародышевом наборе антител человека in vivo.
Термин «специфически связывает», как используется в данной заявке, относится к той ситуации, при которой один участник пары специфического связывания не связывает в значительной степени молекулы, отличные от его партнера (партнеров) по специфическому связыванию.
Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который переносится рядом антигенов, в таком случае специфическое антитело, имеющее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию различных антигенов, несущих эпитоп. Соответственно, моноклональное антитело по изобретению специфически связывает эпитоп бета цепи Т клеточного рецептора человека, относящегося к семейству TRBV9, в то время как оно специфически не связывает бета-цепи ТКР других семейств и альфа цепи ТКР.
Термин «эпитоп» относится к той части молекулы, которая способна распознаваться и связываться с антителом в одном или более антигенсвязывающих участках антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими зарядовыми характеристиками.
Термин «эпитоп», как используется в данной заявке, кроме того, относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например, мыши, крысы или человека. Термин «антигенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, определенная любым способом, хорошо известным из уровня техники, например, при помощи традиционного иммунного анализа. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут также быть имуногенными. «Иммуногенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, который вызывает отклик антитела у животного, как устанавливается любым способом, известным из уровня техники. «Нелинейный эпитоп» или «конформационный эпитоп» содержат несмежные полипептиды (или аминокислоты) в пределах антигенного протеина, с которым антитело, специфическое к эпитопу, связывается.
Выражения «биологическое свойство» или «биологическая характеристика» или термины «активность» или «биоактивность по отношению к антителу и его функциональным фрагментам по изобретению используются в данной заявке как взаимозаменяемые и включают, но не ограничиваются приведенными, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность, способность ингибировать или быть антагонистом активности ТКР, в состав которого входит бета цепь, принадлежащая к семейству TRBV9.
Остальные идентифицируемые из уровня техники биологические свойства или характеристики антитела включают, например, перекрестную реактивность (т.е. с нечеловеческими гомологами пептида-мишени или с остальными протеинами или мишенями, в общем), и способность сохранять высокие уровни экспрессии протеина в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться, измеряться или оцениваться с использованием методик, признанных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь, приведенными, анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, BIACORE или анализ поверхностного плазмонного резонанса KINEXA, анализы ингибирования in vitro или in vivo без ограничений, рецепторного связывания, продуцирования и/или секреции цитокина или фактора роста, сигнальную трансдукцию и иммуногистохимию срезов тканей, полученных из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник.
Термины «ингибировать» или «нейтрализовать», как используется в данной заявке, по отношению к активности антитела по изобретению, означают способность в значительной степени противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, уничтожать, прекращать, уменьшать, например, развитие или тяжесть того, что ингибируют, включая, но, не ограничиваясь вышеприведенными, биологическую активность антитела или свойство, заболевание или состояние.
Как здесь используется, термин «мутант» или «вариант» относятся к антителу, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей антител настоящего изобретения или их фрагментов. Как здесь используется, термин «мутант» также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин «мутант» относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
Термин «гомология» используется для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.
Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности «по существу сходны» или «по существу такие же» как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют, по крайней мере, 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере 90% идентичности, или по крайней мере 91% идентичности, или по крайней мере 92% идентичности, или по крайней мере 93% идентичности, или по крайней мере 94% идентичности, ли по крайней мере 95% идентичности, или по крайней мере 96% идентичности, или по крайней мере 97% идентичности, или по крайней мере 98% идентичности, или по крайней мере 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, так же по существу сходны.
Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как IgBLAST, описанный в Ye et al. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40. Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ IgBLAST, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами. Для вычисления процента идентичности используется полная длина референсной последовательности, например, вариабельного региона.
Ссылка на нуклеотидную последовательность «кодирующую» полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин так же включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидная последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.
Антитела
Как указано выше, настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным гуманизированным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.
Антитела согласно изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими антителами, или их антигенсвязывающими фрагментами и могут использоваться в качестве лекарственного средства для лечения АС и других заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, целиакии или Т-клеточной лимфомы.
Антитело согласно изобретению является моноклональным. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, гибридомных методик, хорошо известных из уровня техники, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных из уровня техники. Термин «моноклональное антитело», используемый в данной заявке, относится к антителу, полученному из единой копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу его получения.
Гуманизированные и химерные антитела могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК как описано ниже в разделе «Нуклеиновые кислоты».
В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения являются химерными и характеризуются тем, что имеют вариабельные домены легкой и тяжелой цепей нечеловеческого происхождения (например, крысиного или мышиного), а константные домены, характерные для человека.
Антитело настоящего изобретения содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с тремя гипервариабельными участками
1) HCDR1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
2) HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2
3) HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 3;
2) вариабельный домен легкой цепи (VL) с тремя гипервариабельными участками LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,
LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,
LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Здесь и далее при определении CDR антител используется известная номенклатура Kabat, если отдельно не оговорено иное.
Во всех воплощениях вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антитела настоящего изобретения гуманизированы и отличаются от вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей родительского антитела гуманизирующими аминокислотными заменами, при этом вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.
В преимущественных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID No: 16, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 8, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.
В преимущественных воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит аминокислотные замены и имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO 18, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 10, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.
В некоторых воплощениях моноклональные тела по изобретению являются полноразмерными антителами IgG человека, например, IgG1 или IgG2 или IgG3 или IgG4.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает легкую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.
В некоторых воплощениях антитело имеет легкую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 22, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 20.
Из уровня техники известно, что в последовательности антител, включая вариабельные домены, могут быть внесены мутации, которые не затрагивают по существу способность антитела связываться с антигеном.
Антитела согласно настоящему изобретению могут также содержать дополнительные мутации, которые не приводят к потере способности антитела связывать бета цепь ТКР семейства TRBV9, но могут приводить к снижению антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или увеличению аффинности или других биологических свойств антител. В частности, из уровня техники хорошо известно, что в последовательности антител могут быть внесены консервативные замены аминокислот. Под «консервативной заменой» в контексте заявки подразумевается замена, при которой остаток аминокислоты замещается другим остатком аминокислоты, имеющим близкую боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих близкие боковые цепи, определены в уровне техники, в том числе основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Предпочтительно в участки CDR3 в доменах VL и/или VH делают не более пяти консервативных замен аминокислот, чаще не более трех консервативных замен. Как правило, консервативные замены не делают в положениях аминокислот, критических для связывания эпитопа бета цепи семейства TRBV9.
