WO2020139175A2 - Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения - Google Patents

Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения Download PDF

Info

Publication number
WO2020139175A2
WO2020139175A2 PCT/RU2020/050024 RU2020050024W WO2020139175A2 WO 2020139175 A2 WO2020139175 A2 WO 2020139175A2 RU 2020050024 W RU2020050024 W RU 2020050024W WO 2020139175 A2 WO2020139175 A2 WO 2020139175A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
ser
antibodies
thr
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/RU2020/050024
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2020139175A3 (ru
Inventor
Ольга Владимировна БРИТАНОВА
Дмитрий Борисович СТАРОВЕРОВ
Анна Валентиновна ЕВСТРАТЬЕВА
Алексей Константинович МИСОРИН
Тимофей Александрович НЕМАНКИН
Мария Александровна ЩЕМЕЛЕВА
Анна Константиновна ВЛАДИМИРОВА
Арина Витальевна АНИКИНА
Роман Алексеевич ИВАНОВ
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Павел Андреевич ЯКОВЛЕВ
Сергей Анатольевич ЛУКЬЯНОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to EP20734640.4A priority Critical patent/EP3907239A4/en
Priority to PE2021001081A priority patent/PE20220217A1/es
Priority to MX2021007719A priority patent/MX2021007719A/es
Priority to US17/417,686 priority patent/US20220112286A1/en
Priority to JP2021537707A priority patent/JP2022532274A/ja
Priority to JOP/2021/0169A priority patent/JOP20210169A1/ar
Priority to CA3124813A priority patent/CA3124813A1/en
Priority to SG11202106975VA priority patent/SG11202106975VA/en
Priority to CR20210354A priority patent/CR20210354A/es
Priority to MA53689A priority patent/MA53689B1/fr
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority to CN202080016346.4A priority patent/CN114144432A/zh
Priority to AU2020204492A priority patent/AU2020204492A1/en
Priority to KR1020217023568A priority patent/KR20220131489A/ko
Priority to BR112021012555-8A priority patent/BR112021012555A2/pt
Priority to EA202191813A priority patent/EA202191813A1/ru
Publication of WO2020139175A2 publication Critical patent/WO2020139175A2/ru
Publication of WO2020139175A3 publication Critical patent/WO2020139175A3/ru
Priority to CONC2021/0008218A priority patent/CO2021008218A2/es
Priority to ZA2021/04357A priority patent/ZA202104357B/en
Priority to IL284370A priority patent/IL284370A/en
Priority to PH12021551532A priority patent/PH12021551532A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology and biomedicine, namely to antibodies or their antigen-binding fragments, as well as their use. More specifically, the present invention relates to a monoclonal humanized antibody that specifically binds to the human T cell receptor family. The invention also relates to a nucleic acid encoding a given antibody or antigen binding fragment thereof, an expression vector, a method for producing an antibody, and the use of an antibody for the treatment of diseases or disorders associated with the human T-cell receptor family.
  • Variable sites of TCR form the antigen-binding center of TCR. This means that they are clone-specific, i.e. differ in T lymphocytes that respond to different antigens.
  • V variable
  • T-cell receptors are divided into different families. According to the IMGT nomenclature, 26 different families are distinguished for the beta chain and 41 families for the alpha chain (Turner SJ et al., Nature Reviews Immunology 2006, V.6, 883-894).
  • TCR chain family To determine the TCR chain family, multiple alignment of the tested amino acid sequence with known TCR chain sequences is used, the information on which is summarized in the IMGT database (“The international ImMunoGeneTics information system”, Lefranc M-P., Nucl Acids Res 2001; 29: 207-209 ), available on the Internet at http://www.imgt.org. Multiple alignment and determination of the TCR chain family can be done using the IgBlast software package.
  • Monoclonal antibodies W112 and 2D1 to beta-chain regions of the human T-receptor variable domains of the TRBV5-3 family of TRBV8-1 (W09006758), proposed as a tool for the diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis, are described. These monoclonal antibodies recognize 0.3-5% of peripheral T lymphocytes bearing TRBV5-3 and 0.5-13% of peripheral T lymphocytes bearing TRBV8-1, respectively.
  • the basis for the use of monoclonal antibodies specific for regions of beta-chains of T-receptors was the results of many studies demonstrating the involvement of T-lymphocytes in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
  • Monoclonal antibodies specifically recognizing the beta chain of the 13th rat TRC family are also described.
  • VB13 + T cells T cells whose T receptor contains the VB13 beta chain
  • this procedure protects against the development of type I diabetes in rats disease of the line, and also significantly reduces the risk of developing virus-induced diabetes (Zhijun Liu et al., Diabetes. 2012 May; 61 (5): 1160-1168.).
  • the removal of T cells whose T receptor contains a different family of beta chains (VB16) does not differ in result from the control groups. It is important to note that the very first administration of a monoclonal antibody against VB13 leads to a 60% reduction in the number of VB13 + T cells in the rat spleen.
  • a consensus variant of autoimmune TCR with ankylosing spondylitis is described, it is shown that it is presented in patients with AS in synovial fluid and peripheral blood and is absent at the same depth of analysis in healthy donors, regardless of the status of the HLA * B27 allele (Faham M . et al., Arthritis Rheumatol. 2017; 69 (4): 774-784; Komech E et al. 12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference; 2016 Sep 3-7; Strbske Pleso, Slovakia. Abstract book p. 39).
  • the indicated TCRs belong to the TRBV9 family (according to the IMGT nomenclature).
  • T-cell receptors carrying beta chains of the TRBV9 family are also involved in the development of an autoimmune disease such as celiac disease (Petersen J et al., J Immunol. 2015; 194 (12): 6112-22). They are also found on the surface of T cells susceptible to magnetization in the case of T-cell lymphomas and T-cell leukemias, including T-cell lymphoma caused by Epstein-Barr virus (EBV) (Toyabe S et al., Clin Exp Immunol. 2003 ; 134 (1): 92-97).
  • EBV Epstein-Barr virus
  • chimeric monoclonal antibodies have been described that have the ability to specifically bind to the beta region of the human TRBV9 T-receptor family, which can be used in the treatment of autoimmune and oncological diseases, in the pathogenesis of which TKRs belonging to the TRBV9 family, for example, AS, celiac disease and some T -cellular lymphomas and T-cell leukemia (application for the invention of the Russian Federation 2017145662).
  • the above parental monoclonal antibody includes:
  • VH variable domain of their heavy chain
  • HCDR1 (according to Kabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • HCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • HCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • VL variable domain of their light chain (VL), which contains 3 hypervariable region LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which:
  • LCDR1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
  • LCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
  • LCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the above parental monoclonal antibody includes the variable domains of the heavy and light chains that have the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 8 and 10.
  • the above parental monoclonal antibody includes a light chain that has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and an antibody heavy chain that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • nucleotide sequences encoding the indicated amino acid sequences of the heavy and light chains of the aforementioned parent antibody are given in SEQ ID NOs: 13 and 11.
  • the invention is directed to the creation of a monoclonal antibody that can be used to eliminate T cells carrying TKR family TRBV9, in particular, for the treatment of AS, celiac disease and malignant blood diseases, in the pathogenesis of which TKR family TRBV9 is involved, and which is characterized by a high degree of humanization. Humanization at the same time often leads to a critical decrease in the affinity and / or solubility of antibodies. Thus, obtaining humanized functional antibodies is an urgent task.
  • the present invention relates to a humanized monoclonal antibody and its antigennegative fragment, which have the ability to specifically bind specifically to the beta region of the human TRBV9 T-receptor family.
  • the antibody according to the invention can be used as a medicine for the treatment of autoimmune and oncological diseases, in the pathogenesis of which TKR related to TRBV9 are involved.
  • the antibody of the present invention comprises a heavy chain (VH) variable domain with three hypervariable regions
  • HCDR 1 (according to Kabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • HCDR 2 has the amino acid sequence of SEQ W NO: 2
  • HCDR 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • variable domain of the light chain (VL) with three hypervariable regions LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which:
  • LCDR 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
  • LCDR 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
  • LCDR 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • variable domains of the heavy and light chains of the antibody contain amino acid substitutions in the FR fragments of the variable domains of the heavy and light chains, which increase the degree of humanization of the antibody compared to the parent antibody.
  • the antibody heavy chain variable domain of the present invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 16 and differs from the parent antibody heavy chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 8, by the presence of humanizing amino acid substitutions.
  • the antibody heavy chain variable domain of the present invention contains additional amino acid substitutions that do not affect antibody specificity.
  • the light chain variable domain of an antibody of the present invention has the sequence shown in SEQ ID NO: 18, and differs from the heavy chain variable domain of the parent antibody, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 10, by the presence of humanizing amino acid substitutions.
  • variable domain of the light chain of an antibody of the present invention contains additional amino acid substitutions that do not affect the specificity of the antibody.
  • the monoclonal antibodies of the invention are full-length human IgG antibodies, for example, IgGl or IgG2 or IgG3 or IgG4.
  • the antibody of the invention comprises a heavy chain, the amino acid sequence of which is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least at least 92%, or identical, at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98% or at least 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • an antibody of the invention comprises a light chain whose amino acid sequence is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least at least 92%, or identical, at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98% or at least 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the antibody has a light chain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 22, and a heavy chain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 20.
  • nucleic acids that encode the variable domains of the heavy and light chains of the antibodies of the invention, nucleic acids encoding the heavy and light chains of the antibodies of the invention, and functional fragments of antibodies.
  • expression cassettes and expression vectors comprising the nucleic acid of the present invention and the regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in the selected host cell.
  • the expression vector or cassette can be located in the host cell as an extrachromosomal element or integrated into the cell genome as a result of the introduction (by transfection) of the specified expression cassette or vector into the cell.
  • cells and stable cell lines including nucleic acids, vectors or expression cassettes of the present invention, and methods for their preparation.
  • the method comprises the subsequent isolation and purification of the resulting antibody.
  • compositions for the prophylaxis or treatment of a disease or disorder mediated by the beta chain region of the human TRBV9 T receptor family containing the aforementioned antibody or antigen binding fragment thereof, in in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the pharmaceutical composition is intended to prevent or treat a disease or disorder selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • a pharmaceutical combination is also provided for the prophylaxis or treatment of a disease or disorder mediated by a human T-cell receptor bearing a beta chain of the TRBV9 family containing the above antibody or antigen binding fragment thereof and at least one other therapeutically active compound.
  • the pharmaceutical combination is intended to prevent or treat a disease or disorder selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • the pharmaceutical combination or composition comprises another therapeutically active compound that is selected from a small molecule, an antibody, or steroid hormones, such as corticosteroids.
  • the disease or disorder is selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • the disease is selected from the group: ankylosing spondylitis, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma.
  • the technical result of the present invention is to obtain antibodies with a high degree of humanization, which specifically with high affinity bind to TKR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family and can be used to treat autoimmune and oncological diseases, in the pathogenesis of which TKR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family.
  • the antibody heavy chain variable fragment is characterized by a degree of humanization of 84%. In preferred embodiments, the variable fragment of the light chain of the antibody is characterized by a degree of humanization of 85%.
  • the present invention relates to isolated monoclonal antibodies and their functional fragments having the ability to specifically bind to a portion of the beta chain of the TRBV9 family of T- human receptors with an increased degree of humanization relative to analogues.
  • nucleic acids encoding the antibodies and fragments thereof of the invention, expression cassettes and expression vectors comprising the nucleic acid of the present invention and regulatory elements necessary for expression of the nucleic acid in the selected host cell.
  • cells and stable cell lines are provided, including nucleic acids, vectors, or expression cassettes of the present invention.
  • T-cell receptor also referred to as “TPK”, “T-receptor” or “TCR” of a person, is a heterodimeric protein complex located on the surface of a T lymphocyte.
  • the T receptor is present only on T lymphocytes.
  • the main function of TCR is the specific recognition of processed antigens associated with molecules of the major histocompatibility complex (HLA).
  • HLA major histocompatibility complex
  • Human TCR consists of two subunits, a and b, or g and d chains, interconnected by a disulfide bond and fixed in the cell membrane.
  • Each of the TCR chains has an N-terminal variable (V) domain, a connecting domain, and a constant (C) domain connected to a transmembrane domain that secures the receptor in the plasma membrane of the T-lymphocyte.
  • the length of the constant domain of alpha and beta chains is 91 and 129 amino acid residues, respectively.
  • the length of the connecting and transmembrane domain of the alpha chain is 30 and 17 amino acid residues (a.a.), and that of the beta chain is 21 and 22 a.o.
  • the length of the variable domains of T-receptors varies from 104 to 125 a.o.
  • T lymphocytes A small fraction of T lymphocytes has g / d type T receptors. In their structure, they are similar to a / b receptors, but differ in their primary structure and have a number of functional features. Their variability is much lower (limited clone specificity), they recognize antigens in combination with "non-classical" (not MHC) antigen-presenting molecules or even free antigens.
  • the T receptor interacts with the MHC-antigen complex in six regions that determine its complementarity (CDR): three regions of the alpha chain and three beta chains. These CDRs are hypervariable regions, loops of the variable domains of the T-cell receptor - Ualfa and Ubeta.
  • TRBV9 or "TRBV9 family” refer to the ninth family of beta chains of T-cell receptors isolated according to the IMGT nomenclature, which is characterized by the fact that the amino acid sequence of their variable domain includes unique motifs CDR1 (amino acid sequence - SGDLS) and CDR2 (sequence amino acids - YYNGEE).
  • TCR of the TRBV9 family refers to a T cell receptor whose beta chain belongs to the TRBV9 family.
  • T-lymphocytes or TCR means that this TCR or T-lymphocyte bearing it is associated with a disease or pathology and / or is the cause of the disease and / or contribute to the development of the disease.
  • autoimmune in relation to TCR means that this TCR is involved in the development of an autoimmune disease.
  • antibody as used herein is intended to define an immunoglobulin molecule consisting of four polypeptide chains (two heavy (H) chains and two light (L) chains) linked by disulfide bonds.
  • Light chains are classified as kappa or lambda.
  • Heavy chains are classified as gamma, mu, alpha, delta or epsilon, and they define an isotype of an antibody, such as IgG, IgM, IgA, IgD and IgE, respectively, and several of them can be further divided into subclasses (isotypes), for example, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2.
  • Each type of heavy chain is characterized by a specific constant region.
  • Each heavy chain contains a variable region of the heavy chain (abbreviated here as HCVR or VH) and a constant region of the heavy chain.
  • the heavy chain constant region contains three CHI, CH2, and CH3 domains.
  • Each light chain contains a variable region of the light chain (abbreviated here as LCVR or VL) and a constant region of the light chain.
  • the light chain constant region contains one CL domain.
  • the VH and VL regions can be further subdivided into hypervariability regions called complementarity determining regions (CDRs) surrounded by regions that are more conservative called skeletal regions (FR).
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR skeletal regions
  • Each of VH and VL consists of three CDRs and four FR sites located from the amino to the carboxyl end in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • CDRs of the heavy chains are designated as “HCDR1, HCDR2 and HCDR3”, and 3 CDRs of the light chain are designated as “LCDR1, LCDR2 and LCDR3”.
  • CDRs contain most residues that form specific interactions with the antigen.
  • the numbering and positioning of CDR amino acid residues within the HCVR and LCVR regions of the antibodies of this invention is carried out with the well-known Kabat nomenclature, unless otherwise indicated. In this application, unless otherwise indicated, the generally accepted letter designations of amino acids.
  • anti-TRB U9 antibody refers to an antibody, which specifically binds to the beta chain epitope of the TRBV9 family of the human T cell receptor.
  • the “monoclonal antibody” as used herein may be a single chain Fv fragment that can be obtained by linking DNA encoding LCVR and HCVR to a linker sequence (see Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). It is understood that, regardless of whether fragments or parts are indicated, the term “antibody” as used herein includes such fragments or parts, as well as single chain forms. As long as the protein retains the ability to specifically or preferentially bind its target (eg, epitope or antigen), it refers to the term “antibody”. Antibodies may or may not be glycosylated, and are within the scope of the invention.
  • antibody and “monoclonal antibody” for the needs of this application refer to a monoclonal antibody against TCR of the TRBV9 family.
  • a “monoclonal antibody” refers to a rodent, primate family or Camelidae antibody, preferably a mouse, macaque, camel or llama antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully human antibody, unless otherwise indicated.
  • a "monoclonal antibody” population refers to a homogeneous or substantially homogeneous antibody population (i.e., at least about 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, more preferably at least about 97 or 98% or even more preferably at least 99% of the antibodies in the population will compete in the ELISA for the same antigen or epitope, or more preferably the antibodies are identical in amino acid sequence).
  • Antibodies may or may not be glycolized and still fall within the scope of the invention.
  • Monoclonal antibodies can be homogeneous if they have the same amino acid sequence, although they may differ in post-translational modification, for example, the glycolization pattern.
  • variable regions of each of the light / heavy chain pairs form the antigen-binding sites of the antibody.
  • antigen binding portion or “antigen binding site” or “antigen binding domain” or “antigen binding center” refers, interchangeably, to that part of an antibody molecule that contains amino acid residues that interact with the antigen and give the antibody its specificity and affinity for the antigen. This part of the antibody includes the "frame" amino acid residues necessary to maintain the proper conformation of antigen binding residues.
  • human antibody as used herein means an antibody in which the sequences of the variable and constant domains are derived from human sequences.
  • Human antibodies of the invention may include amino acid residues that are not characteristic of humans (for example, mutations introduced by undirected or site-specific mutagenesis in vitro or somatic mutation in vivo), for example, in CDR and especially in CDR3.
  • humanized with respect to antibodies is used to refer to antibodies that are characterized by the presence of human constant regions and structural components, but have complementarity determining regions (CDRs) that characteristic of immunoglobulins of other origin or corresponding fragments of modified antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions
  • a “parent” antibody in this application is an antibody encoded by the amino acid sequence that is used to produce the variant.
  • the parent antibody may be from a rodent, llama, chimeric, humanized, or human antibody.
  • the term “degree of humanization” with respect to antibodies is used to denote the percent sequence identity of the framework region of a humanized antibody relative to the primary human acceptor framework region that was used to create the humanized antibody and which is available from the human library.
  • the antibody of the invention contains a frame region with an identity of at least 80%, usually at least 82%, more often at least 83%, for example at least 84%, or at least 85%, or at least 86%, or at least 87% identity in relation to the frame portion obtained from the human library.
  • humanizing substitutions refers to amino acid substitutions that increase the degree of humanization of an antibody or fragment thereof.
  • chimeric in relation to the antibodies of the present invention is used to refer to antibodies that are characterized by the presence of human constant regions, but have variable domains of a different origin.
  • variable domains of light and / or heavy chains of non-human origin for example, taken from rats
  • non-human origin for example, taken from rats
  • operatively linked refers to polypeptide sequences that are are in physical (covalent, unless otherwise indicated) and functional connection with one another.
  • the functions of the polypeptide components of the chimeric molecule are not changed compared with the functional properties of the isolated polypeptide components.
  • nucleotide sequences encoding a chimeric protein including “operably linked” components consist of fragments encoding these components, where these the fragments are covalently linked in such a way that during translation and transcription of the nucleotide sequence a full-sized chimeric protein is produced, for example, a chimeric antibody according to the invention.
  • isolated and “isolated” mean a molecule or cell that is in an environment other than the environment in which the molecule or cell is in vivo.
  • the antibodies of the present invention are recombinant, that is, obtained using the recombinant DNA technique.
  • recombinant antibody includes all antibodies that are obtained, expressed, created or isolated by recombinant means, such as antibodies expressed using a recombinant expression vector introduced into a host cell, antibodies isolated from a set of known recombinant human combinatorial antibodies, antibodies isolated from an animal, which is transgenic in relation to genes for human immunoglobulin (see, for example, Taylor LD et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295).
  • the recombinant human antibodies are subjected to in vitro mutagenesis (or, if an animal transgenic from human Ig sequences is used, somatic mutagenesis in vivo) and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that, because they isolated from human VH and VL human sequences and close to them, cannot exist in vivo in the germinal set of human antibodies in vivo.
  • the antigen binding domain of an antibody of the invention is specific for a particular epitope that is carried by a number of antigens, in which case a specific antibody having an antigen binding domain will be capable of specifically binding to different antigens carrying the epitope.
  • the monoclonal antibody of the invention specifically binds an epitope of the T chain beta receptor of a human cell receptor belonging to the TRBV9 family, while it does not specifically bind the TCR beta chains of other families and the TCR alpha chain.
  • epitope refers to that part of a molecule that is capable of being recognized and bound to an antibody in one or more antigen binding sites of an antibody. Epitopes often consist of chemically active surface groups of molecules, such as amino acids or sugar side chains, and have specific three-dimensional structural characteristics, as well as specific charge characteristics.
  • epitope also refers to a portion of a polypeptide that has antigenic and / or immunogenic activity in an animal, preferably a mammal, for example, a mouse, rat, or human.
  • antigenic epitope is defined as the portion of a polypeptide to which an antibody can specifically bind, as determined by any method well known in the art, for example, by means of a conventional immune assay. Antigenic epitopes need not be immunogenic, but may also be immunogenic.
  • An “immunogenic epitope”, as used herein, is defined as part of a polypeptide that elicits an antibody response in an animal, as established by any method known in the art.
  • a “non-linear epitope” or “conformational epitope” contains non-contiguous polypeptides (or amino acids) within the antigenic protein with which the antibody specific for the epitope binds.
  • biological property or “biological characteristic” or the terms “activity” or “bioactivity with respect to an antibody and its functional fragments according to the invention are used interchangeably in this application and include, but are not limited to, epitope / antigenic affinity and specificity, ability inhibit or be an antagonist of TCR activity, which includes the beta chain belonging to the TRBV9 family.
  • an antibody identified by the prior art includes, for example, cross reactivity (i.e. with non-human homologues of the target peptide or with other proteins or targets, in general), and the ability to maintain high levels of protein expression in mammalian cells.
  • the above properties or characteristics may be observed, measured or evaluated using methods recognized in the art, including, but not limited to, ELISA, competitive ELISA, BIACORE, or KINEXA surface plasmon resonance analysis, in vitro or in vivo inhibition assays restrictions, receptor binding, production and / or secretion of a cytokine or growth factor, signal transduction and immunohistochemistry of tissue sections obtained from various sources, including humans, primate or any other source.
  • inhibitor or “neutralize”, as used herein, with respect to the activity of an antibody of the invention, mean the ability to significantly counteract, inhibit, prevent, limit, slow down, interrupt, destroy, terminate, reduce, for example, development or the severity of what is inhibited, including, but not limited to, the biological activity of an antibody or property, disease, or condition.
  • mutant refers to an antibody disclosed in the present invention in which one or more amino acids are added and / or substituted and / or deleted (deleted) and / or inserted (inserted) at the N-terminus and / or C-terminus and / or within the native amino acid sequences of the antibodies of the present invention or fragments thereof.
  • mutant also refers to a nucleic acid molecule that encodes a mutant protein.
  • mutant refers to to any option that is shorter or longer than the protein or nucleic acid.
  • homology is used to describe the relationship of nucleotide or amino acid sequences to other nucleotide or amino acid sequences, which is determined by the degree of identity and / or similarity between said compared sequences.
  • an amino acid or nucleotide sequence is “substantially similar” or “substantially the same” as a reference sequence if the amino acid or nucleotide sequence has at least 85% identity with the specified sequence within the region selected for comparison.
  • substantially similar sequences include those that have, for example, at least 90% identity, or at least 91% identity, or at least 92% identity, or at least 93% identity, or at least 94% identity, whether at least 95% identity, or at least 96% identity, or at least 97% identity, or at least 98% identity, or at least 99% identity.
