JPS59186923A - ヒト前立腺癌治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト前立腺癌に対する抗体産生細胞とインビ
トロにおいて長期継代培養可能な細胞との門の融合細胞
（以下、ハイブリドーマと称する）より分泌される抗体
、その誘導体またはその限定分解物のヒト前立腺癌の治
療剤および治療方法に関する。

ここでいう抗体の誘導体とは、該抗体に抗癌剤を化学的
に結合させた生成物であり、抗体の限定分解物とは、該
抗体を化学的処理または酵素処理によって限定分解して
生ずる分解物であって、これら自身も本発明に包含され
る。

近年、癌はあらゆる疾患の中で死亡率の最も高い疾患に
なっており、ネ１会的問題になっている。

その対策はあらゆる方面から検討されているが、未だ根
本的な解決法は見出されていない。日本に於いては、胃
癌、肺癌、肝癌が多く、癌による死亡者全体の５０％以
」−を占めているが、一方において、近年、生活様式の
変化から従来は少なかった種類の癌も増加傾向にある。

その中で、前立腺癌などの泌尿器系悪性腫瘍は年々増加
の一途をたどっている代表的な例である。

その治療法としては手術療法を主体とし、放射線療法、
化学療法、免疫療法などが施行されているが、末期熱や
進行病では限界があり、従来と異なった治療方法が求め
られているのが現状である。

本発明の抗体は前立腺癌の治療に極めて有効な手段を提
供するものである。

５− 一般に、癌１１Ｉ飽表面に存在する癌関連抗原・癌特異
抗原については膨大な研究がなされている。

これらの抗原は、実験動物を用いた移植実験等でその存
在が証明されているが、人癌については充分な検討がな
されていない。現在、癌表面にある抗原としては、■自
家にのみ存在する抗原、■同種の腫瘍に共通して存在す
る抗原、■他臓器の腫瘍あるいは正常細胞にも存在する
抗原などが考えられている。

従来の同種又は異種抗血清を用いて上記の３種を区別す
る抗体を作製するためには、吸収操作を繰り返す必要が
ある。しかし、この操作は抗体力価の低下を伴い、実用
に適さない。又、目的とする抗体が得られても、再現性
よく同じ特箕性をもつ抗体を得ることは不可能に近い。

１９７５年、Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎらによって始められた
細胞融合法によるモノクローナル抗体の作製は、上記、
７％　　　　　　　　　　　　　６一の３種類の抗原を
区別することが可能な新しい手法の１つである。そして
、ヒトリンパ球すブセッ１〜、ヒト白面病、ヒ］〜メラ
ノーマなどのヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル
抗体が得られたとの報告が近年なさねている。

しかし、細胞融合法によるモノクローナル抗体作製の手
法を用いれば一般的に特異抗体の作製は可能とされてい
るものの、細胞によってはその抗原性に変動があり、果
して目的とする特異性の優れた抗体が得られるかどうか
は現在のところ予知できないとされている。癌細胞に関
しても上述のごく一部の、しかも特定の癌細胞について
の報告しかなく、前立腺癌に関してはその報告もなく、
まして実用化されている抗体もない。

本発明者らは、ヒト前立腺癌の表面抗原についての研究
を重ねた結果、ヒト前立腺癌に対する抗体産生細胞とイ
ンビトロにおいて長期継代培養可能な細胞との間のハイ
ブリドーマにより分泌される抗体にはヒト前立腺癌に対
する極めて特異性の優れた抗体が存在することを見出し
た。更にそれを用いたヒト前立腺癌の治療剤について検
討を重ね、本発明を完成するに至った。

本発明で用いる抗体は、事実上、単一の特異性を有する
、また単一の分子種からなる抗体である。

またタンパク質当りの力価は極めて高い。抗原に対する
高度に特異的な反応性のために、あらかじめ投与する宿
主の正常組織との反応性を調べて交叉反応しないものを
選ぶことにより、宿主組織に対する抗体の攻撃に由来す
る副作用をほとんどなくすことができる。また、物質と
しての純度の高さの故に、従来の血清療法にありがちで
あった夾雑物質に由来するアレルギー反応等の出現頻度
が低下する。

本発明で使用する抗体は、例えば次のようにして製造で
きる。

Ａ、民化寛ユ」胞を調製する王稈： ヒ［−前立腺癌細胞に対する抗体産生細胞はヒトを含め
たいずれの動物種から得てもよく、またあらかじめ免疫
を行なうことは必須ではないが、これを行なうことによ
って目的とするハイブリドーマの採取効率を著しく１げ
ることができる。

