JP2022532274A - ヒトｔｒｂｖ９のベータ鎖領域に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーに特異的に結合するモノクローナルヒト化抗体またはその抗原結合断片に関する。本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、発現ベクター、前記抗体を調製するための方法、およびヒトＴ細胞受容体ファミリーに関連付けられる疾患または障害の処置における前記抗体の使用にも関する。本発明は、病態形成がＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを伴う、特にＡＳ、セリアック病および悪性血液疾患を処置するために使用され得る抗体の生成を対象とする。

Description

本発明はバイオテクノロジーおよび生物医学の分野に、特に、抗体またはそれらの抗原結合断片に、ならびにそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、ヒトＴ細胞受容体ファミリーに特異的に結合するモノクローナルヒト化抗体に関する。本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、発現ベクター、前記抗体を調製するための方法、およびヒトＴ細胞受容体ファミリーに関連付けられる疾患または障害の処置における前記抗体の使用にも関する。

自己免疫疾患は自己反応性Ｔリンパ球によって引き起こされる（Ｈａｒｏｏｎ Ｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０１３年１０月；６５（１０）：２６４５～５４．、Ｄｕａｒｔｅ Ｊ．ら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ２０１０年５月１０日；５（５）：ｅ１０５５８；Ｋｏｎｉｇ Ｍ．ら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１６年１月２５日；７：１１）。先行技術は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列が、自己免疫疾患の病態形成に関与するＴリンパ球クローンを特定するのを可能にするマーカーであることを開示する。構造的に、Ｔ細胞受容体のサブユニットは免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバであり、いくつかの遺伝子セグメントから形成される。ＴＣＲ可変領域はＴＣＲ抗原結合部位を形成する。このことは、ＴＣＲ可変領域はクローン特異的であること、すなわち、個別の抗原に応答するＴリンパ球で異なることを意味する。

ＴＣＲ可変ドメイン内の可変（Ｖ）遺伝子セグメントのアミノ酸相同性の観点から、Ｔ細胞受容体は、様々なファミリーに分けられる。ＩＭＧＴ命名法にしたがって、ベータ鎖は２６の個別のファミリーに区別され、アルファ鎖は４１のファミリーに区別される（Ｔｕｒｎｅｒ ＳＪら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００６、Ｖ．６、８８３～８９４）。ＴＣＲ鎖ファミリーを決定するために、試験アミノ酸配列、および既知のＴＣＲ鎖配列の多重整列を使用するが、これに関する情報は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇにてインターネット上で入手可能なＩＭＧＴデータベース（「Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ－Ｐ．、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００１；２９：２０７～２０９）にまとめられてある。ＩｇＢｌａｓｔソフトウェアパッケージを使用して、ＴＣＲ鎖ファミリーの多重整列と決定が行われ得る。

ＷＯ９００６７５８が開示するところは、関節リウマチの診断および治療のための手段として提案された、ＴＲＢＶ５－３およびＴＲＢＶ８－１のファミリーに属する、ヒトＴ細胞受容体可変ドメインのβ鎖領域に対する、モノクローナル抗体Ｗ１１２および２Ｄ１である。前記モノクローナル抗体は、それぞれ、ＴＲＢＶ５－３を有する０．３～５％の間の末梢Ｔリンパ球、およびＴＲＢＶ８－１を有する０．５～１３％の間の末梢Ｔリンパ球を認める。関節リウマチの病態形成におけるＴリンパ球の関与を実証する多くの研究の結果は、Ｔ受容体のベータ鎖領域に特異的なモノクローナル抗体の使用をもたらした。具体的には、Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８年９月；７３（３）：４１７～４２３が、関節リウマチを罹患する患者の骨液試料において、健常者の骨液試料と比較して、ＴＲＢＶ５およびＴＲＢＶ８を有するＴリンパ球の高いパーセンテージを実証した。ＷＯ９４０５８０１は、ヒトＴ細胞受容体のＶＢ３．１可変領域のエピトープと相互作用する、関節リウマチの診断および治療のためのモノクローナル抗体を開示しており、これは、ＴＣＲ Ｖ（ベータ）３．１サブファミリーと相互作用する。

ラットＴＲＣの第１３ファミリーベータ鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体も記載されてきた。動物モデルが実証したところは、それら抗体の助けを借りて、Ｔ受容体がＶＢ１３ベータ鎖を含む（ＶＢ１３＋ Ｔ細胞）Ｔ細胞の小集団を予防的に除去することが可能であることであり、そして、こうした処置は、糖尿病易発性の系統のラットにおいて、Ｉ型糖尿病の発症を予防するとともに、また、ウイルス誘導性糖尿病の発症のリスクも著明に低減すること、が示されてきた（Ｚｈｉｊｕｎ Ｌｉｕら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１２年５月；６１（５）：１１６０～１１６８．）。同時に、Ｔ受容体が個別のベータ鎖ファミリー（ＶＢ１６）を含むＴ細胞の除去の結果は、対照群の結果とは異ならない。ＶＢ１３に対するモノクローナル抗体の最初の投与でさえ、ラット脾臓において、ＶＢ１３＋ Ｔ細胞数の６０％低下をもたらすことに留意されたい。

強直性脊椎炎（ＡＳまたはベクテレフ病）の患者における自己免疫ＴＣＲのコンセンサスバリアントが記載されており、これは、ＴＣＲのＨＬＡ^＊Ｂ２７対立遺伝子の状態に関わらず、ＡＳの患者において滑液および末梢血中に存在し、そして健常ドナーにおいては同じ分析深度にて非存在であることが示されてきた（Ｆａｈａｍ Ｍら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１７；６９（４）：７７４～７８４；Ｋｏｍｅｃｈ Еら １２ｔｈ ＥＪＩ－ＥＦＩＳ Ｔａｔｒａ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ；２０１６年９月３～７日；Ｓｔｒｂｓｋｅ Ｐｌｅｓｏ、Ｓｌｏｖａｋｉａ．要旨集３９ページ）。前記ＴＣＲは、ＴＲＢＶ９ファミリーのメンバである（ＩＭＧＴの命名法による）。ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を有するＴ細胞受容体は、セリアック病としてかかる自己免疫疾患の発症にも関与することが示されてきた（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｊら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（１２）：６１１２～２２）。それらはまた、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）によって引き起こされるＴ細胞リンパ腫を含めて、Ｔ細胞リンパ腫およびＴ細胞白血病において、悪性化にせまりやすいＴ細胞の表面でも見られる（Ｔｏｙａｂｅ Ｓら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１３４（１）：９２～９７）。

出願第ＲＵ２０１７１４５６６２号は最近、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合することができるキメラモノクローナル抗体について記載しており、このモノクローナル抗体は、病態形成がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲを伴う自己免疫疾患および腫瘍性疾患、例えば、ＡＳ、セリアック病およびある種のＴ細胞リンパ腫およびＴ細胞白血病の治療に使用され得る。

前記抗体は、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを有するＴ細胞を排除するのに使用され得る唯一の現在知られる抗体である。前記抗体の主たる欠点は、比較的低い程度のヒト化である、すなわち、前記抗体は、ヒト様の定常領域および構造成分を含むが、ラット様可変ドメインを有する。前記抗体の重鎖の可変断片に関してヒト化の程度は７２％であり、一方、軽鎖の可変断片に関してヒト化の程度は６９％である。

上記親モノクローナル抗体は、
１）それらの重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）であって、３つの超可変領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、
ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔナンバリングスキームによる）は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する、重鎖の可変ドメイン；
２）それらの軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）であって、３つの超可変領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、
ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を有する、軽鎖の可変ドメイン
を含む。

上記親モノクローナル抗体は、配列番号８および１０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインを含む。
上記親モノクローナル抗体は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号１４のアミノ酸配列を有する抗体重鎖を含む。

上記親抗体の重鎖の前記アミノ酸配列および軽鎖の前記アミノ酸配列をコードする各ヌクレオチド配列の例が、配列番号１３および１１に示される。
本発明は、モノクローナル抗体の生成を対象とし、この抗体は、病態形成がＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを伴う、特にＡＳ、セリアック病および悪性血液疾患の治療のために、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを有するＴ細胞を排除するのに使用され得、かつ、この抗体は高程度のヒト化によって特徴付けられる。同時に、ヒト化は抗体の親和性および／または溶解性の極めて重大な低下をもたらす場合が多い。したがって、ヒト化機能抗体を生成することは適切なタスクである。

本発明は、ヒト化モノクローナル抗体およびその抗原結合断片であって、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に高親和性で特異的に結合する能力を有する、ヒト化モノクローナル抗体およびその抗原結合断片に関する。本発明による抗体は、病態形成がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲを伴う自己免疫疾患および腫瘍性疾患、例えば、ＡＳ、セリアック病およびある種のＴ細胞リンパ腫およびＴ細胞白血病を処置するための医薬として使用され得る。

好ましい態様では、本発明の抗体は、
３つの超可変領域を持つ重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）であって、
１）ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔナンバリングスキームによる）は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、
２）ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、
３）ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有する、重鎖の可変ドメイン；
２）３つの超可変領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を持つ軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）であって、
ＬＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列を有する、軽鎖の可変ドメイン
を含む。

特段の記載がない限り、抗体のＣＤＲを決定するために以下では、よく知られるＫａｂａｔナンバリングスキームが使用される。
それによって、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのＦＲ断片にアミノ酸置換を含み、この置換は、親抗体と比較して、本発明の抗体のヒト化の程度を向上する。

好ましい態様では、本発明の抗体の重鎖の可変ドメインは、配列番号１６に示される配列を有し、ヒト化アミノ酸置換が存在することで、アミノ酸配列が配列番号８に示される、親抗体の重鎖の可変ドメインとは異なる。

いくつかの態様では、本発明の抗体の重鎖の可変ドメインは、抗体特異性を改変しないさらなるアミノ酸置換を含む。
好ましい態様では、本発明の抗体の軽鎖の可変ドメインは、配列番号１８に示される配列を有し、ヒト化アミノ酸置換が存在することで、アミノ酸配列が配列番号１０に示される、親抗体の重鎖の可変ドメインとは異なる。

いくつかの態様では、本発明の抗体の軽鎖の可変ドメインは、抗体特異性を改変しないさらなるアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様では、本発明のモノクローナル抗体は、完全長のヒトＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２またはＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。

いくつかの態様では、本発明の抗体は重鎖を含み、この重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一である。

いくつかの態様では、本発明の抗体は軽鎖を含み、この軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一である。

いくつかの態様では、抗体は、アミノ酸配列が配列番号２２に示される軽鎖と、アミノ酸配列が配列番号２０に示される重鎖とを有する。
また提供されるのは、本発明による抗体の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインをコードする核酸、本発明による抗体の重鎖および軽鎖ならびにそれらの機能的断片をコードする核酸、でもある。

また提供されるのは、本発明の核酸および選択された宿主細胞において当該核酸の発現に必要な調節エレメントを含む発現カセットおよび発現ベクターでもある。ベクターまたは発現カセットは、染色体外エレメントとして宿主細胞中に存在してもよく、前記発現カセットまたはベクターの細胞への導入（トランスフェクションによる）の結果として細胞ゲノムに統合されてもよい。

