JPS59186925A - カンジダ菌感染症治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、カンジダ菌に対する抗体産生細胞とインビト
ロにおいて長期継代培養可能な細胞との間の融合細胞（
以下、ハイブリドーマと称する）より分泌される抗体、
その誘導体またはその限定分解物を含有するカンジダ菌
症の治療剤や予防剤およびその方法に関する。

ここでいう抗体の誘導体とは、該抗体に抗真菌剤を化学
的に結合させた生成物であり、抗体の限定分解物とは、
該抗体を化学的処理または酵素処理によって限定分解し
て生ずる分解物であって、これら自身も本発明に包含さ
れる。

近年、細菌による感染症は予防医学の発達と抗生物質の
普及によって著しく減少してきたが、真菌による疾患は
世界的にかえって増加の傾向にある。これらの多くは通
常の環境下に常在している菌であり、健康者の口腔、消
化管、咽頭、皮虞、膣などに存在しており、真菌症とし
ては心内膜炎、肺炎、尿路疾患、髄膜炎、骨、関節疾患
および皮５− 膚疾患等が報告されている。真菌症はまた、結核や癌な
ど慢性消耗性疾患に併発して著しく症状を悪化させるこ
とも知られている。一方、真菌症に有効な抗生物質等の
治療剤は少なく、その副作用は強い。したがって、真菌
症に有効な治療剤が切望されている。

カンジダ菌は、このような真菌の代表的なものの１つで
あり、本発明の抗体およびその組成物は、上記のような
要請のあるカンジダ症の治療剤として極めて有効な手段
を提供するものである。

従来、真菌症の治療剤にはアムホテリシンＢや５−フル
オロサイトシンを中心とした抗真菌剤が用いられていた
が、真菌のこれら薬剤に対する感受性は一般に低く、し
かも副作用が強く、必ずしも満足すべき結果は得られて
いなかった。

一方、抗体を治療に用いる方法として、感染症などに対
し、ヒトガンマグロブリン製剤の投与が　　− 行なわれているが、特に免疫操作等を行なっていないた
め、製剤中に占める起炎菌に対する特異抗体の含量は低
いと考えられ、その効果は限られていた。免疫操作を行
なって目′的とする抗体の力価を高めた抗体液を用いる
治療法としては、従来よりヘビ毒などによる急性中毒に
対する血清療法が行なわれていた。この療法は著効を示
すが、特異抗体以外に多くの不純物を含むウマ等の異種
血清を投与するため、異種抗原に対する免疫反応が惹起
され、再度の使用に際して異種抗原に対するアレルギー
反応を起こしたり、効果が減弱することが予想され、真
菌症の治療法としては用いられていなかった。

本発明者らは、治療目的に使用可能な抗カンジダ菌抗体
について研究を重ねた結果、カンジダ菌に対する抗体産
生細胞とインビトロにおいて長期継代培養可能な細胞と
の間のハイブリドーマにより分泌される抗体がこの目的
に使用できることを見出し、更にそれらを用いたカンジ
ダ症の治療、予防剤について検討を重ねた結果、本発明
を完成するに至った。

本発明の方法を適用できる感染症は、カンジダ症であれ
ばよく、尿路、肺、腎臓などその部位は問わない。たと
えば次のような起炎菌が例示でき（ｒｕｓｅｉ　０ また、本発明の方法に使用できる抗体も、カンジダ菌に
対する抗体産生細胞と４２１１〜口において長期継代培
養可能な細胞との間のハイブリドーマより分泌される抗
体で、カンジダ菌に反応すればいずれでもよくζたとえ
ば後記表−１に示すようなハイブリドーマによって分泌
される抗体が例示できる。本発明の抗体は、単一の特異
性を右し、単一の分子種からなり、タンパク質当りの力
価は極めて高い。さらに、抗原に対する高度に特異的な
反応性のために、あらかじめ投与対象とする動物（ヒト
を含む）の組織との反応性を調べて交叉反応しないもの
を選ぶことにより、宿主組織に対する抗体の攻撃に由来
する副作用をほとんどなくすことができる。また、物質
としての純度の高さの故に、従来の血清療法にありがち
であった夾雑物質に由来するアレルギー反応等の出現頻
度も低下する。

本発明に使用する抗体は例えば以下の方法で製造される
。

Ａ、抗体産生細胞の調製　〜 本発明のハイブリドーマおよび抗体を得る為には、カン
ジダ菌に対する抗体産生細胞とインビトロにおける長期
継代培養可能な細胞を必要とする。

両者の融合により、カンジダ菌に対する抗体を産生じ、
しかもインごトロにおいて長期継代培養可能なハイブリ
ドーマを）与ることができるわｔづである。

カンジダ菌に対する抗体産生細胞は、ヒトを含めたいず
れの動物種から得てもよく、また、あらかじめ免疫を行
なうことは必須ではないが、これを行なうことによって
目的とするハイブリドーマの採取効率を著しく上げるこ
とができる。

ヒトの細胞を用いる場合には、カンジダ感染症の病歴の
ある者や、血清中のカンジダ菌に対する抗体価が高い者
を選ぶことができる。人為的に免疫した生体から得よう
とする場合、免疫原としては、生菌またはグルタルアル
デヒド処理、マイトマイシン処理もしくＩ＾加熱処理な
どによって増殖性を失わせた菌体を用いてもよく、また
菌体より表面抗原を酵素処卵などの適当な方法で分１［
製したものを用いてもよい。また菌種としては次に挙げ
る菌種の中から選ぶことができる。菌糸、酵母、厚膜胞
子などその形態はいずれでもよい。

免疫に際し、フロイント完全または不完全アジュバント
のような助剤を免疫原に混合して用いることができる。

免疫の際の免疫原投与法は皮下注射、腹腔内注射、静脈
内注射、皮肉注射、筋肉内注射等いずれでもよいが、皮
下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１回、また
は適当な間隔、好ましくは１週乃至５週をおいて繰り返
し行なってもよい。免疫した動物の血清中のカンジダ菌
に対する抗体価を測定し抗体価が充分高くなった動物か
ら抗体産生細胞を得れば、その後の操作の効率を上げる
ことかできる。融合には最終免疫後３〜５日後の動物由
来の抗体産生細胞を用いるのが好ましい。該抗体産生細
胞は形質細胞およびその前駆細胞であるリンパ球であり
、これは個体のいずれの部位から得てもよいが、一般に
は牌臓、リンパ節、末梢血またはそれらの組み合わせか
ら得ることができる。

Ｂ、靴濃」１℃ インビトロにおいて長期継代培養可能な細胞は、抗体産
生細胞と融合して目的にかなったハイブリドーマを生ず
るものであればいずれぐもよいが、その確率の高いのは
骨髄腫等の白血病細胞である、由来の秤もヒト、ラット
、マウス等いずれでもよい。後述するように、融合後混
在する親細胞を除くためにはヒポキサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ欠損株細胞またはチミ
ジンキナーゼ欠損株細胞を用いるのが好ましい。

例えば、ヒト由来の（Ｊ−１５００６ＴＧ−ＡＩ−２゜
ＲＰＭＩ８２２６、マウス由来のｐ　３−Ｘ　６３−Δ
ｇ８．　Ｐ３−Ｎ　Ｓ　Ｉ　／１−Ａ！１１４−１．　
Ｓ　ｐ２１０−Ａｏ１４．Ｘ６３−　Ａ（＋８．６５３
などを用いることができる。

