JPS58501257A

JPS58501257A - ヒト非分泌性プラスマサイトイドセルライン

Info

Publication number: JPS58501257A
Application number: JP57502717A
Authority: JP
Inventors: リツツ・ロイ・エロツト・ジユニア
Original assignee: リサ−チ・コ−ポレイション
Priority date: 1981-08-12
Filing date: 1982-08-10
Publication date: 1983-08-04
Also published as: EP0072752A3; WO1983000503A1; US4434230A; EP0072752A2; CA1188642A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、モノクローン抗体分泌性ヒト−ヒトハイブリドーマの調製に有用なヒトセルラインに関する。

背景技術マウスρミエローマセルラインと与えられた抗原に対して感受性を伺与されたマウスのＢ−リンパ球を融合させて誘導される、ハイブリドーマセルラインの製造は、良く知られている。たとえば、Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、とＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５　４９７　（１，９７５）；　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＋　Ｖｏｌ。

６、ｐｐ、５１１−５１９　（１９７６）；　まだ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、ｃ。

：　“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　Ｖｏｌ。

２４３：　６６−７４　（１９８０）も参照）による最初の仕事に基づいて、Ｋ　ｏｐｒｏｗｓｋ　ｉらはハイポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）欠乏セルと悪性腫瘍細胞を予め与えられたマウスから誘導された肺臓またはリンパ細胞の間で体細胞のハイプリントを製造した（Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　４，１．７２，１２４）。Ｋｏｐｒｏｕｒｓｋｉらは特異的ビールスとその抗原抗原性決定因子に対するモノクロナール抗体を大量に生産することが出来る、遺伝子的に安定な融合セルハイブリッドの連続的セルラインを製造した（Ｕ、　Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ４．１９６，２６５）。Ｋｏｐｒｏｕｒｓｋｉらの後者のセルラインはビールス抗体生産性細胞とミエローマ細胞の間の融合セルハイブリッドである。Ｗａｎｄｓらは、動物リンパ球を肝炎抗原で免疫して抗体生産性細胞を形成せしめ、次いでこれをミエローマ細胞と融合させることにより確立された肝炎ビールスに討するもモアクロナール抗体製造用セルラインを開示している（Ｕ、Ｓ−Ｐａｔｅｎｔ　４，２７１，１４５）。

しかしなが呟上記公知文献に開示されたものは、いずれも非ヒトミエローマ（多くの場合マウス）と非ヒトリンパ球細胞から誘導されたハイブリドーマである。

種々の治療的応用のためには、マウスやラットよりもヒトのリンパ球から誘導された抗体の方が逼かに望ましいことが認められている　（たとえば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ０：上記５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ誌７４頁参照）。

マウスのミエローマ細胞とヒトの１．Ｇ生産性細胞を融合させたキメラハイブリドーマが得られているが（Ｌｅｖｙ、Ｒ。

とＤｉｌｌｅｙ、Ｊ、　、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｕ、Ｓ、Ａ、　、７５：　２４１１−２４１５（１９７８））、このようなハイプリントはヒトの細胞を動物の細胞と融合させた場合、得られたハイブリッドセルからヒト染色体が迅速かつ優先的に失われる事実に鑑み、不安定な傾向を有する。

事実、１９８０年１０月、Ｍｉｌｓｔｅｉｎは次のように述べている（上記５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ誌参照）＝「培養することが出来、かつ融合させて種間ハイプリントを作る適当なヒトのミエローマに対する研究はこれまで成功していない。」従って、ヒト−ヒトハイブリドーマセルラインの成功的製造法の出現か要請されて来た。この要請は、適切な、長期にわたって生存力のある、純粋かつ連続的なヒトのセルラインであって、ヒトのＢ−リンパ球と融合して上記ハイブリドーマラインを与えるものの存在によって充足されるであろう。

発明の開示従って、本発明の目的は、前記セルラインとヒトのＢ−リンパ球を融合させることによりヒト−ヒトハイブリドーマを製造するのに有用なヒトのセルラインを提供することにある。

本発明の池の目的は、ヒト−ヒトハイブリドーマの製造に有用なヒトのプラスマシトーマセルラインであって、該プラス７シトーマセルラインはＣＯ２に感受性であるものを提供するにある。

本発明のさらに他の目的は、イム７グロブリンを分泌しない前記ヒトのプラスマシトーマセルラインを提供するにある。

本発明のさらに池の目的は、ヒト−ヒトハイブリドーマを製造する方法を提供するにある。

本発明のさらに池の目的は、ヒト−ヒトハイブリドーマの製造法であって、該ハイブリドーマセルラインの単離のためにＣＯ７選択法または／および表面膜イム７グロブリンリセプターの欠除を利用するものを提供するにある。

以下においてより容易に明らかとなるであろう本発明の上記あるいはその他の目的は、連続したヒＦの非分泌性プラスマサイトイドセルラインの生化学的に純粋な培養体（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ８０８３）およびそのクローンならびにサブクローンを提供することによって達成される。

本発明の池の目的は、ヒトのＢ−リンパ球を前記非分泌性ヒトの連続的プラスマントーマセルラインと融合させて抗体生産性ｌ）イブリドーマを形成することからなるヒト−ヒトハイブリドーマを調製する方法を提供することによって達成される。

図面の簡単車底を第１図は蛍光活性化セルソータにおいてマイスラマイシン（＋ｎ１ｔｈｒａ＋ｎｙｃｉｎ）ストレインドセルを使用した場合のＣＲＬ−８０８３のセルサイクルを示す。横軸は蛍光強度、縦軸はセルの数である。

