JPH0753110B2

JPH0753110B2 - 細胞産生物を取得する方法

Info

Publication number: JPH0753110B2
Application number: JP60184369A
Authority: JP
Inventors: ヘルベルト・ユングフエル; ハインリツヒ・バルヒエト; ヴインフリート・アルベルト
Original assignee: ベ−リンガ−・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1982-05-04
Filing date: 1985-08-23
Publication date: 1995-06-07
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: IL68515A0; FI85282B; AU1414183A; PT76629B; DE3367412D1; EP0093436A2; LV11042B; JPS61205486A; YU94883A; IE54881B1; SU1424744A3; US5114847A; EP0093436A3; ES522086A0; DK199083A; FI85282C; EP0093436B1; ES8402346A1; FI831509A0; DD210708A5

Description

【発明の詳細な説明】本発明は永久培養可能な動物及びヒトの細胞系を製造す
る方法により得た細胞系を細胞産生物の取得のために使
用することに関する。従来から、科学的及び実際的理由
から、正常な動物又はヒトの組織とは無関係に、ヒト及
び動物の細胞を永久的に培養する努力がなされている。
このことは、従来は、満足のいくように成功しておら
ず、僅かな特別な場合にのみ、特定の血液細胞において
永久培養可能性が達成できただけである。

所定の抗原−結合特異性を有するモノクローン性抗体を
製造するためには、いわゆるハイブリドーマ（Hybridom
a−Technik）を使用することは公知である。このケーラ
ー（Ｋhler）及びミルスタイン（Milstein）により開
発された方法（Continuous culture of fused cells se
creting antibody of predefined specificity,Nature
256、495〜497頁、1975年、参照）を用いると、個々の
抗体（AK）形成性の細胞を潜在的「不死」にし、任意に
増殖させることができる。

AK−産生性細胞（Ｂ−リンパ球）と悪性変性した細胞
（骨髄腫）との融合により、双方の片親の特性（抗体を
産生する能力及び永久的生長する能力）を共に有してい
る細胞ハイブリツドを得ることができる。この新用語
「ハイブリドーマ」とは、ハイブリツド細胞（Hybrid−
zelle）と骨髄腫（Myeloma）との融合を意味する造語で
ある。

この方法に特殊性を理解し易くするために、抗体（免疫
グロフリン、Ig）の構造及び合成のいくつかの基本を示
す。Ig−分子は２本の同定容易（Ｌ）な鎖及び２本の同
定困難（Ｈ）な鎖から成つている。各々のＨ−及びＬ−
鎖は遺伝的及び機能的に異なる断片に分けられている。
抗体の抗原結合部位（combining sites）は、高度の配
列−異種性（Sequenz−Heterogenitｔ）を有する、い
わゆる可変部（variable region）内に形成されてい
る。多様なアミノ酸交換により、その形において、多数
の抗原に対して複雑である三次元的構造の大きなレパー
トリーが得られる。哺乳動物は10⁶〜10⁷個の種々の抗原
−結合部位を形成できることは認められている。

抗体は、Ｂ−リンパ球の合成産生物である。幹細胞から
のＢ−細胞の個体発生の間に、Ｌ−鎖に関してもＨ−鎖
に関しても、多く入手可能な可変部遺伝子１つと比較的
少ない固定部遺伝子の１つとが組合わされる。遺伝子会
合が行なわれると直ちに、当該Ｂ−細胞はその上に固定
され、１個の特有の型の抗体分子を形成し、この固定
は、その娘細胞にそれを遺伝する。抗原刺激なしに、こ
のＢ−細胞は貫生することなしに硬化し、静止状態にな
る。これは僅かな免疫グロブリンのみを生成し、かつ分
泌するが、その細胞膜内で堅固に固着した抗体を有し、
これは正確に、分泌された抗体と同様な抗原−結合部位
を有する。抗原が組織内に入ると、これは一連の複雑な
細胞作用でＢ−細胞を刺激する。

その膜−免疫グロビリンが抗原と特異的に反応するＢ−
細胞は、分裂し、分化して、抗体産生細胞（プラズマ細
胞）になる娘細胞のクローンを形成する。Ｂ−細胞クロ
ーンは同じ構造及び同じ抗原結合部位を有する抗体を形
成するので、この種のクローンの産生物をモノクローン
性抗体（monoklonar Antikrper）と称する。複雑に構
成された抗原例えば蛋白質、微生物又は細胞は、多くの
種々の抗体作用部位〔デテルミナント（Determinan
t）、エピトープ（Epitope）〕を有し、整合的に多くの
種々のＢ−細胞を刺激し、分裂し、クローンを形成す
る。従つて、その大きさ、電荷、特異性及び親和性に関
して異なり、免疫血清中に連合して現われる多数の抗体
が形成される。特定のデテルミナントに対して向けられ
た免疫応答も通例多クローン性である。マウスは、１個
の単純ハプテン即ち単離されたデテルミナントに対して
10³個までの種々の抗体を形成することができることは
公知である。この事実は、不可能でないにしても、再現
可能な方法で特定の抗原に対する抗血清を得ることが極
めて困難であることを説明している。従つて、数年来、
その方法で均一なモノクローン性抗体を得るための、与
えられた別々のＢ−細胞をクローン的に拡大させる１つ
の方法が試みられた。天然の前駆体は、悪性疾患として
従来からマウス、ラツテ及びヒトに公知であつた骨髄腫
もしくは形質細胞腫である。Ｂ−細胞が悪性に変性し、
無制限に増殖すると骨髄腫が生じ、この際娘細胞のクロ
ーンは多量の均一な抗体を産生する。特定の内部交配−
マウス種において、骨髄腫は化学的操作により誘起され
うる。しかしながら、過免疫化及び骨髄腫誘起の組合せ
により、公知の抗原結合特異性を有するモノクローン性
抗体を生じさせるすべての実験は成功していない。絶え
ず、試験管内で培養可能であり、ハイブリドーマ法の基
本となつている骨髄腫細胞系を得るこの努力がなされて
いた。ミルスタイン（milstein）及びケーラー（Ｋhl
er）による基本思想は、免疫化された動物からの正常の
Ｂ−細胞に培養可能で永久生長する骨髄腫を融合するこ
とによりハイブリツド細胞を得ることであつた。

彼等の最初の実験では、骨髄腫細胞を羊−赤血球で免疫
化されたマウスの脾臓からのリンパ球と融合させた。彼
等は10個の生存性ハイブリツドを得、それから、羊−赤
血球に対する特異性を有する２個の抗体を生じた。この
抗体−再生性ハイブリツドは、それが連続的に培養液中
で生長し、それの同種のマウスに移植すると腫瘍を形成
する点で、骨髄腫と類似している。更にこのハイブリツ
ド細胞が骨髄腫と同様に、液体窒素中で貯蔵され、長時
間にわたり生存可能に保存できることは、実際上極めて
重要であつた。

ハイブリドーマー製造の技術マウスを、抗原を用いる慣用の抗血清製造法により免疫
化し、通例、数週間の中断して繰り返す。融合の直前に
マウスを殺し、その脾臓を無菌条件下に切除する。脾臓
嚢を切り取り、脾髄を注意深く押し出す。脾臓リンパ球
（約10⁸細胞）を、細胞培養媒体内に懸濁させ、骨髄腫
細胞と1:1〜10:1の割合で混合する。この細胞混合物を
遠心により、試験管内の培地上に気密に詰め、液上の上
澄みの除去の後に融合培地〔30〜50％のポリエチレン−
グリコール−溶液又は懸濁され、不活性化されたセンダ
イ−ウイルス（Sendai−Virus）〕で処理する。融合培
地の洗出の後に、1ml当り約10⁶細胞の細胞密度を有する
細胞混合物を無菌の培養容器（点滴板）に移し、CO₂−
吹き込んだインキユベーター（Inkubator）中で培養す
る。融合の２〜４週後に、ハイブリドーマクローンの生
長が顕微鏡で認められる。この時点から、培養液上澄み
は、所望の特異性を有する抗体の存在に関して検査でき
る。このために、マイクログラム以下の領域で、抗体を
立証できる分析法（RIA、ELISA、免疫螢光）が必要であ
る。次いで、陽性の部分培養液からの細胞をクローン化
し、即ち単細胞培養を刺激する。単離されたクローン
（これは真性抗体を形成する）を拡げ、腫瘍誘起のため
に、プリスタン（Pristan）−前処理された同種マウス
の腹腔内に注射する。この接種の後６〜20日に、この腫
瘍の開始時に、血液又は有利に復腔（腹水）から均一な
抗体を得ることができる（マウス１匹当り、モノクロー
性抗体50〜150mgの収量）。

