JPS60251881A - ヒト−リンフオブラストイド細胞系及びこれから誘導されたハイブリド−マ - Google Patents
ヒト−リンフオブラストイド細胞系及びこれから誘導されたハイブリド−マInfo
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- JPS60251881A JPS60251881A JP60089116A JP8911685A JPS60251881A JP S60251881 A JPS60251881 A JP S60251881A JP 60089116 A JP60089116 A JP 60089116A JP 8911685 A JP8911685 A JP 8911685A JP S60251881 A JPS60251881 A JP S60251881A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は生物工学分野に属し、そして体細胞ハイブリ
ダイゼーション及び免疫化学に関する。
ダイゼーション及び免疫化学に関する。
さらに詳しくは、この発明はニジスタイン−バールウィ
ルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ −Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ：
ＥＢＶ ）で形質転換されたリンフすブラストイドｍ合
一−トナ−５このリンフ寸プラストイド系を用いて作ら
れたヒト×ヒトハイプリドーマ、及びこのノ・イブリド
ーマにより産生されるヒトモノクローナル抗体に関する
。
ルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ −Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ：
ＥＢＶ ）で形質転換されたリンフすブラストイドｍ合
一−トナ−５このリンフ寸プラストイド系を用いて作ら
れたヒト×ヒトハイプリドーマ、及びこのノ・イブリド
ーマにより産生されるヒトモノクローナル抗体に関する
。
コーラ−２Ｂ、及びミリスタイン、Ｃ１，ネイチェアー
（Ｎａｔｕｒｅ ）（１９７５）２５６ ：４９５−４
９７は、モノクローナル抗体を産生ずる連続的ハイツリ
ドーマを造成するための体細胞・・イブリダイゼーシ百
ンの使用の先駆を成した。彼らの研究はネズミ由来の形
質細胞腫及びリン／＃球を用いた。これに続く研究者は
コーラ−及びミリスタインの技法のヒト細胞への応用を
報告している。
（Ｎａｔｕｒｅ ）（１９７５）２５６ ：４９５−４
９７は、モノクローナル抗体を産生ずる連続的ハイツリ
ドーマを造成するための体細胞・・イブリダイゼーシ百
ンの使用の先駆を成した。彼らの研究はネズミ由来の形
質細胞腫及びリン／＃球を用いた。これに続く研究者は
コーラ−及びミリスタインの技法のヒト細胞への応用を
報告している。
クロースＣ，Ｍ、等、ネイチェアー（Ｎａｔｕｒｅ ）
（。
（。
ンドン）（１９８０）２８８：４８８：並びにオルソン
Ｌ、及びカブランＨ，８，，７’ロシーデインダス・オ
プ・ナシ目ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシス・オ
プ・ザ・ユナイテッドースティン・オプ・アメリカ［Ｐ
ＮＡＳ （ＵＳＡ ） ］ （１９８０）７７ ： ５
４２９を参照のこと。
Ｌ、及びカブランＨ，８，，７’ロシーデインダス・オ
プ・ナシ目ナル・アカデミ−・オプ・サイエンシス・オ
プ・ザ・ユナイテッドースティン・オプ・アメリカ［Ｐ
ＮＡＳ （ＵＳＡ ） ］ （１９８０）７７ ： ５
４２９を参照のこと。
スタインウィッツＭ０等、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）
（１９７７）２６９ ：４２０、及びリンァンチＡ、Ｇ
。
（１９７７）２６９ ：４２０、及びリンァンチＡ、Ｇ
。
等、ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） （１９７７） ２
６９：４１９は、ＥＢＶで形質転換されたヒトＢリンフ
すプラストイド細胞からの特異的ヒト抗体のイン−ビト
ロ産生を記載している。ＥＢＶによる形質転換は、これ
らの細胞が連続的に増殖することを可能にしたが、この
細胞は典型的にはＩｇを分泌する能力を短期間に喪失し
た。幾つかの最近の文献は、Ｉｇ産生ヒトリンノ臂球と
の融合における親腫瘍バートナートとしてＥＢＶで形質
転換されたとトーリンフオプ２ストイド細胞系を使用す
ることを記載している。１９８２年１０月１３日に公表
されたヨーロッノ母特許出願第８２３０１１０３．６号
は、ＷＩ−Ｌ２−７２９ＨＦ２と称する細胞系を記載し
ている。この細胞系ｄ、ＷＩ−Ｌ２系のヒポキサンチン
ホスホリゾジルトランスフェラーゼ（ＥＰＲＴ）欠損変
異株であると報告されている〔レビーＪ、Ａ等Ｖキャン
サー（Ｃａｎｃｅｒ ） （１９’６８ ） ２２ ：
５１７〕。この細胞系は、ｓＩｇＭに＋、ｃｙｌｇＭに
す。
６９：４１９は、ＥＢＶで形質転換されたヒトＢリンフ
すプラストイド細胞からの特異的ヒト抗体のイン−ビト
ロ産生を記載している。ＥＢＶによる形質転換は、これ
らの細胞が連続的に増殖することを可能にしたが、この
細胞は典型的にはＩｇを分泌する能力を短期間に喪失し
た。幾つかの最近の文献は、Ｉｇ産生ヒトリンノ臂球と
の融合における親腫瘍バートナートとしてＥＢＶで形質
転換されたとトーリンフオプ２ストイド細胞系を使用す
ることを記載している。１９８２年１０月１３日に公表
されたヨーロッノ母特許出願第８２３０１１０３．６号
は、ＷＩ−Ｌ２−７２９ＨＦ２と称する細胞系を記載し
ている。この細胞系ｄ、ＷＩ−Ｌ２系のヒポキサンチン
ホスホリゾジルトランスフェラーゼ（ＥＰＲＴ）欠損変
異株であると報告されている〔レビーＪ、Ａ等Ｖキャン
サー（Ｃａｎｃｅｒ ） （１９’６８ ） ２２ ：
５１７〕。この細胞系は、ｓＩｇＭに＋、ｃｙｌｇＭに
す。
非分泌であシ、そして血清不含培地中で増殖することが
できるものとして特徴付けられる。チオラッチＮ０等、
ジャーナル礫オプ豐エクスイリメンタルーメデシン（Ｊ
、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ−） （１９８２）Ｌ互６：９３
０−９３５はＷｒ −Ｉ、２系に由来するＥＢＶによシ
形質転換された他のヒト−リン７オプラストイド細胞系
を記載する。Ｈ２Ｓ、１．１゜と称するこの細胞系はＷ
Ｉ−Ｌ２−７２９ＨＦ２系とは異る特徴を有するようで
ある。ハンドレイＨ，Ｈ，等、第１５回国際白血球培養
会議の会報（Ｐｒｏｅｅ＠ｄｉｎｇｇ ｏｆ ｔｈｅ
１５ ｔｈ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｓｕｅｏｃ
ｙｔｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ）
、アシロマー（１９８２）、２６７頁は、Ｕ Ｃ，７２
９−６と称するＷｌ−Ｌ２−７２９ＨＦ２の中間親糸を
記載している。ＵＣ７２９−６はＷＩ−Ｌ２−７２９Ｈ
Ｆ２と共通の性質を有するものと報告され、そしてＩｇ
産産生ヒト上ヒトハイツリドーマ造成する場合の融合の
ハードナーとして使用された。
できるものとして特徴付けられる。チオラッチＮ０等、
ジャーナル礫オプ豐エクスイリメンタルーメデシン（Ｊ
、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ−） （１９８２）Ｌ互６：９３
０−９３５はＷｒ −Ｉ、２系に由来するＥＢＶによシ
形質転換された他のヒト−リン７オプラストイド細胞系
を記載する。Ｈ２Ｓ、１．１゜と称するこの細胞系はＷ
Ｉ−Ｌ２−７２９ＨＦ２系とは異る特徴を有するようで
ある。ハンドレイＨ，Ｈ，等、第１５回国際白血球培養
会議の会報（Ｐｒｏｅｅ＠ｄｉｎｇｇ ｏｆ ｔｈｅ
１５ ｔｈ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＬｓｕｅｏｃ
ｙｔｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ）
、アシロマー（１９８２）、２６７頁は、Ｕ Ｃ，７２
９−６と称するＷｌ−Ｌ２−７２９ＨＦ２の中間親糸を
記載している。ＵＣ７２９−６はＷＩ−Ｌ２−７２９Ｈ
Ｆ２と共通の性質を有するものと報告され、そしてＩｇ
産産生ヒト上ヒトハイツリドーマ造成する場合の融合の
ハードナーとして使用された。
この発明の１つの観点は、ＬＴ８２２８と称する、ＫＢ
Ｖで形質転換されたヒト−リンフすプラストイドＢ細胞
、及びその子孫である。
Ｖで形質転換されたヒト−リンフすプラストイドＢ細胞
、及びその子孫である。