上述の抗体産生細胞の由来する種と長期継代培養可能な
細胞の由来する種は同一であることが不可欠ではないが
、融合の効率、融合後の細胞の性質の安定性、生体内で
培養する際の簡便さなどの点から一般には同一のものを
用いる方が有利である場合が多い。特に長期継代培養可
能な細胞としテマウス由来（７）Ｐ３−Ｘ６３−ＡＣＩ
８．　Ｐ３−ＮＳ　Ｉ／１−八０４−１．５ｒ１２１０
−Ａ（１１４またはＸ　６３−　Ａ　ｇ８．６５３を用
いる場合には、同系マウスであるＢＡＬＢ／ｃまたはそ
の交雑マウスを用いるのが有利である。

＝１３− 融合に際してはセンダイウィルス、ポリエチレングリコ
ール等の融合促進剤を用いるのがよく、特にポリエチレ
ングリコール１０００，１５４０，２０００゜４０００
または６０００などを用いるのが好ましい。これを約３
０〜５５％含む溶液中で融合を行なわせる。助剤として
更にジメヂルスルホキシドを添加してもよい。

Ｃ，ハイブリドーマの樹立 融合後の混合物中には、ハイブリドーマの他、親細胞で
ある抗体産生細胞とインビトロで長期継代培養可能な細
胞等が残存している。前者は通常長期間のインビトロの
培養に耐えられないので問題はないが、後者は目的とす
るハイブリドーマと共に増殖する可能性があるのでこれ
を除くことが望ましい。このため後者として、ヒポキサ
ンヂングアニンホスボリボシルトランスフエラーゼまた
はチミジンキナーゼ欠損株細胞を用い、融合させ１４− た後、ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン
を含む培地中で培養する。これによりハイブリドーマの
みを選択的に生育させることができる。親細胞としてヒ
ポキサン°チングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼまたはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用いない場合
には、融合に先だって該細胞をエメヂンおよびアクチノ
マイシンＤで処理して細胞の増殖性を失わせておくこと
により、ハイブリドーマを親細胞との混合物から選択し
てもよい。

このようにして得たハイブリドーマ群は、一般には２個
以上のクローンを含むことが多く、完全に同一の性質を
右する細胞の集団ではない。個々のクローンを分離した
い場合には、クローン化を行なうことが必要である。ク
ローン化は、単一の特異性をもつ抗体を製造する為には
勿論であるが、多種類のクローンが混在する系において
長期間培養を行なっている間にしばしば起こるポピユレ
ーションの変化を防ぐ意味からも有効であり、行なうこ
とが望ましい。クローン化の方法としては、限界希釈法
、軟寒天法、フィブリンゲル法等を用いることができる
。また螢光活性化細胞選別装置を用いてクローン化の際
の細胞の分離を行なうことも可能である。また、長期間
培養の間に起こる変異株の出現に対し、時々クローン化
を行なうことで元の細胞の性質をもった細胞を保存する
ことができる。

以上のような製造法に従って作製したカンジダ菌に対す
る抗体を産生ずるハイブリドーマの例として、後述の実
施例にも示すように、ＣＤ−１，ＣＤ−２，ＣＤ−３，
ＣＤ−４，Ｃｒ）−５，ＣＤ−６，ＣＤ−７゜ＣＤ−８
およびＣＤ−９が挙げられる。

ハイブリドーマの維持法としては、インビトロおよびイ
ンビボで継代する弛に常法に従って凍結保存することが
できる。

Ｄ、抗体の製造 抗体の製造にあたっては、カンジダ菌に対する抗体を産
生ずるハイブリドーマをインごトロまたは生体内で培養
する。

インビトロの培養の場合には、本発明のハイブリドーマ
のために適当な栄養培地、例えば１０％（Ｖ／Ｖ）の牛
胎児血清、５ｘ１０　　Ｍのβ−メルカプトエタノール
、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび抗生物質を含有
したＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０培地を用いることができる
。ＲＰＭＴ１６４０培地に代えて、４．５（＋／Ｌのグ
ルコースを含む１）ｕｌｂｅａｃｏ　ｓｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ　　Ｅ　ａｇｌｅ’ｓ　　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（以下、［）
　ｕ　ｌ　ｂｅｃｃＯｓＭＥＭと略す）培地を用いても
よい。細胞を増殖させる時適当な初期濃度は、各々のハ
イブリドーマによって異なるが、一般に約１０　　個／
ｍｌであり、培養中の細胞濃度は２Ｘ１０’個／ｍｌを
超えないこ１７− とが望ましい。

本発明のハイブリドーマを生体に移植して、固型または
腹水τｊで増殖させ、その生体より体液、望ましくは血
清または腹水を採取することにより、該ハイブリドーマ
が分泌する抗体を製造することもできる。この方法によ
って得られる粗製抗体液は、不純物として宿主となった
生体由来の種々の物質を含むという欠点をもつ一方、生
体外の培養によって得られる抗体液に比べて著しく高濃
度の目的抗体を含むという点で優れている。ハイブリド
ーマを腹腔に移植して増殖させる場合においては移植の
前、好ましくは３〜９週間前にブリスタン（２，６，１
０，１４−テトラメヂルペンタデカン）を腹腔内に投与
しておくことにより、粗製抗体液の収量を高めることが
できるが、この処置は必須ではない。なお、宿主として
用いる生体は、移植するハイブリドーマの親細胞と同種
同系の動物が望ま１８− しい。この場合には通常特別の処置をしなくてもハイブ
リドーマはその生体内で増殖するが、ハイブリドーマと
宿主の組織適合性抗原型が一致しない場合、一般に宿主
生体に抗リンパ球抗体投与、Ｘ線照射等の処置をあらか
じめ施しておくことが必要である。移植後、細胞が成長
してくるまでに通常１週間から３週間を要する。

以上のような製造法に従って作製したＣａｎｄｉｄａａ
ｌｂｉｃａｎｓに対する抗体の例として、後述の実施例
に示すように、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓと反
応する抗ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌ　ｉｓとも反応
する抗体、および伯の真菌類とも反応する抗体が挙げら
れる。その特異性と免疫グロブリンのクラスは後記表−
１に示す通りである。

なお、従来法により、ウサギをＣａｎｄｉｄａａｌｂｉ
ｃａｎｓで免疫して得られた抗自消をＣａｎｄｉｄａｔ
ｒｏｐｉｃａｌｉｓで吸収して得られた抗体は、Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓのみならず仙のＣａｎｄｉ
ｄａ属の秤（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉ
ｓ　）とも反応した。まｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌ
ｉｓで吸収して得られた抗体は、力価が極めて低く　Ｃ
ａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓとほとんど反応しなか
った。

本発明の抗体は、精製抗体液のまま使用してもよいが、
硫酸アンモニウム分画法やイオン交換クロマトグラフィ
ーなど免疫グロブリン精製の常法に従って、或いはｐ　
ｒｏｔｅｉｎ　　Ａや抗原によるアフィニティクロマト
グラフィー法等により、精製して用いることができる。

また、得られた抗体は、前述の如く、Ｃａｎｄｉｄａａ
ｌｂｉｃａｎｓの分類・同定およびカンジダ症の治療剤
や予防剤に有効であり、アフィニテイクロマトグラフイ
ー等によって抗原物質の精製を行なう場合など、広範囲
に使用できる。

また、必要に応じて上記抗体を混合して用いても差し支
えない。

投与による効果は、後述の実施例に示した如く、カンジ
ダ菌の致死的感染の防御という形で確認することができ
る。その作用機序は、投与された抗体がカンジダ菌菌体
表面の抗原と結合することに伴い、補体結合反応や体内
のマクロファージその他の免疫系の細胞のカンジダ菌に
対する攻撃が促進されることによると考えられ、これら
の反応はインビトロにおいても確認できる。