ヒトの細胞を用いる場合には、前立腺癌の病歴のある者
や血清中の該細胞に対する抗体価が高い者を選ぶことが
できる。癌細胞の免疫においては、癌細胞そのものまた
はグルタルアルデヒド処理やマイトマイシン処理により
増殖性を失わせたｍｌ胞を用いてもよく、また細胞より
該表面抗原を適当な方法で分離、精製したものを用いて
もよい。また免疫に際し、フロイント完全または不完全
７ジコバントのような助剤を免疫原に混入して用いるこ
とができる。免疫の際の免疫原投与法は、皮下９− 注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮肉注射、筋肉内注射
等いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ま
しい。免疫は１回または適当な間隔、好ましくは１週乃
至５週をおいて繰り返し行なってもよい。免疫した動物
の血清中の該細胞に対する抗体価を測定し、抗体価が充
分高くなった動物を抗体産生細胞のソースとして用いれ
ば、その後の操作の効率を上げることができる。融合に
は、最終免疫後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を
用いるのが好ましい。該抗体産生細胞は形質細胞および
その前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体のいず
れの部位から得てもよいが、一般には牌、リンパ節、末
梢血またはこれらの適宜の組み合わせから得ることがで
きる。

Ｂ、細胞融合の工程： もう一方の親ＩＩｌ飽であるインビトロにおいて長期継
代培養可能な細胞は、抗体産生細胞と融合し一１ハ− て目的にかなったハイブリドーマを生ずるものであれば
いずれでもよいが、その確率の高いのは骨髄腫等の白面
病細胞である。由来の秤も、ヒト、ラット、マウス等い
ずれでもよい。後述するように、融合後混在する親細胞
を除くためにはヒボキサンチングアニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ欠損細胞またはブミジンキナーゼ欠
損細胞を用いるのが好ましい。例えば、ヒト由来のＧＭ
１５００−６Ｔ　Ｇ　−Ａ　Ｉ２．　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　８
２２６．マウス由来のＰ３−Ｘ６３−Ａ（＋８．　Ｐ３
−ＮＳ　Ｉ／１−Ａ（＋４−１．５ｐ２１０−Ａｏ　１
４．　Ｘ６３−Ａ＜１８，６５３等を用いることができ
る。

上述の抗体産生細胞の由来する種と長期継代培養可能な
細胞の由来する種が同一であることは不可欠ではないが
、融合の効率、融合後の細胞の性質の安定性、生体内で
培養する際の簡便さなどの点から、一般には同一のもの
を用いる方が右利である場合が多い。特に長期継代培養
可能な細胞として、マウス由来のＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８
．　Ｐ３−ＮＳ　Ｉ／１−Ａ（＋４−１．５ｔ１２１０
−Ａ（１１４またはＸ　６３−　Ａ　（］８．６５３を
用いる場合には、抗体産生細胞を得る動物として、同系
マウスであるＢＡＬＢ／ｃまたはその交雑マウスを用い
るのが有利である。融合に際しては、センダイウィルス
、ポリエチレングリコール等の融合促進剤を用いるのが
よく、特にポリエチレングリコール１０００，１５４０
，２０００．４０００または６０００などを用いるのが
好ましい。これを約３０〜５５％含む溶液中で融合を行
なわせる。助剤として更にジメヂルスルホキシドを添加
してもよい。

Ｃ，ハイブリドーマの樹立： 融合後の混合物中には、ハイブリドーマの伯、親細胞で
ある抗体産生細胞とインビトロで長期継代培養可能な細
胞等が残存している。前者は通常長期間のインビトロの
培養に耐えられないので問題はないが、後者は目的とす
るハイブリドーマと共に増殖する可能性があるのでこれ
を除くことが望ましい。このため４１として、ヒボキサ
ンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼまた
はチミジンキナーゼ欠損株ａ胞を用いて融合をさせた後
、ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびデミジンを含
む培地中で培養する。これによりハイブリドーマのみを
選択的に生育させることができる。親細胞としてヒボキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼま
たはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用いない場合には、
融合に先だって該細胞をエメチンおよびアクチノマイシ
ンＤで処理して細胞の増殖性を失わせておくことにより
、ハイブリドーマを親細胞との混合物から選択してもよ
い。

このようにして得たハイブリドーマは、一般には２種類
以上のクローンを含むことが多く完全に同一の性質を有
する細胞の集団ではない。個々のクローンを分離したい
場合には、クローン化を行なうことが必要である。クロ
ーン化は、単一の特異性をもつ抗体を製造するためには
勿論であるが、多種類のクローンが混在する系において
長期間培養を行なっている間にしばしば起こるポピユレ
ーションの変化を防ぐ意味からも有効であり、行なうこ
とが望ましい。クローン化の方法としては、限界希釈法
、軟寒天法、フィブリンゲル法を用いることができる。

また螢光活性化細胞選別装置を用いてクローン化の際の
細胞の分離を行なうことも可能である。また、長期間培
養の間に起こる変異株の出現に対し、時々クローン化を
行なうことで元の細胞の性質をもった細胞を保存するこ
とができる。以上のような製造方法に従って作製したヒ
ト前立腺癌に対する抗体を分泌するハイブリドーマの例
としては、後述の実施例に示すようにＰ−００１，Ｐ−
００２，ｐ−００３またはｐ−００４が挙げられる。