さらに、提供されるのは、本発明の核酸、ベクターまたは発現カセットを含む細胞および安定な細胞株、ならびにこれらの調製方法である。
また提供されるのは、上記抗体またはその抗原結合断片を生産するための方法でもあり、前記抗体の産生を確実にする条件下で、培養培地中で上記宿主細胞を培養するステップを含む。いくつかの態様では、方法は、生成する抗体のその後の単離および精製を含む。

また提供されるのは、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域によって媒介される疾患または障害を予防または処置するための医薬組成物でもあり、これは、上記抗体またはその抗原結合断片を、１つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて含む。

一態様では、医薬組成物は、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される疾患または障害を予防または処置することを意図するものである。

また提供されるのは、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を有するヒトＴ細胞受容体によって媒介される疾患または障害を予防または処置するための医薬組合せでもあり、これは、上記抗体またはその抗原結合断片およびその他の少なくとも１つの治療活性化合物を含む。

一態様では、医薬組合せは、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される疾患または障害を予防または処置することを意図するものである。

一態様では、医薬組合せまたは医薬組成物は、小分子、抗体、またはコルチコステロイドなどのステロイドホルモンから選択される他の治療活性化合物を含む。
また提供されるのは、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴ細胞受容体の生物学的活性を阻害することが必要な対象において、そのような活性を阻害するための方法でもあり、この方法は、上記抗体またはその抗原結合断片の有効量を対象に投与するステップを含む。

また提供されるのは、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を有するヒトＴ細胞受容体によって媒介される疾患または障害を処置するための方法でもあり、この方法は、治療有効量の上記抗体もしくはその抗原結合断片または前記医薬組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与するステップを含む。

疾患または障害を処置するための方法の態様の１つでは、疾患または障害は、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される。
また提供されるのは、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を有するヒトＴ細胞受容体によって媒介される疾患または障害の処置を必要とする対象において、そのような処置をするための、上記抗体もしくはその抗原結合断片または上記医薬組成物の使用でもある。

使用の態様の１つでは、疾患は、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される。
本発明の技術的成果とは、高度のヒト化を備える抗体を得ることにあり、この抗体は、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲに、高親和性で特異的に結合し、かつ、自己免疫および腫瘍性疾患であって、その病態形成がＴＣＲを伴い、このベータ鎖はＴＲＢＶ９ファミリーに属する、自己免疫および腫瘍性疾患を処置するのに使用され得る。

好ましい態様では、抗体重鎖可変断片は８４％のヒト化の程度によって特徴付けられる。好ましい態様では、抗体軽鎖可変断片は８５％のヒト化の程度によって特徴付けられる。

本発明は、アナログと比較して、ヒト化の程度が向上した、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合する能力を有する単離されたモノクローナル抗体およびそれらの機能的断片に関する。

また提供されるのは、本発明の抗体およびそれらの断片をコードする核酸、本発明の核酸を含む発現カセットおよび発現ベクター、ならびに選択された宿主細胞における核酸の発現に必要な調節エレメントでもある。

さらに、提供されるのは、本発明の核酸、ベクターまたは発現カセットを含む細胞および安定な細胞株である。
また提供されるのは、モノクローナル抗体またはその機能的断片を生産するための方法、有効量の本発明の抗体を、１つもしくは複数の医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて含む、医薬組成物および医薬組合せ、ならびに、本発明の抗体を使用したＡＳおよびその他の疾患の診断および治療のための方法でもある。

定義
本発明は、まずいくつかの用語の定義があることで、より容易に理解されるであろう。
本明細書で提供の材料および方法は、これらは変化してもよいので、特定の組成物および方法ステップに限定されないことが理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上が明らかに指示されていない限り、単数形は相当する複数形の参照を含むことに留意されたい。

ヒト「Ｔ細胞受容体」とは、「ＴＣＲ」、「Ｔ受容体」とも呼ばれるが、Ｔリンパ球表面上に見られるヘテロ二量体タンパク質複合体である。Ｔ受容体は、Ｔリンパ球上にのみ存在する。ＴＣＲの主な機能は、主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ）の分子に結合した、プロセシングを受けた抗原を特異的に認識することである。

ヒトＴＣＲは、２つのサブユニット、α鎖およびβ鎖、またはγ鎖およびδ鎖からなり、ジスルフィド結合を通して連結され、細胞膜上に結合される。ＴＣＲ鎖はそれぞれ、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン、連結ドメイン、およびＴリンパ球形質膜中に受容体を固定する膜貫通ドメインに連結された定常（Ｃ）ドメインを有する。アルファ鎖およびベータ鎖の定常ドメインの長さは、それぞれ、９１個および１２９個のアミノ酸残基である。アルファ鎖の連結ドメインおよび膜貫通ドメインの長さは３０個および１７個のアミノ酸残基（ＡＡＲ）であり、そしてベータ鎖の連結ドメインおよび膜貫通ドメインの長さは２１個および２２個のＡＡＲである。Ｔ受容体可変ドメインの長さは、１０４個から１２５個までのＡＡＲで変動する。

Ｔリンパ球のごく一部が、γ／δ型Ｔ受容体を有する。これらは、α／β受容体と類似して構成されるが、一次構造が異なるとともにいくつかの機能的特徴を有する。これらは、はるかにより低い可変性（限定されたクローン特異性）を呈するとともに、「非古典的」（非ＭＨＣ）抗原提示分子を含む複合体中の抗原またはさらには遊離抗原を認識する。

Ｔ受容体は、その相補性を決定する６つの領域（ＣＤＲ）：３つのアルファ鎖領域および３つのベータ鎖領域を介して、ＭＨＣ／抗原複合体と反応する。これらのＣＤＲは、超可変領域、Ｔ細胞受容体の可変ドメインのループ、ＶアルファおよびＶベータである。

「ＴＲＢＶ９」または「ＴＲＢＶ９ファミリー」という用語は、ＩＭＧＴ命名法にしたがって区別されるように、Ｔ細胞受容体のベータ鎖の第９ファミリーを指し、これは、その可変ドメインのアミノ酸配列が、ＣＤＲ１（アミノ酸配列はＳ－Ｇ－Ｄ－Ｌ－Ｓである）およびＣＤＲ２（アミノ酸配列はＹ－Ｙ－Ｎ－Ｇ－Ｅ－Ｅである）の独特なモチーフを含むことで特徴付けられる。「ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲ」という用語は、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴ細胞受容体を指す。

Ｔリンパ球またはＴＣＲと関連して「病理的」という用語は、かかるＴＣＲまたはＴＣＲ担持Ｔリンパ球が、疾患または病理に関連付けられるおよび／または疾患を引き起こすおよび／または疾患の発症の一因である、ことを意味する。

ＴＣＲと関連して「自己免疫」という用語は、かかるＴＣＲが自己免疫疾患の発症に関与することを意味する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって連結された４つのポリペプチド鎖（２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖）からなる免疫グロブリン分子を指すことを意図するものである。軽鎖は、カッパまたはラムダと分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンと分類される；これらは、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどの抗体アイソタイプを決定し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。各重鎖タイプは、特定の定常領域によって特徴付けられる。

各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬの領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分され得るが、これらの領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域によって取り囲まれる。ＶＨおよびＶＬそれぞれは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１，ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。

本出願では、３つの重鎖ＣＤＲは「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３」と呼ばれ、一方、３つの軽鎖ＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原と特異的に相互作用する残基の大部分を含有する。本発明による抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ内のＣＤＲアミノ残基は、特に明記しない限り、よく知られたＫａｂａｔナンバリングスキームに準じて番号付けおよび位置付けされる。本出願は、特に明記しない限り、アミノ酸に関する従来法の文字コードを含む。

「抗ＴＲＢＶ９抗体」、「ＴＲＢＶ９に対する抗体」、「ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に特異的に結合する抗体」および「ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に対する抗体」という用語は、本出願の文脈において交換可能であり、ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープに特異的に結合する抗体に関するものである。

加えて、本出願で使用される「モノクローナル抗体」とは、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲをコードするＤＮＡをリンカー配列に結合することによって得ることができる単鎖Ｆｖ断片とすることができる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９～３１５ページ、１９９４を参照されたい）。断片または部分が言及されるかを問わず、本出願で使用される「抗体」という用語は、かかる断片または部分ならびに一本鎖形態を含むことが企図される。タンパク質がその標的（例えば、エピトープまたは抗原）に特異的にまたは好ましくは結合するその能力を維持する限り、当該タンパク質は「抗体」という用語によってカバーされる。抗体は、グリコシル化されていてもされていなくてもよく、なおも本発明の範囲内にある。

本出願の目的上、「抗体」および「モノクローナル抗体」という用語は、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲに対するモノクローナル抗体を指す。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは、特に明記しない限り、げっ歯類、霊長類またはラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の抗体に、好ましくはマウス、サル、ラクダもしくはラマの抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト型抗体に、関するものである。

「モノクローナル抗体」の集団は、同種または実質的に同種の抗体集団を指す（すなわち、集団中の抗体の少なくとも約８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６％、より好ましくは少なくとも約９７または９８％、さらにはより好ましくは少なくとも９９％が、ＥＬＩＳＡにおいて同じ抗原／エピトープに対して競合するか、またはより好ましくは、抗体はそれらのアミノ酸配列の点で同一である）。抗体は、グリコシル化されていてもされていなくてもよく、それでもなおも本発明の範囲内にある。

モノクローナル抗体は、同一のアミノ酸配列を有する場合は同種であるとすることができるが、翻訳後修飾、例えばグリコシル化パターンにおいて異なる場合がある。
各対の軽／重鎖の可変領域は、抗体の抗原結合部位を形成する。本出願において使用される場合、「抗原結合部分」、または「抗原結合領域」、または「抗原結合ドメイン」または「抗原結合部位」とは、抗体分子の部分であって、抗原と相互作用するとともに抗原と関連して抗体特異性および親和性を与えるアミノ酸残基を含む、このような抗体分子の部分に、相互転換可能に関するものである。抗体のこの部分は、抗原結合残基の適当なコンホメーションを維持するのに必要な、「フレームワーク」アミノ酸残基を含む。

本明細書で使用される、「ヒト抗体」という用語は、可変ドメインおよび定常ドメインの配列がヒト配列に由来する抗体を指す。本発明によるヒト抗体は、例えばＣＤＲ中に、特にＣＤＲ３中に、ヒトにとっては通常のものでないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ非特異的（ｕｎｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発またはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含むことができる。

「ヒト化」という用語は、抗体に関して使用される場合、ヒト様の定常領域および構造成分の存在によって特徴付けられるが、他の起源の免疫グロブリンにとって、または修飾抗体の相当する断片にとって特有である相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、抗体を指すために使用される。

本出願で使用される、「親」抗体とは、バリアントを得るために使用される、アミノ酸配列によってコードされる抗体である。親抗体は、げっ歯類、ラマ、キメラ、ヒト化またはヒトの各抗体に由来することができる。

抗体と関連して「ヒト化の程度」という用語は、ヒト化抗体を生成するのに使用された、かつ、ヒトライブラリーから入手可能である元のヒトアクセプターフレームワーク領域と、ヒト化抗体のフレームワーク領域配列とのパーセント同一性を指すために使用される。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトライブラリーから得たフレームワーク領域に関連して、少なくとも８０％の同一性、典型的には少なくとも８２％、より頻繁には少なくとも８３％、例えば、少なくとも８４％、または少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％の同一性を有するフレームワーク領域を含む。