融合の後に、ハイブリツドと融合されなかつた細胞との
以上に不均質な混合物が存在する。マウス−脾臓細胞10
⁸個の使用時に、最大10³個の生存可能なハイブリドーマ
ー細胞を算出できる。このハイブリツド細胞はそれが増
殖する前に一定の始動時間を必要とするので（但し、融
合しなかつた骨髄腫は直ちに生長する）、選択法は、少
ないハイブリドーマの生残を確保すべきである。ハイブ
リドーマ法における標準選択法は、いわゆるHAT−選択
培地〔Littlefield、J.W:Selection of hybrids from m
atings of fibroblasts in vitro and their presumed
recombinants.Science 145、709〜710頁（1964年）参
照〕を基本とする。Ａは、アミノプテリン（Aminopteri
n）、DNS−合成の主要経路をブロツクする葉酸−拮抗因
を意味する。正常細胞は、これらに、培地中でチミジン
（Ｔ）及びヒポキサンチン（Ｈ）が供給されるかぎり、
チミジン−キナーゼ（TK）及びヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシル−トランスフエラーゼ（HGPRT）を
用いて、アミノプテリン−ブロツクを回避することがで
きる。細胞にこれら２酵素が欠けていれば、これらは、
HAT−培地中で生残不可能である。従つて、ハイブリド
ーマー発生のためにTK−又はHGPRT−欠落している骨髄
腫細胞の突然変異体を使用する。これらの細胞は、これ
らとその遺伝子プールと共に欠落酵素をそのハイブリツ
ド細胞中に挿入する正常細胞と融合させる際にのみ、生
残可能である。脾臓の融合されなかつたリンパ球は、培
養液中で、自然に限られた寿命を有し、従つて、ハイブ
リドーマのおそれはない。

ハイブリドーマー製造時には次の問題が生じる： 1. HAT−培地−選択融合しなかつた骨髄腫細胞の生長の選択的抑制は、前記
のように、ハイブリドーマークローンを得るための主要
な前提である。このHAT−選択は、しかしながら、正常
の、欠落してない細胞に対しても、細胞の分裂能及び生
残能に悪影響を及ぼす極めて非生理学的な方法である。
特にヒトのリンパ球においては、HAT−培地の成分を濃
度に応じて、HGPRT−陰性細胞を確実に殺し、これと反
対にHGPRT−陽性細胞を生存させるように調節すること
は極めて困難である。

使用リンパ球及び骨髄腫細胞の数との間の混合割合及び
増加可能なハイブリツドの収率は、次の数で示される：
典型的な融合バツチ中のマウス−リンパ球10⁸個の装入
時に、500ハイブリドーマークローンが一般に非常に良
好な結果に当てはまる。マウスの脾臓内では（それらが
繰り返し、（過剰）免疫化されていても）10⁴〜10³個の
細胞のみが、免疫原に対する抗体を形成する〔Jerne−P
laque−Technik、N.V.及びNORDIN、A.A.:Science 140、
405頁（1963年）参照〕ので、純粋に偶然制限されたハ
イブリドーマー形成では、所望の抗体−特異性を有する
クローンでのみ予期することができるように、クローン
10³〜10⁴個を引き出すことができるべきである。ヒトの
ハイブリドーマーの製造時には、この混合割合はなお著
しく、融合１回当り、ハイブリツド−クローン４〜10個
が得られる際に良好な結果として通用する。

2. 染色体−損失効果的融合の後に、新たに生じたハイブリツド細胞は、
自然に当初から存在する染色体量の約２倍を有して完成
されるはずである。実際の経験が示しているように、ハ
イブリツド細胞は、染色体を失なう傾向を有する。各々
の細胞分裂時に、染色体の非生理学的過剰量では、これ
らが、一様に２個の娘細胞に分配されない危険性があ
る。極めて僅かに生じ、従つて過剰生産では滞留しない
娘細胞は他に比べて選択利点を有し、培養液中の優先細
胞になる。しかしながら、免疫グロブリンの合成は、ハ
イブリツド細胞の生存能にとつては重要ではなく、過剰
合成能（Luxus−Synthese−Leistung）を示している。
従つて、ハイブリドーマークローン中の非プロデユーサ
ー変形（Non−Producer−Varianten）の現象が屡々現わ
れ、クローンの産生能を確保するためには、経費のかか
る再−クローン化法（Re−Klonierungs−maβnahmen）
が必要である。染色体を失なう傾向は、種間−ハイブリ
ツドの際に特に顕著である。

3. ハイブリツド免疫グロブリン骨髄腫細胞は悪性Ｂ−細胞であり、それ自体免疫グロブ
リンを形成する（未知の抗原結合特異性を有する）。こ
の能力は、骨髄腫細胞を正常のＢ−細胞と同様にハイブ
リドーマ中に入れる。Ig−分子の種々の連鎖を別々に合
成し、後に一緒にしてはじめて完全な抗体にされるの
で、１個のハイブリドーマー細胞（この中で２種の異な
るＬ−及びＨ−鎖が合成される）中に、偶然制限された
10の種々の組合せが生じ、そのうち、所望の真性抗体は
全−Ig−量の1/16のみに達する。従つて、多大の経費を
用いて、それ自体Ｈ−又はＬ−鎖を形成しないマウス−
骨髄種−細胞−突然変異体が開発された。しかしながら
ヒトのリンパ球の融合のためには、従来は、類似の充分
に開発された骨髄腫系は供給されていない。

なお不利な問題は、ハイブリドーマー法に対する変形に
おいて存在する： 1. ウイルスによるＢ−リンパ球の不滅化正常の供給者のヒトのＢ−リンパ球をエプスタイン−バ
ール−ウイルス（Epstein−Barr−Virus;EBV）の感染に
より悪性に形質転換することができる。EBV−感染され
たリンパ芽球細胞を連続的に、試験管内で培養し、クロ
ーン化することができる。しかしながら、ハイブリドー
マと比べて、EBV−リンパ芽球系は、不充分な産生安定
性で、1/10又はより少ない免疫グロブリンを産生する。
Ｂ−細胞は早い分化期にEBVで固定され、従つて、過渡
に屡々、非常に僅かな量でIgMを産生するクローンが得
られる。

同様に、マウス−Ｂ−リンパ球をアベルソン−マウス−
白血病−ウイスル（Abelson−Ｍuse−Leukmie−Vir
us;MuLV）により形質転換することができる。ここで
も、リンパ球は不都合に早い分化期で固定され、抗体産
生は悪い。

2. 形質転換されなかつたＢ−リンパ球の長時間培養最新の文献〔Spredni.B、等によるLongterm culture an
d cloning of nontransformed human B−Lymphocytes、
J.Exp.Med.154、1500〜1516頁（1981年）、Howard、M.
等によるLong−therm culture of normal mouse B−Lym
phocytes Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.〕は、Ｂ−リンパ
球を、形質転換せずに、特別な培養条件（永久分裂促進
刺激；リンホカイン−調節された培地等）により永久的
に培養し、クローン化する可能性を示している。モノク
ローン性抗体の通常の製造のために、この方法は、現在
までのところ、確実にはなお好適ではない。

従つて、従来の技術水準を次にまとめて記載することが
できる：正常の供給者のＢ−リンパ球は、人工的に不滅化するこ
とができる。ハイブリドーマー法では、培養液中で無制
限に増殖しうる生きている骨髄腫細胞（これは抗原刺激
性Ｂ−リンパ球と融合される）を使用する。細胞−細胞
−融合により生じるハイブリツド細胞を、HAT−選択に
より単離し、単細胞培養の構想によりクローン化する。
所望の特異性を有する抗体を形成するハイブリドーマー
クローンをモノクローン性抗体の大量生産のために増殖
させる。しかしながら、このHAT−選択から、染色体損
失及びハイブリツド免疫グロブリンにより著しい欠点が
生じる。

もう１つの他の方法で、Ｂ−リンパ球は、特別なウイル
スの感染により悪性に形質転換され、抗体合成の保持下
に永久に生長する細胞に変えられる。しかしながら、こ
れらは周知の弱い抗体産生体である。

従つて、所定の抗原−結合特異性を有するモノクローン
性抗体の大量生産に関して、このハイブリドーマ法は、
現在、その変形法よりも優れている。

しかしながら、このハイブリドーマ法も重大な欠点を有
する。その最も重要な欠点は、一方で、この方法は、HA
T−敏感な融合成分に限られ、他方で僅かな種類の細胞
即ちリンパ球及び神経細胞に限られていることにある。
本発明は、この欠点を排除し、永久に培養可能な動物及
びヒトの細胞系を製造する新規の有利な方法を得ること
を課題としている。

この課題を、本発明により、正常な動物及びヒトの細胞
と、試験管内で培養能に作用する生物学的成分との融合
により、永久培養可能な動物及びヒトの細胞系を得る方
法により解決され、この方法は、正常の動物及びヒトの
細胞を、単独では増殖不能な細胞フラグメントを用いて
形質転換された細胞と融合させ、培養液中で選択物質な
しに培養することよりなる。