本発明のハイブリドーマは、対数増殖期において、凍害
防御物質として５％（Ｖ／Ｖ）のジメチルスルホキシド
を添加した牛胎児血清中に１〜１０×１０′個／１に懸
濁して凍結することで長期間保存することができる。そ
の場合、凍結時の冷却速度は−１℃／分であることが望
ましく、また保存は一８０℃以下で行なうのが好ましい
。

解凍はなるべく１みやかに行なうのがよく、融解後直ち
に細胞を培地で洗浄してジメチルスルホキシドをとり除
けば、そのまま通常の培地に懸濁して培養を再開するこ
とができる。但し解凍した時点での細胞の生存率が悪く
、増殖活性が著しく低い場合には、適宜マウス牌細胞な
どを加える必要がある。

Ｄ、肛碧（７）　’ＪＪ　’＞’Ｍ　：抗体の製造にあ
たっては、ヒト前立腺癌細胞に対する抗体を産生ずるハ
イブリドーマを、インビトロまたは生体内（インビボ）
で培養する。

インビトロの培養の場合には、本発明のハイブリドーマ
増殖のために適当な栄養培地、たとえば１０％（Ｖ／Ｖ
）の牛胎児血清、５ｘｌＯ−５Ｍのβ−メルカプトエタ
ノール、Ｉｎ＋Ｍのピルビン酸ナトリウムおよび抗生物
質を含有したＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０培地を用いること
ができる。また、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に代えて、
４．５ｏ／Ｌのグルコースを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ　ｓ
　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｅａｇｌｅ　ｓ　　ＭＥＭ　（
以下、１１−ＭＥＭと略す）を用いてもよい。細胞を増
殖させる時の適当な初期濃度は、各々のハイブリドーマ
によって異なるが一般に約１０　　個／ｍｌであり、培
養中の細胞濃度は２×１０　　個／ｍｌを越えないこと
が望ましい。

また、本発明のハイブリドーマを生体に移植して固型ま
たは腹水型で増殖させ、その生体より体液、望ましくは
白酒または腹水を採取することにより、該ハイブリドー
マが分泌する抗体を製造することができる。この方法に
よって得られる粗製抗体液は、不純物として宿主となっ
た生体由来の種々の物質を含むという欠点をもつ一方、
生体外（インご１−口）の培養によって得られる抗体液
に比べて著しく高濃度の目的抗体を含むという点で優れ
ている。ハイブリドーマを腹腔に移植して増殖させる場
合においては、移植の前、好ましくは３〜９″ＩＭ間前
にブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメヂルペン
タデカン）を腹腔内に投与しておくことにより、粗製抗
体液の収量を高めることができるが、この処置は必須ぐ
はない。なお、宿主として用いる生体は、移植するハイ
ブリドーマの親細胞と同種同系の動物が望ましい。この
場合には、通常、特別の処置をしなくてもハイブリドー
マはその生体内で増殖するが、ハイブリドーマと宿主の
１７− 組織適合性抗原型が一致しない場合、一般に宿主生体に
抗リンパ球抗体投与、Ｘ線照射等の処置をあらかじめ施
しておくことが必要である。移植後、細胞が生長してく
るまでに通常１週間から３週間を要する。

ハイブリドーマを生体外または生体内で培養して抗体を
産生分泌させる時に、放射性同位元素標識のロイシンま
たはりシン等の放射活性物質を培地中に添加または宿主
に投与することにより、分子内部に放射活性物質を含み
、化学構造が非標識物と全く変わらない抗体を製造する
ことができる。

本発明の抗体は、粗製抗体液のまま使用してもよいが、
硫酸アンモニウム分画法やイオン交換クロマトグラフィ
ーなど免疫グロブリン精製の常法に従って、或いは、ｐ
　ｒｏｔｅｉｎ　　Ａや抗原によるアフイニティクロマ
トグラフィー等により精製して用いることができる。

１８− 抗体は、そのまま投与してもよいが、抗体の代わりに抗
体を化学的又は酵素的処理によって限定分解して得た抗
体の部分たとえばｒ（ａｂ′）２　を用いることもでき
る。これにより、補体結合反応等が非特異的に生じて宿
主の組織を障害する可能性を除くことができる。また、
マイトマイシンや塩酸ドキソルごシンなどの抗癌剤やリ
シンなどの毒素を化学的に結合させた生成物を用いるこ
とにより更に高い効果が発揮される。その作用機序は、
投与された抗体がヒト前立腺癌細胞表面の抗原と結合す
るに伴い、補体結合反応や体内のマクロファージその他
の免疫系細胞の癌細胞に対する攻撃が促進されることに
よると考えられる。制癌剤や毒素と抗体との結合物を用
いる場合、その作用機序は、投与された結合物質がヒト
前立腺癌細胞表面の抗原と結合するに伴い、抗癌剤や毒
素が癌細胞を攻撃することにＪ、るものであり、この場
合、抗癌剤や毒素単独投与時と比べ副作用は極めて低く
なり、効果が増強される。