「ヒト化置換」という用語は、抗体またはその断片のヒト化の程度を向上するアミノ酸置換を指す。
本発明の抗体に関して「キメラ」という用語は、ヒト様定常領域によって特徴付けられるが、他の起源の可変領域を有する、抗体を指すために使用される。かかる抗体では、非ヒト起源の（例えば、ラット起源の）軽鎖の可変ドメインおよび／または重鎖の可変ドメインは、ヒト起源の相当する鎖の定常ドメインに作動可能に連結される。

「作動可能に連結される」等の用語は、抗体について記載するのに使用される場合、互いに物理的（他に明記しない限り、共有結合の）および機能的関係に置かれたポリペプチド配列を指す。最も好ましい態様では、キメラ分子のポリペプチド成分の機能は、単離ポリペプチド成分の機能的特性と比較して未変化である。

「作動可能に連結される」等の用語は、核酸について記載するのに使用される場合、核酸が連結されるポイントにリーディングフレームシフトおよびストップコドンが存在しないように核酸は共有結合で連結されることを、意味する。当業者であれば明白なように、「作動可能に連結される」成分（タンパク質、ポリペプチド、リンカー配列、タンパク質ドメイン等）を含むキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、前記成分をコードする断片からなり、完全長キメラタンパク質、例えば、本発明によるキメラ抗体が、ヌクレオチド配列の翻訳および転写過程で作り出されるように、前記断片は共有結合で連結される。

本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏで分子または細胞が存在する環境とは異なる環境に存在する分子または細胞を意味する。
好ましい態様では、本発明の抗体は、組換え体である、すなわち、組換えＤＮＡ技法を使用して得られる。

本明細書で使用される「組換え抗体」という用語には、組換え手段によって取得、発現、創製または単離されるあらゆる抗体、例えば、宿主細胞に導入された組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、１セットの既知の組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ Ｌ．Ｄ．ら（１９９２） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７～６２９５を参照されたい）、が含まれる。いくつかの態様では、組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物が使用される場合、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）に供され、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来および関連するが、一方、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然では存在し得ない、配列である。

本出願で使用される「特異的に結合する」という用語は、特異的結合対の一方のメンバがその特異的結合パートナー以外の分子に有意には結合しないという、状況を指す。
この用語はまた、例えば、本発明の抗体の抗原結合ドメインは、いくつかの抗原が有する特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能である；この場合、抗原結合ドメインを含む特異的抗体は、当該エピトープを有する種々の抗原に特異的に結合することができることになる。したがって、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＴ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープと特異的に結合するが、一方、その他のファミリーのＴＣＲベータ鎖およびＴＣＲアルファ鎖と特異的に結合しない。

「エピトープ」という用語は、抗体の抗原結合領域のうちの１つまたは複数にて抗体によって認識され、抗体によって結合されることができる分子のその部分を指す。エピトープは多くの場合、アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学活性表面グルーピングからなっており、特定の３次元構造特質ならびに特定の電荷特質を有する。

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、とりわけ、動物において、好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラットまたはヒトにおいて、抗原性および／または免疫原性活性を有する、ポリペプチド断片を指す。本出願で使用される「抗原性エピトープ」という用語は、抗体と特異的に結合することができ、先行技術からよく知られる任意の技法によって、例えば、標準的なイムノアッセイによって、検出され得るポリペプチド断片である。抗原エピトープは必ずしも免疫原性である必要はないが、免疫原性であってもよい。本明細書で使用される「免疫原性エピトープ」とは、先行技術から知られる任意の方法によって決定して、動物において抗体応答を惹起するポリペプチド断片として定義される。「非線形エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープ特異的抗体に結合する抗原タンパク質内の非隣接ポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。

本発明の抗体またはその機能的断片に関して「生物学的特性」もしくは「生物学的特質」という句、または「活性」もしくは「生物活性」という用語は本出願において相互転換可能に使用され、これらには、エピトープ／抗原の親和性および特異性、ＴＲＢＶ９ファミリーに属するベータ鎖を含むＴＣＲの活性を中和するまたはアンタゴナイズする能力が含まれるが、これらに限定されない。

抗体の他の識別可能な生物学的特性には、例えば、交差反応性（すなわち、標的ペプチドの非ヒト相同体との、または一般にはその他のタンパク質または組織との）、および哺乳動物細胞でのタンパク質の高レベルの発現を保存する能力が含まれる。前述の特性または特質は、当技術分野で認められる技法を使用して観察、測定、および／または評価され得るが、それには、ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥもしくはＫＩＮＥＸＡ表面プラズモン共鳴分析、限定されないｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ阻害アッセイ、受容体結合アッセイ、サイトカインもしくは増殖因子の産生アッセイおよび／または分泌アッセイ、およびシグナル伝達、およびヒト、霊長類または他の任意の供源を含めて種々の供源から得た組織切片の免疫組織化学が含まれるが、これらには限定されない。

本発明の抗体の活性に関連して本出願で使用される「阻害する」または「中和する」という用語は、上記のものに限定されないが、抗体の生物学的活性、または特性、疾患または状態を含めて、まさに阻害されるところのものの例えば進行または重症度を、実質的に、アンタゴナイズする、妨げる、防止する、抑制する、遅延させる、中断する、排除する、停止する、低減する能力を指す。

本明細書で使用される場合、「突然変異型」または「バリアント」という用語は、本発明に開示の抗体を指し、本発明の抗体またはそれらの断片の、Ｎ末端および／またはＣ末端にておよび／またはそれらの天然アミノ酸配列内で、１個または複数のアミノ酸が付加および／または置換および／または欠失および／または挿入される。本明細書で使用される場合、「突然変異型」という用語はまた、突然変異型タンパク質をコードする核酸分子も指す。さらに、「突然変異型」という用語は、タンパク質または核酸よりも短いまたは長い任意のバリアントを指す。

「相同性」という用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と他のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列との関係を記載するのに使用され、この関係は、比較される前記配列どうしの間の同一性および／または類似性の程度によって決定される。

本明細書で使用される場合、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、比較のために選択された領域内の指定された配列と、少なくとも８５％の同一性を有する場合、参照配列と「実質的に類似」または「実質的に同じ」である。したがって、実質的に類似の配列には、例えば、少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９１％の同一性、または少なくとも９２％の同一性、または少なくとも９３％の同一性、または少なくとも９４％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９６％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有するものが含まれる。互いに同一である２つの配列も実質的に類似である。

参照配列に基づいて、配列同一性が決定される。配列解析用のアルゴリズムは、当技術分野で知られ、例えば、Ｙｅら Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３、Ｗ３４～４０に記載のＩｇＢＬＡＳＴが知られる。本発明の目的上、ヌクレオチド配列どうしの間およびアミノ酸配列どうしの間の同一性および類似性のレベルを決定するため、標準的パラメータでのギャップアラインメントを使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）によって提供されるＩｇＢＬＡＳＴソフトウェアパッケージの助けを借りて、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が比較され得る。パーセント同一性を計算するため、参照配列、例えば可変領域の完全長が使用される。

ポリペプチドを「コードする」ヌクレオチド配列への言及は、ポリペプチドが、ｍＲＮＡの翻訳および転写過程でヌクレオチド配列から産生されることを意味する。これによって、ｍＲＮＡと同一であるとともに配列のリストで通常使用もされるコード鎖と、転写のテンプレートとして機能する相補鎖との両方が指示され得る。当業者であれば明白なように、用語はまた、同じアミノ酸配列をコードする任意の縮重ヌクレオチド配列も含む。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含む配列を含む。

抗体
上述のように、本発明は、ヒトＴ受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖領域に特異的に結合する能力を有する単離モノクローナルヒト化抗体およびそれらの機能的断片に関する。

本発明による抗体は、キメラ、ヒト化またはヒトの各抗体、またはそれらの抗原結合断片とすることができ、病態形成が例えばＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲを伴うＡＳおよびその他の疾患、例えば、セリアック病またはＴ細胞リンパ腫を処置するための医薬として使用され得る。

本発明による抗体はモノクローナルである。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、当技術分野でよく知られるハイブリドーマ技法、ならびに組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはそのような技術または当技術分野でよく知られるその他の技術の組合せを使用して生産され得る。本出願で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、その生産方法ではなく、例えば、任意の真核の、原核のまたはファージのクローンを含めて、単一コピーまたはクローンから得られる抗体を指す。

ヒト化抗体およびキメラ抗体は、ペプチド合成によって、または下の「核酸」セクションで記載のように組換えＤＮＡ技法を使用して産生され得る。
いくつかの態様では、本発明の抗体は、キメラであり、非ヒト起源（例えば、ラットまたはマウス起源）の軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメイン、ならびにヒト起源の定常ドメインを有することで特徴付けられる。

本発明の抗体は、以下の３つの超可変領域を持つ重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）であって、
１）ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔナンバリングスキームによる）は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、
２）ＨＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有し、
３）ＨＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する、重鎖の可変ドメイン；
２）３つの超可変領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を持つ軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）であって、
ＬＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列を有する、軽鎖の可変ドメイン
を含む。

特段の記載がない限り、抗体のＣＤＲを決定するために以下では、よく知られるＫａｂａｔナンバリングスキームが使用される。
すべての態様では、本発明の抗体の軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインは、ヒト化されており、アミノ酸置換のヒト化の上で親抗体の両可変ドメインとは異なり、抗体の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインのＦＲ断片中にアミノ酸置換を含み、その結果、親抗体と比較して、本発明の抗体のヒト化の程度を向上する。

好ましい態様では、本発明の抗体の重鎖の可変ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有し、ヒト化アミノ酸置換が存在することで、アミノ酸配列が配列番号８に示される、親抗体の重鎖の可変ドメインとは異なる。

いくつかの態様では、本発明の抗体の重鎖の可変ドメインは、抗体特異性を改変しないさらなるアミノ酸置換を含む。
好ましい態様では、本発明の抗体の軽鎖の可変ドメインは、アミノ酸置換を含むとともに配列番号１８に示される配列を有し、かつ、ヒト化アミノ酸置換が存在することで、アミノ酸配列が配列番号１０に示される、親抗体の重鎖の可変ドメインとは異なる。

いくつかの態様では、本発明の抗体の軽鎖の可変ドメインは、抗体特異性を改変しないさらなるアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様では、本発明のモノクローナル抗体は、完全長のヒトＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２またはＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。

いくつかの態様では、本発明の抗体は重鎖を含み、この重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一である。

いくつかの態様では、本発明の抗体は軽鎖を含み、この軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一である。

いくつかの態様では、抗体は、アミノ酸配列が配列番号２２に示される軽鎖と、アミノ酸配列が配列番号２０に示される重鎖とを有する。
先行技術から知られるように、突然変異が、可変ドメインを含めて、抗体配列に導入され得るが、このことは、抗原に結合する抗体の能力を実質的に改変しない。本発明による抗体はまた、ＴＣＲのＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖と結合する抗体能力の喪失をもたらさないが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害の低下または抗体の親和性またはその他の生物学的特性の向上をもたらすことができる、さらなる突然変異も含有し得る。特に、先行技術からよく知られるが、保存的アミノ酸置換が抗体配列において作製され得る。本出願の文脈における「保存的置換」とは、あるアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられる置換を指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野でよく知られており、このファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。好ましくは、ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインのＣＤＲ３領域は、５個以下の保存的アミノ酸置換、より頻繁には３個以下の保存的置換を含む。典型的には、保存的置換は、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープに結合するために極めて重要なアミノ酸の位置では作製されない。