Описанные выше варианты (мутанты) антител согласно изобретению могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК как описано ниже в разделе «Нуклеиновые кислоты».
В предпочтительных воплощениях антитело содержит константный участок тяжелой цепи, такой как константный участок IgG1, IgG2, IgGS, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD человека. Предпочтительно константным участком тяжелой цепи является константный участок тяжелой цепи IgG1 человека. Более того, антитело может содержать как константный участок легкой цепи либо каппа-константный участок легкой цепи, либо лямбда-константный участок легкой цепи. Предпочтительно антитело содержит каппа-константный участок легкой цепи.
В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 84%. В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент легкой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 85%.
Так же обеспечиваются антигенсвязывающие фрагменты антител настоящего изобретения.
Термин «антиген-связывающий фрагмент» антитела (или «функциональный фрагмент антитела» или «активный фрагмент антитела»), используемый здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген. Показано, что антиген-связывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины.
Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином «антиген-связывающий фрагмент» антитела включают (а) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1; (б) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в районе петли; (в) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; (г) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (д) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH, и (е) выделенный участок (CDR), определяющий комплементарность. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть рекомбинантными способами связаны с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как Fv одной цепи (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие антитела из одной цепи также охватываются термином «антиген-связывающий фрагмент» антитела. К ним относятся также другие формы антител из одной цепи, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта (см., например, Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994) Structure 2:1121-1123).
Фрагменты антител, такие как Fab F(ab')2, могут быть получены из целых антител с использованием принятых способов, таких как разложение папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Более того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов с применением рекомбинантной ДНК.
Антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной связью антитела или фрагмента антитела с одним или более белком или пептидом. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование участка ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и уменьшенных биомолекул scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1994) Mol. Immunol., 31:1047-1058). Другие химические связывания фрагментов антител также хорошо известны из уровня техники.
Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению находятся в изолированной форме, то есть это означает, что данный белок по существу свободен от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагмента и т.п., где термин «по существу свободен» в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу.
В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин «по существу очищенная форма» обозначает чистоту, равную, по меньшей мере, 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.
Способы очистки антитела, полученного путем рекомбинантной или гибридомной хорошо известны из уровня техники, например, очистка может быть осуществлена путем хроматографии (например, ионообменной, аффинной, особенно аффинной для специфичных антигенов - белка А или белка G, и колоночной хроматографией размеров), центрифугирования, дифференциальной растворимости, или любой другой стандартной методикой для очистки белков. Кроме того, антитела по технологии в соответствии с настоящим изобретением или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями (например, гистидиновой меткой) для облегчения очистки.
Аффинность антитела можно определять с применением стандартного анализа через определение константы диссоциации (KD). KD вычисляется через уравнение KD=kdis/kon, где kdis - экспериментально вычисляемая константа скорости диссоциации и kon - экспериментально вычисляемая константа скорости ассоциации комплекса антитело-антиген.
Предпочтительными антителами являются те, которые связывают антиген человека со значением KD не более чем приблизительно 1×10-7 М; предпочтительно не более чем приблизительно 1×10-8 М; чаще не более чем приблизительно 1×10-9 М; более предпочтительно не более чем приблизительно 1×10-10 М, и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1×10-11 М, например, не более чем приблизительно 1×10-12 М.
Антитела и их фрагменты, которые можно использовать в настоящих композициях и способах, являются биологически активными антителами и фрагментами, то есть способны связывать желаемые антигенные эпитопы и проявлять биологический эффект непосредственно или опосредованно.
Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению способны специфически связывать эпитоп (участок) бета цепи семейства TRBV9. В преимущественных воплощениях в результате их специфического связывания с бета цепью семейства TRBV9 происходит ингибирование активности ТКР, включающих указанную бета цепь. Как правило, ингибирование составляет предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 20, или 30, или 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90, или 95% или выше.
В некоторых вариантах осуществления антитело против бета цепи семейства TRBV9 согласно изобретению или его фрагмент может элиминировать Т-лимфоциты, несущие ТКР, содержащий бета-цепь семейства TRBV9. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент согласно изобретению может обеспечивать, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50%, по меньшей мере, приблизительно 60%, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95% или приблизительно 100% элиминацию Т-лимфоцитов.
В преимущественном варианте изобретения антитело представляет собой антитело МА-043.
Антитело МА-043, включает вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 16 и 18.
Антитело МА-043, включает тяжелую и легкую цепи, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20 и 22, соответственно.
Нуклеиновые кислоты
Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела настоящего изобретения, их функциональные фрагменты и вариабельные домены, которые могут быть использованы для получения химерных антител, включающих вариабельные домены по изобретению, оперативно слитые с известными константными доменами антител человека.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где
HCDR1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 1;
HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 2;
HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 3.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 4;
LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 5;
LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No 6.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, которые содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гомологи и мутанты указанных цепей антител, их функциональных фрагментов и доменов также находятся в рамках настоящего изобретения.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No: 16.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой имеет аминокислотную последовательность SEQ ID No: 18.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.
Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих легкие и тяжелые цепи по изобретению показаны в SEQ ID No: 19 и 21.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антитела так же представляют интерес. Нуклеиновые кислоты, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, могут быть использованы для оперативного слияния с нуклеиновыми кислотами, кодирующие соответствующие константные домены антител.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен тяжелой цепи антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 16.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен легкой цепи антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 18.
Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, показаны в SEQ ID No: 15 и 17.
Как здесь используется, «молекула нуклеиновой кислоты» или «нуклеиновая кислота» - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. В некоторых воплощениях, молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или кДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии в гетерологической системе экспрессии.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения получена методами генной инженерии. Способы получения нуклеиновых кислот хорошо известны из области техники.
Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза.
В случае информации о последовательности аминокислот, может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.
Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы следующим образом: могут быть синтезированы несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть также клонированы из биологических источников.
Настоящее изобретение так же охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны, или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды настоящего изобретения.
