JPH0361428B2

JPH0361428B2 -

Info

Publication number: JPH0361428B2
Application number: JP59274659A
Authority: JP
Inventors: Shuzo Sawada; Takashi Kawamura; Yasuhiko Masuyasu; Katsuhiko Tomibe
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1984-12-28
Filing date: 1984-12-28
Publication date: 1991-09-19
Also published as: JPS61155398A

Description

【発明の詳細な説明】

(イ) 産業上の利用分野本発明は、緑膿菌（シユードモナス・エルギノ
ーサ、Pseudomnas aeruginosa）に対するヒト
モノクローナル抗体とその製造法、並びにそれを
有効成分とする緑膿菌感染症の治療剤に関する。
その目的とするところは、緑膿菌感染症の診断及
び治療等に役立つところの、抗緑膿菌ヒトモノク
ローナル抗体を提供することにある。 (ロ) 従来の技術緑膿菌（シユードモナス・エルギノーサ、
Pseudomnas aeruginosa）は本来病原性の低い
菌であるが、最近は、抗生物質の投与による菌交
代性増殖の結果、薬剤耐性緑膿菌による感染症が
増え、しばしば免疫不全、とりわけシステイツク
フアイブローシス（のう胞性線維症）、熱傷、ガ
ン等の患者に発症し重篤な症状を呈するようにな
つている。この感染症においては、緑膿菌が薬剤
耐性をもつていることが多いため、又患者の免疫
力が弱まつている等のため、抗生物質による治療
が必ずしも十分な威力を発揮しないという問題が
ある。従つて、抗緑膿菌抗体によるいわゆる免疫
治療法が考えられ研究されつつあるが、未だ臨床
に供されるに至つていない。また、緑膿菌感染症
の治療を適格に行なうためには、その早期診断が
必要であるが、従来の抗血清を用いる方法は満足
すべき状況にないという問題がある。これらの問
題点を解決するためには、抗緑膿菌モノクローナ
ル抗体が必要である。一方、緑膿菌の表面抗原としては、リポ多糖
（LPS）、外層蛋白（Outer membrane protein，
OMP）、ベン毛、スライム由来の多糖等が知られ
ている。このうちLPSは緑膿菌の血清型を決定す
る０−多糖側鎖を有し、今まで１から16までの16
種類の血清型（Hommaの分類による）が知られ
ている。LPSは０−多糖側鎖の他にコアーリージ
ヨン、リピドＡを有し、リピドＡが緑膿菌の外層
（Outer membrane）にうずもれ、これより２−
ケト−３−デオキシオクトン酸を介してコアーリ
ージヨンが外層外に伸び、コアーリージヨンから
Ｏ−多糖側鎖が更に外側に伸展している。LPSに
対する抗体は、ヒトや動物において作られやす
く、感染防御的に働く事が知られている。抗LPS
抗体は、緑膿菌のLPSと結合し、この抗原抗体複
合体に補体が結合し、免疫溶菌を受けるか、もし
くは多形核白血球などの食細胞により処理され、
生体が緑膿菌感染症から免れる事ができると言わ
れている。緑膿菌の感染が成立している患者で
は、緑膿菌抗原が多く、抗LPS抗体が不足になり
がちである。これを防ぎ治療するために、従来か
らヒトの血液から調製したIgG製剤が使われてき
たが、その製剤に含まれている緑膿菌の抗体価は
極めて少なく、感染治療上十分ではなかつた。ところで、細胞融合の技術を用いて、特異的な
抗体を産生するがやがては死滅する運命にあるリ
ンパ球又はＢ細胞（抗体産生細胞）と、培養器の
中で永久に増殖しつづけるミエローマ細胞（骨髄
腫細胞）を融合させることにより、特異抗体を永
続的に産生分泌するハイブリドーマ（融合細胞）
株を樹立させる方法は公知である。かかる方法に
よつて作成されたハイブリドーマが産生するモノ
クローナル抗体は、高い精度と信頼度をもつ純粋
な化学試薬として、検査試薬や標識試薬、アフイ
ニテイークロマトグラフイーなどに応用ができる
他、各種疾病の治療薬、予防薬としての応用も期
待できるものである。モノクローナルな抗緑膿菌抗体を得ようとする
場合には、抗緑膿菌抗体産生細胞とミエローマ細
胞とを融合させ、クローニングによつて抗緑膿菌
抗体産生性のハイブリドーマを得ればよいことは
一般論としては知られている。そして、具体的に
は、例えば、特開昭59−29622号公報には、緑膿
菌のLPSで免疫されたBALB／Ｃマウスの脾臓細
胞（抗体産生細胞）と、マウスのミエローマ細胞