抗体はそのまま投与してもよいが、殺菌剤やアムホテリ
シン３，５−フルオロサイトシン、ナイス２１− クチン、グリセオフルビンなどの抗真菌剤と化学的に結
合させた生成物を用いることにより、更に高い効果が発
揮できる。また、抗体そのものの代わりに、抗体を化学
的または酵素的処理によって限定分解して得た抗体の部
分、たとえば、Ｆ’（ａｂ’）　　を用いることもでき
る。これにより、補体結合反応等が非特異的に生じて、
宿主の組織を障害する可能性を除くことができる。なお
、これらの生成物も混合して用いることもできる。

本発明の抗体又は生成物の急性毒性を知るため３群のＩ
Ｃ，Ｒマウス（１群１０匹）の第１群に経口投与で２ａ
／　ｋａ、第２群に腹腔内投与で４００ｍ（１／　ｋ（
１゜また第３群に静脈内投与で２００ｍｇ／　ｋＱをそ
れぞれ投与し、１４日間観察したが、死亡は認められな
かった。従って、本発明の抗体は極めて安全なものであ
るといえる。

本発明の抗体及び生成物は、注射剤として皮下注射、筋
肉的注射、静脈内注射、好ましくは皮下または筋肉内に
投与することができ、また、経口投与によっても、その
一部が抗体として構造を保持したまま、腸管を通過して
吸収されることが確認されているので、経口投与°剤と
して投与することも可能である。注射剤の製剤方法とし
ては、例えば、抗体そのものまたはアムホテリシンＢや
５−フルオロサイトシン結合抗体１０ｍｇを蒸溜水に溶
解または懸濁させて１０１１１１とし、常法で除菌した
後、２１ずつを注射用小瓶に分注し、そのまま凍結乾燥
して注射剤とする。この場合、使用に際しては生理食塩
水に溶解して注射液とする。このほか、注射剤の製剤に
は、本抗体の弛に、担体、希釈剤、！！衝剤、安定化剤
、等層剤等を添加してもよく、常法によって皮下注射剤
、筋肉注射剤および静脈内注射剤とすることができる。

経口投与剤としては、常法により腸溶剤の形で用いるこ
とができる。

投与量は、主として症状に左右されるが、マウスなどの
動物で０．００１ｍｇ〜１０（１／ｋ（Ｊ／日、ヒトで
は０．０１〜３，０００ｍｇ／人／日である。

以下、具体的な実施例を述べる。

実施例１ （１１１１ｊＱの調製：　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉ
ｃａｎｓ　Ａ　７００７５２株をサブロー培地を含む斜
面寒天に接種し、３７℃のふ開蓋で３日間培養を行なっ
た。培養終了後、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ
と略、ｐＨ７，２＞を入れ、ピペッティングによって菌
を浮遊せしめ、遠心分＠　（１０００ｘ　ｇ、　４℃、
１０分間）を行ない、沈渣（菌体）を得た。この洗浄操
作を３回繰り返した後の菌体に１．０％グルタルアルデ
ヒドを加え、０℃で３０分間処理した。次に、菌体をＰ
ＢＳで５回洗浄した後、ＰＢＳで２×１０７個／１の濃
度に調整し、免疫原懸濁液として以下の実験に用いた。

（２）抗体産生細胞の調製：　　８週令の雌性ＢΔＬＢ
／Ｃマウス（日本チャールズリバー）に、上記免疫原懸
濁液０．２ｍｌを腹腔内投与することにより免疫を行な
った。さらに、１０日間隔で免疫を繰り返し、免疫開始
後１００日目に、上記免疫原懸濁液０．２１を静脈内投
与することによりブースターを行ない、３日後にマウス
を脱血死せしめ、クリーンベンヂ（日立製作所）内ｒｌ
を無菌的に摘出した。次に、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地
を含むシャーレに稗を入れ、ビンセットにて細片にほぐ
し、おだやかにピペッティングを行なった後、上記牌懸
濁液をステンレス製金網で濾過して、牌細胞懸濁液を得
た。この懸濁液を遠心分離（５００ｘｇ、　　１０分間
）して得た細胞ペレットに対して、０．７４７％の塩化
アンモニウムを含む１．７１１ＩＭトリス・塩酸緩衝液
（１）ｌ−１７，６５）を加え、懸濁することにより赤
血球を破壊・除去した。そして、この牌細胞懸濁液２５
− を遠心分離（５００ｘｇ、　３分間）して得た細胞ペレ
ットを、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地で３回洗浄し、ＲＰ
Ｍｉ　１６４０培地で１０　　個／１の濃度に調整した
。

（３）乳腹員澄Ｊよびハイブリドーマ■：前もってイン
ビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｓｐ２１０−Ａｇ１
４１×１０７個と、上記Ｐ細胞懸濁液（ｌＸ１０　　個
）とを混合し、遠心分＠　（！１００Ｘ（＋、　５分間
）を行ない、上清を除去して細胞ペレットを得た。容器
の底をおだやかにたたくことによりペレットをほぐした
後、３７℃に保温した５０％（Ｖ／Ｖ）のポリエチレン
グリコール４０００を含むＲＰＭ　Ｔ　１６４０培地１
１を添加し、１分間放置した。

次に、３７℃の恒温槽に入れ、１分間容器をおだやかに
まわすことにより、ポリエチレングリコール溶液と細胞
ペレットを混合させた。次に３７℃に保温したＲ　ＰＭ
　Ｔ　１６４０培地を、１ｍｌ／３０秒の速度で合計１
０１加えた後、遠心分離（５００Ｘｇ、　５分間）−９
６− を行なった。上清を除去した後、細胞ペレットをＲＰＭ
　ｒ　１６４０培地に懸濁させ、遠心分離（５００ｘ（
］、　５５分間を行ない、細胞ペレットを得た。この洗
浄操作を再度繰り返した後、細胞ペレットに、３７℃に
保温した）−ＩＡＴ培地、すなわち２０％牛脂児面清、
　２ｍＭグルタミン、　１ｍＭピルビン酸、　　４．５
（］／Ｌのグルコース、　　５ｘ１０　　Ｍのβ−メル
カプトエタノール、　　１ｘｉｏ’Ｍヒポキサンチン、
　　４ｘ１０−”Ｍアミノプテリン、　　１．６Ｘ１０
　　Ｍチミジンおよび５０ｍｏ／　Ｌの硫酸カナマイシ
ンを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地２０ｍ１を加え、よ
く懸濁させた。この細胞懸濁液を９６ウエルの組織培養
用プレート＜　Ｎ　ｕｎｃ１６７００８、　Ｎｕｎｃ社
、デンマーク）の各ウェルに１００μｍずつ分注し、３
７℃で、５％の炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養
を開始した。培養開始２４時間後に、ＨＡＴ培地を１０
０μｍずつ添加した。その後、２〜３日間隔で各ウェル
中の培地１００μｍを除き、新たにｌ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地
１００Ｉｌｌを加えることにより培養を行ない、ｌ−Ｉ
　Ａ　Ｔ培地中で増殖能力を右するハイブリドーマを選
択した。

培養開始２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察する
と共に、各つＩル中の培養上清中の産生抗体の有無を下
記（４）に記載の方法で検査した。

