JPS61152281A - 抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法 - Google Patents
抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法Info
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- JPS61152281A JPS61152281A JP59273156A JP27315684A JPS61152281A JP S61152281 A JPS61152281 A JP S61152281A JP 59273156 A JP59273156 A JP 59273156A JP 27315684 A JP27315684 A JP 27315684A JP S61152281 A JPS61152281 A JP S61152281A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
本発明は、抗緑膿菌ヒ１−抗体を産１１−するマウス−
ヒトハイブリドーマとその製３％法、並びにその使用方
法に関する。その目的とするところは、緑膿菌感染症の
診断及び治療等に役立つところの抗緑膿菌ヒト抗体を産
生する、マウス−ヒトハイブリドーマを提供することに
ある。
ヒトハイブリドーマとその製３％法、並びにその使用方
法に関する。その目的とするところは、緑膿菌感染症の
診断及び治療等に役立つところの抗緑膿菌ヒト抗体を産
生する、マウス−ヒトハイブリドーマを提供することに
ある。
（ロ）従来の技術
緑膿菌（シュードモナス・エルギノーサ、ｐｓｅｔｌｄ
ｏｍＯｎａｓ ａｅｒｌｌ（１！ ｎ０３ａ ）は本
来病原性の低い菌であるが、最近は、抗生物質の投与に
よる菌交代性増殖の結果、薬剤耐性緑膿菌による感染症
が増え、しばしば免疫不全、とりわけシスティック フ
ァイブローシス（のう胞性線紺症）、熱傷、ガン等の患
者に発症し重篤な症状を甲するようになっている。この
感染症においては、緑膿菌が薬剤耐性をちっている”こ
とが多いため、又患者の免疫力が弱まっている等のため
、抗生物質による治療が必ずしも十分な威力を発揮しな
いという問題がある。
ｏｍＯｎａｓ ａｅｒｌｌ（１！ ｎ０３ａ ）は本
来病原性の低い菌であるが、最近は、抗生物質の投与に
よる菌交代性増殖の結果、薬剤耐性緑膿菌による感染症
が増え、しばしば免疫不全、とりわけシスティック フ
ァイブローシス（のう胞性線紺症）、熱傷、ガン等の患
者に発症し重篤な症状を甲するようになっている。この
感染症においては、緑膿菌が薬剤耐性をちっている”こ
とが多いため、又患者の免疫力が弱まっている等のため
、抗生物質による治療が必ずしも十分な威力を発揮しな
いという問題がある。
従って、抗緑膿菌抗体によるいわゆる免疫療法が考えら
れ研究されつつあるが、未だ臨床に供されるに至ってい
ない。また、緑膿菌感染症の治療を適格に行なうために
は、その早期診断が必要であるが、従来の抗面清を用い
る方法は満足すべき状況にないという問題がある。これ
らの問題点を解決するためには、抗緑膿菌モノクローナ
ル抗体が必要である。
れ研究されつつあるが、未だ臨床に供されるに至ってい
ない。また、緑膿菌感染症の治療を適格に行なうために
は、その早期診断が必要であるが、従来の抗面清を用い
る方法は満足すべき状況にないという問題がある。これ
らの問題点を解決するためには、抗緑膿菌モノクローナ
ル抗体が必要である。
一方、緑膿菌の表面抗原としては、リポ多糖（１−ＰＳ
）、外層蛋白（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ。
）、外層蛋白（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ。
ＯＭＰ）、ペン毛、スライム由来の多糖等が知られてい
る。このうちＩＰＳは緑膿菌の面清型を決定する〇−多
糖側鎖を有し、今まで１から１６までの１６種類の面清
型（１−１ｏｍｍａの分類による）が知られている。ｌ
−Ｐ Ｓは〇−多糖側鎖の伯に］アーリージョン、リビ
ドΔを有し、リビドΔが緑膿菌の外層（ｏ＋１ｔｅｒ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ）にうずもれ、これより２−ケト
−３−デオキシオフトン酸を介しコアーリージョンが外
層外に伸び、コアーリージョンから〇−多糖側鎖が更に
外側に伸展している。１．ＰＳに対する抗体は、ヒトや
動物において作られやすく、感染防御的に働く事が知ら
れている。抗ＬＰＳ抗体は緑膿菌のＩ−Ｐ Ｓと結合し
、この抗原抗体複合体に補体が結合し、免疫溶菌を受け
るか、もしくは多形核白血球などの食細胞により処即さ
れ、生体が緑膿菌感染症から免がれる事ができると言わ
れている。緑膿菌の感染が成立している患者では、緑膿
菌抗原が多く、抗ＬＰＳ抗体が不犀になりがちである。
る。このうちＩＰＳは緑膿菌の面清型を決定する〇−多
糖側鎖を有し、今まで１から１６までの１６種類の面清
型（１−１ｏｍｍａの分類による）が知られている。ｌ
−Ｐ Ｓは〇−多糖側鎖の伯に］アーリージョン、リビ
ドΔを有し、リビドΔが緑膿菌の外層（ｏ＋１ｔｅｒ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ）にうずもれ、これより２−ケト
−３−デオキシオフトン酸を介しコアーリージョンが外
層外に伸び、コアーリージョンから〇−多糖側鎖が更に
外側に伸展している。１．ＰＳに対する抗体は、ヒトや