（P3−Ｘ 63−Ag ８−U1株）とを融合させハイ
ブリドーマを得、これをクローニングすることに
よつて、モノクローナルな抗緑膿菌マウス抗体を
産生するマウス−マウスハイブリドーマを得たこ
と、そして得られたマウスモノクローナル抗体
は、緑膿菌感染に防御効果を示したことが開示さ
れている。 (ハ) 発明が解決しようとする問題点以上のごとく、抗緑膿菌抗体に関しては、具体
的な成功例は抗緑膿菌マウスモノクローナル抗体
だけである。しかし、ヒトの病気の診断や治療の
ためには、同種タンパクである抗緑膿菌ヒト抗体
の方が有用でかつ安全であり、そのためには、ヒ
トの抗体産生細胞を用いてマウス−ヒトハイブリ
ドーマやヒト−ヒトハイブリドーマを樹立する必
要がある。しかしながら、動物の場合と異なり、
ヒトの場合には、ヒトをあらかじめ多量の緑膿菌
やその表面抗原で免疫し、有効に刺激された抗体
産生細胞を採取して細胞融合に用いるといつた方
法をとるわけにはいかないので、適切な抗体産生
細胞の採取・調整が困難であるといつた問題等が
あり、未だ明確な成功例の報告がない。 (ニ) 問題点を解決するための手段（その一）本発明者らは、抗緑膿菌ヒト抗体を得るため
に、マウス−ヒトハイブリドーマに関し鋭意研究
を行なつた結果、細胞融合法と形質転換法によつ
て、特定の抗緑膿菌抗体を得ることができた。即ち、本発明は、緑膿菌の血清型が１型、５
型、７型、８型及び10型のいずれかである緑膿菌
のリポ多糖のＯ−多糖側鎖を認識する性質を有す
るヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞とのマウス−ヒトハイブリドーマ由来の
抗緑膿菌ヒトモノクローナルIgG抗体である。かかるモノクローナル抗体、ヒトの抗緑膿菌抗
体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とのマウス
−ヒトハイブリドーマを作成し、該ハイブリドー
マ及び／又はそれに由来する細胞株を培養し、培
養物から緑膿菌のリポ多糖に結合する性質を有す
るヒトモノクローナル抗体を採取する方法によつ
て得られる。本発明においてヒトの抗体産生細胞とは、ヒト
のリンパ球（又はＢ細胞）であつて、抗体を分泌
している又は分泌する能力を持つた細胞をいう。
これは脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、ア
デノイド等の細胞の中に含まれている。本発明の
目的のためには、いかなるソースのリンパ球でも
用いることができるが、好ましいのは扁桃腺又は
脾臓から採取されたものである。マウスのミエローマ細胞としては、８−アザグ
アニン耐性株を用いるのが有利であり、公知のも
のとしては、BALB／ＣマウスのP3−X63−
Ag8、P3−X63−Ag8−U1、P3−NS1／１−
Ag4−１、P3−X63−Ag8−６，５，３、SP2／
Ｏ−Ag14、FO、MPC11−45.6TG1.7などがあ
る。本発明においては、まず、抗原である特定の
LPSを有する緑膿菌を選ぶ。次にヒトのリンパ球
を扁桃腺、リンパ節、脾臓及び末梢血等の組織か
らモノヌクリアーセル（単核細胞）として調整す
る。このモノヌクリアーセルを５日〜７日、ポー
クウイードマイトジエン等のマイトジエンの添加
もしくは無添加の条件下で、５％CO₂インキユベ
ーターで培養し、その培養上清液中の抗体を、前
記緑膿菌を固定したプレートで酵素抗体法により
測定し、望ましいモノクリアーセルを含む組織を
選ぶ。次いで、この組織のリンパ球とミエローマ
細胞を融合させ、ハイブリドーマの異質集落を形
成させる。細胞融合は公知の方法で行なうことが
できる。例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞
融を10：１〜１：10、好ましくは１：１〜１：３
の比率で混合し、適当な細胞融合用溶液、例えば
約35％ポリエチレングリコール（分子量1000〜
6000程度）および約7.5％ジメチルスルホキシド
を含むRPMI1640を加えて、室温〜37℃で１〜数
分間撹拌し、その後10％FCS加RPMI1640で徐々
に希釈し、洗浄の後HAT（ヒポキサンチン−ア
ミノプテリン−チミジン）選択培養液にて細胞濃
度が１〜５×10⁵個／mlとなるように調整する。
これを0.2mlずつ、例えば96穴プレートに分注し、
５％CO₂を含む空気中で35〜38℃で２〜３時間培
養する。HAT培養液中ではハイブリドーマのみ
が存在し、８−アザグアニン耐性のミエローマ細
胞及びミエローマ同士の融合細胞は生存し得ない
（未融合の抗体産生細胞は数日で死滅する。）次
に、このハイブリドーマ集落から、緑膿菌LPSに