Нуклеиновые кислоты изобретения находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которой они находятся в естественных условиях.
Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей таких, как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы «мутантами» или «производными» исходной последовательности.
Мутантные или производные нуклеиновые кислоты или варианты нуклеиновых кислот могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генная реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственное перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.
Также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.
Вышеуказанные модификации не изменяют по существу свойства антител и их функциональных фрагментов, но могут облегчать белковый фолдинг в клетке-хозяине, снижать способность к агрегации или модулировать другие биохимические свойства белков, например, полупериод распада. В некоторых воплощениях, эти модификации не изменяют биохимические свойства белка. В некоторых воплощениях, эти модификации приводят к уменьшению иммуногенности антител. Все виды модификаций и мутаций, указанные выше, осуществляются на уровне нуклеиновой кислоты.
Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются, по меньшей мере, приблизительно на 50% чистыми, обычно, по меньшей мере, приблизительно на 90% чистыми и обычно являются «рекомбинантными», то есть, фланкированы одним или более нуклеотидами, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые белки, включающие белок настоящего изобретения, или их фрагменты, которые ниже рассматриваются более детально. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные домены по изобретению могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими соответствующие константные домены легкой и тяжелой цепи антитела. Нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими лидерный (сигнальный) пептид, обеспечивающий транспорт продуктов экспрессии из клетки-хозяина. Лидерный пептид впоследствии отщепляется во время созревания полипептида.
Вектор
Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Термин «вектор» включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она оперативно связана. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, в то время как остальные векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицированы наряду с геномом-хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы имеют в данной заявке название «векторы рекомбинантной экспрессии» (или, упрощенно, «векторы экспрессии» или «экспрессионные векторы»), а иллюстративные векторы хорошо известны из уровня техники. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области.
Полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.
Вектор, как правило, имеет ориджин репликации, обеспечивающий его размножение в клетках-хозяевах в результате его введения в клетку как внехромосомного элемента. Вектор также может содержать регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине и получение целевого полипептида. В экспрессионном векторе, указанная нуклеиновая кислота является оперативно связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению нуклеиновая кислота также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки-хозяина во внеклеточное пространство.
Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных полипептидов (например, легкой и тяжелой цепей антитела по изобретению или вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела по изобретению) на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты.
Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии белковый продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжи, растения, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В кассете экспрессии целевая нуклеиновая кислота оперативно соединяется с регуляторными последовательностями, которые могут включать промоторы, энхансеры, терминирующие последовательности, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению нуклеиновая кислота также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки-хозяина во внеклеточное пространство. Способы получения кассет или систем экспрессии, способных экспрессировать желательный продукт, известны специалистам в данной области.
Клетка-хозяин
Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, не являющиеся эмбриональными клетками человека, такие как дрожжи, растения, позвоночные, например, СНО клетки (например, АТСС CRL-9096), NS0 клетки, SP2/0 клетки, HEK293 клетки, COS клетки (например, АТСС CRL-1650, CRL-1651) и HeLa (например, АТСС CCL-2).
Для получения антитела по изобретению клетка-хозяин ко-трансформируется экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, и экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела. В некоторых воплощениях используется один экспрессионный вектор, в который внедрены нуклеиновые кислоты, кодирующие и легкую, и тяжелую цепи антитела.
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионным вектором(ами), кодирующим тяжелую и легкую цепи, трансформируют (ко-трансформируют) в клетку-хозяина таким образом, что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и, предпочтительно, выделяются в среду, в которой культивируют клетки-хозяина, из этой среды могут быть выделены антитела. Различные трактовки термина «трансформация» предназначены для включения широкого ряда способов, обычно используемых при интродукции экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клетку-хозяина, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана и др., как описано Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989; Ausubel F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989).
Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты антитела, интродуцируют в клетки-хозяева, антитела образуются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, который достаточен для экспрессии антитела в клетке-хозяине, или (более предпочтительно) секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяина. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков. Условия культивирования различных клеток хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000.
Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.
Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).
Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотидных последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР, с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно, образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например, нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-пробами, иммобилизованными на твердый чип. Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью указывает на экспрессию гена в образце.
Терапевтическое применение антител по изобретению
В одном аспекте антитело или его активный фрагмент по данному изобретению применяется в лечении нарушений, которые связаны с активностью патологических Т-лимфоцитов, несущих на поверхности ТКР семейства TRBV9, например, с активностью аутоиммунных Т-лимфоцитов при АС, целиакии, Т-клеточных лимфомах.
Термин «пациент» в данной заявке относится к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь приведенными, мышей, обезьян, людей, млекопитающих сельскохозяйственных животных, млекопитающих спортивных животных и млекопитающих комнатных животных; предпочтительно термин относится к людям. В определенном из вариантов осуществления пациент дополнительно характеризуется заболеванием или расстройством, или состоянием, опосредованными наличием в его организме ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9. Из уровня техники известно, что ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, ассоциированы с АС и целиакией. Также ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, могут быть связаны с развитием ряда заболеваний крови, таких как Т клеточная лимфома, вызванная вирусом Эпштейн-Барр.
Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относящиеся антителу с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, ссылаются или включают:
1) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
2) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
3) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также
4) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.
Антитело по данному изобретению может назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии.
Кроме того, лечение антителом по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для аутоиммунного или онкологического заболевания, в патогенез которого вовлечены ТКР, содержащие бета-цепь TRBV9, например, АС, целиакия, Т-клеточная лимфома, Т-клеточный лейкоз.
Дозы и пути введения
Антитело по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата.
Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение антитела самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных иммуносупрессивных или противовоспалительных методов лечения.
Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации.
Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (b) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.
Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, также как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.
Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.
Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.
Предполагается, что подходящая доза антитела по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1-200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Антитело может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере, 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере, 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере, 5 мг/кг; и, например, вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости.
Фармацевтическая композиция
Антитело по изобретению может быть включено в фармацевтическую композицию, пригодную для введения пациенту. Антитела по изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или наполнителем в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному режиму введения, а фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или наполнители, такие как диспергирующие агенты, буфера, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизаторы и т.п.использованы должным образом. Указанные композиции разработаны в соответствии с традиционными методами, приведенными в, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, где описаны различные методы получения композиций, в общем известных специалистам.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела по данному изобретению.
Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку.
Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение рН, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату антитела проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п.буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг.В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например, полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8°С. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело по изобретению, может быть введена пациенту, имеющему патологии, как описано в данной заявке, с использованием стандартных методов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно содержит или является «терапевтически эффективным количеством» антитела по изобретению. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума, и способности антитела или части антитела вызывать желательную реакцию у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезный эффект антитела преобладает над токсическим или вредным эффектом. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желательного профилактического результата. Поскольку профилактическую дозу используют для индивидуумов до или на ранней стадии заболевания, то, типично, профилактически эффективное количество может быть меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой, по крайней мере, минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза активного агента, необходимую для обеспечения терапевтической пользы пациенту. С другой стороны, терапевтически эффективное количество антитела по изобретению представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно людей, снижает биологическую активность аутоиммунных клонов, например, через связывание ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, где присутствие этих клонов вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам, или снижение уровней ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, вызывает благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека.
Путь введения антитела по изобретению может быть пероральным, парентеральным, путем ингаляции или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин «парентеральный», как используется в данной заявке, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Преимущественным является введение путем внутривенной или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций непосредственно известны из уровня техники.
Фармацевтическая композиция, как указано в соответствующих руководствах, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в контейнере, который обеспечивается, включая, например, герметично закрытый флакон (ампула) или шприц. Поэтому фармацевтические композиции могут быть стерильно профильтрованными после получения состава либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Типичная композиция для внутривенной инфузий может иметь объем в 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу (например, 1-100 мг/мл или более) концентрации антитела. Доза может варьировать в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно из уровня техники в области медицины, дозировки для любого из пациентов зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, предназначенное для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводят одновременно. Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001-1000 мкг; однако, предвидятся дозы, находящиеся ниже или выше этого иллюстративного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Режим дозировок ежедневного парентерального введения может составлять от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно от 0,3 мкг/кг до 10 мг/кг и более предпочтительно от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, даже более предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день.
Процесс лечения можно контролировать путем периодической оценки состояния пациента. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния пациента лечение повторяют до достижения желаемого ответа или подавления симптомов болезни. Однако также могут применяться другие режимы дозировок, которые не описаны в данной заявке. Желаемая дозировка может быть введена путем одноболюсного введения, множественных болюсных введений или путем непрерывного инфузионного введения антитела в зависимости от образца фармакокинетического распада, которого хочет достигнуть практикующий специалист.
Эти предположительные количества антитела в сильной степени зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима является желаемый результат. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место введения антитела, конкретный вид антитела, способ введения, режим введения и остальные факторы, известные практикующим специалистам-медикам.
Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены либо лиофилизированы и восстановлены перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизирование и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антитела. Дозировки могут быть скорректированы для компенсации этой потери. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 6 до 8.
Изделие (продукты) и наборы
Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения аутоиммунных заболеваний и родственных состояний и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР, несущие бета-цепь семейства TRBV9. К таким заболеваниям относятся, например, АС, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома и другие.
Изделие представляет собой контейнер с этикеткой и листовкой-вкладышем, которые могут быть размещены в блистере и/или пачке. Приемлемыми контейнерами являются, например, флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или полимерные материалы. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело, предлагаемое в изобретении. На этикетке и листовке-вкладыше в упаковке указано, что лекарственное средство применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка и/или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту, в том числе информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения указать чего.
Кроме того, изделие может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например, растворители, разбавители, фильтры, иглы и шприцы, но не ограничиваясь ими.
Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей, например, для оценки способности уничтожать Т-клетки, несущие ТКР семейства TRBV9, для очистки или иммунопреципитации рецептора TRBV9 из клеток. Для выделения и очистки набор может содержать антитело связанное с гранулами (например, сефарозными гранулами). Набор содержит контейнер и этикетку и листовку-вкладыш в упаковке.
Диагностическое использование
Антитела по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo). Например, антитело может использоваться для обнаружения или измерения уровня Т-лимфоцитов, содержащих ТКР семейства TRBV9 в образцах, полученных от пациента, например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, жидкость кишечника, слюна или моча. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы, например, диагностические наборы, содержащие антитела, описанные в данном документе.
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Экспериментальная часть
Пример 1. In silico гуманизация последовательностей вариабельных доменов антитела
В качестве родительских (опорных) использовались последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела анти-TRBV9-2, аминокислотные последовательности которого показаны в SEQ ID Nos: 8 и 10.
Аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей сравнивали с пулом гермлайн-последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, гермлайн-последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулинов крысы, последовательностей зрелых антител человека и крысы, полученных как из открытых источников, так и из донорской библиотеки, предоставленной компанией Биокад (Россия). Для анализа использовался пакет программного обеспечения Ylab (Биокад, Россия). В ходе анализа в последовательностях вариабельных доменов анализируемых антител были установлены позиции и их сочетания, наиболее характерные для животных и не характерные для человека. В то же время были установлены сочетания аминокислот, наиболее часто представленные в антителах человека в данных позициях. На основании полученных данных был осуществлен дизайн искусственных последовательностей вариабельных доменов, содержащих замены, повышающие степень гуманизации антитела. Также была проведена кодон-оптимизация нуклеотидных последовательностей, кодирующих предложенные аминокислотные варианты, для осуществления экспрессии гуманизированного антитела в клеточной линии СНО.
Гуманизированные нуклеотидные последовательности HCVR и LCVR (SEQ ID Nos: 15 и 17) были синтезированы de novo и клонированы в вектора рЕЕ-НС, рЕЕ-CK, формат IgG1 (Xu et al. Front. Chem. Sci. Eng. 2015, 9(3): 376-380) по сайтам рестрикции SalI/NheI и SalI/BsiWI, соответственно. Последовательности нуклеиновых полученных легкой и тяжелой цепи проверяли путем секвенирования по методу Сенгера.
Для дальнейшей работы было отобрано антитело МА-043, аминокислотные и нуклеотидные последовательности легкой и тяжелой цепей которого показаны в SEQ ID Nos: 19-22. Антитело МА-043, включает вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 16 и 18.