本発明のこの方法において重要なことは、融合に使用さ
れるフラグメントが、なお増殖可能な細胞をまつたく含
まず、単独ではもはや増殖できないことである。

意外にも、この発明の方法で、変性されなかつた成分の
即ち正常細胞細胞質分の超過は、変性された細胞の悪性
特性を消失させず、従つて、形質転換された細胞と非悪
性細胞からの正常細胞質との融合により、悪性が解消さ
れることが公知（Shay.W.J.等によるSupression of tum
origenicity in Cybrids.J.Supramol.St.Cell.Biochem.
16、75〜82（1981年）参照）であるにもかかわらず、永
久生長の能力を排除する。同様に、骨髄腫細胞質をハイ
ブリツドに挿入しない場合に、細胞核を変性された細胞
の単離された核を有する細胞核が例えば骨髄腫核と一緒
になつて共通のゲノムになるか否かは予測できることで
はなかつた。

この融合は、公知方法で、融合因子物質特にポリエチレ
ングリコール又はセンダイ−ウイルス（sendai−Viru
s）の存在で行なうのが有利である。それというのも、
これによつて、ハイブリドーマ法におけると同様に、融
合収率を高める作用をするからである。他の融合因子物
質は当業者にとつて公知であり、同様に使用可能であ
る。

形質転換された細胞例えば骨髄腫細胞のフラグメントの
取得は、公知方法で行なうことができる。細胞壁を溶解
により又は機械的に破断するのが有利である。場合によ
つては遠心により、核フラクシヨンを細胞質フラクシヨ
ンから分離させ、これらのフラクシヨンを単独で使用す
ることができる。この分解を、細胞をグリセリン中で膨
潤させ、引続き、グリセリン不含の緩衝液中に入れるこ
とにより行なうのが特に有利である。こうして、細胞膜
が破裂する。もう１つの有利な方法は、細胞をサイトカ
ラシンＢ（Cytochalasin B:市場で入手されうる抗生物
質）で処理することにより、核質体と細胞質体を製造す
ることよりなる。この方法は、Biochem.Biophys.Res.Co
mm.63、669〜674頁（1975年）から公知である。この方
法では、なお細胞膜で包囲されている細胞核のみに、一
方で核質体及び同様に他方で膜で包囲された核のない細
胞質いわゆる細胞質体を生じる１種の細胞分裂が行なわ
れる。双方は、本発明の範囲内で、同様に、溶解による
か又は機械的に得られる細胞フラグメントもしくは核又
は細胞質フラクシヨン（これはもはや細胞膜で包囲され
ていない）と同様に、融合に好適であることが明らかで
ある。機械的崩壊は、当業者により公知の方法で行なう
ことができ、この方法は説明を必要としない。

細胞フラグメントは新鮮な状態でその製造の直後に又は
その後にはじめて融合に使用され−この際、後者の場合
には、凍結乾燥状態での保存が有効である。

形質転換された細胞とは、試験管内でかつ生体内で正常
の生長規則機構にもはや従がわないものと解される。こ
の例は、悪性変形した細胞例えば癌細胞、ウイルス感染
（例えばエプスタイン−バール−ウイルス）により変性
された細胞及び発癌物質で変えられた細胞である。

本発明の方法のために細胞フラクシヨンを使用する場合
には、これは完全に純粋である必要はないが、無傷の増
殖可能な細胞を含有していてはならない。

本発明の主要特徴は、得られるハイブリツドが、変性さ
れ、試験管内で培養可能な非ハイブリツド細胞の競争に
さらされず、従つて、その生長がHAT−選択物質によつ
ても抑制されないことにある。これによつて、ハイブリ
ツド上へのHAT−選択培地の非常に不利な影響は除か
れ、永久培養可能な細胞の収率及び生存能の決定的改良
が得られる。

更に本発明によれば、ハイブリツド形成のために、変性
された細胞としてHAT−敏感な細胞を使用することはも
はや前提ではない。HAT−敏感性を有せず、慣用のハイ
ブリドーマー法には使用できないが本発明の範囲では融
合用のフラグメントの製造のために使用できる永久生長
性の細胞系が存在する。

細胞をサイトカラシンＢ（CytochalasinB:菌−代謝物
質）により処理して、その核を極端な膨出で押し出す。
重力（例えば遠心）の影響下で、薄い結合体は容易に破
壊する。これにより、核のない細胞体（細胞質体）及び
細胞膜と細い細胞質縁部で包囲されている核（核質体及
びミニ細胞）が生じる。核質体も細胞質体も増殖性では
ないが、それらの特異的な機能は数時間〜数日間にわた
り保持される。核押し出しは、比較的高いサイトカラシ
ン−Ｂ−濃度を必要とし、この結合が破壊しないかぎ
り、完全に可逆性である。

低いサイトカラシン−Ｂ−濃度は、核突出なしに有糸分
裂による細胞分裂を抑制する。非粘着性細胞を得るため
の細胞質体／核質体製造のための標準法は、ウイグラー
（Wigler）、M.H.及びワインスタイン（Weinstein）、
I.B.によるプレパラテイブ・メソツド・フオア・オブテ
イニング・エヌクリエーテツド・ママリアン・セルズ
（Preparative method for obtaining enucleated mamm
alian cells）Biochem.Biophys.Res.Comm.63、669〜674
頁（1975年）に記載されている。

更に、前記のＢ−リンパ球だけでなく、他の従来試験さ
れていない動物及びヒトのすべての細胞も本発明によ
り、不滅化（Immortalisieren）することができる（実
施例６〜８参照）。従つて、例えばＴ−リンパ球（細胞
媒介免疫の担体及び免疫系の調節細胞）、内皮細胞（ヒ
トの臍静脈からの壁細胞）及び黒色腫細胞（冷凍保存さ
れた腫瘍転移物質から単離）等の種々の型の細胞を、本
発明の方法により永久生長体に変えること（不滅化）が
できた。

従つて、本発明による方法は、任意の動物及びヒトの細
胞を培養可能とし、こうして、細胞産生物例えば抗体、
凝固因子、酵素及びその他の細胞により合成される物質
を試験管内で製造する問題をも解決可能とする。同様に
本発明による培養は、化学物質の検査用の実験動物を著
しく不必要とすることを可能とする。

本発明のもう１つの目的は、本発明方法で製造された永
久培養可能な細胞系を、細胞産生物例えばモノクローン
性抗体、凝固因子、リンフオカイン、酵素及びその他の
蛋白質又は他の物質群に属する細胞産生物を得るために
使用することでもある。

殊に、本発明のこの実施形を、永久培養可能なＢ−リン
パ球の使用の際にはモノクローン性抗体の製造のため
に、永久培養可能な内皮細胞、黒色腫細胞、肝臓細胞、
腎臓細胞及び類似物を使用する際には凝固因子の取得の
ために、永久培養可能なＴ−リンパ球＋Ｂ−リンパ球及
び／又はマクロフアージの使用の際にはリンフオカイン
の取得のために、永久培養可能な腺細胞の場合には腺か
ら分泌される物質例えばホルモン及び類似物の取得のた
めに、使用することができる。本発明による不滅化のた
めに使用される動物細胞の種類に応じて、重要なすべて
の細胞産生物を得ることができることは明らかであるの
で、ここではそれを詳述する必要はない。

しかしながら、細胞産生物の取得は、原料細胞の産生物
即ち同種の細胞産生物に限らない。本発明により得られ
る永久培養可能な細胞は、その出発細胞からは形成され
ない即ち異種の、かつその遺伝子情報が遺伝子組換えの
方法ではじめて、永久ハイブリツド細胞（即ち異種であ
る）に挿入される細胞産生物の表出にも使用できる。異
種細胞産生物を永久ハイブリツド細胞により製造するこ
とは、例えば形質転換により作用されうる。従つて、実
験は、本発明による永久細胞内にベクターを用いてDNA
を導入することができ、従つて、導入したDNAによりコ
ードされた産生物の表出のために使用できることが明ら
かにしている。

本発明による永久培養可能な細胞は、更に、前記のよう
に、作用物質の検査対象としても使用できる。更に、本
発明により得られる不滅化されたハイブリツド細胞の遺
伝子情報源（これは所望の細胞産生物の発現をコードす
る）として、ハイブリツド細胞の遺伝子情報を有する成
分即ちそのゲノム、ゲノム分又はRNAを得て、遺伝子組
換え法により形質転換して適当な微生物にし、後者から
所望の細胞産生物を得るように、使用することもでき
る。

本発明の使用の変形によれば、細胞産生物例えばモノク
ローン性抗体及び他の細胞物質の製造は、次のように、
即ち、生じたハイブリツド細胞を、細胞産生物形成もし
くは物質合成のために直接、培養せず、そのゲノム又は
ゲノム分又はRNAを遺伝子組換え法で形質転換して適当
な微生物にし、後者をモノクローン性抗体又は細胞物質
の取得のために培養することによつても行なうことがで
きる。本発明のこの実施形では、ハイブリツド細胞のゲ
ノムを当業者にとつてそのために公知の方法で単離し、
適当なベクター（このために、市場で入手しうるベクタ
ーを使用することができ）を用い、このために開発され
た標準法により、形質転換して適当な微生物にする。

次に、形質転換された微生物を常法で培養し、所望の細
胞産生物をこれから得る。微生物としては有利に、遺伝
子組換に有効なＥ・コリー菌株の１種を使用するのが有
利である。

