JPS6054687A - ヒト モノクロ−ン抗体の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はヒト　モノクローン抗体に関する。

融合してハイシリドーマ細胞にする前にヒト抗体を分泌
する細胞を株化（永続的に増殖しながら生存すること）
することを含む新規なモノクローン抗体製造法が開示さ
れており、ヒト細胞の表面抗原やヘルはス（庖疹）群に
関係するウィルスｔ−認識するヒト　モノクローン抗体
が開示されている 要　旨 この発明り以下を含むヒトＢ−リ／・９球からヒトのモ
ノクローン抗体を造る方法に関する。

１）組織培養法において、ヒトＢ−９７１９球（Ｉ（Ｂ
Ｌ）を免疫する。

２）永続的に生存しうる細胞を作り出すためにウィルス
性の薬剤、特にＦ！ｐｓｔ−１ｎ−１１轟ｒｒウイルス
によってＨＢＬを形質転換する。

３）特別な抗体を分泌する細胞を選択しその細胞をクロ
ーン化する。

４）クローン化した細胞を適当なヒトまたはマウスのミ
エローマ（骨髄腫）細胞と融合して高分泌性のハイクリ
ドーマとし、そのノ１イゾリドーマをクローン化する。

この方法は、例えばｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（試Ｉｉ！ｌ！
管内で）で免疫されたＰＢＬ　（末梢血リンパ球）を形
質転換すること、あるいは出産経験をもち、抗ＨＬＡ抗
体価や抗ＤＢ抗体価の高い女性の血液からとったＰＢＬ
を形質転換することによってＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｏ抗原ま
たはＤＢ抗原ｔ−認識するヒトモノクローン抗体を調製
するために使われる。

この方法はｔｆｃ、永続的に生存する、即ち分裂増殖す
る細胞を作シ出し、その形質転換された細胞を第２の永
続的に生存する細胞と融合するためにサイトメガロウィ
ルスにさらされた人からＰＢＬｔウィルス性の薬剤、望
ましくはＢｐｓｔｅｉｎ　−Ｂａｒｒウィルスで形質転
換することによってサイトメガロウィルス抗原ｔ−認識
するヒトモノクローン抗体を作るのにも使われる０３１
２Ａ９１．４や３１１／２５と記載されるヒト　モノク
ローン抗体はこの方法で作られｊＣ。

背　景 ネズミのＢ−リンパ球ノ）イゾリドーマが作られるよう
になつｆｃことで限定された特異性上もった抗体を大量
に生産することを可能にしｆＣ。

しかし、ネズミの抗体で確立された方法論でヒトのモノ
クローン抗体を作る試みはうまくいつていない。

ヒトの細胞の表層抗原特に主要組織適合抗原（ＭＨＯ）
に対するヒト　モノクローン抗体がめられている。ＨＬ
Ａ　、　Ａ　、　Ｂ　、　０表層抗原やＤＲ抗原に対す
るマウスのモノクローン抗体（ｍＡｂ）は数多く作られ
ている（　Ｂｒｏｄｓｋｙ　、　Ｐ、　Ｍ、、Ｐａｒｂ
ａｍ＋Ｐ、、　Ｂａｒｎａｔａｂｌｅ＋　Ｏ，Ｊ、、　
Ｏｒｕｍｐｔｏｎ　ｒ　Ｍ−Ｊ、ｒ　ａｎｄＢｏｄｍｅ
ｒ＋　Ｗ、Ｆ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、几＠Ｙ、　４７　：　
３　１９７９；　Ｔｒｕｃｃｏ、　Ｍ、、　Ｇａｒｏｔ
ｔａ＋　Ｊ、　ｗ、ｌ　５ｔｒｏｃｋｅｒ、　Ｊ。

ｗ、、　ａｎｄ　０ｅｐｅｌｌｌｎｉ、　Ｒ，Ｉｍｎ＋
ｕｎｏｌＬ、　Ｒｅｖ、＋　４７　：２１９　＋　１９
７９　；　Ｔｒｕｏｃｏ、Ｍ、、５ｔｏｅｋｅｒ＋　Ｊ
、Ｗ。

ａｎｄ　０ｅｐｅｌｌｉｎｉ、　Ｒ，Ｎａｔｕｒｅ　２
７３　：　６６６　、１９７８；　Ｑｕａｒａｎｔａ、
　Ｖ、、　Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ、　Ｍ、　Ａ、ａｎｄ
　Ｆｅｒｒｏｎｅ＋Ｓ、「モノクローン抗体とＴ細胞ハ
イシリドーマ」Ｇ、　Ｊ、　Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、　
Ｕ、　Ｈａｍｍｓｒｌｉ’ｎｇ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｆ。

Ｋ＠ａｒｎｅｙ編Ｅｌｓｓｖｉｅｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ
１ｌａｎｄ、アムステルダム、８４ページ１９８１の中
で；　Ｌａｍｐｓｏｎ。

Ｌ、　Ａ−ａｎｄ　Ｌｅｖｙ、　Ｒ，Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、
ｏｌ、　１２５　：　２９３　。