対し特異的なヒトモノクローナル抗体を分泌する
ものだけ選別する。この選別工程スクリーニング
は、異なるハイブリドーマより産生されたヒトモ
ノクローナル抗体を、目的とする血清型を有する
緑膿菌又は緑膿菌LPSを固定したプレートを用い
て、酵素抗体法を用いて行なう事ができる。全て
の緑膿菌の血清型に反応するヒトモノクローナル
抗体を得る為には、16種類の異る血清型の緑膿菌
を使用しなくてはならない。これらの緑膿菌は、
アメリカン・タイプカルチヤーコレクシヨン
（ATCC）から入手できる。目的とする緑膿菌に対するモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマは、次にクローニング
によりクローン化細胞にしなくてはならない。こ
の工程は、具体的には軟寒天法を用い行う事がで
きる。約２〜３週間後、軟寒天中で生育したコロ
ニーを拾い、再び酵素抗体法で緑膿菌に対する抗
体活性を調べ選別する。選別したハイブリドーマ
を培養して、所望のLPS特異的ヒトモノクローナ
ル抗体を生成させる。モノクローナル抗体を得るためのもう一つの方
法は、ヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞をエプスタイ
ン・バー・ウイルス（Epstein−Barr Virus、以
下Ｅ−Ｂウイルスと略称する）を感染させて形質
転換細胞を作成し、該形質転換細胞及び／又はそ
れに由来する細胞株を培養し、培養物から緑膿菌
のリポ多糖に結合する性質を有するヒトモノクロ
ーナル抗体を採取する方法である。Ｅ−Ｂウイルスは、バーキツトリンパ腫や鼻咽
頭ガンの原因ウイルスとされている、ヘルペスウ
イルス群に属するウイルスである。前記と同様な
ヒトのリンパ球のモノヌクリアーセルをＥ−Ｂウ
イルスに感染させ、約２〜３週間、５％CO₂イン
キユベータで培養し、多くの異質集落から成る形
質転換細胞（トランスフオームドセル）を形成さ
せる。次に、この形質転換細胞から、緑膿菌LPS
に対し特異的なヒトモノクローナル抗体を分泌す
るものだけを、前記と同様な方法で選別する。そ
して、前記と同様にして、クローン化された形質
転換細胞を得ることができる。次に、本発明においては、選択したハイブリド
ーマ又は形質転換細胞を培養して、所望の特異的
ヒトモノクローナル抗体を生成させる。クローニングによつて選択された、抗緑膿菌ヒ
ト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマ又
はヒト形質転換細胞は凍結して保存することがで
き、また、これを適当な方法で大量に培養するこ
ともできる。そして、培養上清から緑膿菌LPSに
特異的に結合するモノクローナルな抗緑膿菌ヒト
抗体を得ることができる。また、かかる細胞を動
物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清から抗緑
膿菌ヒト抗体を得ることもできる。抗緑膿菌ヒト
抗体の精製は、モノクローナル抗体を用いるアフ
イニテイクロマトグラフイー等の方法によつて行
なわれる。 (ホ) 作用抗緑膿菌LPSヒトモノクローナル抗体は、緑膿
菌LPSに特異的に結合して補体により緑膿菌を免
疫溶菌させる。また、緑膿菌感染マウスモデル実
験の系でマウスを感染から防御することもでき
る。本発明のヒノモノクローナル抗体は、互いに混
合され、緑膿菌の全ての16種の血清型に結合させ
る事ができる。抗緑膿菌LPSヒトモノクローナル
抗体は、血清型特異的に結合し、感染モデル実験
系で感染防御能を発揮する。すなわち、ある血清
型に特異的なヒトモノクローナル抗体は、同じ血
清型の緑膿菌には、100％結合し得るが、異る血
清型の緑膿菌には全く結合できない。従つて、各
ヒトモノクローナル抗体を混ぜ合せる事により、
現在わかつている全ての血清型の緑膿菌に結合せ
しめる事ができる。 (ヘ) 問題点を解決するための手段（その二）本発明の緑膿菌のリポ多糖を認識する性質を有
する抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体は、他の通
常の医薬助剤と共に医薬製剤とすることができ、
これはヒト及び動物の緑膿菌感染症の治療剤とし
て用いられる。かかる製剤においては、全ての血
清型に対応するモノクローナル抗体を混合するこ
とは必ずしも必要ではなく、少なくとも血清型が
１型、５型、７型、８型及び10型の緑膿菌に対す
る抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体を含む製剤と
すれば、緑膿菌感染症の70％以上を治療すること