  • Two sequences that are identical to one another are also essentially similar.
  • the identity of the sequences is determined based on the reference sequence.
  • Algorithms for sequence analysis are known in the art, such as IgBLAST described in Ye et al. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40.
  • IgBLAST described in Ye et al. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40.
  • a comparison of the nucleotide and amino acid sequences made using the package can be used.
  • IgBLAST programs provided by the National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) using alignment breaks with standard parameters.
  • To calculate the percentage of identity the full length of the reference sequence, for example, a variable region, is used.
  • nucleotide sequence of the “coding” polypeptide means that the polypeptide is produced from the nucleotide sequence during translation and transcription of mRNA.
  • both the coding strand identical to the mRNA and usually used in the list of sequences can be indicated, as well as the complementary strand, which is used as a template for transcription.
  • the term also includes any degenerate nucleotide sequences encoding the same amino acid sequence. Nucleotide sequences encoding a polypeptide include sequences containing nitrons.
  • the present invention relates to isolated monoclonal humanized antibodies and their functional fragments having the ability to specifically bind to the beta region of the human TRBV9 T receptor family.
  • Antibodies according to the invention can be chimeric, humanized or human antibodies, or antigen-binding fragments thereof, and can be used as a medicine for the treatment of AS and other diseases in the pathogenesis of which the TKRs belonging to the TRBV9 family, for example, celiac disease or T-cell lymphoma, are involved.
  • the antibody of the invention is monoclonal.
  • Monoclonal antibodies according to the invention can be obtained using, for example, hybridoma techniques, a bury known in the art, as well as recombinant technologies, phage display technologies, synthetic technologies, or combinations of such technologies or other technologies well known in the art.
  • monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a single copy or clone, including, for example, any eukaryotic, prokaryotic or phage clone, and not to a method for its preparation.
  • Humanized and chimeric antibodies can be prepared by peptide synthesis or using recombinant DNA techniques as described below in the Nucleic Acids section.
  • the antibodies of the present invention are chimeric and are characterized in that they have variable domains of light and heavy chains of non-human origin (e.g., rat or mouse), and constant domains are characteristic of humans.
  • non-human origin e.g., rat or mouse
  • An antibody of the present invention contains a heavy chain variable domain (VH) with three hypervariable regions
  • HCDR1 (according to the Kabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
  • HCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2,
  • HCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
  • variable domain of the light chain (VL) with three hypervariable regions LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which:
  • LCDR 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
  • LCDR 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5,
  • LCDR 3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • Kabat nomenclature is used to determine the CDR of antibodies, unless specifically stated otherwise.
  • the light and heavy chain variable domains of the antibody of the present invention are humanized and different from the parent and light chain variable domains of the parent antibody by humanizing amino acid substitutions, wherein the antibody heavy and light chain variable domains contain amino acid substitutions in FR fragments of the heavy and light chain variable domains, increasing the degree of humanization of the antibody compared to the parent antibody.
  • the antibody heavy chain variable domain of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and differs from the parent antibody heavy chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 8, by the presence of humanizing amino acid substitutions.
  • the antibody heavy chain variable domain of the present invention contains additional amino acid substitutions that do not affect antibody specificity.
  • the light chain variable domain of an antibody of the present invention contains amino acid substitutions and has the sequence shown in SEQ ID NO: 18, and differs from the parental antibody heavy chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 10, by the presence of humanizing amino acid substitutions .
  • variable domain of the light chain of an antibody of the present invention contains additional amino acid substitutions that do not affect the specificity of the antibody.
  • the monoclonal antibodies of the invention are full-length human IgG antibodies, for example, IgGl or IgG2 or IgG3 or IgG4.
  • the antibody of the invention comprises a heavy chain, the amino acid sequence of which is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least at least 92%, or identical, at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98% or at least 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • an antibody of the invention comprises a light chain whose amino acid sequence is at least 85% identical, or at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least at least 92%, or identical, at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98% or at least 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22.
  • the antibody has a light chain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 22, and a heavy chain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 20.
  • Antibodies according to the present invention may also contain additional mutations that do not lead to a loss in the ability of the antibody to bind the TKR beta chain of the TRBV9 family, but can lead to a decrease in antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity or an increase in the affinity or other biological properties of antibodies.
  • conservative amino acid substitutions can be made in an antibody sequence.
  • conservative substitution in the context of the application is meant a substitution in which the amino acid residue is replaced by another amino acid residue having a close side chain.
  • Families of amino acid residues having close side chains are defined in the prior art, including main side chains (e.g., lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g., aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g. glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar side chains (e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), b-branched side chains (e.g. threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (e.g.
  • main side chains e.g., lysine, arginine, histidine
  • acidic side chains e.g., aspartic acid, glutamic acid
  • uncharged polar side chains e.g. glycine,
  • conservative amino acid substitutions are made in the CDR3 regions in the VL and / or VH domains, most often no more than three conservative substitutions.
  • conservative substitutions are not made at amino acid positions critical for binding of the epitope of the beta chain of the TRBV9 family.
  • variants (mutants) of antibodies according to the invention can be obtained by peptide synthesis or using recombinant DNA techniques as described below in the section "Nucleic acids”.
  • the antibody comprises a constant region of a heavy chain, such as a constant region of IgGl, IgG2, IgGS, IgG4, IgA, IgE, IgM, human IgD.
  • the constant region of the heavy chain is a constant region of the heavy chain of human IgGl.
  • the antibody may contain as a constant region of light chains are either a kappa-constant region of the light chain or a lambda-constant region of the light chain.
  • the antibody comprises a kappa constant region of the light chain.
  • the antibody heavy chain variable fragment is characterized by a degree of humanization of 84%. In preferred embodiments, the variable fragment of the light chain of the antibody is characterized by a degree of humanization of 85%.
  • Antigen binding fragments of the antibodies of the present invention are also provided.
  • antigen binding fragment of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind antigen. It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be carried out by full-length antibody fragments.
  • binding fragments encompassed by the term “antigen binding fragment” of an antibody include (a) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL, and CH1 domains; (b) a F (ab ′) 2 fragment, a bivalent fragment containing two Fab fragments linked by a disulfide bridge in the loop region; (c) a Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (d) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of one arm of an antibody; (d) a dAb fragment (Ward et al.
  • single chain antibodies are also encompassed by the term “antigen binding fragment” of an antibody.
  • Diabodies are bivalent, bispecific antibodies in which the VH and VL domains are expressed on the same polypeptide chain, but using a linker that is too short to allow two domains to pair on the same chain, causing the domains to pair with complementary domains of the other chain and create two antigen-binding sites (see, for example, Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak RJ et al. (1994) Structure 2: 1121- 1123).
  • Antibody fragments such as Fab and F (ab ') 2
  • Fab and F (ab ') 2 can be obtained from whole antibodies using accepted methods, such as degradation by papain or pepsin, respectively, of whole antibodies.
  • antibodies, antibody fragments, and immunoadhesion molecules can be obtained using standard methods using recombinant DNA.
  • An antibody or antigen binding fragment thereof may be part of larger immunoadhesion molecules formed by covalent or non-covalent binding of an antibody or antibody fragment to one or more protein or peptide.
  • immunoadhesion molecules include the use of a streptavidin core region to produce a tetrameric scFv molecule (Kipriyanov SM et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) and the use of a cysteine residue, a marker peptide and a C-terminal polyhistidine tag to obtain bivalent and reduced scFv biomolecules (Kipriyanov SM et al. (1994) Mol. Immunol., 31: 1047-1058).
  • Antibodies and their functional fragments according to the invention are in isolated form, i.e. this means that this protein is essentially free from the presence of other proteins or other natural biological molecules, such as oligosaccharides, nucleic acids and their fragment and the like, where the term “Substantially free” in this case means that less than 70%, usually less than 60% and more often less than 50% of said composition containing the isolated protein is another naturally occurring biological molecule.
  • said proteins are present in substantially purified form, where the term “substantially purified form” means a purity of at least 95%, usually equal to at least 97%, and more often equal to at least 99%.
  • purification can be carried out by chromatography (for example, ion exchange, affinity, especially affinity for specific antigens — protein A or protein G, and column size chromatography), centrifugation , differential solubility, or any other standard technique for protein purification.
  • chromatography for example, ion exchange, affinity, especially affinity for specific antigens — protein A or protein G, and column size chromatography
  • centrifugation e.g., a histine tag
  • KD dissociation constant
  • kdis the experimentally calculated dissociation rate constant
  • kop the experimentally calculated rate constant for the association of the antibody-antigen complex.
  • Preferred antibodies are those that bind a human antigen with a KD value of not more than about 1 c 10 7 M; preferably not more than about 1 x 10 -8 M; more often not more than about 1 x 10 -9 M; more preferably not more than about 1 c 10 -10 M, and most preferably not more than about 1 x 10 -11 M, for example, not more than about 1 c 10 -12 M
  • Antibodies and fragments thereof which can be used in the present compositions and methods, are biologically active antibodies and fragments, that is, they are able to bind the desired antigenic epitopes and exhibit a biological effect directly or indirectly.
  • Antibodies and their functional fragments according to the invention are able to specifically bind the epitope (region) of the beta chain of the TRBV9 family.
  • inhibition of TCR activity involving said beta chain occurs.
  • the inhibition is preferably at least about 20, or 30, or 40, or 50, or 60, or 70, or 80, or 90, or 95% or higher.
  • an anti-beta chain antibody of the TRBV9 family of the invention can eliminate T cells carrying TCR containing a beta chain of the TRBV9 family.
  • an antibody or fragment thereof according to the invention can provide at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least approximately 90%, at least approximately 95%, or approximately 100% elimination of T-lymphocytes.
  • the antibody is an MA-043 antibody.
  • the MA-043 antibody includes the variable domains of the heavy and light chains that have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 18.
  • the MA-043 antibody comprises heavy and light chains that have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 22, respectively.
  • the present invention provides nucleic acid molecules encoding the heavy and light chains of the antibodies of the present invention, their functional fragments and variable domains, which can be used to produce chimeric antibodies, including the variable domains of the invention, operatively fused with the known constant domains of human antibodies.
  • the nucleic acid of the invention encodes an antibody heavy chain, the variable domain of which comprises 3 hypervariable regions of HCDR1, HCDR2 and HCDR3, where
  • HCDR1 (according to Rabat nomenclature) has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
  • HCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
  • HCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the nucleic acid of the invention encodes an antibody light chain, the variable domain of which contains 3 hypervariable sections LCDR1, LCDR2 and LCDR3, in which:
  • LCDR1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
  • LCDR2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5;
  • LCDR3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the nucleic acid of the invention encodes the variable domains of the heavy and light chains of an antibody that contain amino acid substitutions in FR fragments of the variable domains of the heavy and light chains that increase the degree of humanization of the antibody compared to the parent antibody.
  • nucleic acid molecules encoding homologues and mutants of these antibody chains, their functional fragments and domains are also within the scope of the present invention.
  • the nucleic acid encodes a heavy chain of an antibody whose variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the nucleic acid encodes a light chain of an antibody whose variable domain has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • the nucleic acid encodes a heavy chain of an antibody whose amino acid sequence is at least 85% identical, at least 90% identical, or at least 91% identical, or at least at least 92%, or identical, at least 93%, or at least 94%, or at least 95%, or at least 96%, or at least 97%, or at least 98% or at least 99% or 100% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20.
  • the nucleic acid encodes an antibody light chain whose amino acid sequence is identical in at least 85%, or identical, at least 90%, or identical, at least 91%, or identical, at least 92%, or identical, at least 93% , or at least 94% or at least 95% or at least 96% or at least 97%, or at least 98% or at least 99% or 100% identical amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 .
  • nucleic acids encoding the light and heavy chains of the invention are shown in SEQ ID NO: 19 and 21.
  • Nucleic acids encoding the variable domains of the light and heavy chains of antibodies are also of interest. Nucleic acids encoding the variable domains of the heavy and light chains of antibodies can be used for rapid fusion with nucleic acids encoding the corresponding constant domains of antibodies.
  • the nucleic acid encodes an antibody heavy chain variable domain, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the nucleic acid encodes the variable domain of the light chain of an antibody, the amino acid sequence of which is shown in SEQ ID NO: 18.
  • nucleic acids encoding the variable domains of the heavy and light chains of the antibodies shown in SEQ ID NO: 15 and 17.
  • nucleic acid molecule or “nucleic acid” is a DNA molecule, such as a genomic DNA or a DNA molecule, or an RNA molecule, such as an mRNA molecule.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a DNA (or to a DNA) molecule containing an open reading frame that encodes an antibody or antibody fragment of the present invention and is capable of under suitable conditions (e.g. physiological intracellular conditions) be used for expression in a heterologous expression system.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is obtained by genetic engineering. Methods for producing nucleic acids are well known in the art.
  • amino acid sequence information or nucleotide sequence information enables the production of the isolated nucleic acid molecules of the present invention using oligonucleotide synthesis.
  • nucleic acids that differ from each other due to the degeneracy of the genetic code can be synthesized. Methods for selecting codon variants for a desired host are well known in the art.
  • Synthetic oligonucleotides can be prepared using the phosphoramidite method, and the resulting constructs can be purified using methods well known in the art, such as high performance liquid chromatography (HPLC) or other methods as described, for example, in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, and following instructions described, for example, in the United States Dept of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the long double-stranded DNA molecules of the present invention can be synthesized as follows: several smaller fragments with the necessary complementarity can be synthesized, which contain suitable ends capable of cohesion with the adjacent fragment. Adjacent fragments can be crosslinked using DNA ligase or a PCR based method.
  • nucleic acid molecules of the present invention can also be cloned from biological sources.
  • the present invention also encompasses nucleic acids that are homologous, substantially similar, identical, or derived from nucleic acids encoding the polypeptides of the present invention.
  • nucleic acids of the invention are located in a medium different from the environment in which they are found under natural conditions, for example, they are isolated, present in an increased amount, are or are expressed in vitro systems or in cells or organisms other than those in which they are located in vivo.
  • Changes or differences in the nucleotide sequence between highly similar nucleotide sequences can represent nucleotide substitutions in the sequence that occur during normal replication or duplication. Other substitutions can be specifically calculated and inserted into the sequence for specific purposes, such as changing the codons of certain amino acids or the nucleotide sequence of a regulatory region. Such special substitutions can be made in vitro using various mutagenesis technologies or obtained in host organisms under specific breeding conditions that induce or select these changes. Such specially derived sequence variants may be called “mutants” or “derivatives” of the original sequence.
  • Mutant or derivative nucleic acids or nucleic acid variants can be obtained on a matrix nucleic acid selected from the above nucleic acids by modifying, deletion or addition of one or more nucleotides in a matrix sequence or combination thereof, to obtain a variant of the matrix nucleic acid. Modifications, additions or deletions can be performed by any method known in the art (see, for example, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; and Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199: 537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp.
  • Modifications, additions or deletions can also be performed by a method including recombination, recursive recombination of sequences, phosphotioate-modified DNA mutagenesis, mutation on a uracil-containing matrix, double-pass mutagenesis, point-mutation reductive mutagenesis, strain mutagenesis, recovery-deficient mutagenesis, radioactive mutagenesis, deletion mutagenesis, restriction-selective mutagenesis, restriction mutagenesis with purification, synthesis of artificial genes, multiple mutagenesis, the creation of chimeric multiple nucleic acids and combinations thereof.
  • Degenerate variants of nucleic acids that encode the proteins of the present invention are also provided.
  • Degenerate nucleic acid variants include substitutions of nucleic acid codons for other codons encoding the same amino acids.
  • degenerate nucleic acid variants are created to increase expression in the host cell.
  • nucleic acid codons that are not preferred or less preferred in the genes of the host cell are replaced by codons that are abundantly represented in the coding sequences of the genes in the cell- a host where said substituted codons encode the same amino acid.
  • modifications do not essentially change the properties of antibodies and their functional fragments, but can facilitate protein folding in the host cell, reduce the ability to aggregate, or modulate other biochemical properties of proteins, for example, half-life. In some embodiments, these modifications do not alter the biochemical properties of the protein. In some embodiments, these modifications result in a decrease in the immunogenicity of antibodies. All types of modifications and mutations mentioned above are carried out at the nucleic acid level.
  • the claimed nucleic acids can be isolated and obtained essentially in purified form.
  • Essentially purified form means that the nucleic acids are at least about 50% pure, usually at least about 90% pure and usually are “recombinant”, that is, flanked by one or more nucleotides with which it is usually not linked on the chromosome found naturally in its natural host organism.
  • nucleic acids that encode fusion proteins comprising the protein of the present invention, or fragments thereof, which are discussed in more detail below.
  • Nucleic acids encoding the variable domains of the invention can be operatively fused to nucleic acids encoding the corresponding constant domains of the light and heavy chains of an antibody.
  • Nucleic acids encoding the light and heavy chains of an antibody can be rapidly fused to nucleic acids encoding a leader (signal) peptide that facilitates the transport of expression products from the host cell. The leader peptide is subsequently cleaved during maturation of the polypeptide.
  • a vector and other nucleic acid constructs containing the claimed nucleic acids are also provided.
  • the term “vector” includes a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid with which it is operatively linked. Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced, while the remaining vectors can be integrated into the genome of the host cell and thus are replicated along with the host genome. Moreover, certain vectors are capable of directing the expression of genes with which they are operatively linked. Such vectors are referred to in this application as “recombinant expression vectors” (or, simply, “expression vectors” or “expression vectors”), and illustrative burial vectors are known in the art.
  • Suitable vectors include viral and non-viral vectors, plasmids, cosmids, phages, etc., preferably plasmids, and are used for cloning, amplification, expression, transfer, etc., of the nucleic acid sequence of the present invention in a suitable host.
  • the selection of a suitable vector is understandable for a qualified specialist in this field.
  • a full-length nucleic acid or part thereof is typically inserted into a vector by attachment of a DNA ligase to a restriction enzyme cleaved site in a vector.
  • the desired nucleotide sequence can be inserted by in vivo homologous recombination, usually by attaching homologous regions to a vector on the flanks of the desired nucleotide sequence.
  • Homologous sites are added by ligation of oligonucleotides or polymerase chain reaction, using primers including, for example, both homologous regions and part of the desired nucleotide sequence.
  • a vector as a rule, has an origin of replication, which ensures its reproduction in host cells as a result of its introduction into the cell as an extrachromosomal element.
  • the vector may also contain regulatory elements that provide expression of the nucleic acid in the host cell and obtain the desired polypeptide.
  • said nucleic acid is operably linked to a regulatory sequence, which may include promoters, enhancers, terminators, operators, repressors and inducers, as well as a start codon of the polypeptide.
  • the nucleic acid of the invention is also operably linked to a leader peptide that isolates the expression product from the host cell into the extracellular space.
  • the claimed polypeptides e.g., light and heavy chains of an antibody of the invention or variable domains of light and heavy chains of an antibody of the invention
  • the expression cassette may exist as an extrachromosomal element or may be incorporated into the genome of a cell by introducing said expression cassette into the cell.
  • the protein product encoded by the nucleic acid of the invention is expressed in any convenient expression system, including, for example, bacterial systems, yeast, plants, insects, amphibians, or mammalian cells.
  • the target nucleic acid is operatively linked to regulatory sequences, which may include promoters, enhancers, termination sequences, operators, repressors and inducers, as well as the start codon of the polypeptide.
  • the nucleic acid of the invention is also operably linked to a leader peptide that isolates the expression product from the host cell into the extracellular space.
  • a leader peptide that isolates the expression product from the host cell into the extracellular space.
  • the above expression systems can be used in prokaryotic or eukaryotic hosts.
  • host cells such as E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, insect cells in combination with baculovirus vectors, or higher cells, such as yeast cells, plant cells, vertebrate cells, mammalian cells, can be used.
  • human cells e.g. CHO cells (e.g., ATCC CRL-9096), NS0 cells, SP2 / 0 cells, HEK293 cells, COS cells (e.g., ATCC CRL-1650, CRL-1651) and HeLa (e.g., ATCC CCL-2 )
  • a host cell is transformed with an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody light chain and an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody heavy chain.
  • an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody light chain and an expression vector comprising a nucleic acid encoding an antibody heavy chain.
  • a single expression vector is used in which nucleic acids encoding both the light and heavy chains of an antibody are inserted.
  • the expression vector (s) encoding the heavy and light chains are transformed (co-transformed) into a host cell such that the light and heavy chains are expressed in the host cell and are preferably secreted in the medium in which the host cells are cultured, antibodies can be isolated from this medium.
  • transformation are intended to include a wide range of methods commonly used for introducing exogenous DNA into a prokaryotic or eukaryotic host cell, for example, electroporation, precipitation with calcium phosphate, transfection with DEAE-dextran, etc., as described by Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989; Ausubel FM et al. (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989).
  • the antibodies When recombinant expression vectors containing nucleic acids of an antibody are introduced into the host cells, the antibodies are formed by culturing the host cells for a period of time sufficient to express the antibody in the host cell, or (more preferably) secreting the antibody into the culture medium, which host cells are grown.
  • Antibodies can be isolated from the culture medium using standard protein purification methods. Culturing conditions for various cells are well known to those skilled in the art and are described, for example, in Current Protocols in Cell Biology, ed. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. and Yamada K.M., John Wiley & Sons, Inc., 2000.
  • the resulting replicated nucleic acid, expressed protein or polypeptide is within the scope of the invention as a product of the host cell or organism.
  • the product may be isolated by a suitable method known in the art.
  • Cell lines that stably express the proteins of the present invention can be selected by methods known in the art (e.g., co-transfection with a selectable marker, such as dhfr, gpt, neomycin, hygromycin, which makes it possible to identify and isolate transfected cells that contain gene included in the genome).
  • the nucleic acid molecules of the present invention can also be used to determine gene expression in a biological sample.
  • a method in which cells are examined for the presence of specific nucleotide sequences, such as genomic DNA or RNA, is well established in the art. Briefly, DNA or mRNA is isolated from a cell sample. mRNA can be amplified by RT-PCR using reverse transcriptase to form a complementary strand of DNA, followed by amplification using a polymerase chain reaction using primers specific for the declared DNA sequences. Alternatively, the mRNA sample is separated by gel electrophoresis, transferred to a suitable carrier, for example, nitrocellulose, nylon, etc., and then tested with a fragment of the claimed DNA as a sample.