（４）抗体産生ハイブリドーマの樹立二　上記により得
られた培養上清中の抗体産生の有無は酵素免疫測定法に
より調べた。すなわち、９６ウ工ル組織培養用プレート
（Ｎ　ｕｎｃ　１６７００８．　Ｎ　ｕｎｃネ１．デン
マーク）の各ウェルに、抗Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｔ＋１
ｃａｎｓ抗体（１００℃テ２．５時間加熱処理したＣａ
ｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ　　２ｘ　１０　　個をウ
サギに５回静脈内免疫して得られた白酒を、硫安塩析法
により分画した１（ＩＧ両分）を０．１Ｍの炭酸水素ナ
トリウムで３０μＯ／ｍｌの蛋白質濃度に調整した溶液
を、５０μｍ　′ずつ分注し、４℃で２４時間放胃した
。次に、蒸溜水で充分に各ウェルを洗浄した後、Ｃａｎ
ｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ　ＡＴＣＣ７５２菌体液（２
Ｘ１０　　個／ｍ１）３０μｍを分注し、室温で反応さ
せた。更に、７０℃。

３時間の処理によりプレートウェルを乾燥させた。

このプレートは使用時まで一２０℃で保存した。次に、
このプレートの各ウェルに、０．５％グルタルアルデヒ
ドを含むＰ　Ｂ　Ｓ　５０μｍを分注し、室温で３０分
間放置後、各ウェルを０．０５％ツイーン２０゜を含む
ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後の各ウェルに、被検体（
各ウェルの培養上清）を１００μｍ加え、３７℃で１時
間反応させた。そして０．０５％ツイーン２０＠を含む
ＰＢＳで３回洗浄後、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体（カッベル社、ア
メリカ）を馬血清で１ｏｏｏ倍に希釈した溶液５０μｍ
を、各ウェルに分注し、３７℃で１時間反応させた。反
応終了後、０．０５％ツイーン２０（！りを含むＰＢＳ
で各ウェルを２９− ５回洗浄し、１ｍＭｌ１ｌｌの０−）Ｘニレンジアミン
および０．０４％（Ｖ／Ｖ）の３１％過酸化水素水を含
む０．ＩＭ／７Ｔン酸緩衝液（１’１８４．５）　　１
００μｍを、各ウェルに加え、室温で３０分間反応させ
た。各つＩルに１２．５％硫酸を５０μｍ加えることに
より酵素反応を停止Ｆさせ、４９２ｎｍにおける吸光度
測定により同定を行なった。その結果、１９２つＴル中
２２個のウェルで抗体産生が認められた。

次いで、抗体産生が認められたウ−［ル中のハイブリド
ーマのり［１−ン化を行なった。すなわち、栄養供給細
胞（ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅｌｌｓ）として無処置の８週令
旧性ＢＡＬＢ／ｃマウスから稗を摘出し、上記（２）と
同様の方法で牌ＰＲ胞を得、ＨＡＴ培地で５Ｘ１０’個
／１の濃度に調整した。そして、この特細胞懸濁液に上
記ハイブリドーマを２個／ｍｌになるように加え、よく
撹拌した後、９６ウエルの組織培養用プレート（Ｎ　ｕ
ｎｃ　１６７００８．　Ｎ　ｕｎｃ社。

３０− デンマーク）の各ウェルに１００μｍずつ分注した。

２４時間後に、各ウェルにＨＡＴ培地を１００μｉずつ
分注し、３７℃で、５％の炭酸ガスを含む培養器中で培
養を行なった。

クローン化２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察す
ると共に、各ウェル中の培養上清中の抗体の有無を上記
の方法で検査した。その結果、各ウェルのクローン化に
つき、２個から８０個の抗体産生クローンが得られた。

これらクローンの中から、抗体分泌能が高く、増殖性に
優れ、しかも安定な細胞であるクローンを選び、上と同
様の方法で再度クローン化を行ない、抗体産生ハイブリ
ドーマＣＤ−１，ＣＤ−２およびＣＤ−３を樹立した。

（５）抗体の生産：　（インビトロ培養による生Ｌ）；
ハイブリドーマＣＤ−１，ＣＤ−２ま＼たはＣＤ−３を
、２０％牛脂児血清、　２ｍＭグルタミン、　１ｍＭピ
ルビン酸、４．５（］／Ｌのグルコース、　　５Ｘ１０
　　Ｍ−３１−’ のβ−メルカプトエタノールおよび！ｉ０ｍｏ／　Ｌの
硫酸カナマイシンを含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０培地に
、１×１０’個／ｍｌになるように懸濁させ、この細胞
懸濁液２５ｍ１を７５　ｃ　ｍ２　組織培養用フラスコ
（コーニング社、アメリカ）に分注し、３７℃で５％炭
酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を行なった。増殖
がほぼ定常に達した４日日に、培養上清を採取した。

この時の細胞数は約２ｘ１０’　個／＋１１１であり、
上清の抗体含量は各々３，０ｔｌａ　／ｍｌ、　　２．
３μ！］／ｎ＋Ｉ。

２．８μ０／ｍ１であった。

（インビボ培養による生産）；ブリスタン（２，６゜１
０．１４−テトラメチルペンタデカン）　　０．５ｍｌ
を腹腔内に投与後１０日から３０日口のＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に、インビトロで増殖させたハイブリドー
マＣＤ−１，ＣＤ−２またはｃ　６−３を５Ｘ１０’個
接種した。接種後２ないし３週目に腹水を採取し、遠心
分離（１０００ｘ　ｇ、　４℃、１５分間）により腹水
上３２− 清を得た。各ハイブリドーマにつき１０匹のマウスから
約３０ｍ１の腹水上清が得られ、その抗体含量は各々　
１．５１１１Ｍｍｌ、　　２．３１１１ｇ／１１１＋、
　　１．８１１１！＋／ｍｌであった。

（６）抗体の特異性および性状＝　（特異性の検Ｎ　）
　：　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ７５２の他、同種賃株の抗原細胞としてＣａｎｄｉｄ
ａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｔ　Ｆ００５８８、　Ｃａｎｄ
ｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉ　Ｆ　０１３８５゜Ｃａ
ｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　　Ｉ　ＦＯ１３８９，
Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉ　Ｆ　０１５９４
およびＣａｎｄｉｄａ　ａｔｂｉｃａｎｓＩＦＯ１２６
９を、同居異種の抗原細胞としてＣａｎｄｉｄａ　ｔｒ
ｏｐｉｃａｌｉｓ　ＡＴＣＣ７５０、Ｃａｎｄｉｄａｇ
ｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　　Ｉ　ＦＯＯ６７９，Ｃ
ａｎｄｉｄａ　ｋｒｕｓｅｉＩ　Ｆ　０１３９５．　Ｃ
ａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｔｌｏｓｉｓ　　Ｉ　Ｆ　
Ｏ１３９６およびＣａｎｄｔｄａ　ｐｓｅｕｄｏｔｒｏ
ｐｉｃａｌｉｓ　Ｉ　Ｆ　００４３２株を上記〈１）と
同様の方法で培養し、ホルマリン処理を行ない、０．０
５％ツイーン２０°を含むＰＢ−３３−・ Ｓで１×１０　　個／１に調整した。この抗原細胞懸濁
液０．３１１１１を、直径１．２ｃｍのシリコン化・処
理した試験管に分注し、遠心分ｌ！！ｌ　（１０００ｘ
ｇ、　５分間）して上清を除いた後、上記（５）で得た
バイブリド−ｖＣＤ−１，ＣＤ−２またハｃＤ−３（７
）インビトロ培養液上清を０．５１加え、３７℃で１時
間反応させた。