本発明による抗体の上記バリアント（突然変異型）は、ペプチド合成によって、または下の「核酸」セクションで記載のように組換えＤＮＡ技法を使用して取得され得る。
好ましい態様では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧＳ、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤの定常領域などの重鎖の定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域または軽鎖カッパ定常領域または軽鎖ラムダ定常領域のいずれかを含み得る。好ましくは、抗体は軽鎖カッパ定常領域を含む。

好ましい態様では、抗体重鎖可変断片は８４％のヒト化の程度によって特徴付けられる。好ましい態様では、抗体軽鎖可変断片は８５％のヒト化の程度によって特徴付けられる。

また提供されるのは、本発明の抗体の抗原結合断片でもある。
本明細書で使用される抗体の「抗原結合断片」（または「抗体の機能的断片」または「抗体の活性断片」）という用語は、抗原と特異的に結合する能力を保持する１つまたは複数の抗体断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示されてきた。

抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例として、（ａ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１の各ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｂ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ）２断片；（ｃ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｄ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｅ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４～５４６）、ならびに（ｆ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、ＶＬおよびＶＨが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して、連結され得る。この場合、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価の分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２６；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３を参照されたい）。こうした単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含されると企図される。これらにはまた、ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体も含まれる。ダイアボディとは、二価の二重特異性抗体であり、この場合、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインどうしの間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、これによって、当該ドメインに別の鎖の相補ドメインと対形成することを強制し、２つの抗原結合部位を創製する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Р．ら（１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８；Ｐｏｌｊａｋ Ｒ．Ｊ．ら（１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１～１１２３を参照されたい）。

ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などの抗体断片は、全抗体の、それぞれ、パパイン消化やペプシン消化などの従来技法を使用して、全抗体から取得され得る。さらに、抗体、抗体断片、および免疫接着分子が、標準的な組換えＤＮＡ技法を使用して取得され得る。

抗体またはその抗原結合部分は、１つもしくは複数のタンパク質またはペプチドと抗体または抗体断片との共有結合のまたは非共有結合の会合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部とすることができる。こうした免疫接着分子の例として、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ Ｓ．Ｍ．ら（１９９５） Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ６：９３～１０１）ならびに二価でサイズが縮小したｓｃＦｖ生体分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ Ｓ．Ｍ．ら（１９９４） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１：１０４７～１０５８）、が挙げられる。抗体断片どうしの間の他の化学的結合もまた、最新技術からよく知られる。

本発明による抗体およびそれらの機能的断片は、単離された形態で存在する、すなわち、このことは、かかるタンパク質が、他のタンパク質またはオリゴ糖、核酸およびそれらの断片等などのその他の天然に存在する生体分子の存在を実質的に含まないことを意味するが、この場合における「実質的に含まない」という用語は、単離されたタンパク質を含む前記組成物のうちの７０％未満、典型的には６０％未満、より頻繁に５０％未満が、他の天然に存在する生体分子であることを意味する。

いくつかの態様では、前記タンパク質は、実質的に精製された形態で存在し、「実質的に精製された形態」という用語は、少なくとも９５％に等しい、典型的には少なくとも９７％に等しい、より頻繁に少なくとも９９％に等しい純度を意味する。

組換えまたはハイブリドーマの技法によって得られる抗体を精製する方法は当技術分野でよく知られており、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に特異抗原プロテインＡまたはプロテインＧに対する親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー（ｓｉｚｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））、遠心分離、溶解度の差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質を精製するためのその他の任意の標準技法によって、精製が実行され得る。さらに、本発明による技術によって得られる抗体またはそれらの断片は、異種ポリペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ）に融合されて、精製を容易にすることができる。

抗体親和性が、解離定数（ＫＤ）を決定することによる標準分析を使用して、決定され得る。等式ＫＤ＝ｋｄｉｓ／ｋｏｎを使用してＫＤが計算されるが、ｋｄｉｓは実験的に求めた解離速度定数であり、ｋｏｎは抗体－抗原複合体の実験的に求めた会合速度定数である。

好ましい抗体は、約１×１０^－７Ｍ以下；好ましくは約１×１０^－８Ｍ以下；より頻繁には、約１×１０^－９Ｍ以下、より好ましくは約１×１０^－１０Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０^－１１Ｍ以下、例えば、約１×１０^－１２Ｍ以下、のＫＤ値でヒト抗原と結合する抗体である。

本発明の組成物および方法で使用され得る抗体およびそれらの断片は、生物学的に活性な抗体および断片である、すなわち、これらは、所望の抗原性エピトープと結合するとともに直接的または間接的に生物学的効果を呈することができる。

本発明による抗体およびその機能的断片は、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖のエピトープ（領域）と特異的に結合することができる。好ましい態様では、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖へのそれらの特異的結合の結果として、前記ベータ鎖を含むＴＣＲの活性の阻害。典型的には、阻害は、好ましくは、少なくとも約２０、または３０、または４０、または５０、または６０、または７０、または８０、または９０、または９５％またはこれ超に達する。

いくつかの態様では、本発明によるＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖に対する抗体またはその断片は、ＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を含むＴＣＲを有するＴ細胞を排除することができる。いくつかの態様では、本発明による抗体またはその断片は、Ｔリンパ球のうちの、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％排除を提供することができる。

本発明の好ましい態様では、抗体は抗体ＭＡ－０４３である。
抗体ＭＡ－０４３は、配列番号１６および１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインを含む。

抗体ＭＡ－０４３は、それぞれ、配列番号２０および２２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む。

核酸
本発明は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖、その機能的断片ならびに可変ドメインをコードする核酸分子を提供し、これは、ヒト抗体の既知の定常ドメインと作動可能に融合した本発明の可変ドメインを含むキメラ抗体を得るために、使用され得る。

好ましい態様では、本発明の核酸は、抗体重鎖をコードし、この重鎖の可変ドメインは３つの超可変領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含有し、
ＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔナンバリングスキームによる）は配列番号１のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ２は配列番号２のアミノ酸配列を有し、
ＨＣＤＲ３は配列番号３のアミノ酸配列を有する。

好ましい態様では、本発明の核酸は抗体軽鎖をコードし、この軽鎖の可変ドメインは３つの超可変領域、ＬＤＣＲ１、ＬＤＣＲ２およびＬＤＣＲ３を含み、ここで：
ＬＣＤＲ１は配列番号４のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ２は配列番号５のアミノ酸配列を有し、
ＬＣＤＲ３は配列番号６のアミノ酸配列を有する。

好ましい態様では、本発明の核酸は、抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードし、これらは、重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインのＦＲ断片にアミノ酸置換を含有し、この置換は、親抗体と比較して、本発明の抗体のヒト化の程度を向上する。

前記抗体鎖、これらの機能的断片およびドメインの相同体および突然変異型をコードする核酸分子もまた、本発明の範囲内である。
いくつかの態様では、核酸は抗体重鎖をコードし、この重鎖の可変ドメインは配列番号１６のアミノ酸配列を有する。

いくつかの態様では、核酸は抗体軽鎖をコードし、この軽鎖の可変ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様では、核酸は抗体重鎖をコードし、この重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一である。

いくつかの態様では、核酸は抗体軽鎖をコードし、この軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列と、少なくとも８５％同一、または少なくとも９０％同一、または少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％同一である。

本発明の軽鎖および重鎖をコードする各核酸の例は、配列番号１９および２１に示される。
抗体の軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインをコードする核酸も目的である。抗体の軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインをコードする核酸は、抗体の相当する定常ドメインをコードする核酸との操作可能な融合に使用され得る。

いくつかの態様では、核酸が、アミノ酸配列が配列番号１６に示される、抗体の重鎖の可変ドメインをコードする。
いくつかの態様では、核酸が、アミノ酸配列が配列番号１８に示される、抗体の軽鎖の可変ドメインをコードする。

抗体の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインをコードする各核酸の例は、配列番号１５および１７に示される。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」または「核酸」とは、ゲノムＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子などのＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子である。いくつかの態様では、本発明の核酸分子とは、本発明の抗体または抗体断片をコードし、適切な条件（例えば、生理学的細胞内条件）下で、異種発現システムでの発現に使用されることが可能であるオープンリーディングフレームを含有する、ＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子である。

いくつかの態様では、本発明の核酸分子は、遺伝子工学的方法によって生産される。核酸の生産方法は当技術分野でよく知られる。
例えば、アミノ酸配列情報またはヌクレオチド配列情報のアベイラビリティが、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離された核酸分子の調製を可能にする。

アミノ酸配列情報の場合、縮重コードに起因して互いに異なるいくつかの核酸が合成され得る。所望の宿主向けにコドンバリアントを選択する方法は、当技術分野でよく知られる。

合成オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法によって調製され得るが、生成した構築物は、当技術分野でよく知られる方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、に記載のその他の方法にしたがって、および、例えば、米国ＨＨＳ省、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ） Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、に記載の指示のもとで、精製され得る。本発明の長い二本鎖ＤＮＡ分子は、以下の方式で合成され得る：隣接する断片と接着することができる適切な末端を含む適切な相補性のより小さないくつかの断片を合成することによる。隣接する断片は、ＤＮＡリガーゼまたはＰＣＲベースの方法を使用して連結され得る。

本発明の核酸分子はまた、生物学的供源からクローニングされ得る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸と、相同である、実質的に同じである、同一である、またはそれらに由来する、核酸を包含する。

本発明の核酸は、これらが自然界で存在する環境以外の環境において存在するものであり、例えば、本発明の核酸は、増加した量で単離され、存在するものであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系においてあるいは本発明の核酸が自然界で存在する細胞もしくは生物体以外の細胞または生物体において、存在しまたは発現されるものである。

密接に関連する核酸配列どうしの間のヌクレオチド配列の変化または差異は、正常な複製または重複の過程中で生じる配列中のヌクレオチド変化を表すことができる。特定のアミノ酸のコドンまたは調節領域のヌクレオチド配列を変更するなどの、特定の目的のために他の変更が、特別に設計され、配列に導入され得る。このような特定の変更が、様々な突然変異誘発技法を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで作製され得るか、またはこれらの変更向けに誘発または選択する特定の選択条件下に置かれた宿主生物体において生み出され得る。このような特別に得られた配列バリアントは、元の配列の「突然変異型」または「派生体」と呼ばれ得る。