１９８０）。これらの抗体は全てのＭＨＯ抗原に共通し
た抗原部位と反応することが示されたが、ある例を除い
ては、ヒトのＭＨＯの多量性を示す決定基とは反応しな
い。免疫遺伝学の一般的経験によれば、同種免疫とその
結果できる同種抗体の微細な特異性の重要性を教えてい
る。従って同種抗体だけがヒトのＭＨＯの遺伝的、血清
学的な複雑さを図解するのに適しているとみなされてい
る。すなわち、ヒトの組織のタイプ分けに必要な試薬と
なる。当該のモノクローン抗体は異種免疫のリンパ球か
らよシも、同種免疫したリンノぐ球からの方が早くひき
出せることが期待される。ヒト細胞の表面抗原に対する
これまでのヒト　モノクローン抗体、特にＭＨＯ抗原に
対するものは知られていない。

ヘルペス群のウィルスに関連したヒト　モノクローン抗
体もめられている。ヘルペスウィルス群は多くのヒトの
病気の原因となるかまたは関連していることが知られて
いる数多くのウィルスからなっている。これらにはヘル
ペス１型、２型、サイトメガロウィルス、Ｖａｒｉａｅ
ｌｌ島Ｚｏｔｅｒ　、　Ｂｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィ
ルス等が含まれている。サイトメガロウィルス（ＯＭＶ
）はそれ自体複数の群のウィルスであシ、そのひとつひ
とつはヒトで多くの病気を起こす。患者の血清タイプに
おけるＯＭＶの血清学的な分類は、いくらよくみても不
完全である。モノクローン゛抗体は血清学的なタイプ分
けにとって理想的な試薬を提供するだろう。ヒトのモノ
クローン抗体はまた患者の免疫グロブリンが有効に使わ
れることから考えられるように、ＯＭＶ感染の治療に重
要な添加物となシうるだろう。今日までＯＭＶに特異性
をもったヒト　モノクローン抗体は生産されていない。

いまやヒト　モノクローン抗体を生産するために、ネズ
ミでの方法論に使われるものからのアプローチを全く変
える必要があることは明白である。

構成の説明 この発明は添付図すなわち、この方法のウィルス形質転
換のステップを描いた第１図と共に以下の記述からよシ
十分に理解されよう。

この発明で明らかにされた方法によって得られたヒト　
モノクローナル抗体は指定寄託番号をもち８１ｏａｎ　
−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（１２７
５Ｙｏｒｋ　Ａｖｅｎｕｅ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｒ　
Ｎｏｗ　Ｙｏｒｋ　１００２１）に寄託されている。こ
の発明による選択された細胞株はＭａｒｙｌａｎｄのＢ
ｅｔｈｅｓｄａにあるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　０ｕｌｔｕｒｅ　０ｏｌｌｅｅｔ１ｏｎに
も寄託され、次のような寄託番号がつけられている。

ＳＫ寄託番号　ＡＴＯＯ−＃ ３１２Ａ９１．４　ＨＢ８３１７ ３１１／１２５　０ＲＴ、８３１６ 寄託は発表を可能にする目的のためのみのものであって
、寄託された特定の材料にこの発明の概念を限定しよう
とするものではない◇この明細書の中では１リン／ｅ３
１−と″′細胞”という用語が同じような意味で使われ
ているが、それはこの学問分野では通例のことである。

この発明された方法に従えば免疫されたヒトＢ細胞に信
頼すべき材料をめねばならない。

望ましくは正常な末梢血リンパ球がその材料になる。こ
の目的のために開発されている培養方法（Ｈｏｆｆｍａ
ｎ＋　Ｍ、　Ｋ、　ＰｒｏＣ，Ｎａｔ’１．　Ａｅａｄ
、　Ｓｅｔ、＋ＵＳＡ　７７．１１３９，１９８０；Ｌ
ａｎ・＋　１１．０．　ａｔ　ａｌ。

Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍａｄ、　１５４　、１０４３　、１
９８１　；Ｍｌｓｌｔｉ。

Ｊ、　ａｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５
４　、１０６９　、１９８１：　Ｍｏｒ１ｍｏｔｏ＋　
Ｏｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２７　＋
　５１４′。

１９８１）は感作されていないヒ）ＰＢＭｉヒツジの赤
血球（８ＲＢＯ）または８　ＲＢ　Ｏに結合した抗原（
トリニトロフェニール基、ＴＮＰのような）に対して効
果的に免疫しｆｃ、　Ｆ）　、予め感作したヒト　リン
パ球を他の抗原（破傷風菌毒素や同種抗原）で免役する
ものである。この方法で得られる特異的なりリンパ球は
、この発明による方法によればＥＢウィルスで容易に形
質転換され、ＴＮＰに特異的なめるいは他の抗原に特異
的な形質転換されたＢ細胞株が得られるＯ好都合なこと
に一旦獲得すればＰＢＬは免疫に使うまで凍結保存でき
る。