第２図は蛍光活性化セルソータにおけるＣＲ′Ｌ−８０８３のセルサイズ、の分布を示す。

本発明実施の最良の形態本発明者は、イムノグロブリンを分泌しない、そのラインが細胞＠養において連続的に培養され得る、生化学的に純粋であってマイコプラスマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）を含有しない、ヒトのＢ−リンノく球と融合してヒト−ヒトハイブリドーマを与えることのできる、ヒｔのプラスマントーマセルラインを発見した。このプラスマン）−マセルラインの発見は、それ故−二、安定な連続したヒト−ヒトハイブリドーマ調製の可能性を導くものである。

プラスマントーマセルラインはイムノグロブリンを分′！ＩＩＬないが、ハイブリドーマは分泌するので、この性質を利用することによりハイブリドーマをプラスマンドーマから選択的に分離することが可能である。また、本発明者は、この発明のプラスマントーマセルラインが３〜５％ＣＯ２雰囲気中でよく生長する一方、ＣＯ，ａ度が９〜１１％もしくはそれ以上の雰囲気において８５〜９５％が死滅することを見出した。これはハイブリドーマが１０％ＣＯ２申において普通に生育する事実に鑑み、ハイブリドーマをプラスマン）−マか・ら７分離する。

他の方法を提供するものである。さらに本発明者は、本発明のプラスマントーマセルラインの＋Ｐ！Ｒ’Ｔ欠乏変異株が調製されうろことを見出した。従って、よく知られたＨＡＴ選択培地を使用することによって（変異株）プラスマントーマセルラインをハイブリドーマから分離する第３の方法を提供するものである。

光学顕微鏡観察によれば、ＣＲＬ−８０，８３のセルは相当な多形性（ｐｌｅｏＩＩＩｏｒｐｈｉｃ）外観を有し、その寸法において変動が認められる。

このセルはパイロニンーメチルグリーンまたはギームサ染色１こよって特徴のあるプラスマサイトイド外観を示す。セルの多くはシグネ・・・トリング（ｓｉｇｎｅｔ　ｒｉｎｇ）様の外観を呈し、比較的正常な核−細胞質比を有しており、細胞質は深く染色され、ラッセル体を有し、さらにしばしば顕著な核部とミドコンＶリアを有している。核は卵形であって中心を離れて存在し、不定形の核正体が顕著である。電子顕微鏡観察によれば、通常の多形的特徴と、正規の反応性プラスマセルもしくは骨髄中に見られるかなり高度の悪性形態において認められる未熟性が見出される（Ｍａｌｄｏｎａｄｏ、Ｊ、　Ｅ、　ら、Ｃａｎｃｅｒ　１９：］］６１３−１６２７１９６６）参照）。多くのセルに認められる形質縦飽的特徴は、ラメラにまで充分組織化されていないあるｔ・は更に未分化な細胞の状態にある粗い小胞体である。ゴルジ領域および顕著な、ときには奇怪なミＦコンドリア、ＩＩ密な親オスミウム酸性体および液胞が極めて顕著に認められ、卵形の、中心からかたよった核が周辺のクロマチン分布と共に観察される。

組織化学的染色によれば、この細胞はミエロパーオキシグーゼ、アルブミン、スグン７：ラックおよびリゾチームに対し峰性である（Ｇｒａｈａｕ、Ｒ，Ｃ，ら、Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｅｈｅｍ、１４：２９１−３０２（１９６６）：　ＭｃＭａｎｕｓ、Ｊ、Ｆ、Ａ、　、Ｎａｔｕｒｅ　１５８　：２０２（１９４６）；　Ｌｉ、Ｃ，Ｙ、ら、Ａｍ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ。

７０ニア２ｌ−７３２（１９’７８）：　およびＭｃＭａｎｕｓ、前出、参照）。

一部の細胞については明らかにＰＡＳ陽性であることが注目された（Ｓｈｅｅｈａｎ、Ｈ，Ｌ、および５ｔｏｒｅ）＋＋Ｇ、　Ｗ、　、Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｔ、５９：３３６−３３７（１９４７））。しかし、これは必ずしも明確に認められたわけではない。α−す７チルブチレートエステラーゼとの反応性は不確かであったが（±）（Ｌｉ、Ｃ，Ｙ、　ら、Ｊ、Ｈｉ９ｓｔｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　２１：１−１２（１９７３））、ａ−ナフチルアセテートエステラーゼに対しては著しく陽性であった（Ｙａｍ、Ｌ、Ｔ。

ら、Ａｍ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、５Ｓ：２８３−２９０（１９７１））。

この細胞はまたβ−ゲルコニダーゼ（Ｌｏｒｂａｃｈｅｒ、Ｐ、呟　Ｊ、ＨｉｓＬｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、Ｉ　Ｓ：６８０−６９７（１９６７））および酸ボス７７ターゼ（Ｌｉ、Ｃ，Ｙ、呟Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、１８：４？３−４８１（１９７０））に対して陽性であり、同様に末端デオキシヌクレオチノルトランス７エラーゼ（ＴＤＴ）に対しても陽性であって、生化学的方法（Ｇｒｅｅｎｕ＋ｏｏｄ、Ｍ、　Ｆ、ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　５９：８８９−８９９（１９７７））お上びイムノ蛍光法（Ｂｏｌｌｕｍ。

Ｆ、　Ｊ９、”Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｎ＋ｓｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｎｅｏｐｌａｓｉａ”（Ｅｄ、　Ｃｈａｎｄｒａ、Ｃ，、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐ　ｒｅｓｓ、ＮｅＩＩＩＹｏｒｋ　１９７８））で決定された。