Степень гуманизации вариабельного домена тяжелой цепи антитела МА-043 составила 84%, а степень гуманизации вариабельного домена легкой цепи - 85% (Таблица 1). Константный домен тяжелой цепи представлен форматом IgG1 аллотип Gm3.
Пример 2. Получение рекомбинантного антитела и определение его аффинности
Векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела МА-043, полученные как описано в Примере 1 нарабатывали в клетках E.coli и очищали при помощи набора реактивов для очистки плазмидной ДНК производства фирмы Qiagen (Германия) и использовали для трансфекции клеточной линии CHO-Fut8 с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ «МАХ», «Polysciences», США) согласно инструкции производителя. Полученные реакционные смеси инкубировали при 37°С на качалке. Через 9 дней после трансфекции культуральную жидкость отделяли от клеток фильтрацией через фильтр с размером пор 0,5/0,22 мкм. Культуральную жидкость после фильтрации использовали для выделения антител с помощью аффинной хроматографии на колонках PreDictor RoboColumn MabSelect SuRe объемом 0,2 мл (GE Healthcare, США), уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН 7,4). Затем колонку промывали 5 объемами ФСБ. Связанный с носителем белок элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер рН 3. Собирали основной пик, содержащий белок и доводили рН до нейтрального с помощью 1 М буфера Tris (рН 7,5). Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (рН 7,4) с помощью диализа, фильтровали через фильтр диаметром 0,22 мкм, переносили в новые стерильные пробирки. Качество выделения оценивали с помощью 12% ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях.
Количественную оценку проводили с помощью измерения на микроспектрофотометре NanoDrop2000 при 280А. Выделенный белок хранили при -70°С. Определение аффинности антитела проводили на приборе OctetRed 96 (ForteBio, США). Антиген в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхность AR2G сенсоров (ForteBio) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя. Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антител на 300 сек, где происходила ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течение 600 секунд. Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1 Global.
Полученные данные (Таблица 2) показали, что антитело специфически и с высокой аффинностью связывается с антигеном человека.
Пример 3. Получение клеточной линии, стабильно продуцирующей антитело в формате IgG1, и наработка антитела.
Последовательности тяжелой и легкой цепей антитела МА-043 были получены, как описано в Примере 1, и клонированы в векторы pSX по сайтам рестрикции HindIII, XbaI. Полученные плазмиды нарабатывали в клетках Е. coli и выделяли с помощью прибора BenchPro 2000 (Life Technology, США) согласно инструкции производителя в количестве 600-700 мкг. Плазмиды линеаризовали в течение ночи с помощью эндонуклеазы PvuI, затем осаждали этанолом, осадок растворяли в воде, концентрация в конечном объеме составляла 900-1100 нг/мкл. Клеточную линию CHO-K1-S культивировали в среде Ham's F12 Gibco (Thermo, США).
Трансфекцию генетическими конструкциями, содержащими кодирующие последовательности цепей МА-043 проводили с помощью электропорации на приборе Nucleofector™ (Lonza, Швейцария) согласно протоколу производителя. На следующий день после трансфекции в течение 24 дней проводили антибиотическую селекцию трансфецированных клеток, добавляя в среду пуромицин (конечная концентрация 7,2 мкг/мл) и гигромицин Б (конечная концентрация 640 мкг/мл). Далее были отобраны гомогенные по структуре устойчивые к антибиотикам клеточные клоны, экспрессирующие на высоком уровне МА-043.
Для культивирования CHO-K1-S, экспрессирующие МА-043 использовали бессывороточную среду Ham's F12 Gibco (Thermo, США) с добавлением 25-100 мкМ 2-дезокси-2-фтор-L-фукозы (CarboSynth, Великобритания).
Наработку моноклонального антитела МА-043 для доклинических исследований проводили в ферментере HyClone single-use bioreactor (Thermo Fisher Scientific) рабочим объемом 50 л. Удаление клеток продуцентов из культуральной жидкости проводили с помощью глубинного фильтра Millistak С0НС (Merck-Millipore, США). Первичную очистку антитела из осветленной культуральной жидкости проводили на аффинном сорбенте с белком А. Специфическую элюцию целевого белка проводили в кислых условиях рН 3.3-3.8 в глициновом буфере. Полученный элюат выдерживали в кислом рН в течение 30-60 минут для вирусной инактивации, а затем нейтрализовали 1М раствором Tris-HCl до значения рН 6.5-7.0. Для удаления возможных примесей (ДНК, белков клеток продуцента, отщепленного лиганда аффинного сорбента, агрегатов и фрагментов антител) финальную хроматографическую очистку в режиме проскока проводили на сорбенте CaptoAdhere (GE HealthCare LifeSciences, США) Для этого раствор белка пропускали через подготовленный сорбент, уравновешенный трис-буфером с рН 6,5-7,0 при низком значении кондуктивности (<3 мС/см2).
Очищенный белок подвергали противовирусной фильтрации с использованием набора фильтров Viresolve PRO (Millipore, США), концентрированию и диафильтрации против конечного буфера, содержащего ацетатный буфер (рН 5,0-5,5) и трегалозу.
Пример 4. Применение антитела для специфического связывания с фрагментом бета-цепи Т-клеточного рецептора семейства рецепторов TRBV9
Моноклональные антитела МА-043, полученные как описано в Примере 3, использовали для сортировки субпопуляций лифоцитов.
Антитела метили флуоресциином с помощью реагента флуоресциин изотиоцианат (Sigma, США) по протоколу производителя. Контроль количества флуорофоров, вступивших в реакцию с молекулами антитела, осуществляли по соотношению спектра поглощения при длинах волн 495/280 нм. Т-лимфоциты получали из периферической крови здорового донора. Кровь собирали в пробирки Vacuette с EDTA (по 2×9 мл), мононуклеарную фракцию согласно стандартной методике, описанной в (Ковальчук Л. В. и др. Иммунология: практикум - 2010. - 176 с). После выделения клетки переносили в фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 mM ЭДТА. Суммарное количество клеток и их жизнеспособность определяли по методу окрашивания с трипановым синим как описано Лангом Н.Р. (Стимуляция лимфоцитов М.: Медицина, 1976. - 288 с). К клеточной суспензии добавляли равный объем 0,1% раствора трипанового синего, далее проводили подсчет окрашенных (мертвых) и неокрашенных синих клеток в камере Горяева. На основании этих данных делался вывод о проценте мертвых клеток в исследуемом образце.