次に実施例につき本発明を詳細する。

ここで、次の略字及び商品名を用いる。

AK 抗体 Ig 免疫グロブリンＨ−もしくはＬ−鎖 Ig−分子の重い−もしくは軽い蛋白質鎖プリスタン（pristan） 2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン HAT−選択培地ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含有する
培地 TK チミジン−キナーゼ HGPRT ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル−トランス
フエラーゼ EBV エプスタイン−バール−ウイルス MuLV アベルソン−マウス−白血病ウイルス CB サイトカラシンＢ（抗生物質、ALDRICHBIOCH−EMICAL
S、Milwaukee USA） DMSO ジメチルスルホキシド DMEM デユルベツコス・ミニマル・エセンシヤル培地（Dulbec
co′sMinimal Essential Medium） FKS 牛胎児血清フイコル（Ficoll）蔗糖ポリマー（PHAMACIA） PEG ポリエチレングリコール PBS 燐酸塩緩衝食塩水 POD ペルオキシダーゼ ABTS 2,2′−アジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６
−スルホン酸）のアンモニウム塩 EBSS エールズ・バランスド・塩溶液（Earl′s Balanced Sal
t Solution） RPMI1640 ローズウエル・パーク・メモリー・インステイチユート
（Rosewell Park Memory Institute）の培地トリス（Tris）トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン PBL 末梢血液−リンパ球 MNC 単核細胞（リンパ球、単核白血球） hTSH ヒトの甲状腺刺激ホルモン β−TSH ヒトの甲状腺刺激ホルモンのβ−鎖 FA フロインドのアジユバンス（Freund′sches Adjuvans） CFA 完全なフロイドのアジユバンス IFA 不完全なフロイドのアジユバンスメトセル（Methocel）1500 メチルセルロース（FLUKA） CMV 細胞質膜嚢 FITC−コバスフエレス（Covaspheres）球形のフルオレツセインイソチオシアネート（COVA−LE
NTTECHNICAS、AnnArbor.Mich.U.S.A.） EAZ エールリツヒ腹水細胞（ATCC;CCL77）例１（参考例） A. ラインP3×63Ag8.653ATCC No−CRL−1580のマウス
骨髄腫細胞からの核質体及び細胞質体の製造〔Wingler.
M.H及びWeinstein.I.B.によるA preparative method fo
r obtaining enucleated mammlin cells.Biochem.Bioph
ys.Res.Comm.63 669〜674頁（1975年）に記載の方法参
照〕。

A.1 材料サイトカラシンＢ（CB.Aldrich Biochemical
s.Milwaukee.USA）をジメチルスルホキシド（DMSO Merc
k）中に溶かし（2mg/ml）、基本溶液として４℃で貯蔵
した。

フイコル−400（pharmacia;蔗糖ポリマー）を再蒸溜水
中に溶かし（1g/ml）、オートクレーブ処理し、50％基
本溶液として−20℃で貯蔵した。

１倍−及び２倍濃度のデユベツコス・ミニマム・エセン
シヤル倍地（DMEM）、牛胎児血清（FKS）、Ｌ−グルタ
ミン（200mモル／）、ベーリンガー・マンハイムのス
トレプトマイシン−ペニシリン。硝酸セルロース管をUV
−照射により滅菌した。

骨髄腫細胞系Ag8.653 ATCC CRL−1580:この系は、ケー
ルニイ（Kearney）、J.F.等による、ア・ニユー・マウ
ス・イエローマ・セル・ライン・ザツト・ハツト・ロス
ト・イムノグロブリン・エクスプレシヨン・バツト・パ
ーミツト・ザ・コンスツラクシヨン・オブ・アンチボデ
イセクリーテイング・ハイブリツド・セル・ラインズ
（A new mouse myeloma cell line that hat lost immu
noglobulin expression but permits the construction
of antibodysecreting hybrid cell lines）J.Immuno
l.123 1548〜1550頁（1979年）に記載されている。これ
はアザグアニン抵抗性であり、HAT−敏感で、Ｈ−もＬ
−Ig−鎖も合成しない。これをDMEM＋15％FKS＋グルタ
ミン＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋ピルベート
（＝DMEM−完全培地）中、37℃で、７％CO₂−雰囲気中
に保持する。

A.2 方法脱核:Ag8.653−細胞８×10⁷を10³upMで５分間
遠心分離し、12.5％フイコル−DMEM−CB−DMSO−溶液12
ml中に、細胞塊不含の顕濁液が得られるまでの長時間再
懸濁させた。細胞懸濁液各3mlを、予め４時間、12時間
前に調製されたフイコル−勾配溶液上に積層し、フイコ
ル不含のDMEM−CB−DMSO−溶液2mlをその上に積層し
た。この勾配溶液を有する試験管を超遠心機中、25000u
pM（31℃）で60分間遠心分離した。

この遠心終了後に、肉眼視可能なフラクシヨン（バン
ド）を長いカニユーレを有する注射器を用いて、上から
別々に集め、培地（添加物不含のDMEM）各20ml中で稀釈
し、遠心により沈殿させ、新しいDMEM中に再懸濁させ
る。

次の４フラクシヨンが得られた：ａ）細胞−デブリス（フイコル０〜12.5％間の範囲
で）、ｂ）核のない細胞質（フイコル15〜16％の範囲内で）ｃ）認識可能なプラズマ縁不含の核及び約２％の核不
含細胞（フイコル17〜25％の範囲で）ｄ）試験管底部の沈殿物としての、核を有し、良好に
認識可能なプラズマ縁を有する形態学的規準で無傷の細
胞及びプラズマ縁を有しない僅かな核細胞計測の結果、Ag8.653−細胞８×10⁷からｂ）内に細
胞質体1.25×10⁶個、ｃ）内に核質体４×10⁶及びｄ）内
に推定上無傷の細胞1.1×10⁷個が含有されていた。

Ｂマウス脾臓細胞と実験Ａからの単離された骨髄腫−
核質体−、細胞質体及び−沈殿細胞との融合 B.1材料融合剤：ポリエチレングリコール（PEG−4000）20gをオ
ートクレーブ中で融解させ、56℃まで冷却し、この温度
でDMEM20mlと混合した。

HAT選択培地:OMEM−完全培地に、アミノプテリン（４×
10^-7M）、チミジン（１×10^-4M）及びヒポキサンチン
（3.1×10^-5M）を加えた。

培養容器：コスター社（Firma Coster,Cambridge.Mass.
USA）の組織培養クラスター（Tissue Culture Cluste
r）24及びクラスター96。

B.2方法融合：実験Ａで調製されたフラクシヨンｂ）、ｃ）及び
ｄ）を、別々のバツチ中で脾臓細胞と10:1の割合で混合
し、遠心により沈殿させた。上澄み液を注意深く除去し
た。この沈殿上に、50％PEG−溶液0.8ml（37℃で、一様
に１分間にわたり分配し、絶えず緩るく振動しながら）
を加え、次いでDMEM 5ml（室温で、一様に５分間にわた
り）を加えた。更にDMEM 20mlの添加後に、細胞を沈殿
させ、新しいDMEM−完全培地（5ml）中に再懸濁させ、
フイーダー（Feeder）細胞で塗布された24コスタースポ
ツト（24erCoster−Ｔpfel）組織培養容器各10個上に
分配した。個々の培養物に１、２、３、５、７、10、13
日目にDMEM−完全培地を与えた。

フイーダー細胞〔（腹腔−マクロフアージ）：融合の前
日に同系交配マウス（Balb/c）を伸張により殺した。無
菌条件下でBBS4〜5mlを腹腔内に注入し、１分後に再び
吸引した。洗出した細胞をDMEM中で洗浄し、完全培地中
に1ml当り細胞２×10⁵個の密度で懸濁させ、24コースタ
ースポツト（Coster Tpfel）上に、0.5ml宛分配させ
た。

脾臓細胞:Balb/c−マウスから、無菌条件下で融合直前
に脾臓を別除し、その細胞をDMEM中に懸濁させた。細胞
集塊物及び組織片をガーセを用いて濾去した。

マウス−免疫グロブリン上のELISA:マイクロ滴定プレー
トに羊のマウス−Ig−抗体（Ig G−フラクシヨン；スポ
ツト１個当り0.9％NaCl−溶液10μg/ml;抗体溶液150μ
を塗布した。培養上澄み各100μを、この塗布され
たスポツト上に点滴し、室温で１時間インキユベートし
た。上澄みの吸引除去及び２回洗浄の後に、このスポツ
トに抗−マウス−Ig−POD−接合体−溶液（前記と同じ
抗体；オランダガラシ−ペルオキシダーゼと共有結合）
100μを装入し、室温で１時間インキユベートした。
３回洗浄後に、スポツト１個当り基質溶液（ABTB）100
μを点滴し、発色を光学的に測定した。

B.3結果Ａにより調製された細胞質体、核質体及び沈殿フラクシ
ヨンを、平行的に、Balb/c−マウスの脾臓細胞と融合さ
せ、各10〜1ml−培養駅上に分配させた。培養分各５個
にはHAT−添加物を与えず（プレートＩ）、各５個にはH
AT−添加物を与えた（プレートII）。