ができる。本発明のヒトモノクローナル抗体の投与方法は
個々の状況たとえば処置すべき緑膿菌感染症の状
況により変化し、同様に投与量及び投与の頻度に
応じて変化する。一般に、抗体は投与前に非毒性
の医薬上許容し得るキヤリア物質、例えば、通常
の食塩水と混合され、任意の医療上適当な方法、
例えば、静脈投与によつて投与される。一般に、
抗体はキヤリア中に約0.5μｇ抗体／ml〜500μｇ抗
体／mlの濃度で存在させる。１回の投与する抗体
の量は、一般に体重１Kg値り10μｇ〜10mgの抗体
の範囲である。或る場合には、１回以上の一連の
投与が必要とされる。 (ト) 実施例以下、実施例により本発明を詳述する。実施例１ (1) 抗緑膿菌抗体産生細胞の選別８人の扁桃炎患者より８ロツトの扁桃腺を
得、これよりフアイコールパツクを用いモノヌ
クリアーセルを調製した。細胞濃度が５×
10⁶／mlになる様に、モノヌクリアーセルを培
養液Ａ（RPMI1640＋10％胎児牛血清＋2mMグ
ルタミン＋1mMピルビン酸＋0.02mg／mlセリ
ン＋80μｇ／mlゲンタマイシン）に浮遊させ、
これに、ポークウイードマイトジエン
（PWM）を20μｇ／mlになる様に加えた。この
試料を200μづつ培養プレートに入れ、CO₂イ
ンキユベータ（５％CO₂）で６〜７日培養し
た。その後、それぞれの培養上清液100μを
緑膿菌をコートしたプレートに移し、酵素抗体
法で測定を行つたところ、１ロツトだけ強く抗
緑膿菌抗体を産生していた。このロツトのモノ
ヌクリアーセルを、マウスミエローマ細胞P3
−Ｘ 63−Ag8−UI（以下P3UIと略記する）と
の細胞融合に用いた。 (2) 細胞融合前もつてP3UIを培養液Ａ中で培養しておい
た。使用時の細胞濃度は６×10⁵個／mlであつ
た。上記の抗緑膿菌抗体産生がすぐれていた扁
桃腺ロツトのリンパ球とP3UIを、それぞれ
別々に無血清RPMI1640で２回洗浄し。そし
て、リンパ球と５×10⁶個のP3UIとを試験管の
中で一緒にし、次いで1500rpmで５分間遠心
し、上清を捨てた。細胞ペレツトを、試験管に
たたくことによつて、よく分散させた。これに
0.5mlのポリエチレングリコール液
（RPMI1640 75ml×ポリエチレングリコール
1500 3.5ml＋ジメチルスルホキサイド0.75ml）
（PEG液と略記する）を加えて、細胞をゆるや
かに浮遊させた。１分後に0.5mlのRPMI1640
を加え、さらに１分後に１mlRPMI、さらに２
分後に４mlのHAT培養液（RPMI1640＋20％
胎児牛血清＋80μｇ／mlゲンタマインシン＋
95μMヒポキサンチン＋0.4μMアミノプテリン
＋1.6μMチミジン）、さらに２分後には４mlの
HAT培養液を加えた。最後に、HAT培養液
で25ml細胞浮遊液とした。これを培養プレート
（96穴）１枚に蒔いて、37℃、５％CO₂含有空
気中で培養した。一週間毎に半量の培養液を新
しいHT培養液（HATからＡを除去したもの）
で交換していきハイブリドーマを得た。 (3) クローニング及び培養得られたハイブリドーマの上清をホルマリン
死滅緑膿菌をコーテイングしたプレートを用い
てELISA法で測定を行つた結果、緑膿菌血清
型Hommaのtype5に結合するヒトモノクロー
ナル抗体P3を得た。そこで、P3を産生するハ
イブリドーマを、２回限界希釈法によりクロー
ニングを行い（96穴プレート２枚）最終的に
P3D9というヒトモノクローナル抗体（IgG、
λ）を産生するマウス−ヒトハイブリドーマを
得た。本ハイブリドーマを、無血清培地RDF／
TES培地（Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.79、
1158−1162参照）１で培養を行い、P3D9を
含む培養液を限外濾過膜PM30（アミコン社製）
を用いて濃縮を行い、30mlとした。そして
DEAE−Sephacelでカラムクロマトを行い、
P3D9を精製し12mgを得た。 (4) モノクローナル抗体の感染防御効果 P3D9の感染防御効果を調べるため、緑膿菌
臨床分離株Ｎ−２及び97が選ばれた。Ｎ−２の
血清型は、Homma type5で、97のそれは
Homma type7であつた。４週令のICRマウス（雄、体重16〜20ｇ）に
２又は4LD50のＮ−２株又は97株を腹腔に投与
した。（一群10匹）そして、１時間後に、10μ
ｇ又は1μｇのP3D9を腹腔内に投与した。ポジ
テイブコントロールとして、ヒト血清から精製
したIgGを腹腔内に投与した。ネガテイブコン
トロールとして、生理食塩水を同量投与した。
５日間観察後の結果を第１表に示した。