Для подтверждения селективности связывания МА-043 с целевой популяцией Т-лимфоцитов, несущих на своей мембране ТКР, относящийся к семейству TRBV9, аликвоты клеток по 500 тыс из мононуклеарной фракции, добавляли к буферу PBS, содержащему 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2 mM ЭДТА рН8, антитела МА-043, меченые FITC, CD3-eFluor405 (маркер Т-лимфоцитов) (eBioscience, США) и CD45-PC5 (eBioscience, США) (общий лейкоцитарный маркер) в концентрации 100 нг/мл. Реакционные смеси объемом 50 мкл инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после этого клетки промывали буфером PBS с 0.5% БСА 2 mM ЭДТА. Клетки после процедуры окрашивания использовали для сортировки с помощью проточной цитометрии (FACSARIA III, США). Использование этих маркеров при покраске позволило изолировать клетки целевой популяции, которые несли на своей поверхность TRBV9+, CD3+, CD45+, а также получить клетки из негативной популяции, то есть соответствующие иммунофенотипу «TRBV9-, CD3+, CD45+».
Полученные в двух повторностях клетки из популяций «TRBV9+» и «TRBV9-» использовали для выделения суммарной РНК и секвенирования последовательностей бета цепей ТКР. Полученные фракции клеток помещали в RLT-буфер (Quagen, Германия) и выделяли из них РНК с помощью набора реактивов Quiagen RNAeasy mini kit #217004 (Quagen) согласно протоколу производителя. На матрице выделенной РНК синтезировали кДНК и амплифицировали фрагменты бета цепи Т-рецептора по протоколу, описанному Britanova et al (J Immunol, 2016, 196 (12) 5005-5013) с использованием набора реактивов Mint cDNA synthesis kit (Евроген, Россия). К наработанным ампликонам лигировали адаптеры Illumina (США) и секвенировали на платформе MiSeq Illumina согласно протоколу производителя секвенатора. Данные секвенирования анализировали с помощью программ MiGEC, MiXCR и VDJtools, представленных на сайте в сети Интернет: https://milaboratory.com. Анализ полученных репертуаров бета цепей ТКР показал, что библиотеки, полученные в результате сортировки с помощью антитела МА-043, были обогащены на 91% последовательностями, которые кодировались генным сегментом TRBV9. Тогда как в репертуарах бета цепей негативной фракции «TRBV9-» последовательностей, содержащих TRBV9, обнаружено не было.
Пример 5. Функциональная активность антитела МА-043
Моноклональное антитело МА-043 получали как описано в Примере 3. Мононуклеарную фракцию крови человека получали как описано в Примере 4.
Дополнительно из части мононуклеарной фракции осуществляли выделение естественных киллеров с помощью набора реагентовдля выделения NK клеток человека # 130-092-657 (Miltenyi biotec, США). Использовали протокол производителей. Качество выделения NK клеток оценивали с помощью цитофлуометрии (BD FACS ARIA III, США) с использованием меченных антител CD 16- FITC, CD56-PE, CD3-VioBlue. Обогащение NK клетками составляло 85-95%.
Для оценки цитотоксичности к аликвоте мононуклеарной фракции, содержащей 1×106 клеток добавляли антитела МА-043 до конечной концентрации 500 нг/мл. В качестве негативного контроля использовали антитела ремикэйд в такой же концентрации, как и МА-043. К контрольной аликвоте клеток (положительный контроль) антитела не добавляли. Также во все реакционные смеси добавляли по 105 NK клеток. Конечный объем реакции составлял 100 мкл. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре один час, далее клетки отмывали несколько раз от антител и разносили по лункам 96-луночного кругл о донного планшета, на столе.
Через 6 дней клетки собирали из лунок и использовали для иммунофенотипического анализа с помощью проточной цитометрии. Для детекции Т лимфоцитов были использованы следующие антитела: anti-CD3-eFluor450 (клон OKT3, eBioscience); anti-CD8-PC7 (клон SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, США); МА-043, меченые Fitc. После окрашивания клетки отмывали и анализировали на приборе BD FACSARIA III. Т-лимфоциты CD3+ МА-043+ в образцах, подвергшихся инкубации с МА-043 антителами настоящего изобретения, не обнаруживаются.
В то же время в контрольном образце без добавления антитела ("ноль-контроль"), а также с добавлением терапевтических антител ремикейд детекция двойных позитивных Т-лимфоцитов по маркерам CD3+ МА-043+ сохраняется, что подтверждает специфическую элиминацию Т-клеток TRBV9+ при добавлении антител против TRBV9.
В дополнительном негативном контроле, где вместо МА-043 антител настоящего изобретения использовались нецитотоксические антитела против CD6, целевая популяция CD3+CD6+ не менялась по сравнению с "ноль-контролем". Это указывает, что экранирования эпитопа не меченными антителами на 6 день не происходит и подтверждает способность МА-043 антител элиминировать клетки, несущие ТКР семейства TRBV9.
Пример 6. Получение фармацевтической композиции, содержащей антитело согласно изобретению
Фармацевтическую композицию получали стандартными методами, которые известны из уровня техники.
Компоненты фармацевтической композиции показаны в Таблице 3.
Пример 7. Набор, содержащий фармацевтическую композицию с антителами
Для выпуска наборов с лекарственной формой, содержащей композицию с антителом МА-043, фармацевтическую композицию, полученную согласно примеру 6 запаивают в ампулы или шприцы объемом 1 мл в стерильных условиях, маркируют и упаковывают в контейнеры из пластикового или картонного материала.
Также в контейнер с ампулой вкладывают инструкцию по применению.
Claims (20)
1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV-9 Т-клеточного рецептора человека, включающее вариабельный домен тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 16, и вариабельный домен легкой цепи, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No: 18.
2. Моноклональное антитело по п. 1, которое включает тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID No: 20, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID No: 22.