この発明の他の観点は、ＬＴＲ２２８と抗体産生ヒト細
胞とのハイプリドーマ及びこのハイプリドーマの子孫に
関する。
胞とのハイプリドーマ及びこのハイプリドーマの子孫に
関する。
この発明の他の観点はモノクローナル抗体産生ヒト×ヒ
トハイプリドーマの製造方法に関し、この方法は、 （ａ） ＬＴＲ２２８系のリンフすプラストイドＢ細胞
とヒト抗体産生細胞とを融合促進剤（ｆｕ＠ｏｇｓｎ）
を含有する融合媒体中で融合せしめ； （ｂ） 前記融合媒体から細胞を分離し；（Ｃ） 前記
分離された細胞を拡げ：そして、（ｄ） 前記拡げられ
た細胞をヒポキサンチン及びアザセリンを含有する培地
中で増殖せしめ、こうすることによって前記ハイシリド
ーマを選択する；ことを含んで成る。
トハイプリドーマの製造方法に関し、この方法は、 （ａ） ＬＴＲ２２８系のリンフすプラストイドＢ細胞
とヒト抗体産生細胞とを融合促進剤（ｆｕ＠ｏｇｓｎ）
を含有する融合媒体中で融合せしめ； （ｂ） 前記融合媒体から細胞を分離し；（Ｃ） 前記
分離された細胞を拡げ：そして、（ｄ） 前記拡げられ
た細胞をヒポキサンチン及びアザセリンを含有する培地
中で増殖せしめ、こうすることによって前記ハイシリド
ーマを選択する；ことを含んで成る。
この発明の他の観点はヒトモノクローナル抗体の製造方
法であり、この方法は、 （、） 前記ハイプリドーマを増殖培地中で増殖せしめ
；そして、 （ｂ） この増殖培地からヒトモノクローナル抗体を単
離することを含んで成る。
法であり、この方法は、 （、） 前記ハイプリドーマを増殖培地中で増殖せしめ
；そして、 （ｂ） この増殖培地からヒトモノクローナル抗体を単
離することを含んで成る。
この発明の他の観点は、ヒトモノクローナル抗体８Ａ１
３及びその機能的同等物である。
３及びその機能的同等物である。
この発明の他の観点は、ノ・イブリドーマ５Ａ１３及び
その子孫である。
その子孫である。
この発明の他の観点は、破傷風に対するヒトモノクロー
ナル抗体の製造方法であり、この方法位増殖培地中でノ
・イブリドーマＳＡＩ ３を培養し、そしてこの増殖培
地から抗体を採取する方法に関する。
ナル抗体の製造方法であり、この方法位増殖培地中でノ
・イブリドーマＳＡＩ ３を培養し、そしてこの増殖培
地から抗体を採取する方法に関する。
この発明の他の観点は、医薬として許容される非経腸的
担体と混合されたモノクローナル抗体５Ａ１３又はその
機能的同等物の有効量を含んで成る破傷風を治療するた
めの医薬組成物に間する。
担体と混合されたモノクローナル抗体５Ａ１３又はその
機能的同等物の有効量を含んで成る破傷風を治療するた
めの医薬組成物に間する。
この発明の他の観点は、モノクローナル抗体ＳＡＩ ３
又はその機能的同等物の有効量を個体に〔発明の実施方
法〕 ここに記載する細胞系に関して使用する「子孫」なる語
は、世代又は核型の同一性にかかわらず、記載された細
胞系のすべての誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ）、子
（１ｓｓｕｅ ）、及び結果物（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ
）を包含する。これに関して、核型の変化は細胞が維持
される条件に依存して自然的に誘導され又は生ずること
がよく知られている。ＬＴＲ２２８系の場合において、
ＬＴＲ２２８の融合能力、６−チオグアニン耐性、及び
増殖特性を有する子孫が好ましい。
又はその機能的同等物の有効量を個体に〔発明の実施方
法〕 ここに記載する細胞系に関して使用する「子孫」なる語
は、世代又は核型の同一性にかかわらず、記載された細
胞系のすべての誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ）、子
（１ｓｓｕｅ ）、及び結果物（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ
）を包含する。これに関して、核型の変化は細胞が維持
される条件に依存して自然的に誘導され又は生ずること
がよく知られている。ＬＴＲ２２８系の場合において、
ＬＴＲ２２８の融合能力、６−チオグアニン耐性、及び
増殖特性を有する子孫が好ましい。
この明細書において使用する「機能的同等物」は、モノ
クローナル抗体５Ａ１３と同一の破傷風決定基を認識し
、モノクローナル抗体５−Ａ１３をクロスブロックする
ヒトモノクローナル抗体を意味する。同一のクラス又は
異るクラスの抗体、及びモノクローナル抗体の抗原結合
断片〔例えｄｌＦｍｂ 、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ ）ｆ包
含することが意図される。
クローナル抗体５Ａ１３と同一の破傷風決定基を認識し
、モノクローナル抗体５−Ａ１３をクロスブロックする
ヒトモノクローナル抗体を意味する。同一のクラス又は
異るクラスの抗体、及びモノクローナル抗体の抗原結合
断片〔例えｄｌＦｍｂ 、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖ ）ｆ包
含することが意図される。
抗体についてこの明細書において用いる「対する」なる
語は、言及された抗体が言及された抗原を認識し、そし
てそれに特異的に結合する（非共有結合物抗原−抗体反
応）ことを意味する。
語は、言及された抗体が言及された抗原を認識し、そし
てそれに特異的に結合する（非共有結合物抗原−抗体反
応）ことを意味する。
抗体の投与に関してこの明細書において使用する「処理
」なる語は又社これと関連する語は、療法及び／又は予
防を意味する。
」なる語は又社これと関連する語は、療法及び／又は予
防を意味する。
ＥＢＶで形質転換された親規なヒトーリンフ寸プラスト
イドＢ細胞系はＷＩ−Ｌ２系の亜変種（５ｕｂｖａｒｌ
ａｎｔ ）である。これは、マイコプラスマで汚染され
た一般的Ｗｌ−Ｌ２親系をソフトアガー中でクローニン
グし、親糸の汚染を除去し、そしてこれを、２０μ？／
−の６−チオグアニン（６−ＴＧ ）を含有するイスコ
ペ（Ｉａｅｏｖｅ ）の培地中で培養することによシ前
記親系から誘導された。ＬＴＲ２２８は、正常なりリン
パ球と効率的に融合して安定なヒト×ヒトハイプリドー
マを生成するこの能力を基礎にして、６−ＴＧ耐性クロ
ーンの中から選択された。
イドＢ細胞系はＷＩ−Ｌ２系の亜変種（５ｕｂｖａｒｌ
ａｎｔ ）である。これは、マイコプラスマで汚染され
た一般的Ｗｌ−Ｌ２親系をソフトアガー中でクローニン
グし、親糸の汚染を除去し、そしてこれを、２０μ？／
−の６−チオグアニン（６−ＴＧ ）を含有するイスコ
ペ（Ｉａｅｏｖｅ ）の培地中で培養することによシ前
記親系から誘導された。ＬＴＲ２２８は、正常なりリン
パ球と効率的に融合して安定なヒト×ヒトハイプリドー
マを生成するこの能力を基礎にして、６−ＴＧ耐性クロ
ーンの中から選択された。
ミクロタイタープレートウェル当り１０ 細胞でプレー
トされたＬＴＲ２２８の融合生成物はウェル当り１個以
上のコロニーを一貫して示す。
トされたＬＴＲ２２８の融合生成物はウェル当り１個以
上のコロニーを一貫して示す。
ＬＴＲ２２８はハイノＲ−ディグロイド様染色体数４８
を有する。Ｔ、ＴＲ２２８細胞は次のことによって特徴
伺けられる。すなわち、染色体Ｊ３及び２０のエクスト
ラコピー；染色体１４及び２１の間のロバートソン転位
（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｌａｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｌｏ
ｎ ） ：均一に染色する領域から成る拡大されたショ
ートアームを有する染色体８のコピー；及び染色体１１
の末端からの転位を有するマーカー２】を有する。ＬＴ
Ｒ２２Ｂの核型は、４８、ＸＹ、４−１３．、＋２０．
−１４．＋ｔ（１４ｑ ： ２１ ｑ ） ＋ ２１
＋ ＋ ｄ、ｅｒ （２１） ｐｔ（１１：２１）（ｑ
ｌ、３；ｐＨ）、８ｐｔ＋である。ＬＴＲ２２８は少量
のＩｇＭにを分泌し、そして約１６時間の倍化時間を有
する。その高い増殖速度、並びにソフトアガー中での及
び限界稀釈法による高いクローニング効率がこの細胞系
の重要な特徴である。
を有する。Ｔ、ＴＲ２２８細胞は次のことによって特徴
伺けられる。すなわち、染色体Ｊ３及び２０のエクスト
ラコピー；染色体１４及び２１の間のロバートソン転位
（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎｌａｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｌｏ
ｎ ） ：均一に染色する領域から成る拡大されたショ
ートアームを有する染色体８のコピー；及び染色体１１
の末端からの転位を有するマーカー２】を有する。ＬＴ