動物において作られやすく、感染防御的に働く事が知ら
れている。抗ＬＰＳ抗体は緑膿菌のＩ−Ｐ Ｓと結合し
、この抗原抗体複合体に補体が結合し、免疫溶菌を受け
るか、もしくは多形核白血球などの食細胞により処即さ
れ、生体が緑膿菌感染症から免がれる事ができると言わ
れている。緑膿菌の感染が成立している患者では、緑膿
菌抗原が多く、抗ＬＰＳ抗体が不犀になりがちである。
これを防ぎ治療するために、従来からヒトの白液から調
製したＴｏＧ製剤が使われてきたが、その製剤に含まれ
ている緑膿菌の抗体価は極めて少なく、感染治療上十分
ではなかった。
製したＴｏＧ製剤が使われてきたが、その製剤に含まれ
ている緑膿菌の抗体価は極めて少なく、感染治療上十分
ではなかった。
ところで、細胞融合の技術を用いて、特巽的な抗体を産
生するがやがては死滅する運命にあるリンパ球又はＢ１
１１ｌ胞（抗体産生側１と、培養器の中で永久に増殖し
つづけるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）を融合させるこ
とにり、モノクローナルを永続的に産生分泌するハイブ
リドーマ（融合細胞）株を樹立させる方法は公知である
。そして、モノクローナルな抗緑膿菌抗体を得ようとす
る場合には、抗緑膿菌抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させ、クローニングによって抗緑膿菌抗体産生性
のハイブリドーマを得ればよいことは一般論としては知
られている。そして、具体的には、例えば、特開１’ｆ
ｆ５’９−２９６２２号公報には、緑膿菌のＬＰＳで免
疫されたＢΔＬｒ３／Ｃマウスの牌臓細飽（抗体産生細
胞）と、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Δｏ
８−Ｕ１株）とを融合させハイブリドーマを得、これを
クローニングすることによって、モノクローナルな抗緑
膿菌マウス抗体を産生するハイブリドーマを得たことが
開示されている。
生するがやがては死滅する運命にあるリンパ球又はＢ１
１１ｌ胞（抗体産生側１と、培養器の中で永久に増殖し
つづけるミエローマ細胞（骨髄腫細胞）を融合させるこ
とにり、モノクローナルを永続的に産生分泌するハイブ
リドーマ（融合細胞）株を樹立させる方法は公知である
。そして、モノクローナルな抗緑膿菌抗体を得ようとす
る場合には、抗緑膿菌抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させ、クローニングによって抗緑膿菌抗体産生性
のハイブリドーマを得ればよいことは一般論としては知
られている。そして、具体的には、例えば、特開１’ｆ
ｆ５’９−２９６２２号公報には、緑膿菌のＬＰＳで免
疫されたＢΔＬｒ３／Ｃマウスの牌臓細飽（抗体産生細
胞）と、マウスのミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Δｏ
８−Ｕ１株）とを融合させハイブリドーマを得、これを
クローニングすることによって、モノクローナルな抗緑
膿菌マウス抗体を産生するハイブリドーマを得たことが
開示されている。
（ハ）発明が解決しようとする問題点
１ズ上のごとく、抗緑膿菌抗体を産生するハイブリドー
マに関しては、具体的な成功例は抗緑膿菌マウス抗体を
産生するマウス−マウスハイブリドーマだけである。し
かし、ヒトの病気の診断や治療のためには、同種タンパ
クである杭緑ｗ８ｉ′ｉ！ｉヒト抗体の方が有用でかつ
安全であり、そのためには、ヒトの抗体産生ｆｌｌｌｌ
ｌｌを用いてマウス−ヒトハイブリドーマやヒト−ヒト
ハイブリドーマを樹立する必要がある。しかしながら、
動物の場合と異なり、ヒトの場合には、ヒトをあらかじ
め多量の緑膿菌やその表面抗原で免疫し、有効に刺激さ
れた抗体産生細胞を採取して細胞融合に用いるといった
方法をとるわけにはいかないので、適切な抗体産生細胞
の採取・調整が困難であるといった問題等があり、未だ
明ｍな成功例の報告がない。
マに関しては、具体的な成功例は抗緑膿菌マウス抗体を
産生するマウス−マウスハイブリドーマだけである。し
かし、ヒトの病気の診断や治療のためには、同種タンパ
クである杭緑ｗ８ｉ′ｉ！ｉヒト抗体の方が有用でかつ
安全であり、そのためには、ヒトの抗体産生ｆｌｌｌｌ
ｌｌを用いてマウス−ヒトハイブリドーマやヒト−ヒト
ハイブリドーマを樹立する必要がある。しかしながら、
動物の場合と異なり、ヒトの場合には、ヒトをあらかじ
め多量の緑膿菌やその表面抗原で免疫し、有効に刺激さ
れた抗体産生細胞を採取して細胞融合に用いるといった
方法をとるわけにはいかないので、適切な抗体産生細胞
の採取・調整が困難であるといった問題等があり、未だ
明ｍな成功例の報告がない。
（ニ）問題点を解決するための手段
本発明者らは、抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒ
トハイブリドーマを得ることを目的として鋭意研究を行
なった結果、まず、抗緑膿菌抗体を産生するヒトの細胞
を多く含む組織を選別し、この組織の細胞とマウスのミ
エローマ細胞とを融合させるという方法によって、抗緑
膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマを
得ることができた。
トハイブリドーマを得ることを目的として鋭意研究を行
なった結果、まず、抗緑膿菌抗体を産生するヒトの細胞
を多く含む組織を選別し、この組織の細胞とマウスのミ
エローマ細胞とを融合させるという方法によって、抗緑
膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマを
得ることができた。
本発明においてヒトの抗体産生１１１１飽とは、ヒトの
リンパ球（又はＢ細胞）であって、抗体を分泌している
又は分泌する能力を持った細胞をいう。
リンパ球（又はＢ細胞）であって、抗体を分泌している
又は分泌する能力を持った細胞をいう。
これは脾臓、リンパ節、末梢面、骨髄、扁桃、アデノイ
ド等の細胞の中に含まれている。本発明の目的のために
は、いかなるソースのリンパ球でも用いることができる
が、好ましいのは扁桃腺又は牌臓から採取されたもので
ある。
ド等の細胞の中に含まれている。本発明の目的のために
は、いかなるソースのリンパ球でも用いることができる
が、好ましいのは扁桃腺又は牌臓から採取されたもので
ある。
マウスのミエローマ細胞としては、８−アザグアニン耐
性株を用いるのが右利であり、公知のものとしては、Ｂ
Δ１．、Ｂ／ＣマウスのＰ ３− Ｘ ６３−Ａ（１Ｂ
、Ｐ３−Ｘ６３−／！１１ ｓ−’ｕ１．ｐ３”Ｎ５１
７１−Ａ！１／Ｉ−１、ｐ３−ｘｅ３−Ａｇ８Ｊ、５．
’３゜５Ｐ２１０−ΔＱ １４． ＦＯ，ＭＰＣｌｌ−
４５，６ＴＧ１．７などがある。
性株を用いるのが右利であり、公知のものとしては、Ｂ
Δ１．、Ｂ／ＣマウスのＰ ３− Ｘ ６３−Ａ（１Ｂ
、Ｐ３−Ｘ６３−／！１１ ｓ−’ｕ１．ｐ３”Ｎ５１
７１−Ａ！１／Ｉ−１、ｐ３−ｘｅ３−Ａｇ８Ｊ、５．
’３゜５Ｐ２１０−ΔＱ １４． ＦＯ，ＭＰＣｌｌ−
４５，６ＴＧ１．７などがある。
本発明においては、抗原としては、Ｂ膿菌の表面抗原の
うちどれを用いても良いが、以下ＬＰＳを用いた場合に
ついて説明する。まず、抗原である特定のＩＰｓを右づ
るＢＨ３菌を選ぶ。次にヒトのリンパ球を扁桃腺、リン
パ節、牌臓及び末梢面等のｌ′ｌ織からモノヌクリアー
セル（単核細胞）として調製する。モノヌクリアーセル
を５０〜７日。
うちどれを用いても良いが、以下ＬＰＳを用いた場合に
ついて説明する。まず、抗原である特定のＩＰｓを右づ
るＢＨ３菌を選ぶ。次にヒトのリンパ球を扁桃腺、リン
パ節、牌臓及び末梢面等のｌ′ｌ織からモノヌクリアー
セル（単核細胞）として調製する。モノヌクリアーセル
を５０〜７日。
ホークライードマイトジェン等のマイト−ジエンの添加
もしくは無添加の条件下で、５％ＣＯ２インキエベータ
ーで培養し、その培養土清液中の抗体を、緑膿菌を固定
したプレートで酵素抗体法（ＦＬＴＳΔ）により測定し
、望ましいモノヌクリアーセルを含む組織をＭ ／’Ｓ
’ Ｏ次いで、この１１１Ｂのリンパ球とマウスのミエ
ローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマの巽質集落を形
成させる。細胞融合は公知の方法で行なうことができる
。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞融を１０：１
〜１：１０、好ましくは１：１〜１：３の比率で混合し
、適当な細胞融合用溶液、例えば約３５％ポリエチレン
グリコール（分子＠ １，０００〜６，０００程度）お
よび約７．５％ジメチルスルホキシドを含むＲＰＭｒ１
６４０を加えて、室温〜３７℃で１〜数分間撹拌し、そ
の１η１０％ＦＣ３加ＲＰＭ １１６４０で徐々に希釈
し、洗浄の４９）−ＩＡＴ（ヒポキサンチンーアミノプ
テリンーヂミジン）選択培養液にて細胞濃度が１〜５
Ｘ １０５個／猷となるように調整する。これを０．２
ｍＱずつ、例えば９６穴プレートに分注し、５％ＣＯ２
を含む空気中で３５〜３８℃で２〜３週間培養する。Ｉ
−Ｉ Ａ Ｔ培養液中ではハイブリドーマのみが生存し
、８−アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエロー
マ同士の融合細胞はイト存し得ないく未融合の抗体産生
細胞は数日で死滅する）。次に、このハイブリドーマ集
落から、緑膿菌ＬＰＳに対し特異的なヒトモノクローナ
ル抗体を分泌するものだけ選別する。この選別工程（ク
ローニング）は、異なるハイブリドーマより産生された
ヒトモノクローナル抗体を、目的とする血清型を有する
緑膿菌又は緑膿菌ＩＰｓを固定したプレートを用いて、
酸素抗体法を用いて行なう事ができる。
もしくは無添加の条件下で、５％ＣＯ２インキエベータ
ーで培養し、その培養土清液中の抗体を、緑膿菌を固定
したプレートで酵素抗体法（ＦＬＴＳΔ）により測定し
、望ましいモノヌクリアーセルを含む組織をＭ ／’Ｓ
’ Ｏ次いで、この１１１Ｂのリンパ球とマウスのミエ
ローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマの巽質集落を形
成させる。細胞融合は公知の方法で行なうことができる
。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞融を１０：１
〜１：１０、好ましくは１：１〜１：３の比率で混合し
、適当な細胞融合用溶液、例えば約３５％ポリエチレン
グリコール（分子＠ １，０００〜６，０００程度）お
よび約７．５％ジメチルスルホキシドを含むＲＰＭｒ１
６４０を加えて、室温〜３７℃で１〜数分間撹拌し、そ
の１η１０％ＦＣ３加ＲＰＭ １１６４０で徐々に希釈
し、洗浄の４９）−ＩＡＴ（ヒポキサンチンーアミノプ
テリンーヂミジン）選択培養液にて細胞濃度が１〜５
Ｘ １０５個／猷となるように調整する。これを０．２
ｍＱずつ、例えば９６穴プレートに分注し、５％ＣＯ２
を含む空気中で３５〜３８℃で２〜３週間培養する。Ｉ
−Ｉ Ａ Ｔ培養液中ではハイブリドーマのみが生存し