本発明の抗体または抗癌剤結合物の急性毒性を知るため
、３群のＩＣＲマウス（１群１０匹）の第１群に経口投
与で２ａ／　ｋｏ、第２群に腹腔内投与で４００ｍＭ　
ｋｏ、また第３群に静脈内投与で２０．Ｏｍｇ／ｋｇを
それぞれ投与し、１４日間観察したが、死亡は認められ
なかった。したがって、本発明の抗体および抗体・抗癌
剤結合物は、極めて安全なものであるといえる。

抗体及び該抗癌剤結合物は、注射剤として皮下注射、筋
肉的注射、静脈内注射、好ましくは皮下または筋肉的注
射で投与することができ、また経口投与によっても、そ
の一部が抗体としての構造を保持したまま腸管を通過し
て吸収されることが確認されているので、経口投与剤と
して投与することも可能である。

注射剤の製剤方法としては、例えば、抗体そのものまた
はマイトマイシンもしくは塩酸ドキソルビシン結合抗体
１０ｍｇとマンニトール５０ｍｇを蒸溜水に溶解させて
１０ｍ）とし、常法で除菌した後、２ｍｌずつを注射用
小瓶に分注し、そのまま凍結乾燥して注射剤とする。こ
の場合、使用に際しては生理食塩水に溶解または！！濁
させて注射液とする。この他、注射剤の製剤には、本発
明の抗体または抗癌剤結合物の他に、担体、希釈剤、緩
衝剤、安定化剤、等層剤等を添加してもよく、常法によ
って皮下注射剤、筋肉注射剤および静脈内注射剤とする
ことができる。

経口投与剤としては常法により腸溶剤の形で用いること
ができる。

投与ｍは、主として症状に左右されるが、マウスなどの
動物で０．００１ｍｇ〜１０（１／Ｋ（１／日、ヒトで
は０．０１〜３０００ｍｏ／人／日である。

＝２１一 本発明の方法を適用できる熱押はヒト前立腺癌であれば
いずれでもよく、また、本発明の方法に使用できる抗体
も、ヒト前立腺癌に対する抗体産生細胞とインビトロに
おいて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマ
より分泌される抗体で、ヒト前立腺癌と反応する抗体で
あればいずれでもよく、例えば後記表−１に示すような
ハイブリドーマによって分泌される抗体が例示できる。

その特異性、免疫グロブリンクラスは後記表−２に示す
通りである。

また、これらの抗体および抗癌剤結合物は必要に応じて
混合して用いることもできる。

以下、具体的な実施例を述べる。

長期インビトロ継代培養ヒト前立腺癌細胞８Ｐ２２− Ｃ９３２Ｘ１０５個を、１００Ｉｊｆ（性器（Ｆ　ａｌ
ｃｏｎ　３００３）中で、イーグルスＭＦＭアール塩（
以下ＭＦＭと略）に１０％（Ｖ／Ｖ）生胎児自消および
抗生物質硫酸カナマイシン（最終濃度６０ｍａ／　Ｌ　
）を添加した培地で、３７℃、５％炭酸ガスを含む湿っ
た雰囲気中で培養した。３日後、細胞をポリスマンで剥
離し、培養上清を遠心で除き、さらに、リン酸緩衝生理
食塩水（ｐｌ］７．２、以下ＰＢＳと略）で遠心分離洗
浄後、ＰＢＳに懸濁させた。１枚の培養器より約２Ｘ　
１０’個の細胞が得られた。

（２）　ｆＬ！１ｉＬＩＩ重細胞の培養マウス骨髄腫細
胞Ｓ　ｐ２／　Ｏ−Ａ　ｏ１４１０　’個／ｍｌを、Ｄ
−ＭＥＭに牛脂児面清１０％（Ｖ／Ｖ）、ピルビンｉｌ
ｌ　ＩＩＩＩＭ　、グルタミン２ｍＭおよび硫酸カナマ
イシン６０ｍｇ／ｌ−を添加した培地で培養し、３日ご
とに継代した。Ｓ　ｐ２／　０−Ａ　ｏ１４は、細胞融
合を行なう前日に２，５ｘ　１０５個／ｍｌに細胞濃度
を調整し、上記の培地で培養した。

（３）８ＰＣ９３１胞による免疫 雌性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（日本チャールズリバー礼、９
週令）に０．５１のＰＢＳに懸濁した上記（１）の８Ｐ
Ｃ９３細胞１０　　個を２回、約３週問おきに腹腔内に
注射することで免疫した。

（４）細胞の融合 細胞の融合をにδｈｌｅｒおよびＭ　１ｌｓｔｅｉｎの
方法に準じて実施した（　■ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　
；　（：、　Ｉｉｒ＋１ｃａｌＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　１９８０　
ｓ　ｅｄ。