Ｒ２２Ｂの核型は、４８、ＸＹ、４−１３．、＋２０．
−１４．＋ｔ（１４ｑ ： ２１ ｑ ） ＋ ２１
＋ ＋ ｄ、ｅｒ （２１） ｐｔ（１１：２１）（ｑ
ｌ、３；ｐＨ）、８ｐｔ＋である。ＬＴＲ２２８は少量
のＩｇＭにを分泌し、そして約１６時間の倍化時間を有
する。その高い増殖速度、並びにソフトアガー中での及
び限界稀釈法による高いクローニング効率がこの細胞系
の重要な特徴である。
ＬＴＲ２２８は、他の種々のヒト細胞との融合における
親腫瘍／り一トナーとして使用することができる。モノ
クローナル抗体産生バイブリドを作るために、ＬＴＲ２
２８はＩｇ産生ヒト細胞、例えば末梢血リンツク球（Ｐ
ＢＬ ） 、肺臓細胞、リンパ腺細胞、骨髄細胞、及び
滑液組織、細胞に融合するであろう。ＰＢＬがその入手
可能性のために好ましい。
親腫瘍／り一トナーとして使用することができる。モノ
クローナル抗体産生バイブリドを作るために、ＬＴＲ２
２８はＩｇ産生ヒト細胞、例えば末梢血リンツク球（Ｐ
ＢＬ ） 、肺臓細胞、リンパ腺細胞、骨髄細胞、及び
滑液組織、細胞に融合するであろう。ＰＢＬがその入手
可能性のために好ましい。
ＬＴＲ２２８と融合するＩｇ産生細胞は、標的抗原に暴
露することによシ該抗原に対する抗体を産生ずるように
刺激又は感作されている。標的抗原は外来性抗原であっ
ても自己抗原（例えば、自己免疫反応を惹起する内因性
物質）であってもよい。
露することによシ該抗原に対する抗体を産生ずるように
刺激又は感作されている。標的抗原は外来性抗原であっ
ても自己抗原（例えば、自己免疫反応を惹起する内因性
物質）であってもよい。
感作されたリンパ球は、標的抗原に自然に感染した、又
は標的抗原によ）免疫された患者から、あるいは自己抗
原の場合には自己免疫状態にかかった患者から得ること
ができる。枦的抗原によるインービボ接種を用いる場合
、典型的には宿主に抗原を接種し、そしてその後１回又
は複数回の追加免疫接種ヲ行う。通常、最後の追加免疫
の２〜３週間後に宿主から細胞を集める。
は標的抗原によ）免疫された患者から、あるいは自己抗
原の場合には自己免疫状態にかかった患者から得ること
ができる。枦的抗原によるインービボ接種を用いる場合
、典型的には宿主に抗原を接種し、そしてその後１回又
は複数回の追加免疫接種ヲ行う。通常、最後の追加免疫
の２〜３週間後に宿主から細胞を集める。
上記の方法に代えて、宿主から細胞又は組織をイｎ１必
要であれば生存細胞の椋品を調！ＲＪし、そして適切な
ａ１度で標的抗原を・含有する栄養培地中で前記の細胞
を培養することによシ、細胞をイン−ビトロ感作するこ
とができる。ＰＢＬが使用される場合、培地はさらにマ
クロファージを含有するであろう。典型的には、抗原含
有培地中で細胞を約２〜４日間インキュベートする。
要であれば生存細胞の椋品を調！ＲＪし、そして適切な
ａ１度で標的抗原を・含有する栄養培地中で前記の細胞
を培養することによシ、細胞をイン−ビトロ感作するこ
とができる。ＰＢＬが使用される場合、培地はさらにマ
クロファージを含有するであろう。典型的には、抗原含
有培地中で細胞を約２〜４日間インキュベートする。
融合方法は、融合促進剤を含有する媒体中、生存バイブ
リドの形成を促進する条件下で親細胞を接触せしめるこ
とを含む。融合媒体は典型的には平衡塩溶液から成シ、
例えば３０％〜５０チの範囲の濃度においてポリエチレ
ングリコール（分子量１０００−・４０００ダルトン）
を含有するバンクの平衡塩溶液から成る。この媒体は打
首しくは妊 Ｃａ を含有せず、そして約７．５〜７９の声を有する
。との媒体は場合によっては効果的°なハイブリダイゼ
ーションを促進する添加剤、例えばジメチルスルホキシ
ド全含有することができる。融合は、伝統的な「チーー
プ融合法」によって、又はグレート法によって行うこと
ができ、このグレート法におりては、親細胞がピーナツ
アグルチニンのごとき非窃性結合剤によってプレートに
付着される。
リドの形成を促進する条件下で親細胞を接触せしめるこ
とを含む。融合媒体は典型的には平衡塩溶液から成シ、
例えば３０％〜５０チの範囲の濃度においてポリエチレ
ングリコール（分子量１０００−・４０００ダルトン）
を含有するバンクの平衡塩溶液から成る。この媒体は打
首しくは妊 Ｃａ を含有せず、そして約７．５〜７９の声を有する
。との媒体は場合によっては効果的°なハイブリダイゼ
ーションを促進する添加剤、例えばジメチルスルホキシ
ド全含有することができる。融合は、伝統的な「チーー
プ融合法」によって、又はグレート法によって行うこと
ができ、このグレート法におりては、親細胞がピーナツ
アグルチニンのごとき非窃性結合剤によってプレートに
付着される。
ＬＴＲ２２８細胞と融合パートナ−との比率は通常１０
：１〜１：１０の範囲、さらに一般には約２：１〜１：
２の範囲である。１：１の細胞比が好ましい。典型的に
は、親細胞は約３０秒間〜２分間融合媒体と接触した状
態に保持される。次に、平衡溶液の近状的又は連続的添
加によシ融合混合物を稀釈し、そして次に平衡溶液によ
り洗浄する。
：１〜１：１０の範囲、さらに一般には約２：１〜１：
２の範囲である。１：１の細胞比が好ましい。典型的に
は、親細胞は約３０秒間〜２分間融合媒体と接触した状
態に保持される。次に、平衡溶液の近状的又は連続的添
加によシ融合混合物を稀釈し、そして次に平衡溶液によ
り洗浄する。
洗浄した後、細胞を適当な増殖培地に拡げ、そして次に
、適当な選択培地、例えば富化されたヒポキサンチン−
アザセリン培地（２０％のウシ胎児血清、１４μｙ−／
−のヒポキサンチン、及び４ ｔｔＶ−のアゾセリンが
補充されたイスコペ培地）を収容するミクロタイターグ
レートに接種する。約１０〜２０日間培養した後、未融
合親細胞は死滅し、バイブリドが残る。バイブリドの上
清液を、常用のイムノアッセイ法、例えばラジオイムノ
アッセイ又はエンザイムイムノアソセイによ）、抗体又
はある場合には他の因子の存在について測定することが
できる。好ましいノ・イブリドを限界稀釈条件下でサブ
クローニングし、そして単クローンを拡り“て目的ノ・
イブリドーマの純粋培養物を得ることができる。
、適当な選択培地、例えば富化されたヒポキサンチン−
アザセリン培地（２０％のウシ胎児血清、１４μｙ−／
−のヒポキサンチン、及び４ ｔｔＶ−のアゾセリンが
補充されたイスコペ培地）を収容するミクロタイターグ
レートに接種する。約１０〜２０日間培養した後、未融
合親細胞は死滅し、バイブリドが残る。バイブリドの上
清液を、常用のイムノアッセイ法、例えばラジオイムノ
アッセイ又はエンザイムイムノアソセイによ）、抗体又
はある場合には他の因子の存在について測定することが
できる。好ましいノ・イブリドを限界稀釈条件下でサブ
クローニングし、そして単クローンを拡り“て目的ノ・
イブリドーマの純粋培養物を得ることができる。
ＬＴＲ２２Ｂと抗体産生融合ツヤ−トナーとのノ・イブ
リドーマは、通常はス硬ント培地１ｍ７！当り１〜５μ
？の高いモノクローナル抗体力価をもたらす。
リドーマは、通常はス硬ント培地１ｍ７！当り１〜５μ
？の高いモノクローナル抗体力価をもたらす。
抗体は、公知の技法、例えば硫酸アンモニウム沈澱、ジ
エチルアミノエチル（ＤＥＡＥ ）セルロースクロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気
泳動、ミクロフィルトレージ［へ及び超遠心分離によシ
培地から回収される。この方法に代えて、）・イブリド
ーマを適切な哺乳動物宿主、例えばヌードマウスに移植
することによジイン−ビトロ増殖せしめることかで”き
る。十分な接種期間の後、接種された宿主の体液、例え
ば腹水、及び匍清からモノクローナル抗体を回収するこ
とができる。
エチルアミノエチル（ＤＥＡＥ ）セルロースクロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気
泳動、ミクロフィルトレージ［へ及び超遠心分離によシ
培地から回収される。この方法に代えて、）・イブリド
ーマを適切な哺乳動物宿主、例えばヌードマウスに移植
することによジイン−ビトロ増殖せしめることかで”き
る。十分な接種期間の後、接種された宿主の体液、例え
ば腹水、及び匍清からモノクローナル抗体を回収するこ
とができる。
ＬＴＲ２−２８は、これをウアバインに対して耐性にす
ることによりネズミ細胞との融合のために適するように
することができる。ウアバイン耐性は、増加する濃度の
ウアバインを含有する培地中でＬＴｌ ２２８を培養す
ることにより達成することができる。ＬＴＲ２２８のウ
アバイン耐性子孫は、正常なヒト細胞又は不滅化（ＥＢ
Ｖで形質転換された）ヒト細胞又はネズミ細、胞と、上
記の融合法を用いて融合せしめることができる。言うま
でもなく、バイブリド選択培地にはウアバインが補充さ
れる。
ることによりネズミ細胞との融合のために適するように