融合後（n.F）21日までは、沈殿フラクシヨンの融合物
がHAT−媒体を含有しないプレートＩ上のスポツト4A,4
B,4C,3C及び3Dは例外として、どのスポツト中でもリン
パ系細胞の生長は、肉眼的にも顕微鏡でも検出できなか
つた。これらのスポツト中では、融合後（n.F.）５日で
既に迅速に生長したコロニーが認識可能であつた。n.F.
8日目には、これらスポツト中にHAT−培地を加え、従つ
て、４日以内にすべての可視のコロニーは枯死した。

n.F.27日目から、差当り、別々にすると、次に殆んどす
べてのスポツト中でコロニーが見え、これらは、大きな
球状の透明な非粘着性で生長する細胞より成つていた。
n.F.65日目に、Ｉ−3B、II−1A、II−4Aを例外としてす
べてのスポツトにリンパ系細胞の複数のコロニーが付い
ていた。この日における培養上澄みのマウス−Igの含分
に関する検査で、第１表にまとめて示したように、前記
のコロニー不含スポツトを除いてすべての培養分内のEL
ISA中で、陽性〜強い陽性値が得られた：ａ）該質体とマウス脾臓細胞との融合により、試験管
内で増殖可能な免疫グロブリン−分泌細胞を生じた。悪
性成分の細胞質の小部分のみをこのハイブリツド中に導
入しても、永久生長のこの特徴を消失することはできな
かつた。

ｂ）該質体を用いて得たハイブリツド細胞は、マウス
−免疫グロブリンをハイブリドーマー定量的に合成しか
つ分泌させた。従つて、Ag8.653の細胞質分の欠如は、
該質体−脾臓−ハイブリツドの産生性及び分泌性に悪影
響を及ぼした。

ｃ）細胞質体と脾臓細胞との融合から、同様に試験管
内で増殖し、抗体を分泌する細胞クローンが明らかにな
つた。この特別な意想外の現象に対する満足しうる説明
は現在の所、得られていない。

例２グリセリン−溶解及び−ヒト血液リンパ球との融合によ
る細胞断片化材料エールズ・バランスド・ソルト・ソリユーシン（EBS
S）、培地APMI 1640、ベーリンガー・マンハイムの牛胎
児血清（FKS）、セルバ（Serva、Heiderberg）の８−ア
ザグアニン（８−Ag）、デイフコ（Difco、Fa.Hedinger
KG、Stuttgart）の寒天（Bacto−Agar 1614）。ヒト・
プラズマサイトーム−系（human plasmacytom−Linie）
HSSULTAN ATCC CRL−1484を、冷凍保存した（kryoprs
erviertes）細胞材料としてATCC−処方に従つて融か
し、培養液中に入れる。

Proc.Acad.Sci.USA 71 2679〜2683頁（1974年）に記載
の方法により、HSスルタン−細胞（HS Sultan zellen）
８×10⁷個をRPMI 1640−完全培地（８×Ag20μＭ含有）
100ml中で48時間培養した。生残細胞を８−Ag不含のRPM
I 1640−完全培地10ml中に入れ、10日間にわたり増殖さ
せた。次にこの細胞を軟−寒天−プレート（COFFINO、
P.等によるPro.Natl.Acad.Sci.USA 68 219〜223頁（197
1年））（RPMI 1640−完全培地＋８−Ag20μＭから製造
した）上に播種（ペトリシャーレ１個当り約500細胞）
し、CO₂−インキユベータ中で温置した。９日後に、単
離した生長性のコロニーを無菌下にこの寒天表面から取
り、PRMI 1640＋８−Ag中で増殖させた。約20時間の２
倍の時間で生長した１クローン（HS−SULTAN−8 Ag−R1
と称す）を次の実験に使用した。HS−R1細胞はHAT−敏
感であり、HAT−倍地（RPMI 1640−完全倍地＋ヒポキサ
ンチン0.1mM、アミノプテリン400nM、チミジン31μＭ）
1ml当り１〜５×10⁵の密度で培養した細胞は、増殖せ
ず、７日間以内に完全に死滅した。

ヒトリンパ球（末梢血液:PBLから）：静脈血300mlを、
無菌下に、ヘパリン溶液（2U/血液ml）中に集め、単核
細胞（MNC:リンパ球、単核白血球）のフラクシヨンを標
準法で単離した。MNC 3×10⁸をRPMI 1640＋10％FKS 100
m中に懸濁させ、単核白血球の分離のために、培養器
中、37℃で５％CO₂雰囲気中で24時間インキユベートし
た。

方法 HS−R1の断片化：細胞をJett、M.等の方法（Jett,M.等;
Isolation and characte−riz−ation of plasma membr
ans and intact nuclei from lymphoid cells.J.Biol.C
hem.252、2134〜2142（1977年）参照）で、グリセリン
塗布し、10mMトリス−HCl−緩衝液中でインキユベート
することにより溶解させた。核を200g（10分、４℃）で
の遠心により膜嚢から分離し、これ自体は5000g（40
分、４℃）での遠心により沈殿された。融合:729HS−R1
−核約１×10⁸個をヒト−リンパ球と共にPRMI 1640中
に、1:1の割合で懸濁させ、例１、B.2に記載と同様に、
PEGを用いて融合させた。

HS−R1−細胞約１×10⁸個からの膜嚢の沈殿に、ヒト−
リンパ球１×10⁷個の懸濁液を重積させPEGを用いて融合
させた。

対照バツチでRPMI 1640−完全倍地（HAT不含）中にHS−
R1−核約２×10⁷個を入れ、24コスタースポツト板４枚
で、co₂−インキユベータ中で培養液中に入れた。

融合物及び対照−培養液のすべてを、マウス腹腔−マク
ロフアージ上で例１に記載と同様に、フイーダー細胞と
して培養した。

培養液上澄み中のヒト−Igの検出：マイクロ滴定ELISA
は例１、B2の記載と同様であつた。

塗布のために、免疫吸着性の精製した羊の抗ヒト−Igを
用いた。同じAK−調製物を抗−ヒト−Ig−POD−共有物
の製造のために使用した。羊−AKはすべてのヒトIg−群
と反応し、牛−又はマウスIgとの交叉反応は示さなかつ
た。

結果グリセリン−トリス−HCl−リーゼによる断片化：この
処理によりHS−R1−細胞は、核含有フラクシヨン（これ
は200gで沈殿した）と核不含の細胞質−膜−嚢−フラク
シヨン（5000gで沈殿可能であつた）とに分かれた。顕
微鏡下では、前記双方のフラクシヨンのどちらの中に
も、無傷のHS−R1−細胞は認められなかつた。核は多か
れ少なかれ、不規則に限られた細胞質片で包囲されてい
た。計測によると、核収率は85％であつた。嚢−フラク
シヨンは少量のデブリス（Debvis）と共に多量の0.5〜
２μの大きさの嚢を有し、認識可能の核成分を有しなか
つた。

RPMI−完全倍地（HAT不含）中の核２×10⁷個の培養で
は、12週間の観察時間で、HS−R1−細胞の生長はなかつ
た。

融合物の培養：核−リンパ球及び細胞質嚢−リンパ球−
融合物を96コスタースポツトもしくは10個の24コスター
スポツト上に分配させ、HAT−添加物含有する又は含有
しない各半分を、マウス−マクロフアージ上でインキユ
ベートした。融合後第２週目からリンパ系細胞のコロニ
ーが認められ、これは連続的に増加した。

ヒト免疫グロブリンの産生：融合後21日目に培養液上澄
み（19日目に完全な培地交替を行なつた）をヒト免疫グ
ロブリンの含分に関して検査した。結果を第2a及び第2b
表に示す。

０〜99の消失値を陰性〜凝陽性とし、 100〜200の値を陽性とし、＞200の値を強い陽性とすると、核融合により得られた培養液に対して次の分配が得られ
た：この結果から次のことを知ることができる：溶解フラクシヨンを用いて製造される融合物は、HAT−
選択なしに培養することができる。この方法はサイトカ
ラシン−Ｂ−押出しによるよりも非常に作業経費がかか
らず、融合可能な材料を高収率で生じる。核−及び細胞
質−膜−フラクシヨン中の明確な分離は、この２つのい
ずれの方法でも達成されない。主として核物質を有する
フラクシヨンも、主として細胞質膜嚢を含有するフラク
シヨンも、血液からのヒトリンパ球との融合の後に、試
験管内で増殖可能なAK−産生性の細胞−クローンを生じ
る。

HAT−添加物を含有する核−リンパ球−ハイブリツドとH
AT−添加物を含有しない核リンパ球−ハイブリツドとの
平行バツチは、選択培地の陰性作用を示している:HATを
含有すると、１次培養液の23％はIg−陰性であり、40％
だけが強陽性であり、HAT不含では、70％以上が強陽性
であり、４％だけがIg−陰性である。