ｂｙ　　ＮａｋａｍｕｒａＲ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｅ、　Ｓ、　ＡｔａｎＲ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、Ｎ、　Ｙ
、、　１９８０．　ｐｐ３０１〜３２４　）。

最終免疫後４日目にマウスを層殺し、牌を取り出し、よ
くほぐした後、１５０メツシユのステンレスメツシュに
通し、４００Ｘ　ｇで遠心分ｌ！ｉ後、沈澱した細胞に
０．７４７％塩化アンモニウムを含むトリス・塩酸緩衝
液（０，０１７Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン、　　ｐ＋−＋　７．６５　）を加えて赤血球を
除去１ノ、遠心（４００Ｘ！ＩＩ　’）で１！！？細胞
を集めた。

ＭＦＭを加えて遠心分１ｔｌｆｆ　（４００ｘｇ　）を
行ない、細胞を新たなＭＥＭに懸濁する操作を３回繰り
返すことで洗浄し、最終的にＭＥＭに懸濁した。

３　ｐ２／　Ｏ−Ａ　ＩＪ１４は培養容器よりピペッテ
ィングではがし、遠沈管に移した。遠心分ＩＩＩ　（４
００ｘｇ　）後、集めた細胞にＭＥＭを加えて懸濁、遠
心分離（４００ｘａ　）することで血清を除去した後、
ＭＥＭに再懸濁した。上記牌細胞１０ｘ１０７個と５ｐ
２１０−△（＋１４　２Ｘ　１０２個を混合し、よくピ
ペッティングした後、遠心分１ｉｆｔ　（４００Ｘｇ　
）　ｌ、た。上清を除いた後、軽く遠沈管をたたくこと
で沈澱をほぐした。ＭＥＭに３０％（Ｖ／Ｖ）のポリエ
チレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　１０００）を加えたも
のを３７℃に保温し、その０．６ｍｌをほぐした細胞に
加えた。ゆるやかに撹拌後、５分間室温に４いた。７Ｘ
ｇで遠心２５− を２分間行なった後、ＭＥＭをゆっくりと５ｍｌ添加し
た。ゆるやかに撹拌後、４００ｘ　ｇで５分間室温で遠
心した。上清をすて、沈澱に５ｍｌのＭＥＭを加え、同
様に遠心分離し、上清を除去した。沈澱した細胞に５１
の次の培地を加え、ピペッティングした。培地としては
、Ｄ−ＭＥＭに、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清、２Ｉｌ
１Ｍノクルタミン、５×１０−５Ｍのβ−メルカプトエ
タノール、６０ｍｏ／　Ｌの硫酸カナマイシンを加え、
さらにグルコースを４．５ｏ　／　Ｌとなるように添加
したものを用いた。

なお、この培地をＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳと略称する。

上記１０ｍ１の細胞懸濁液に４０１のＤ−ＭＥＭ−ＦＢ
Ｓを加え、その２５１ずつを２５０Ｉｌｌ”培養フラス
コ（コーニング社、Ｃ−２５１００＞に分注し、たてて
３７℃で、炭酸ガス５％を含む湿った雰囲気中で１晩培
養した。なお、培養は以下同様の条件で行なった。翌日
、軽くピペッティングをした後、遠心管に移して、４ｏ
ｏｘｇｒ遠心分Ｎ１を行なった。上清を除去した後、１
ｘ１０　　Ｍヒポキリーンヂン、４×１０−′ｒＭ　７
　ミ／　フ７　！Ｊ　’、／オＪ：（Ｆ　１．６ｘ　ｉ
ｏ−”Ｍチミジンを含むＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ　（以下、
ＨＡＴ培地と略す）　６０ｎ＋Ｉに懸濁し、その０．１
１を９６つＩル培養用プレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０
７２＞の各つＪルに入れ、１週間培養した。その後、２
５μｍのＬＩ　Ｔ培地を２０又は３日ごとに添加した。

ＨＴ培地としてはＩ」ＡＴ培地からアミノプテリンを除
いたものを用いた。

Ｂ、抗体産生ハイブリドーマの選択および増殖細胞融合
後、２週間めに酵素結合固相免疫測定法で、各ウェル上
清中の８ＰＣ９３細胞に対する抗体産生の有無を調べた
。

８ＰＣ９３細胞をプレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０７２
）に固定し、上記各ウェル中の培養上清４０μｍと室温
で２時間反応さぜた後、よ＜ＰＢＳで洗浄し、馬血清で
１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免
疫グロブリン抗体（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌ　ａｂ、　　Ｉ　
、ｎｃ、。