することができる。ウアバイン耐性は、増加する濃度の
ウアバインを含有する培地中でＬＴｌ ２２８を培養す
ることにより達成することができる。ＬＴＲ２２８のウ
アバイン耐性子孫は、正常なヒト細胞又は不滅化（ＥＢ
Ｖで形質転換された）ヒト細胞又はネズミ細、胞と、上
記の融合法を用いて融合せしめることができる。言うま
でもなく、バイブリド選択培地にはウアバインが補充さ
れる。
次の例において、ＬＴＲ２２８と種々のヒト細胞集団と
の融合を記載する。これらの例によりこの発明の範囲を
なんら限定するものではない。
の融合を記載する。これらの例によりこの発明の範囲を
なんら限定するものではない。
白血球を、フィコール−ハイバーク密度勾配上でヒト末
梢血又は肺細胞懸濁液から単離し、そしてバンク平衡塩
溶液（ＨＢＳＳ ）中で２回洗浄した。
梢血又は肺細胞懸濁液から単離し、そしてバンク平衡塩
溶液（ＨＢＳＳ ）中で２回洗浄した。
次にＴ細胞をＡＥＴ −５ＲＢＣｏゼット法（Ｍａｄｓ
ｅｎＭ。
ｅｎＭ。
及びＪｏｈｎｓｏｎ Ｈ，Ｅ、＋ジャーナル・オブ・イ
ムノロジカル’メソズ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ）（１９７９）２７：６１）によシ取シ出し、
照射しく１５００ラド）、そして１：１の比率で残シの
リン・や球と再び一緒にした。混合された細胞を、１０
６／ｍｌの濃度において、イスコペの完全培地（ＩＣＭ
）、１５Ｌｌｂウシ胎児血清（Ｆｅ２ ） 、 １ ：
１００ポークウイードマイトゼン（ＰＷＭ 、ギブコ）
中で培養し、そして回収ｉ〜て３日後に融合に用いた。
ムノロジカル’メソズ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎ、 Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ）（１９７９）２７：６１）によシ取シ出し、
照射しく１５００ラド）、そして１：１の比率で残シの
リン・や球と再び一緒にした。混合された細胞を、１０
６／ｍｌの濃度において、イスコペの完全培地（ＩＣＭ
）、１５Ｌｌｂウシ胎児血清（Ｆｅ２ ） 、 １ ：
１００ポークウイードマイトゼン（ＰＷＭ 、ギブコ）
中で培養し、そして回収ｉ〜て３日後に融合に用いた。
融合方法
融合混合物は、４０ ｗ／ｖ％のＩリエテレングリコー
ル（Ｐ′Ｆ、Ｇ ） ４０００ 、及び５μｍ／艷のポ
リーＬ−アルギニン（シグマ、７０に一１５０Ｋ）が補
充されたＨＢＳＣ−／ ＋ （Ｃａ丑不含、 ２ ｍＭ
７４ｇＳＯ４）中１０係ツメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）を含有する。４０ＪのＰＥＧ ４０００を１０−
のＤＭＳＯ及び５０−のＨＢＳＳ−／十と混合した。こ
の混合物を２５分間オートクレーブ処理した。溶液が室
温に冷却された時、フィルターで無菌化された１０００
倍ストック溶液のポリーＬ−アルギニンを加えて最終濃
度５μｉ／ｄとした。使用前、無菌の０．ｌＮＮａＯＨ
を加えて融合混合物のＰ）１を７．９に調整した。
ル（Ｐ′Ｆ、Ｇ ） ４０００ 、及び５μｍ／艷のポ
リーＬ−アルギニン（シグマ、７０に一１５０Ｋ）が補
充されたＨＢＳＣ−／ ＋ （Ｃａ丑不含、 ２ ｍＭ
７４ｇＳＯ４）中１０係ツメチルスルホキシド（ＤＭ
ＳＯ）を含有する。４０ＪのＰＥＧ ４０００を１０−
のＤＭＳＯ及び５０−のＨＢＳＳ−／十と混合した。こ
の混合物を２５分間オートクレーブ処理した。溶液が室
温に冷却された時、フィルターで無菌化された１０００
倍ストック溶液のポリーＬ−アルギニンを加えて最終濃
度５μｉ／ｄとした。使用前、無菌の０．ｌＮＮａＯＨ
を加えて融合混合物のＰ）１を７．９に調整した。
２〜３週間毎に新たな融合混合物を調製した。
グレート（コスタール３５０６．６ウエルクラスター、
ウェルの直径３５ＲＩＩ＋）を次のようにして用意した
。すなわち、２−のＨＢＳＳ−／十及び５０μｊのピー
ナツアグルチニン（ＰＮＡ 、シグマ）（１００μｌｉ
’／ｄ ） ’ｅ各タウエル加えた。使用する前に、グ
レートを少なくとも１時間３７℃にてインキユベートし
た。ＰＮＡストック全凍結貯蔵し、そして新しく解凍し
たアリコーｉ用いて融合セルを被覆した。細胞数が限ら
れている場合には一層小さいウェルを使用した。
ウェルの直径３５ＲＩＩ＋）を次のようにして用意した
。すなわち、２−のＨＢＳＳ−／十及び５０μｊのピー
ナツアグルチニン（ＰＮＡ 、シグマ）（１００μｌｉ
’／ｄ ） ’ｅ各タウエル加えた。使用する前に、グ
レートを少なくとも１時間３７℃にてインキユベートし
た。ＰＮＡストック全凍結貯蔵し、そして新しく解凍し
たアリコーｉ用いて融合セルを被覆した。細胞数が限ら
れている場合には一層小さいウェルを使用した。
細胞集団を）（ＢＳＳ−／土中で室温にて２回洗浄し、
そして次に懸濁し、そして３７℃に加温されたＨＢＳＳ
−／土中で御粘にした。２πｌの懸濁液（１千万〜２千
万細胞）を、ＰＮＡ被覆溶液を収容する各予備処理され
たウェルに加えた。グレートを、４００〜５００ ｘｇ
％室温にて６分間回転させて細胞の単層を形成した。
そして次に懸濁し、そして３７℃に加温されたＨＢＳＳ
−／土中で御粘にした。２πｌの懸濁液（１千万〜２千
万細胞）を、ＰＮＡ被覆溶液を収容する各予備処理され
たウェルに加えた。グレートを、４００〜５００ ｘｇ
％室温にて６分間回転させて細胞の単層を形成した。
次に、上清をプレートから吸引除去した。
３７℃に加温された融合混合物２ｔｎｌ全融合セルの側
面に注意深く加えた。１分間後、ＰＥＧを、ＨＢＳＣ−
／−１−（フィルター無菌化）中５％ＤＭＳＯ（３７℃
）によシ、２ｍｅ１分（１５秒ごとに０５ｍ１ ）の速
度で３分間（６ｍＡ ）にわたって稀釈した。
面に注意深く加えた。１分間後、ＰＥＧを、ＨＢＳＣ−
／−１−（フィルター無菌化）中５％ＤＭＳＯ（３７℃
）によシ、２ｍｅ１分（１５秒ごとに０５ｍ１ ）の速
度で３分間（６ｍＡ ）にわたって稀釈した。
次に、融合稀釈混合物（ＦＤＭ ）を４ゴ／分の速度で
ウェルが満たされるまで加えた。ＦＤＭは常にウェルの
側面に加え、単層が攪乱されないようにし、そして最適
混合を保証するためにプレートを一定速度で渦動した。
ウェルが満たされるまで加えた。ＦＤＭは常にウェルの
側面に加え、単層が攪乱されないようにし、そして最適
混合を保証するためにプレートを一定速度で渦動した。
この段凹“でウェルを吸引した。ＰＥＧ混合物の残留フ
ィルムを温ＦＤＭによす２−７分の速度で２分間稀釈し
た。再び、プレートを一定速度で渦動した。１５秒間に
わたって、５ ｒｙｅのＩ（ＢＳＳ −／＋（３７℃）
全融合ウェルに加え、そしてすべての上清を単層から吸
引除去した。最後に、各融合ウェルを５〜１０−の温Ｈ
ＢＳＳ ＋／−で２回洗浄した。各ウェルに５−の温Ｉ
ＣＭ”、１５％ＦＣ８を加え、そしてグレートを３７℃
にて１８時間インキエペートした。次に細胞をピ硬ット
操作によシラニルから取シ出し、ピイットから出し、そ
して選択培地に再懸濁した。
ィルムを温ＦＤＭによす２−７分の速度で２分間稀釈し
た。再び、プレートを一定速度で渦動した。１５秒間に
わたって、５ ｒｙｅのＩ（ＢＳＳ −／＋（３７℃）
全融合ウェルに加え、そしてすべての上清を単層から吸
引除去した。最後に、各融合ウェルを５〜１０−の温Ｈ
ＢＳＳ ＋／−で２回洗浄した。各ウェルに５−の温Ｉ
ＣＭ”、１５％ＦＣ８を加え、そしてグレートを３７℃
にて１８時間インキエペートした。次に細胞をピ硬ット
操作によシラニルから取シ出し、ピイットから出し、そ
して選択培地に再懸濁した。
融合後の細胞を、９６ウエル平底ミクロタイタープレー
ト（コスタ−）に１〜３ｘｌＯ／ウエルの密度で分配し
た。ノ・イブリドの選択のために富化されたヒポキサン
チン−アザセリン培地（ＥＴ（Ａ）〔２０チのＦｅ２
ｔ １４ ｔｉｔ／ｍｔのヒボキサンチン（シグマ）及
び４μＰ／ｆｎｌのアザセリン（シグマ）を補充したイ
スコペ培地〕を使用した。細胞の「バイブリドｊ性は、
セルソーターから得られたＤＮＡヒストグラムを介して
確認された。ノ・イブリドコロニーは一般に融合後１０
〜２０日で出現する。
ト（コスタ−）に１〜３ｘｌＯ／ウエルの密度で分配し
た。ノ・イブリドの選択のために富化されたヒポキサン
チン−アザセリン培地（ＥＴ（Ａ）〔２０チのＦｅ２
ｔ １４ ｔｉｔ／ｍｔのヒボキサンチン（シグマ）及
び４μＰ／ｆｎｌのアザセリン（シグマ）を補充したイ
スコペ培地〕を使用した。細胞の「バイブリドｊ性は、
セルソーターから得られたＤＮＡヒストグラムを介して
確認された。ノ・イブリドコロニーは一般に融合後１０
〜２０日で出現する。
生存性染色
ハイグリドの形成を２種類のＤＮＡ特異的螢光色素によ
シ監視した。ヘシュト（Ｈｏｅｓｃｈｔ ）３３２５８
（カルビオケム）ぽ生細胞及び死細胞の両者の核を染色