  • a suitable carrier for example, nitrocellulose, nylon, etc.
  • oligonucleotide crosslinking assays such as in situ hybridization and hybridization with DNA probes immobilized on a solid chip. Detection of mRNA hybridizing with the claimed sequence indicates gene expression in the sample.
  • the antibody or active fragment thereof of this invention is used in the treatment of disorders that are associated with the activity of pathological T-lymphocytes bearing on the surface of TCR family TRBV9, for example, with the activity of autoimmune T-lymphocytes in AS, celiac disease, T-cell lymphomas.
  • the term "patient” in this application refers to a mammal, including, but not limited to, mice, monkeys, humans, mammals, farm animals, mammals, sports animals and mammals of domestic animals; preferably, the term refers to people.
  • the patient is further characterized by a disease or disorder, or condition, mediated by the presence of TCR in his body, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family.
  • TCR whose beta chain belongs to the TRBV9 family
  • AS and celiac disease can be associated with the development of a number of blood diseases, such as T cell lymphoma caused by the Epstein-Barr virus.
  • co-administration refers to or include:
  • An antibody of the invention may be administered without additional therapeutic treatment, i.e. as an independent therapy.
  • the antibody treatment of this invention may include at least one additional therapeutic treatment (combination therapy).
  • the antibody may be co-administered or formulated with another medication / drug for an autoimmune or oncological disease in the pathogenesis of which TCRs containing the beta chain are involved TRBV9, for example, AS, celiac disease, T-cell lymphoma, T-cell leukemia.
  • the antibody of this invention will be administered in an amount effective to treat the condition in question, i.e. in doses and for periods of time necessary to achieve the desired result.
  • the therapeutically effective amount may vary depending on factors such as the particular condition being treated, the patient’s age, gender and weight, and whether the administration of the antibody is an independent treatment or in combination with one or more additional immunosuppressive or anti-inflammatory methods treatment.
  • Drug regimens can be adjusted to provide the optimal desired response. For example, a single bolus may be administered, several divided doses may be administered over time, or the dose may be proportionally reduced or increased depending on the severity of the therapeutic situation. Particularly useful is the manufacture of parenteral compositions in unit dosage form for ease of administration and uniformity of dosage.
  • the unit dosage form refers to physically discrete units suitable as unit doses for patients / subjects to be treated; each unit contains a predetermined amount of the active compound, calculated to produce the desired therapeutic effect in combination with the desired pharmaceutical carrier.
  • unit dosage forms of the present invention is generally dictated and directly depends on (a) the unique characteristics of the chemotherapeutic agent and the particular therapeutic or prophylactic effect to be achieved, and (b) the limitations inherent in the compounding technique of such an active compound to treat sensitivity in subjects.
  • the dose and dosage regimen are adjusted in accordance with methods well known in the therapeutic field.
  • the maximum tolerated dose can be easily set and an effective amount can also be determined to provide a detectable therapeutic effect for the patient, as well as the time requirements for the administration of each agent to achieve a visible therapeutic effect for the patient.
  • some dosages and regimen regimens are given as examples herein, these examples in no way limit the dosages and modes of administration that may be necessary for a patient to practice using the present invention.
  • dosage values may vary, depending on the type and severity of the condition, which should be alleviated, and may include one or more doses.
  • specific administration schemes should be adjusted after some time according to individual needs and at the discretion of the medical professional who administers or controls the administration of the compositions, and that the concentration ranges given in this description are only given as an example and are not intended to limit the scope or practice of the claimed compositions.
  • the dosage regimen with the compositions of this invention can be based on various factors, including the type of disease, age, weight, gender, patient health status, severity of the condition, route of administration, and the specific antibody used. Thus, the dosage regimen can vary widely, but can be determined regularly using standard methods.
  • doses may be adjusted based on pharmacokinetic and pharmacodynamic parameters, which may include clinical effects, such as toxic effects or laboratory values.
  • the present invention encompasses an individual dose increase, which is determined by a qualified specialist. Determination of the required dose and modes are well known in the relevant field of technology and will be clear to a person skilled in the art after familiarization with the ideas disclosed herein.
  • a suitable dose of an antibody of the invention will be in the range of 0.1-200 mg / kg, preferably 0.1-100 mg / kg, including about 0.5-50 mg / kg, for example, about 1- 20 mg / kg.
  • An antibody can be administered, for example, at a dose of at least 0.25 mg / kg, for example at least 0.5 mg / kg, including at least 1 mg / kg, for example at least 1, 5 mg / kg, for example, as well as at least 2 mg / kg, for example at least 3 mg / kg, including at least 4 mg / kg, for example at least 5 mg / kg; and, for example, up to a maximum of 50 mg / kg, including up to a maximum of 30 mg / kg, for example, up to a maximum of 20 mg / kg, including up to a maximum of 15 mg / kg.
  • compositions for example, once a week, once every two weeks, once every three weeks, or once every four weeks, and for as long as it is deemed appropriate by the responsible physician, who may in some cases increase or reduce the dose if necessary.
  • An antibody of the invention may be included in a pharmaceutical composition suitable for administration to a patient.
  • Antibodies of the invention may be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or excipient in single or multiple doses.
  • the pharmaceutical compositions for administration are designed to meet the selected mode of administration, and pharmaceutically acceptable diluents, carriers and / or excipients such as dispersing agents, buffers, surfactants, preservatives, solubilizing agents, isotonic agents, stabilizers, etc. . used properly.
  • compositions are developed in accordance with traditional methods described in, for example, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, which describes various methods for preparing the compositions, generally known to specialists.
  • “Medicinal product (preparation)” a substance or mixture of substances in the form of a pharmaceutical composition in the form of tablets, capsules, powders, lyophilisates, injections, infusions, ointments and other formulations intended to restore, correct or alter physiological functions in humans and animals as well as for the treatment and prevention of diseases, diagnostics, anesthesia, contraception, cosmetology and other things. Any method of administering peptides, proteins, or antibodies adopted in the art can be suitably used for an antibody of the invention.
  • pharmaceutically acceptable means one or more compatible liquid or solid components that are suitable for administration to a mammal, preferably a human.
  • excipient or “excipient” is used herein to describe any component other than previously described in this invention. These are substances of inorganic or organic origin, used in the production process, the manufacture of drugs to give them the necessary physical and chemical properties.
  • buffer By the term “buffer”, “buffer composition”, “buffer agent” is meant a solution capable of maintaining a pH value due to the interaction of the acid and alkaline components included in its composition, which allows the antibody preparation to be resistant to pH changes. In general, pH values of the pharmaceutical composition of 4.0 to 8.0 are preferred.
  • buffering agents for example, acetate, phosphate, citrate, histidine, succinate and the like can be used. buffer solutions, but not limited to them.
  • tonic agent refers to an excipient that can apply the osmotic pressure of a liquid antibody preparation.
  • An “isotonic” drug is a drug that has an osmotic pressure equivalent to that of human blood. Isotonic preparations typically have an osmotic pressure of about 250 to 350 mOsm / kg.
  • isotonic agents polyols, mono- and disaccharides, amino acids, metal salts, for example, sodium chloride, etc., can be used, but not limited to.
  • stabilizer is meant an auxiliary substance or a mixture of two or more auxiliary substances that provide the physical and / or chemical stability of the active agent.
  • amino acids can be used, for example, arginine, histidine, glycine, lysine, glutamine, proline, but not limited to them; surfactants, e.g.
  • Polysorbate 20 (trade name Tween 20), Polysorbate 80 (trade name Tween 80), polyethylene-polypropylene glycol and its copolymers (trade names Poloxamer, Pluronic), sodium dodecyl sulfate (SDS ), but not limited to them; antioxidants, for example, methionine, acetylcysteine, ascorbic acid, monothioglycerol, salts of seric acids, and the like, but not limited to; chelating agents, for example, but not limited to ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), sodium citrate and the like.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DTPA diethylene triamine pentaacetic acid
  • the pharmaceutical composition is “stable” if the active agent retains its physical stability and / or chemical stability and / or biological activity during the stated shelf life at a storage temperature, for example, at 2-8 ° C.
  • the active agent retains both physical and chemical stability as well as biological activity.
  • the storage period is selected based on the results of stability studies during accelerated and natural storage.
  • a pharmaceutical composition containing a monoclonal antibody of the invention can be administered to a patient having pathologies as described herein using standard administration methods, including oral, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, pulmonary, transdermal, intramuscular, intranasal, buccal, sublingual or using suppositories.
  • the pharmaceutical composition of the invention preferably contains or is a “therapeutically effective amount” of an antibody of the invention.
  • a “therapeutically effective amount” refers to an amount effective at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired therapeutic result.
  • a therapeutically effective amount of an antibody may vary depending on factors such as the condition of the disease, the age, gender and weight of the individual, and the ability of the antibody or part of the antibody to elicit the desired response in the individual.
  • a therapeutically effective amount is also an amount in which the therapeutically beneficial effect of the antibody prevails over the toxic or harmful effect.
  • a “prophylactically effective amount” refers to an amount effective at dosages and for periods of time necessary to achieve the desired prophylactic result. Since a prophylactic dose is used for individuals before or at an early stage of the disease, typically a prophylactically effective amount may be less than a therapeutically effective amount.
  • a therapeutically effective or prophylactically effective amount is at least the minimum dose, but less than the toxic dose of the active agent, necessary to provide therapeutic benefits to the patient.
  • a therapeutically effective amount of an antibody of the invention is an amount that, in mammals, preferably humans, reduces the biological activity of autoimmune clones, for example, by binding to TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, where the presence of these clones causes or contributes to undesirable pathological effects, or decreased levels of TCR, the beta chain of which belongs to the TRBV9 family, causes a beneficial therapeutic effect in a mammal, preferably a human.
  • the route of administration of the antibodies of the invention may be oral, parenteral, by inhalation, or topical.
  • antibodies of the invention may be incorporated into a pharmaceutical composition suitable for parenteral administration.
  • parenteral as used in this application includes intravenous, intramuscular, subcutaneous, rectal, vaginal or intraperitoneal administration.
  • Advantageous is the introduction by intravenous or intraperitoneal, or subcutaneous injection. Suitable carriers for such injections are directly known in the art.
  • compositions must be sterile and stable under the conditions of manufacture and storage in a container that is provided, including, for example, a hermetically sealed vial (ampoule) or syringe. Therefore, pharmaceutical compositions can be sterile filtered after preparation, or otherwise made microbiologically suitable.
  • a typical composition for intravenous infusion may have a volume of 250-1000 ml of liquid, such as sterile Ringer's solution, physiological saline, dextrose solution and Hank's solution, and a therapeutically effective dose (for example, 1-100 mg / ml or more) of antibody concentration. The dose may vary depending on the type and severity of the disease.
  • the dosages for any of the patients depend on many factors, including patient size, body surface area, age, specific compound to be administered, gender, time and route of administration, general health and other medications that are administered simultaneously.
  • a typical dose may be, for example, in the range of 0.001-1000 ⁇ g; however, doses below or above this illustrative range are anticipated, especially given the above factors.
  • the dosage regimen of daily parenteral administration may be from 0.1 ⁇ g / kg to 100 mg / kg of total body weight, preferably from 0.3 ⁇ g / kg to 10 mg / kg, and more preferably from 1 ⁇ g / kg to 1 mg / kg, even more preferably from 0.5 to 10 mg / kg of body weight per day.
  • the treatment process can be monitored by periodically evaluating the patient's condition. For repeated administration over several days or longer, depending on the condition of the patient, the treatment is repeated until the desired response is achieved or the symptoms of the disease are suppressed.
  • other dosage regimens that are not described in this application may also be used.
  • the desired dosage may be administered by single-pole administration, multiple bolus administrations, or by continuous infusion of an antibody, depending on the pharmacokinetic decay sample that the practitioner wants to achieve.
  • the therapeutic agents of the invention can be frozen or lyophilized and reconstituted before use in a suitable sterile vehicle. Lyophilization and recovery can lead to varying degrees of loss of antibody activity. Dosages may be adjusted to compensate for this loss. In general, pH values of the pharmaceutical composition of 6 to 8 are preferred.
  • a further embodiment of the invention is a product that contains products used to treat autoimmune diseases and related conditions and malignant blood diseases, in the pathogenesis of which are involved TKRs carrying the beta chain of the TRBV9 family.
  • diseases include, for example, AS, celiac disease, T-cell leukemia, T-cell lymphoma and others.
  • the product is a container with a label and a leaflet, which can be placed in a blister and / or pack.
  • Suitable containers are, for example, vials, ampoules, syringes, etc.
  • Containers can be made of various materials, such as glass or polymeric materials.
  • the container contains a composition effective to treat a particular condition, and may have a sterile inlet channel). At least one active ingredient in the composition is an antibody of the invention.
  • the label and package insert indicate that the drug is used to treat a specific condition.
  • the label and / or package leaflet must additionally contain instructions for administering the antibody composition to the patient, including information on the indications, use, dose, route of administration, contraindications and / or precautions regarding the use of such therapeutic products.
  • the package insert indicates that the composition is used for treatment to indicate what.
  • the product may include other products necessary from a commercial point of view and from the point of view of the consumer, for example, but not limited to solvents, diluents, filters, needles and syringes.
  • the invention also relates to kits that can be used for various purposes, for example, to assess the ability to destroy T cells carrying TKR family TRBV9, for purification or immunoprecipitation of the TRBV9 receptor from cells.
  • the kit may contain an antibody bound to granules (e.g., sepharose granules).
  • the kit contains a container and a label and a package leaflet.
  • the antibodies of the present invention are also used for diagnostic purposes (e.g., in vitro, ex vivo).
  • an antibody can be used to detect or measure the level of T lymphocytes containing TRBV9 TCR family in samples obtained from a patient, for example, a tissue sample or a sample of body fluid, such as inflammatory exudate, blood, intestinal fluid, saliva or urine.
  • Suitable detection and measurement methods include immunological methods such as flow cytometry, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescent analysis, radioimmunoassay and immunohistology.
  • the invention further includes kits, for example, diagnostic kits containing the antibodies described herein.
  • variable domains of the heavy and light chains of the antibody aHTn-TRBV9-2 As the parent (reference) sequences of the variable domains of the heavy and light chains of the antibody aHTn-TRBV9-2, the amino acid sequences of which are shown in SEQ ID Nos: 8 and 10 were used.
  • variable domains of the heavy and light chains were compared with a pool of germline sequences of the variable domains of human immunoglobulins, germline sequences of the variable domains of rat immunoglobulins, sequences of mature human and rat antibodies obtained both from open sources and from a donor library provided by Biocad ( Russia). For analysis, we used the Ylab software package (Biocad, Russia).
  • the humanized nucleotide sequences HCVR and LCVR (SEQ ID Nos: 15 and 17) were synthesized de novo and cloned into pEE-HC, pEE-SK vectors, IgGl format (Xu et al. Front. Chem. Sci. Eng. 2015, 9 ( 3): 376-380) at the restriction sites Sall / Nhel and Sall / BsiWI, respectively.
  • the nucleic acid sequences of the light and heavy chains obtained were verified by Senger sequencing.
  • the MA-043 antibody was selected, the amino acid and nucleotide sequences of the light and heavy chains of which are shown in SEQ ID Nos: 19-22.
  • the MA-043 antibody includes the variable domains of the heavy and light chains that have the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 16 and 18.
  • the degree of humanization of the variable domain of the heavy chain of the MA-043 antibody was 84%, and the degree of humanization of the variable domain of the light chain was 85% (Table 1).
  • the constant domain of the heavy chain is represented by the IgGl allotype Gm3 format.
  • Example 2 Obtaining a recombinant antibody and determining its affinity
  • the vectors containing nucleic acids encoding the light and heavy chains of the MA-043 antibody, obtained as described in Example 1, were obtained in E.coH cells and purified using a plasmid DNA purification reagent manufactured by Qiagen (Germany) and used for transfection cell line CHO-Fut8 using linear polyethyleneimine (PEI "MAX", "Polysciences", USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the resulting reaction mixtures were incubated at 37 ° C on a rocking chair. 9 days after transfection, the culture fluid was separated from the cells by filtration through a filter with a pore size of 0.5 / 0.22 ⁇ m.
  • the culture fluid was used to isolate antibodies using affinity chromatography on 0.2 ml PreDictor RoboColumn MabSelect SuRe columns (GE Healthcare, USA), balanced with phosphate-buffered saline (FSB, pH 7.4). Then the column was washed with 5 volumes of FSB. The carrier-bound protein was eluted using 0.1 M pH 3 glycine buffer. The main peak containing protein was collected and the pH adjusted to neutral with 1 M Tris buffer (pH 7.5). All stages were carried out at a flow rate of 110 cm / h. Next, the protein was transferred to PBS (pH 7.4) using dialysis, filtered through a 0.22 ⁇ m filter, transferred to new sterile tubes. The quality of the release was evaluated using 12% PAAG electrophoresis under denaturing conditions.
  • Quantification was carried out using measurements on a NanoDrop2000 microspectrophotometer at 280A.
  • the isolated protein was stored at -70 ° C.
  • Determination of antibody affinity was performed on an OctetRed 96 instrument (ForteBio, USA).
  • Antigen at a concentration of 20 ⁇ g / ml was immobilized on the surface of AR2G sensors (ForteBio) according to the standard protocol according to the manufacturer's instructions.
  • Analysis carried out at 30 ° C using FSB containing 0.1% Tween-20 and 0.1% BSA as a working buffer. After the baseline was prescribed in the buffer solution, the sensors were immersed in wells with an antibody solution for 300 sec, where the complex was associated. Then, the dissociation of the complex in the buffer solution was detected for 600 seconds.
  • the binding curves with the deduction of the reference signal were analyzed using the Octet Data Analysis software (version 9.0) according to the standard procedure using the 1: 1 Global interaction model.
  • Example 3 Obtaining a cell line stably producing antibody e IgGl format, and the production of antibodies.
  • the heavy and light chain sequences of the MA-043 antibody were obtained as described in Example 1 and cloned into pSX vectors at the Hindlll, Xbal restriction sites.
  • the obtained plasmids were obtained in E. coli cells and isolated using a BenchPro 2000 device (Life Technology, USA) according to the manufacturer's instructions in the amount of 600-700 ⁇ g. Plasmids were linearized overnight using Pvul endonuclease, then ethanol precipitated, the precipitate was dissolved in water, the concentration in the final volume was 900-1100 ng / ⁇ l.
  • the CHO-K1-S cell line was cultured in Ham's F12 Gibco medium (Thermo, USA).
  • Transfection with genetic constructs containing MA-043 coding sequences was performed by electroporation on a Nucleofector TM instrument (Lonza, Switzerland) according to the manufacturer's protocol. The next day after transfection, antibiotic selection of transfected cells was performed for 24 days by adding puromycin (final concentration of 7.2 ⁇ g / ml) and hygromycin B (final concentration of 640 ⁇ g / ml) to the medium. Then, homogeneous in structure antibiotic-resistant cell clones expressing at a high level of MA-043 were selected.
  • the preclinical monoclonal antibody MA-043 was produced in a 50 L HyClone single-use bioreactor fermenter (Thermo Fisher Scientific). Removal of producer cells from the culture fluid was performed using a Millistak C0HC depth filter (Merck-Millipore, USA). The primary purification of the antibody from the clarified culture fluid was carried out on an affinity sorbent with protein A. Specific elution of the target protein was carried out under acidic conditions of pHZ.Z-Z.8 in glycine buffer. The resulting eluate was kept at an acidic pH for 30-60 minutes for viral inactivation, and then neutralized with a 1M Tris-HCl solution to a pH of 6.5-7.0.
  • the final chromatographic purification in slip mode was performed on a CaptoAdhere sorbent (GE Healthcare LifeSciences, USA). For this, the protein solution was passed through a prepared sorbent, balanced with Tris buffer with a pH of 6, 5-7.0 at a low conductivity value ( ⁇ 3 mS / cm 2 ).
  • the purified protein was subjected to antiviral filtration using a Viresolve PRO filter kit (Millipore, USA), concentration and diafiltration against a final buffer containing acetate buffer (pH 5, 0-5, 5) and trehalose.
  • Example 4 The use of antibodies for specific binding to a fragment of the beta chain of the T cell receptor family of receptors TRBV9
  • Antibodies were labeled with fluorescein using the fluorescein isothiocyanate reagent (Sigma, USA) according to the manufacturer's protocol.
  • the number of fluorophores that reacted with the antibody molecules was controlled by the ratio of the absorption spectrum at wavelengths of 495/280 nm.
  • T lymphocytes were obtained from the peripheral blood of a healthy donor. Blood was collected in Vacuette tubes with EDTA (2x9 ml each), the mononuclear fraction according to the standard procedure described in (Kovalchuk L.V. et al. Immunology: Workshop - 2010. - 176 p.). After isolation, cells were transferred to phosphate-buffered saline (PBS) containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 2 mM EDTA. The total number of cells and their viability was determined by the method of staining with trypan blue as described by Lang N.R. (Stimulation of lymphocytes M.: Medicine, 1976.-288 s).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • RNA samples obtained in duplicate from populations “TRBV9 +” and “TRBV9-” were used to isolate total RNA and sequence sequencing of TCR beta chains.
  • the obtained cell fractions were placed in an RLT buffer (Quagen, Germany) and RNA was isolated from them using the Quiagen RNAeasy mini kit # 217004 reagent kit (Quagen) according to the manufacturer's protocol. Fragments of the beta-chain of the T receptor were synthesized to DNA on an isolated RNA matrix according to the protocol described by Britanova et al (J Immunol, 2016, 196 (12) 5005-5013) using the Mint cDNA synthesis kit (Eurogen, Russia).
  • Illumina adapters USA were ligated to the developed amplicons and sequenced on the MiSeq Illumina platform according to sequencer manufacturer protocol. Sequencing data was analyzed using the programs MiGEC, MiXCR and VDJtools, presented on the website on the Internet: https://milaboratory.com. An analysis of the obtained repertoires of TCR beta chains showed that the libraries obtained by sorting using the MA-043 antibody were enriched by 91% sequences that were encoded by the TRBV9 gene segment. Whereas in the repertoires of beta chains of the negative fraction “TRBV9-”, sequences containing TRBV9 were not found.
  • Monoclonal antibody MA-043 was obtained as described in Example 3.
  • a mononuclear fraction of human blood was obtained as described in Example 4.
  • NK cells were isolated from a portion of the mononuclear fraction using a reagent kit for the isolation of human NK cells # 130-092-657 (Miltenyi biotec, USA). Used the manufacturers protocol. The quality of NK cell isolation was assessed by cytofluometry (BD FACS ARIA III, USA) using labeled antibodies CD16-FITC, CD56-PE, CD3-VioBlue. Enrichment of NK cells was 85-95%.
  • an MA-043 antibody was added to an aliquot of a mononuclear fraction containing 1 x 10 6 cells to a final concentration of 500 ng / ml. Remicade antibodies in the same concentration as MA-043 were used as a negative control. Antibodies were not added to the control aliquot of cells (positive control). Also, 10 5 NK cells were added to all reaction mixtures. The final reaction volume was 100 ⁇ l. The reaction mixtures were incubated at room temperature for one hour, then the cells were washed several times from antibodies and spread into the wells of a 96-well round bottom plate on the table.
  • T lymphocytes After 6 days, cells were harvested from the wells and used for immunophenotypic analysis using flow cytometry. The following antibodies were used to detect T lymphocytes: anti-CD3-eFluor450 (OCTZ clone, eBioscience); anti-CD8-PC7 (clone SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, USA); MA-043, labeled Fite.
  • anti-CD3-eFluor450 OCTZ clone, eBioscience
  • anti-CD8-PC7 clone SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, USA
  • MA-043, labeled Fite MA-043, labeled Fite.
  • CD3 + MA-043 + T lymphocytes were not detected in samples incubated with the MA-043 antibodies of the present invention.
  • the target population of CD3 + CD6 + did not change compared to the “zero control”. This indicates that screening of the epitope by unlabeled antibodies on day 6 does not occur and confirms the ability of MA-043 antibodies to eliminate cells bearing TCR family TRBV9.
  • Example 6 Obtaining a pharmaceutical composition containing an antibody according to the invention
  • the pharmaceutical composition was prepared by standard methods known in the art.
  • the components of the pharmaceutical composition are shown in Table 3. Table 3. The concentration of the components of the pharmaceutical composition
  • Example 7 Kit containing a pharmaceutical composition with antibodies
  • kits with a dosage form containing a composition with MA-043 antibody the pharmaceutical composition obtained according to example 6 is sealed in 1 ml ampoules or syringes under sterile conditions, labeled and packaged in containers made of plastic or cardboard material.
  • instructions for use are placed in the container with the ampoule.
  • Sly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Sly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
  • Leu Slo lie Ser Asn Leu Lys Asn Slu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
  • caggtgcasc ttgttcsgtc ggggcctgaa cttaagaagc caggggaaag tgtaaagtg 68 agetgcaaag cctcaggcta cacgtttacc gattatcttg tgcattgggt tagaca gct 128 ccaggtaagg gactggaatg gatgggatgg atcaatacct ataeagggac acccacatat 288 gccgatgact tigagggacg gtttgtcttc tcacttgata ccagtgcgtc csctgctaac 248 ctccagatat gcagcctgaa gaatgaggac acegecacct attactgcgc ccgatcatgg 388 aggagaggcc t3cgagg
  • Sly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ale Asp Asp Phe
  • Sly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Sly Thr Pro Thr Tug Ala Asp Asp Ph “50 55 68