突然変異型または派生体の核酸が、テンプレート配列中の１個もしくは複数のヌクレオチドの修飾、欠失もしくは付加、またはそれらの組合せによって、上記核酸から選択されるテンプレート核酸上で取得されて、テンプレート核酸のバリアントを取得することができる。修飾、付加または欠失は、当技術分野で知られる任意の方法によって実施され得る（例えば、Ｇｕｓｔｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （１９９３） １４：２２；Ｂａｒａｎｙ、Ｇｅｎｅ （１９８５） ３７：１１１～１２３；およびＣｏｌｉｃｅｌｌｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ． （１９８５） １９９：５３７～５３９、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（１９８９）、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．１５．３～１５．１０８を参照されたい）が、それには、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、性的なＰＣＲ突然変異誘発、ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、遺伝子再構築、遺伝子部位飽和突然変異誘発（ＧＳＳＭ）、合成ライゲーション再構築（ＳＬＲ）、またはそれらの組合せが含まれる。修飾、付加または欠失はまた、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有鋳型突然変異誘発、ギャップドデュプレックス突然変異誘発、点ミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発、欠失突然変異誘発、制限－選択突然変異誘発、制限－精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、アンサンブル突然変異誘発、キメラ核酸マルチマークリエーション、およびそれらの組合せを含む方法によっても実行され得る。

また提供されるのは、本発明のタンパク質をコードする核酸の縮重バリアントでもある。核酸の縮重バリアントは、核酸のコドンを同じアミノ酸をコードする他のコドンと置き換えることを含む。特に、核酸の縮重バリアントが創製されて、宿主細胞における発現を向上させる。この態様では、宿主細胞中の遺伝子において、好ましくないかまたはより好ましくはない核酸のコドンが、宿主細胞中の遺伝子のコード配列中で大きな比率を占めるコドンと置き換えられ、前記置き換えられたコドンは同じアミノ酸をコードする。

上記修飾は、抗体またはそれらの機能的断片の特性を実質的に改変しないが、宿主細胞におけるタンパク質折り畳みを容易にし、凝集能力を低下しまたはタンパク質のその他の生化学的特性、例えば半減期をモジュレートすることができる。いくつかの態様では、これらの修飾は、タンパク質の生化学的特性を修飾しない。いくつかの態様では、これらの修飾は、抗体免疫原性の減少をまねく。上で特定のすべてのタイプの修飾および突然変異は、核酸レベルにて実行される。

開示の核酸は、実質的に精製された形態で単離および調製され得る。実質的に精製された形態とは、核酸が少なくとも約５０％純粋であり、典型的には少なくとも約９０％純粋であり、そして、典型的には「組換え体」、すなわち、ヌクレオチドが、その天然の宿主生物体中で自然に存在する染色体上で通常には会合しない１個または複数のヌクレオチドによって隣接される、ことを意味する。

また提供されるのは、本発明のタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質をコードする核酸でもあり、この核酸については下でより詳細に論じられる。発明の可変ドメインをコードする核酸は、抗体の軽鎖および重鎖の相当する定常ドメインをコードする核酸に作動可能に連結され得る。抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸は、宿主細胞からの発現産物の輸送を容易にするリーダー（シグナル）ペプチドをコードする核酸に作動可能に連結され得る。これに続いて、リーダーペプチドは、ポリペプチドの成熟過程で排除される。

ベクター
また提供されるのは、開示の核酸を含むベクターおよびその他の核酸構築物でもある。「ベクター」という用語は、核酸分子が作動可能に連結された別の核酸を輸送することができる上記核酸分子を指す。導入された宿主細胞で自律的に複製することができるある特定のベクターもあれば、一方、宿主細胞ゲノムに統合し、宿主ゲノムと一緒に複製することができる他のベクターもある。さらに、いくつかのベクターは、これが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれ、例示的なベクターは、先行技術からよく知られる。適切なベクターには、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、ファージ等、好ましくはプラスミドが含まれ、適切なベクターは本発明の核酸配列の適当な宿主への、クローニング、増幅、発現、搬送等用に使用される。適当なベクターの選択は、当業者にとって明白である。

完全長の核酸またはその部分が典型的には、ベクター中の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ付着の手段によって、ベクター内に挿入される。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えによって、典型的には、所望のヌクレオチド配列の隣接に、ベクターに相同の領域を付着することによって挿入され得る。相同性の領域は、オリゴヌクレオチドのライゲーションによって、または、例えば、相同性の領域と所望のヌクレオチド配列の一部、の双方を含むプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって付加される。

典型的には、ベクターは、染色体外エレメントとして細胞へのベクターの導入結果として、宿主細胞におけるその増殖を確実にする複製起点を有する。ベクターはまた、宿主細胞における核酸の発現および標的ポリペプチドの産生を確実にする調節エレメントを含み得る。発現ベクターでは、前記核酸は、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサーおよびインデューサー、ならびにポリペプチドのスタートコドンを含み得る調節配列に作動可能に連結される。いくつかの態様では、本発明の核酸はさらに、リーダーペプチドに作動可能に連結され、その結果、宿主細胞から細胞外空間への発現産物の分離を確実にする。

また提供されるのは、とりわけ、発現カセットまたはシステムであって、これらに基づいた開示のポリペプチド（例えば、本発明の抗体の軽鎖および重鎖、または本発明の抗体の軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメイン）の取得用にまたは開示された核酸分子の複製用に使用される、発現カセットまたはシステムでもある。

発現カセットは染色体外エレメントとして存在してもよく、前記発現カセットの細胞への導入の結果として細胞ゲノムに統合されてもよい。発現については、本発明の核酸によってコードされるタンパク質産物は、例えば細菌系、酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物の細胞を含めて、好適な任意の発現系において発現される。発現カセットでは、標的核酸は、プロモーター、エンハンサー、終結配列、オペレーター、リプレッサーおよびインデューサー、ならびにポリペプチドのスタートコドンを含み得る調節配列に作動可能に連結される。いくつかの態様では、本発明の核酸はさらに、リーダーペプチドに作動可能に連結され、その結果、宿主細胞から細胞外空間への発現産物の分離を確実にする。所望の産物を発現することができる発現カセットまたはシステムの取得方法は、当業者に知られる。

宿主細胞
上記発現系は、原核のまたは真核の宿主において使用され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バキュロウイルスベクターと組合せで昆虫細胞、またはヒト胚細胞ではない高等生物体の細胞、例を挙げると、酵母、植物、脊椎動物、例えば、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０９６）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５０、ＣＲＬ－１６５１）およびＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）などの、宿主細胞はタンパク質の取得用に使用され得る。

本発明の抗体を生産するため、宿主細胞が、抗体軽鎖をコードする核酸を含む発現ベクターと、抗体重鎖をコードする核酸を含む発現ベクターと、で共形質転換される。いくつかの態様では、単一の発現ベクターが使用され、これに、抗体の軽鎖と重鎖の両方をコードする核酸が導入される。

軽鎖および重鎖の発現の場合、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは宿主細胞に形質転換（共形質転換）され、その結果、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現され、好ましくは宿主細胞が培養される培地に分泌され、そしてその培地から抗体が単離され得る。「形質転換」という用語に関する種々の解釈は、原核または真核の宿主細胞に外在性ＤＮＡを導入するために一般的に使用される広範囲の方法を含むことを意図するものであるが、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（編） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（編） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）に記載の、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等である。

抗体の核酸を含有する組換え発現ベクターが宿主細胞に導入される場合、宿主細胞中で抗体を発現するのに十分な時間期間、または（より好ましくは）宿主細胞が増殖する培地中に抗体を分泌するのに十分な時間期間、宿主細胞を培養することによって、抗体が得られる。抗体は、標準的なタンパク質精製技法を使用して培養培地から単離され得る。細胞培養条件は当業者によく知られており、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ Ｊ．В．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ． ａｎｄ Ｙａｍａｄａ Ｋ．Ｍ．（編） Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．により出版、２０００、に記載される。

本発明の核酸の複製および／または発現に適した、上記宿主細胞またはその他の宿主細胞もしくは生物体のいずれかが使用される場合、生成する複製核酸、発現タンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物体の産物として、本発明の範囲内である。産物は、当技術分野で知られる適切な技法によって単離され得る。

本発明のタンパク質を安定して発現する細胞株は、当技術分野で知られる方法によって選択され得る（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマイシンなどの選択可能なマーカーでのコトランスフェクション、これは、ゲノムに統合された遺伝子を含有するトランスフェクト細胞の特定および単離を可能にする）。

本発明の核酸分子はまた、生物学的試料における遺伝子発現を決定するのに使用され得る。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなどの特定のヌクレオチド配列の存在について細胞が試験される方法は、当技術分野で十分に確立される。要約すると、ＤＮＡまたはｍＲＮＡが細胞試料から単離される。ｍＲＮＡは、逆転写酵素を使用してＲＴ－ＰＣＲによって増幅されて相補的ＤＮＡ鎖を形成することができ、これに続いて、対象のＤＮＡ配列に特異的なプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応増幅が行われる。あるいは、ｍＲＮＡ試料はゲル電気泳動によって単離され、適切な担体に、例えばニトロセルロース、ナイロン等に移され、次いで、プローブとして対象のＤＮＡの断片を用いてプローブされる。他の技法、例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、および固相チップ上に固定されたＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションもまた使用され得る。対象の配列にハイブリダイズするｍＲＮＡの検出は、試料における遺伝子発現を示すものである。

本発明の抗体の治療的使用
一側面では、本発明の抗体またはその活性断片は、表面ＴＲＢＶ９ファミリーのＴＣＲを有する病理的Ｔリンパ球の活性に関連付けられる障害であって、例えば、ＡＳ、セリアック病、Ｔ細胞リンパ腫において自己免疫Ｔリンパ球の活性を呈する、障害の処置に使用される。

本出願で使用される「患者」という用語は、限定されないが、マウス、サル、ヒト、家畜哺乳動物、スポーツ哺乳動物およびペット哺乳動物を含めて哺乳動物を指し；好ましくは、当該用語はヒトに適用される。特定の態様では、患者は、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲの、患者体内での存在によって媒介される疾患または障害、または状態によってさらに特徴付けられる。先行技術から知られるように、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲは、ＡＳおよびセリアック病に関連付けられる。さらに、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲは、エプスタインバーウイルスによって引き起こされるＴ細胞リンパ腫などの、いくつかの血液疾患の発症に関連付けられ得る。

本明細書で使用される場合、１つまたは複数の他の治療薬を伴う抗体を指す、「同時投与」、「同時投与された」、および「組合せで」という用語は、以下を意味し、指し、かつ含むことが、企図される：
１）本発明の抗体と治療薬である成分が、患者に実質的に同時に前記成分を放出する単一剤形に一緒に製剤化される場合、処置を必要とする前記患者への、本発明の抗体と治療薬のこのような組合せの同時投与、
２）本発明の抗体と治療薬である成分が、患者によって実質的に同時に服用され、その上で、前記成分は前記患者に実質的に同時に放出される、別々の剤形に互いに離れて製剤化される場合、処置を必要とする前記患者への、本発明の抗体と治療薬のこのような組合せの同時投与、
３）本発明の抗体と治療薬である成分が、それぞれの投与の間に十分な時間間隔を持って患者によって連続した時間で服用され、その上で、前記成分は前記患者に実質的に異なる時間に放出される、別々の剤形に互いに離れて製剤化される場合、処置を必要とする前記患者への、本発明の抗体と治療薬のこのような組合せの連続投与；ならびにまた
４）本発明の抗体と治療薬である成分が、制御された様式で前記成分を放出し、その上で、前記成分は前記患者に、同じ時間および／または異なる時間に、同時に、連続的に、および／または重複して放出される、単一剤形に一緒に製剤化される場合、処置を必要とする前記患者への、本発明の抗体と治療薬のこのような組合せの連続投与、この場合、各部分が、同じ経路または異なる経路のいずれかによって投与され得る。