するが、グロビジウムイオジド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ
１ｏｄｉｄｅ ） （カルビオケム）は変化した形質膜
を有する細胞の核のみを染色する。
シ監視した。ヘシュト（Ｈｏｅｓｃｈｔ ）３３２５８
（カルビオケム）ぽ生細胞及び死細胞の両者の核を染色
するが、グロビジウムイオジド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ
１ｏｄｉｄｅ ） （カルビオケム）は変化した形質膜
を有する細胞の核のみを染色する。
結果として「生」細胞は青の螢光を発し、そして「死」
細胞は赤の螢光を発する。従って、融合の数時間以内に
１個よシ多くの核を有する生細胞を計数することによシ
可能性ある生存ノ・イブリドのおよその算定を行うこと
ができる。混合されたが融合しなかった細胞の同一集団
が対照として機能するり 融合処即後の細胞サングルをＥＣＭ 、 １５チＦＣ８
中に懸濁し、そして５０μｌｉ’／ｍｌのへシート３３
２５８及び２０μＰ／ｍｅのグロピジウムイオジドによ
シ３０分間分間上た。次に、サンプルをスライド上で細
胞分離（ｃｙｔｏｆｕｇｅ ） Ｌ、そして螢光顕微鏡
の下で可視化した。次の表にこれらの試験の結果を示す
。
細胞は赤の螢光を発する。従って、融合の数時間以内に
１個よシ多くの核を有する生細胞を計数することによシ
可能性ある生存ノ・イブリドのおよその算定を行うこと
ができる。混合されたが融合しなかった細胞の同一集団
が対照として機能するり 融合処即後の細胞サングルをＥＣＭ 、 １５チＦＣ８
中に懸濁し、そして５０μｌｉ’／ｍｌのへシート３３
２５８及び２０μＰ／ｍｅのグロピジウムイオジドによ
シ３０分間分間上た。次に、サンプルをスライド上で細
胞分離（ｃｙｔｏｆｕｇｅ ） Ｌ、そして螢光顕微鏡
の下で可視化した。次の表にこれらの試験の結果を示す
。
１ν下余白
例２．モノクローナル抗−破傷風抗体産生ハイブ患者Ｊ
Ｂを破傷風トキソイド（ＴＴ）（ワイス・ラプス）の筋
肉内投与によシ免疫した。免疫処理の９日後に８０献の
末梢血を採取し、そ゛して融合のためにＢ細胞を調製し
、ＬＴＲ２２８と融合せしめ、そして例１と同様にして
融合混合物からバイブリドを選択した。
Ｂを破傷風トキソイド（ＴＴ）（ワイス・ラプス）の筋
肉内投与によシ免疫した。免疫処理の９日後に８０献の
末梢血を採取し、そ゛して融合のためにＢ細胞を調製し
、ＬＴＲ２２８と融合せしめ、そして例１と同様にして
融合混合物からバイブリドを選択した。
培養物からの上清を、抗−ＴＴ抗体及び全免疫グロブリ
ンについて、エンザイムリンクドイムノソルペントアッ
セイ（ｒｔ、ｌ５Ａ） ＣエングパルＥ、及びノぐ−ル
マンＰ、Ｇイムノケミストリー（ＧＩｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｌｓｃｔｒｙ ） （１９７１）８ ：８７１ ）に
よυ、次のようにして試験した。
ンについて、エンザイムリンクドイムノソルペントアッ
セイ（ｒｔ、ｌ５Ａ） ＣエングパルＥ、及びノぐ−ル
マンＰ、Ｇイムノケミストリー（ＧＩｍｍｕｎｏｃｈｅ
ｍｌｓｃｔｒｙ ） （１９７１）８ ：８７１ ）に
よυ、次のようにして試験した。
破傷風ＥＬＩＳＡ
ミクロタイターウェル（コスタ−）を、炭酸ナトリウム
緩衝液（５０ｒｒＭ 、 ｐＨ９，５）中１０μｆｉｌ
／ｍｌの濃度で、４℃にて一夜、精製ＴＴ（マサチュー
セノツ・ステート・ラプス）で被覆した。ウェルな、Ｐ
ＢＳ中１％ＢＳＡ及び０．１チゼラチンで、３７℃にて
２時間ブロックした。培養上清液及び抗破傷風含有ヒト
血清標準をＰＢＳ中に稀釈し、そして３７℃にて１時間
インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして
・や−オキシダーゼ接合ヤギ抗ヒトに、λ、μ、又はγ
、鎖特異的抗体ＣＰＢＳ−ＢＳＡ／ゼラチン中に１ ：
１０００稀釈）（ＤＡＫＯラプス、アキュレートケミカ
ルス、ウエストプルグ、ニューヨーク）により発色させ
た。
緩衝液（５０ｒｒＭ 、 ｐＨ９，５）中１０μｆｉｌ
／ｍｌの濃度で、４℃にて一夜、精製ＴＴ（マサチュー
セノツ・ステート・ラプス）で被覆した。ウェルな、Ｐ
ＢＳ中１％ＢＳＡ及び０．１チゼラチンで、３７℃にて
２時間ブロックした。培養上清液及び抗破傷風含有ヒト
血清標準をＰＢＳ中に稀釈し、そして３７℃にて１時間
インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして
・や−オキシダーゼ接合ヤギ抗ヒトに、λ、μ、又はγ
、鎖特異的抗体ＣＰＢＳ−ＢＳＡ／ゼラチン中に１ ：
１０００稀釈）（ＤＡＫＯラプス、アキュレートケミカ
ルス、ウエストプルグ、ニューヨーク）により発色させ
た。
最終洗浄の後、ステップ基質ＡＢＴＳ ［： ２ 、２
’−アジノージ（３−エチルにンズチアゾリンスルホン
酸）〕を加え、そしてタイターチックＥＬＩＳＡプレー
トリーダー（フロウラブス、ペセスダ、ＭＤ）中で０Ｄ
４１５を読み取った。
’−アジノージ（３−エチルにンズチアゾリンスルホン
酸）〕を加え、そしてタイターチックＥＬＩＳＡプレー
トリーダー（フロウラブス、ペセスダ、ＭＤ）中で０Ｄ
４１５を読み取った。
グロブリンＥＬＩＳＡ
培養土清液の免疫グロブリンレベルを特異的阻害ＥＬＩ
ＳＡ Ｋより測定した。ウェルを、４℃にて一夜、精製
ヒト免疫グロブリン（１０μ、！ｉｌ／ｍｌ 、 ｐＨ
９，５，炭酸塩緩衝液）で被覆した。ウェルを前記のよ
うにしてブロックした。上清液又は標準液とアフィニテ
ィー精製されたノ４−オキシダーゼラベル抗−に、λ、
μ、又はｒとを混合し、そしてウェルに加えた。プレー
トを洗浄し、そして破傷風ＥＬＩＳＡと同一の方法によ
って発色させた。
ＳＡ Ｋより測定した。ウェルを、４℃にて一夜、精製
ヒト免疫グロブリン（１０μ、！ｉｌ／ｍｌ 、 ｐＨ
９，５，炭酸塩緩衝液）で被覆した。ウェルを前記のよ
うにしてブロックした。上清液又は標準液とアフィニテ
ィー精製されたノ４−オキシダーゼラベル抗−に、λ、
μ、又はｒとを混合し、そしてウェルに加えた。プレー
トを洗浄し、そして破傷風ＥＬＩＳＡと同一の方法によ
って発色させた。
一般的生化学的方法
内部ラベルのため、２０ Ｘ １０ 個の細胞を、ｌ−
の透析されたＦｃＳ及び３５＆−メチオニン（０，８ｄ
１）にューイングランドニュークレア）を補充したメチ
オニン不含培地４ｄ中で１夜インキユベートした。培養
上清液を、スタフィロコッカスＡ含有細菌に付加された
鎖特異的うビット抗−ヒト抗体（ＤＡＫＯ）によシ免疫
沈澱せしめた。免疫沈澱ラドデシル硫酸ナトリウム（８
ＤＳ）中５〜１５チポリアクリルアミドグラノエントグ
ル上で電気泳動した。ダルを、螢光シグナル強化俗液に
１時間浸漬することによりフルオログラフィーのために
ＦＡ製したクマーシブルー〔この実験においてはＥｎ’
ａｎｃｅ−にューイングランドニュークレカ中で染色し
、そして乾燥した。フルオログラフィーのために、フル
オログラフィーに適するフィルム（この実験においては
デュポンクロネツクス）を使用した。
の透析されたＦｃＳ及び３５＆−メチオニン（０，８ｄ
１）にューイングランドニュークレア）を補充したメチ
オニン不含培地４ｄ中で１夜インキユベートした。培養
上清液を、スタフィロコッカスＡ含有細菌に付加された
鎖特異的うビット抗−ヒト抗体（ＤＡＫＯ）によシ免疫
沈澱せしめた。免疫沈澱ラドデシル硫酸ナトリウム（８
ＤＳ）中５〜１５チポリアクリルアミドグラノエントグ
ル上で電気泳動した。ダルを、螢光シグナル強化俗液に
１時間浸漬することによりフルオログラフィーのために
ＦＡ製したクマーシブルー〔この実験においてはＥｎ’
ａｎｃｅ−にューイングランドニュークレカ中で染色し
、そして乾燥した。フルオログラフィーのために、フル
オログラフィーに適するフィルム（この実験においては
デュポンクロネツクス）を使用した。
モノクローナル抗破傷風抗体をスタフ（Ｓｔａｐｈ）−
プロティンＡ−セファロースアフィニティークロマトグ
ラフィー（ファルマシアファインケミカルス、アゲサラ
、スウェーデン）によシ精製した。
プロティンＡ−セファロースアフィニティークロマトグ
ラフィー（ファルマシアファインケミカルス、アゲサラ
、スウェーデン）によシ精製した。
１００ｍＦｖｌ酢酸緩衝化１５０ ｍＭ ＮａＣ１ｐＨ
２，３により抗体を溶出した。
２，３により抗体を溶出した。
すべてのウェルが、ｉ、３ｘｔｏ５細胞当り少なくとも
１細胞のハイブリダイゼーション頻度で、増殖するハイ
プリドーマを生成した。ウェルの半分近くが１．ｇＧク
ラス及び／又はＩｇＭクラスの免疫グロブリンを生成し
た。５個のウェルが、破傷風ＫＬＩＳＡによシ強く陽性
であった。これらのウェルを、限界稀釈により、及びソ
フトアガー中でクローン化した。さらに深く特徴付ける
ためＥｌと称する１つのクローンを選択した。この細胞