Abstract

Изобретение относится к моноклональному гуманизированному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с семейством TRBV9 Т-клеточных рецепторов человека. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с семейством Т-клеточных рецепторов человека. Изобретение направлено на создание антител, которые могут быть использованы для терапии, в частности, анкилозирующем спондилите (АС или болезнь Бехтерева), целиакии и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР семейства TRBV9.

Description

Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 ТКР человека, и способы их применения
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и биомедицины а именно к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, а также их применению. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному гуманизированному антителу, которое специфически связываются с семейством Т-клеточных рецепторов человека. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вектору экспрессии, способу получения антитела и применению антитела для лечения заболеваний или нарушений, связанных с семейством Т-клеточных рецепторов человека.
Предшествующий уровень техники
Причиной возникновения аутоиммунных заболеваний являются аутореактивные Т лимфоциты (Haroon N et al, Arthritis Rheum. 2013 Oct;65(10):2645-54., Duarte J. et al., PloS One 2010 May 10;5(5):el0558; Konig M. et al., Front Immunol 2016 Jan 25;7 : 11). Из уровня техники известно, что маркером, позволяющим идентифицировать клон Т-лимфоцитов, вовлеченный в патогенез аутоиммунного заболевания, является последовательность Т-клеточного рецептора (ТКР). Субъединицы Т- клеточных рецепторов структурно относятся к суперсемейству иммуноглобулинов и формируются из нескольких генных сегментов. Вариабельные участки ТКР образуют антигенсвязывающий центр ТКР. Это означает, что они клоноспецифичны, т.е. отличаются у Т-лимфоцитов, реагирующих на разные антигены. По аминокислотной гомологии вариабельных (V) генных сегментов, входящих в состав вариабельного домена ТКР, Т-клеточные рецепторы подразделяют на различные семейства. Согласно номенклатуре IMGT для бета цепи выделяют 26 различных семейств, а для альфа цепи - 41 семейство (Turner SJ et al., Nature Reviews Immunology 2006, V.6, 883-894). Для определения семейства цепи ТКР используют множественное выравнивание тестируемой аминокислотной последовательности с известными последовательностями цепей ТКР, информация о которых суммирована в базе данных IMGT («The international ImMunoGeneTics information system», Lefranc М-P., Nucl Acids Res 2001 ; 29:207-209), доступной в сети Интернет по адресу http://www.imgt.org. Множественное выравнивание и определение семейства цепи ТКР может быть осуществлено с помощью пакета программ IgBlast.
Описаны моноклональные антитела W112 и 2D1 к участкам бета цепи вариабельных доменов Т-рецептора человека, относящихся к семействам TRBV5-3 TRBV8-1 (W09006758), предложенные в качестве инструмента для диагностики и терапии ревматоидного артрита. Данные моноклональные антитела узнают соответственно 0.3-5% периферических Т лимфоцитов, несущих TRBV5-3 и 0.5-13% периферических Т лимфоцитов, несущих TRBV8-1. Основанием для использования моноклональных антител специфичных к участкам бета цепей Т-рецепторов послужили результаты многих исследований, демонстрирующие вовлеченность Т-лимфоцитов в патогенез ревматоидного артрита. В частности, данные статьи F.M. Brennan et al., Clin Exp Immunol. 1988 Sep; 73(3): 417-423, где было продемонстрировано увеличение процентного содержания Т-лимфоцитов, несущих TRBV5 TRBV8 в синовиальных образцах пациентов, страдающих ревматоидным артритом по сравнению со здоровыми донорами. Так же для диагностики и терапии ревматоидного артрита описаны моноклональные антитела, взаимодействующие с эпитопом вариабельной области VB3.1 Т-клеточного рецептора человека (W09405801), которые взаимодействуют с подсемейством ТКР У(бета)3.1.
Так же описаны моноклональные антитела, специфично узнающие бета цепь 13-го семейства ТРК крысы. На модельных животных показано, что с помощью этих антител возможно превентивное удаление небольшой популяции Т-клеток, Т-рецептор которых содержит бета цепь VB13 (VB13+ Т клетки), и показано, что такая процедура защищает от развития диабета I типа у крыс предрасположенной к этому заболеванию линии, а также значительно снижает риск развития вирус-индуцированного диабета (Zhijun Liu et al., Diabetes. 2012 May; 61(5): 1160-1168.). В то же время, удаление Т клеток, Т-рецептор которых содержит другое семейство бета цепи (VB16), не отличается по результату от контрольных групп. Важно отметить, что уже первое введение моноклонального антитела против VB13 приводит к 60% снижению количества VB13+ Т клеток в селезенке крыс.
Описан консенсусный вариант аутоиммунных ТКР при анкилозирующем спондилите (АС или болезнь Бехтерева), показано, что он представлен у больных АС в синовиальной жидкости и периферической крови и отсутствует при той же глубине анализа у здоровых доноров независимо от статуса по аллелю HLA*B27 (Faham М. et al., Arthritis Rheumatol. 2017;69(4):774-784; Komech E et al. 12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference; 2016 Sep 3-7; Strbske Pleso, Slovakia. Abstract book p. 39). Указанные ТКР относятся к TRBV9 семейству (согласно номенклатуре IMGT). Показано, что Т-клеточные рецепторы, несущие бета цепи семейства TRBV9, вовлечены также в развитие такого аутоиммунного заболевания как целиакия (Petersen J et al., J Immunol. 2015; 194(12): 6112- 22). Также они обнаруживаются на поверхности Т клеток, подверженных маглинизации в случае Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий, в том числе Т-клеточной лимфомы, вызванной вирусом Эпштейн-Барр (EBV) (Toyabe S et al., Clin Exp Immunol. 2003; 134(1): 92-97). Недавно описаны химерные моноклональные антитела, обладающие способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека, которые могут использоваться при терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, АС, целиакии и некоторых Т-клеточных лимфом и Т-клеточных лейкемий (заявка на изобретение РФ 2017145662).
Указанные антитела являются единственными известными сегодня антителами, которые могут быть использованы для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9. Основным недостатком указанных антител является их относительно низкая степень гуманизации - они содержат свойственные человеку константные области и структурные компоненты, но имеют вариабельный домен, свойственный крысе. Степень гуманизации вариабельного фрагмента тяжелой цепи указанных антител составляет 72%, а вариабельного фрагмента легкой цепи - 69%.
Вышеуказанное родительское моноклональное антитело, включает:
1) вариабельный домен их тяжелой цепи (VH), который содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где
HCDR1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2
HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;
2) вариабельный домен их легкой цепи (VL), который содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1 , LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,
LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,
LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Вышеуказанное родительское моноклональное антитело, включает вариабельные домены тяжелой и лёгкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 8 и 10.
Вышеуказанное родительское моноклональное антитело, включает легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12 и тяжелую цепь антитела, которая имеет аминокислотную последовательность - SEQ ID NO: 14.
Примеры нуклеотидных последовательностей, кодирующих указанные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей вышеуказанного родительского антитела, приведены в SEQ ID NOs: 13 и 11.
Изобретение направлено на создание моноклонального антитела, которое может быть использовано для элиминации Т-клеток, несущих ТКР семейства TRBV9, в частности, для терапии АС, целиакии и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР семейства TRBV9, и которое отличается высокой степенью гуманизации. Гуманизация в тоже время часто приводит к критическому снижению аффинности и/или растворимости антител. Таким образом, получение гуманизированных функциональных антител является актуальной задачей.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к гуманизированному моноклональному антителу и его антигенсвязывающему фрагменту, которые обладают способностью с высокой аффинностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека. Антитело, согласно изобретению, может использоваться в качестве лекарственного средства для лечения аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, АС, целиакии и некоторых Т-клеточных лимфом и Т- клеточных лейкемий.
В преимущественных воплощениях антитело настоящего изобретения содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с тремя гипервариабельными участками
1) HCDR 1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
2) HCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 2
3) HCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;
2) вариабельный домен легкой цепи (VL) с тремя гипервариабельными участками LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,
LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,
LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Здесь и далее при определении CDR антител используется известная номенклатура Kabat, если отдельно не оговорено иное.
При этом вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.
В преимущественных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16 и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 8, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела. В преимущественных воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 10, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.
В некоторых воплощениях моноклональные антитела по изобретению являются полноразмерными антителами IgG человека, например, IgGl или IgG2 или IgG3 или IgG4.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает легкую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22. В некоторых воплощениях антитело имеет легкую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 22, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 20.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют вариабельные домены тяжелой и легкой цепи антитела согласно изобретению, нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи антител согласно изобретению и функциональные фрагменты антител.
Также обеспечиваются кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Вектор или кассета экспрессии могут находиться в клетке-хозяине как внехромосомный элемент или интегрироваться в геном клетки в результате введения (путем трансфекции) указанной кассеты экспрессии или вектора в клетку.
Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения, и способы их получения.
Также обеспечивается способ получения вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, заключающийся в культивировании вышеуказанной клетки-хозяина в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела. В некоторых воплощениях способ включает последующее выделение и очистку полученного антитела.
Также обеспечивается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами .
В одном из вариантов фармацевтическая композиция предназначена для профилактики или лечения заболевания или нарушения, выбранного из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т- клеточная лимфома.
Также обеспечивается фармацевтическая комбинация для профилактики или лечения заболевания, или нарушения, опосредуемого Т- клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, содержащая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и, по меньшей мере, одно другое терапевтически активное соединение.
В одном из вариантов фармацевтическая комбинация предназначена для профилактики или лечения заболевания, или нарушения, выбранного из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т- клеточная лимфома.
В одном из вариантов фармацевтическая комбинация или композиция включает другое терапевтически активное соединение, которое выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов, например, кортикостероидов .
Также обеспечивается способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Также обеспечивается способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве.
В одном из вариантов способа лечения заболевания или нарушения, заболевание или нарушение выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Также обеспечивается применение вышеуказанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9.
В одном из вариантов применения, заболевание выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
Технический результат настоящего изобретения состоит в получении антител с повышенной степенью гуманизации, которые специфически с высокой аффинностью связываются с ТКР, бета цепь которых относится к TRBV9 семейству и могут быть использованы для терапии аутоиммунных и онкологических заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, бета цепь которых относится к TRBV9 семейству.
В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 84%. В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент легкой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 85%.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т- рецептора человека с повышенной степенью гуманизации относительно аналогов.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их фрагменты по изобретению, кассеты экспрессии и экспрессионные векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине.
Кроме того, обеспечиваются клетки и стабильные клеточные линии, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.
Также обеспечиваются способ получения моноклонального антитела или его функционального фрагмента, фармацевтическая композиция и фармацевтическая комбинация, содержащая в эффективном количестве антитело настоящего изобретения, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, разбавителями или носителями и способы диагностики и терапии АС и иных заболеваний с использованием антител настоящего изобретения.
Определения
С целью более легкого понимания изобретения сначала определяются некоторые термины.
Следует понимать, что материалы и способы, предлагаемые в данном документе, не ограничиваются конкретными композициями или этапами способа, поскольку они могут варьироваться. Указано, что, как используется в данном описании и приложенной формуле изобретения, формы единственного числа включают и соответствующие формы во множественном числе, если контекст явно не предписывает иное.
«Т-клеточный рецептор», так же указанный как «ТРК», «Т-рецептор» или «TCR» человека представляет собой гетеродимерный белковый комплекс, расположенный на поверхности Т лимфоцита. Т-рецептор присутствует только на Т-лимфоцитах. Основная функция ТКР заключается в специфическом распознавание процессированных антигенов, связанных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (HLA).
ТКР человека состоит из двух субъединиц, а и b, либо g и d цепей, связанных между собой дисульфидной связью и закрепленных в клеточной мембране. Каждая из цепей ТКР имеет N-концевой вариабельный (V) домен, соединительный домен и константный (С) домен, соединенный с трансмембранным доменом, закрепляющим рецептор в плазматической мембране Т-лимфоцита. Протяженность константного домена альфа и бета цепей составляет 91 и 129 аминокислотных остатков, соответственно. Длина соединительного и трансмембранного домена альфа цепи - 30 и 17 аминокислотных остатков (а.о.), а у бета цепи - 21 и 22 а.о. Протяженность вариабельных доменов Т-рецепторов варьирует от 104 до 125 а.о.
Небольшая фракция Т-лимфоцитов располагает Т-рецепторами типа g/d. По своему устройству они аналогичны a/b рецепторам, но отличаются по первичной структуре и имеют ряд функциональных особенностей. Их вариабельность гораздо ниже (ограниченная клоноспецифичность), они распознают антигены в комплексе с «неклассическими» (не МНС) антигенпредставляющими молекулами или даже свободные антигены.
Т-рецептор взаимодействует с комплексом МНС-антиген шестью участками, определяющими его комплементарность (CDR): три участка альфа цепи и три бета цепи. Эти CDR представляют собой гипервариабельные участки, петли вариабельных доменов Т-клеточного рецептора - Уальфа и Убета.
Термины «TRBV9» или «семейство TRBV9» относятся к девятому семейству бета-цепей Т-клеточных рецепторов, выделяемому согласно номенклатуре IMGT, которое характеризуется тем, что аминокислотная последовательность их вариабельного домена включает уникальные мотивы CDR1 (последовательность аминокислот - S-G-D-L-S) и CDR2 (последовательность аминокислот - Y-Y-N-G-E-E). Термин «ТКР семейства TRBV9» обозначает Т-клеточный рецептор, бета-цепь которого относится к TRBV9 семейству.
Термин «патологический» по отношению к Т-лимфоцитам или ТКР означает, что данное ТКР или Т-лимфоцит, его несущий, ассоциированы с заболеванием или патологией и/или являются причиной заболевания и/или способствуют развитию заболевания.
Термин «аутоиммунный» по отношению к ТКР означает, что данное ТКР вовлечено в развитие аутоиммунного заболевания.
Термин «антитело», используемый здесь, предназначен для определения молекулы иммуноглобулина, состоящей из четырех полипептидных цепей (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), связанных дисульфидными связями. Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно, и несколько из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретным константным участком.
Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенный здесь как HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена CHI, СН2 и СНЗ . Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (сокращенный здесь как LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен CL. Участки VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), окруженные участками, которые являются более консервативными, называемыми скелетными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR участков, расположенных от амино- до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
В данной заявке 3 CDR тяжелые цепи обозначены как «HCDR1 , HCDR2 и HCDR3», а 3 CDR легкой цепи обозначены как «LCDR1 , LCDR2 и LCDR3». CDR содержат большинство остатков, которые образуют специфические взаимодействия с антигеном. Нумерацию и позиционирование CDR-аминокислотных остатков в пределах HCVR и LCVR участков антител согласно данному изобретению осуществляют с хорошо известной номенклатурой Kabat, если не указано иного. В настоящей заявке используется, если не указано иного, общепринятые буквенные обозначения аминокислот.
Термины «анти-TRB У9-антитело», «антитело к TRBV9», «антитело, специфически связывающееся с бета цепью семейства TRBV9» или «антитело против бета цепи семейства TRBV9» и им подобные являются взаимозаменяемыми в контексте настоящей заявки и относятся к антителу, которое специфически связывается с эпитопом бета цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека.
Кроме того, «моноклональное антитело», как используется в данной заявке, может быть одноцепочечным Fv-фрагментом, который может быть получен путем связывания ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, с линкерной последовательностью (см. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Подразумевается, что вне зависимости от того, указаны ли фрагменты или части, термин «антитело», как используется в данной заявке, включает такие фрагменты или части, а также одноцепочечные формы. До тех пор, пока белок сохраняет способность специфического или предпочтительного связывания своей мишени (например, эпитопа или антигена), он относится к термину «антитело». Антитела могут быть гликозилированными, или не быть таковыми, и входят в рамки изобретения.
Термины «антитело» и «моноклональное антитело» для нужд настоящей заявки относятся к моноклональному антителу против ТКР семейства TRBV9. Как используется в настоящей заявке «моноклональное антитело» относится к антителу грызуна, семейства приматов или Camelidae, предпочтительно к антителу мыши, макаки, верблюда или ламы, химерному антителу, гуманизированному антителу или полностью человеческому антителу, если не указано иное.
Популяция «моноклональных антител» относится к гомогенной или по существу гомогенной популяции антител (т.е. по крайней мере приблизительно 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 97 или 98% или еще более предпочтительно по крайней мере 99% антител в популяции будут конкурировать в анализе ELISA за тот же антиген или эпитоп, или более предпочтительно антитела являются идентичными в аминокислотной последовательности). Антитела могут быть, а могут и не быть, гликолизированными и все еще подпадать в объем изобретения.
Моноклональные антитела могут быть гомогенными, если они имеют идентичную аминокислотную последовательность, хотя они могут отличаться по посттрансляционной модификации, например, паттерн гликолизации.
Вариабельные участки каждой из пар легкая/тяжелая цепь образуют антигенсвязывающие сайты антитела. Как используется в данной заявке, «антиген связывающая часть», или «антигенсвязывающий участок», или «антиген связывающий домен» или «антигенсвязывающий центр» относятся, взаимозаменяемо, к такой части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и придающие антителу его специфичность и аффинность по отношению к антигену. Эта часть антитела включает «каркасные» аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков.
Термин «человеческое антитело», используемый здесь, означает антитело, в котором последовательности вариабельных и константных доменов происходят от человеческих последовательностей. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут включать остатки аминокислот, нехарактерные для человека (например, мутации, интродуцированные ненаправленным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и особенно в CDR3.
Термин «гуманизированные» по отношению к антителам используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей и структурных компонентов, но имеют обусловливающие комплементарность участки (CDR), которые свойственны иммуноглобулинам иного происхождения или соответствующим фрагментам модифицированных антител.
«Родительское» антитело в данной заявке - это антитело, кодированное аминокислотной последовательностью, которая используется для получения варианта. Родительское антитело может быть из грызуна, ламы, химерным, гуманизированным или человеческим антителом.
Термин «степень гуманизации» по отношению к антителам используются для обозначения процента идентичности последовательности каркасного участка гуманизированного антитела относительно первичного человеческого акцепторного каркасного участка, который был использован для создания гуманизированного антитела и который доступен из человеческой библиотеки. Предпочтительно, антитело изобретения содержит каркасный участок с идентичностью не менее 80%, обычно не менее 82%, чаще не менее 83%, например, не менее 84%, или не менее 85%, или не менее 86%, или не менее 87% идентичностью в отношении к каркасному участку, полученному из человеческой библиотеки.
Термин «гуманизирующие замены» относятся к аминокислотным заменам, которые увеличивают степень гуманизации антитела или его фрагмента.
Термин «химерные» по отношению к антителам настоящего изобретения используются для обозначения антител, которые характеризуются наличием свойственных человеку константных областей, но имеют вариабельные домены иного происхождения. В таких антителах вариабельные домены легких и/или тяжелых цепей, имеющие нечеловеческое происхождение (например, взятые из крысы), оказываются оперативно связаны с константными доменами соответствующих цепей человеческого происхождения.
Термин «оперативно связанный» или ему подобный при описании антител относиться к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической (ковалентной, если не указано иного) и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях, функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов.
Термин «оперативно связанный» или ему подобный при описании нуклеиновых кислот означает, что нуклеиновые кислоты ковалентно связаны таким образом, что в местах их соединения отсутствуют «сбойки» рамки считывания и стоп-кодоны. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий «оперативно связанные» компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок, например, химерное антитело согласно изобретению.
Как здесь используется, термины «изолированный» и «выделенный» означают молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.
В преимущественных воплощениях антитела настоящего изобретения являются рекомбинантными, то есть полученными с помощью техники рекомбинантных ДНК.
Термин «рекомбинантное антитело», используемый здесь, включает все антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, введенного в клетку -хозяин, антитела, выделенные из набора известных рекомбинантных комбинаторных человеческих антител, антитела, выделенные из животного, которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295). В некоторых вариантах осуществления, рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, поскольку они выделены из последовательностей зародышевых VH и VL человека и близки к ним, не могут в естественных условиях существовать в зародышевом наборе антител человека in vivo.
Термин «специфически связывает», как используется в данной заявке, относится к той ситуации, при которой один участник пары специфического связывания не связывает в значительной степени молекулы, отличные от его партнера (партнеров) по специфическому связыванию.
Термин также применим, когда, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфическим для конкретного эпитопа, который переносится рядом антигенов, в таком случае специфическое антитело, имеющее антигенсвязывающий домен, будет способно к специфическому связыванию различных антигенов, несущих эпитоп. Соответственно, моноклональное антитело по изобретению специфически связывает эпитоп бета цепи Т клеточного рецептора человека, относящегося к семейству TRBV9, в то время как оно специфически не связывает бета-цепи ТКР других семейств и альфа цепи ТКР.
Термин «эпитоп» относится к той части молекулы, которая способна распознаваться и связываться с антителом в одном или более антигенсвязывающих участках антитела. Эпитопы часто состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, а также специфическими зарядовыми характеристиками.
Термин «эпитоп», как используется в данной заявке, кроме того, относится к части полипептида, которая обладает антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например, мыши, крысы или человека. Термин «антигенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, с которой может специфически связываться антитело, определенная любым способом, хорошо известным из уровня техники, например, при помощи традиционного иммунного анализа. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут также быть имуногенными. «Иммуногенный эпитоп», как используется в данной заявке, определяется как часть полипептида, который вызывает отклик антитела у животного, как устанавливается любым способом, известным из уровня техники. «Нелинейный эпитоп» или «конформационный эпитоп» содержат несмежные полипептиды (или аминокислоты) в пределах антигенного протеина, с которым антитело, специфическое к эпитопу, связывается.
Выражения «биологическое свойство» или «биологическая характеристика» или термины «активность» или «биоактивность по отношению к антителу и его функциональным фрагментам по изобретению используются в данной заявке как взаимозаменяемые и включают, но не ограничиваются приведенными, эпитоп/антигенную аффинность и специфичность, способность ингибировать или быть антагонистом активности ТКР, в состав которого входит бета цепь, принадлежащая к семейству TRBV9.
Остальные идентифицируемые из уровня техники биологические свойства или характеристики антитела включают, например, перекрестную реактивность (т.е. с нечеловеческими гомологами пептида-мишени или с остальными протеинами или мишенями, в общем), и способность сохранять высокие уровни экспрессии протеина в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться, измеряться или оцениваться с использованием методик, признанных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь, приведенными, анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, BIACORE или анализ поверхностного плазмонного резонанса KINEXA, анализы ингибирования in vitro или in vivo без ограничений, рецепторного связывания, продуцирования и/или секреции цитокина или фактора роста, сигнальную трансдукцию и иммуногистохимию срезов тканей, полученных из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник.
Термины «ингибировать» или «нейтрализовать», как используется в данной заявке, по отношению к активности антитела по изобретению, означают способность в значительной степени противодействовать, препятствовать, предотвращать, ограничивать, замедлять, прерывать, уничтожать, прекращать, уменьшать, например, развитие или тяжесть того, что ингибируют, включая, но, не ограничиваясь вышеприведенными, биологическую активность антитела или свойство, заболевание или состояние.
Как здесь используется, термин «мутант» или «вариант» относятся к антителу, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей антител настоящего изобретения или их фрагментов. Как здесь используется, термин «мутант» также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин «мутант» относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
Термин «гомология» используется для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями .
Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности «по существу сходны» или «по существу такие же» как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют, по крайней мере, 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере 90% идентичности, или по крайней мере 91% идентичности, или по крайней мере 92% идентичности, или по крайней мере 93% идентичности, или по крайней мере 94% идентичности, ли по крайней мере 95% идентичности, или по крайней мере 96% идентичности, или по крайней мере 97% идентичности, или по крайней мере 98% идентичности, или по крайней мере 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, так же по существу сходны.
Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как IgBLAST, описанный в Ye et al. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40. Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ IgBLAST, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами. Для вычисления процента идентичности используется полная длина референсной последовательности, например, вариабельного региона.
Ссылка на нуклеотидную последовательность «кодирующую» полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин так же включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидная последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие нитроны.
Антитела
Как указано выше, настоящее изобретение относится к изолированным моноклональным гуманизированным антителам и их функциональным фрагментам, обладающим способностью специфически связываться с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.
Антитела согласно изобретению могут быть химерными, гуманизированными или человеческими антителами, или их антигенсвязывающими фрагментами и могут использоваться в качестве лекарственного средства для лечения АС и других заболеваний, в патогенез которых вовлечены ТКР, относящиеся к TRBV9 семейству, например, целиакии или Т-клеточной лимфомы. Антитело согласно изобретению является моноклональным. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, гибридомных методик, хороню известных из уровня техники, а также рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, хорошо известных из уровня техники. Термин «моноклональное антитело», используемый в данной заявке, относится к антителу, полученному из единой копии или клона, включая, например, любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу его получения.
Гуманизированные и химерные антитела могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК как описано ниже в разделе «Нуклеиновые кислоты».
В некоторых воплощениях антитела настоящего изобретения являются химерными и характеризуются тем, что имеют вариабельные домены легкой и тяжелой цепей нечеловеческого происхождения (например, крысиного или мышиного), а константные домены, характерные для человека.
Антитело настоящего изобретения содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) с тремя гипервариабельными участками
1) HCDR1 (согласно номенклатуре Kabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1,
2) HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2,
3) HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;
2) вариабельный домен легкой цепи (VL) с тремя гипервариабельными участками LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR 1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,
LCDR 2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5,
LCDR 3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. Здесь и далее при определении CDR антител используется известная номенклатура Kabat, если отдельно не оговорено иное.
Во всех воплощениях вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антитела настоящего изобретения гуманизированы и отличаются от вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей родительского антитела гуманизирующими аминокислотными заменами, при этом вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.
В преимущественных воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 8, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен тяжелой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела.
В преимущественных воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит аминокислотные замены и имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18, и отличается от вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 10, наличием гуманизирующих аминокислотных замен.
В некоторых воплощениях вариабельный домен легкой цепи антитела настоящего изобретения содержит дополнительные аминокислотные замены, не влияющие на специфичность антитела. В некоторых воплощениях моноклональные антитела по изобретению являются полноразмерными антителами IgG человека, например, IgGl или IgG2 или IgG3 или IgG4.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых воплощениях антитело согласно изобретению включает легкую цепь, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.
В некоторых воплощениях антитело имеет легкую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 22, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой показана в SEQ ID NO: 20.
Из уровня техники известно, что в последовательности антител, включая вариабельные домены, могут быть внесены мутации, которые не затрагивают по существу способность антитела связываться с антигеном. Антитела согласно настоящему изобретению могут также содержать дополнительные мутации, которые не приводят к потере способности антитела связывать бета цепь ТКР семейства TRBV9, но могут приводить к снижению антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности или увеличению аффинности или других биологических свойств антител. В частности, из уровня техники хорошо известно, что в последовательности антител могут быть внесены консервативные замены аминокислот. Под «консервативной заменой» в контексте заявки подразумевается замена, при которой остаток аминокислоты замещается другим остатком аминокислоты, имеющим близкую боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, имеющих близкие боковые цепи, определены в уровне техники, в том числе основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), b-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Предпочтительно в участки CDR3 в доменах VL и/или VH делают не более пяти консервативных замен аминокислот, чаще не более трех консервативных замен. Как правило, консервативные замены не делают в положениях аминокислот, критических для связывания эпитопа бета цепи семейства TRBV9.
Описанные выше варианты (мутанты) антител согласно изобретению могут быть получены пептидным синтезом или с использованием техники рекомбинантных ДНК как описано ниже в разделе «Нуклеиновые кислоты».