【表】＊生存数／測定数を示す
第１表から、本発明のヒトモノクローナル抗
体P3D9は、緑膿菌のＮ−２株（Homma
type5）に特異的な感染防御効果を示すことが
わかる。実施例２ (1) ヒトの脾細胞を用いる以外は、実施例１の場
合と同様にして、抗体産生細胞の選別及び細胞
融合を行なつた。得られたハイブリドーマの上
清を、ホルマリン死滅緑膿菌をコーテイングし
たプレートを用いてELISA法で測定を行つた
結果、緑膿菌血清型Homma type2、Homma
type7、Homma type13のいずれとも結合する
ヒトモノクローナル抗体B8を得た。B8を産生
するハイブリドーマを、２回限界希釈法により
クローニングを行い、B8E2というヒトモノク
ローナル抗体（IgG、λ）を産生するマウス−
ヒトハイブリドーマを得た。本ハイブリドーマを、10％FCSRPMI16401
で培養を行い、B8E2を硫安沈澱（50％飽和）
により回収した。DEAE−Sephacelで部分精
製を行つた。ヒトIg量は、一元平板免疫拡散法
（SRID）により定量を行い、８mgのB8E2を含
む抗体溶液を得た。本モノクローナル抗体は、
Homma type2、Homma type7及びHomma
type13から、Johnson and Perry（Can.J.
microbiol 1976 vol22：29−34の方法により抽
出したLPS及びその熱処理（100℃−30分）
LPSをコーテイングしたプレートを用いた
ELISA法で、それぞれのLPSに結合する事が
確められ、LPSを認識するモノクローナル抗体
である事がわかつた。 (2) モノクローナル抗体の感染防御効果 B8E2の感染防御効果を実施例１の場合と全
く同様にして、緑膿菌臨床分離株Ｎ−２
（type5）と97（type7）を用いて行ない、結果を
第２表に示した。