反応終了後、０．０５％ツイーン２０ノを含むＰＢＳで
３回洗浄し、次いで西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ結
合抗マウス免疫グロブリン抗体（カッベル社、アメリカ
）を馬面清で１０００倍に希釈した溶液を０．５１１１
１加え、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、０．
０５％ツイーン２０°を含むＰＢＳで５回洗浄し、次い
で、１ｍｇ／ｍｌの０−フェニレンジアミンおよび０．
０４％（Ｖ／Ｖ）の３１％過酸化水素水を含む０．１Ｍ
クエン酸緩衝液ａｎｔを加え、室温で３０分間反応させ
た。そして、反応停止剤として１２．５％硫酸を０．５
１加え、４９２ｎｍにお番プる吸光度３４− 測定により同定を行なった。その結果を後記表−１に示
した。

（ｆｉ）；抗マウスＴ（ＩＧ抗体、抗マウスＨＡ抗体お
よび抗マウスＩ（ＩＭ抗体（マイルス社、アメリカ）を
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムで１００倍希釈した溶液５
０μｍを、９６ウ工ル平底組織培養用プレート（Ｎ　＋
ｉｎｃ　１６７００８．Ｎｕｎｃ社、デンマーク）に分
注し、４℃で２４時間放置した。

０．０５％ツイーン２０＠を含むＰＢＳで各ウェルを充
分に洗浄後、上記（５）で得たハイブリドーマＣＤ−１
，ＣＤ−２またはＣＤ−３の培養上清を１００μｍ添加
し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、０．０５
％ツイーン２Ｐを含むＰＢＳで３回洗浄し、西洋ワサビ
由来ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体
（カッベル社、アメリカ）を馬血清で１０００倍に希釈
した溶液５０μｍを、各ウェルに分注し、３１℃で１時
間反応させた。反応終了後、０．０５％ツイーン２Ｐを
含むＰＢＳで各ウェルを５回洗浄し、　１１ｎＯ／ｍｌ
の０−フェニレンジアミンおよび０．０４％（Ｖ／Ｖ）
の３１％過酸化水素水を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（
ｒｌｌ−１４，５）　　１００μｍを各つ゛［ルに加え
、室温で３０分間反応させた。

各つＩルに１２．５％硫酸を加えることにより酵素反応
を停」１させ、／１９２ｎｍにお（プる吸光度の測定に
Ｊ：り同定を行なった。

その結果を後記表−１に示す。

実施例２ （１）免ｑ原のｐ％　：　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉ
ｃａｎｓ　Ｉ　Ｆ０１５９４株をサブロー培地を含む斜
面寒天に接種し、３７℃の／ＳＮ卵器開蓋日間培養を行
なった。培養終了後、ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）を入れ、
ピペッティングによって菌を浮遊せしめ、遠心分＃Ｉ（
１０００ｘｇ、　４℃、１０分間）を行ない、沈渣（菌
体）を得た。この洗浄操作を３回繰り返した後、ＰＢＳ
で５×１０９個／ｍｌの濃度に調整し、免疫原懸濁液と
して以下の実験に用いた。

（２）抗体産生　　の調製二　　８週令の雌性ＣＤＦ１
　　マウス（日本フレア）に上記免疫原懸濁液０．２ｍ
ｌを静脈内投与することにより免疫を行なった。さらに
、１４日間隔で免疫を繰り返し、免疫開始後７０日日日
、上記免疫原懸濁液０．２ｍｌを静脈内投与することに
よりブースターを行ない、３日後にマウスを脱血化せし
め、クリーンベンチ（日立製作所）内で稗を無菌的に摘
出した。次に、Ｄ　ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培
地を含むシャーレに牌を入れ、実施例１（２）と同様の
方法により　Ｉ　Ｘ、　１０’個／ｍｌの牌細胞懸濁液
を得た。

（３）細胞融合およびハイブリドーマの調製：前もって
インビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｐ　３−Ｘ　６
３−ΔＱ８１Ｘ１０　　個と、上記牌細胞懸濁液（１Ｘ
１０’個）とを混合し、遠心分＠　（５００ｘ３７− １１ ９．５分間）を行ない、上清を除去して細胞ペレットを
得た。容器の底をおだやかにたたくことによりベレット
をほぐした後、３７℃に保温した。これに、３７℃に保
温した４５％ポリエヂレングリコール４０００を含むＯ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地１１を、約１分間
かけて徐々に加えた。３７℃に７分間保った後、容器を
ゆっくりと回転さ刊ながら、３７℃に保温した［）　ｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地１５ｍ１を、容器壁
面に伝わらせながら約５分間かけて加えた。更に約２５
ｍ１のＱ　ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を加え
た後、遠心分離（５００ｘｇ、　５分間）を行ない、上
清を除いた。

細胞ペレットに、３７℃に保温した１０％牛脂児而清を
含む［）　ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を加え
、１ｘｌＯ’個／１に調整し、おだやかにピペットで混
和した後、２４ウエルの組織培養用プレート（Ｎ　ｕｎ
ｃｌｏｎ。

Ｎ１１ｎｃ社、デンマーク）の各ウェルに１×１０　　
個分注し、３７℃で５％の炭酸ガスを含む炭酸ガス培。

　　　　　　　　　　　−３８− ？！！器中で培養を開始した。培養開始２４時間後に、
ＨＡＴ培地を１ｍｌずつ添加した。その後、２〜３日間
隔で各ウェル中の培地１１を除き、新たにＨＡＴ培地培
地１加ｌ加ことにより培養を行ない、ＨＡＴ培地中で増
殖能力を右するハイブリドーマを選択した。

培養開始２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察する
と共に、各ウェル中の培養上清中の産生抗体を実施例１
（４）に記載の方法で検査した。

その結果、４８ウ工ル中１０個のウェルで抗体産生が認
められた。

（４）抗体産生ハイブリドーマの樹立：次いで、抗体産
生が認められたウェル中のハイブリドーマのクローン化
を、軟寒天法により行なった。すなわち、４５℃に保温
した２、５％寒天（１）　ｔｆｃｏ、　　ドイツ）　３
０ｍ１と１０倍濃度の［）　ｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏ’ｓＭ
ＥＭ培地３ｍｌを混合し培地３転ｌ５℃保温の［）　ｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍ　Ｆ　Ｍ培地１１７ｍ１を加えた
。この寒天溶液に栄養供給細胞（ｆ’ｅｅ’ｄｅｒ　ｃ
ｅｌｌｓ）として無処訂の８週令雌性ＣＤＦ　　マウス
牌細胞を５ｘ１０５個／１になるように加えた後、直径
１０ｃｍのペトリ皿（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３００３．　Ｒ
ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、アメリカ）に１０ｍ
１ずつ分注し、室温で１５分間放置することによりゲル
化させた。そして、抗体産生陽性のウール中のハイプリ
ドーマ懸濁液約２１と、等量の０．５％寒天を含む［）
　ｕｌｈｅｃｃｏ”Ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を混合し、２１
ずつ上記ゲル化層上に細胞が均一に分布するように分注
した。３７℃で５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で
培養を行なった。培養開始後１０日日日降、軟寒天上に
生じた細胞のコロニーをバスツールビペラ］へにて採取
し、９６ウエルの組織培養用平底プレートに移し、さら
にＤ　ｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏｓＭＥＭ培地を０．２１加え
、３７℃で５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養
を行なった。そして、ハイブリドーマの増殖を観察する
と共に、各つ■ル中の培養上清中の抗体の有無を実施例
１（４）に記載の方法で検査した。