アメリカ、カタログ番号３２１１−０２３１）　　１０
０μｍと２時間反応させ、その後、よ＜ＰＢＳで洗浄し
た。

クエン酸緩衝液（０，１Ｍ、　　Ｉ）Ｈ４，５）に基質
（０−フェニレンジアミン）を１ｍｇ／ｍｌおよび３１
％過酸化水素水を０．４μｍ／ｍ１加えた溶液を２００
μｍ入れ、３０分発色反応を行なわせた。８ＰＣ９３細
胞と反応する抗体を含有する２ウエルにつぎクローン化
を行なった。クローン化は、限界希釈法を用い、以下の
通りに行なった。

抗体産生陽性の２ウエルのハイブリドーマ１００個をそ
れぞれＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に懸濁し、一方、上記Ａ、
（４）の融合に使用したと同様の方法で、ＢＡＬＢ／ｃ
マウスより稗細胞１０”個をＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に調
整し、２種の細胞を混ぜ合せた。細胞密度５Ｘ　１０’
個／ｍ１となるようにＤ−ＭＥＭ−Ｆｒ３Ｓを加え、０
．２１を９６ウエル培養プレーｉ−（Ｆａｌｃｏｎ　３
０７２）の各ウェルに入れ、培養した。培養開始１４日
後に、上記の酵素結合同相免疫測定法でハイブリドーマ
の抗体産生の有無を各つｒルにつき検討した。その結果
、表−１に示した４株を含め、総計３８株のハイブリド
ーマが得られた。

Ｃ０抗体の生産＝　（インビトロ培養による生産）ハイ
ブリドーマＰ−００１，Ｐ−００２，Ｐ−００３または
ｐ−００４を２０％牛脂児血清、　２１１１Ｍグルタミ
ン、　１ｍＭピルビン酸、４．５（１／ｌ−のグルコー
ス、　　５Ｘ１０−ＳＭのβ−メルカプ１−■タノール
および５０ｍｏ／　Ｌの硫酸カッマイシンを含むＤ−Ｍ
ＥＭに、ｌＸ１０５個／Ｉｎ＋になるように懸濁させ、
この細胞懸濁液２５１を７５ｃｍ　　組織培養用フラス
コ（］−ニング社。

アメリカ）に分注し、３７℃で５％炭酸ガスを含む炭酸
ガス培養器中で培養を行なった。増殖がほぼ２９一 定常に達した４日目に、培養上清を採取した。この時の
細胞数はいずれも約２×１０　　個／ｍｌであり、上清
の抗体含ωは各々３．１μｇ　／ｍｌ、　　２．８Ｍｇ
／ｍｌ、　　２．８μａ　／ｍｌ、　　２．５μｇ／ｍ
ｌであった。

（インビボ培養による生産）ニブリスタン（２，６゜１
０．１４−テトラメヂルペンタデカン）　　０．５ｍｌ
を腹腔内に投与後１０日から３００日目ＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に、インビトロで増殖させたハイブリドー
マＰ−００１，Ｐ−００２，Ｐ−００３またはＰ−００
４を５×１０　　個接種した。接種後２ないし３週目に
腹水を採取し、遠心弁１１１ｔ　（１０００Ｘ（＋　、
　　４℃、１５分間）により腹水上清を得た。各ハイブ
リドーマにつき１０匹のマウスから約３０ｍ１の腹水上
清が得られ、その抗体含量は各々２．５ｍＭｍ１．　２
．Ｏｎ＋Ｍｍｌ、　　１．５ｎ＋。

／ｍｌ、　　１，８１ＨＪ／ｍｌであった。

これら４株の形状、大きさ、性状を表−１に示す。

３０− なお、これら抗体を１群１０匹のＩ　ＣＲマウスに２０
／　ｋ（ＩＩ　口、４００ｍ！’］／　ｋｇ腹腔内また
は２００ｍＱ／　ｋｇ静脈内投与し、１４日間観察した
ところ、これら抗体による死亡は全く認められなかった
。

−９１− 表−１ ３２− ４２１１〜口で継代されている次の細胞を用いた。

Ｉ　ｎｔｅｓｔｉｎｅ　４０７　（ヒト胎児小腸細胞株
）　、Ｋ　−５ｅ２（ヒト白血病細胞株）、１３ｒｉ７
（ヒト末梢面リンパ球株）および８ＰＣ９３（ヒト前立
腺癌細胞株）。