系について、限界稀釈によシ、ＩＰＩＣ８Ｖセルソータ
ー（コールターインストルメンツ）を用いるフローサイ
トメトリーによシ、及びソ・アトアガー中で、２回目の
クローン化を行った。Ｅｌは２５〜２８時間毎に倍化し
、そしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、） （７００Ｉ
ｌｌ／ｒｒｔｌ ）、トランスフェニン（１０μｇ／ｍ
ＩＶ）及びインシュリン（０，２ユニツト／ｄ）を補充
した血清不含培地中での増殖に容易に適応することがで
きる。これらの条件下で、培養がコンフルエンスに達す
るために必要な時間は、１５％ＦＣ８を含有するイスコ
ベ゛のＤＭＥＭ中でのそれより３０％長い。Ｅ１クロー
ンは安定な４倍体ＤＮＡ含量、及び長時間にわたってそ
して有意な拡大にもかかわらず抗体の分泌を維持する能
力を示した。
１細胞のハイブリダイゼーション頻度で、増殖するハイ
プリドーマを生成した。ウェルの半分近くが１．ｇＧク
ラス及び／又はＩｇＭクラスの免疫グロブリンを生成し
た。５個のウェルが、破傷風ＫＬＩＳＡによシ強く陽性
であった。これらのウェルを、限界稀釈により、及びソ
フトアガー中でクローン化した。さらに深く特徴付ける
ためＥｌと称する１つのクローンを選択した。この細胞
系について、限界稀釈によシ、ＩＰＩＣ８Ｖセルソータ
ー（コールターインストルメンツ）を用いるフローサイ
トメトリーによシ、及びソ・アトアガー中で、２回目の
クローン化を行った。Ｅｌは２５〜２８時間毎に倍化し
、そしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、） （７００Ｉ
ｌｌ／ｒｒｔｌ ）、トランスフェニン（１０μｇ／ｍ
ＩＶ）及びインシュリン（０，２ユニツト／ｄ）を補充
した血清不含培地中での増殖に容易に適応することがで
きる。これらの条件下で、培養がコンフルエンスに達す
るために必要な時間は、１５％ＦＣ８を含有するイスコ
ベ゛のＤＭＥＭ中でのそれより３０％長い。Ｅ１クロー
ンは安定な４倍体ＤＮＡ含量、及び長時間にわたってそ
して有意な拡大にもかかわらず抗体の分泌を維持する能
力を示した。
選択されたＥ１クローンはスペント培地Ｍ当り１０μｇ
までの抗体を産生ずることができる。
までの抗体を産生ずることができる。
Ｅｌにより分泌された抗体は破傷風毒素に対して特異的
なＩｇＧ 、にである。この細胞系及びこれによって産
生される抗体を５Ａ１３と称する。
なＩｇＧ 、にである。この細胞系及びこれによって産
生される抗体を５Ａ１３と称する。
５Ａ１３はヌードマウス中での増殖に適応した。
１０７個の細胞を皮下接種することにより３〜４週間以
内に腫瘍が生じた。マウスから取り出し、そして次にイ
ン−ビトロ培養した後、このクローンは高力価のヒトモ
ノクローナル抗体を含有する腹水を生成することができ
た。適応した細胞（２×１０７個）をヌードマウスに注
射した場合、０．５ｍ９７ｍ１の特異抗体を含有する腹
水が２週間以内に生成した。
内に腫瘍が生じた。マウスから取り出し、そして次にイ
ン−ビトロ培養した後、このクローンは高力価のヒトモ
ノクローナル抗体を含有する腹水を生成することができ
た。適応した細胞（２×１０７個）をヌードマウスに注
射した場合、０．５ｍ９７ｍ１の特異抗体を含有する腹
水が２週間以内に生成した。
異系交配スイスーヌエプスターマウス（２０１に、５Ａ
１３ハイブリドーマ又はＬＴＲ２２８によって条件調節
された血清不含媒体と混合された種々の量の破傷風毒素
を腹腔内注射Ｃ０，５ｍ１）した。
１３ハイブリドーマ又はＬＴＲ２２８によって条件調節
された血清不含媒体と混合された種々の量の破傷風毒素
を腹腔内注射Ｃ０，５ｍ１）した。
毒素の投与量はＬＤ５ｏの１〜１０００倍とした。下記
の表中の結果は、モノクローナル抗体が破傷風毒素の致
死的効果に対してインービゲで採機的であることを示し
ている。
の表中の結果は、モノクローナル抗体が破傷風毒素の致
死的効果に対してインービゲで採機的であることを示し
ている。
１ ３／３ ３／３
１ １／２ ３／３
１０ ０／３ ３／３
１００ ．０／３ ３／３
１０００ ０／３ ２／３ 。
（１）上記の結果は生存マウス数（４日目）／注射され
た全マウス数を示す。
た全マウス数を示す。
（２） ＊１ユ＝ｙト＝ＬＤ５ｏ０
（３）０．５ｗＬｌのスペント培地を破傷風毒素と混合
し、そして腹腔内注射した。
し、そして腹腔内注射した。
上記の試験は、モノクローナル抗体がヒトを含む唾乳動
物の処理のために効果的であることを示している。従っ
て、この抗体又はその機能的同等物は、破傷風に罹患し
た個体又は破傷風に感染する危険がある個体を受動免疫
するために使用することができる。このような処理にお
いて、抗体は一般に非経腸的（例えば、静脈内、動脈内
、筋肉内、腹腔内）に、好ましくは筋肉内に投与される
であろう。投与量及び投与方法は、抗体が治療のために
投与されるか予防のために投与されるか、患者、及び患
者の来歴に依存するであろう。成人の場合、２５０〜５
００ユニツトの抗体の筋肉内注射が典型的には２〜４週
間の保護をもたらすであろう（前記ユニットは、破傷風
抗毒素についての第２国際標準０．０３３８４１ｖ中に
含まれる活性である）。治療のためには、３．０００〜
１０．０００ユニツトの範囲の高い投与量が典型的に使
用されるであろう。新生児破傷風の治療的処理のために
は約２００〜５００ユニツトの範囲の低い投与量が使用
されるであろう。これらの投与量はこの発明の抗体の゛
有効”（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ）Ｈｉの例である。
物の処理のために効果的であることを示している。従っ
て、この抗体又はその機能的同等物は、破傷風に罹患し
た個体又は破傷風に感染する危険がある個体を受動免疫
するために使用することができる。このような処理にお
いて、抗体は一般に非経腸的（例えば、静脈内、動脈内
、筋肉内、腹腔内）に、好ましくは筋肉内に投与される
であろう。投与量及び投与方法は、抗体が治療のために
投与されるか予防のために投与されるか、患者、及び患
者の来歴に依存するであろう。成人の場合、２５０〜５
００ユニツトの抗体の筋肉内注射が典型的には２〜４週
間の保護をもたらすであろう（前記ユニットは、破傷風
抗毒素についての第２国際標準０．０３３８４１ｖ中に
含まれる活性である）。治療のためには、３．０００〜
１０．０００ユニツトの範囲の高い投与量が典型的に使
用されるであろう。新生児破傷風の治療的処理のために
は約２００〜５００ユニツトの範囲の低い投与量が使用
されるであろう。これらの投与量はこの発明の抗体の゛
有効”（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ）Ｈｉの例である。
非経腸投与のためには、抗体は、医薬として許容される
非経腸担体と組合わせた単位投与注射剤の形（溶液、懸
濁液、乳懸液）で製剤化されるであろう。このような担
体は本来的に非毒性であシ、そして非療法剤的である。
非経腸担体と組合わせた単位投与注射剤の形（溶液、懸
濁液、乳懸液）で製剤化されるであろう。このような担
体は本来的に非毒性であシ、そして非療法剤的である。
この上うな担体の例としてリンゲル溶液、ブドウ糖溶液
、及び５％ヒト血清アルブミンを挙げることができる。
、及び５％ヒト血清アルブミンを挙げることができる。
非水性担体、例えば不揮発油及びオレイン酸エチルを使
用することもできる。担体としてリポゾームを使用する
ことができる。担体は少量の添加剤、例えば等張性及び
化学的安定性を強化する物質、例えば緩衝液及び防腐剤
を含有することができる。抗体は典型的には、このよう
な担体中に約１ ｒａｇｔ ／ ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度で製剤化されるであろう。
用することもできる。担体としてリポゾームを使用する
ことができる。担体は少量の添加剤、例えば等張性及び
化学的安定性を強化する物質、例えば緩衝液及び防腐剤
を含有することができる。抗体は典型的には、このよう
な担体中に約１ ｒａｇｔ ／ ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ
の濃度で製剤化されるであろう。
例３ 抗−血グループＡ抗体を産生するハイブリドーマ
の調製 ＬＴＲ，２２８細胞を、１０ Ｍウアバインを含有する
ＩＣＭ中で培養することによシウアパイン耐性にした。
の調製 ＬＴＲ，２２８細胞を、１０ Ｍウアバインを含有する
ＩＣＭ中で培養することによシウアパイン耐性にした。
耐性細胞を拡げ、そしてウアバインの濃度を徐々に上げ
た。細胞がＩＦ６Ｍ ウア・ぐインに対して生存できる
ようになるまで上記の方法を反復した。６−ＴＧ（２０
μ９７Ｉｌｌ）及びウア・ぐイン（１０−６Ｍ）を補充
されたソフトアガーからクローンを選択した。
た。細胞がＩＦ６Ｍ ウア・ぐインに対して生存できる
ようになるまで上記の方法を反復した。６−ＴＧ（２０
μ９７Ｉｌｌ）及びウア・ぐイン（１０−６Ｍ）を補充
されたソフトアガーからクローンを選択した。
例１と同様にして、地中海貧血を有する子供の牌細胞の
サンゾルから白血球を単離した。これらの細胞をパパイ
ン及びＡダルーゾ赤血球（ＡＲＢＣ）（Ｐａｐ／ ＡＲ
ＢＣ）で処理することによりロゼツト化した。ロゼノＩ
−細胞をフィコール−ハイ・ぞり・グラジェント遠心に
より分離し、そして１０チマルモセノトＢ−９５８上清
液を用いてＥＢＶ−形質転換した。この形質転換された
細胞を４×１０細胞／ウエルで９６ウエルコヌターグレ
ート上にプレートした。
サンゾルから白血球を単離した。これらの細胞をパパイ
ン及びＡダルーゾ赤血球（ＡＲＢＣ）（Ｐａｐ／ ＡＲ
ＢＣ）で処理することによりロゼツト化した。ロゼノＩ
−細胞をフィコール−ハイ・ぞり・グラジェント遠心に
より分離し、そして１０チマルモセノトＢ−９５８上清
液を用いてＥＢＶ−形質転換した。この形質転換された
細胞を４×１０細胞／ウエルで９６ウエルコヌターグレ
ート上にプレートした。
抗−ＡＩｇを含むウェルをＡＲＢＣ凝集試験にょシ同定
した。２個の陽性クローンを同定したがＥ６と称する１
個のみが生存した。Ｅ６細胞をＰａｐ／ＡＲＢｃ ヲ用
いるロゼツト形成及びグラジェント遠心によシ濃縮（収
率１ｏ％）し、そして次にソ７トアが一中でクローニン
グした。コロニーを拾い上げ、拡げ、そしてＡＲＢＣ凝
集によシ抗−Ａ活性について測定した。Ｅ６Ｃ６と同定
される１つのサブクローンを、ウアバイン耐性ＬＴＲ２
２８との融合のために選択し、そして拡げた。
した。２個の陽性クローンを同定したがＥ６と称する１
個のみが生存した。Ｅ６細胞をＰａｐ／ＡＲＢｃ ヲ用
いるロゼツト形成及びグラジェント遠心によシ濃縮（収
率１ｏ％）し、そして次にソ７トアが一中でクローニン
グした。コロニーを拾い上げ、拡げ、そしてＡＲＢＣ凝
集によシ抗−Ａ活性について測定した。Ｅ６Ｃ６と同定
される１つのサブクローンを、ウアバイン耐性ＬＴＲ２
２８との融合のために選択し、そして拡げた。
例１の方法を用いて、ウアバイン耐性ＬＴＲ２２８とＥ
６Ｃ６とを１＝１の細胞比率で融合せしめた。
６Ｃ６とを１＝１の細胞比率で融合せしめた。
融合の翌日、細胞を、アザセリン（２μｇ／ｍｌ ）及
びウアバイン（１０−６Ｍ）を含有す４１０Ｍ中、１ｏ
５細胞／ウエルでプレートした。増殖するハイブリドー
マは１０日までに見ることができた。２１日０に、増殖
ウェルを血球凝集試験にょシ抗−Ａ活性について試験し
た。陽性細胞を軟寒天中で再クローニングした。
びウアバイン（１０−６Ｍ）を含有す４１０Ｍ中、１ｏ
５細胞／ウエルでプレートした。増殖するハイブリドー
マは１０日までに見ることができた。２１日０に、増殖
ウェルを血球凝集試験にょシ抗−Ａ活性について試験し
た。陽性細胞を軟寒天中で再クローニングした。
Ｌ’Ｉ”Ｒ２２８，並びに例２及び例３のハイブリドー
マの各サンゾルは、アメリカン・タイツ０カルチユア・
コレクション、１２３０１１々−クラウンドライブ、ロ
ックビレ、メリーランドに寄託された。
マの各サンゾルは、アメリカン・タイツ０カルチユア・
コレクション、１２３０１１々−クラウンドライブ、ロ
ックビレ、メリーランドに寄託された。
寄託日及び番号は次の通りである。
例屋 細胞系の表示 寄託日 寄託番号ＬＴＲ２２８Ｔ
ＴＧ １９８４年２月１４日 ＣＪｔユ８５０２２ Ｓ
Ａ］３ １９８４年２月１４日 ＨＢ８５０１３ ＨＡ
ＡＩ １９８４年３月２８日 ＨＢ８５３４上記の寄託
はブタにスト条約のもとになされた。
ＴＧ １９８４年２月１４日 ＣＪｔユ８５０２２ Ｓ
Ａ］３ １９８４年２月１４日 ＨＢ８５０１３ ＨＡ
ＡＩ １９８４年３月２８日 ＨＢ８５３４上記の寄託
はブタにスト条約のもとになされた。
これらの寄託物は該条約の規定のもとに保持され、そし
て入手可能にされるであろう。
て入手可能にされるであろう。
上記の方法の自明の変法を用いて、ＬＴＲ２２８を他の
ヒト抗体産生細胞と融合せしめ、種々の薬剤、細胞表面
抗原、毒素等を含む任意のハゲテン又は抗原に対するモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを造成する
ことができる。ＬＴＲ２２８のバイブリドによシ産生さ
れるモノクローナル抗体は、医療、診断、又はクロマト
グラフィーにおいて使用することができる。
ヒト抗体産生細胞と融合せしめ、種々の薬剤、細胞表面
抗原、毒素等を含む任意のハゲテン又は抗原に対するモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを造成する
ことができる。ＬＴＲ２２８のバイブリドによシ産生さ
れるモノクローナル抗体は、医療、診断、又はクロマト
グラフィーにおいて使用することができる。
し１下金白
第１頁の続き
■ｔｎｔ、ｃ１．’ 識別記号
０発 明 者 アンドリュー ニー。
ラウビツチェク
庁内整理番号
アメリカ合衆国、カリフォルニア ９４０６１．レッド
ウッドシティ、アラメダ １９７１
ウッドシティ、アラメダ １９７１
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＬＴＲ２２８系のヒトーリンフ寸ツラストイイドＢ
細胞及びその子孫。 ２、特許請求の範囲第１項記載のリンフォブラストイド
Ｂ細胞のウアバイン耐性子孫。 ３、（ａ） ＬＴＲ２２８系のヒトーリンフ寸ツラスト
イドＢ細胞又はその子孫；及び （ｂ） 抗体産生ヒト細胞； のモノクローナル抗体産生ヒト×ヒトハイツリドーマ。 ４ 前記モノクローナル抗体が抗−破傷風トキソイド抗
体である特許請求の範囲第３項記載のノ・イブリドーマ
。 ５、 ヒト×ヒトハイプリドーマ５Ａ１３及びその子孫
。 ６、モノクローナル抗体産生ヒト×ヒトハイツリドーマ
の製造方法であって、 （ａ） ＬＴＲ２２８系のリンフ寸プラストイドＢ細胞
又はその子孫とヒト抗体産生細胞とを融合促進剤を含有
する融合媒体中で融合せしめ； （ｂ） 前記融合媒体から細胞を分離し：（ｅ） 前記
分離された細胞を拡げ；そして、（ｄ） 前記拡げられ
た細胞をヒポキサンチン及びアザセリンを含有する培地
中で増殖せしめ、こうすることによって前記ハイツリド
ーマを選択する； ことを含んでなる方法。 ７、 ヒトモノクローナル抗体の製造方法であって、 （ａ） ＬＴＲ２２８系のヒト−リンフすゲラストイド
Ｂ細胞又はその子孫と抗体産生ヒト細胞との、モノクロ
ーナル抗体産生ヒト×ヒトハイツリドーマを増殖培地中
で増殖せしめ；そして、 （ｂ） 前記増殖培地からヒトモノ゛クローナル抗体を
単離する； ことを含んで成る方法。 ８、モノクローナル抗体ＳＡＩ ３及びその機能的同等
物。 ９、ハイプリドーマ５Ａ１３’ｅ増殖培地中で培養し、
そして該増殖培地から抗体を採取することを含んで成る
モノクローナル抗体ＳＡＩ ３の製造方法。 １０、医薬として許容される非経腸的担体と混合された
モノクローナル抗体ＳＡＩ ３又はその機能的同等物の
有効量を含んで成る破傷風処理用医薬組成物。 Ｊｌ、モノクローナル抗体ＳＡＩ ３又はその機能的同
等物の有効ａｔ個体に非経腸的に投与することを含んで
成る個体の破傷風を処理する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US604068 | 1984-04-26 | ||
| US06/604,068 US4624921A (en) | 1984-04-26 | 1984-04-26 | Human lymphoblastold cell line and hybridomas derived therefrom |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60251881A true JPS60251881A (ja) | 1985-12-12 |
Family
ID=24418057
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60089116A Pending JPS60251881A (ja) | 1984-04-26 | 1985-04-26 | ヒト−リンフオブラストイド細胞系及びこれから誘導されたハイブリド−マ |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4624921A (ja) |
| EP (1) | EP0160550A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60251881A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0257195A (ja) * | 1988-08-19 | 1990-02-26 | Morinaga & Co Ltd | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