【表】

【表】第２表より、本発明のヒトモノクローナル抗
体B8E2は、緑膿菌の97株（type7）に特異的に
感染防御効果を呈していることがわかる。実施例３ヒトの扁桃腺細胞を用い、実施例１の場合同様
にして、抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行な
つた。得られたハイブリドーマの上清を、ホルマ
リン死滅緑膿菌をコーテイングしたプレートを用
いてELISA法で測定を行つた結果、緑膿菌血清
型Homma type1に結合する31−７、同type7に
結合する31−８、同type8に結合する31−９、及
び同type10に結合する31−12を得た。これらのヒ
トモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を、限界希釈法及び軟寒天法により２回クローニ
ングを行い（96穴プレート５枚）それぞれ31−７
−2A、31−８−5G、31−９−F4、31−12−H3
のヒト型IgGを産生するハイブリドーマを得た。かかるハイブリドーマを実施例２と同様の方法
で培養し、部分精製を行い、それぞれのモノクロ
ーナル抗体が反応する抗原部位を決定すべく、
LPS及び熱処理（100℃×2hr）LPSとの結合性を
ELISAにより実施した。その結果を第３表に示
した。（反応時間は60分）。

【表】第３表から、ヒトモノクローナル抗体はそれぞ
れ特異なLPSに結合していることがわかる。実施例４実施例１〜３で得られたマウス−ヒトハイブリ
ドーマが産生するヒトモノクローナル抗体の、緑
膿菌シユードモナス属の菌株及び腸内細菌科グラ
ム陽性の菌株に対する、結合スペクトラムを
ELISA法で測定した。その結果を第４表に示し
た。

【表】第４表から、ヒトモノクローナル抗体は緑膿菌
血清型特異性を有することがわかる。実施例５抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体P3D9、
B8E2、31−７−2A、31−８−5G、31−９−F4、
31−12−H3の同一血清型の緑膿菌に対する結合
性をELISA法で測定した。その結果を第５表に
示した。表からそれぞれのモノクローナル抗体
が、同一血清型の緑膿菌と100％完全に反応して
いることがわかる。

【表】

【表】実施例６ 10Hμｇ／ml濃度のP3D9の0.5mlを２×
10⁶CFU／ml濃度の緑膿菌Ｎ−２（type5）の0.5ml
及び２×10⁶CFU／ml濃度緑膿菌Ｏ−64（type6）
の0.5mlとそれぞれ混ぜ合せ、該当菌株で吸収を
行つたモルモツト生補体を0.2ml加え、37℃で培
養した。そして、30分、１時間、２時間毎に0.3
mlづつサンプリングし、HIA培地上で生育させ
てコロニー数を測定した。結果を第６表に示し
た。

【表】 P3D9はtype5のＮ−２のみを選択的に攻撃して
いることがわかる。実施例７ヒトの扁桃腺細胞を用いて、実施例１の場合と
同様に抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行つ
た。得られたハイブリドーマの上清をホルマリン
死滅緑膿菌をコーテイングしたプレートを用い
て、第２次抗体をヤギ抗ヒトIgM抗体（アルカリ
フオスフアターゼ標識）として、ELISAを行つ
た結果、血清型がHomma type5、type7、type8
に反応するIgM型ヒトモノクローナル抗体が得ら
れた。これらのヒトモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマを、限界希釈法及び軟寒天法に
より２回クローニングを行い、それぞれ、313−
ａ、313−ｂ、313−ｃのヒトモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマを得た。その後、実施
例２と同様の方法により部分精製を行い、それぞ
れのモノクローナル抗体が反応する抗原部位を決
定すべく、LPS及び熱処理LPSとの結合性を
ELISA法により検討した。その結果を第７表に
示した。

【表】実施例８緑膿菌敗血症患者の末梢リンパ球を用いて実施
例１の場合と同様に細胞融合を行ない、スクリー
ニングによりHomma type5にのみ反応するヒト
IgAモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ4H11D10を得た。 4H11D10は血清型がtype5の９つの株にはすべ
て反応した。結果は第８表に示した。