最終的に分化の進んだ細胞として抗体分泌性のと）Ｂ細
胞はその生物学的なライフサイクルにおいて世代サイク
ルが限られている。そのような障害は融合細胞の相手を
不利な方に影響を与えうる大きな特徴であると考えられ
る。ヒトの血漿中の細胞が増殖にとって限度があるとい
うことはヒトのｐｌａｓｍａｅｙｔｏｍａ　（：ゾラズ
マ細胞腫）の数が少ないこと、そのようなｐｌａｆｉｍ
ａｅ７ｔｏｍ＆を細胞培養することが一般にむづかしい
こと、１ｉｉＢＶで形質転換したＢ細胞からイムノグロ
ブリン全分泌する血漿細胞性の子孫をクローン化するこ
とができなかったという報告があること（Ｆ’ｕ、Ｓ、
Ｍ、、ｅｔａｌ　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、　１４８　
、１５７０　。

１９７８）、ＰＦＯ中で正常ヒ）Ｂ細胞を培養で維持す
ることができないことなどによって支持される。事実、
その状況はＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ１０以外の大抵のマウス系統
で頻度が多くないマウスのｐｌ−ａｓｍａｅｙｔｏｍａ
のそれとあまシ変わるものではない。（Ｐｏｔｔｅｒ、
　Ｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　０ａｎｅｅｒ　Ｒ＠＋
５ｅａｒｃｈ。

Ｅｄ、Ｈ，Ｂｕｎｃｈ、　Ａｅａｄｓｍｌｃ　Ｐｒ＠＠
＋ｓ、　Ｖｏｌ、　２，１９６７゜ｐ、１０５） この仮説に基づき、ヒトのリンパ球の表面抗原特にＨＬ
Ａ−Ａ、Ｂ、ＯおよびＤＢ抗原に対するヒトのアロ抗体
を形成する細胞を無限に増殖しうるようにしてクローン
化する方法としてＥＢＶ形質転換法を適用して、生物的
な障害の可能性をさけて通るようにこの発明における方
法が工夫された。分泌能の低い細胞のクローンが標準的
なネズミのｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ細胞またはヒトの
骨髄腫細胞と融合することによって分泌能の高い細胞に
変換される。

ヒトのモノクローン抗体（ｍＡｂ）ｔ”産生する本発明
方法は次のステップを包含している。

（１）　ヒトの８９７２球が適当な抗原で感作または免
疫される。免疫は望ましくはｉｎ　ｖｌｔｒ。

で行われるが、ある特殊な抗原に高い抗体価をもつ感作
されたＰＢＬが用いられる。

（２）抗体を産生する細胞株はＤＢウィルスによる形質
転換法で永久に増殖可能としている。

（３）形質転換された細胞が例えばマウ臘のミエローマ
細胞のような第２の永久に増殖しうる細胞株と融合され
る。

それから形質転換された細胞株はクローン化され、すな
わち培養ののち望ましい特性をもった細胞のコロニー（
集団）を選択し、そしてクローン化された細胞株は望ま
しい抗体を生産するために生育させもれる。さらにこの
方法は形質転換した細胞をクローニングし抗体産生のた
めにクローン化した形質転換細胞をよシ分け、そして効
率のよい抗体分泌細胞、すなわちクローニングの条件で
多量の抗体を分泌する細胞を選択する、各ステップを包
含している。

この発明の方法とそれによって得られるヒトモノクロー
ン抗体全説明するのに以下の実施例を提供する。しかし
この実施例は本発明をいささかも制限するものではない
。

実施例 ｍＡｂ ａ）ヒト末梢血りンパ球（ＰＢＬ）の分離この方法は標
準的なｆｌａｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｓ密度勾配遠心分離
法に従っている。５０ｍ１のヒト血液を２借景のＦ！ａ
ｒｌｅｓの平衡塩溶液（ＥＢｓｓ）で希釈し、リンホプ
レップ（几ｙ＊ｇａｒｄ＋　Ｄｅｍａｒｋ）上に層状に
おき室温で３０分　１８００　ｒｌｌｌｌｌで遠心分離
した。中間層から細胞を分離しＥＢＳ８で洗って計数し
た。

免疫 ４０Ｘ１０’ケのヒトＰＢＬを５％のウシ胎児血清（ｐ
ｎｓ）、抗生物質５×１０″″Ｉ　の２−メルカプトエ
タノール（２−Ｍｎ）’ｉ含む１０　ｍｌのＭ１ｓｈ＠
１ＩＤｕｔｔｏｎ培地（Ｍｌｓｈｅｌｌ。

Ｒ，１，ａｎｄ　ＤｕｔｔＯｎ、Ｒ，Ｗ、　Ｊ、　ＥＸ
Ｐ、　Ｍｅｄ。

１２６：４２３）に懸濁する。３０ｆｉｌの加熱で殺し
た５ｔａｐｈｙｌｏｅｏｃｅｕａ　ａｕｒ＠ｕｓ　Ｏｏ
ｗａｎ１株の５０％懸濁液と３００μｊのＤｊｔ１１分
化因子（ＢＤＦ）　（Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　Ｍ、　Ｋ、
、　Ｐｒｏｓ。