抗体産生が陽性のハイブリドーマの中から、抗体分泌能
が高く、増殖性に優れ、しかも安定なりローンを選び、
上述と同様の方法で再度クローン化を行ない、抗体産生
ハイブリドーマＣＤ−４およびＣＤ−５を樹立した。

（５）抗体の生産：　（インビトロ培養による生産−）
：実施例１（５）に記載の方法によりハイブリドーマＣ
Ｄ−４およびＣＤ−５の培養を行ない、培養上清を得た
。

（インビボ培養による生産）：実施例１（５）に記載の
方法により、ＣＤＦ、　　マウス腹腔内にハイブリドー
マＣＤ−４およびＣＤ−５を移植し、２ないし３週目に
腹水を採取し、腹水上清を得た。１０匹のマウスから約
３０ｍ　ｌの上清が得られた。

−４１＝ （６）疲淋の特異性および付人：　実施例１（６）に記
載の方法ｅハイブリドーマＣＩ）−’４およびＣＤ＝５
の培養上清中に含まれる抗体の特異性および免疫グロブ
リンのクラスを調べた。その結果を後記表−１に示す。

実施例３ （１）■原のｐ　’！＠−：　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌ
ｂｔｃａｎｓ　Ｉ　ＦＱ　０５８８株をサブロー培地を
含む斜面寒天に接種し、３７℃のふ部器で３日間培養を
行なった。培養終了後、白金■にて菌を回収し、ＰＢＳ
　’（ＩＩＨ７，２＞に懸濁せしめ、遠心分離（１００
０ｘ　ｇ、　４℃、１０分間）を行ない、沈８＋１（菌
体）を得た。この洗浄操作を３回繰り返した後の菌体を
１００℃で２．５時間加熱処理した。

菌体をＰｒ３Ｓで３回洗浄した後、ＰＢＳで２×１０７
個／ｍ１の濃度に調整し、免疫原！濁液として以下の実
験に用いた。

−４９− （２）抗体産生細胞の調製二　　８週令の雌性ＢＡＬＢ
／ｃマウス（日本ヂャールズリバー）に上記免疫原懸濁
液０．２ｍｌを腹腔的投与することにより免疫を行なっ
た。さらに２週間隔で免疫を繰り返し、免疫開始後１０
週目に上記免疫原懸濁液０．２ｍｌを静脈内投与するこ
とによりブースターを行ない、３日後にマウスを脱血化
せしめ、クリーンベンチ（日立製作所）内で牌を無菌的
に摘出した。次に、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地を含むシ
ャーレに牌を入れ、実施例１（２）と同様の方法により
、５×１０　　個／ｍ１の濃度の牌細胞懸濁液を得た。

（３）細胞融合およびハイブリドーマの調製：前もって
インビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｐ　３−Ｎ　Ｓ
　Ｉ　／　１−Ａ　ｇ４−１０．５ｘ　ｉｏ　　個と、
上記牌細胞懸濁液（５Ｘ１０　　個）とを混合し、遠心
分離（５００Ｘｇ、　５分間）を行ない、上清を除去し
て細胞ペレットを得た。容器の底をおだやかにたたくこ
とによりベレットをほぐした後、３７℃に保温した４２
．５％ポリエチレングリコール１５４０および１５％ジ
メヂルスルホキシドを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地０
．５ｍｌを添加し、１分間反応させた。この際、容器を
ゆっくり指でまわしでおだやかに回転させることにより
、ポリ■チレングリ］−ル溶液と細胞ベレットを混合さ
せた。１分後より同様にゆっくりと容器を回転させなが
ら、３７℃に保温したＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地をｌ＋
Ｉ／３０秒の速度で合計１０ｍ１加えた後、遠心分１１
　（５００Ｘｇ、　５分間）を行なった。

上清を除去した後、細胞ペレットをＲＰＭ　Ｉ　１６４
０培地に懸濁させ、遠心分１１ｆｆ　（５００Ｘｇ、　
５分間）を行ない、細胞ペレットを得た。この洗浄操作
を再度繰り返した後、細胞ペレットに３７℃に保温した
培養用培地、すなわち１０％牛脂児面清、　２１１１Ｍ
グルタミン、　１ｍＭピルビン酸、　　４．５０／Ｌ、
（７）クルｒ　−ス、５ｘ１０　　Ｍのβ−メルカプト
エタノールおよび５０ｍｇ／　Ｌの硫酸カナマイシンを
含むＲＰＭ１１６４０培地１０ｍ１を加え、よく懸濁さ
せた。この細胞懸濁液を９６ウエルの組織培養用プレー
ト（Ｎ　ｕｎｃ１６７００８、　Ｎ　ｕｎｃ社、デンマ
ーク）の各ウェルに２００μｉずつ分注し、３７℃で５
％の炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を開始した
。培養開始２４時間後に、上清を半分すて、３７℃に保
温した１」ΔＴ培地、すなわち上記培養用培地に１ｘ１
０　　Ｍヒボキサンチン、　　４ｘ１０　　Ｍアミノプ
テリン。

１．６Ｘ　１０−９Ｍチミジンを添加したものを１００
μｍ加えた。以後、２〜３日間隔で各ウェル中の培地１
００μｍを除き、新たにＳＡＴ培地１００μｍを加える
ことにより培養を行ない、ＨΔＴ培地中で増殖能力を有
するハイブリドーマを選択した。

培養開始２週間以後、ハイブリドーマの増殖を観察する
と共に、各ウェル中の培養上滑中の産生抗体を実施例１
（４）に記載の方法で検査した。

−４５−＋＋ ただしプレートに結合させる菌体としてはＣａｎｄｉｄ
ａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ｉ　Ｆ　００５８８株を用いた
。その結果、４８ウ工ル中３個のウェルで抗体産生が認
められた。

（４）鉄産（トハイブリドーマの１魚：　　次いで、抗
体産生が認められたウェル中のハイブリドーマのクロー
ン化を、実施例１（４）に記載の方法により行ない、抗
体産生ハイブリドーマＣＤ−６およびＣＤ−７を樹立し
た。

ハイブリドーマは培地交換または継代に際し、１−ＩＡ
Ｔ培地に代えてＨＴ培地（培養用培地に１×４ １０　　Ｍヒポ先すンヂンおよび１，６Ｘ　１０　　Ｍ
チミジンを添加したもの）を用いることにより、徐々に
培地をＨＴ培地に交換し、ＨＴ培地にて２週間以上培養
した後、更に）−ＩＴ培地に代えてヒポキサンチンやチ
ミジンを含まない培養用培地を用いることにより、徐々
に選択培地中での培養から通常の４６− 培養用培地中での培養に適合させた。

（５）抗体の生産：　（インビトロ培養による生Ｌ）：
実施例１（５）に記載の方法により、ハイブリドーマＣ
Ｄ−６およびＣＤ−７の培養を行ない、培養上清を得た
。ただし、培養開始時の細胞濃度は２×１０　　個／ｍ
ｌであり、４Ｂ後の培養上清の抗体含量は各々２．５μ
ｇ　／ｍｌ、　　３．０μｇ　／ｍｌであった。

（インビボ培養による生産）：実施例１（５）に記載の
方法により、ＢＡＬＢ／ｃマウス腹腔内にハイブリドー
マＣＤ−６またはＣＤ−７を各々ｌＸ１０７個接秤し、
接種後２ないし３週目に腹水を採取して腹水上清を得た
。１０匹のマウスから各々約３０ｍ１の上清が得られた
。