В предпочтительных воплощениях антитело содержит константный участок тяжелой цепи, такой как константный участок IgGl, IgG2, IgGS, IgG4, IgA, IgE, IgM, IgD человека. Предпочтительно константным участком тяжелой цепи является константный участок тяжелой цепи IgGl человека. Более того, антитело может содержать как константный участок легкой цепи либо каппа-константный участок легкой цепи, либо лямбда- константный участок легкой цепи. Предпочтительно антитело содержит каппа- константный участок легкой цепи.
В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 84%. В преимущественных воплощениях вариабельный фрагмент легкой цепи антитела характеризуется степенью гуманизации - 85%.
Так же обеспечиваются антигенсвязывающие фрагменты антител настоящего изобретения.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела (или «функциональный фрагмент антитела» или «активный фрагмент антитела»), используемый здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген. Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины.
Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела включают (а) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1 ; (б) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в районе петли; (в) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1 ; (г) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (д) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 341 :544-546), который состоит из домена VH, и (е) выделенный участок (CDR), определяющий комплементарность. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть рекомбинантными способами связаны с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как Fv одной цепи (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие антитела из одной цепи также охватываются термином «антиген-связывающий фрагмент» антитела. К ним относятся также другие формы антител из одной цепи, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта (см., например, Holliger Р. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994) Structure 2: 1121-1123).
Фрагменты антител, такие как Fab и F(ab')2, могут быть получены из целых антител с использованием принятых способов, таких как разложение папаином или пепсином, соответственно, целых антител. Более того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов с применением рекомбинантной ДНК.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной связью антитела или фрагмента антитела с одним или более белком или пептидом. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование участка ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и уменьшенных биомолекул scFv (Kipriyanov S.M. et al. (1994) Mol. Immunol., 31 : 1047-1058). Другие химические связывания фрагментов антител также хорошо известны из уровня техники. Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению находятся в изолированной форме, то есть это означает, что данный белок по существу свободен от присутствия других белков или других природных биологических молекул, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагмента и т.п., где термин «по существу свободен» в данном случае означает, что менее чем 70%, обычно менее чем 60% и чаще менее чем 50% указанной композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой другую природную биологическую молекулу.
В некоторых вариантах указанные белки присутствуют по существу в очищенной форме, где термин «по существу очищенная форма» обозначает чистоту, равную, по меньшей мере, 95%, обычно равную по меньшей мере 97% и чаще равную по меньшей мере 99%.
Способы очистки антитела, полученного путем рекомбинантной или гибридомной технологии хорошо известны из уровня техники, например, очистка может быть осуществлена путем хроматографии (например, ионообменной, аффинной, особенно аффинной для специфичных антигенов - белка А или белка G, и колоночной хроматографией размеров), центрифугирования, дифференциальной растворимости, или любой другой стандартной методикой для очистки белков. Кроме того, антитела по технологии в соответствии с настоящим изобретением или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями (например, гисти диновой меткой) для облегчения очистки.
Аффинность антитела можно определять с применением стандартного анализа через определение константы диссоциации (KD). KD вычисляется через уравнение KD=kdis/kon, где kdis - экспериментально вычисляемая константа скорости диссоциации и коп - экспериментально вычисляемая константа скорости ассоциации комплекса антитело-антиген. Предпочтительными антителами являются те, которые связывают антиген человека со значением KD не более чем приблизительно 1 c 10 7 М; предпочтительно не более чем приблизительно 1 x 10-8 М; чаще не более чем приблизительно 1 x 10-9 М; более предпочтительно не более чем приблизительно 1 c 10-10 М, и наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 1 x 10-11 М, например, не более чем приблизительно 1 c 10-12 М.
Антитела и их фрагменты, которые можно использовать в настоящих композициях и способах, являются биологически активными антителами и фрагментами, то есть способны связывать желаемые антигенные эпитопы и проявлять биологический эффект непосредственно или опосредованно.
Антитела и их функциональные фрагменты согласно изобретению способны специфически связывать эпитоп (участок) бета цепи семейства TRBV9. В преимущественных воплощениях в результате их специфического связывания с бета цепью семейства TRBV9 происходит ингибирование активности ТКР, включающих указанную бета цепь. Как правило, ингибирование составляет предпочтительно, по крайней мере, приблизительно 20, или 30, или 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90, или 95% или выше.
В некоторых вариантах осуществления антитело против бета цепи семейства TRBV9 согласно изобретению или его фрагмент может элиминировать Т-лимфоциты, несущие ТКР, содержащий бета-цепь семейства TRBV9. В некоторых вариантах осуществления антитело или его фрагмент согласно изобретению может обеспечивать, по меньшей мере, приблизительно 20%, по меньшей мере, приблизительно 30%, по меньшей мере, приблизительно 40%, по меньшей мере, приблизительно 50%, по меньшей мере, приблизительно 60%, по меньшей мере, приблизительно 70%, по меньшей мере, приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере, приблизительно 95% или приблизительно 100% элиминацию Т-лимфоцитов.
В преимущественном варианте изобретения антитело представляет собой антитело МА-043.
Антитело МА-043, включает вариабельные домены тяжелой и лёгкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 16 и 18.
Антитело МА-043, включает тяжелую и лёгкую цепи, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20 и 22, соответственно.
Нуклеиновые кислоты
Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела настоящего изобретения, их функциональные фрагменты и вариабельные домены, которые могут быть использованы для получения химерных антител, включающих вариабельные домены по изобретению, оперативно слитые с известными константными доменами антител человека.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка HCDR1, HCDR2 и HCDR3, где
HCDR1 (согласно номенклатуре Rabat) имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;
HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2;
HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой содержит 3 гипервариабельных участка LCDR1, LCDR2 и LCDR3, в которых:
LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В преимущественных воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению кодирует вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, которые содержат аминокислотные замены в FR фрагментах вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, повышающие степень гуманизации антитела по сравнению с родительским антителом.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гомологи и мутанты указанных цепей антител, их функциональных фрагментов и доменов также находятся в рамках настоящего изобретения.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, вариабельный домен которой имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь антитела, вариабельный домен которой имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует тяжелую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует легкую цепь антитела, аминокислотная последовательность которой идентична, по крайней мере, на 85%, или идентична, по крайней мере, на 90%, или идентична, по крайней мере, на 91%, или идентична, по крайней мере, на 92%, или идентична, по крайней мере, на 93%, или по крайней мере 94% или по крайней мере 95% или по крайней мере 96% или по крайней мере 97%, или по крайней мере 98% или по крайней мере 99% или идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.
Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих легкие и тяжелые цепи по изобретению показаны в SEQ ID NO: 19 и 21.
Нуклеиновые кислоты кодирующие вариабельные домены легкой и тяжелой цепи антитела так же представляют интерес. Нуклеиновые кислоты, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, могут быть использованы для оперативного слияния с нуклеиновыми кислотами, кодирующие соответствующие константные домены антител.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен тяжелой цепи антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 16.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота кодирует вариабельный домен легкой цепи антитела, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 18.
Примеры нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные домены тяжелой и легкой цепей антитела, показаны в SEQ ID NO: 15 и 17.
Как здесь используется, «молекула нуклеиновой кислоты» или «нуклеиновая кислота» - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или к ДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. В некоторых воплощениях, молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или к ДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует антитело или фрагмент антитела настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии в гетерологической системе экспрессии.
В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения получена методами генной инженерии. Способы получения нуклеиновых кислот хорошо известны из области техники.
Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза.
В случае информации о последовательности аминокислот, может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области.
Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы следующим образом: могут быть синтезированы несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК -лига зы или метода, основанного на ПЦР.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть также клонированы из биологических источников. Настоящее изобретение так же охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны, или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды настоящего изобретения.
Нуклеиновые кислоты изобретения находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которой они находятся в естественных условиях.
Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей таких, как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы «мутантами» или «производными» исходной последовательности.
Мутантные или производные нуклеиновые кислоты или варианты нуклеиновых кислот могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537- 539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генная реассемблирование (gene reassembly), генный сайт- насыщающий мутагенез (GSSM), искусственное перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил- содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.
Также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют белки настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке- хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.
Вышеуказанные модификации не изменяют по существу свойства антител и их функциональных фрагментов, но могут облегчать белковый фолдинг в клетке-хозяине, снижать способность к агрегации или модулировать другие биохимические свойства белков, например, полупериод распада. В некоторых воплощениях, эти модификации не изменяют биохимические свойства белка. В некоторых воплощениях, эти модификации приводят к уменьшению иммуногенности антител. Все виды модификаций и мутаций, указанные выше, осуществляются на уровне нуклеиновой кислоты.
Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются, по меньшей мере, приблизительно на 50% чистыми, обычно, по меньшей мере, приблизительно на 90% чистыми и обычно являются «рекомбинантными», то есть, фланкированы одним или более нуклеотидами, с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.
Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, которые кодируют слитые белки, включающие белок настоящего изобретения, или их фрагменты, которые ниже рассматриваются более детально. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные домены по изобретению могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими соответствующие константные домены легкой и тяжелой цепи антитела. Нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, могут быть оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими лидерный (сигнальный) пептид, обеспечивающий транспорт продуктов экспрессии из клетки-хозяина. Лидерный пептид впоследствии отщепляется во время созревания полипептида. Вектор
Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Термин «вектор» включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она оперативно связана. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке- хозяине, в которую они введены, в то время как остальные векторы могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицированы наряду с геномом -хозяином. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы имеют в данной заявке название «векторы рекомбинантной экспрессии» (или, упрощенно, «векторы экспрессии» или «экспрессионные векторы»), а иллюстративные векторы хороню известны из уровня техники. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области.
Полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно вставляются в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляются лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.
Вектор, как правило, имеет ориджин репликации, обеспечивающий его размножение в клетках -хозяевах в результате его введения в клетку как внехромосомного элемента. Вектор также может содержать регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке- хозяине и получение целевого полипептида. В экспрессионном векторе, указанная нуклеиновая кислота является оперативно связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению нуклеиновая кислота также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки-хозяина во внеклеточное пространство.
Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных полипептидов (например, легкой и тяжелой цепей антитела по изобретению или вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антитела по изобретению) на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты.
Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии белковый продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжи, растения, насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. В кассете экспрессии целевая нуклеиновая кислота оперативно соединяется с регуляторными последовательностями, которые могут включать промоторы, энхансеры, терминирующие последовательности, операторы, репрессоры и индукторы, а также стартовый кодон полипептида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота по изобретению нуклеиновая кислота также оперативно связана с лидерным пептидом, обеспечивающим выделение продукта экспрессии из клетки-хозяина во внеклеточное пространство. Способы получения кассет или систем экспрессии, способных экспрессировать желательный продукт, известны специалистам в данной области.
Клетка-хозяин
Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такие как клетки дрожжей, клетки растений, клетки позвоночных, клетки млекопитающего, клетки человека, например, СНО клетки (например, АТСС CRL-9096), NS0 клетки, SP2/0 клетки, НЕК293 клетки, COS клетки (например, АТСС CRL-1650, CRL-1651) и HeLa (например, АТСС CCL-2).
Для получения антитела по изобретению клетка-хозяин ко- трансформируется экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, и экспрессионным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела. В некоторых воплощениях используется один экспрессионный вектор, в который внедрены нуклеиновые кислоты, кодирующие и легкую, и тяжелую цепи антитела.
Для экспрессии легкой и тяжелой цепей экспрессионным вектором(ами), кодирующим тяжелую и легкую цепи, трансформируют (ко- трансформируют) в клетку-хозяина таким образом, что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и, предпочтительно, выделяются в среду, в которой культивируют клетки-хозяина, из этой среды могут быть выделены антитела. Различные трактовки термина «трансформация» предназначены для включения широкого ряда способов, обычно используемых при интродукции экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клетку-хозяина, например, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, трансфекцию с помощью DEAE-декстрана и др., как описано Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989; Ausubel F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates (1989).
Когда рекомбинантные экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты антитела, интродуцируют в клетки-хозяева, антитела образуются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, который достаточен для экспрессии антитела в клетке-хозяине, или (более предпочтительно) секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяина. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белков. Условия культивирования различных клеток хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott- Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000.
Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, ко-трансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).
Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения также могут применяться для определения экспрессии гена в биологическом образце. Способ, в котором исследуются клетки на наличие специфических нуклеотидных последовательностей, таких как геномная ДНК или РНК, хорошо отработан в данной области. Кратко, выделяют ДНК или мРНК из образца клетки. мРНК может быть амплифицирована ОТ-ПЦР, с использованием обратной транскриптазы для формирования комплементарной цепочки ДНК, с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, специфических для заявленных последовательностей ДНК. Альтернативно, образец мРНК отделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на подходящий носитель, например, нитроцеллюлозу, нейлон и т.д., и затем тестируют фрагментом заявленной ДНК в качестве пробы. Могут также использоваться другие способы, такие как анализы сшивания олигонуклеотидов, гибридизация in situ и гибридизация ДНК-пробами, иммобилизованными на твердый чип. Обнаружение мРНК, гибридизующейся с заявленной последовательностью указывает на экспрессию гена в образце.
Терапевтическое применение антител по изобретению
В одном аспекте антитело или его активный фрагмент по данному изобретению применяется в лечении нарушений, которые связаны с активностью патологических Т-лимфоцитов, несущих на поверхности ТКР семейства TRBV9, например, с активностью аутоиммунных Т-лимфоцитов при АС, целиакии, Т-клеточных лимфомах.
Термин «пациент» в данной заявке относится к млекопитающему, включая, но не ограничиваясь приведенными, мышей, обезьян, людей, млекопитающих сельскохозяйственных животных, млекопитающих спортивных животных и млекопитающих комнатных животных; предпочтительно термин относится к людям. В определенном из вариантов осуществления пациент дополнительно характеризуется заболеванием или расстройством, или состоянием, опосредованными наличием в его организме ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9. Из уровня техники известно, что ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, ассоциированы с АС и целиакией. Также ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, могут быть связаны с развитием ряда заболеваний крови, таких как Т клеточная лимфома, вызванная вирусом Эпштейн -Барр.
Используемые в данном документе термины «совместное назначение», «совместно назначенный» и «в сочетании с» относящиеся антителу с одним или более другими терапевтическими агентами, как предполагается, означают, ссылаются или включают:
1) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в одной лекарственной форме, из которой указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
2) одновременное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно в разных лекарственных формах, введение которых происходит практически в одно и то же время указанному пациенту, после чего указанные компоненты высвобождаются практически одновременно указанному пациенту,
3) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы отдельно друг от друга в отдельных лекарственных формах, которые принимаются в последовательно по времени указанным пациентом со значимым временным интервалом между каждым введением, после чего указанные компоненты высвобождаются в практически разное время указанному пациенту; а также
4) последовательное введение такой комбинации антитела по данному изобретению и терапевтического агента пациенту, который нуждается в лечении, когда такие компоненты сформулированы вместе в единый лекарственной форме, из которой высвобождение указанных компонентов происходит контролируемым образом, после чего они одновременно, последовательно или совместно высвобождаются в одно и то же время и/или разное время указанному пациенту, где каждая часть может быть введена одним или разными путями.
Антитело по данному изобретению может назначаться без дополнительного терапевтического лечения, т.е. в качестве самостоятельной терапии.
Кроме того, лечение антителом по данному изобретению может включать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое лечение (комбинированная терапия).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может вводиться совместно или быть сформулирована с другим медикаментом/препаратом для аутоиммунного или онкологического заболевания, в патогенез которого вовлечены ТКР, содержащие бета-цепь TRBV9, например, АС, целиакия, Т-клеточная лимфома, Т-клеточный лейкоз.
Дозы и пути ееедения
Антитело по данному изобретению будет вводиться в количестве, эффективном для лечения состояния, о котором идет речь, т.е. в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого результата.
Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, по поводу которого проводится лечение, возраста, пола и веса пациента, а также является ли введение антитела самостоятельным лечением или оно проводится в комбинации с одним или более дополнительных иммуносупрессивных или противовоспалительных методов лечения.
Схемы приема лекарственных средств можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный желаемый ответ. Например, может быть введен один болюс, несколько разделенных доз могут быть введены в течение некоторого времени, или доза могут быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации. Особенно полезным является изготовление парентеральных композиций в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозирования. Стандартная лекарственная форма при использовании в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для пациентов/субъектов, подлежащих лечению; каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению, как правило, диктуется и непосредственно зависит от (а) уникальных характеристик химиотерапевтического агента и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которые должны быть достигнуты, и (Ь) ограничений, присущих в технике компаундирования такого активного соединения для лечения чувствительности у субъектов.
Таким образом, квалифицированным специалистам понятно, исходя из раскрытия, представленного в данном документе, что дозы и режим дозирования корректируются в соответствии со способами, хорошо известными в терапевтической области. Это означает, что может быть легко установлена максимально переносимая доза и может быть также определено эффективное количество, обеспечивающее обнаруживаемый терапевтический эффект для пациента, также как и требования к времени введения каждого агента для достижения видимого терапевтического эффекта для пациента. Таким образом, хотя некоторые дозы и схемы режима введения приведены в качестве примеров в данном документе, эти примеры никоим образом не ограничивают дозы и режимы введения, которые могут понадобиться для пациента в практике применения настоящего изобретения.
Следует отметить, что значения дозировки могут изменяться, в зависимости от типа и тяжести состояния, которое следует облегчить, и может включать одну или более доз. Кроме того, необходимо понимать, что для любого конкретного пациента, конкретные схемы введения должны быть скорректированы через некоторое время согласно индивидуальной потребности и на усмотрение медицинского работника, который осуществляет введение или контролирует введение композиций, и что диапазоны концентрации, приведенные в данном описании, приведены только в качестве примера и не предназначены для ограничения объема или практики заявленных композиций. Кроме того, режим дозирования с композициями по данному изобретению может быть основан на различных факторах, включая тип заболевания, возраст, вес, пол, состояния здоровья пациента, тяжесть состояния, путь введения и конкретное используемое антитело. Таким образом, режим дозирования может широко варьироваться, но может определяться регулярно с помощью стандартных методов. Например, дозы могут быть скорректированы на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров, которые могут включать клинические эффекты, такие как токсические эффекты или лабораторные значения. Таким образом, настоящее изобретение охватывает индивидуальное повышение дозы, которое определяется квалифицированным специалистом. Определение необходимой дозы и режимы хорошо известны в соответствующей области техники и будут понятны специалисту в данной области после ознакомления с идеями, раскрытыми в данном документе.
Примеры подходящих способов введения предусмотрены выше.
Предполагается, что подходящая доза антитела по данному изобретению будет в диапазоне от 0,1 -200 мг/кг, предпочтительно 0,1-100 мг/кг, в том числе около 0,5-50 мг/кг, например, около 1-20 мг/кг. Антитело может быть введено, например, в дозе по меньшей мере 0,25 мг/кг, например, по меньшей мере, 0,5 мг/кг, в том числе не менее 1 мг/кг, например, по меньшей мере, 1,5 мг/кг, например, также как не менее 2 мг/кг, например, по меньшей мере 3 мг/кг, в том числе по меньшей мере 4 мг/кг, например, по меньшей мере, 5 мг/кг; и, например, вплоть до максимально 50 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 30 мг/кг, например, вплоть до максимально 20 мг/кг, в том числе вплоть до максимально 15 мг/кг. Введение будет повторяться обычно в подходящие промежутки времени, например, раз в неделю, раз в две недели, один раз каждые три недели или один раз каждые четыре недели, и так долго, как будет сочтено целесообразным ответственным врачом, который может в некоторых случаях увеличить или уменьшить дозу при необходимости. Фармацевтическая композиция
Антитело по изобретению может быть включено в фармацевтическую композицию, пригодную для введения пациенту. Антитела по изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или наполнителем в однократных или многократных дозах. Фармацевтические композиции для введения разработаны таким образом, чтобы соответствовать выбранному режиму введения, а фармацевтически приемлемые разбавители, носители и/или наполнители, такие как диспергирующие агенты, буфера, поверхностно - активные вещества, консерванты, солюбилизирующие агенты, изотонические агенты, стабилизаторы и т.п. использованы должным образом. Указанные композиции разработаны в соответствии с традиционными методами, приведенными в, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, где описаны различные методы получения композиций, в общем известных специалистам.
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество или смесь веществ в виде фармацевтической композиции в виде таблеток, капсул, порошков, лиофилизатов, инъекций, инфузий, мазей и др. готовых форм, предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего. Любой способ введения пептидов, белков или антител, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для антитела по данному изобретению.
Термин «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько совместимых жидких или твердых компонентов, которые подходят для введения млекопитающему, предпочтительно человеку. Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.
Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение pH, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату антитела проявлять устойчивость к изменениям pH. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.
Термины «тонический агент», «осмолитик» или «осмотический агент» в том виде, как они здесь использованы, относятся к эксципиенту, который может подводить осмотическое давление жидкого препарата антитела. «Изотоничный» препарат представляет собой препарат, который имеет осмотическое давление, эквивалентное давлению человеческой крови. Изотоничные препараты обычно имеют осмотическое давление от примерно 250 до 350 мОсм/кг. В качестве изотоноческих агентов могут быть использованы полиолы, моно- и дисахара, аминокислоты, соли металлов, например, хлорид натрия, и т.п., но, не ограничиваясь ими.
Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента. В качестве стабилизаторов могут быть использованы аминокислоты, например, аргинин, гистидин, глицин, лизин, глутамин, пролин, но, не ограничиваясь ими; поверхностно-активные вещества, например, полисорбат 20 (торговое наименование Tween 20), полисорбат 80 (торговое наименование Tween 80), полиэтилен-полипропилен гликоль и его кополимеры (торговые наименования Полоксамер (Poloxaner), Плуроник (Pluronic)), натрия додецилсульфат (SDS), но, не ограничиваясь ими; антиоксиданты, например, метионин, ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, монотиоглицерол, соли серистых кислот, и т.п., но не ограничиваясь ими; хелатирующие агенты, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), цитрат натрия и т.п., но не ограничиваясь ими.
Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8 °С.
Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.
Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело по изобретению, может быть введена пациенту, имеющему патологии, как описано в данной заявке, с использованием стандартных методов введения, включая пероральное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, буккальное, сублингвальное или при помощи суппозиториев.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно содержит или является «терапевтически эффективным количеством» антитела по изобретению. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума, и способности антитела или части антитела вызывать желательную реакцию у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также представляет собой количество, при котором терапевтически полезный эффект антитела преобладает над токсическим или вредным эффектом. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при дозировках и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желательного профилактического результата. Поскольку профилактическую дозу используют для индивидуумов до или на ранней стадии заболевания, то, типично, профилактически эффективное количество может быть меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество представляет собой, по крайней мере, минимальную дозу, но меньшую, чем токсическая доза активного агента, необходимую для обеспечения терапевтической пользы пациенту. С другой стороны, терапевтически эффективное количество антитела по изобретению представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно людей, снижает биологическую активность аутоиммунных клонов, например, через связывание ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, где присутствие этих клонов вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам, или снижение уровней ТКР, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, вызывает благоприятный терапевтический эффект у млекопитающего, предпочтительно человека.
Путь введения антитела по изобретению может быть пероральным, парентеральным, путем ингаляции или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию пригодную для парентерального введения. Термин «парентеральный», как используется в данной заявке, включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или интраперитонеальное введение. Преимущественным является введение путем внутривенной или интраперитонеальной, или подкожной инъекции. Подходящие носители для таких инъекций непосредственно известны из уровня техники.
Фармацевтическая композиция, как указано в соответствующих руководствах, должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в контейнере, который обеспечивается, включая, например, герметично закрытый флакон (ампула) или шприц. Поэтому фармацевтические композиции могут быть стерильно профильтрованными после получения состава либо сделаны микробиологически пригодными иным образом. Типичная композиция для внутривенной инфузии может иметь объем в 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хенка, и терапевтически эффективную дозу (например, 1 -100 мг/мл или более) концентрации антитела. Доза может варьировать в зависимости от вида и тяжести заболевания. Как хорошо известно из уровня техники в области медицины, дозировки для любого из пациентов зависят от многих факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное соединение, предназначенное для введения, пол, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарства, которые вводят одновременно. Типичная доза может находиться, например, в диапазоне 0,001-1000 мкг; однако, предвидятся дозы, находящиеся ниже или выше этого иллюстративного диапазона, особенно учитывая вышеуказанные факторы. Режим дозировок ежедневного парентерального введения может составлять от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг от общей массы тела, предпочтительно от 0,3 мкг/кг до 10 мг/кг и более предпочтительно от 1 мкг/кг до 1 мг/кг, даже более предпочтительно от 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день.
Процесс лечения можно контролировать путем периодической оценки состояния пациента. Для повторного введения в течение нескольких дней или дольше в зависимости от состояния пациента лечение повторяют до достижения желаемого ответа или подавления симптомов болезни. Однако также могут применяться другие режимы дозировок, которые не описаны в данной заявке. Желаемая дозировка может быть введена путем одноболюсного введения, множественных болюсных введений или путем непрерывного инфузионного введения антитела в зависимости от образца фармакокинетического распада, которого хочет достигнуть практикующий специалист.
Эти предположительные количества антитела в сильной степени зависят от решения терапевта. Ключевым фактором выбора соответствующей дозы и режима является желаемый результат. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное заболевание, которое лечат, конкретное млекопитающее, которое лечат, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место введения антитела, конкретный вид антитела, способ введения, режим введения и остальные факторы, известные практикующим специалистам-медикам.
Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены либо лиофилизированы и восстановлены перед применением в подходящем стерильном носителе. Лиофилизирование и восстановление могут приводить к различным степеням потери активности антитела. Дозировки могут быть скорректированы для компенсации этой потери. В общем случае, преимущественными являются значения pH фармацевтической композиции от 6 до 8. Изделие (продукты) и наборы
Следующим вариантом осуществления изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения аутоиммунных заболеваний и родственных состояний и злокачественных заболеваний крови, в патогенез которых вовлечены ТКР, несущие бета-цепь семейства TRBV9. К таким заболеваниям относятся, например, АС, целиакия, Т- клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома и другие.