市販されている種々の試薬あるいは種々の他の抗血清を用いて表面膜イム７グロブリンの証明をくり返して行ったが、悉く失敗した。

同様に、細胞培養上澄液を１００００倍まで濃縮したものを用いて衿表昭５８− ５０１２５７　（４）ラジオイムノアッセイおよび酵素イムノアッセイにより、また細胞をプラークアッセイ法に使用したか、何れも不成功であった。しがしなが呟ＦＩＴＣ標識ヤギポリクロナールＦ　（ａｂ’　）２や、重鎮およびχならびにλ軽鎖に対して特異的なマウスモノクロナール抗ヒトＩｇＡ、ＩｇＭ、１ｇＧおよびＩｇＤ抗血清を用いた細胞質染色（ト１ｉｊｍａｎｓ、　Ｗ、呟Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４：４５７　４７２（１９６９））は、細胞の１５〜１８％において蛍光性細胞質γおよびχの強い陽性を示す。これらの反応は、染色に先立って未標識の純粋な抗ＩｇＧまたはχを加えることによって阻止される。サンドイッチイム／アンセイを次のとおり行った。すなわち、５Ｘｉ０５の細胞をプラスチックミクロタイターの底に固定し、複数回にわたって吸収させたウサギ抗Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４抗血清で培養し、３回洗い、アルカリ性ホス７７ターゼで標識されたヤギの抗うビントγグロブリン抗血清で培養し、次いでパラニトロフェニルホスフェートで３０分間展開した。この酵素イム７アツセイは細胞が専らＧ１を有することを等しく証明する。

電子顕微鏡断面および新鮮な細胞においてフェリチン標識抗１ｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、χおよびλ（Ｋｒａｅｈｅｎｂｕｈｌ、　Ｊ、　Ｐ、およびＪａｍｉｅｓｏｎ＋　Ｊ、　Ｄ、　＋　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、１３：１ −５３（１９７４））は表面膜の結合がないことを証明したが、細胞の１７％は抗ＴｇＧまたはχ試薬により濃厚な液胞染色を示す。これらの液胞は中心的にもしくは均一的に強く染色される。これらは分泌性細胞の培養体と異っており、後者は対象的に濃厚なＳｍＩｇ染色性を有し、液胞内においてＩＨのより分散的にかつより弱い染色性を示すか“、液胞の周辺においてのみ本発明のセルラインに匹敵する強度を示す。

若モの核型についての研究が行われたが、その各々において約３０の中期かＧＴＧパッディングによって分析された（Ｓｅａｌｂｒｉｇｈｔ。

Ｍ、　、Ｌａｎｃｅｔ、　２：９７１−９７２（１９７１））。第８継代において（１９７７）、２中期が４５、ＸＹ、＋（２：１２）（Ｇ３７；ｐｌ　３）として報告された松座を持つことが見出されたが、これはその後の研究でも認められた。それ故、異常なりローンまたは単なる人工品を表］−２わすこの発見の可能な意義は確実には知られていない。１９７９年における第５５継代の核型は、異常な染色体を持った１つの中期と、約９０の染色体の３つの１ｑ過剰二倍体中期と４５の染色体をもつ３低二倍体細胞を示し、各々は異った染色体を欠１・ており（−１、−１２、−２１）、更に池のものは−１０、−１５、−１７、−Ｙである。これらの欠乏の異った異常性か呟これらは技術的または方法的誤りの結果であると解釈され、細胞は正常な４６、ＸＹであると結論される。

セルラインは５つのヒトの部位、ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＮＰ、ＭＰＩおよびＳ　ＯＩ）　２において（０’Ｂｒ１ｅｎ、Ｓ、、Ｊ、　＋５ｈａｎｎｏｎ＋Ｊ。

Ｅ、およびＧａ１ｌ、Ｍ、　Ｈｌ、）ｎ　Ｖｉｔｒｏ、１Ｇ、１１９−１３５（１９８０））ヒトの標準にアイソザイムが一致するユニ〇・す、ヒトオリノンのものであることか証明された６　８つの多形性ヒトの位置における複合アイソザイムの表現型を表わすライ、／の７０ザイム遺伝子記号は次のとおりであった：ＰＧＭ１−１．ＰＧＤ−Ａ、ＰＧＭ３−１　、ＧＬＯ−１−２、ＥＳ　Ｄ−１、ＡＤＡ−１、Ｇ６ＰＤ−ＢおよびＡＫＩ−１，この表現型は今日までに試験されたＨｅＬａ細胞、Ｒａ１ｉ細胞および池のヒシリンパ細胞とは異るものである（０’Ｂｒ１ｅｒ＋＋　Ｓ、　Ｊ、　ｓ　Ｋｌｅｉｎｅｒ、Ｇ、、０ｌｓｏｎ、Ｒ，および５ｈａｎｎｏｎｔＪ、　Ｅ、　、５ｐｉｅｎｃｅ、１９５．１３４５− １３４８（１９７７）、Ｏ’Ｂｒ１ｅｎ　Ｓ、　Ｊ、、５ｈａｎｎｏｎ、Ｊ、　Ｅ、およびＧａｉ　ｌ。

Ｍ、Ｈ６，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、１６．１１９−１３５（１９８０））。

ニブシュタイン−バールビールス抗原は細胞上第２継代においてまた第９２連続継代において現われた。初期アンチデン（ＥＡ）は細胞の０．５〜１．０％に見出された。細胞は時に２つの参照抗血清によりビールス性カブジッド抗原（ＶＣＡ）に対し士反応を示し、細胞の全ては３種の陽性参照抗血清により核抗原（ＥＢＮＡ）に対し陽性であった（Ｒｅｅｄｍａｎ、Ｂ、　Ｍ、およびＫｌｅｉｎ＋　Ｇ、Ｉｎｔ、Ｊ。