実施例１で得られた培養上清を用いて、上記細胞との反
応性を酵素結合固相免疫測定法により調べた。表−２に
示す如＜８ＰＣ９３に極めて特異的な抗体が得られた。

Ｂ、螢光抗体法による細胞染色 ハイブリドーマの１つＰ−００２が分泌する抗体を用い
て、８ＰＣ９３細胞を間接螢光抗体法で染色した。

８ＰＣ９３細胞を無螢光のガラススライドに固定し、培
養上清５０μｍと３７℃、４５分湿った雰囲気中で反応
させた後、ＰＢＳに１％牛而自消ルブミン、１ｏ　ｍＭ
　　１−ＩＦＰＥｓ　（Ｎ−２−ヒｔ’ロキシＩチルヒ
ペラジンーＮ′−２−エタンスルホン酸）および０．１
％アジ化ナトリウムを添加した溶液に、３分から５分処
理することで洗浄を３回行なった。フルオレッセイン結
合抗マウスＩ　ｇＧ　（Ｍ　１ｌｅｓ　−ＹｅｄａＬｔ
ｄ、、イスラエル、コード番号６５−１７１　）を２０
倍希釈した溶液５０μｍと、上記と同じ条件でさらに４
５分反応させた。洗浄も同様の手法で行なった。乾燥さ
せた後、炭酸緩衝・グリセリン液（０，０５Ｍ。

ＤＨ９，５，１０％グリセリンを含む）を重層し、カバ
ーグラスをのス螢光顕微鏡（オリンパス、モデルＡ　Ｉ
−１−ＲＦ　Ｌ　−Ｌ　Ｂ　）で検鏡した。その結果、
８ＰＣ９３細胞表面で強い螢光が観察された。なお、使
用したフルオレッセイン結合抗マウスＩｇＧは、あらか
じめ８ＰＣ９３１１ｆｌ胞で６回吸収操作を行なった。

Ｃ０免疫グロブリンクラスの同定 抗体の免疫グロブリンクラスの同定を酵素結合固相免疫
測定法で行なった。ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫
グロブリン抗体として、抗免疫グロブリン（Ｉｌｌ）、
抗１０Ｇ１抗１（ＩＭ（いずれもＣａｔ＋ｔ＋ｃｌ　Ｌ
　ａｈ、　　Ｉ　ｎｃ、、アメリカ、カタログ番号３２
１１−０２３１．３２１１−００８１．３２１１−０２
０１　＞を用いた。

検討した４種の抗体は、いずれも表−２に示したように
Ｉ（ＩＧであった。

−ｆｌ＋：１− 表−２ ＋：反応陽性、−：反応陰性 ＝３Ｇ− ハイブリドーマＰ−００１，Ｐ−００２，Ｐ−００３ま
たはＰ−００４から得られた抗体く腹水上清を精製した
抗体）を蒸溜水にて１０．４ｍ（Ｊ／ｍｌに調整し、こ
れに１３、Ｏｍｇのマイトマイシンを加え、撹拌下に塩
酸で溶液のρ１−１を４．７５に調節しつつ、３．７ｍ
ｇの１−．１デル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
ジイミド塩酸塩を加えて１０．　３０または６０分間反
応させ、酢酸緩衝液（　　ｐＨ　４．７０　）　　２ｍ
ｌを添加することにより反応を停止させた。次いで、反
応液を４℃で７２時間　５Ｌの蒸溜水に対して透析した
。

なお、透析外液は３回交換した。透析内液を濃縮した後
に、３　ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５”（ファルマシア，
スウェーデン）を充填した直径１．５ｃｍ．高さ５５ｃ
ｍのカラムを通して反応液中の低分子物質を完全に除去
し、得られた溶液を一２０℃で凍結乾燥し、マイ３７− トマイシンと抗体の結合物を得た。なお、抗体１ｍｇ当
りの結合量は表−３に示す通りである。

上記の操作に準じて、抗体ど塩酸ドキソルビシンとを反
応せしめて、結合物を得た。抗体１ｍｇ当りの塩酸ドキ
ソルビシンとの結合量は表−３に示す通りであった。

なお、これら抗体と抗癌剤との結合物（６０分間反応物
）を１群１０匹のＩＣＲマウスに４００＋ｎｇ／　ｋｇ
経口，　　１００＋１１０／　ｋａ静脈内または５０ｍ
ｇ／　ｋｏ静脈内投与し、１４日間観察したところ、こ
れら薬剤投与による死亡は全く認められなかった。

へ・　　　　　　　　　　　−３８− 表−３ １１」（１止且イｙχ津Ｊ１ロ１１」」インビトロで継
代されているヒト前立腺癌細胞株８ＰＣ９３を用い、抗
体および実施例３で得た制癌剤と抗体との結合物質の抗
Ｉｌｉ！瘍活性を調べた。

すなわち、１０％の牛胎児血清を添加したＥａｇｌｅｓ
ＭＥＭ培地で上記細胞を５ｘ　１０　　／　ｍｌの濃度
に調整し、５ｍｉずつシャーレに分注し、３７℃で５％
炭酸ガスを含んだ炭酸ガス培養器中で２４時間培養を行
なった後、ハイブリドーマＰ−００４由来抗体又は実施
例３で調製したハイブリドーマＰ−００４由来抗体とマ
イトマイシンとの結合物（６０分間反応物質）を加え、
さらに培養を行なった。薬剤添加後、２４時間目にＬ　
−［ＬＪ−”’Ｃ’］ロイシン（Ｒ２Ｏ社。