Изделие представляет собой контейнер с этикеткой и листовкой- вкладышем, которые могут быть размещены в блистере и/или пачке. Приемлемыми контейнерами являются, например, флаконы, ампулы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или полимерные материалы. Контейнер содержит композицию, эффективную для лечения определенного состояния, и может иметь стерильный входной канал). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело, предлагаемое в изобретении. На этикетке и листовке-вкладыше в упаковке указано, что лекарственное средство применяют для лечения конкретного состояния. Этикетка и/или листовка-вкладыш в упаковке дополнительно должны содержать инструкции по введению композиции антитела пациенту, в том числе информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, касающихся применения таких терапевтических продуктов. В одном из вариантов осуществления изобретения на листовке-вкладыше в упаковке указано, что композицию применяют для лечения указать чего.
Кроме того, изделие может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, например, растворители, разбавители, фильтры, иглы и шприцы, но не ограничиваясь ими. Изобретение относится также к наборам, которые можно применять для различных целей, например, для оценки способности уничтожать Т- клетки, несущие ТКР семейства TRBV9, для очистки или иммунопреципитации рецептора TRBV9 из клеток. Для выделения и очистки набор может содержать антитело связанное с гранулами (например, сефарозными гранулами). Набор содержит контейнер и этикетку и листовку-вкладыш в упаковке.
Диагностическое использование
Антитела по настоящему изобретению также используются в диагностических целях (например, in vitro, ex vivo). Например, антитело может использоваться для обнаружения или измерения уровня Т- лимфоцитов, содержащих ТКР семейства TRBV9 в образцах, полученных от пациента, например, образец ткани или образец жидкости тела, такой как воспалительный экссудат, кровь, жидкость кишечника, слюна или моча. Подходящие методы обнаружения и измерения включают иммунологические методы, такие как проточная цитометрия, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный анализ, радиоиммуноанализ и иммуногистология. Изобретение далее включает наборы, например, диагностические наборы, содержащие антитела, описанные в данном документе.
Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.
Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.
Экспериментальная часть
Пример 1. In silico гуманизация последовательностей
вариабельных доменов антитела
В качестве родительских (опорных) использовались последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела aHTn-TRBV9-2, аминокислотные последовательности которого показаны в SEQ ID Nos: 8 и 10.
Аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и лёгкой цепей сравнивали с пулом гермлайн-последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, гермлайн- последовательностей вариабельных доменов иммуноглобулинов крысы, последовательностей зрелых антител человека и крысы, полученных как из открытых источников, так и из донорской библиотеки, предоставленной компанией Биокад (Россия). Для анализа использовался пакет программного обеспечения Ylab (Биокад, Россия).
В ходе анализа в последовательностях вариабельных доменов анализируемых антител были установлены позиции и их сочетания, наиболее характерные для животных и не характерные для человека. В то же время были установлены сочетания аминокислот, наиболее часто представленные в антителах человека в данных позициях. На основании полученных данных был осуществлен дизайн искусственных последовательностей вариабельных доменов, содержащих замены, повышающие степень гуманизации антитела. Также была проведена кодон-оптимизация нуклеотидных последовательностей, кодирующих предложенные аминокислотные варианты, для осуществления экспрессии гуманизированного антитела в клеточной линии СНО.
Гуманизированные нуклеотидные последовательности HCVR и LCVR (SEQ ID Nos: 15 и 17) были синтезированы de novo и клонированы в вектора рЕЕ-НС, рЕЕ-СК, формат IgGl (Xu et al. Front. Chem. Sci. Eng. 2015, 9(3): 376-380) по сайтам рестрикции Sall/Nhel и Sall/BsiWI, соответственно.
Последовательности нуклеиновых полученных легкой и тяжелой цепи проверяли путем секвенирования по методу Сенгера.
Для дальнейшей работы было отобрано антитело МА-043, аминокислотные и нуклеотидные последовательности легкой и тяжелой цепей которого показаны в SEQ ID Nos: 19-22.
Антитело МА-043, включает вариабельные домены тяжелой и лёгкой цепей, которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 16 и 18.
Степень гуманизации вариабельного домена тяжелой цепи антитела МА-043 составила 84%, а степень гуманизации вариабельного домена легкой цепи - 85% (Таблица 1). Константный домен тяжелой цепи представлен форматом IgGl аллотип Gm3.
Таблица 1. Сравнение степени гуманизации вариабельных доменов родительского антитела и антитела МА-043
Figure imgf000060_0001
Пример 2. Получение рекомбинантного антитела и определение его аффинности
Векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела МА-043, полученные как описано в Примере 1 нарабатывали в клетках Е.соН и очищали при помощи набора реактивов для очистки плазм ид ной ДНК производства фирмы Qiagen (Германия) и использовали для трансфекции клеточной линии CHO-Fut8 с помощью линейного полиэтиленимина (ПЭИ «МАХ», «Polysciences», США) согласно инструкции производителя. Полученные реакционные смеси инкубировали при 37°С на качалке. Через 9 дней после трансфекции культуральную жидкость отделяли от клеток фильтрацией через фильтр с размером пор 0,5/0,22 мкм. Культуральную жидкость после фильтрации использовали для выделения антител с помощью аффинной хроматографии на колонках PreDictor RoboColumn MabSelect SuRe объемом 0,2 мл (GE Healthcare, США), уравновешенную фосфатно-солевым буфером (ФСБ, pH 7,4). Затем колонку промывали 5 объемами ФСБ. Связанный с носителем белок элюировали, используя 0,1 М глициновый буфер pH 3. Собирали основной пик, содержащий белок и доводили pH до нейтрального с помощью 1 М буфера Tris (pH 7,5). Все стадии проводили при скорости потока 110 см/ч. Далее белок переводили в ФСБ (pH 7,4) с помощью диализа, фильтровали через фильтр диаметром 0,22 мкм, переносили в новые стерильные пробирки. Качество выделения оценивали с помощью 12% ПААГ- электрофореза в денатурирующих условиях.
Количественную оценку проводили с помощью измерения на микроспектрофотометре NanoDrop2000 при 280А. Выделенный белок хранили при -70°С. Определение аффинности антитела проводили на приборе OctetRed 96 (ForteBio, США). Антиген в концентрации 20 мкг/мл иммобилизовали на поверхность AR2G сенсоров (ForteBio) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя. Анализ проводили при 30°С с использованием ФСБ, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% БСА в качестве рабочего буфера. После того как в буферном растворе прописывали базовую линию сенсоры погружали в лунки с раствором антител на 300 сек, где происходила ассоциация комплекса. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течение 600 секунд. Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1 : 1 Global.
Полученные данные (Таблица 2) показали, что антитело специфически и с высокой аффинностью связывается с антигеном человека.
Таблица 2. Характеристика аффинности антитела МА-043
Figure imgf000062_0001
Пример 3. Получение клеточной линии, стабильно продуцирующей антитело е формате IgGl, и наработка антитела.
Последовательности тяжелой и легкой цепей антитела МА-043 были получены, как описано в Примере 1, и клонированы в векторы pSX по сайтам рестрикции Hindlll, Xbal. Полученные плазмиды нарабатывали в клетках Е. coli и выделяли с помощью прибора BenchPro 2000 (Life Technology, США) согласно инструкции производителя в количестве 600- 700 мкг. Плазмиды линеаризовали в течение ночи с помощью эндонуклеазы Pvul, затем осаждали этанолом, осадок растворяли в воде, концентрация в конечном объеме составляла 900-1100 нг/мкл. Клеточную линию СНО-К1- S культивировали в среде Ham’s F12 Gibco (Thermo, США). Трансфекцию генетическими конструкциями, содержащими кодирующие последовательности цепей МА-043 проводили с помощью электропорации на приборе Nucleofector™ (Lonza, Швейцария) согласно протоколу производителя. На следующий день после трансфекции в течение 24 дней проводили антибиотическую селекцию трансфецированных клеток, добавляя в среду пуромицин (конечная концентрация 7,2 мкг/мл) и гигромицин Б (конечная концентрация 640 мкг/мл). Далее были отобраны гомогенные по структуре устойчивые к антибиотикам клеточные клоны, экспрессирующие на высоком уровне МА- 043.
Для культивирования CHO-K1-S, экспрессирующие МА-043 использовали бессывороточную среду Ham’s F12 Gibco (Thermo, США) с добавлением 25-100 мкМ 2-дезокси-2-фтор-Б-фукозы (CarboSynth, В елико британия) .
Наработку моноклонального антитела МА-043 для доклинических исследований проводили в ферментере HyClone single-use bioreactor (Thermo Fisher Scientific) рабочим объемом 50 л. Удаление клеток продуцентов из культуральной жидкости проводили с помощью глубинного фильтра Millistak C0HC (Merck-Millipore, США). Первичную очистку антитела из осветленной культуральной жидкости проводили на аффинном сорбенте с белком А. Специфическую элюцию целевого белка проводили в кислых условиях рНЗ.З-З.8 в глициновом буфере. Полученный элюат выдерживали в кислом pH в течение 30-60 минут для вирусной инактивации, а затем нейтрализовали 1М раствором Tris-HCl до значения pH 6.5-7.0. Для удаления возможных примесей (ДНК, белков клеток продуцента, отщепленного лиганда аффинного сорбента, агрегатов и фрагментов антител) финальную хроматографическую очистку в режиме проскока проводили на сорбенте CaptoAdhere (GE Healthcare LifeSciences, США) Для этого раствор белка пропускали через подготовленный сорбент, уравновешенный трис-буфером с pH 6, 5-7,0 при низком значении кондуктивности (< 3 мС/см2).
Очищенный белок подвергали противовирусной фильтрации с использованием набора фильтров Viresolve PRO (Millipore, США), концентрированию и диафильтрации против конечного буфера, содержащего ацетатный буфер (pH 5, 0-5, 5) и трегалозу.
Пример 4. Применение антитела для специфического связывания с фрагментом бета-цепи Т-клеточного рецептора семейства рецепторов TRBV9
Моноклональные антитела МА-043, полученные как описано в Примере 3, использовали для сортировки субпопуляций лифоцитов. Антитела метили флуоресциином с помощью реагента флуоресциин изотиоцианат (Sigma, США) по протоколу производителя. Контроль количества флуорофоров, вступивших в реакцию с молекулами антитела, осуществляли по соотношению спектра поглощения при длинах волн 495/280 нм.
Т-лимфоциты получали из периферической крови здорового донора. Кровь собирали в пробирки Vacuette с EDTA (по 2x9 мл), мононуклеарную фракцию согласно стандартной методике, описанной в (Ковальчук Л. В. и др. Иммунология: практикум - 2010. - 176 с.). После выделения клетки переносили в фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 шМ ЭДТА. Суммарное количество клеток и их жизнеспособность определяли по методу окрашивания с трипановым синим как описано Лангом Н.Р. (Стимуляция лимфоцитов М.:Медицина, 1976.-288 с). К клеточной суспензии добавляли равный объем 0,1% раствора трипанового синего, далее проводили подсчет окрашенных (мертвых) и неокрашенных синих клеток в камере Горяева. На основании этих данных делался вывод о проценте мертвых клеток в исследуемом образце.
Для подтверждения селективности связывания МА-043 с целевой популяцией Т-лимфоцитов, несущих на своей мембране ТКР, относящийся к семейству TRBV9, аликвоты клеток по 500 тыс из мононуклеарной фракции, добавляли к буферу PBS, содержащему 0.5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2 тМ ЭДТА рН8, антитела МА-043, меченые FITC, CD3-eFluor405 (маркер Т-лимфоцитов) (eBioscience, США) и CD45-PC5 (eBioscience, США) (общий лейкоцитарный маркер) в концентрации 100 нг/мл. Реакционные смеси объемом 50 мкл инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после этого клетки промывали буфером PBS с 0.5% БСА 2m М ЭДТА. Клетки после процедуры окрашивания использовали для сортировки с помощью проточной цитометрии (FACSARIA III, США). Использование этих маркеров при покраске позволило изолировать клетки целевой популяции, которые несли на своей поверхность TRBV9+, CD3+, CD45+, а также получить клетки из негативной популяции, то есть соответствующие иммунофенотипу «TRBV9-, CD3+, CD45+».
Полученные в двух повторностях клетки из популяций «TRBV9+» и «TRBV9-» использовали для выделения суммарной РНК и секвенирования последовательностей бета цепей ТКР. Полученные фракции клеток помещали в RLT-буфер (Quagen, Германия) и выделяли из них РНК с помощью набора реактивов Quiagen RNAeasy mini kit #217004 (Quagen) согласно протоколу производителя. На матрице выделенной РНК синтезировали к ДНК и амплифицировали фрагменты бета цепи Т- рецептора по протоколу, описанному Britanova et al (J Immunol, 2016, 196 (12) 5005-5013) с использованием набора реактивов Mint cDNA synthesis kit (Евроген, Россия). К наработанным ампликонам лигировали адаптеры Illumina (США) и секвенировали на платформе MiSeq Illumina согласно протоколу производителя секвенатора. Данные секвенирования анализировали с помощью программ MiGEC, MiXCR и VDJtools, представленных на сайте в сети Интернет: https://milaboratory.com. Анализ полученных репертуаров бета цепей ТКР показал, что библиотеки, полученные в результате сортировки с помощью антитела МА-043, были обогащены на 91% последовательностями, которые кодировались генным сегментом TRBV9. Тогда как в репертуарах бета цепей негативной фракции «TRBV9-» последовательностей, содержащих TRBV9, обнаружено не было.
Пример 5. Функциональная активность антитела МА-043
Моноклональное антитело МА-043 получали как описано в Примере 3. Мононуклеарную фракцию крови человека получали как описано в Примере 4.
Дополнительно из части мононуклеарной фракции осуществляли выделение естественных киллеров с помощью набора реагентовдля выделения NK клеток человека # 130-092-657 (Miltenyi biotec, США). Использовали протокол производителей. Качество выделения NK клеток оценивали с помощью цитофлуометрии (BD FACS ARIA III, США) с использованием меченных антител CD16- FITC, CD56-PE, CD3-VioBlue. Обогащение NK клетками составляло 85-95%.
Для оценки цитотоксичности к аликвоте мононуклеарной фракции, содержащей 1 х 106 клеток добавляли антитела МА-043 до конечной концентрации 500 нг/мл. В качестве негативного контроля использовали антитела ремикэйд в такой же концентрации, как и МА-043. К контрольной аликвоте клеток (положительный контроль) антитела не добавляли. Также во все реакционные смеси добавляли по 105 NK клеток. Конечный объем реакции составлял 100 мкл. Реакционные смеси инкубировали при комнатной температуре один час, далее клетки отмывали несколько раз от антител и разносили по лункам 96 -луночного кругло донного планшета, на столе.
Через 6 дней клетки собирали из лунок и использовали для иммунофенотипического анализа с помощью проточной цитометрии. Для детекции Т лимфоцитов были использованы следующие антитела: anti-CD3- eFluor450 (клон ОКТЗ, eBioscience); anti-CD8-PC7 (клон SFCI21Thy2D3, Beckman Coulter, США); MA-043, меченые Fite.
После окрашивания клетки отмывали и анализировали на приборе BD FACSARIA III. Т-лимфоциты CD3+ МА-043+ в образцах, подвергшихся инкубации с МА-043 антителами настоящего изобретения, не обнаруживаются.
В то же время в контрольном образце без добавления антитела (“ноль- контроль”), а также с добавлением терапевтических антител ремикейд детекция двойных позитивных Т-лимфоцитов по маркерам CD3+ МА-043+ сохраняется, что подтверждает специфическую элиминацию Т-клеток TRBV9+ при добавлении антител против TRBV9.
В дополнительном негативном контроле, где вместо МА-043 антител настоящего изобретения использовались нецитотоксические антитела против CD6, целевая популяция CD3+CD6+ не менялась по сравнению с “ноль-контролем”. Это указывает, что экранирования эпитопа не меченными антителами на 6 день не происходит и подтверждает способность МА-043 антител элиминировать клетки, несущие ТКР семейства TRBV9.
Пример 6. Получение фармацевтической композиции , содержащей антитело согласно изобретению
Фармацевтическую композицию получали стандартными методами, которые известны из уровня техники.
Компоненты фармацевтической композиции показаны в Таблице 3. Таблица 3. Концентрации компонентов фармацевтической композиции
Figure imgf000068_0001
Пример 7. Набор, содержащий фармацевтическую композицию с антителами
Для выпуска наборов с лекарственной формой, содержащей композицию с антителом МА-043, фармацевтическую композицию, полученную согласно примеру 6 запаивают в ампулы или шприцы объемом 1 мл в стерильных условиях, маркируют и упаковывают в контейнеры из пластикового или картонного материала.
Также в контейнер с ампулой вкладывают инструкцию по применению.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110 > ЗАО "БйОКАД”
3SC "BIOCAD"
<12q> Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9- го семейства TRSVS ТКР человека, и способы их применения
< 13Q > MAQ43 , d осх
<1dQ> 22
<178> Patentln vers ion 3 , 5
«2ΐq> 1
<2П> 5
<212> R?
<213> Artificial
< 2®>
<223> Последовательность HC0R1 родительского антитела TR8VS-2
<40® > 1
Asp Туг Leu vai His
2 5
<2ί0> 2
<212> 27
<212> PRT
<213> Artificial
<228>
<223> Последовательность HCDR2 родительского антитела TR8V9-2
<408> 2
Trp He Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 61u
1 s 28 15
Gly
<2ie> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<228>
<223> Последовательность HCDR3 родительского антитела TR8V9-2
<408> 3
Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly He Gly Phe Asp Tyr
1 5 20
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial <228>
<223> Последовательность LC0R1 родительского антитела TR8V9-2
<48b> 4
Lys Ala Ser Lys Ser He Asn Lys Туг leu Ala
1 5 10
Figure imgf000070_0001
<22®>
<223> Последовательность ICDR2 родительского антитела TR8V8-2
<40®> S
Asp Sly Ser Thr Leu Gin Ser
1 5
<218> 6
212 9
<212> PRT
<213> Artificial
<228>
<223> Последовательность LCOR3 родительского антитела TR8V8-2
<408> 6
Gin Gin His Asn Glu Туг Pro Pro Thr
1 s
Figure imgf000070_0002
<228>
<223> Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела TRSV9-2
Figure imgf000070_0003
agtfgtasgg ccagcggata cactttcact gactatctcg tgeactgggt gaascagget 220 cccggt3agg gattgaaatg gatgggatgg atcaatactt ataccggcac acctacatat 180 gcagacgatt tcgaggggcg atttgtgttc agtttggagg: eetetgcesg cacggcgasc 240 ctgcagatat egaatctcaa gaatgaggac acegecacgt atttctgcgc tagatcttgg 380 agacgcggat tgsgaggtst cggattcgae tactggggac aaggcgtctt egtgaetgta 368 tcatcc 366
Figure imgf000070_0004
<213> Artificial
Figure imgf000071_0001
<488> 8
Sir's lie Sin Leu Val Gin Ser Sly Pro 6X« Leu Arg GIu Pro Sly 61u
1 5 18 15
Ser Val lys Leo Ser Cys Lys Ala See Sly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
28 * 25 ' 38 leu Val His Trp val Lys Sin Ala Pro Sly lys GXy leu Lys Trp Set
35 48 45
Sly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Sly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
58 55 68
Slu Sly Arg Phe Val Phe Ser Leo Slo Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 7Й 75 08 leu Sin Tie Ser Asn Leu Lys Asn Slu Asp Thr Ala Thr yr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Sly Leu Arg Gly He Sly Phe Asp Ty Trp
108 105 118
Sly Gin Sly Val Phe Val Thr Val Ser Ser
IIS 120 210 9
<211> 321
<212> DNA
<213> Artificial
<228>
<223> Нукдеотиднан последовательность вариабельного домена легкой цепи родительского антитела TR8V9-2
<4®0> 9
gatgtaeaga tgacacaatc accctacaac cttgctgctt eccctgggga aagtgtcagt 60 stcaattgca sggcatcgaa gtcgatcaac aagtat ttg cgtggtatca gcagaagcca 120 ggaaagccca acaagctcct gatctatgac ggctctacac tgcaatctgg cataccttcg 180 cggttttctg gctcggggtc cgggactgac ttcactctta caatacgagg acttgaaccc 240 gaagacttcg gcctgtatta ct ccagcag cacaatgagt atccacctac cttcggggct 308 ggcsceaagt tggagettaa g 321
<218> 10
<211> 187 <m> PRT
<213> Artificial
<226>
<223> Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой
цепи родительского антитела TRSV9-2
<460> 16
Asp Val Gin Met Thr Gin Sen Pro Туг Asa leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 S 18 15
Glu Ser Val Ser lie Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser He Asm Lys Tyr
28 ' 25 36 leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu He
35 46 45
Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Glfl Ser Gly .Tie Pro Ser Arg Phe Ser Gly
S@' SS 66
Ser Gly Ser sly Thr Asp Phe Thr leu Thr He Arg Sly Leu Glu Pro
SS 70 75 86
Glu Asp Phe Giy Leu yr Tyr Cys Gin Gin His Asn Glu Tyr Pro Pro
85 " 90 SS
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leo Glu leu Lys
168 10S
<210> 11
<211> 63S
<212> DNA
<213» Artificial
<22S>
<223> Нуклеотидная последовательность легкой цепи родительского
антитела TR8V9-2
<460> 11
gaegtgcaga tgacccagtc cccctacaac ctggccgcct cccccggcga gtccgtgtcc 60 atcaaetgca aggcctccaa gtccatcaac aagtacctgg cctggtacca gcagaagccc 126 ggcaagccca acaagctgct gatctacgac ggctcceccc tgcagtccgg catcccctcc 180 aggttctccg gctceggctc cggcaccgac ttcaccctgs ccatcagggg cctggagcec 246 gsggacttcg gcctgtacts ctgecageag cacaacgagt acccccccac cttcggcgcc 380 ggcaccasge tggagctgaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcecgcea 368 tctgatgagc agttgasatc tggaactgcc tctgtcgtgt gcctgctgaa taacttctst 420 cccagagagg ccsaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccsatcggg taactcccsg 48Q gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag eaccctgacg 54Q ctgageaaag tagactscgs gaaacscaaa gtctacgcct gcgaagicae ccatcsgggc dbb ctgtcctcgc ccgtcacaaa gsgcttcaac aggggsgsg 639 2W> 12
<2ll> 223
an> PRT
<213> Artificial
Figure imgf000073_0001
<4 Ш> 12
Asp Val 61n Met ты
Figure imgf000073_0002
Ser Pro Туг Asn leu Ala Ala Sen Pro Sly
X 5 28 25
Slu Se Val Ser lie Asn Cys Lys Ala Sen Lys Ser Ils Asn Lys Тут
28 25 38
Leo Ala Trp Туг Sin Sin tys Pr Sly Lys Pro Asn Lys leu Leu lie
35 4g 45
Tyr Asp Sly Ser Thr Leu Sin Sen Sly lie Pro Ser Arg Phe Sen Sly
58 5 68
Ser Sly Ser Sly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Arg Sly Leo Slu Pro
65 78 75 88
Slu Asp Phe Sly Leu Tyr Tyr Cys Sin Sin His Asn Slu Tyr Pro Pro
85 ' 88 95
Thr phe Sly Ala Sly Thr Lys Leu Slu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
188 " 285 218
Pro Sen Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Slu Sin Leu Lys Ser Sly
US 128 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Lao Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Slo Ala
238 133 140
Lys Val Sin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Sin Ser Sly Asn Ser Sin
245 158 155 268
Slu Ser Val Thr Slu Sin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leo Ser
165 278 275
Ser Thr Leo Thr Leu Ser lys Ala Asp Tyr Slo ys His Lys Val Tyr
28S 185 198
Ala Cys Slu Val Thr His 61n Giy Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 19S 288 28S
РИе Asa Arg: Sly Gl
218
<m> i3
<2tl> 23SS
<212> А
<213> Artificial
Figure imgf000074_0001
<4Й8> 13
cagatccagc tggtgcagtc cggccecgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgsagctg 60 tcctgcaagg cctccggcts csccttcacc gaetacetgg tgcactgggt gaagcaggcc 128 cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccceaectae 180 gccgscgact tegagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccasc 248 ctgcagatct ccsacctgaa gsacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtectgg 380 aggaggggcc tgaggggcat cggcttcgac tactggggce agggcgtgtt cgtgaccgtg 360 tcctccgcct ceaceaaggg eccatcggtc ttceccctgg caccctcotc caagagcaec 428 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgeaca ccttcccggc tgtcctacag 548 tcctcaggse tctactccct eagcagegtg gtgactgtgc cctetageag efctgggcace 680 cagaccfcaea tctgcaaegt gsatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 568 gsgeccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccsge acctgaactc 720 etggggggac cgtcagtett cctcttcccc ccsaaaccea aggacaccct catgatctcc 788 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagce acgaagaccc Igaggtcaag 840 tteaactggt acgiggacgg cgtggaggtg cataafgcca agacaaagcc gcgggaggag 908 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 360 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080 cgggatgagc tgaecaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1148 agcgaeatcg ccgtggagtg ggagagcaat iggcagccgg agaacsacta caagaccacg 1280 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1268 sgcaggtggc agcaggggas cgtcttetea tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1328 cactacacgc agaagagcet ctccctgtct ccgggteast gataa 1365
<218> 14 <2Л> 453
<222> P8T
«213> Artificial
<22®>
<223> Аминокислотная последовательность тянеа а цеп» родительского антитела T8SV9-2
48®ϊ* 24
Gin lie Sin leu Val dΐh Ser Gly Pro Slu LSU Arg Slu Pro C-iy Siu 1 5 is IS
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Sly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
2® 25 38 leu Val His Trp V'al tys Gin Ala Pro Sly Lys Sly Leo tys Trp Met 35 48 45
Sl Trp He Asn Thr Tyr Thr Sly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 58 55 68
Slu Sly Arg Phe Val Phe Ser leu Slu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 70 7S 88
Leu Slo lie Ser Asn Leu Lys Asn Slu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 9® $5
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Sly Leu Arg Sly He Sly Phe Asp Tyr Trp
188 105 218
Sly Sin Sly val Phe val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys sly Pro 115 120 225
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser lys Ser Thr Sen Sly Sly Thr 138 135 24#
Ala Ala Leo Sly Cys Leu Val tys Asp Тут Phe Pro Slu Pro Val Thr 245 150 2S5 168
Val Ser Trp Asn Se Sly Ala Leu Thr Ser Sly Val His Thr Phe Pro
265 178 175
Ala Val Leu sin Ser Ser Sly tee Tyr Ser Leu Sar Ser Val Val Thr
288 285 298 val Pro Sen Ser Ser Leo Sly Thr Sin Thr Tyr He Cys Asn Vsi Asn 295 288 285
His Lys Pro Ser Asn Thr lys val Asp tys tys Val Slu Pro Pro Lys 218 215 228 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Poo Sly leu 225 230 235 248 leu sly ly Pro Ser val Phe leu Phe Pro Pro lys Pro Lys Asp Thr
245 258 255
Leu Het He Ser Arg Thr Pro Slu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
268 265 278
Ser His Slu Asp Pro Slu Val lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Sly Val
275 2S0 285
Slu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Slu Slu Sin Tyr Asn Ser 298 295 ' 388
Thr Tyr Arg Val Val Ser Vsl leu Thr Val Leo His Sir Asp Trp Leu 385 318 315 328
Asn Sly lys Slu Tyr lys Cys lys Val Ser Asn lys Ala Leu Pro Ala
325 338 335 pro Tie Slu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Sly Sin Pro Arg Sly Pro
348 345 350
Sin Val Tyr Thr leu Pro Pro Ser Arg Asp Slu Leu Thr Lys Asn Gin 355 368 365
Val Ser leu Thr Cys Leo Val Lys Sly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala
370 375 ' 388 val Slu Trp Slu Ser Asn Sly Gin Pro Slu Asn Asn Tyr lys Thr Thr 385 308 38$ 480 pro Pro Val leu Asp Ser Asp Sly Ser Phe Phe leu Tyr Ser Lys Leu
405 428 425
Thr Vsl Asp Lys Ser Arg Trp Sin Sin Sl Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Het His 81u Ala Leo His Asn His Tyr Thr Gin lys Ser leu Ser 435 448 445
Leu Ser Pro Gly Lys
458
<210> 15
<21i> 366
<212> O A
<213> Artificial <228>
<223> Нукдеотиднав последовательность вариабельного домена тяжелой цепи антитела Д-843
<488 > 15
caggtgcasc ttgttcsgtc ggggcctgaa cttaagaagc caggggaaag tgtaaaagtg 68 agetgcaaag cctcaggcta cacgtttacc gattatcttg tgcattgggt tagaca gct 128 ccaggtaagg gactggaatg gatgggatgg atcaatacct ataeagggac acccacatat 288 gccgatgact tigagggacg gtttgtcttc tcacttgata ccagtgcgtc csctgctaac 248 ctccagatat gcagcctgaa gaatgaggac acegecacct attactgcgc ccgatcatgg 388 aggagaggcc t3cgaggaat cggattegat tactggggtc agggcactt :t agtcactgtc 368 tctagc 366
<218> 16
<2ll> 122
<212> РЙТ
<213> Artificial
<228>
<223» Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи родительского антитела МД -843
<488» 16
Sin Val Gin leu Val 61n Ser Sly Pro Glu Leu lys Lys Pro sly Glu
2 5 18 is"
Ser Val Lys Val Ser Cys lys Ala Ser Sly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
28 2S 38
Leu Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys 61y Leu Glu Trp Met
35 40 45
Sly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ale Asp Asp Phe
68 55 " 60
Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65 78 75 88
Leu Gin lie Cys Ser leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tvr Tyr Cys
85 98 ' 95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Sly lie Sly Phe Asp Tyr Trp
188 185 118
Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<218> 17 <2il> 321
<212> ОНА
<213> Artificial
228
<223> Нуклеотидная последовательность ва иабельного домена легкой цепи антитела мд-843
<488> 17
gacatacaga tgactcaaag cccttattcg ctcagtgcgt cggtcgggga cagagtaacc 68 atcacctgca sggcgtcsaa gfccaatcaat aagtstctgg cgtggttcca gcagaagcca 128 ggaaagceta acaagetatt aatatacgat gggtctaccc tccaatccgg ggtcccttce 1S8 egattttctg gaegcggctc aggasccgat ttcscgctga ccatcagtag cttggagcct 248 gaggactttg ccacttatta ttgccagcag cacaacgagt atcctcccac cttcggacag 388 ggtacaaaac tggsgatcaa g 321 18
Figure imgf000078_0001
Artificial
<228>
<223> Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи антитела МА-843
<488> 18
Asp lie dΐo Met Thr Gin Ser Pro Tyr Ser Leo Ser Ala Ser val Sly
1 ' S 18 IS
Asp Arg Val Thr I Thr Cys Lys Ala Ser lys Ser lie Asn Lys Tyr
28 25 38 leu Ala Trp Phe Sin Sin lys Pro Sly lys Pro Asn Lys Leu Leo lie
3:5 48 45
Tyr Asp Sly Ser Thr Leu Sir Ser sly Val Pro ser Arg Phe Ser Sly
58 ' 55 68
Ser sly Ser Sl Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu slu Pro
&S * 70 7S 88
Slu Asp Phe Als Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin His Asn filu Tyr Pro Pro
SS 98 9S
Thr Phs Sly Gin Sly Thr Lys Leu Slu He L s
188 ' 18S
<218> 18
<211> 13S6
<212> DfiA
<213> Artificial <228>
<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи антитела МД-843
<408> 19
caggtgcaac ttgttcagtc ggggcctgaa cttsagasgc caggggaaag tgtoaaagtg 6§ agctgcaaag cctcsggcta cacgtttacc gattatcttg tgcattgggt tagacaggct 220 ccaggtaagg gactggaatg gstgggatgg atcaatacct atacaggga acccacatat 180 gccgatgsct ttgagggacg gtttgtcttc tcacttgata ccagtgtgtc cactgctaac 240 ctccagatat gcagectgaa gaatgaggac aeegecscct attactgcgc ccgatcatgg 338 aggapggcc tscgaggaat cggattcgat tactggggtc agggcacttt agtcsctgte 360 tctsgegeta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg eaecctcctc eaagagcacc 428 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gteasggact acttteccga aeeggtgscg 488 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 548 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgsccgtgc cctccagcag cttgggcscc 600 cagacetaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 668 gagcccaaat cttgtgac3s sactcacaca fcgcccaccgt gcecagcacc tgaactcctg 728 gggggsccgt cegtcttcet Ctttccccca saacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 scccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 848 aactggtacg tggscggcgt ggaggtg at aatgceaaga caaagccgcg ggaggagcag 988 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccaggs ctggctgast 968 ggcaaggagt acaagtgcas ggtctccaac aaagccctcc csgeccccat cgagaasacc 1028 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1880 gaggagatga ccaagaacea ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcceagc 2X40 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggags acaaetaeaa gaccacgcct 1288 cccgtgctgg aetecgaegg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 22S8 sggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 2328 tacacgcaga assgcctctc cctgtccccg ggtaaa 1356
<22b> 28
<211> 4S2
<212> РЙ7
<223> Artificial
<22 >
<223> Амннокиелотнай последовательность тяжелой цепи антитела мд -043 <488> 28
Sin Vsl Sin Leo Val Gin Se Sly Pro
Figure imgf000079_0002
Figure imgf000079_0001
Ser Val Lys val Ser Cys lys Ala Ser Sly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 28 2S 38 leu Val His Trp Val Arg Sin Ala Pro Sly Lys Sly Leu Slu Trp Met 35 48 45
Sly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Sly Thr Pro Thr Туг Ala Asp Asp Ph« 50 55 68
Slu Sly Arg pfce Val Phe $er « Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Asn 65 78 75 88 Thr Tyr Tyr Cys
Figure imgf000080_0001
95
Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Sly lie Sly Phe Asp Tyr Trp
108 185 110
Sly Sin Sly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Sly Pro 115 128 12S
Ser Val Phe Pro leu Ala Pro Ser Sen Lys Ser Thr Ser Sly Sly Thr 138 235 148
Ala Ala Leu Sly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Slu Pro Val Thr 145 158 155 168
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Sly Val His Thr Phe Pro
165 178 175
Ala Val leu Sin Ser Ser Sly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
188 185 198
Val Pro Ser Ser Ser Leu Sly Thr Sin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn 185 28® 28S
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg val Slu Pro lys Ser 210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Slu Leu Leu 225 230 ' 235 240
Sly Sly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
24S 258 255
«et He Ser Arg Thr Pro Slu Val Thr Cys val Val Val Asp Val Ser
268 265 270 His Glu Asp Pro Sly Val Lys Phe Asn Trp Туг Val Asp Sly Val Glu
275 288 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Sly Giu Gin Tyr Asn Sen Thr
298 295 300
Tyr Arg Val Val Sen Val Leu Thr Val Leu His sin Asp Trp Leu Asn
305 310 115 320
Sly Lys 6Iu Tyr Lys Cys Lys Val Sen Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 33S lie Glu Lys Thr lie S er lys Ala Lys Gly Sin Pro Arg Glu Pro Gin
340 345 358
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Hot Thr Lys Asn Gin Val
355 368 365
Ser Leu Thr Cys leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala val
370 37S 388
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
38:5 390 395 400
Pro Val leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
485 410 415 val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vsl Phe Ser Cys Ser Val
428 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<2i8> 21
<211» 642
<212» OKA
<213» Artificial
<228>
<223» Нуклеотидная последовательность легкой цепи антитела КА-043 <408> 21
gacatacaga tgactcaaag ecettattcg ctcagtgcgt eggtcgggga cagagtaace 60 ateacctgca aggcgtcaaa gtcaatcaat aagtatctgg cgtggttcca geagaagcca 120 ggaaagccta acasgctatt aatatacgat gggtctaccc tccaatccgg ggtcccttca 188 cgattttctg gaagcggctc aggaaccgat ttcacgctga ccatcagtag cttggagcct 240 gaggactttg ecacttatta ttgccagcag cacsacgagt stcctcccac cttcggscag 388 ggtscaaaac tggegatesa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 368 tctgatgagc agttgaaate tggaactgcc tctgttgtgt gcetgetgsg taaetlctat 428 tccagagagg ccssagtaca gtggaaggtg gatascgcce tccastcggg taaetcccag 488 gagagtgiea cagagcagga cagcaaggac agcacetaca gcctcagcag caccctgscg 548 ctgagcaasg cagactacga gaaaeacaaa tctaegcct gcgaa tear ccatcagggc 680 etgagctcgc ccglcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<218> 22
<211> 214
<212> PRT
<213» Artificial
Figure imgf000082_0001
043 <408> 22
Asp lie Sin Met Thr Sin Sen Pro Tyr Ser lea Ser Ala Se VaX Sly
2 5 10 is
Asp Arg Val Thr He Thr Cys lys Ala S«r Lys Ser lie Asn Lys Tyr
28 2S 38
Isu Ala Trp Phe 6Xn GXn lys Pro Sly Lys Pro Asn Lys Leu Leo He
35 48 ' 45
Tyr Asp Qly Ser Thr Leu Sin Ser 61 Val Pro Ser Arg Phe Se Sly
58 S5 68
Ser Sly Ser Sly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser leu G!a Pro
65 78 75 88
Slu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr His Asn Slu Tyr Pro Pro
8S
Figure imgf000082_0002
95
Thr he Sly Sin Sly Thr Lys Leu Slu He lys Arg Thr Val Ala Ala
188 185 210
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Slu sin Leu lys Ser Sly
215 128 125
Thr Ala Ser val Val Cys leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Slu Ala
138 US 140
Lys Val Sin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Sin Ser Sly Asn Ser Sin
245 150 155 168 Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser lys Asp Ser Thr Туг Ser Leu Ser 165 17Q 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Giu Lys His Lys Val Tyr
189 18S * 199
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 290 295
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims

Формула изобретения:
1. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV- 9 Т-клеточного рецептора человека, включающее вариабельный домен тяжелой цепи, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 16 и вариабельный домен легкой цепи, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 18.
2. Моноклональное антитело по п. 1, которое включает тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
3. Моноклональное антитело по любому из пп. 1-2, которое представляет собой полноразмерное антитело IgG.
4. Нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.
5. Нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с участком бета цепи семейства TRBV9 Т-рецептора человека.
6. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по и. 4.
7. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по и. 5.
8. Способ получения клетки -хозяина для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из и. и. 1-3, включающий ^трансформирование клетки вектором по и. 6 и вектором по и. 7.
9. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из и. и. 1-3, содержащая нуклеиновую кислоту по и. 4 и нуклеиновую кислоту по и. 5.
10. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1 -3, заключающийся в культивировании клетки-хозяина по п. 9 в культуральной среде в условиях, обеспечивающих продукцию указанного антитела, с последующим выделением и очисткой полученного антитела.
11. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого участком бета цепи семейства TRBV9 Т-клеточного рецептора человека, содержащая в терапевтически эффективном количество антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из п.п. 1-3, в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
12. Фармацевтическая композиция по и. 11, где указанные заболевание или нарушение выбирают из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
13. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, содержащая в терапевтически эффективном количестве антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3 и, по меньшей мере, другое терапевтически активное соединение в терапевтически эффективном количестве.
14. Фармацевтическая композиция по п. 13, где указанные заболевание или нарушение выбирают из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
15. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 13-14, где другое терапевтически активное соединение выбирают из малой молекулы, антитела или стероидных гормонов.
16. Способ ингибирования биологической активности Т-клеточного рецептора, бета цепь которого относится к семейству TRBV9, у субъекта, нуждающегося в таком ингибировании, включающий введение субъекту эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из п.п. 1-3.
17. Способ лечения заболевания или нарушения, опосредованного Т- клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пи. 1 -3 или фармацевтической композиции по любому из пи. 11-15 в терапевтически эффективном количестве.
18. Способ лечения заболевания или нарушения по и. 17, где заболевание или нарушение выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
19. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пи. 1-3 или фармацевтической композиции по любому из пи. 11- 15 для лечения у субъекта, нуждающегося в таком лечении, заболевания или нарушения, опосредуемого Т-клеточным рецептором человека, несущим бета цепь семейства TRBV9.
20. Применение по и. 19, где заболевание выбрано из группы: анкилозирующий спондилит, целиакия, Т-клеточный лейкоз, Т-клеточная лимфома.
PCT/RU2020/050024 2018-12-25 2020-02-20 Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения WO2020139175A2 (ru)