【表】実施例９健常人より10mlのヘパリン加静脈血を入手し
た。これから、フイコールパツク液で処理し、リ
ンパ球画分を含むモノヌクリアーセルを単離し
た。このモノヌクリアーセル５×10⁶個に、B95
−８株の培養上清中に含まれるＥ−Ｂウイルス
（トランスフオーメーシヨンドース50TD50＝
10⁵／ml）をm.o.i（感染の多重性）を0.1として感
染させた。次いで、２×10⁵／mlになる様に、20
％FCS RPMI培地で希釈を行い、その100μづ
つを96穴平底プレートに入れ、約２週間CO₂イン
キユベータで培養を行つた。生育した形質転換細
胞の培養上清液を、緑膿菌コーテイングしたプレ
ートでELISA法によりアツセイした結果、
Hommaの血清型１，４，５のそれぞれの菌株に
反応する上清液を産生する形質転換細胞が選別さ
れた。軟寒天培養でこれらの細胞をクローニング
し、第９表のような抗緑膿菌ヒトモノクローナル
抗体を産生する形質細胞株を樹立した。

【表】い、インヒビシヨンテストで決定した。
実施例 10 実施例１とは異る健常人よりヘパリン加静脈血
を入手した。実施例９と同じ方法で、抗緑膿菌ヒ
ト−モノクローナル抗体を産生するＥ−Ｂウイル
ス形質転換ヒト細胞をクローニングした。その結
果を第10表に示した。

【表】インヒビシヨンテストで決定した。
Homma標準血清型６型、10型のそれぞれの菌
株に反応するモノクローナル抗体を産生する形質
転換ヒト細胞株が樹立できた。また、SE11株は、
２型、７型、13型のいずれにも反応するというブ
ロードな性質を示した。実施例 11 異る健常人よりヘパリン加血静脈を入手した。
実施例９と同じ方法で、抗緑膿菌ヒトモノクロー
ナル抗体を産生するＥ−Ｂウイルス形質転換細胞
をクローニングした。そのクローニング細胞株の
性状を第11表に示した。

【表】インヒビシヨンテストで決定した。
実施例 12 扁桃腺細胞をヒト扁桃腺より調製し、実施例９
と同じ方法で、抗緑膿菌ヒトモノクローナル抗体
を産生するＥ−Ｂウイルス形質転換細胞４−3D8
をクローニングした。４−3D8はIgMで、
Homma標準血清型type5とのみ反応した。次に、血清型がtype5に属する緑膿菌８株との
結合特異性を調べたところ、第12表に示したよう
に、８株中８株に反応した。

【表】実施例 13 緑膿菌Ｏ−64株（Homma type6）をICRマウ
ス（４週令、雄、一群５匹）の腹腔に４×10⁷個
（2LD50）感染後１時間して、実施例10で得られ
た形質転換細胞SE10より粗精製（硫酸アンモニ
ウム沈澱）したモノクローナル抗体（MCA−
SE10）を投与し、感染防御が成立するかどうか
調べた。SE10の産生する抗体量は、シングルラ
デイアルイミユノデイフユージヨン法により算出
した。コントロールモノクローナル抗体として、
実施例12のtype5に反応する４−3D8（MCA−４
−3D8）を用いた。結果を第13表に示した。

【表】＊マウスの生存率

Claims

【特許請求の範囲】１緑膿菌の血清型が１型、５型、７型、８型及
び10型のいずれかであつて、該緑膿菌のリポ多糖
のＯ−多糖側鎖を認識する性質を有するヒトの抗
緑膿菌抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞と
のマウス−ヒトハイブリドーマ由来の抗緑膿菌ヒ
トモノクローナルIgG抗体。２ヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞とマウスのミエ
ローマ細胞とのマウス−ヒトハイブリドーマを作
成し、該ハイブリドーマ及び／又はそれに由来す
る細胞株を培養し、培養物から緑膿菌の血清型が
１型、５型、７型、８型及び10型のいずれかであ
つて、該緑膿菌のリポ多糖のＯ−多糖側鎖に結合
する性質を有するヒトモノクローナルIgG抗体を
採取することからなる、抗緑膿菌ヒトモノクロー
ナルIgG抗体の製造法。３緑膿菌の血清型が１型、５型、７型、８型及
び10型いずれかであつて、該緑膿菌のリポ多糖の
Ｏ−多糖側鎖を認識する性質を有するヒトの抗緑
膿菌抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞との
マウス−ヒトハイブリドーマ由来の抗緑膿菌ヒト
モノクローナルIgG抗体を有効成分とする緑膿菌
感染症治療剤。