、８−アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエロー
マ同士の融合細胞はイト存し得ないく未融合の抗体産生
細胞は数日で死滅する）。次に、このハイブリドーマ集
落から、緑膿菌ＬＰＳに対し特異的なヒトモノクローナ
ル抗体を分泌するものだけ選別する。この選別工程（ク
ローニング）は、異なるハイブリドーマより産生された
ヒトモノクローナル抗体を、目的とする血清型を有する
緑膿菌又は緑膿菌ＩＰｓを固定したプレートを用いて、
酸素抗体法を用いて行なう事ができる。
全ての緑膿菌の血清型に反応するヒトモノクローナル抗
体を得る為には、１６種類の異る血清型の緑膿菌を使用
しなくてはならない。これらの緑膿菌は、アメリカンタ
イプカルチＩ７−コレクション（ΔＴＣＣ）等から入手
できる。
体を得る為には、１６種類の異る血清型の緑膿菌を使用
しなくてはならない。これらの緑膿菌は、アメリカンタ
イプカルチＩ７−コレクション（ΔＴＣＣ）等から入手
できる。
次に、選択したハイブリドーマを培養して、所望の特異
的ヒトモノクローナル抗体を生成させる。
的ヒトモノクローナル抗体を生成させる。
クローニングによって選択された、本発明の抗緑膿菌ヒ
ト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍結
して保存することができ、また、これを適当な方法で大
量に培養することもできる。
ト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍結
して保存することができ、また、これを適当な方法で大
量に培養することもできる。
かかるセルライン（細胞株）又は複製された細胞も本発
明の範囲に含まれるものである。すＦだ、クローン化さ
れたハイブリドーマと実質的に同一の抗緑膿菌ヒト抗体
を産生する限り、その変異株等も本発明の範囲に含まれ
る。
明の範囲に含まれるものである。すＦだ、クローン化さ
れたハイブリドーマと実質的に同一の抗緑膿菌ヒト抗体
を産生する限り、その変異株等も本発明の範囲に含まれ
る。
（ホ）発明の効宋
本発明のハイブリドーマを、適当な方法で大量に培養す
ると、培養上清から、例えば、緑膿菌のＬＰＳに特異的
に結合するモノクローナルな抗緑膿菌ヒト抗体を得るこ
とができる。また、このハイブリドーマを動物に移植し
て腫瘍化し、その腹水や面清から抗緑膿菌ヒト抗体を得
ることもできる。抗緑膿菌ヒト抗体の精製は、モノクロ
ーナル抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィー等
の方法によって行なわれる。
ると、培養上清から、例えば、緑膿菌のＬＰＳに特異的
に結合するモノクローナルな抗緑膿菌ヒト抗体を得るこ
とができる。また、このハイブリドーマを動物に移植し
て腫瘍化し、その腹水や面清から抗緑膿菌ヒト抗体を得
ることもできる。抗緑膿菌ヒト抗体の精製は、モノクロ
ーナル抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィー等
の方法によって行なわれる。
本発明のハイブリドーマは、緑膿菌の、例えばＬ Ｐ
Ｓに特質的に結合するヒトモノクローナル抗体を提供し
、かかる抗緑膿菌抗体は、緑膿菌感染症の患者に投与す
る事により、血中に抗ＬＰＳ抗体の力価を有意に上背せ
しめ、治療を達成する事ができる。また、モノクローナ
ル抗体は、高い精度と信頼爪をもつ緑膿菌の検査試薬や
標識試薬などに応用ができる。
Ｓに特質的に結合するヒトモノクローナル抗体を提供し
、かかる抗緑膿菌抗体は、緑膿菌感染症の患者に投与す
る事により、血中に抗ＬＰＳ抗体の力価を有意に上背せ
しめ、治療を達成する事ができる。また、モノクローナ
ル抗体は、高い精度と信頼爪をもつ緑膿菌の検査試薬や
標識試薬などに応用ができる。
（へ）実施例
以下、実施例により本発明を詳述する。
実施例１
（１）抗緑膿菌抗体産生細胞の選別
８人の扁桃炎患者より８０ツトの扁桃腺を（ｑｌこれよ
りファイコールバックを用いモノヌクリアーセルを調製
した。細胞濃度が５Ｘ１０６／ａｔ！になる様に、モノ
ヌクリアーセルを培養液Ａ（ＲＰＭＩ １Ｂ４０＋ １
０％胎児牛而清＋２＋ｎＭグリタミン＋１１１１Ｍピリ
ジン酸→−０，０２ｍ９／ ｍＱセリン＋８０μｇ／〆
ゲンタマイシン）に浮遊させ、これに、ホークライード
マイトジェン（ＰＷＭ）を２０μｇ／＃Ｉｌ！になる様
に加えた。この試ｒ１を２００μｐづつ培養プレートに
入れ、ＣＯ２インキコベーター（５％Ｃ０２）で６〜７
０培養した。その後、それぞれの培養土漬液１１００Ｉ
１を、緑膿菌を］−トしたプレートに移し、ＥＬＴＳ△
で測定を行ったところ、１ｎツトだけ強く抗緑膿菌抗体
を産生じていた。
りファイコールバックを用いモノヌクリアーセルを調製
した。細胞濃度が５Ｘ１０６／ａｔ！になる様に、モノ
ヌクリアーセルを培養液Ａ（ＲＰＭＩ １Ｂ４０＋ １
０％胎児牛而清＋２＋ｎＭグリタミン＋１１１１Ｍピリ
ジン酸→−０，０２ｍ９／ ｍＱセリン＋８０μｇ／〆
ゲンタマイシン）に浮遊させ、これに、ホークライード
マイトジェン（ＰＷＭ）を２０μｇ／＃Ｉｌ！になる様
に加えた。この試ｒ１を２００μｐづつ培養プレートに
入れ、ＣＯ２インキコベーター（５％Ｃ０２）で６〜７
０培養した。その後、それぞれの培養土漬液１１００Ｉ
１を、緑膿菌を］−トしたプレートに移し、ＥＬＴＳ△
で測定を行ったところ、１ｎツトだけ強く抗緑膿菌抗体
を産生じていた。
このロットのモノヌクリアーゼを、マクスミ１０−マＰ
３−Ｘ６３−Δ（］ ８−Ｕｌ （以下Ｐ３Ｕ１と略記
する）との細胞融合に用いた。