アメリカ、比放射活性３４２ｍ　Ｃｉ　／ｍ　ｍｏｌｅ
）　　１ｕＣｉ／ｍｌを加え、更に２時間培養を行なっ
た。培養終了後、培地を除き、細胞を０℃に冷却したＰ
Ｂ　Ｓ　（ｐｆ−（、、，７，２）で３回洗浄し、５％
トリクロル酢酸溶液で処即し、洗浄細胞を濾紙に移して
乾燥させた。そして、液体シンデレージョンカウンター
（パラカード社、アメリカ）を用いて、細胞内蛋白質に
取り込まれた放射活性を測定した。

その結果、第１図に見られるように、マイトマイシンと
抗体との結合物添加により、放ｔＦ１ｇ性取り込みの５
０％ｌ害濃度が対照に比して低下した。

Ｘ濃側５　抗体のインビボ抗腫瘍効果 １群１０匹の雌性ＢＡ　ＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎ＋１マウス
にヒト前立腺癌細胞株８ＰＣ９３を６Ｘ　１０５個／匹
、腹腔内移植し、５時間後及び１２時間後にハイブリド
ーマＰ−００４由来抗体またはハイブリドーマＰ　−０
０４由来抗体とマイトマイシンとの結合物（６０分間反
応物質、マイトマイシンとして５０μｇ／ｌ）を５００
μｇ／匹（マイトマイシン換算２０μｇ／匹）腹腔的投
与し、６０日間４ト存率を観察することにより、抗腫瘍
活性を調べた。

４１− その結果、第２図に見られるように、マイトマイシンと
抗体との結合物投与により５０％生存日数の延長がみら
れた。また、抗体単独投与でも延命傾向がみられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例４のマイトマイシン−抗体結合物によ
る特異的殺細胞効果を示す図であり、第２図は、実施例
５のマイトマイシン−抗体結合物のインビボ抗腫瘍効果
を示す図である。 代理人弁理士今　　村　　　元 −４９− ン１トマＴシン　（Ａｇ／ｍｌ） 第２図 腫Ｓ朴厄後の日数 第１頁の続き ０発　明　者　吉汲親雄 国立市東２−１９−４６

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. （１）　抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞とインビトロにお
   いて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマに
   より分泌される抗体の一種またはそれ以上を含有するヒ
   ト前立腺癌治療用薬剤。
2. （２）　担体または希釈剤を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の薬剤。
3. （３）　該ヒト前立腺癌がヒト前立腺癌細胞株８ＰＣ９
   ３であることを特徴とする特許請求の範囲第１項または
   第２項に記載の薬剤。
4. （４）　該抗体がハイブリドーマＰ−００１，Ｐ−００
   ２゜Ｐ−００３またはｐ−００／Ｉにより分泌される抗
   体であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載
   の薬剤。 １−
5. （５）　ヒトまたは動物用であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の薬剤。
6. （６）　抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞とインビトロにお
   いて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマに
   より分泌される抗体に抗癌剤を化学的に結合させた物質
   。
7. （７）　該抗癌剤がマイトマイシンまたは塩酸ドキソル
   ビシンであることを特徴とする特許請求の範囲第６項に
   記載の物質。
8. （８）　該ヒト前立腺癌がヒト前立腺癌細胞株８ＰＣ９
   ３であることを特徴とする特許請求の範囲第６項または
   第７項に記載の物質。
9. （９）　該抗体がハイブリドーマＰ−００１，ｐ−００
   ２゜ｐ−００３またはＰ−００４により分泌される抗体
   であることを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の
   物質。 ２−
10. （１０）　　抗ヒト前立腺癌抗体産生細胞とインビトロ
    において長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドー
    マにより分泌される抗体に抗癌剤を化学的に結合させた
    物質の一種またはそれ以上を含有するヒト前立腺癌治療
    用薬剤。
11. （１１）　　担体または希釈剤を含有することを特徴と
    する特許請求の範囲第１０項に記載の薬剤。
12. （１２）　　該抗癌剤がマイトマイシンまたは塩酸ドキ
    ソルビシンであることを特徴とする特許請求の範囲第１
    ０項または第１１項に記載の薬剤。
13. （１３）　　該ヒト前立腺癌がヒト前立腺癌細胞株８Ｐ
    Ｃ９３であることを特徴とする特許請求の範囲第１０項
    乃至第１２項のいずれかに記載の薬剤。
14. （１４）　　該抗体がハイブリドーマＰ　−００１，Ｐ
    −００２゜ｐ−００３またはｐ−ｏｏ４により分泌され
    る抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第１３項
    に記載の薬剤。
15. （１５）　　ヒトまたは動物用であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１０項乃至第１４項のいずれかに記載
    の薬剤。
16. （１６）　　特許請求の範囲第１項乃至第５項および第
    １０項乃至第１５項のいずれかに記載の薬剤を用いるこ
    とからなるヒト前立腺癌の治療法。