（６）抗体の特異性および性状：　実施例１（６）に記
載の方法でハイブリドーマＣＤ−６およびＣＤ−７の培
養上清中に含まれる抗体の特異性および免疫グロブリン
のクラスを調べた。その結果を後記表−１に示す。

実施例４ （１）免疫原のｍ！Ｊｆ　：　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌ
ｂｉｃａｎｓ　Ａ　７００７５２株をコーンミール（日
本製薬）を含む平板寒天に接種し、２５℃のふ開蓋で１
０日間培養を行なった。培養終了後、薬匙にて菌糸体お
よび厚膜胞子に富む部分を回収し、ＰＢＳ　（ＩＩＨ７
，２）に懸濁せしめ、ホモゲナイズした。そして遠心分
離（１０００ｘ　ｇ、　４℃、１０分間）を行ない、沈
渣（菌体）を得た。この洗浄操作を３回繰り返した後、
ＰＢＳで１％容積に調整し、免疫原懸濁液として以下の
実験に用いた。

（２）抗体産生細胞の［Ｌ＝８週令の雌性ＢΔＬＢ／Ｃ
マウス（日本ヂャールズリバー）に上記免疫原懸濁液０
．２１１１１を腹腔的投与することにより免疫を行なっ
た。さらに１４０間隔で免疫を繰り返し、免疫開始後１
０日日に上記免疫原懸濁液０．２ｍｌを腹腔的投与する
ことによりブースターを行ない、３日後にマウスを脱血
死せしめ、クリーンベンヂ（日立製作所）内で牌及び腸
間膜リンパ節を無菌的に摘出した。以下、実施例１．（
２）に記載の方法に従い１０８個／ｍ１の牌細胞懸濁液
を得た。

（３）細胞融合およびハイブリドーマの調製：前もって
インビトロで培養したマウス骨髄腫細胞Ｘ　６３−　Ａ
　（＋８，６５３１ｘ　１０７個と上記ｐｍ胞懸濁液（
ＩＸ１０ｅ個）とを混合し、実施例２（３）に記載の方
法で細胞融合を行ない、ハイブリドーマをｖＡ！Ｆ！Ｉ
した。その結果、４８ウエル中１０ウエルで抗体産生が
認められた。

（４）抗体産生ハイブリドーマの樹立：　次いで、抗体
産生が認められたウェル中のハイブリドーマのクローン
化をフィブリンゲル法により行なった。

すなわち、２，５ｍｏ／ｍｌのフィブリノーゲン（マイ
４９− ルス社、アメリカ）、８１１１（＋／＋ｎｌの塩化ナト
リウム、０．５ｍ（１／１１１＋の塩化カリウムおよび
クエン酸ナトリウムを含む溶液１ｍｌをシ１７−レ（［
ａｌｃｏｎ　３００２゜［３ｅｃｋｔｏｎ　−［）　１
ｃｋｉｎｓｏｎ社、アメリカ）に分注し、底にまんべん
なく広げた侵、１０ｍＵ／ｍｌのトロンビン（マイルス
社、アメリカ）および２０％の牛脂児白酒を含むＤｕｌ
ｈｅｃｃｏ’ｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地４１を加え、３７℃で
１時間静置してゲル化させた。次にハイブリドーマ１Ｘ
１０　　個／１を１００μＩずつゲルに加えて細胞が均
一に広がるようにして、３７℃で５％炭酸ガスを含む炭
酸ガス培養器中で培養を行なった。培養開始１０日日日
陪、ゲル上に生じた細胞コロニーをパスツールピペット
にて採取し、９６ウエルの組織培養用平底プレートに移
し、Ｑ　ｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏｓＭＥＭ培地０．２ｍｌを
さらに加え、３７℃で５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養
器中で培養を行なった。

そしてハイブリドーマの増殖を観察すると共に、５０− 各ウェル中の培養上清中の抗体の有無を実施例１（４）
に記載の方法で検査した。抗体産生が陽性のハイブリド
ーマの中から、抗体分泌能が高く、増殖性に優れ、しか
も安定なりローンを選び、上述と同様の方法で再度クロ
ーン化を行ない、抗体産生ハイブリドーマＣＤ−８およ
びＣＤ−９を樹立した。

（５）抗体の生産：　実施例１（５）に記載の方法によ
り、上記ハイブリドーマＣＤ−８およびＣＤ−９のイン
ごトロおよびインビボ培養を行ない、培養上清および腹
水上清を得た。

（６）抗体の特異性および性状：　実施例１（６）に記
載の方法によりハイブリドーマＣＤ−８およびＣＤ−９
の培養上清中に含まれる抗体の特異性および免疫グロブ
リンクラスを調べだ。その結果を表−１に示す。

実施例５ 実施例１乃至４で冑られた抗体を、１群１０匹のＩＣＲ
マウスに２ｇ／ｋｇ経口、４００１１１０／ｋｇ腹腔内
または２００１１＜ｌ／　ｈａ静脈内投与し、１４日間
観察したところ、これら抗体による死亡は全く認められ
なかった。

また、実施例１乃至４で得られたハイブリドーマＣＤ−
１乃至ＣＩ）　−９の形・状、大きさ、性状を表−２に
示す。

前二２ ５４− Ｄ　　（）　一 実施例６　抗体にＪ：仝Ｊスえ久豆屓速防御効果＝１ｎ
Ｙ１５匹１７）８週令（７）ＩｆｆＲＡＬＢ／ｃｖウス
（日本チャールズリバー、［１木）に、βｊ見す」史ａ
ｌｂｉｃａｎｓ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃ７５２を５ｘｌＯ’Ｃ
ＦＵ腹腔内に接種した。３週間後に、ハイブリドーマＣ
Ｄ−１゜ＣＤ−２，ＣＤ＝３．ＣＤ−４，ＣＤ−５，Ｃ
Ｄ−６，ＣＤ−７，ＣＤ−８またはＣＤ−９から得られ
た抗体溶液（凝集力価１：　　５１２）を０．２１静脈
内投与し、２時間後に致死量のＣ！μｄｉｄａ　ａｌｂ
ｉｃａｎｓ　Ａ　Ｔ　ＣＣ７５２！１Ｘ１０　　ＣＦＵ
を静脈内接種して感染死の有無を１４日間観察した。

その結果、表−３に示すように、抗体非投与群では全例
死亡するが、抗体を投与した群では治癒生存マウスがみ
られ、明らかに感染防御効果がみとめられた。

５５− 表−３ ※　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ致死量接種後１
４日目の生存匹数実施例７　腹腔マクロファージのカン
ジダ菌食菌８週令の雌゛性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（日本チ
１７−ルズリバー、日本）に０．１％グリコーゲン（関
東化学２日本）１１を腹腔的投与し、４日後にマウスを
屠殺せしめ、腹腔滲出細胞を１０％牛脂児血清を含むＲ
ＰＭ　Ｔ　１６４０培地で洗い出し、遠心分離（５００
ｘｇ、　５分間）により腹腔滲出細胞を回収した。１０
％牛脂児面清を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に上記細
胞を懸濁させ、１ｘ１０’個／１に調整後、組織培養用
ヂャンバ＝（Ｌ　ａｈ　−Ｔ　ｅｋｅ：　、アメリカ）
に　１１ずつ分注し、３７℃で３０分間静直重ることに
より、腹腔滲出細胞中のマクロファージをヂャンバー底
に付着せしめた。同ヂャンバーをＲＰＭ１１６４０培地
で洗浄し、非付着性細胞を除いた後、１０％牛脂児而清
を含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に、ｌＸ１０’個／ｍ
ｌの濃度に調整したＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ
ΔＴＣＧ７５２１ｍｌを加え、３７℃で２時間反応させ
た。