３−Ｘ６３−Δ（］ ８−Ｕｌ （以下Ｐ３Ｕ１と略記
する）との細胞融合に用いた。
（２）細胞融合
前もってＰ３Ｕ１を培養液Ａ中で培養しておいた。使用
時の細胞濃度は６Ｘ１０５個／７１１１！であった。
時の細胞濃度は６Ｘ１０５個／７１１１！であった。
上記の抗ＢＩＩｌ菌抗体産生がすぐれていた扁桃腺ロッ
トのリンパ球とＰ３Ｕ１を、それぞれ別々に無Ｉｆｎ消
ＲＰＭ Ｔ １６４０で２回洗浄した。そして、リンパ
球と５×１０Ｇ個のＰ３Ｕ１とを試験管の中で一緒にし
、次いで１５００ｐｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた
。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よく
分散させた。これに０ 、５ｍ（！のポリエヂレングリ
コール液（ＲＰＭ Ｉ １６４０５．７！ｉ ｄ＋ポリ
エチレングリ］−ル５００ ３．５７＋ジメチルエルホ
キサイド０．７５ ｍｉ！＞ （ＰＥＧ液と略記する
）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０
．５ｍｅ ＋ ＲＰ Ｍ Ｔ １６４０を加え、さらに
１分後に１ｍ６ＲＰＭｒ、さらに２分後に４１ｄ、のト
ＩＡＴ培養液（ＲＰＭ Ｉ １６４０＋２０％胎児牛面
清＋８０ｔ１ｇ／ ｍｅゲンタマインシン＋９５μＭヒ
ポキザンチン＋０．４μＭアミノプテリン＋ １．６μ
Ｍデミジン）、さらに２分後には４ ｍ（！の１−１Δ
丁培養液を加えた。最後に、ト１ΔＴ培養液で２５ ｍ
ｅ細胞浮遊液とした。これを培養プレート（９６穴）１
枚に蒔いて、３７℃、５％ＣＯ２含右空気中で培養した
。−週間毎に生母の培養液を新しい１−Ｉ■培養ｌ （
）−ＩＡＴからＡを除去したもの）で交換していきハイ
ブリドーマを得た。
トのリンパ球とＰ３Ｕ１を、それぞれ別々に無Ｉｆｎ消
ＲＰＭ Ｔ １６４０で２回洗浄した。そして、リンパ
球と５×１０Ｇ個のＰ３Ｕ１とを試験管の中で一緒にし
、次いで１５００ｐｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた
。細胞ペレットを、試験管をたたくことによって、よく
分散させた。これに０ 、５ｍ（！のポリエヂレングリ
コール液（ＲＰＭ Ｉ １６４０５．７！ｉ ｄ＋ポリ
エチレングリ］−ル５００ ３．５７＋ジメチルエルホ
キサイド０．７５ ｍｉ！＞ （ＰＥＧ液と略記する
）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分後に０
．５ｍｅ ＋ ＲＰ Ｍ Ｔ １６４０を加え、さらに
１分後に１ｍ６ＲＰＭｒ、さらに２分後に４１ｄ、のト
ＩＡＴ培養液（ＲＰＭ Ｉ １６４０＋２０％胎児牛面
清＋８０ｔ１ｇ／ ｍｅゲンタマインシン＋９５μＭヒ
ポキザンチン＋０．４μＭアミノプテリン＋ １．６μ
Ｍデミジン）、さらに２分後には４ ｍ（！の１−１Δ
丁培養液を加えた。最後に、ト１ΔＴ培養液で２５ ｍ
ｅ細胞浮遊液とした。これを培養プレート（９６穴）１
枚に蒔いて、３７℃、５％ＣＯ２含右空気中で培養した
。−週間毎に生母の培養液を新しい１−Ｉ■培養ｌ （
）−ＩＡＴからＡを除去したもの）で交換していきハイ
ブリドーマを得た。
（３） クローニング及び培養
得られたハイブリドーマのｌｘ ｆｆｉを、ホルマリン
死滅緑膿菌をコーティングしたプレートを用いてＥＩ
ＩｓＡ法で測定を行った結果、緑膿菌自消型１１ ｏ
ｍｍａ ｔＶｒｌｅ ５に結合するヒトモノクローナ
ル抗体Ｐ３を拐た。そこで、Ｆ３を産生するハイブリド
ーマを、２回限界希釈法によりクローニングを行い（９
６穴プレ一ト２枚）、最終的にＰ３ｒ）９というヒトモ
ノクローナル抗体（Ｔ（ＩＧ、λ）を産生するマウス−
ヒトハイブリドーマを得た。
死滅緑膿菌をコーティングしたプレートを用いてＥＩ
ＩｓＡ法で測定を行った結果、緑膿菌自消型１１ ｏ
ｍｍａ ｔＶｒｌｅ ５に結合するヒトモノクローナ
ル抗体Ｐ３を拐た。そこで、Ｆ３を産生するハイブリド
ーマを、２回限界希釈法によりクローニングを行い（９
６穴プレ一ト２枚）、最終的にＰ３ｒ）９というヒトモ
ノクローナル抗体（Ｔ（ＩＧ、λ）を産生するマウス−
ヒトハイブリドーマを得た。
本ハイブリドーマを、無血清１ａ地ＲＤＦ／ＴＥＳ培地
（Ｐ ｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａ ｃｏｄ、ｓ ｃｉ、
Ｕ Ｓ Ａ ｖｏｌ。
（Ｐ ｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａ ｃｏｄ、ｓ ｃｉ、
Ｕ Ｓ Ａ ｖｏｌ。
７９、１１！’＋８−１１６２参照）１ρで培養を行い
、Ｐ３Ｆ）９を含む培養液を限外濾過膜ＰＭ３０（アミ
コン社製）を用いて濃縮を行い、３０ｍ？とした。そし
て、Ｄ Ｅ Ａ Ｆ −Ｓ ｅｐｈａｃｅｌでカラｌ＼
クロマトを行い、Ｆ３１”）９を精製し、１２■を得た
。
、Ｐ３Ｆ）９を含む培養液を限外濾過膜ＰＭ３０（アミ
コン社製）を用いて濃縮を行い、３０ｍ？とした。そし
て、Ｄ Ｅ Ａ Ｆ −Ｓ ｅｐｈａｃｅｌでカラｌ＼
クロマトを行い、Ｆ３１”）９を精製し、１２■を得た
。
実施例２
ヒトの牌細胞を用いる以外は、実施例１の場合と同様に
して、抗体産生＄１１１胞の芦別及び細胞融合を行なっ
た。ｉｑられたハイブリドーマの上清を、ホルマリン死
滅ｌ′ｉ！ｌ１ｌｎ菌をコーティングしたプレートを用
いて［Ｌｒ５Ａ法で測定を行った結果、緑繭菌面清型Ｉ
」ｏｍｍａ ｔｙｐｅ ２ 、 ｌ−１ｏｍｍａ
ｔｙｐｅ ７ 、 ）−１ｏｍｍａ ｔｙｐｅ１３の