例３免疫化されたマウスの脾臓細胞と陰性の断片化された骨
髄腫AG8.653との融合材料ヒトの甲状腺刺激ホルモン（hTSH）及びその単離された
β−鎖（β−hTSH）をベーリンガー・マンハイムから入
手した。デイフコ（Difco）の完全又は不完全なフロイ
ンドのアジユハンス（CFA、IFA）、フルカ・ウント・FI
TC−コバスフエレス・フオン・コバレント・Tech.Co.
（Fluka und FITC−Covaspheres von Covaleut Tech.C
o.,Ann.Arbor.Michigan.USA）のメトセル（Methocel）1
500。

方法免疫化:Balb/c−マウスをβhTSH（CFA中40μｇ、腹膜
内）で１次的に免疫化し（１日）、196日目にhTSH（IFA
中50μ、腹腔内）で、266日目にアジユバンス不含のhTS
H（腹腔内）で、かつ294日目にhTSH（静脈内）で促進さ
せた。（geboostert）。

免疫化されたマウスの１匹から、最後の促進剤免疫化の
後３日目に、例1B.2の記載と同様に脾臓細胞（約１×10
⁸）を得、各々の半分を２種の融合のために用いた。

融合1:脾臓細胞５×10⁷個及びAg8.653−細胞１×10⁷個
を例1B.2の記載と同様に混合し、融合させ、かつ24スポ
ツトプレート48枚中でマウス−マクロフアージと共にHA
T−含有DMEM−完全培地中で培養した。

融合2:Ag8.653−細胞１×10⁷個を例２の記載と同様に、
グリセリンと10mMトリス−HCl−緩衝液での段階的処置
により溶解させた。細胞質−膜嚢−（CMV−）フラクシ
ヨンをペレツト化した（5000g、40分、４℃）。核融合
物を脾臓細胞７×10⁷個と混合し、遠心によりCMV−沈殿
物上に積層し、PEGを用い標準法で、例１、B.2に記載と
同様にして融合させた。この融合物をDMEM−完全培地中
で、マクロフアージを有する24コースタースポツトプレ
ート24枚上に分配し、かつHAT−添加物なしで培養し
た。

ハイブリツド細胞の抗原特異的標識化及びクローン化：
（FITC−）コバスフエレスを製造業者に一般的処方に従
つて、hTSHで共有的に塗布し（TSH−CS）、５％ナトリ
ウムアジド溶液中で貯蔵した。PARK,D.R.等によるProc.
Natl.Acad.Sci.USA 76、1982〜1966（1979年）に記載の
方法で、細胞を塗布されたコバスフエレスにより標識付
けし、サイトフルオログラフ（Cytofluorograph）を用
いて、大きな螢光陽性細胞を、個々にスポツト中及び96
コースタープレート中で貯蔵熟成させた。このスポツト
は24時間前に、DMEM−完全培地中のマウス−マクロフア
ージで塗布した。

TSH−特異抗体用のELISA:塗布、培養液上澄みのインキ
ユベーシヨン、基質−反応及び読み取りは、例１、B.2
の同様に行なう。抗マウス−Ig−PODの代わりに、TSH−
POD−共有物を用いた。陽性対照として、hTSH−過免疫
化されたマウスの血清を10^-3稀釈して使用し、陰性対照
として、非類縁抗原に対して抗体（マウス−抗ジゴキシ
ン）を形成するクローンを用いた。

結果融合１（無傷のAg8.653−細胞と）からの培養液中に
も、融合２（Ag8.653−リーゼーフラグメントと）から
の培養液中にも、14日目に、すべてのスポツト中に大き
なリンパ系細胞のコロニーが認められた。培養上澄みを
用いて14日に実施したTSH−特異抗体検出用のELISAは、
第３表にまとめた値を示した：すべての培養分で抗−TS
Hが検出された。

陰性−対照（DMEN−完全培値）:000 陽性−対照（抗−TSH−マウス血清）:362 融合後14日目の培養液上澄み中の抗−TSH を検出するためのBLISA. ａ）融合１（不完全Ag8.653）ｂ）融合２（Ag653−フラグメント） 15日目に非粘着性細胞を融合１及び２の個々のスポツト
から洗出させ、別個のバツチ中でTSH−抗原−特異的に
標識し（基本：ハイブリドーマは、一般にＢ−リンパ球
とと同様に、これにより合成された抗体の１部を細胞膜
中に係留担持し、外向きの抗原−結合位置を有する）、
この細胞ソルター（zellsorters）を用いてクローン化
した。

例４ヒトPBLと無傷でかつ断片化されたAg3.653−細胞との融
合材料不活性へパチチス−Ｂ−表面−抗原（HBsi;Biotest）を
血清蛋白質の免疫吸着により精製した。ヒトHBs−抗体
検出用ELISA:マイクロ滴定プレートに精製HBsi（20μg/
0.9％NaCl溶液ml）を塗布した。培養上澄みのインキユ
ベーシヨン、共有物−及び基質−反応及び読み取りは例
１、B.2の記載と同様である。抗−マウス−Ig−PODの代
りに、（羊−）抗−ヒト−Ig−PODを用いた。

実施高い抗HBs−価を有するスペンダー（Spender）のHPBLを
静脈血液200mlから、フイコル勾配−遠心により単離し
た。Ｂ−リンパ球の増加のためにＴ−細胞を羊赤血球
（標準法で）でロゼツト形成させ、第２のフイコル勾配
−遠心を用いて分離した。ロゼツト形成した細胞（HPBL
（Ｂ））のフラクシヨンを、RPMI 1640＋10％オートロ
ーグプラズマ（autologen Plasma）中の細胞５×10⁷個
の密度で（30分/56℃−加熱不活化）、HBsi約10μｇと
共にCO₂−イキユベーター中で培養した（培地交換は12
時間毎）。

融合1:前処理したHPBL（Ｂ）１×10⁷個をAg8.653 1×10
⁷個と混合し、例１、B.2の記載と同様に、PEGを用いて
融合させた。この融合物をRPMT 1640＋10％ヒトプラズ
マ＋HAT中、24コースタースポツト４枚中で培養した。

融合2:Ag 8.653−細胞1.1×10⁸個をグリセリン−溶解を
用いて断片化した。A 8.653−核１×10⁷個とHPBL（Ｂ）
１×10⁷個を混合し、膜−細胞質−嚢の沈殿（Ag 8.653
細胞１×10⁸個より）を塗布した。PEGとの融合の後に、
この融合物を、24コスタースポツトプレート４枚中、RP
MI 1640＋10％ヒトプラズマ（HAT−添加物不含）中でイ
ンキユベートした。

結果融合１及び２のすべてのスポツト中で、３日目から、非
常に大きな粘着性細胞の著るしい生長が始まつた。５日
目に非粘着性細胞の主要量を注意深く懸濁させ、２枚の
新しい24コスタースポツトプレート上に分配させた（例
えばA1、B1及びC1）。

28日目に融合１では、A₂及びA₃中に小さなコロニーが認
められ、その他のスポツト中には粘着性細胞のみが認め
られ、融合２では、c₃を除くすべてのスポツト中で複数
のコロニーの多量の生長が認められた。培養上澄みを用
いて35日実施した、肝炎−Ｂ−抗原に対する特異性を有
するヒト免疫グロブリンの検出用ELISAは、第４表にま
とめた結果を示した：融合１（無傷のAg 8.653−細胞、HAT−培地中で培養）
で、陽性の培養液は得られず、これに反して、融合２
（Ag 8.653−フラグメント、通常培地中で培養）の12培
養物の５個で明瞭な抗HBs−陽性であつた。

陰性−対照（抗−HBs−陰性ヒト血清）:000 陽性−対照（抗−HBs−陽性ヒト血清）:185 融合後35日目の培養上澄み中のヒト−抗−HB検出用ELIS
A。

ａ）融合１（無傷のAg 8.653）ｂ）融合２（Ag 8.653−フラグメント）。

例５（参考例） HPBLとヒトプラズマ細胞−系HS SUL−TANからのフラグ
メントとの融合材料 HS SULTANをATCCコードCRL−1484として、冷凍保存され
た細胞物質から入手し、ATCC−処方により氷解させ、培
養液中に入れた。

実施 HPBLを、例４に記載と同じスペンダーから同様に後処理
し、試験管中、HBsiで促進させた。

融合:HS SULTAN−細肪４×10⁷個をグリセリン−溶解を
用いて断片化した。膜−細胞質−嚢−フラクシヨンを55
00g（40分）で沈澱させ、HS−SULTAN−核約４×10⁷個と
HPBL（Ｂ）４×10⁷個との混合物をこの上に積層した。P
EG−融合は例４の方法で行なつた。この融合物を24コス
タースポツトプレート12枚上で、RPMI1640＋20％FKS＋
ピルベート＋インシユリン（Novo 2U/ml）＋1 ％非必須
アミノ酸（BM）＋HAT−添加物不含の１％メトセル1500
中に播種した。