本発明の抗体は、さらなる治療的処置なしで、すなわち、独立した治療として投与され得る。
さらに、本発明の抗体による処置は、少なくとも１つのさらなる治療的処置（併用療法）を含み得る。

本発明のいくつかの態様では、病態形成がＴＲＢＶ９ベータ鎖を含むＴＣＲを伴う、自己免疫疾患または腫瘍性疾患、例えば、ＡＣ、セリアック病、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞白血病用の別の医薬／薬物とともに、抗体が同時投与または製剤化され得る。
用量および投与の経路
本発明の抗体は、問題の状態の処置に有効である量で、すなわち、所望の成果を達成するのに必要な用量でおよび時間期間中、投与されることになる。

治療有効量は、患者の処置される特定の状態、年齢、性別、および体重、ならびに抗体が単独で投与されるか、または１つもしくは複数のさらなる免疫抑制または抗炎症の治療術と組合せで投与されるか、などの要因によって変化してもよい。

投薬レジメンは、最適な応答を提供するために調整され得る。例えば、単一ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割された用量が経時的に投与されてもよく、治療状況の緊急性によって指示されるように、用量が比例的に増減されてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書で使用される標準剤形は、処置される患者／対象向けのまとまった投薬量として適した物理的に個別の単位を指すことを意図するものである；各単位は、所望の医薬担体と共同で、所望の治療効果を生み出すように計算された、活性化合物の所定量を含有する。本発明の標準剤形の仕様は典型的には、（ａ）化学療法剤の独特な特質、および達成しようとする特定の療法的または予防的効果、ならびに（ｂ）対象における感受性を処置するためのこうした活性化合物の配合技術に固有の限界、によって規定されるとともにこれらに直接左右される。

したがって、当業者であれば、本明細書で提供される開示に基づいて、用量および投薬レジメンが、治療技術でよく知られる方法にしたがって調整されることを理解するであろう。すなわち、最大許容用量が容易に確立され得るが、患者に検出可能な治療効果を提供する有効量もまた決定される場合もあり、患者に検出可能な治療効果を提供する各薬剤を投与するための時間的要件も同様に決定され得る。したがって、本文書ではいくつかの用量およびレジメンスキームが例として与えられるが、これらの例は、決して、本発明の実施において患者に必要となり得る投与の用量およびレジメンを制限するものではない。

投薬値は、緩和される状態のタイプおよび重症度とともに変化することができ、単回または多回用量を含み得ることに留意されたい。さらに、特定の任意の対象の場合、特定の投薬レジメンは、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する医療専門家の判断にしたがって、経時的に調整される必要があること、ならびに、本明細書に記載の投薬の範囲は、例示に過ぎず、特許請求された組成物の範囲または実施を制限することを意図するものではないことを理解されたい。さらに、本発明の組成物による投薬レジメンは、疾患のタイプ、年齢、体重、性別、患者の健康状態、状態の重症度、投与経路、および使用される特定の抗体を含めて、種々の要因に基づくことができる。したがって、投薬レジメンは幅広に変化することができるが、標準法を使用してルーチン的に決定され得る。例えば、用量は、薬物動態学的または薬力学的パラメータに基づいて調整され得るが、このパラメータには、毒性効果および／または臨床検査値などの臨床効果が含まれ得る。したがって、本発明は、当業者によって決定される患者間用量漸増を包含する。適当な投薬量およびレジメンの決定方法は当技術分野でよく知られており、本明細書に開示のアイデアが提供されれば、当業者によって理解されるであろう。

適切な投与方法の例が上に提供される。
本発明の抗体の適切な用量は、０．１～２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．５～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１～２０ｍｇ／ｋｇを含めて、０．１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であることが企図される。抗体は、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇといった少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇなどの少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇの用量で、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇなどの少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇの用量で、例えば少なくとも４ｍｇ／ｋｇを含めて少なくとも３ｍｇ／ｋｇの用量で、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇの用量で；および例えば最大３０ｍｇ／ｋｇまでを含めて最大５０ｍｇ／ｋｇまで、例えば最大１５ｍｇ／ｋｇまでを含めて最大２０ｍｇ／ｋｇまで、投与され得る。投与は典型的には、適当な時間間隔で、例えば週１回、２週毎に１回、３週毎に１回または４週毎に１回、そして担当医が適切であると判断される限りの間、繰り返されることになるが、場合によっては、担当医は必要であれば用量を増減してもよい。

医薬組成物
本発明の抗体は、患者への投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。本発明の抗体は、単回または多回用量で、単独で、または医薬的に許容される担体、希釈剤、および／もしくは賦形剤と組み合わせて、投与され得る。投与用の医薬組成物は、投与の選択された様式に適当であるように設計され、そして薬学的に許容される希釈剤、担体、および／または賦形剤、例えば分散剤、バッファ、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤等が、適宜使用される。前記組成物は、例えば、開業医に一般的に知られる、組成物を得るための種々の技法を提供する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ １９９５、におけるような従来技法にしたがって設計される。

「医薬（薬物）」－とは、錠剤、カプセル、散剤、凍結乾燥物、注射剤、輸液、軟膏およびその他の既成型にある医薬組成物としての化合物または化合物の混合物であり、ヒトおよび動物において生理学的機能の回復、改善、または改変を、また、疾患の処置および防止を、診断、麻酔、避妊、美容術等を、意図されたものである。当技術分野で許容されるペプチド、タンパク質または抗体を投与するための任意の方法が、本発明の抗体に対して適切に用いられ得る。

「医薬的に許容される」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいての投与に適した１つまたは複数の適合性のある液体または固体の成分を指す。
「賦形剤」という用語は、本明細書では、本発明の上記成分以外の任意の成分を記載するのに使用される。これらは、薬品製品に必要な物理化学的特性を与えるために医薬品製造において使用される無機または有機の性質の物質である。

「バッファ」、「バッファ組成物」、「バッファ剤」という用語は、溶液であって、その酸塩基共役成分の作用によってｐＨの変化に抵抗することができ、抗体薬物がｐＨの変化に抵抗することを可能にする、溶液を指す。一般に、医薬組成物は好ましくは、４．０から８．０の範囲のｐＨを有する。使用されるバッファの例としては、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩等の各バッファ液が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「等張剤」、「浸透圧調節物質」または「浸透圧剤」という用語は、液体の抗体製剤の浸透圧を上昇させることができる賦形剤を指す。「等張」薬とは、ヒトの血液の浸透圧と等しい浸透圧を有する薬物である。等張薬は通常、約２５０から３５０ｍＯｓｍ／ｋｇまでの浸透圧を有する。等張剤として、ポリオール、糖類およびスクロース、アミノ酸、金属塩、例えば、塩化ナトリウム等が使用され得るが、これらに限定されない。

「安定化剤」とは、活性剤の物理的および／または化学的安定性をもたらす賦形剤または２種以上の賦形剤の混合物を指す。安定化剤として、アミノ酸、例えば、限定されないが、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、リジン、グルタミン、プロリン；界面活性剤、例えば、限定されないが、ポリソルベート ２０（商品名：Ｔｗｅｅｎ ２０）、ポリソルベート ８０（商品名：Ｔｗｅｅｎ ８０）、ポリエチレン－ポリプロピレングリコールおよびそのコポリマー（商品名：ポロキサマー、プルロニック（登録商標）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；抗酸化剤、例えば、限定されないが、メチオニン、アセチルシステイン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、硫酸塩等；キレート剤、例えば、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸ナトリウム等が使用され得る。

医薬組成物は、活性剤が、例えば、２～８℃の貯蔵温度での指定有効期間の間、その物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を保持する場合、「安定」である。好ましくは、活性剤は、物理的および化学的安定性、ならびに生物学的活性の両方を保持する。保管期間は、加速劣化条件または自然劣化条件での安定性試験の結果に基づいて選択される。

本発明のモノクローナル抗体を含有する組成物は、経口、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、口腔内、舌下、または坐剤の各投与を含めて、標準投与技法を使用して、本出願に記載の病状を呈する患者に投与され得る。

本発明の医薬組成物は好ましくは、「治療有効量」の本発明の抗体を含有する、または「治療有効量」の本発明の抗体である。「治療有効量」という用語は、所望の治療成果を達成するのに必要な投薬量および期間において有効である量を指すことを意図するものである。抗体の治療有効量は、対象の病状、年齢、性別、および体重、ならびに対象において所望の応答を誘発する抗体またはこの一部の能力などの要因に応じて変化し得る。治療有効量とはまた、抗体の治療上有益な効果が毒性または有害ないかなる効果よりまさる量でもある。「予防的有効量」とは、所望の予防的成果を達成するのに必要な投薬量および期間において有効である量を指すことを意図するものである。予防的用量は、疾患以前にまたは疾患の初期段階に個人に処方されるので、通常には、予防的有効量は、治療有効量よりも少ない場合もある。

治療有効量または予防有効量とは、少なくとも、活性剤の毒性用量よりも少ない治療上有益な最小用量である。他方、本発明の抗体の治療有効量とは、例えば、自己免疫クローンの存在が望ましくない病理的効果を引き起こすかもしくはこれの一因である場合、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリー属にするＴＣＲと結合することによって、前記クローンの生物学的活性を哺乳動物、好ましくはヒトにおいて減少させる量であり、または、ベータ鎖がＴＲＢＶ９ファミリーに属するＴＣＲを低下させることによって、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて有益な治療効果を引き起こす量である。

本発明の抗体の投与経路は、経口、非経口、吸入または局所とすることができる。好ましくは、本発明の抗体は、非経口投与に許容される医薬組成物に含まれ得る。本出願で使用される「非経口」という用語には、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣または腹腔内の各投与が含まれる。静脈内、腹腔内または皮下の各注射が好ましい投与経路である。そのような注射用の許容可能な医薬担体は、先行技術からよく知られる。

適当な指針に記載のように、医薬組成物とは容器内での製造および貯蔵の条件下で無菌かつ安定である必要があるが、この容器は、例えば、気密性のバイアル（アンプル）または注射器によって用意される。したがって、医薬組成物は、当該組成物を調製した後にろ過滅菌に供されてもよく、他の任意の技法によって微生物学的に適切であるとされ得る。静脈内注入用の典型的な組成物は、滅菌リンゲル液、生理食塩水、デキストロース溶液またはハンクス塩溶液などの流体２５０～１０００ｍｌと、治療有効用量（例えば、１～１００ｍｇ／ｍｌまたはこれ超）の抗体濃縮物とを含み得る。用量は、疾患の種類と重症度に応じて変化することができる。任意の患者への用量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与期間および投与経路、全身健康状態および同時投与のその他医薬を含めて多重要因に左右されることは、最新医療技術からよく知られる。典型的な用量は、例えば、０．００１～１０００μｇの範囲としてもよい；しかし、特に上記のパラメータを考慮すると、この例示的な範囲よりも低めのおよび高めの用量が予想される。毎日の非経口投薬レジメンは、０．１μｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇ総体重まで、好ましくは０．３μｇ／ｋｇから１０μｇ／ｋｇまで、より好ましくは１μｇ／ｋｇから１μｇ／ｋｇまで、さらより好ましくは、１日あたり０．５から１０μｇ／ｋｇ体重まで、とすることができる。