ｃａｎｃｅｒ、１１．４９９−５２０、（１９７３）、ＰｅａｒｓｏｎｙＧ、Ｒ，＋Ｈｅｎ１ｅ、Ｇ、　＃よびＨｅｎ１ｅ、Ｗ、　ｔＪ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、４６．１２４３−１２５０（１９７１））。もとのおよびその後の１０２代にいたる継代におけるマイコプラスマに対する培養体（Ｂａｒｉ特表昭ｓｇ−５ａ１２５７　（５）ｌｅ、Ｍ、　Ｆ、およびＫｅｒｒ＋＋　Ｊ、　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｃｌｌ、１３８．４３２−４３７（１９７１））は１５０代までの生化学的および免疫学的試験におけると同様、一致して陰性であった。

セルラインは５年後かつ１５０以上の継代後も９０％以上の優れた生存性を保持する。制限希釈法にょろりクローニングはもとの冷凍参照培養体と同一の生長的、形態的かつ免疫的特徴を有する培養体を生産する。

本発明のセルラインの次の２つの性質は、ハイブリドーマセルラインを有利に調製し、選択して分離するために利用することができる＝１）該セルラインはＩｇＧまたはＭを生産する分泌性セルラインではない；　２）該セルラインは３〜５％Ｃ○２中では成育するが、９〜１１％またはそれ以上のＣＯ２の１境では死滅する。

１）基本的ハイブリドーマ技術は不滅性細胞（たとえば本発明のセ□　ルライン）が不滅性となる融合セルやハイブリドーマがら分離されることを必要とする。

融合しない抗体生産性Ｂ細胞は問題ではない。

正常であれば、それは培養中７〜１４日で死滅する。根本的な問題は、不滅性セルラインが初期の段階において破壊されやすく、極めてゆっくりと複製する融合よりも速い速度で生長し、著しい数的有利性をもって、ハイブリッドを救出し、発見しもしくは単離することをほとんど不可能にする。そうでなければ、不滅性セルラインは単に過剰に生育するか、ハイブリッドを殺滅することになる。現在入手可能な融合性セルラインはミエローマ細胞であり、ハイブリッドが分泌するのと同じ＜　ｈＧ、ＩＢＭ（またはまれにはｒｇＡ）を分泌する。従って、ハイプリントと元のセルラインを区別することはできない。しカルながら、本発明の形質細胞腫セルラインはＩｇＧやＩｇＭを生産する分泌性のセルラインではないので、本発明のセルラインをヒトのＢ−細胞と融合させ、融合後ただちに蛍光活性化セルソータ（たとえばＦＡＣ８ＩＶ　）により形質細胞腫を分離することが可能である。なぜならモノクロナール抗体生成細胞とＢ−細胞のみがその細胞膜上１ｇＧまたはＭに対するリセプターをもつからである。本発明のセルラインはこれをもたない。またＢ−細胞が死滅するまで２〜３週間を待ち、その後セルソーティングにょっ６て形質細胞腫をハイブリドーマから分離することができる。融合頻度が低いため（非常にわずかなハイブリッドが反応混合物中に存在し、本発明の形質細胞腫の数百万の細胞からＦ　Ａ、　ＣＳにより容易に分離されない。）、この方法を実施して成功を得るには実際的な問題があるが、蛍光活性化選別は明らかに本発明によって意図された好ましい分離法である。非常に選別能力のある、感受性の高いＦＡＣ８により、形質細胞腫からハイブリッドを容易に分離することが可能である。

２）形質細胞腫の第２の有用な性質は、生育培地懸濁液上の気体雰囲気か少なくとも９〜１１％Ｃ○２（ν／ｖ）の濃度である場合、それが本質的に死滅することである。ハイブリドーマは１０％ＣＯ２中において通常普通に生育し、生存するので、形質細胞腫をハイブリドーマから分離することは容易に行いうる。そこで、形質細胞腫をヒ）Ｂ−細胞と融合せしめ、反応参与体を約９〜１１％もしくはそれ以上のＣＯ２雰囲気中に置くことによって、１．Ｇ生産性ハイブリッドと非生存性形質細胞腫を分離すること力呵能である。１１％を越えるＣＯ７濃度は本発明のセルラインを非生存性にするが、このよ）な高いＣＯ７濃度は生育培地をハイブリドーマにとって過剰酸性にするので、避けるべきであろう。

いずれにせよ、蛍光セル選別とＣＯ７選択は分離に等しく有効であるように思われる。π実、両方法を連続してまたはグ互に１回もしくはくり返して適用することができる。

本発明の形質細胞腫セルラインを変異させてＨＰＲＴ−１６−チオグアニン（６ＴＨＧ）変異株を作り出すこともまた可能である。典型的には、公知のハイブリドーマ技術において、ＨＰＲＴ陰性変異株（変異誘発原による自発的または誘４さｒた）、便宜的には８−アザグアニン（ＡＺＧ）または６−ＴＨＧにおける生長性により確認されたものはヒボキサンチン、アミ７プテリンおよびチミシ゛ン（ＨＡ１゛）を含む特別の組織培養基においては生育しないが、ハイブリドーマは生育しよう。これは、もし不滅性セルラインが融合しうるちのであるならばそれ自身のＨＡ　Ｔにおける生存性は皆無であるが、そのＩ−（Ｐ　ＲＴ　’ハイブリッドは複生し、融合Ｂ−セル配偶体により寄与された１８合歳、分泌機構によりモノクロナール抗体を生産することを保証する。本発明者はＨＰ　Ｒｉ’− １６−ＴＨＧ変異株を調製し、８−ＡＺＧおよび６−Ｔ　ＨＧ自発性変異株を分離した。形質細胞腫のこれらの変異株は親ラインと同様の条件下に生長する、− とかにきる。また、（第ｊ）の方法として）これをＢ−細胞：こ融合させたハイ７リドーーーー２を調製し、トＩＡ’ｒ培地中でこのハイフリドーマを分離することができる。