3. Моноклональное антитело по любому из пп. 1, 2, которое представляет собой полноразмерное антитело IgG.
4. Нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.
5. Нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.
6. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 4.
7. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 5.
8. Способ получения клетки-хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3, включающий трансформирование клетки вектором по п. 6 и вектором по п. 7.
9. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 4 и нуклеиновую кислоту по п. 5.
10. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-3, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 9 в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
11. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека, содержащая в терапевтически эффективном количестве антитело по любому из пп. 1-3, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где указанные заболевание или нарушение выбирают из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
13. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, содержащая в терапевтически эффективном количестве антитело по любому из пп. 1-3 и, по меньшей мере, в терапевтически эффективном количестве другое терапевтически активное соединение.
14. Фармацевтическая композиция по п. 13, где указанные заболевание или нарушение выбирают из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
15. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 13, 14, где другое терапевтически активное соединение выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов.
16. Способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела по любому из пп. 1-3.
17. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, антитела по любому из пп. 1-3 или фармацевтической композиции по любому из пп. 11-15 в терапевтически эффективном количестве.
18. Способ лечения заболевания или нарушения по п. 17, где заболевание или нарушение выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
19. Применение антитела по любому из пп. 1-3 или фармацевтической композиции по любому из пп. 11-15 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9.
20. Применение антитела по п. 19, где заболевание выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Priority Applications (30)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018146031A RU2712251C1 (ru) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения |
ARP190103840A AR117734A1 (es) | 2018-12-25 | 2019-12-23 | ANTICUERPOS HUMANIZADOS CONTRA LA REGIÓN DE LA CADENA b DE LA 9NA FAMILIA TRBV9 DEL TCR HUMANO, Y SUS MÉTODOS DE USO |
PCT/RU2019/050258 WO2020091635A2 (ru) | 2018-12-25 | 2019-12-24 | Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения |
CN201980092905.7A CN113646333A (zh) | 2018-12-25 | 2019-12-24 | 针对人TRBV9的β链区域的单克隆抗体 |
CA3127767A CA3127767A1 (en) | 2018-12-25 | 2019-12-24 | Monoclonal antibodies that specifically bind to the beta region of the trbv-9 family of the human t-cell receptor, and methods for their use |
KR1020217023541A KR20210119404A (ko) | 2018-12-25 | 2019-12-24 | 인간 trbv9의 베타 쇄 영역에 대한 단일클론 항체 |
TW108147432A TW202039574A (zh) | 2018-12-25 | 2019-12-24 | 針對人類TCR TRBV9第9家族之β鏈區的人類化抗體及其使用方法 |
CA3124813A CA3124813A1 (en) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9 |
JOP/2021/0169A JOP20210169A1 (ar) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | أجسام مضادة أحادية النسيلة ضد منطقة سلسلة بيتا من trbv9 بشري |
EP20734640.4A EP3907239A4 (en) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE BETA CHAIN REGION OF HUMAN TRBV9 |
US17/417,686 US20220112286A1 (en) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9 |
CR20210354A CR20210354A (es) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Anticuerpos humanizados contra la región de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus métodos de uso |
KR1020217023568A KR20220131489A (ko) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | 인간 trbv9의 베타 쇄 영역에 대한 단일클론 항체 |
MX2021007719A MX2021007719A (es) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Anticuerpos humanizados contra la region de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus metodos de uso. |
JP2021537707A JP2022532274A (ja) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | ヒトtrbv9のベータ鎖領域に対するモノクローナル抗体 |
EA202191813A EA202191813A1 (ru) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Моноклональные антитела против участка бета-цепи trbv9 человека |
SG11202106975VA SG11202106975VA (en) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9 |
MA53689A MA53689B1 (fr) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Anticorps humanisés contre un fragment bêta d'une chaîne de la famille 9 du récepteur cellulaire trbv-9 de l'humain et méthodes de leur application |
CN202080016346.4A CN114144432A (zh) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | 针对人TRBV9的β链区域的单克隆抗体 |
BR112021012555-8A BR112021012555A2 (pt) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Anticorpos monoclonais contra a região de cadeia beta do trbv9 humano |
AU2020204492A AU2020204492A1 (en) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9 |
PE2021001081A PE20220217A1 (es) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Anticuerpos humanizados contra la region de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus metodos de uso |
PCT/RU2020/050024 WO2020139175A2 (ru) | 2018-12-25 | 2020-02-20 | Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения |
CONC2021/0008218A CO2021008218A2 (es) | 2018-12-25 | 2021-06-23 | Anticuerpos humanizados contra la región de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus métodos de uso |
IL284370A IL284370A (en) | 2018-12-25 | 2021-06-24 | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9 |
ECSENADI202146333A ECSP21046333A (es) | 2018-12-25 | 2021-06-24 | Anticuerpos humanizados contra la región de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano y sus métodos de uso |
CL2021001705A CL2021001705A1 (es) | 2018-12-25 | 2021-06-24 | Anticuerpos humanizados contra la región de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus métodos de uso. |
ZA2021/04357A ZA202104357B (en) | 2018-12-25 | 2021-06-24 | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9 |
PH12021551532A PH12021551532A1 (en) | 2018-12-25 | 2021-06-25 | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9 |