結果融合後14日：大きな非粘着性リンパ系細胞コロニーの生
長。

例６（参考例）ヒトＴ−リンパ球の不滅化 6.1材料及び方法Ｔ−リンパ球を標準法で（羊赤血球を用いるロゼツト
化、フイコル勾配遠心）、リンパ球全フラクシヨンから
単離し、直ちに又は３日培養の後に処理した。エールリ
ツヒ膜水細胞（ATCC;CCL 77）を10％ウマ血清含有DMEN
中で培養し、形質転換されたフラグメントのスペンダー
として用いた。このEAZの断片化は、ジエツト（Jett）
等による方法（J.Biol.chem.252、2134〜2142頁（1977
年））で、グリセリン溶解を用いて実施した。主として
核物質を有するフラクシヨンを遠心分離し捨てた。ミト
コンドリアの多い細胞質膜嚢フラクシヨン（CMV）を形
質転換のために使用した。Ｔ−リンパ球５×10⁷個に過
剰のPHA−レクチン（Difco）を施与し、FAZからのCMV−
フラクシヨンと混合し、室温で20分インキユベートし
た。混合物を遠心により沈澱させ、液体上澄みを完全に
除去し50％PEG−溶液1mlで代えた。１分間の作用時間の
後に、PEG−溶液をRPMI−1640培地の添加により稀釈
し、遠心により細胞を分離した。細胞を牛胎児血清（FK
S、BM）20％を含有するRPMI−培地中に入れ、1ml−培養
スポツトプレート12枚に分配させ、37℃で５％CO₂雰囲
気中で培養した。表面特性に基づく細胞の同定は、羊赤
血球（Ｅ）−ロゼツト化を用いる（KAPLAN、M.E.等によ
るJ.Immunol.Methods ５、131頁（1974年））を用い、
かつ双方のＴ−細胞特異性抗体OKT−３（Ortho;REINER
Z,E.L.等によるJ.Immunol.123、1312頁（1979年））も
しくはMAK4−11（RIEBER、P.等によるHybridoma １ 59
頁（1881年））の使用下における螢光標識された抗−ヒ
ト−免疫グロブリン（Ig;Fa,Dako社）を用いる、Ｂ−細
胞−典型的な膜−Igの検出のための標準的方法により行
なつた。

6.2結果最初の14日以内に、培養液中の細胞のほとんどは死滅し
た。21日目から、細胞デブリス中に小〜中程度の細胞の
コロニーが認められ、これは連続的に増殖した。すべて
の12枚のスポツトプレート中でコロニーの生長が見出さ
れ、１スポツト当り50込までのコロニーが見出された。
30日目にこのコロニーを大きな培養容器中に移し、更に
増殖させた。細胞をその表面マーカー（Marker）に基づ
き分析し、次の結果を得たａ）Ｅ−ロゼツト−陽性＞95％ｂ） OKT−３−陽性＞90％ｃ）４−11−陽性＞90％ｄ） Igs−陽性＜５％ 6.3 評価 EAZ（永久マウス細胞系）からグリセリン溶解により得
ることのできるフラグメントは、単離されたＴ−リンパ
球とのPEG−融合の後に、永久的に培養液中で生長する
細胞を生じ、これは表面特徴に基づき、明白にＴ−リン
パ球として同定可能である。

例７（参考例）ヒト内皮細胞の不滅化 7.1 材料及び方法すべての培養容器に細胞の播種の前にゼラチンを層状に
装入した。この培地は、RPMI−1640と20％FKS含有培地1
99（BM）との1:1−混合物より成つた。ヒト内皮細胞を
ジヤツフエ（Jaffe）等による方法（J.Clin.Invest.5
2、2745〜2756頁（1973年））で、コラーゲナーゼ−溶
液（Gibco）を用いて、新しい臍帯の静脈から得、形質
転換の前に１次培養液の添付により約14日間にわたり増
殖させた。形質転換のために、粘着性で生長する内皮細
胞をトリプシン−EDTA−溶液（BM）を用いて溶解させ、
6.1に記載と同様に懸濁液中で、EAZからのCMV−フラク
シヨンと融合させた。このように処理した細胞を75ml−
培養容器１個当り５×10⁵個の細胞密度で播種し、CO₂−
インキユベーター中で培養した。対照のために、それぞ
れ、CMV−フラクシヨン不含の１次培養液からの内皮細
胞の小部分をPEG−溶液で処理し（偽融合）、再培養し
た。細胞が、培養容器の底部上で裂目のない細胞叢を形
成したら直ちに、これらをトリプシン−EDTA−溶液を用
いて溶解させ、1:3の割合で、新しい培養容器に移した
（通過）。

7.2 結果 CMV−フラクシヨンと融合した内皮細胞は、播種の後に2
0〜30％の効率で付着し、２〜３日以内に生長して集合
細胞叢になつた。偽融合した細胞は、ほぼ同じ効率で付
着するがまつたく増殖せず（集合細胞叢を形成せず）、
約21日以内に完全に死滅した。未処理の内皮細胞はすべ
て、第３通過で最大まで増殖し、次に、生長を調節し、
培養容器の底から団塊崩壊下に溶解し、分解した。異な
る計18臍帯からの内皮細胞を含有する８種の異なるバツ
チ中で、CMV−処理した細胞は、問題なく、10通過にわ
たり生長した。形質転換された内皮細胞は、生存能及び
分裂能を失なうことなしに、液体窒素中で貯蔵できた。

7.3 評価ヒト−臍内皮細胞は形質転換処理をせずには、本発明に
より第３通過にわたり培養できなかつたので、文献に記
載の知識（例えばGrimbrone.M.A.Progress in Haemosta
sis and Thrombosis.3巻;Maciag.T.等によるJ.Cell Bio
l.91、420〜426頁（1981年））は、確認された。エール
リツヒ腹水細胞からのミトコンドリアの多いCMV−フラ
クシヨンとの融合により、内皮細胞の培養特性は、これ
らが限界の第３通過を越えて増殖可能であるように変化
した（かつ第23通過時にも、疲労現象を（Ermndung−
serscheinungen）示さなかつた）例８（参考例）ヒト骨髄腫細胞の不滅化 8.1 材料及び方法骨髄細胞含有組織を、股リンパ球転移部の外科的切除に
より得、無菌条件下で小立方体に切断し、融合するま
で、液体窒素中に貯蔵した。EAZからのCMV−フラクシヨ
ンを6.1に記載と同様にして製造した。

融合の前に、この骨髄腫細胞含有物質を解凍させ、トリ
プシン−処理により単細胞懸濁液を製造した。大きな褐
赤色骨髄腫細胞を、フイコル−勾配遠心により付着リン
パ球を除き、6.1の記載と同様に、CMV−フラクシヨンPE
G−作用下に融合させた（骨髄腫約４×10⁵とEAZ約１×1
0⁶からのCMV）。融合調節のために、CMVなしにPEGで処
理した骨髄腫細胞４×10⁵個を用いた細胞を融合の後
に、スポツト１個当り細胞１×10⁵個の密度でRPMI 1640
＋20％FKS中に播腫し、37℃で５％CO₂−雰囲気中で培養
した。

8.2 結果 CMVと融合した骨髄腫の培養分４個すべてで、28日目か
ら、典型的な色を有する細胞のコロニーが半粘着性細胞
塊の形で生長し、これは連続的に増大した。偽融合した
細胞の対照−培養では、細胞増殖は起こらず、むしろ、
８日目から、顆粒化が増加し、22日目には細胞破片のみ
が培養液中に存在した。

8.3 評価冷凍保存した転移組織からのヒト骨髄腫細胞は、CMV−
融合により試験管内で培養−及び増殖可能な細胞に変え
ることができた。これに反して、同じ起源の偽融合した
骨髄腫細胞は、その他は同じ培養条件下で死滅した。

例９不滅化されたヒト内皮細胞中への真核性DNA−ベクター
の導入 9.1 ヒルト上澄（Hirt−berstanden）の蘇生（サウ
ザン・ブロテイングSouthern blotting）による細胞内
の形質転換された物質の検出。

9.1.1 材料プラスミドＺ−PBR 322/Rchr βＧ−△425B（Dierkes,
P.等によるProc.Natl.Acad.Sci.USA 78、1411〜1415頁
（1981年））は、2.070塩基対（BP）ウサギ−β−グロ
ブリン−遺伝子フラグメント１個を有する。

pBR 322のCla−Pvu I−フラグメントを、3.039BpHpa I
−Bam HI−フラグメント〔これはSV40の先の遺伝子の全
域及び後の遺伝子の当初或を有する（Tooze,J.（1980）
の“DNA Tumor Viruses."J.Tooze.等による、第２版Col
d Spring Harbor Laboratory und B.Wieringa等によるC
etus−UCLA Symposium on gene regulation 1982）〕で
換えた。このプラスミドを以後pBR 322RβG SV 40と称
する。