Ｎａｔ’ｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、ｙ　ＵＳＡ　７７
　ｇ　１１３９　。

１９８０）と５０　Ａｌｆ）６　％　ＴＮＰ−８ＲＢＯ
ｗＡ濁液とをこの細胞懸濁液に加える。そして混合液を
１枚の９６ウエルの０ｏｓｔｓｒプレートに平均に分配
した。細胞を加湿した００２インΦユペーター中で１８
時間培養してから各々のウェルにと）ＡＢ血清ｌＯμｌ
を加える。さらに培養１ｔ４日間絖けるが１日おきにｌ
θμノの培養液（ＭｌａｈｅｌＬ　ｅｔ　ａｌ上記）を
間けつ的に添加する。そして細胞を集めＥＨ１１で洗っ
て細胞数を計測する。抗体の形成はＴＮＰ化したウマ赤
血球と５ＲＢＯを使ってＪａｒｎｅのプラーク法（Ｊｅ
ｒｎｅ　Ｎ。

Ｋ、　ａｎｄ　Ｎｏｒｄｉｎ＋　Ａ、Ａ、　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　１４０：４０５゜１９６３　）によって検定した
。

免疫されたＰＢＬは５％のＦＢ８　ｔ−含む培ｍＫ　１
　ｒｄ当、！ＩＩ　４Ｘ１０”　りにナル！　５　ａｌ
ｉ！ｉスる。この混合液の１０−を特異的親和性で精製
した多価のウサギ抗ヒ）　Ｉｇ抗体でコーティングした
ペトリ皿に加える。このペトリ皿は１０ｃｒｎの微生物
用のプラスチックシャーレに１０μｇ／Ｒ１の抗体液１
０−を入れて冷蔵庫中に一晩おき、次いでＢＢＳＳ中１
０％のＦＢ８を含む液を用いて３７Ｃで１時間インキュ
ベートして残った場所を塞ぐことで調製する。Ｂｍ胞は
４Ｃでは３時間で接着する。それからシャーレを穏やか
にＥＢ８Ｓで２回洗ってＴ細胞を除く。高活性のＩＢＶ
を含むウィルス液１ｏｍＪを加え、それからシャーレ全
００２インキユベータに移し一晩おく。このウィルスの
懸濁液はすでに明らかにされているように、キヌザルの
細胞株の培養液（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｌｉ
ｐｍａｎ　。

Ｍ、　Ｐｒｏａ、　Ｎａｔ’ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ
、　Ｕ、８．Ａ、　７０　：１９０．１９７３）である
。−晩培養した後Ｂ細胞をベトリ皿から集めて計数し、
ヒトの繊維芽細胞が全面に成育した状態（例えばＦｌｏ
ｗ　５０００細胞）の９６ウエルプレートに移す。個々
のウェルには４０Ｘ１０’ケの細胞が入れられる。培養
液を週２回の割で与える。培養液は１０％のＦＢ８と抗
生物質、２−ＭＢｔ−含むＲＰＭＩ　−１６４０である
。

このＩＢＭ−形質転換法のスキームは第１図に示されて
いる。

ウェル当）１〜２Ｘ１０”細胞まで成育したとき上清を
とる。抗体含量はＴＮＰ化した５ＲＢ０，８ＲＢＯだけ
、ＴＮＰ化したラダのＲＢＯを使って血球凝集によって
測定する。

並行して、ウシ血清アルブミ／に結合したＴＮＰでＥｉ
ＬＩ８Ａ分析を行う（Ｇ、Ｊ。

Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｋｅａｒｎ＠
ｙ　Ｍｏｎｏｅｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｌｅｓ　ａｎ
ｄ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓＰｅｒｓｐ會
ｅｔｉｖｅｓ　ａｎｄ　ｔ＠ｅｈｎ１ｅａｌ　ａｄｖａ
ｎｃｅｓ。

Ａｐｐｅｎｄｉｘ、　Ｆ！１ｓ＠ｖｌｅｒ　Ｎｏｒｔｈ
　Ｈｏ１ｌａｎｄ　＋１９８ｉ　ｐ、５７４）。発色用
の抗体は多価のアフィニティーカラムで精製された抗ヒ
トＩＫＧでアルカリ性７オスフアターゼを結合したもの
である。

そのようにして抗体が陽性の培養はさらに増殖させる細
胞の一部を将来のために凍結する。

ＥＢＶで形質転換した細胞の元の培養では細胞が多くの
はなれた団塊金倉んでいる。

各々のかたまシの中にある細胞は比較的均質だから、個
々のかたｉ夕を毛細管ピペットの授けをかシて手でひろ
いあげ、放射線照射したヒト繊維芽細胞がお互いに接し
た単層となっている新しい９６ウエルプレートに移す。

１ウエル当シｌＸｌ０’ケまで細胞を成育させ、再び適
当な方法で抗体についてテストする。その方法は鉋えば
上記１゜ｄ）で記載した方法である。抗体に対して陽性
の培養物は再び個々の細胞塊を移すことによって増やす
かまたは将来使う時のために液体窒素中に保存する。