Priority Applications (19)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202080016346.4A CN114144432A (zh) 2018-12-25 2020-02-20 针对人TRBV9的β链区域的单克隆抗体
PE2021001081A PE20220217A1 (es) 2018-12-25 2020-02-20 Anticuerpos humanizados contra la region de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus metodos de uso
US17/417,686 US20220112286A1 (en) 2018-12-25 2020-02-20 Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9
JP2021537707A JP2022532274A (ja) 2018-12-25 2020-02-20 ヒトｔｒｂｖ９のベータ鎖領域に対するモノクローナル抗体
JOP/2021/0169A JOP20210169A1 (ar) 2018-12-25 2020-02-20 أجسام مضادة أحادية النسيلة ضد منطقة سلسلة بيتا من trbv9 بشري
CA3124813A CA3124813A1 (en) 2018-12-25 2020-02-20 Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9
SG11202106975VA SG11202106975VA (en) 2018-12-25 2020-02-20 Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9
AU2020204492A AU2020204492A1 (en) 2018-12-25 2020-02-20 Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9
MA53689A MA53689B1 (fr) 2018-12-25 2020-02-20 Anticorps humanisés contre un fragment bêta d'une chaîne de la famille 9 du récepteur cellulaire trbv-9 de l'humain et méthodes de leur application
EP20734640.4A EP3907239A4 (en) 2018-12-25 2020-02-20 MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST THE BETA CHAIN REGION OF HUMAN TRBV9
MX2021007719A MX2021007719A (es) 2018-12-25 2020-02-20 Anticuerpos humanizados contra la region de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus metodos de uso.
CR20210354A CR20210354A (es) 2018-12-25 2020-02-20 Anticuerpos humanizados contra la región de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus métodos de uso
KR1020217023568A KR20220131489A (ko) 2018-12-25 2020-02-20 인간 trbv9의 베타 쇄 영역에 대한 단일클론 항체
BR112021012555-8A BR112021012555A2 (pt) 2018-12-25 2020-02-20 Anticorpos monoclonais contra a região de cadeia beta do trbv9 humano
EA202191813A EA202191813A1 (ru) 2018-12-25 2020-02-20 Моноклональные антитела против участка бета-цепи trbv9 человека
CONC2021/0008218A CO2021008218A2 (es) 2018-12-25 2021-06-23 Anticuerpos humanizados contra la región de la cadena beta de la 9na familia trbv9 del tcr humano, y sus métodos de uso
ZA2021/04357A ZA202104357B (en) 2018-12-25 2021-06-24 Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9
IL284370A IL284370A (en) 2018-12-25 2021-06-24 Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9
PH12021551532A PH12021551532A1 (en) 2018-12-25 2021-06-25 Monoclonal antibodies against the beta chain region of human trbv9

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018146031A RU2712251C1 (ru) 2018-12-25 2018-12-25 Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства TRBV9 TKP человека, и способы их применения
RU2018146031 2018-12-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2020139175A2 true WO2020139175A2 (ru) 2020-07-02
WO2020139175A3 WO2020139175A3 (ru) 2020-10-29

Family

ID=69184123

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/050258 WO2020091635A2 (ru) 2018-12-25 2019-12-24 Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения
PCT/RU2020/050024 WO2020139175A2 (ru) 2018-12-25 2020-02-20 Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2019/050258 WO2020091635A2 (ru) 2018-12-25 2019-12-24 Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20220112286A1 (ru)
EP (1) EP3907239A4 (ru)
JP (1) JP2022532274A (ru)
KR (2) KR20210119404A (ru)
CN (2) CN113646333A (ru)
AR (1) AR117734A1 (ru)
AU (1) AU2020204492A1 (ru)
BR (1) BR112021012555A2 (ru)
CA (2) CA3127767A1 (ru)
CL (1) CL2021001705A1 (ru)
CO (2) CO2021008218A2 (ru)
CR (1) CR20210354A (ru)
EA (1) EA202191813A1 (ru)
EC (1) ECSP21046333A (ru)
IL (1) IL284370A (ru)
JO (1) JOP20210169A1 (ru)
MA (1) MA53689B1 (ru)
MX (1) MX2021007719A (ru)
PE (1) PE20220217A1 (ru)
PH (1) PH12021551532A1 (ru)
RU (1) RU2712251C1 (ru)
SG (1) SG11202106975VA (ru)
TW (1) TW202039574A (ru)
WO (2) WO2020091635A2 (ru)
ZA (1) ZA202104357B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116510006A (zh) * 2022-01-31 2023-08-01 拜奥卡德联合股份公司 抗trbv9抗体的药物组合物及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006758A1 (en) 1988-12-15 1990-06-28 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
WO1994005801A1 (en) 1992-08-31 1994-03-17 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
RU2017145662A (ru) 2017-12-25 2019-06-25 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Моноклональные антитела и способы их применения

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2765949C (en) * 2009-06-25 2016-03-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of measuring adaptive immunity
EP3202784A1 (en) * 2016-02-08 2017-08-09 Polybiocept AB T-cell receptor sequences for active immunotherapy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990006758A1 (en) 1988-12-15 1990-06-28 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
WO1994005801A1 (en) 1992-08-31 1994-03-17 T Cell Sciences, Inc. Monoclonal antibodies reactive with defined regions of the t cell antigen receptor
RU2017145662A (ru) 2017-12-25 2019-06-25 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) Моноклональные антитела и способы их применения

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Cell Biology", 2000, JOHN WILEY & SONS, INC.
"Remington, The Science and Practice of Pharmacy", 1995, MACK PUBLISHING CO.
BARANY, GENE, vol. 37, 1985, pages 111 - 123
BIRD ET AL., SCIENCE, vol. 242, 1988, pages 423 - 426
BRENNAN ET AL., CLIN EXP IMMUNOL., vol. 73, no. 3, September 1988 (1988-09-01), pages 417 - 423
BRITANOVA ET AL., J IMMUNOL, vol. 196, no. 12, 2016, pages 5005 - 5013
COLICELLI ET AL., MOL. GEN. GENET., vol. 199, 1985, pages 537 - 539
DUARTE J. ET AL., PLOS ONE, vol. 5, no. 5, 10 May 2010 (2010-05-10), pages e10558
FAHAM M ET AL., ARTHRITIS RHEUMATOL, vol. 69, no. 4, 2017, pages 774 - 784
GUSTIN ET AL., BIOTECHNIQUES, vol. 14, 1993, pages 22
HAROON N ET AL., ARTHRITIS RHEUM., vol. 65, no. 10, October 2013 (2013-10-01), pages 2645 - 54
HOLLIGER P ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 90, 1993, pages 6444 - 6448
HUSTON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, 1988, pages 5879 - 5883
KIPRIYANOV S.M. ET AL., HUMAN ANTIBODIES AND HYBRIDOMAS, vol. 6, 1995, pages 93 - 101
KIPRIYANOV S.M. ET AL., MOL. IMMUNOL., vol. 31, 1994, pages 1047 - 1058
KOMECH E ET AL., EJI-EFIS TATRA IMMUNOLOGY CONFERENCE, 3 September 2016 (2016-09-03)
KONIG M. ET AL., FRONT IMMUNOL, vol. 7, 25 January 2016 (2016-01-25), pages 11
KOVALCHUK L. V. ET AL., IMMUNOLOGY: WORKSHOP, 2010, pages 176
LEFRANC M-P.: "The international ImMunoGeneTics information system", NUCL ACIDS RES, vol. 29, 2001, pages 207 - 209
PETERSEN J ET AL., J IMMUNOL., vol. 194, no. 12, 2015, pages 6112 - 22
POLJAK R.J. ET AL., STRUCTURE, vol. 113, 1994, pages 1121 - 1123
SAMBROOK ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1989, GREEN PUBLISHING ASSOCIATES, pages: 3 - 108
TAYLOR L.D. ET AL., NUCL. ACIDS RES, vol. 20, 1992, pages 6287 - 6295
TOYABE S ET AL., CLIN EXP IMMUNO, vol. 134, no. 1, 2003, pages 92 - 97
TURNER SJ ET AL., NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, vol. V.6, 2006, pages 883 - 894
WARD ET AL., NATURE, vol. 341, 1989, pages 544 - 546
XU ET AL., FRONT. CHEM. SCI. ENG., vol. 9, no. 3, 2015, pages 376 - 380
Y ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., 2013
ZHIJUN LIU ET AL., DIABETES, vol. 61, no. 5, May 2012 (2012-05-01), pages 1160 - 1168

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11845797B2 (en) 2018-07-03 2023-12-19 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
US11965025B2 (en) 2018-07-03 2024-04-23 Marengo Therapeutics, Inc. Method of treating solid cancers with bispecific interleukin-anti-TCRß molecules

Also Published As

Publication number Publication date
CA3127767A1 (en) 2020-05-07
AR117734A1 (es) 2021-08-25
WO2020091635A2 (ru) 2020-05-07
MA53689A1 (fr) 2022-06-30
WO2020091635A3 (ru) 2020-10-22
PH12021551532A1 (en) 2022-02-28
SG11202106975VA (en) 2021-07-29
CN113646333A (zh) 2021-11-12
MA53689B1 (fr) 2023-03-31
JOP20210169A1 (ar) 2023-01-30
MX2021007719A (es) 2022-03-25
WO2020139175A3 (ru) 2020-10-29
ZA202104357B (en) 2022-09-28
JP2022532274A (ja) 2022-07-14
CO2021009689A2 (es) 2021-08-09
CN114144432A (zh) 2022-03-04
KR20220131489A (ko) 2022-09-28
CA3124813A1 (en) 2020-07-02
BR112021012555A2 (pt) 2021-09-14
CL2021001705A1 (es) 2022-01-28
US20220112286A1 (en) 2022-04-14
KR20210119404A (ko) 2021-10-05
EP3907239A4 (en) 2022-10-05
AU2020204492A1 (en) 2021-08-12
CR20210354A (es) 2021-12-20
CO2021008218A2 (es) 2021-07-30
RU2712251C1 (ru) 2020-01-27
TW202039574A (zh) 2020-11-01
ECSP21046333A (es) 2021-07-30
EA202191813A1 (ru) 2021-10-07
EP3907239A2 (en) 2021-11-10
IL284370A (en) 2021-08-31
PE20220217A1 (es) 2022-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2536764T3 (en) ANTI-CD28 HUMANIZED ANTIBODIES
CN107207588B (zh) 针对tau的抗体和其用途
US20230357396A1 (en) Monoclonal antibodies and methods for using same
CA3124800A1 (en) Monoclonal antibodies that bind specifically to human trbv9
WO2020139175A2 (ru) Гуманизированные антитела против участка бета цепи 9-го семейства trbv9 ткр человека, и способы их применения
EA041932B1 (ru) Моноклональные антитела, которые специфически связываются с участком бета цепи семейства trbv-9 т-клеточного рецептора человека, и способы их применения
EA041880B1 (ru) Моноклональные антитела и способы их применения
EA042982B1 (ru) Моноклональные антитела против участка бета-цепи trbv9 человека
US11746154B2 (en) CD1a antibodies and uses thereof
OA20246A (en) Monoclonal antibodies against the beta chain region of human TRBV9.
OA20245A (en) Monoclonal antibodies that bind specifically to human TRBV9.

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3124813

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021537707

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112021012555

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020734640

Country of ref document: EP

Effective date: 20210726

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20734640

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020204492

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20200220

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112021012555

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20210624