ハイブリドーマＣＤ−１，ＣＤ−２，ＣＤ−３，ＣＤ−
４゜ＣＤ−５，ＣＤ−６，ＣＤ−７，ＣＤ−８またはＣ
Ｄ−９から得られた抗体は、菌体添加と同時に加えた。

反応終了後、ＰＢＳ　（ｌ１ｌ−１７，２）でヂャンバ
ーを洗浄し、その後１．０％ホルマリンで固定した。そ
して、メイ・グリンワルド・ギムザ染色により食菌して
いるマクロファージ数を測定した。食菌率は全マクロフ
ァージに対する食菌マクロファージの比率で示した。そ
の結果、表−４に示すように、抗体添加により約１４〜
２３％食菌率が高まった。

表−４ ５９一 実施例８ ハイブリドーマＣＤ−１，ＣＤ−２，ＣＤ−３，ＣＤ−
４，ＣＤ−５，ＣＤ−６，ＣＤ−７，ＣＤ−８またはＣ
Ｄ＝９から得られた抗体（腹水上清を精製した抗体）を
蒸溜水にて１０．４ｍｇ／ｍｌに調整し、これに１３．
０ｍｇ／ｌｌのアムホテリシンＢ・ジメチルスルホキシ
ド液を加え、撹拌下に塩酸で溶液のｐＨを４．７５に調
節しつつ、３．７Ｉｌ１ｇの１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加え
て１．３または４時間反応させ、酢酸Ｍｌｉｊ液（ｐＨ
４，７０）　　２ｎ＋Ｉを添加することにより反応を停
止させた。次いで、反応液を４℃で７２時間、ＳＬの蒸
溜水に対して透析した。なお、透析外液は３回交換した
。透析内液を濃縮した後に、３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２
５［Ｆ］　（ファルマシア、スウェーデン）を充填した
直径１．５ｃｍ、高さ５５ｃｍのカラムを通して反応液
中の低分子物質を完全に除去し、得られた溶液を−８８
− −２０℃で凍結乾燥し、アムホテリシンＢ−抗体結合物
を得た。なお、抗体１ｍｇ当りのアムホテリシンＢ結合
吊は、表−５に示す通りである。

上記の操作に準じて、抗体と５−フルオロサイトシンと
を反応Ｖしめて結合物を得た。抗体１ｍｇ当りの５−フ
ルオロサイトシンの結合量は表−５に示す通りである。

なお、これら抗真菌剤と抗体との結合物を、１ｉＹ１０
匹のｒ　ＣＲ？ウスに２０／　ｋＯ経口、　　４００１
１１（＋／　ｋ（１腹腔内または２００ｍ！＋／　ｋ（
ｌ静脈内投与し、１４０間死亡率を観察したところ、こ
れら薬剤投与による死亡は全く認められなかった。

表−５ −６つ− −ｂ　１− 欠溝」１と 実施例８で得られた抗真菌剤−抗体結合物のカンジダ菌
感染防御効果を調べた。すなわち、１群１５四の８週令
雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（日本チＶ−ルズリバー）にＣ
ａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　Ａ　Ｔ　ＣＣ１５２
を５ｘ　１０７ＣＦ　（Ｊ静脈内接種し、１時間後、２
４時間後、４８時間後に実施例８で得られた抗真菌剤−
抗体結合物（４時間反応物）を静脈内または腹腔的投与
した。なお、アムホテリシンＢは静脈内投与、５−フル
オロサイトシンは経口投与した。

本発明の結合物の投与量は、アムホテリシンＢ相当で５
μｇ／四、５−フルオロサイトシン相当で２０μｇ／匹
である。その結果、表−６で示すように、本発明の結合
物投与により、明らかに感染治療効果がみられた。

６３− 表−６ ※　　　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ接種後１４
日目の生存画数日日　　アムホテリシンＢ−抗体結合物
は静脈内投与した。

※※※　５−フルオロサイトシン−抗体結合物は腹腔的
投与した。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）　抗カンジダ菌抗体産生細胞と、インごトロにお
   いて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマに
   より分泌される抗体の一種またはそれ以上を含有するカ
   ンジダ菌感染症治療用薬剤。
2. （２）　担体または希釈剤を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の薬剤。
3. （３）　該カンジダ菌がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａ
   ｎｓであることを特徴とする特許請求の範囲第１項また
   は第２項に記載の薬剤。
4. （４）　該抗体がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓに
   対する抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項乃至第３項のいずれかに記載の薬剤。
5. （５）　該抗体がハイブリドーマＣＤ−１，ＣＤ−２゜
   ＣＤ−３，ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−５，ＣＤ−６，ＣＤ−７
   ，ＣＤ−８またはＣＤ−９により分泌される抗体である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載の薬剤。
6. （６）　ヒトまたは動物用であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の薬剤。
7. （７）　抗カンジダ菌抗体産生細胞とインビトロにおい
   て長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマによ
   り分泌される抗体に抗真菌剤を化学的に結合させた物質
   。
8. （８）　該抗真菌剤がアムホテリシンＢまたは５−フル
   オロサイトシンであることを特徴とする特許請求の範囲
   第７項に記載の物質。
9. （９）　該カンジダ菌がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａ
   ｎｓであることを特徴とする特許請求の範囲第７項また
   は第８項に記載の物質。
10. （１０）　　該抗体がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ
    ｓ　ニ対する抗体であることを特徴とする特許請求の範
    囲第７項乃至第９項のいずれかに記載の物質。
11. （１１）　　該抗体がハイブリドーマＣＤ　−１，ＣＵ
    ）　−’２゜ＣＤ”３．　ｃｏ−４，ＣＤ−５’、’Ｃ
    Ｄ−６．ＣＤ−７．ＣＤ−８またはＣＤ−９により分泌
    される抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第１
    ０項に記載の物質。
12. （１２）　　抗カンジダ菌抗体産生細胞とインビトロに
    おいて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマ
    により分泌される抗体に抗真菌剤を化学的に結合させた
    物質の一種またはそれ以上を含有するカンジダ菌感染症
    治療用薬剤。
13. （１３）　　担体または希釈剤を含有することを特徴と
    する特許請求の範囲第１２項に記載の薬剤。
14. （１４）　　該抗真菌剤がアムホテリシンＢまたは５−
    フルオロサイトシンであることを特徴とする特許請求の
    範囲第１２項または第１３項に記載の薬剤。
15. （１５）　　該カンジダ菌がＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉ
    ｃａｎｓであ、　ることを特徴とする特許請求の範囲第
    １２項乃至第１４項のいずれかに記載の薬剤。
16. （１６）　　該抗体がＣａｎｄｉｃｊａ　ａｌｂｉｃａ
    ｎｓに対する抗体であることを特徴とする特許請求の範
    囲第１２項乃至第１５ＴＪ’ｉのいずれかに記載の薬剤
    。
17. （１７）　　該抗体がハイブリドーマＣＩ）−１，ＣＤ
    −２゜ＣＤ−３，ＣＤ−４，ＣＤ−５，ＣＤ−６，ＣＤ
    −７，ＣＤ−８またはＣＤ−９により分泌される抗体で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載の
    薬剤。
18. （１８）　　ヒトまたは動物用であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１２項乃至第１７項のいずれかに記載
    の薬剤。
19. （１９）　　特許請求の範囲第１項乃至第６項および第
    １２項乃至第１８項のいずれかに記載の薬剤を用いるこ
    とからなるカンジダ菌感染症の治療方法。