形質細胞腫（またはイのＨＰ　ＲＴ−変異株）の融合は当業者によく知られた融合技術を採用することにより行われてよい（例えば、前記したＫｏｐｒｏ粘に」らの特許およびＷａｎｄｓらの特許参照）。例えばヒトのリンパ球は抗原（ビールス性抗原、細菌性抗原等、例えば肝炎８表面抗原、肝炎Ｆ３　Ｆ抗原、ＳＶ・４０腫瘍等）抗原の製造；こよりイン・ビトロまたはイン・ビボで刺激されまたは免疫される。抗原の投与、経路とスケジュールは経静脈的または経複腔的にもしくは両者により行うことができる。投手量は体重当たり１〜約５０マイクログラムであってよく１、：のように調製されでよい。また、好ましくはＢ−細胞は付Ｆ５−された病気を持った患者であって所望のイムノゲンに至る高い抗体タイターを有するものから得られる。Ｂ−細胞はヒ）の肺臓または末梢血液から得られるが、末梢血液を採取原とするのが好ましい（末梢血液はＢ−細胞約２０％を含み、標準の方法によって分離することかできる）。血液は滅菌状態で定常的ｌこ得られ、無直性を容易に試験することがでた、通常無菌である点で好ましく、これに反し肺臓は共生有機体で汚染されている場合が多く、破壊的な方法によってのみ得ることができる。ヒトのＢ−細胞を本発明の形質細胞腫と融合させるには、Ｋｃｎｅｔｔらの方法（Ｃｕｒｒ、　ＴｏｐｉｃｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏＨｉｃａｌ　Ｉ＋ｏｍｕｎｏ１．８　］ニア　７．１９７８）に従って行えばよい。形質細胞腫細胞をＢ−細胞と混合し、元の培地を除いた後、ポリエチレングリフールＣＰＥＧ）を加える。Ｐ　Ｅ　Ｇ　？短時間培養後、細胞を分離し、ハイ７リドーマ培地中に再懸濁し、平板培養に付し、１）〜１１％ＣＯ７雰囲気中で生育せしめる。分離はＦ　Ａ　ＣＳ法（適当に蛍′＃、標識化された抗体を加える）、９〜１１％ＣＯ０雰囲気に保持する、または（変異株が用いられる場合）ＨＡＴ培地中で作業するこ０とにより１ｊうことがで５る。ミクロタイターウェル（ｗｅｌｌ）は融合後１、０−２０　Ｆ１間で生長してものをスクリーンし、モノクロナール抗体を分泌したものからクローニング用のバイブリド−７セルラインを選択する。クローくニングは正規の方法により実施することができる。

要するｉこ、このセルラインはモノクロナール、非分泌性プラスマサイ）・イド細胞から成り、その生長ザイクルにおいて細胞の約１５％がＩｇＣ；１／χを合成するが、重鎮も軽鎖も分泌しない。その安定性、生存性および他の特徴（マイコプラスマを金層ぜず）の故に、ハイ７リドーマや付帯モアクロナール抗体の調製のみならず、分泌欠陥の研究：こも使用し得るものである。

上記ハイブリドーマから得られたヒトのモアクロナール抗体は患者をして外的血清に免疫ならしめる恐れなく、受動免疫に使用することが出来る。それらは、たとえば毒性医薬の標的の如く、腫瘍テラピーに使用することも出来る。特別の器官の組織や推定上の特異な腫瘍抗原に対する抗体は医薬分子にｆ＝ｆ加して該医薬効果を濃縮することが出来る。また、自分自身腫瘍細胞を攻撃する抗腫瘍抗体を生産することも可能である。

以上、本発明を一般的に記載したが、本発明は以下の具体的な例と方法を参照することにより、より良く理解されよう。ただし、特記しない限り、これらは説明のみを目的とするものであり、本発明の限定を意図するものではない。

青味セルライン源細胞を採取した患者は、１９７６年５月にメイヨー・クリニック（ミネソタ州ロチェスター在）において貧血による左心不全（ＨＣＴ２５）および増血機能障害（４１、２００ＷＢＣ／ｍｍ２）と診断された８１才の男性であった。診断医は好中球８％、好酸球１％、リンパ球６０％異常単核細胞（リンパ球または形質細胞と考えられる。）と報告した。この時点における骨髄はミニロイド系およびエリスロイド系の正常な成熟状況にあるものと解釈されたが、形質細胞様と認められる異常な細胞が認められた。臨床医と病理学者は、この患者は形質細胞悪液質であり、かつ骨髄腫、恐らくモノクロナールガンモパシイ不在故の軽鎖疾病であるに違いないと感じた。しかし、血液学者および他の病理学者はその骨髄を形質細胞の失意であるよりはむしろ骨髄単球性白血病であると解釈し、そのＰＡＳ染色が陰性であることに注目した。

前記クリニックに入院する際、患者は近位右撓骨に塊を有し、右手において運動と知覚障害が認められた。末梢血液塗抹標本は好中球５％、好酸球１％、単球１１．５％、リンパ球４３％および不定形リンパ球３９．５％を示した。また、低ガンマグロブリネミアが証明され、主としてＩｇＧ（最低一高値３．８７−４．１１ｍｇ／ｍｌ；４７．８−５０．７ＩＵ）およびＩｇＭ（０，１３−０，５１ｍｇ／ｍ１１２゜４−４８．４　ＩＵ）であって、低イカシカシ正規のＩｇＡ（０，３４−０，３９ｍｇ／ｍｌ；１８．２−２０．８　ＩＵ）を示した。モノクロナールイムノグロブリンは血清や尿中には見出されなかった。１９７６年５月２１日右撓骨を剖検したところ、撓骨神経を含む溶解性形質細胞腫が認められた。光学および電子顕微鏡により観察したところ、末梢血液および骨髄中に不定形細胞の存在が認められたが、これらは骨障害における細胞と形態学的に区別し得ないものであった。表面膜Ｉ　ｇ（Ｓｍ　Ｉ　［１）染色は細胞の何如なるものについても検出し得なかったが、固定細胞の３６％は細胞質のＩｇＧおよびχを示した。