軟寒天中で成育させることによるクローニング この方法は例えばＳｕｇｄｅｎ＋　Ｂ、　ａｎｄ　Ｍａ
ｒｋ＋Ｗ、　Ｊ、によってＶｉｒｏｌ、２３．５０３（
１９７７）に示されているようにこの分骨ではよく知ら
れている。実験結果は第１表と第２表に出されている。

（以下余白） 第１表、Ｍ２表の説明 ヘパリン処理し友血液ｆ　ｆｉｅｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕ
ｅ密度勾配法で分画し％１．０ないし１．２５×１０”
ケのＰＥＭを得た。この細胞ｔ−１技術的記述２のとこ
ろで述べたようにＴＮＰ化した５ＲＢＯで培養１ながら
刺激した。５ないし７日後にアフィニティークロマトグ
ラフイーで精製した多価のクサギ抗ヒトエｇＧｔ−コー
ティングした径１０ｃｍのプラスチックシャーレを４Ｘ
１０Ｙケの細胞当力１枚使ってその上に細胞を流すこ＜
！−によってＢＩＩＢ胞を分離した。１．２ないし２．
５Ｘ、１０すのＢ細胞が接着した部分として回収された
。それらは免疫蛍光法によって９０ないし９５％がＩｇ
＋であったＯＢ細胞をキヌザルの細胞株８９５　ｇ　ノ
希釈しテぃない培養液の３４で感染させた。次いで細胞
は１０％のＦＢ８を含むＲＰＭＩ培地で２Ｘ１０１ケ／
プになるよう希釈し９６ウエルプレートに播種した。

このウェルにはヒト繊維芽細胞が接する程度の層になる
ように生育させ使用前に４０００ラドのガンマ−線照射
した。夫々のウェルには２Ｘ１Ｇ’ケの細胞を入れた。

　生育が２週間後に認められ、４週間後に培養物は次の
ような３つの測定法で抗体を検定した。

１）ＴＮＰ化−８ＲＢＯをウェルに加えて凝集の様子、
２）　Ｔｅｒａｓａｋｌのプレートにおける抗−ＴＮＰ
化８ＲＢＯ，ＴＮＰ化ウマ赤血球、および８ＲＢＯ抗体
に対する凝集性、３）抗原としてＴＮＰ化ＢＡＡを用い
ＥＬＩＳＡで検定した。陽性のウェルからの細胞を液体
窒素で凍結した。さらに進めた３５ケのうち２４は抗体
を作るのを停止し、′またあるものはおそらくは無関係
の細胞が増えすぎたため衰えてしまったのだろう。ＴＮ
Ｐに特異的な細胞の数を測るために、抗体のロゼツト（
溶血斑）ｋＴＮＰ化した８ＲＢＯで作らせた。検定した
２０ケの培養物のうち７ケは１０％ないしそれ以上のロ
ゼツトを形成し、５つは１ないし１０％で残りは陰性か
たまにロゼツトがある程度が、または不確実（死細胞に
よるがたまりのようで）であった。

抗ＴＮＰ抗体を分泌する細胞をアガロースの中でクロー
ン化する試みは部分的には成功している。６ケの選択し
た抗ＴＮＰ抗体陽性培養物からの１０．０００ケの細胞
をＲＰＭＩ培地を使って０．３５％アガロースの中に＋
９濁し０．５％アガロースで覆ったガンマ−線照射した
繊維芽細胞の単層の上で増殖させた。６ケのうち５ケは
３週以内にコロニーを形成した。それらを実体顕微鏡の
下で拾いあげ、ガンマ−線照射した繊維芽細胞のフィー
ダーレーヤーに移し、ウェル当シ１０’〜１０”ケの細
胞になるまで増殖させた。ＥＬＩＳＡで検定すると５ケ
の抗ＴＮＰ抗体陽性の細胞株の中３夕は頻度はいろいろ
であるが、陽性のクローンが得られた（Ｎ３表をみよ）
　培養液はＪ、　Ｋｅａｒｎ＠ｙ（Ｇ、　Ｊ＋Ｈａｍｍ
＠ｒ１１ｎｇ、　Ｕ、　Ｈａｍｍ＠ｒｌｔｎｇ、　ａｎ
ｄＪ、に＠ａｒｎｅｒｙ、Ｍｏｎｏａｌｏｎａｌ　ａｎ
ｔｉｂｏｄｉ＠５ａｎｄ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａｓ、Ｐｅｒｓｐ＊ａｔｌｖ＠５ａｎｄ　ｔ＠ｃｈ
ｎｉｃａｌ　ａｄｖａｎｃｅｓ、Ａｐｐ＠ｎｄｌｘ　Ｉ
Ｅｌｓ＊ｖｌｅｒ　Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　１
９８１　＋ｐ、５７４）のＥＬＩＳ人法で分析された。