9.1.2 方法ヒト内皮細胞を、例７の記載と同様に不滅化しかつ生長
させた。細胞10⁶個当り、pBR322RβGSV40 6μｇ及び超
音波処理された犢胸腺４μｇを、燐酸カルシウム沈澱法
〔Graham.F.L.等によるVirology 52、456〜467頁（1973
年）及びWigler.M.等によるCell.14、725〜731頁（1978
年）参照〕の使用下にDNAトランスフエクシヨンした。
このトランスフエクシヨンの10時間及び40時間後にヒル
ト上澄み（Hirt berstande）を作つた。（Hirt.B.J.M
ol.Biol.26、365〜369頁（1967年）参照）。

このヒルト上澄みを１％アガロースゲル上で分離し、サ
ウザン法〔Soutern.E.M.J.Mol.Biol.98 503〜517頁（1
975年）参照）でニトロセルロース紙上に移した。プラ
スミドpBR 322RβG SV 40を32pでリグビイ（Rigby）等
のニツク−トランスレーシヨン法〔Rigby,P.W.等のJ.Mo
l.Biol.113、237〜251頁（1977年）参照〕で標識し、伝
達性DNAとニトロセルロースフイルター上でハイブリダ
イゼーシヨンさせた〔Maniatis,T.等によるMolecular C
loning,Cold Spring Harbor Laboratory（1982年）参
照〕。このフイルターをレントゲンフイルム上で−70℃
で露光させた。

9.1.3 結果プラスミドpBR 322RβG SV 40でトランスフエクシヨン
されたヒト内皮細胞は、そのアガロースゲル上での運動
性に関して真性プラスミドに相応する強いハイブリダイ
ゼーシヨン信号を示す。このトランスフエクシヨン40時
間後の細胞のヒルト上澄みの信号と、トランスフエクシ
ヨン10時間後の細胞の信号とを比較すると、ハイブリツ
ダイゼーシヨン信号の強さは４〜５倍増加した。

導入されたプラスミドよりも小さいDNA−種のハイブリ
ダイゼーシヨンが同様に観察された。

トランスフエクシヨンされずに不滅化されたヒト内皮細
胞中ではこの信号は測定不能であつた。

HeLa−細胞をプラスミドpBR 322RβG SV 40でトランス
フエクシヨンすると、ハイブリダイゼーシヨン信号の一
様の強度分配が認められた。

9.1.4 評価プラスミドpBR 322RβG SV 40でトランスフエクシヨン
されたヒトの不滅化上皮細胞のヒルト−上澄み中で、DN
A−ハイブリダイゼーシヨンを³²P−標識されて挿入され
たプラスミドで測定されるが、トランスフエクシヨンさ
れていない細胞では測定されない事実は、真核性細胞系
中にベクターが導入されたことを立証している。トラン
スフエクシヨンされた細胞でのハイブリダイゼーシヨン
信号はトランスフエクシヨンの40時間後に、トランスフ
エクシヨンの10時間後のそれよりも４〜５倍の強さを有
することの観察は、トランスフエクシヨンされたプラス
ミドが細胞内で複製されたことを推測させる。

9.2 プラスミドpBR 322RβG SV 40でトランスフエクシ
ヨンされた不滅化されたヒト内皮細胞中へのウサギ−β
−グロブリン特異性転写の立証。

9.2.1 材料ヌクレアーゼSi.T₄ポリヌクレオチドキナーゼ及び犢腸
ホスフアターゼとして、ベーリンガー・マンハイム（Ｂ
hringer Mannheim）社の市販製品を用いた。

9.2.2 方法不滅化されたヒト上皮細胞を例9.1.2の記載と同様に増
殖させ、ウサギ−β−グロブリン−遺伝子含有ベクター
でトランスフエクシヨンした。このトランスフエクシヨ
ンの48時間後に細胞２×10⁶個を溶解させ、RNAをLiol−
尿素−法（Affray.C.等によるEur.J.Biochem.107、303
〜314頁（1980年）参照）で抽出した。

ウサギ−β−グロブリン特異性ハイブリダイゼーシヨン
ゾンデの製造。

プラスミドpBR 322RβG SV 40をHae IIIを用いて崩壊さ
せ、＋135から−75まで拡がつたフラグメント〔Dierks.
P.等によるProc.Natl.Acad.Sci.USA 78、1411〜1415頁
（1981年）及びVan Oyen.A.等によるScience 206、337
〜344頁参照〕を２％アガロースゲル上で単離し、DEAE
−セルロース−クロマトグラフイにより更に精製した
〔Ｍller、W.等によるJ.Mol.Biol.124、343〜358頁
（1978年）参照〕。このフラグメントを、犢腸ホスフア
ターゼを用いて、かつ³²P−デホスホル化し、γ−³²P−
ATP及びT₄ポリヌクレオチドキナーゼで、文献（Mantel.
N.等によるGene 10、１−８頁（1980年））の記載と同
様にして標識した。

ヌクレアーゼS₁記入キナーゼで処理したフラグメントを、Ｅ・コリーｔ−RN
A（Ｂhringer Mannheim）10μｇと共にエタノールを
通して沈殿させ、NaCl0.4M/、EDTA 1mM/、パイプス
（Pipes）−緩衝液（pH6.4）40mM/及びホルムアミド8
0％よりなるもの100μ中に溶かした（Mantei、N.等に
よるNature 281、40〜46頁（1979年）参照）。細胞RNA
（＝25μｇ）を真空乾燥させ、緩衝液中の前記のように
溶かしたゾンデ（0.1pMol、30000cpm）10μ中で変性
させ、ガラス毛細管中に封入し、48℃で16時間ハイブリ
ダイゼーシヨンさせた。対照実験では、このゾンデをウ
サギ−β−グロブリンｍ−RNA（Miles）とハイブリダイ
ゼーシヨンさせた。試料はNaCl 0.2M/、酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH4.5）50mM/、ZnSO₄ 1mM/及びグリセリ
ン0.5％よりなるもの100μで稀釈し、ヌクレアーゼS₁
500単位と共に30℃で60分間インキユベートした（Weav
er、R.等によるNucl.Acid.Res.７、1175〜1193（1979
年）参照〕試料をフエノールで処理し、Ｅ・コリーｔ−RNA 10μｇ
と共にエタノールにより沈殿させ、80％エタノールで
（−70℃で20分）洗浄し、真空乾燥させ、染料溶液（ブ
ロムフエノールブルー0.05％、キシロキサノール0.05
％、EDTA 1mM/、ホルムアミド90v/v）５μ中に溶か
し、沸騰水浴中で２分間加熱し、５％ポリアクリルアミ
ドゲル上の電気泳動にかけた（トリス塩基89mM/、ホ
ウ酸89mM/、EDTA 1mM/及び尿素7M/）。このゲル
をフジ社（Firma Fuji）のレントゲンフイルム及び補強
スクリーンを用いて、−70℃でオートラジオグラフ法に
かけた。

9.2.3 結果保護されたフラグメントの大きさは、寸法マーカー（Gr
oβenmarkern、³²P−標識されたpBR 322×Hinf 1及びpB
R 322×Hae III）との比較により評価した。トランスフ
エクシヨンされていない細胞は、まつたくグロビン特異
性ハイブリダイゼーシヨン信号（再生されたハイブリダ
イゼーシヨンゾンデ＝210Bpは例外）を示さなかつた。
トランスフエクシヨンされ、不滅化されたヒト上皮細胞
から、大きさが80〜90Bpで測定されたRNA保護された２
個のフラグメントを抽出した。この種の転写物は、グロ
スフエルド（Grosveld）等によるネイチユア（Nature）
295、120〜126頁（1982年）及びワイルド（Weidle）U.
等によるネイチユア（Nature）（1981年）によつても発
見されており、内部の潜在的分割位置の存在がウサギ−
β−グロブリン−遺伝子上に記載されている。ウサギ−
β−グロブリン遺伝子のキヤプ位置から得た転写は確認
できなかつた。比較実験でHeLa−細胞プラスミドpBR 32
2RG SV 40でトランスフエクシヨンした。正しく開始さ
れた転写物（135Bp保護）並びに内部の潜在的分割位置
の存在に基因する転写物（Grosveld、G.等によるNature
295、120〜126頁（1982）及びWeidle、U.等によるNatu
re（1983年）参照）を、S₁−記入により測定した。

9.2.4 評価ウサギ−β−グロブリン特異性転写物がウサギ−β−グ
ロビン遺伝子を有するSV 40起源真核性ベクターを用い
てトランスフエクシヨンさせた不滅化されたヒト上皮細
胞中で確認可能である事実は、この細胞系が、再導入さ
れたクローン化された遺伝子の発現のための宿主系とし
て好適であることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/577 //(Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ヴインフリート・アルベルトドイツ連邦共和国ペール・モースシユトラーセ 10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】同種及び／又は異種細胞産生物を得るため
に、正常の動物及びヒトの細胞と形質転換された細胞
の、単独では増殖能力がなく、無傷の増殖可能な細胞を
含有しない細胞フラクションとを融合させ、選択物質不
含の培地中で培養して得た永久培養可能な動物及びヒト
の細胞系を使用して、同種及び／又は異種細胞産生物例
えばモノクローン性抗体を得ることを特徴とする細胞産
生物を取得する方法。