| EP0368662A2 (en) | 1988-11-09 | 1990-05-16 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Parent cell lines for producing human hybridomas |
| US5319430A (en) * | 1993-01-04 | 1994-06-07 | Xerox Corporation | Fuser mechanism having crowned rolls |
Families Citing this family (19)
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| US4834976A (en) * | 1986-07-03 | 1989-05-30 | Genetic Systems Corporation | Monoclonal antibodies to pseudomonas aeruginosa flagella |
| US5001065A (en) * | 1987-05-27 | 1991-03-19 | Cetus Corporation | Human cell line and triomas, antibodies, and transformants derived therefrom |
| US5215913A (en) * | 1987-11-30 | 1993-06-01 | Roger Williams General Hospital | IgG-1 human monoclonal antibody reactive with an HIV-1 antigen and methods of use |
| US5112770A (en) * | 1988-06-08 | 1992-05-12 | North Carolina State University | Precipitation of multivalent antiligands with affinity surfactants |
| US5167925A (en) * | 1988-06-08 | 1992-12-01 | North Carolina State University | Precipitation of multivalent antiligands with affinity surfactants |
| US5750106A (en) * | 1993-01-28 | 1998-05-12 | Novartis Ag | Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus |
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| US20010055581A1 (en) * | 1994-03-18 | 2001-12-27 | Lawrence Tamarkin | Composition and method for delivery of biologically-active factors |
| US7229841B2 (en) * | 2001-04-30 | 2007-06-12 | Cytimmune Sciences, Inc. | Colloidal metal compositions and methods |
| US6407218B1 (en) | 1997-11-10 | 2002-06-18 | Cytimmune Sciences, Inc. | Method and compositions for enhancing immune response and for the production of in vitro mabs |
| AU2004311630A1 (en) * | 2003-12-02 | 2005-07-21 | Cytimmune Sciences, Inc. | Methods and compositions for the production of monoclonal antibodies |
| CA2554755A1 (en) * | 2004-01-28 | 2005-08-11 | Cytimmune Sciences, Inc. | Functionalized colloidal metal compositions and methods |
| WO2009033121A2 (en) | 2007-09-06 | 2009-03-12 | University Of Washington | Molecules and methods for treatment and detection of diabetes |
| EP2200932A4 (en) * | 2007-09-21 | 2014-09-10 | Cytimmune Sciences Inc | NANOTHERAPEUTIC COLLOIDAL METAL COMPOSITIONS AND METHODS |
| US20110014118A1 (en) * | 2007-09-21 | 2011-01-20 | Lawrence Tamarkin | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods |
| CA2706700A1 (en) | 2007-11-08 | 2009-05-14 | Cytimmune Sciences, Inc. | Compositions and methods for generating antibodies |
| DE102009015975B4 (de) | 2009-03-26 | 2012-01-05 | Festo Ag & Co. Kg | Fluidtechnisches Gerät, insbesondere Greifervorrichtung |
| CN109022359A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-12-18 | 远见生物科技（上海）有限公司 | 一种永生化类淋巴母细胞系建立的方法和试剂盒 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4451570A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-29 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line |
| US4594325A (en) * | 1981-03-26 | 1986-06-10 | The Regents Of The University Of Calif. | High fusion frequency fusible lymphoblastoid cell line |
| US4464465A (en) * | 1982-04-05 | 1984-08-07 | Genetic Systems Corporation | Cell-driven viral transfer in eukaryotes |
-
1984
- 1984-04-26 US US06/604,068 patent/US4624921A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-04-26 JP JP60089116A patent/JPS60251881A/ja active Pending
- 1985-04-26 EP EP85302989A patent/EP0160550A3/en not_active Withdrawn
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| JPH0257195A (ja) * | 1988-08-19 | 1990-02-26 | Morinaga & Co Ltd | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0160550A2 (en) | 1985-11-06 |
| US4624921A (en) | 1986-11-25 |
| EP0160550A3 (en) | 1987-11-25 |
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