ヒトのＩｇ（免疫グロブリン）の均質性と七ツクローン
性を証明するための免疫学的分析は現在実施中である。

Ｉｇクラスに対する特異性とＬ鎖に対する特異性につい
て七ツクローン抗体をＫＬＩＳＡで分析することで２２
３／３８と２２３／９７のりｐ−ンはＩｇＧであること
がわかったが２２３／１８７のクローンは不確かでおそ
らくまだ混ざっているものと思われる。これらの結果は
免疫されていないリンパ球、ｔ　ｉｎ　ｖｌｔｒｏで免
疫し、ＢＢＶによる形質転換で生産された免疫細胞を拾
い上げ軟寒天中でクローニングすることがヒトのモノク
ローン抗体の生産に使用可能な方法であるという我々の
見解を裏づけている。

微量細胞毒性検定プレー）　（ＦａＩｃｏｎ　＄３０３
４）にヒトの繊維芽細胞を播いて全面にわたるまで増殖
した。２０００ラドのガンマ−線照射した。選夛分けら
れた正常ヒトＢ細胞（１，ｃ）をみよ）を２Ｘ１０”ケ
ずっ６名のウェルに加え、次いでウェル当シ１ないし５
ケの割合でクローン化すべきＥＢＶで形質転換した細胞
を加えた。プレートを組織培養用のインキュベータ中で
加湿した環境下で培養した。２４時間後１０μｌの培地
を添加した。それ以上追加する必要はなかつｆｃｏウェ
ル当シ１０”ケに増殖したとき、ＥＢＶで形質転換した
細胞をヒトの繊維芽細胞のフィーダ一層を入れた９６ク
エルプレートに移した。抗体の選択は１．ｄ）で既述し
たように行った。

クローン化されているかどうかのテスト＝２つの判定が
使われた。

１）イムノグロブリンか単一のタイプのＬ鎖と単一のタ
イプのり２スに限定されていること、Ｌ鎮の表現型の分
析はＦｉＬＩＳＡ法で行った。ヒトのＩｇ　（イムノグ
ロブリン）に対してクラスおよびＬ鎖にＩＷｆＪＡ的な
ネズミのモノクローン抗体が使われた。

２）培養したウェルの約９８％が再クローン化によって
抗体産生を示した。

９６ウエルプレートにおけるりｐ−ユングフィーダー細
胞としてヒトのガンマ−線照射した繊維芽細胞を入れた
９６ウエルプレートヲもう一つの方法で用いた。さらに
フィーダー細胞をガンマ−線照射した （１５００ラド）。ＨＰ　ＲＴ陰性の変異株ＧＭ１５０
０−６ＴＧの細胞（０ｒｏｃｅ、　Ｏ、Ｍ、。

Ｌｉｎｎ＠ｎｂａｅｈ、　Ａ、　、　Ｈａｌｌ、　ｗ、
　ｌ　８ｔ＠ｐｌｅｖｓｌｃｉ　。

Ｚ　ａｎｄ　Ｋｏｐｒｏｖｍｋｌ、Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ　
２Ｂ８　：　４８８　＋１９８０　）をフェル当シ１０
４ケのわ多で加えた０クローン化しようとするＥＢＶで
形質転換した細胞ｔ工ないし５ヶ加えた。１週間に２回
培養液を足して培養した。２ないし３週後、培養液に２
％のヒＩキサンチン、アミノゾテリンチミジン１ＡＴ）
ｋ混じてフィーダー細胞の成育を止めた。抗体陽性の培
養物の選別はＩ、　ｄ）で既述したようにして４ないし
６週間後に実施した。

ヒトのＰＢＬは妊娠や輸血のために抗 ＨＬＡ抗体価の高いと予め認められたぜランティアの提
供者から得た。ＰＢＬは１．ａ）で既述したようにして
分離した。ＰＢＬをＭｉｓｈｅｌｌ−Ｄｕｔｔｏｎ培地
にＳ濁した。ガンマ−線照射（１５００／ｌド）した末
梢血リン、６球を免疫された提供者（すなわち、妊婦の
場合には夫またはその子供のＰＢＬ）からとって抗原と
して用いた。別の方法としては免疫された状態の提供者
からＥＢＶで形質転換してとった永久的なり細胞株を照
射して用いることができる。抗原を免疫されるべきＰＢ
Ｌに対して０．１％の割合で加えた。

Ｍｌｓｈｅｌｌ−Ｄｕｔｔｏｎの培養は１．ｂ）で既述
したようにして行った。

ｂ）　Ｂ細胞の分離と形質転換 これはＩＯで述べたようにして行われた。

養上清の検索 微量細胞毒性検定法が応用された。上清の５μノに供試
細胞の懸濁液（通常　免疫されている提供者の形質転換
されたＢ細胞が２Ｘ１０”ケ／ｄ）の１μノと１：３に
希釈した選別されたクサギ補体ｔ−２μＩｆ加えた。

検定プレートは３７Ｃで４５分間インキュベートされ、
５μノのトリパンブルー溶液を加えた後倒立型顕微鏡で
測定した。

この方法は！、・）の方法の１つによって行われ、また
は記載されている。

Ｃ）特異性の分析 ひろい枠の細胞について標準的な組織分類法に従って微
量細胞毒性検定法によってテストした。−例が第３表に
あげられている。

（以下余白） ヒ）　ＩＪンパ球のいくつかの際立った同種抗原に対す
る抗体が得られた。反応様式はいままで知られているＨ
ＬＡ抗原のどれとも一致しなかった。

このステップはサイトメガロ感染から回復した患者また
は急性のＯＭＶ感染症の人から高度に免疫されている１
■胞が得られるので必要はない。

ｂ）形質転換 ここでは、５０プの血液から得たＰＢＬをＢ細胞を得る
ために直接分画し、１．ｂ）で述べたようにしてＢ９５
−８ＥＢＶで形質転換した。

すでに述べられた方法（Ｇ、Ｊ、Ｈａｍｍｅｒｌｌｎｇ
＋Ｕ、　Ｈａｍｍｏｒｌｉｎｇ、　ａｎｊＪ、　Ｋｅａ
ｒｎｅｒｙ。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔＬｂｏｄ％ｅｓ＋　ａｎ
ｄ　Ｔ　ｃｅｌｌｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、、Ｐｅｒｓｐ
ｅｅｔｉマｅａ　ａｎｄ　ｔ＠ａｈｎｌｅａｌａｄｖａ
ｎｃｅｓ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ、ｌ１ｆｌｓｖｉｅｒ　Ｎ
ｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ＋　１９８１　、ｐ、５７４　
）が使われた。

９６ウエルプレートは抗原（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得たＯＭＶ　ＯＦ抗原Ａ
Ｄ１６９株、またはコントロール抗原）すなわちＨＥＦ
ｆｉｌｌ胞の細胞溶解物でゴーティングされた。ＢＳＡ
で間隙をふさいだ後、培養液をプレートに移し、それを
２時間室温でインキュベートした。プレートをＴｗｅ　
ｅ　ｎ含有ＰＢ８で洗い、発色用の抗体すなわちアルカ
リ性フォスファターゼを結合したウサギの抗ヒ）　Ｉｇ
Ｇを加えた。２時間後、プレートを再度洗滌し、基質の
ニトロフェニル燐酸を加えた。結果ｔ工ないし２時間後
、自動ＫＬＩＳＡスキャナーで記録した。

３１１／１２５の細胞株のクローンはＩｇＧのＫ（カッ
パ）タイプの抗体を産生ずる。

胞の融合 ＥＢＶで形質転換した細胞（必ずしも完全にクローン化
されている必要はない）２×１０６ケと４Ｘ１０’ケの
ヒト骨Ｎ腫細胞（例えば細胞株ＧＭ１５００　ＨＰＲＴ
陰性の変異株やクワノ々イン耐性変異株、６　ＴＧ　（
Ｃｒｏｓ＠。

０、　Ｍ、、　Ｌｉｎｎ＊ｎｂａｃｈ、　Ａ、Ｉ　Ｈａ
ｌｌｌ　Ｗ、１８ｔｅｐｌｅｖａｋｉ＋　Ｚ、　ａｎｄ
　Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ、　ＨＩＩＮａｔｕｒｅ２８８：
４８８，１９８０）、ＷＩＬ−２，ＡＲＨ（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　０ｏｌｌｅｅｔｉ
ｏｎ　）と混合した。ネズミのプラズマ細胞腫細胞株Ｘ
６３，５，６．３　も使うことができる。細腕の混合物
を遠心分離し、細胞塊を１分間室温で１ゴのＰＥ０４０
０Ｇ（３５％溶液）と混合した。それから混合物ｔ−３
分間に１５μノの割合でＥＨ１１ｔ−滴下して希釈した
。

１胞を遠心分離して２％のＨＡＴを含むＲＰＭＩ培地中
にと夛、ガンマ−線照射されたヒト繊維芽細胞のフィー
ダー細胞を入れｔ９６ウエルプレートニウエル当Ｊ）１
０’ケの細胞になる濃度に播いた。２日間に５×１０″
″”Ｍのウワノ々インと１ｑＡＴを添加し、この追加は
その後１週に２回続けられた。２週間の後、細胞ヲ集め
、ｆ　１　ｃａｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ液の上に重層し、
そして遠心分離した。中間層からとった生細胞を前述の
ようにまたプレートに播いた。勢のよい生育がおきた′
　とき上清１Ｎ、ａ）で述べたようにして抗体−の検定
をした。

ｆ）　（３１２ａ９１）抗ＯＭＶ抗体のキャラクタリゼ
ーション 標準のＯＭ　Ｂ抗原Ａ　Ｄ　１６９　（Ｐｌｏｗ　、Ｔ
＊ｂｏｒａｔｏｒｉｅ＋ｓ）を用いｆｃＥＬＩＳＡ法に
よる特異性の分析は抗ＯＭＶ抗体の存在を示唆した。こ
の後３１２ｍ９１．４．と記す、ＡＤ１６９のザイトメ
ガロウイルスで感染したヒトｔａ　、％１ｉ芽細胞によ
る免疫蛍光分析でＯＭＶに対して特異性があることｔ確
認しているが、感染していない細胞では確認していない
。さらにその上、核のＯＭＶ抗原に関係があることを示
唆している。抗体３１２　Ａ　９１．４はＣＭＶを中和
しない。