患者は形質細胞腫を有する非分泌性の形質細胞白血病をもつものと診断された。

１９７６年５月２７日までに彼の末梢細胞の８２％は不定形の形質細胞性白血球であり、血液は細胞培養のために採取された。右撓骨に対する照射を行い、ディスチャージに先立ってメルフアラン、アロプリノールおよびメチルプレドニソロンを投与したが、これによって診断医の指導下に２つの治療コースが期待された。

１９７６年８月、患者は予後診断のためにメイヨー・クリニックを訪れた。この時点で、不定形の細胞の若干（９，５％）が骨髄もしくは末梢血液中に認められた。しかし、半血球減少症が認められ、患者は相当の骨の痛みを訴えた。患者は結局急性左心不全により死亡した。

細胞培養の確立４１９７６年５月２７日にプラスマセル増殖の水準でヘパ−リン化（保存剤のないヘパ−リン）静脈血２０＋＋＋ｌを得た。末梢血液サンプル中における赤血球は室温において注射筒中で巻物状（ｒｏｕｌｅａｕｘ）を呈した。懸濁された毛羽立った表面を有するセル、主としてプラスマセルはプラスマから１００ＸＧにおいて徐々に遠心され、ペレットは０．８７％塩化アンモニウムで２度洗い、次いで血清を含まない組織培養液（ＴＣ）ＲＰＭ　Ｉ　１６４０で２回洗浄した。Ｎ　ｉ　１ｓｓｏｎらの一般的なグリソドカルチュアアブローチを使用しくＮｉ１ｓｓｏｎ、　Ｋ。

Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　８：４３２−４４２（１９７１））、約１× １０７のセルを滅菌組織培養ペトリディッシュ中２０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４０　１．ｍｌ中の滅菌吸収性ゼラチンスボン：、’１，５Ｘ０．５ｃ１１１片上・＼ビペントで注ぎ、このペトリディッシュを洗うためにＴＣ液５１１１を追加した。最初の培地はＲＰＭ１１６４０および１５％自己由来プラスマであった。ＴＣディツシュはＣＯ２４％を含む湿った大気中に３７℃で放置された。これらの２つのディツシュからの上澄液を１〜３日間培養し、遠心分離し、細胞ベレットを元のセルローズパッド中へ再分散させた。１９７６年７月６日、細胞を再培養し、１５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ１１．６４０中に置き、２５ｃｍ２滅菌Ｍ！Ｌ織培養７ラスフ中へ移し、その後さらに７５ｃｍ２７Ｃ７ラスフ中へ移した。活性増殖とセル塊形成は１９７６年７月９日に観察された。Ｎｉ１ｓｓｏｎ法と異り、線維芽細胞フィーダ一層は使用されなかった。

スポンジを持ったもしくは持たない種々の他の培地（マッマイ、イーグル、ＨＥＰＥＳまたは重炭酸塩緩衝ＴＣ１９９）や種、々の濃度のＦｅ２またはヒ）ＡＢ血清を多少−諸にして用いられた。これらの培地においては、まばらな初期生長以上のものは認められなかった。その後患者の骨髄懸濁液の１ｍｌをとり、Ｆ　１ｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェント（Ｂφｙｕｌｌｌ＋　Ａ、　、　５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５ｕｐｐ１．　ｔ　Ｓ：９−１５（］　９７６））上で分離を行った。ＴＣ培地ＲＰＭ　Ｉ　１６４０の１：１希釈液の後、分離された丸い細胞および池の正味の検体を直接、前記末梢血液サンプルに匹敵するゼラチンスポンジ中にのせた。これらの培地において河如なる成長も認められなかった。

特衣昭５８−５０１２５７（８）懸濁液中に生長した細胞は小さな塊を形成し、これは比較的容易に分散せしめることかでと、かつその分散状態を維持することができた。Ｆｅ２の濃度を１０．１５または２５％に変えることは生長のためには満足な程度もしくは成功する程度に好ましいものであったが、最高のセルの数を生産する最も効率的な方法は３８℃においてＦＣ３濃度を２０％とし、４％ＣＯ２の湿った雰囲気中で得られた。細胞の生長は同じ条件下、０．４８％のアガロ−又中でも同様で・あった。培養を継代する場合に好しい細胞の再形成は元の培地が僅かに酸性になったとぎ、等量の新しい培地を加え、得られた容積の半分を新しい７５ｃｍ’フラスコ中に移すことによって達成された。

先に凍結されたものから１５０を超える連続継代培養のウェル（ｕ＋ｅ１１）をそれ以前の継代のものから凍結した。生存能力はト記の如く１６０−４７０１代培養しタノち、７２−８３％に減少する。Ｆｅ２またはＣＯ２の濃度を変化させても実質的に生存能力の改良をもたらさない。ＴＣ培地から細胞を遠心分離し、新鮮な培地中に植えつぐことはセル密度を０．５〜１Ｘ　］　０６／ｍｌに維持する限り生存能力におけるこの減少を妨げるように見える。継代培養第２代、第４代、第７代、第８代、第１０代およびその後１０〜１５継代毎に第５５代まで比較研究のために液体窒素中に保存した。これらの継代の細胞的特徴について観察したか、核型研究（こおいて認められた若干の異常もしくは！（工体を除いては何如なる相異Ｉｌｊ認められなかった。