処置プロセスは、患者の健康状態の定期的に評価によってモニタリングされ得る。数日間以上の反復投与の場合、患者の状態に応じて、疾患の症状の望ましい応答または抑制まで処置が繰り返される。しかし、本明細書に記載されていない別の投薬レジメンも適用され得る。所望の用量は、単回ボーラス投薬もしくは多回ボーラス投薬によって、または開業医によって所望される薬物動態学的分解に応じて抗体の連続注入によって、投与され得る。

抗体のこれらの推定量は、医師の決定に大きく左右される。意図された効果は、適当な用量とレジメンを選択するためのキー要因である。本明細書で考慮される要因には、処置されるある特定の疾患、処置を受けるある特定の哺乳動物、ある特定の患者の臨床状態、障害の原因、抗体投与部位、特定の抗体タイプ、投与経路、投与レジメン、および医療技術でよく知られるその他の要因が含まれる。

本発明の治療薬は、凍結または凍結乾燥され、そして、投与前に適当な滅菌担体中で再構成され得る。凍結乾燥および再構成は、抗体活性の一部の喪失をもたらす恐れがある。この喪失を補償するために用量が調整され得る。一般に、医薬組成物のｐＨ値６から８までが好ましい。

製造物品（製品）およびキット
本発明のさらなる態様は、病態形成がＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖を有するＴＣＲを伴う自己免疫疾患および関連状態ならびに悪性血液疾患を処置するために使用される製品を含有する、製造物品である。かかる疾患には、例えば、ＡＳ、セリアック病、Ｔ細胞白血病およびＴ細胞リンパ腫等が含まれる。

製造物品とは、ラベルおよび添付文書を備える容器であり、これは、ブリスターおよび／またはパッケージの中に存在してもよい。適切な容器には、例えば、バイアル、アンプル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラスまたはポリマー材料などの種々の材料から作製されてもよい。容器は、ある特定の状態を処置するのに効果的である組成物を含むとともに、滅菌アクセスポートを有することができる。組成物中の少なくとも１つの有効成分は、本発明による抗体である。ラベルと添付文書は、薬物がある特定の状態を処置するために使用されることを意図するものであることを指示する。ラベルおよび／または添付文書は、かかる治療用製品の適応症、頻度、用量、投与経路、禁忌および／または注意を含めて、患者において抗体組成物を投与するための取扱説明書をさらに含有する。一態様では、添付文書は、組成物が処置するために使用されることを意図するものであることを指示する。

さらに、製造物品は、限定なしで、溶媒、希釈剤、フィルター、針および注射器などの、商業目的に必要な、または消費者に必要な他の製品を含むことができる。
本発明はまた、キットであって、種々の目的のために、例えば、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを有するＴ細胞を殺滅する能力の評価のために、細胞由来のＴＲＢＶ９受容体の精製または免疫沈降のために、使用され得るキットに関する。単離および精製の場合、キットは、ビーズ（例えばセファロースビーズ）にカップリングした抗体を含有することができる。キットは、容器、ラベルおよび添付文書を含む。

診断用途
本発明の抗体はまた、診断目的で使用される（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ）。例えば、抗体は、患者から得られた試料（例えば、組織試料または炎症性滲出液、血液、腸液、唾液または尿などの体液の試料）中のＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを含むＴリンパ球のレベルを検出または測定するために使用され得る。検出および測定に適した方法としては、イムノアッセイ、例えばフローサイトメトリー、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学が挙げられる。本発明は、キット、例えば、本明細書に記載の抗体を含む診断用キットをさらに含む。

本発明のよりよき理解のために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、例示のみを目的とするものであり、いかようにも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

本明細書で言及されるあらゆる刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明について、曖昧な解釈を回避するために例示および例によってある程度詳細に説明してきたが、本発明の包含された態様の本質および範囲から逸脱することなくある特定の変更および改変をなし得ることが、本発明で開示されたアイデアに基づいて、本分野の当業者に、非常に明らかとなるであろう。

実験のセクション
実施例１．抗体可変ドメイン配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのヒト化
親（参照）配列として、抗ＴＲＢＶ９－２抗体の重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインの配列を使用したが、これら可変ドメインのアミノ酸配列を配列番号８および１０に示す。

重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を、Ｂｉｏｃａｄ（ロシア）が提供するオープンソースとドナーライブラリーの両方から取得した、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインの生殖細胞系列配列と、ラット免疫グロブリンの可変ドメインの生殖細胞系列配列と、成熟したヒトおよびラットの抗体の配列とのプールと比較した。解析にはＹｌａｂソフトウェアパッケージを使用した（Ｂｉｏｃａｄ、ロシア）。分析によって、試験抗体の可変ドメインの配列において、最も動物様でありかつ非ヒト様である位置およびそれらの組合せを決定した。同時に、これらの位置でヒト抗体において最も頻繁であるアミノ酸の組合せを決定した。本発明の抗体のヒト化の程度を向上する置換を含有する可変ドメインの人工配列を、得られるデータに基づいて設計した。また、対象のアミノ酸バリアントをコードするヌクレオチド配列を、ＣＨＯ細胞株中でヒト化抗体を発現するようにコドン最適化した。

ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのヒト化ヌクレオチド配列（配列番号１５および１７）をｄｅ ｎｏｖｏで合成し、それぞれＳａｌＩ／ＮｈｅＩおよびＳａｌＩ／ＢｓｉＷＩ制限部位にて、ｐＥＥ－ＨＣ、ｐＥＥ－ＣＫベクター、ＩｇＧ１フォーマットにクローニングした（Ｘｕら Ｆｒｏｎｔ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．２０１５、９（３）：３７６～３８０）。得られる軽鎖および重鎖の核酸配列を、Ｓｅｎｇｅｒ配列決定によって検証した。

抗体ＭＡ－０４３をさらなる調査用に選択し、その軽鎖および重鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を配列番号１９～２２に示す。抗体ＭＡ－０４３は重鎖の可変ドメインおよび軽鎖の可変ドメインを含み、これらは配列番号１６および１８に示すアミノ酸配列を有する。

抗体ＭＡ－０４３の重鎖の可変ドメインのヒト化の程度は８４％であったが、一方、軽鎖の可変ドメインのヒト化の程度は８５％であった（表１）。重鎖定常ドメインを、ＩｇＧ１フォーマット、Ｇｍ３アロタイプによって表す。

実施例２．組換え抗体の調製およびその親和性の決定
実施例１に記載のように得られた、抗体ＭＡ－０４３の軽鎖および重鎖をコードする核酸を含むベクターを、大腸菌細胞中で増殖し、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ）製のプラスミドＤＮＡ精製キットを使用して精製し、このベクターを使用して、製造元の取扱説明書にしたがって、線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ 「ＭＡＸ」、「Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ」、米国）を使用してＣＨＯ－Ｆｕｔ８細胞株にトランスフェクトした。得られる反応混合物をシェーカー上で３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの９日後、培養液を０．５／０．２２μｍフィルターを通してろ過することによって細胞から分離した。ろ過後、培養液を使用して、リン酸バッファ生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化した０．２ｍｌのＰｒｅＤｉｃｔｏｒ ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）でのアフィニティークロマトグラフィーを使用して抗体を単離した。次いで、カラムをＰＢＳ５倍量で洗浄した。担体に結合したタンパク質を、０．１ＭグリシンバッファｐＨ３を使用して溶出した。タンパク質を含有するメインピークを採取し、１Ｍ Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．５）でｐＨを中性に調整した。すべての段階を、１１０ｃｍ／ｈの流速下で実施した。次いで、タンパク質を、透析を使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）に移し、０．２２μｍフィルターを通してろ過し、新しい滅菌チューブに移した。変性条件下で１２％ＰＡＧＥを使用して単離品質を評価した。

変性条件下で１２％ＰＡＧＥを使用して単離品質を評価した。２８０ＡにてＮａｎｏＤｒｏｐ２０００マイクロ分光光度計で測定することによって、定量的評価を実施した。単離したタンパク質を－７０℃で保存した。抗体親和性を、ＯｃｔｅｔＲｅｄ ９６システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、米国）で決定した。標準プロトコルおよび製造元の取扱説明書にしたがって、濃度２０μｇ／ｍｌでの抗原をＡＲ２Ｇセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の表面に固定化した。ワーキングバッファとして０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０と０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを使用して３０℃で分析を実施した。ベースラインの記録後、抗体溶液を含有するウェルにセンサーを３００秒間浸漬し、複合体を会合させた。次いで、バッファ液中での複合体の解離を６００秒間検出した。参照シグナルを引いた後、結合曲線を、標準手順にしたがってＯｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（バージョン９．０）ソフトウェアを使用して、１：１Ｇｌｏｂａｌインタラクションモデルを使用して解析した。

得られるデータ（表２）が示したところは、抗体がヒト抗原に特異的かつ高親和性を持って結合することである。

実施例３．ＩｇＧ１フォーマットで抗体を安定して産生する細胞株の調製、および抗体の産生
抗体ＭＡ－０４３の重鎖および軽鎖の配列を、実施例１に記載のように調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ制限部位にてｐＳＸベクターにクローニングした。得られるプラスミドを大腸菌細胞中で培養し、製造元の取扱説明書にしたがってＢｅｎｃｈＰｒｏ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、СＩＩＩА）を使用して６００～７００μｇを単離した。プラスミドをＰｖｕＩエンドヌクレアーゼを使用して一晩線状化し、次いでエタノールを沈殿し、沈殿物を水に溶解し、最終容量中の濃度を９００～１１００ｎｇ／μｌとした。ＣＨＯ－Ｋ１－Ｓ細胞株を、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｇｉｂｃｏ培地（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）で培養した。

МА－０４３鎖のコード配列を含む遺伝子構築物によるトランスフェクションを、製造元のプロトコルにしたがってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ、スイス）でのエレクトロポレーションを使用して、実行した。トランスフェクションの翌日、トランスフェクト細胞を、ピューロマイシン（最終濃度７．２μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシンＢ（最終濃度６４０μｇ／ｍｌ）を培地に添加することによって、２４日間、抗生物質選択に供した。次いで、高レベルのＭＡ－０４３を発現する構造において相同な抗生物質耐性細胞クローンを選択した。

ＭＡ－０４３を発現するＣＨＯ－Ｋ１－Ｓを培養する場合、２－デオキシ－２－フルオロ－Ｌ－フコース（ＣａｒｂｏＳｙｎｔｈ、英国）２５～１００μＭを補充した無血清培地Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｇｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）を使用した。