CONC2021/0009689A CO2021009689A2 (es) | 2018-12-25 | 2021-07-23 | Anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a la región beta de la familia trbv-9 del receptor de células t humano, y los métodos para su uso. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018146031A RU2712251C1 (ru) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2712251C1 true RU2712251C1 (ru) | 2020-01-27 |
Family
ID=69184123
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018146031A RU2712251C1 (ru) | 2018-12-25 | 2018-12-25 | Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения |
Country Status (25)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220112286A1 (ru) |
EP (1) | EP3907239A4 (ru) |
JP (1) | JP2022532274A (ru) |
KR (2) | KR20210119404A (ru) |
CN (2) | CN113646333A (ru) |
AR (1) | AR117734A1 (ru) |
AU (1) | AU2020204492A1 (ru) |
BR (1) | BR112021012555A2 (ru) |
CA (2) | CA3127767A1 (ru) |
CL (1) | CL2021001705A1 (ru) |
CO (2) | CO2021008218A2 (ru) |
CR (1) | CR20210354A (ru) |
EA (1) | EA202191813A1 (ru) |
EC (1) | ECSP21046333A (ru) |
IL (1) | IL284370A (ru) |
JO (1) | JOP20210169A1 (ru) |
MA (1) | MA53689B1 (ru) |
MX (1) | MX2021007719A (ru) |
PE (1) | PE20220217A1 (ru) |
PH (1) | PH12021551532A1 (ru) |
RU (1) | RU2712251C1 (ru) |
SG (1) | SG11202106975VA (ru) |
TW (1) | TW202039574A (ru) |
WO (2) | WO2020091635A2 (ru) |
ZA (1) | ZA202104357B (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023146437A1 (en) * | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Joint Stock Company «Biocad» | Pharmaceutical composition of anti-trbv9 antibody and use thereof |
RU2826886C1 (ru) * | 2022-01-31 | 2024-09-17 | Акционерное общество "БИОКАД" | Фармацевтическая композиция анти-trbv9 антитела и ее применение |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7554742B2 (ja) | 2018-07-03 | 2024-09-20 | マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド | 抗tcr抗体分子およびその使用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2539032C2 (ru) * | 2009-06-25 | 2015-01-10 | Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер | Способ измерения искусственного иммунитета |
WO2017137453A1 (en) * | 2016-02-08 | 2017-08-17 | Polybiocept Ab | T-cell receptor sequences for active immunotherapy |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223426A (en) * | 1988-12-15 | 1993-06-29 | T Cell Sciences, Inc. | Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t-cell antigen receptor |
US5766947A (en) | 1988-12-14 | 1998-06-16 | Astra Ab | Monoclonal antibodies reactive with an epitope of a Vβ3.1 variable region of a T cell receptor |
RU2694412C9 (ru) * | 2017-12-25 | 2019-09-18 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Моноклональные антитела и способы их применения |
-
2018
- 2018-12-25 RU RU2018146031A patent/RU2712251C1/ru active
-
2019
- 2019-12-23 AR ARP190103840A patent/AR117734A1/es unknown
- 2019-12-24 KR KR1020217023541A patent/KR20210119404A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-12-24 TW TW108147432A patent/TW202039574A/zh unknown
- 2019-12-24 CN CN201980092905.7A patent/CN113646333A/zh active Pending
- 2019-12-24 CA CA3127767A patent/CA3127767A1/en active Pending
- 2019-12-24 WO PCT/RU2019/050258 patent/WO2020091635A2/ru active Application Filing
-
2020
- 2020-02-20 US US17/417,686 patent/US20220112286A1/en active Pending
- 2020-02-20 CR CR20210354A patent/CR20210354A/es unknown
- 2020-02-20 BR BR112021012555-8A patent/BR112021012555A2/pt unknown
- 2020-02-20 MX MX2021007719A patent/MX2021007719A/es unknown
- 2020-02-20 WO PCT/RU2020/050024 patent/WO2020139175A2/ru unknown
- 2020-02-20 CA CA3124813A patent/CA3124813A1/en active Pending
- 2020-02-20 AU AU2020204492A patent/AU2020204492A1/en active Pending
- 2020-02-20 KR KR1020217023568A patent/KR20220131489A/ko active Search and Examination
- 2020-02-20 JP JP2021537707A patent/JP2022532274A/ja active Pending
- 2020-02-20 SG SG11202106975VA patent/SG11202106975VA/en unknown
- 2020-02-20 EP EP20734640.4A patent/EP3907239A4/en active Pending
- 2020-02-20 EA EA202191813A patent/EA202191813A1/ru unknown
- 2020-02-20 CN CN202080016346.4A patent/CN114144432A/zh active Pending
- 2020-02-20 MA MA53689A patent/MA53689B1/fr unknown
- 2020-02-20 JO JOP/2021/0169A patent/JOP20210169A1/ar unknown
- 2020-02-20 PE PE2021001081A patent/PE20220217A1/es unknown
-
2021
- 2021-06-23 CO CONC2021/0008218A patent/CO2021008218A2/es unknown
- 2021-06-24 EC ECSENADI202146333A patent/ECSP21046333A/es unknown
- 2021-06-24 IL IL284370A patent/IL284370A/en unknown
- 2021-06-24 ZA ZA2021/04357A patent/ZA202104357B/en unknown
- 2021-06-24 CL CL2021001705A patent/CL2021001705A1/es unknown
- 2021-06-25 PH PH12021551532A patent/PH12021551532A1/en unknown
- 2021-07-23 CO CONC2021/0009689A patent/CO2021009689A2/es unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2539032C2 (ru) * | 2009-06-25 | 2015-01-10 | Фред Хатчинсон Кансэр Рисёч Сентер | Способ измерения искусственного иммунитета |
WO2017137453A1 (en) * | 2016-02-08 | 2017-08-17 | Polybiocept Ab | T-cell receptor sequences for active immunotherapy |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TOYABE S et. al. "Biclonal expansion of T cells infected with monoclonal Epstein-Barr virus (EBV) in a patient with chronic, active EBV infection", Clinical & Experimental Immunology, Vol. 135, Is. 1, October 2003, pp. 92-97, 08.09.2003. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023146437A1 (en) * | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Joint Stock Company «Biocad» | Pharmaceutical composition of anti-trbv9 antibody and use thereof |
RU2826886C1 (ru) * | 2022-01-31 | 2024-09-17 | Акционерное общество "БИОКАД" | Фармацевтическая композиция анти-trbv9 антитела и ее применение |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230357396A1 (en) | Monoclonal antibodies and methods for using same | |
CN113474362B (zh) | 对cd44特异性的抗体 | |
JP7507160B2 (ja) | ヒトtrbv9に特異的に結合するモノクローナル抗体 | |
RU2712251C1 (ru) | Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения | |
EA042982B1 (ru) | Моноклональные антитела против участка бета-цепи trbv9 человека | |
OA20246A (en) | Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9. | |
OA20245A (en) | Monoclonal antibodies that bind specifically to human TRBV9. | |
EA041932B1 (ru) | Моноклональные антитела, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства trbv-9 т-клеточного рецептора человека, и способы их применения | |
EA041880B1 (ru) | Моноклональные антитела и способы их применения |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20210409 |