セルラインの特徴培養庫の平均的：２倍増殖時間はセル濃戻呵（゛　’１−１ＸｌＯ”、・、）′ である場合、ｌ　９　、９４　ｎｉ；　１ｊｉｌ　”ｌ’：　、ｊ’）　２Ｎ　、、蛍ｔ、７：Ｊｉ　＠１．（：　、ｌＩ　□；；　−５＋４．（１、、けるマイｉ　７−、イン　染色細胞（１，５１１）１′１ｄ（、ｌ　纂、”：（４ｊ　 −ｌ　７．　Ｑ　−９ｑ；食塩水中ｆ）、　１　ｍｇ、／”ｍｌ、、　２０分間）生長の特徴１」羊１図９、−示される、１セルの７１．２５％は細胞サイクルのＧｏとＣＩ　１．’　、ＩＣイスにあＨ，、ｑ。

８１％は合成（Ｓ）フェイスにあり、１８．９３％はＧ、およびＭｌ：ある。セルの大きさの範囲は直径ｉ二おいで７〜３０μであるが、その大多数は直径２０ μ以下である（第２図）。生長サイクル７エイスとセルのサイズとの間には特に相関関係は認められない。イ二ヤ−・ロイキン−２はセルサイクルの速度や性質に特別の効果を与えない。

８ただし１．２つの予備的な実験においては生長の促進を暗示した。

セルラインは最も好ましくはベン／′又トラ又またはゲンタマイシンを２−むＲＰＭＩ　１６４０／２０％ＦＣ８中で培養亭れるベトであり、好ましいセル密度は（１，５〜１×１０ｊ′であり、酸の場合には培地を２倍（二Ｉ、別／７ｆｊ貴ス〕（７分離十べぎて゛ある。凍結のためにはセル濃度は１〜２Ｘ１０”セル、”＋１１１が好ましく、ＲＭＰ　ｆ　ｉ　６４０　、ｒ’　１８　Ｑ’、　Ｆ　Ｃ，”、　Ｓ　）最終１度１．ｓ、　、、”　、ＩＬ・９　Ｅ　’、／　７　（？、、　８　’ａｃｔ′ｎ　ｊ　ｙ　””’ｔタマｌ　；二”　４３１Ｇｃ’ に／”’１ｌｌｌ　’Ｃある。１７ン７’Ｊ−当りｉｍｌを液体窒素、ワ）気１本　１．ス中で凍結し、液下に調製す、モことＩｎ　Ｊ、　、て容易に製造することかできる。セルラインｌ′Ｊ］、　９８　Ｌ年８月３日ｉ：ＡＴｃｃｉこ寄託された。

ヒトＢ−細胞源と富化ヘパーＩ＋／化した（保存剤を含まず）靜脈血３ｏθ〕１を抗ＥＶＢ（ＶＧＡ（ビールス性ｈ　７’　シｙド抗原）１：１６０．ＭＡ（膜抗ｉ）１：ｌ１ｌＯ１ＥＡ（初期抗原）１：１０、Ｅ　Ｂ　Ｎ　Ａ　（核抗原）１：３１２）抗体の高いタイターを持つことが知られているヒトから採取された。ただし、採取の時点でこのビールスにさらされていた（職業的に）。単核細胞はＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｆ／Ｈ）クッシＢン上希釈された血液を遠心するこのによって単離された。このようにして得られたセルはＨａｎｋ氏バランスド塩溶液（ＨＢＳ、Ｓ）中で２回洗浄し、１０％０％ヒトブールＢプラスマと１％へバーリン含有ＨＢＳＳ中に再懸濁し、１３Ｘ２ｃｍガラス製ペトリディッシュ中におき、３７° Ｃで５％Ｃ○２を含む１００％湿度雰囲気中４５分間培養した。非接着性７ラクシヨンをプレートからピペツＦによって採取し、ディツシュを温（３７’Ｃ）ＨＢＳＳで２回にわたって洗浄した。ＨＢＳＳで洗浄後、これ□　らの細胞を１：４０の比でフイラミニダーゼ処理ヒツジ赤血球と混合し３７℃において３０分間、水浴中において３．５時間培養し、パスツールピペｙ’ｃで緩やかに再懸濁し、層積後、Ｆ／Ｈり・ンション上で遠心した。界面における細胞を吸引で集め、洗浄し、１０％ＦＣ３’２ｍＭグルタミン、５＋ｎｇ／ｄｌゲンタマイシンおよびポークライード・ミ）−ゲン５０μｇ／ｍｌ含有ＲＰＭ１１６４０培地中におき、３７℃において５％ＣＯ２雰囲気中２４時間培養し、融合に使用した。このセルフラクションは標準のイムノフルオルエツセンスアッセイにより６０〜６５％表面イムノグロブリン陽性（Ｓ＋ｍ１ｇ＋）細胞を含むことが証明された。これをＢ細胞富化群と呼ぶ。

融合方法およびバイブリドセルの生長採用された融合技術はＫｅｎｅｔｔら（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８１　ニア　７．１９７８）によって報告されたものである。要するに、３．５Ｘ１０６Ｂ−富化細胞を同数の対数７エイ３に生長しつつあった形質細胞腫細胞（発生時間２０時間以下）と混合した。この細胞混合物をペレット化し、上澄液を除き、３０％ポリエチレングリコール（分子量９５０〜１ｏｓｏ）溶液０，１ｌＩＩｌを室温における６分間の遠心時間を含め正確に８分間で加えた。細胞を１度洗い、好ましくは２μｇ／ｄｌのエタノールアミンまたは／およびヒＦの内皮細胞からの調製メディウム（ＨＹ）培地中１０％ｖ／ｖ調製メディウム以下）を含むハイブリドーマ（ＨＹ）培地中に再懸濁し、５０μｍの培地におけるウェル当り約３．５Ｘ１０４セル密度において２つの９６平底ミクロタイタープレート中に分散させた。プレートは非融合ＣＲＬ８０８３が死滅することが知られている１０％ＣＯ２雰囲気下３７℃において培養された。