いずれとも結合するヒトモノクローナル杭体Ｂ８を冑た
。Ｂ８を産生するハイブリドーマを、２回限界希釈法に
よりクローニングを行い、８８「２というヒトモノクロ
ーナル抗体（ＴｇＧ、λ）を産生ずるマウス−ヒトハイ
ブリドーマを得た。
して、抗体産生＄１１１胞の芦別及び細胞融合を行なっ
た。ｉｑられたハイブリドーマの上清を、ホルマリン死
滅ｌ′ｉ！ｌ１ｌｎ菌をコーティングしたプレートを用
いて［Ｌｒ５Ａ法で測定を行った結果、緑繭菌面清型Ｉ
」ｏｍｍａ ｔｙｐｅ ２ 、 ｌ−１ｏｍｍａ
ｔｙｐｅ ７ 、 ）−１ｏｍｍａ ｔｙｐｅ１３の
いずれとも結合するヒトモノクローナル杭体Ｂ８を冑た
。Ｂ８を産生するハイブリドーマを、２回限界希釈法に
よりクローニングを行い、８８「２というヒトモノクロ
ーナル抗体（ＴｇＧ、λ）を産生ずるマウス−ヒトハイ
ブリドーマを得た。
本ハイブリドーマを、１０％Ｆ Ｃ’Ｓ ＲＰＭ Ｉ
１６／ＩＱ１すで培養を行い、８８Ｅ２を硫安沈澱（５
０％飽和）により回収した。ｒ）Ｅ△Ｆ −３ｅｐｈａ
ｃｅｌ テ部分精ツ１を行った。ヒトＴｆＩ量は、−元
平板免疫拡散法（ＳＲＩｎ）により定量を行い、８■の
８８Ｅ２を含む抗体溶液を得た。本モノクローナル抗体
は、Ｈｏｍｍａ ｔｙｐｅ ２． Ｈｏｍｍａ ｔ
ｙｐｅ ７及びｔ−＋ｏｍ１１１ａｔｙｐｅ１３から、
Ｊ ｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐ ｅｒｒｙ （Ｃ
ａｎ。
１６／ＩＱ１すで培養を行い、８８Ｅ２を硫安沈澱（５
０％飽和）により回収した。ｒ）Ｅ△Ｆ −３ｅｐｈａ
ｃｅｌ テ部分精ツ１を行った。ヒトＴｆＩ量は、−元
平板免疫拡散法（ＳＲＩｎ）により定量を行い、８■の
８８Ｅ２を含む抗体溶液を得た。本モノクローナル抗体
は、Ｈｏｍｍａ ｔｙｐｅ ２． Ｈｏｍｍａ ｔ
ｙｐｅ ７及びｔ−＋ｏｍ１１１ａｔｙｐｅ１３から、
Ｊ ｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｐ ｅｒｒｙ （Ｃ
ａｎ。
Ｊ、 ｍ１ｃｒｏｂｉｏｌ 、１９７６ ｖｏｌ、２
２．２９−３４）の方法により抽出したＬＰＳ及びその
熱処理（１００℃−３０分）Ｌ Ｐ Ｓを］−ディング
したプレートを用いたＥ ’Ｌ Ｔ ＳＡ法で、それぞ
れのｌ−Ｐ Ｓに結合する事が確められ、Ｌ Ｐ Ｓを
認識するモノクローナル抗体である事がわかった。
２．２９−３４）の方法により抽出したＬＰＳ及びその
熱処理（１００℃−３０分）Ｌ Ｐ Ｓを］−ディング
したプレートを用いたＥ ’Ｌ Ｔ ＳＡ法で、それぞ
れのｌ−Ｐ Ｓに結合する事が確められ、Ｌ Ｐ Ｓを
認識するモノクローナル抗体である事がわかった。
実施例３
ヒトの扁桃腺細胞を用い、実施例１の場合と同様にして
、抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行なった。得られ
たハイブリドーマの上清を、ホルマリン死滅緑膿菌をコ
ーティングしたプレートを用いてＥ Ｌ ｒ ＳＡ法で
測定を行った結果、緑膿菌血清型Ｈｏｍｍａ ｔｙｐ
ｅ １に結合する３１−７．同ｔｙｐｅ７に結合する３
１−８．同ｔｙｐｅ８に結合する３１−９ 。
、抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行なった。得られ
たハイブリドーマの上清を、ホルマリン死滅緑膿菌をコ
ーティングしたプレートを用いてＥ Ｌ ｒ ＳＡ法で
測定を行った結果、緑膿菌血清型Ｈｏｍｍａ ｔｙｐ
ｅ １に結合する３１−７．同ｔｙｐｅ７に結合する３
１−８．同ｔｙｐｅ８に結合する３１−９ 。
及び同ｔｙｐｅ１ｏに結合する３１−１２を得た。これ
らのヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を、限界希釈法及び軟寒天法により２回クローニングを
行い〈９６穴プレ一ト５枚）、それぞれ３１−７ ２Ａ
、３１ ８ ５Ｇ、３１ ９ Ｆ４．３１−１２−８
３のヒト型ＴＯＧを産生ずるバイブリド−マを得た。
らのヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を、限界希釈法及び軟寒天法により２回クローニングを
行い〈９６穴プレ一ト５枚）、それぞれ３１−７ ２Ａ
、３１ ８ ５Ｇ、３１ ９ Ｆ４．３１−１２−８
３のヒト型ＴＯＧを産生ずるバイブリド−マを得た。
かかるハイブリドーマを実施例２と同様の方法で培養し
、部分精製を行い、それぞれのモノクローナル抗体が反
応する抗原部位を決定すべく、１−ＰＳ及熱処理（１０
０１？ｘ ２ｈｒ） ｌ ＰＳとの結合性をＥ Ｌ Ｉ
ＳＡ法により実施した。その結果を第１表に示した（
反応時間は６０分）。
、部分精製を行い、それぞれのモノクローナル抗体が反
応する抗原部位を決定すべく、１−ＰＳ及熱処理（１０
０１？ｘ ２ｈｒ） ｌ ＰＳとの結合性をＥ Ｌ Ｉ
ＳＡ法により実施した。その結果を第１表に示した（
反応時間は６０分）。
（以下余白）
第１表
本表中の数字はＥＬＩＳＡのスコアーである。
第３表から、ヒトモノクローナル抗体はそれぞれ特異な
Ｌ Ｐ’Ｓに結合していることがわかる。
Ｌ Ｐ’Ｓに結合していることがわかる。
実施例４
ヒトの扁桃腺細胞を用いて、実施例１の場合と同様に抗
体産生細胞の選別及び細胞融合を行った。
体産生細胞の選別及び細胞融合を行った。
得られたハイブリドーマの上清を、ホルマリン死滅緑膿
菌を］−ティングしたプレートを用いて、第２次抗体を
ヤギ抗ヒトＩ（ＩＭ抗体（アルカリフ片スファターゼ標
識）として、ＥＩ ＩＳＡ法による測定を行った結果