前臨床試験用のモノクローナル抗体ＭＡ－０４３を、５０ＬのＨｙＣｌｏｎｅシングルユースバイオリアクターファーメンター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で生産した。Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ Ｃ０ＨＣデプスフィルター（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を使用して、培養液から産生細胞を除去した。清澄な培養培地からの抗体の一次精製を、プロテインＡアフィニティー吸着剤で行った。標的タンパク質を、酸性条件下でグリシンバッファｐＨ３．３～３．８で特異的に溶出した。収集した溶出液を、ウイルス不活化の目的で酸性ｐＨに３０～６０分間曝露し、次いで、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液でｐＨ６．５～７．０に中和した。有り得る不純物（ＤＮＡ、産生細胞タンパク質、放出されたアフィン吸着剤のリガンド、凝集体および抗体断片）を除去するための最終的なクロマトグラフィー精製を、フロースルーモードでＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ吸着剤（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行した。したがって、タンパク質溶液を、低導電率（＜３ｍｓｅｃ／ｃｍ^２）で、ｐＨ６．５～７．０のＴｒｉｓバッファで平衡化した調製吸着剤を通して流した。

次いで、精製タンパク質を、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＰＲＯフィルターキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を使用してウイルス除去ろ過に供し、酢酸バッファ（ｐＨ５．０～５．５）とトレハロースを含有する最終バッファに対して濃縮および透析ろ過を行った。

実施例４．Ｔ細胞受容体のＴＲＢＶ９ファミリーベータ鎖断片への特異的結合のための抗体の使用
実施例３に記載のように得られたモノクローナル抗体ＭＡ－０４３を使用して、リンパ球亜集団をソーティングした。製造元のプロトコルにしたがってフルオレセインイソチオシアネート試薬（Ｓｉｇｍａ、米国）を使用して、抗体をフルオレセインで標識した。抗体分子と反応したフルオロフォアの数を、４９５／２８０ｎｍの波長での吸収スペクトル比によって調節した。Ｔリンパ球は健常ドナー由来の末梢血から得た。血液をＥＤＴＡ Ｖａｃｕｅｔｔｅチューブ（それぞれ２×９ｍｌ）に採取し、（Ｋｏｖａｌｃｈｕｋ Ｌ．Ｖ．ら Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｗｏｒｋｓｈｏｐ－２０１０．－１７６ｐ．）に記載の標準手順にしたがって単核画分を単離した。単離後、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および２ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸バッファ生理食塩水（ＰＢＳ）に、細胞を移した。細胞の総数およびその生存率を、Ｌａｎｇ Ｎ．Ｒ．（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｍ．：Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９７６．－２８８ｐ．）によって記載のトリパンブルー染色法によって決定した。等量の０．１％トリパンブルー溶液を細胞懸濁液に添加し、次いで、染色（死滅）と非染色の青色細胞をＧｏｒｙａｅｖチャンバーでカウントした。これらのデータに基づいて、試験試料中の死滅細胞のパーセンテージを決定した。

ＴＲＢＶ９ファミリーに属する膜ＴＣＲを有するＴリンパ球の標的集団へのＭＡ－０４３の結合の選択性を確認するために、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８、１００ｎｇ／ｍｌの濃度での、ＦＩＴＣで標識された抗体ＭＡ－０４３、ＣＤ３－ｅＦｌｕｏｒ４０５（Ｔリンパ球マーカー）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）およびＣＤ４５－ＰＣ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）（総白血球マーカー）を含むＰＢＳバッファに、単核画分の５００，０００細胞分量を添加した。反応混合物５０μｌを室温で３０分間インキュベートし、その後、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを補充したＰＢＳバッファで細胞を洗浄した。染色手順の後、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩ、米国）を使用したソーティングに使用した。染色においてこれらのマーカーを使用することで、表面ＴＲＢＶ９＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋を保有する標的集団細胞を単離すること、ならびに陰性集団細胞、すなわち免疫表現型「ＴＲＢＶ９－、ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋」に相当する細胞を得ること、が可能となった。

２つの複製からのＴＲＢＶ９＋およびＴＲＢＶ９－の集団細胞を、総ＲＮＡの単離およびＴＣＲベータ鎖の配列決定に使用した。得られる細胞画分を、ＲＬＴバッファ（Ｑｕａｇｅｎ、ドイツ）に入れ、製造元のプロトコルにしたがってＱｕｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙミニキット＃２１７００４試薬キット（Ｑｕａｇｅｎ）を使用してそこからＲＮＡを単離した。単離ＲＮＡテンプレート上でｃＤＮＡを合成し、Ｍｉｎｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｅｕｒｏｇｅｎ、ロシア）を使用して、Ｂｒｉｔａｎｏｖａら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１６、１９６（１２）５００５～５０１３）に記載のプロトコルにしたがってＴ受容体ベータ鎖の断片を増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター（米国）を産生されたアンプリコンにライゲーションし、シーケンサー製造元のプロトコルにしたがってＭｉＳｅｑ Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで配列決定を行った。シーケンスデータを、ｈｔｔｐｓ：／／ｍｉｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．ｃｏｍにてインターネットで入手可能なＭｉＧＥＣ、ＭｉＸＣＲ、およびＶＤＪｔｏｏｌｓソフトウェアを使用して解析した。ＴＣＲベータ鎖の得られるレパートリーの解析が示したところは、抗体ＭＡ－０４３を使用してソーティングすることによって得られたライブラリーが、ＴＲＢＶ９遺伝子セグメントによってコードされた配列で９１％だけ濃縮されたのに対して、「ＴＲＢＶ９－」である陰性画分ベータ鎖のレパートリーではＴＲＢＶ９を含む配列は検出されなかったこと、である。

実施例５．抗体ＭＡ－０４３の機能活性
モノクローナル抗体ＭＡ－０４３を、実施例３に記載のように得た。ヒト血液の単核画分を、実施例４に記載のように得た。

さらに、ナチュラルキラー細胞を、ヒトＮＫ細胞単離試薬キット＃１３０－０９２－６５７（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、米国）を使用して、単核画分の一部から単離した。製造元のプロトコルを使用した。ＮＫ細胞単離の品質を、標識抗体ＣＤ１６－ＦＩＴＣ、ＣＤ５６－ＰＥ、ＣＤ３－ＶｉｏＢｌｕｅを使用してサイトフルオメトリー（ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ ＩＩＩ、米国）によって評価した。ＮＫ細胞による濃縮は８５～９５％であった。

細胞毒性を評価するために、抗体ＭＡ－０４３を、最終濃度５００ｎｇ／ｍｌへと、１×１０^６個の細胞を含む単核画分の一定分量に添加した。ＭＡ－０４３と同じ濃度の抗体Ｒｅｍｉｃａｄｅを陰性対照として使用した。対照細胞の一定分量（陽性対照）には抗体をまったく添加しなかった。また、１０^５個のＮＫ細胞をすべての反応混合物に添加した。最終反応容量を１００μｌとした。反応混合物を室温で１時間インキュベートし、次いで、細胞を数回洗浄して抗体を除去し、テーブル上で、９６ウェル丸底プレートのウェルに分配した。

６日後、細胞をウェルから回収し、フローサイトメトリーを使用した免疫表現型解析に使用した。以下の抗体を使用してＴリンパ球を検出した：抗ＣＤ３－ｅＦｌｕｏｒ４５０（ｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；抗ＣＤ８－ＰＣ７（ｃｌｏｎｅ ＳＦＣＩ２１Ｔｈｙ２Ｄ３、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国）；ＦＩＴＣで標識したМА－０４３。

染色後、細胞を洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩＩインスツルメントで解析した。本発明の抗体ＭＡ－０４３とともにインキュベートした試料において、ＣＤ３＋ ＭＡ－０４３＋ Ｔリンパ球は検出されない。

対照的に、ＣＤ３＋ ＭＡ－０４３＋ダブル陽性Ｔリンパ球が、抗体を含まない対照試料（「ゼロ対照」）とともに治療用抗体Ｒｅｍｉｃａｄｅを含む対照試料でなおも検出され、この事実により、ＴＲＢＶ９に対する抗体の添加に続いて、ＴＲＢＶ９＋ Ｔ細胞の特異的排除が確認される。

さらなる陰性対照では、この場合、本発明の抗体ＭＡ－０４３の代わりに非細胞毒性抗ＣＤ６抗体を使用したが、「ゼロ対照」と比較して、標的ＣＤ３＋ ＣＤ６＋集団においていかなる変化も観察されなかった。このことにより、６日目に非標識抗体によるエピトープのスクリーニングが観察されないことが指示され、ＴＲＢＶ９ファミリーＴＣＲを有する細胞を排除する抗体ＭＡ－０４３の能力が確認される。

実施例６．本発明の抗体を含む医薬組成物の調製
医薬組成物を、当技術分野で知られる標準技法によって得た。
医薬組成物の成分を表３に示す。

実施例７．抗体を有する医薬組成物を含むキット
抗体ＭＡ－０４３組成物を含む剤形を有するキットを製造するために、実施例６にしたがって調製された医薬組成物を、滅菌条件下で１ｍｌのアンプルまたは注射器に密封し、プラスチックまたはボール紙の容器にラベルを貼りおよびパッケージする。

また、アンプル容器に添付文書を含める。

Claims (20)

1. ヒトＴＣＲ ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、アミノ酸配列が配列番号１６に示される重鎖可変ドメイン、およびアミノ酸配列が配列番号１８に示される軽鎖可変ドメインを含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
2. 配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 完全長ＩｇＧ抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
4. 請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の重鎖をコードする核酸であって、前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴＣＲ ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域に特異的に結合する、核酸。
5. 請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の軽鎖をコードする核酸であって、前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＴＣＲ ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域に特異的に結合する、核酸。
6. 請求項４に記載の核酸を含有する発現ベクター。
7. 請求項５に記載の核酸を含む発現ベクター。
8. 請求項１から３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を生産するための宿主細胞を得る方法であって、請求項６に記載のベクターおよび請求項７に記載のベクターによる細胞の共形質転換を含む、方法。
9. 請求項４に記載の核酸および請求項５に記載の核酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を得るための宿主細胞。
10. 請求項１から３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を得る方法であって、前記抗体の産生を確実にする条件下で培養培地中で請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップ、これに続いて得られた抗体を単離および精製するステップを含む、方法。
11. ヒトＴＣＲ ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域によって媒介される疾患または障害を予防または処置するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１から３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を、１つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
12. 前記疾患または障害が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. ヒトＴＣＲ ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域によって媒介される疾患または障害を予防または処置するための医薬組成物であって、治療有効量の請求項１から３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片、および治療有効量の少なくともその他の治療活性化合物を含む、医薬組成物。
14. 前記疾患または障害が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. その他の治療活性化合物が、小分子、抗体またはステロイドホルモンから選択される、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
16. ヒトＴＣＲ ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域の生物学的活性を阻害することが必要な対象において、そのような活性を阻害するための方法であって、請求項１から３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の有効量を対象に投与するステップを含む、方法。
17. ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域を有するヒトＴＣＲによって媒介される疾患または障害を処置するための方法であって、治療有効量の請求項１から３のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項１１から１５のいずれかに記載の医薬組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
18. 疾患または障害が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される、請求項１７に記載の疾患または障害を処置するための方法。
19. ヒトＴＣＲ ＴＲＢＶ９の第９ファミリーのベータ鎖領域によって媒介される疾患または障害の処置を必要とする対象において、そのような疾患または障害を処置するための、請求項１から３のいずれかに記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１１から１５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
20. 疾患が、強直性脊椎炎、セリアック病、Ｔ細胞白血病、Ｔ細胞リンパ腫の群から選択される、請求項１９に記載の使用。