全ての培養体に融合後２日目、７日目および１０日目にＨＹＹ地５０μｍを与えた。１２日目までに細胞の塊状生育が１９２のウェル中２４以下に認められ、その他多くのウェルは死滅した細胞および細胞のくずのみが認められた。一方対象ウエルはＢ細胞のみを含んでいた。

抗体生産に対するスクリーニング融合後１２日目に全てのウェルから上澄を除き、予めヤギ抗ヒトイムノグロブリン抗体を物理的に吸収させることによって被覆した酵素イムノア７セイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）ミクロタイタープレートに移した。これらのＥＩＡプレートを３７°Ｃにおいて２時間培養し、ＰＢＳツイン３Ｘで洗い、アルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒ）Ｉｇ抗体の１／１０００希釈液で再び満した。２時間培養した後、未結合の抗体を洗い流し、特異的に結合した抗体の存在をパラニトロフェニルホスフェート溶液１ｍｇ／ｆｎｌを３０分間加えることによって確認し３また。このようにして分析した１９２上澄液中３つについてヒトイムノグロブリンの存在が陽性であった。

制限希釈法による抗体生産性セルのクローニングヒトのイムノグロブリンが証明されたウェルのセルを吸引によって集め、ＨＹ培地に再懸濁し、数を数えた。それらの半分を３つのフラクションに分離し、その１つはＨＹ培培養中ソクロタイタープレートおいて２０〜２５セル／ウ工ル密度においてクローン化した。

第２の７ラクシヨンは上記と同濃度および同培地中、培養培地中０゜５％アガロース５０μｌ中に５Ｘ１０５ヒトヘルパーＴセルがフィーダ一層として予め存在していたプレート中でクローン化を行った。

第３のフラクションは第１のフラクションについて記述したのと同様の条件であるが、大腸菌０１１１：Ｂ４からのりボポリサッカラ″　イド（ＬＰＳ）Ｂ４μ ｇ／ｍｌを添加した培地中でクローン化を行った。

元のコロニーのセルの他の半分はフルオロエラセンイソシアネート標識ヤギ抗ヒト多価Ｉｇ、Ｆ（ＡＢ’）”製剤を用いるＳＩＩＩＩｇ染色を行って分析し、陽性のセルを蛍光活性化セルソータを用いて選別した（ＦＡＣ３ＩＶ、ベックトン・ディッキンソン、サニーバレー、カリフォルニア）。生存能を有する細胞全数の８５％以下を示す５ｍ１ｇ十を計算し、３つの７ラクシヨンに分け、その各々を非選別セルについて記述した上記と同様の方法でクローン化した。

培養物は１０％ＣＯ２含有湿度１００％雰囲気下３７℃に維持し、６〜７日毎に）（Ｙ培地を与え、時折インバーテンド顕＠鏡の下で観察した。

生長は遅く、ネヅミ融合における観察に匹敵する。しかし、いくらかのウェル、特に大腸菌を加えた培地も持ったプレートにおいては若干の塊（ｃｌｕｍｐ）の形成が認められた。

本発明の要旨は上記したとおりであるが、当業者にとって本発明の精神を逸脱することな（、上記記載と均等の方法もしくは組成で種々の改変をなすことは容易であろう。

セｌＬ／　ザイグＩし０　５　Ｔｏ　１５　２０　２５　３０　３５　４０　４５　５０リイ人゛１ＬＦＩＧ、２

Claims

【特許請求の範囲】

１．連続的ヒト非抗体分泌性プラスマサイトイドセルラインから成る生物学的に純粋なセル力ルチュア（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−８０８３）およびそのクローンまたはサブクローン。２、抗体生産性ヒ）Ｂ−リンパ球を特許請求の範囲第１項の非分泌性ヒトプラスマサイトーマと融合させて抗体生産性ハイブリドーマを形成せしめ、少なくとも９〜１１％の二酸化炭素を含む培地中でヒト−ヒトハイブリドーマを選択することを特徴とするヒト−ヒトハイブリドーマの調製方法。３、抗体生産性ヒ）Ｂ−１７ンパ球を特許請求の範囲第１項の非分泌性ヒトプラス１ノサイＹ−マと融合させて抗体生産性ハイブリドーマを形成せしめ、反応混合物を蛍光標識抗体と混合して該抗体を前記ハイブリドーマに結合させ、この複合体を蛍光活性化セル選別により前記非分泌性ヒトプラスマサイトーマから分離することを特徴とするヒト−ヒトハイブリドーマの調製方法。４、上記ハイブリドーマをイン・ビトロで培養する特許請求の範囲門弟２項または第３項の方法。５。融合ハイブリドーマと非分泌性プラスマサイトーマを含む反応混合物を蛍光標識抗体と混合して該抗体を前記ハイブリドーマと結合せしめ、上記非分泌性ヒトプラスマサイトーマを蛍光活性化セル選別により前記蛍光性抗体を維持するハイブリドーマがら分離することを特徴とする特許請求の範囲第２項の方法。６、蛍光活性化セル選別による分離が少なくとも９〜１１％のＣＯ２を含む培地中の選択に先立って実施される特許請求の範囲第５項の方法。