、自消型が１」ｏｍｍａ ｔＶＩ）ｅ５ 。
菌を］−ティングしたプレートを用いて、第２次抗体を
ヤギ抗ヒトＩ（ＩＭ抗体（アルカリフ片スファターゼ標
識）として、ＥＩ ＩＳＡ法による測定を行った結果
、自消型が１」ｏｍｍａ ｔＶＩ）ｅ５ 。
ｔＶＩｌｅ７． ｔｙｐｅｓに反応するＩ（ＩＭ型ヒト
モノクローナル抗体が得られた。これらのヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法及
び軟寒天法により２回クローニングを行い、それぞれ、
３．１３−ａ 、 ３１３−ｂ 、 ３１３−ｃの
ヒトモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを冑
だ。その後、実施例２と同様の方法により部分精製を行
い、それぞれのモノクローナル抗体が反応する抗原部位
を決定すべく、ＬＰＳ及び熱処理ＬＰＳとの結合性をＥ
ｌ ｒｓＡ法により検討した。
モノクローナル抗体が得られた。これらのヒトモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法及
び軟寒天法により２回クローニングを行い、それぞれ、
３．１３−ａ 、 ３１３−ｂ 、 ３１３−ｃの
ヒトモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを冑
だ。その後、実施例２と同様の方法により部分精製を行
い、それぞれのモノクローナル抗体が反応する抗原部位
を決定すべく、ＬＰＳ及び熱処理ＬＰＳとの結合性をＥ
ｌ ｒｓＡ法により検討した。
その結果を第２表に示した。 ′（以下余白）
第２表
本表中の数字は基質反応６０分後のＦＬＩＳＡのスコア
ーである。
ーである。
実施例５
緑廃菌敗血症患者の末梢リンパ球を用いて、実施例１の
場合と同様に細胞融合を行ない、スクリーニングにより
Ｈｏｍｍａ ｔｙｐｅ ５にのみ反応するヒトＴＯＡ
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ／Ｉ ｌ
−１１１Ｄ ｉｎを１！Ｖた。／ｌｌ１１１ｒ）１０は
自消型ｔｙｐｅ５０９つの株にはすべて反応した。結果
は第３表に示した。
場合と同様に細胞融合を行ない、スクリーニングにより
Ｈｏｍｍａ ｔｙｐｅ ５にのみ反応するヒトＴＯＡ
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ／Ｉ ｌ
−１１１Ｄ ｉｎを１！Ｖた。／ｌｌ１１１ｒ）１０は
自消型ｔｙｐｅ５０９つの株にはすべて反応した。結果
は第３表に示した。
（以下余白）
第３表
本表中の数字は基質反応３０分後のＥＬＩＳＡのスコア
ーである。
ーである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞とマウスのミエローマ
細胞とを融合させて得られた、抗緑膿菌ヒト抗体を産生
するマウス−ヒトハイブリドーマ及びそれに由来する細
胞株。 ２、産生される抗緑膿菌ヒト抗体が緑膿菌のリポ多糖を
認識する抗体である、特許請求の範囲第１項記載のマウ
ス−ヒトハイブリドーマ及びそれに由来する細胞株。 ３、産生される抗緑膿菌ヒト抗体が、リポ多糖のＯ−多
糖側鎖を認識する抗体である、特許請求の範囲第２項記
載のマウス−ヒトハイブリドーマ及びそれに由来する細
胞株。 ４、産生される抗緑膿菌ヒト抗体が緑膿菌の１型、５型
、７型、８型及び１０型のいずれかの血清型を認識する
抗体である、特許請求の範囲第３項記載のマウス−ヒト
ハイブリドーマ及びそれに由来する細胞株。 ５、産生される抗緑膿菌ヒト抗体がＩｇＧ抗体。 ＩｇＭ抗体又はＩｇＡ抗体である、特許請求の範囲第１
項乃至第４項のうちいずれか１項記載のマウス−ヒトハ
イブリドーマ及びそれに由来する細胞株。 ６、ヒトの抗体産生細胞が扁桃腺又は脾臓から採取され
た細胞である、特許請求の範囲第１項記載のマウス−ヒ
トハイブリドーマ及びそれに由来する細胞株。 ７、ヒトの抗体産生細胞組織から抗緑膿菌抗体を産生す
る細胞を多く含む組織を選別し、次いで該組織の細胞と
マウスのミエローマ細胞とを融合させることを特徴とす
る、抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリ
ドーマの製造法。 ８、増殖せしめた細胞から抗緑膿菌ヒト抗体を得るため
に、増殖用の細胞として、ヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞
とマウスのミエローマ細胞を融合させて得られた、抗緑
膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマ及
び／又は該ハイブリドーマに由来する細胞株を使用する
ことを特徴とする方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59273156A JPS61152281A (ja) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法 |
| PCT/JP1985/000698 WO1986003754A1 (en) | 1984-12-26 | 1985-12-20 | Anti-pseudomonas aeruginosa human monoclonal antibody |
| AU53093/86A AU597877B2 (en) | 1984-12-26 | 1985-12-20 | Anti-pseudomonas aeruginosa human monoclonal antibody |