免疫化学的な分析ではハイシリドーマの３１２Ａ９１．
４がカツノｅ鎖をもった免疫グロブリンＧを分泌してい
ることを示している。

抗ＣＭＶ抗体はプロティンＡと結合する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のウィルス形質転換のステップを示した
説明図である。 １・・・穿刺（血液を注射針から注入しＦｉｃｏｌｌ　
−Ｈｙｐａｑｕｅ液の上に層状に流し込む）２−　Ｆｉ
ｃｏｌｉ−Ｈｙｐａｑｕｅ液３−　ＰＢＬ（ＰＢＬ　：
　ｐｅｒｌｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅ（末梢血リンノぐ球））十抗原 ４−５日間の改変Ｍｉｓｈｅｌｌ　−Ｄｕｔｔｏｎ　ｊ
＠地による培養 ５・・・ウサギの抗ＫＧ　Ｇ　（ｈｕｍａｎ　ｇａｍｍ
ａｇｌｏｂｕｌ　ｉｎ）でコーティングしである ６　・ＥＢＶ（Ｂ９５−８ＳＰＮＴ）での形質転換７・
・・γ−線照射した繊維芽細胞上で培養８・・・検定（
テラサキ法で） 特許出願人　スローンーケッタリング　インスティテユ
ート第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号＠発明者
　マイケル　ケー、ホフ　アメリカ合衆国、　１００１
２マン　り、グリーン　メトリーｌ ニュー　ヨーク、ニュー　ヨー ・　１３旙地

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　望ましい抗原を認識するヒトのモノクローン抗体
   を産生ずるハイシリドーマを得るために ａ）その抗原でヒトの末梢血９７１４球（ＰＢＬ）を免
   疫し ｂ）永久に増殖可能な細胞を産生ずるために免疫された
   リンパ球をウィルス性物質で形質転換し Ｃ）第２の永久に生存しうる細胞株と形質転換され７を
   細胞とを融合する ことを特徴とするハイブリドーマの調製方法。 ２、　形質転換された細胞をクローニングし、クローン
   化された形質転換細胞を抗体の分泌についてスクリーニ
   ングし、効率のよい抗体産生株を融合のために選択する
   ステップをさらに包含する特許請求の範囲第１項に記載
   の方法０ ３、　上述のＰＢＬがｉｎマ１ｔｒｏで免疫される特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、　上述の抗原にさらされた人から上述のＰＢＬを得
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、　ヒト”の末梢血リンノぐ球が上述の抗原で１ｎｖ
   １ｔｒｏで免疫されてＨＬＡ−Ａ　、Ｂ　、Ｏ抗原また
   はＤＲ抗原ｔ−認識するヒト　モノクローン抗体を生産
   するハイブリドーマを調製する特許請求の範囲第３項に
   記載の方法。 ６、　上述のＰＢＬが高い抗ｔ（ＬＡと抗ＤＲあるいは
   抗ＨＬＡまたは抗り几抗体価をもつ出産経験のある女性
   の血液から得られるＨＬＡ−Ａ、Ｂ。 ０またはＤＲ抗原を認識するヒト　モノクローン抗体を
   産生ずるハイブリドーマを調製する特許請求の範囲第４
   項に記載の方法。 ７、　上述のウィルス性物質がＥｐ＠ｔ・１ｎ−Ｂａｒ
   ｒウィルスである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、　上述の永久的に生存しうる細胞株がネズミまたは
   ヒト由来のものである特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ９、　上述の永久的に生存しうる細胞株がマウスの建工
   四−−ｇ？（骨ｓｉ腫）またはヒトのプラズマ細胞腫で
   ある特許請求の範囲第８項に記載の方法０ １０、上述のＰＢＬが免疫の前に凍結保存されたもので
   ある特許請求の範囲第１項に記・載の方法。 １１、特許請求の範囲第１項に記載の方法で調製された
   ハイシリドーマ。 １２、特許請求の範囲第１１項に記載のノ・イブリドー
   マによって生産されたヒト　モノクローン抗体。 １３、特許請求の範囲第２項に記載の方法によって調製
   されたハイブリドーマ。 １４、特許請求の範囲第１３項に記載のノ〜イブリドー
   マによって生産されたヒト　モノクローン抗体。 １５、サイトメガロウィルスにおかされ九人からとった
   末梢血リンパ球を永久的に生存しうる細胞にするために
   ウィルス性の物質で形質転換し、第２の永久的−に生存
   しうる細胞株とその形質転換細胞を融合することから成
   るサイトメガロウィルス抗原を認識するヒト　モノクロ
   ーン抗体を生産するハイシリドーマを調製する特許請求
   の範囲ｉｔ項に記載の方法。 １６、特許請求の範囲第１５項に記載の方法で調製され
   たハイブリドーマ。 １７、特許請求の範囲第１６項に記載のハイシリドーマ
   で作られたヒト　モノクローン抗体。 １８、　３１２Ａ９１．４と３１１／２５からなる特許
   請求の範囲第１７項に記載のヒト　モノクローン抗体。