| DE8686900258T DE3587178T2 (de) | 1984-12-26 | 1985-12-20 | Humaner monoklonaler antikoerper gegen pseudomonas aeruginosagegen pseudomonas aeruginosa produzierende hybridomen. |
| EP86900258A EP0233289B1 (en) | 1984-12-26 | 1985-12-20 | Hybridomas producing anti-pseudomonas aeruginosa human monoclonal antibody |
| AT86900258T ATE86634T1 (de) | 1984-12-26 | 1985-12-20 | Humaner monoklonaler antikoerper gegen pseudomonas aeruginosagegen pseudomonas aeruginosa produzierende hybridomen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59273156A JPS61152281A (ja) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61152281A true JPS61152281A (ja) | 1986-07-10 |
| JPH0355106B2 JPH0355106B2 (ja) | 1991-08-22 |
Family
ID=17523888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59273156A Granted JPS61152281A (ja) | 1984-12-26 | 1984-12-26 | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリド−マ及びその製造法並びにその使用方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61152281A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011102553A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Antibody against serotype i lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5929622A (ja) * | 1982-08-10 | 1984-02-16 | Meiji Seika Kaisha Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその用途 |
| JPS59137497A (ja) * | 1983-01-20 | 1984-08-07 | ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シテイ・オブ・カリフオルニア | 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| JPS61152280A (ja) * | 1984-12-26 | 1986-07-10 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生する形質転換細胞及びその製造法並びにその使用方法 |
-
1984
- 1984-12-26 JP JP59273156A patent/JPS61152281A/ja active Granted
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5929622A (ja) * | 1982-08-10 | 1984-02-16 | Meiji Seika Kaisha Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製造法およびその用途 |
| JPS59137497A (ja) * | 1983-01-20 | 1984-08-07 | ザ・リ−ジエンツ・オブ・ザ・ユニバ−シテイ・オブ・カリフオルニア | 抗原特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| JPS61152280A (ja) * | 1984-12-26 | 1986-07-10 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒト抗体を産生する形質転換細胞及びその製造法並びにその使用方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011102553A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Antibody against serotype i lipopolysaccharide of pseudomonas aeruginosa |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0355106B2 (ja) | 1991-08-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |